JPH0333318B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は発酵法によるイノシンの製造法に関す
るものである。従来、発酵法によるイノシンの生
産に関しては、アデニン要求性、又はそれに各種
のプリンアナログ耐性を付与したバチルス属（特
公昭38−23098、特開昭56−162998、特公昭55−
2956）、ブレビバクテリウム属（特公昭51−5057
Agr.Bial.Chem.、42、399（1978）等のイノシン
生産菌が知られている。 本発明者らは上述のような従来のイノシンの製
造法に対し、プリンアナログ耐性を有するバチル
ス属の染色体より得たプリンアナログ耐性に関与
する遺伝子領域が組み込まれているベクターをア
デニン要求性のバチルス属の変異株に含有せしめ
たイノシン生産性バチルス属の微生物が著量のイ
ノシンを蓄積することを見い出した。 本発明はこの知見に基づいて完成されたもので
ある。本発明でいうプリンアナログとはバチルス
属の微生物の増殖を抑制し、かつその抑制がヒポ
キサンチン、イノシン、あるいは5′−イノシン酸
等を培地中に添加すれば全体的又は部分的に解除
されるようなものである。例えば、８−アザグア
ニン、８−アザヒポキサンチン、８−アザアデニ
ン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプ
リン、６−メルカプトプリンリボシド、８−メル
カプトグアノシン等がある。 プリンアナログ耐性に関与する染色体遺伝子の
供与菌はバチルス属とプリンアナログ耐性を有す
る変異株ならどのような菌株でもよいが、耐性の
より高いものが望ましい。又、アデニン要求性株
を親株として、プリンアナログ耐性を有する変異
株を誘導すれば、イノシン生産能を有する変異株
を得ることができ、このような変異株を遺伝子供
与菌として用いればよりよい結果が得られる。
又、遺伝子供与菌として、アデニン要求性及びプ
リンアナログ耐性変異株に、さらに従来知られて
いるようなイノシン生産能を向上させるような性
質、例えばサルフア剤耐性、メチオニン耐性等を
付加した菌株を誘導して用いれば、イノシンの生
産性が高い菌株を得ることができ、このような菌
株を染色体遺伝子供与菌として用いれば、より好
ましい結果が得られる。 上記サルフア剤とはバチルス属の微生物の増殖
を抑制し、かつその抑制がｐ−アミノ安息香酸又
は葉酸等の添加により全面的又は部分的に解除さ
れるようなものである。例えば、サルフアグアニ
ジン、サルフアメトメジン、スルフアメトキサゾ
ーム、スルフアニルアミド、サルフアメトメジ
ン、サルフアメラジン等がある。 遺伝子供与菌より染色体DNAを抽出する方法
は、例えばJ.Bacteriol.、89、1065（1965）に記載
されているような通常の方法で行うことができ
る。 ベクターDNAとしては、バチルス属の菌体中
で複製するプラスミド又はフアージならば、どの
ようなものでもよい。例えばスタフイロコツカス
属微生物由来のpT127、pC194、pC221、pC223、
pUB112（以上、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、74、
1680（1977）参照）、pUB110（J.Bacteriol.，134、
318（1978）参照）、pTP4、pTP5（以上Microbiol
Letters，５、55（1978）参照）、枯草菌由来の
pLS15、pLS28（以上、J.Bacteriol.、131、699
（1977）参照）、pLS13（J.Bacteriol.、129、1487
（1977）参照）、pPL1、pPL2（以上、J.
Bacteriol.、124、484（1975）参照）、テンペレー
トフアージとしても知られるrho11（Gene.、５、
89（1979））、phi105（Gene.、５、87（1979））、
SPO2（Gene.、７、51（1979））等がある。更に上
記プラスミドをもとにして構築した複合プラスミ
ドを当然のことながらベクターDNAとし利用で
きうる。 染色体DNA及びベクターDNAはそれぞれ制限
エンドヌクレアーゼを用いて切断する。それぞれ
のベクターには適した制限エンドヌクレアーゼが
あるが、それは上記ベクターについての記載があ
る文献等に示されてある。染色体DNAについて
は制限エンドヌクレアーゼによる切断が部分的に
行なわれるように反応条件を調節すれば多くの種
類の制限酵素が利用できる。 かくして得られた染色体DNA断片と、切断さ
れたベクターDNAとを連結せしめる方法は、リ
ガーセを用いる通常の方法が使用できる。一方、
ターミナルトランスフエラーゼを用いて染色体
DNA断片と開裂したベクターDNAとにデオキシ
アデニール酸とデオキシシチジル酸をそれぞれ付
加し、混合した後アニーリングして連結せしめる
方法も利用し得る。 かくして得られた染色体DNA断片を組み込ん
だ組換えベクターDNAの受容菌はバチルス属の
アデニン要求性を有する変異株からどのようなも
のでもよいが、プリンアナログ耐性を有していな
い菌株を用いれば、形質転換株を選択する際に好
都合である。更に組換えDNA受容菌としてプリ
ンアナログ耐性を有し、より高いイノシン生産能
を有する菌株を用いれば、よりイノシン生産性の
高い形質転換株を得ることができる。受容菌とし
ては当然イノシン分解能がより低いものを用いな
ければならない。 染色体DNAとベクターの混合物をDNA受容菌
に導入するには例えばMalec.Gene.Genet.、168、
111（1979）に記載されているような通常の形質転
換法が利用できる。 イノシン生産能を有し、プリンアナログ耐性に
関与する遺伝子領域が組み込まれているベクター
を含有する形質転換株を選択するには、例えばベ
クター受容菌としてアデニン要求性変異株を用い
て形質転換し、プリンアナログを含有する培地で
生育してくる菌株を選択すればよい。又、ベクタ
ーDNAの抗生物質耐性等の性質を併せもつ菌株
を選択できるような培地を用いればより選別が容
易である。プリンアナログ耐性及び例えばサルフ
ア剤耐性、又はメチオニンスルフオオキシド耐性
等に関与する遺伝子領域が組み込まれている組換
えベクターDNAの受容菌を選択する場合、これ
らの耐性を有する薬剤を含有している培地で生育
してくる菌株を選別すればよい。 このようにして、一旦選別されたプリンアナロ
グ耐性等に関与する遺伝子領域が組み込まれてい
る組換えベクターDNAは、形質転換株より抽出
後、他の組換えベクターDNA受容菌、例えばイ
ノシン生産能を有する菌株に導入することにより
イノシン蓄積量をさらに増大させることができ
る。この場合、受容菌はイノシン生産能のより高
い菌株、例えばプリンアナログ耐性及びサルフア
剤、又はメチオニンスルフオオキシド耐性等を併
せもつ菌株を受容菌とすればさらに高いのイノシ
ン収率が得られる。 かくして得られたイノシン生産菌を用いてイノ
シンを製造する方法は従来のイノシン生産菌の培
養方法と特に変らない。即ち、培地としては炭素
源、窒素源、無機イオン、および有機微量栄養素
を含有する通常の培地である。炭素源としてはグ
ルコース、シユークロース等の炭水化物が望まし
い。窒素源としてはアンモニア水、アンモニアガ
ス、アンモニウム塩、アミノ酸等が利用できる。
無機イオンとしてはリン酸イオンが必要であるほ
か、カリイオン、マグネシウムイオン、鉄イオ
ン、マンガンイオン等が適宜培地中に添加され
る。有機微量栄養素としてアデニン要求性を満足
せしめるべき物質、例えばアデニン、アデノシ
ン、又はRNA加水分解物等を添加する。その他
にビタミン、アミノ酸等が有機微量栄養素として
適宜使用される。 培養は好気的条件下で、望ましくはPH４ないし
８に制御しつつ１ないし５日も行なえばよい。か
くして得られた培養液中には著量のイノシンが生
成蓄積される。培養液よりイノシンを採取する方
法はイオン交換樹脂等を用いる通常の方法でよ
い。 実施例 バチルス・ズブチリスAJ11711（アルギニン、
ロイシン複要求株）からＮ−メチル−N′−ニト
ロ−Ｎ−ニトロソグアニジン変異処理によつて誘
導したアデニン要求性変異株AJ11831（FERM−
P6452）を得た。さらにこのアデニン要求性株か
ら同様の変異処理によつて誘導したイノシン生産
菌AJ11832（FERM−P6453）（アルギニン要求
性、ロイシン要求性、アデニン要求性、８−アザ
グアニン耐性）、AJ11833（FERM−P6454）（ア
ルギニン要求性、ロイシン要求性、アデニン要求
性、８−アザグアニン耐性、アルフアグアニジン
耐性）を原株とし、これより次のような方法で新
規イノシン生産菌を造成した。 (1) 染色体DNAの調製 AJ11832、AJ11833を各々１の「Bacto−
Penassay Broth」（商品名、Difco社製）中で
30℃で約２時間振盪培養を行ない、対数増殖期
の菌体を集菌後、通常のDNA抽出法（J.
Bacteriol.、89、1065（1965））により染色体
DNAを抽出、精製し、AJ11832から3.1mg、
AJ11833から3.7mgを得た。 (2) 染色体DNA断片のベクターへの挿入 ベクターとして自律増殖性のプラスミド
pUB110（カナマイシン、ネオマイシン耐性を
発現する）を用いた。(1)で得た染色体DNAを
各々5μｇずつとプラスミドpUB110 5μｇずつ
を、それぞれ制限エンドヌクレアーゼEcoRIを
37℃で60分間作用させてDNA鎖を切断した。
65℃で10分間の熱処理後、各両反応液を混合
し、ATP及びジチオスライトール存在下、T₄
フアージ由来のDNAリガーゼにて10℃にて24
時間、DNA鎖の連結反応を行なつた。 (3) 形質転換 バチルス・ズブチリスAJ11711（アルギニン、
ロイシン複要求株、アデニン要求性変異株）を
「Penassay Broth」（Difco社製）に接種して
30℃にて１晩振盪培養を行ない、培養培他
（グルコース５ｇ／、（NH₄）₂SO₄2ｇ／、
KH₂PO₄6ｇ／、K₂HPO₄14ｇ／、
MgSO₄・7H₂O0.2ｇ／、クエン酸ナトリウ
ム１ｇ／、酵母エキス２ｇ／、Ｌ−アルギ
ニン250mg／、Ｌ−ロイシン50mg／、アデ
ニン50mg／を含む）に接種し、37℃にて４時
間振盪培養を行なつた後、さらに培養培地
（グルコース５ｇ／、（NH₄）₂SO₄2ｇ／、
KH₂PO₄6ｇ／、K₂HPO₄14ｇ／、
MgSO₄・7H₂O1.2ｇ／、クエン酸ナトリウ
ム１ｇ／、酵母エキス0.2ｇ／、Ｌ−アル
ギニン250mg／、Ｌ−ロイシン５mg／及び
アデニン50mg／を含む）へ接種し、37℃にて
1.5時間振盪培養を行なうことによつて、いわ
ゆるコンピテントな（DNA取込能を有する）
細胞を調製した（参考文献、L.Bacteriol.、
81、741（1961））。このコンピテント細胞懸濁液
に(2)で得たDNA溶液を各々、別々に加えて37
℃でさらに振盪培養を行なつて形質転換反応を
完了させた。 次にAJ11832のDNAによる形質転換株を含
む懸濁的をカナマイシン5μｇ／ml、グルコー
ス５ｇ／、（NH₄）₂SO₄2ｇ／、KH₂PO₄6
ｇ／、K₂HPO₄14ｇ／、MgSO₄・7H₂O0.2
ｇ／、クエン酸ナトリウム１ｇ／、Ｌ−ア
ルギニン100mg／、Ｌ−ロイシン100mg／、
アデニン50mg／、カナマイシン5μｇ／ml、
８−アザグアニン100μｇ／ml及び寒天20ｇ／
を含むPH7.2に調節した最小培地（プレー
ト）に塗沫し、37℃で培養した。又、AJ11833
のDNAによる形質転換を含む懸濁液を最小培
地に更にサルフアグアニジン100r／mlを添加
した最小培地（プレート）に塗沫し、37℃で
培養した。培養３日後には最小培地上に５個
のコロニー、最小培地上に４個のコロニーが
出現したのでこれを釣菌し、各クローンをそれ
ぞれ純粋に分離した。 最小培地から得られた形質転換株の性質
は、いずれもアルギニン要求性、ロイシン要求
性、アデニン要求性、８−アザグアニン要求
性、カナマイシン耐性を示し、最小培地から
得られた形質転換株の性質は、いずれもアルギ
ニン要求性、ロイシン要求性、アデニン要求
性、８−アザグアニン耐性、サルフアグアニジ
ン耐性、カナマイシン耐性を示した。 (4) プリンアナログ等の耐性領域を担うプラスミ
ドpUB110の抽出 (3)で得られたクローンのうち、最小培地上
のクローンAJ11834（FERM−P6455）、培地
上のクローンAJ11835（FERM−P6456）を用
いて、C.I.Kadoらの方法（J.Bacteriol.、145、
1365（1981））に基づいたDNA抽出法により
各々別々との菌体のDNAを抽出し、アガロー
ス電気泳動によつてプラスミドDNAと染色体
DNAを分離し、プラスミドDNA区分を各々分
画採取し精製した。 こうして得られた新規プラスミド、即ち菌株
AJ11834から得られたプラスミドを(3)で述べた
のと同様の方法によつて、原株のイノシン生産
菌AF11832へ形質転換法により再導入し、カナ
マイシン耐性株AJ11836（FERM−P6457）を
得た。又、AJ11835から得られたプラスミドを
イノシン生産菌AJ11833へ形質転換法により再
導入し、カナマイシン耐性株AJ11837（FERM
−P6458）を得た。 (5) イノシンの生産 第１表に示す菌株を各々を培養してイノシン
生産能を調べた。結果を第１表に示す。培養は
500ml容肩付フラスコ中にイノシン生産培地
（グルコース80ｇ／、NH₄Cl15ｇ／、
KH₂PO₄5ｇ／、MgSO₄・7H₂O0.4ｇ／、
FeSO₄・7H₂O10mg／、MnSO₄・7H₂O10
mg／、CaCl₂・2H₂O2ｇ／、アデニン200
mg／、大豆蛋白加水分解液40ml／、アルギ
ニン100mg／及びロイシン100mg／を含みPH
6.5にKOHで調製した。）を20ずつ分注し、
115℃で10分間加圧殺菌した後、予め斜面培地
で培養して得た各種菌体を接種後、34℃で72時
間浸盪培養を行なつた。 【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ バチルス属のプリンアナログ耐性を有する変
   異株の染色体遺伝子より得たプリンアナログ耐性
   に関与する遺伝子領域が組み込まれているベクタ
   ーをバチルス属のアデニン要求性変異株に含有せ
   しめたイノシン生産性微生物を培養し、培地中に
   蓄積されたイノシンを採取することを特徴とする
   イノシンの製造法。