JPH0428357B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は発酵法によるグアノシンの製造法に関
する。 発酵法によるグアノシンの生産に関しては、ア
デニン要求性、又はそれに各種のプリンアナログ
耐性を付与したバチルス属の微生物（特公昭39−
16347）、ブレビバクテリウム属の微生物（特開昭
51−12）、更にサルフア剤（特開昭50−70592）、
デコイニン又はサイコフラニン（特開昭50−
126886）あるいはメチオニン又はアザセリン（特
開昭50−13589）への耐性が付与されたバチルス
属の微生物がグアノシンを生産することが知られ
ている。 本発明者らは上述のような従来のグアノシンの
製造法に対し、プリンアナログ耐性又はデコイニ
ン耐性を有するバチルス属の染色体より得たプリ
ンアナログ耐性又はデコイニン耐性に関与する遺
伝子領域が組み込まれているベクターをアデニン
要求性のバチルス属の変異株に含有せしめたグア
ノシン生産性バチルス属の微生物が著量のグアノ
シンを蓄積することを見い出した。 本発明はこの知見に基づいて完成されたもので
ある。本発明でいうプリンアナログとはバチルス
属の微生物の増殖を抑制し、かつその抑制がヒポ
キサンチン、イノシン、5′−イノシン酸、グアニ
ン、グアノシン、5′−グアニル酸、アデニン、ア
デノシン、５−アデニル酸等を培地中に添加すれ
ば全体的又は部分的に解除されるようなものであ
る。例えば、８−アザグアニン、８−アザヒポキ
サンチン、８−アザアデニン、２，６−ジアミノ
プリン、６−メルカプトプリン、６−メルカプト
プリンリボシド、８−メルカプトグアノシン等が
ある。 プリンアナログ耐性又はデコイニン耐性に関与
する染色体遺伝子の供与菌はバチルス属のプリン
アナログ耐性又はデコイニン耐性を有する変異株
ならどのような菌株でもよいが、耐性度のより高
いものが望ましい。又、アデニン要求性であつて
グアノシン生産能を有する菌株を親株として、プ
リンアナログ耐性又はデコイニン耐性を有する変
異株を誘導すれば、グアノシン生産能がより高い
変異株を得ることができ、このような変異株を遺
伝子供与菌として用いればよりよい効果が得られ
る。又、遺伝子供与菌として、アデニン要求性及
びプリンアナログ又デコイニン耐性変異株に、さ
らに従来知られているようなグアノシン生産能を
向上させるような性質、例えばメチオニンスルホ
キシド耐性、アザセリン耐性、サイコフラニン耐
性、サルフアグアニジン耐性等を付加した菌株を
誘導して用いれば、グアノシンの生産能がより高
い菌株を得ることができ、このような菌株を染色
体遺伝子供与菌として用いれば、、より好ましい
結果が得られる。 遺伝子供与菌より染色体DNAを抽出する方法
は、例えばJ.Bacteriol.，89，1065（1965）に記載
されているような通常の方法により行うことがで
きる。 ベクターDNAとしては、バチルス属の菌体中
で複製するプラスミド又はフアージならば、どの
ようなものでもよい。例えばスタフイロコツカス
属微生物由来のpT127，pC194，pC221，pC223，
pUB112（以上、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，74，
1680（1977）参照）、pUB110（J.Bacteriol.，134，
318（1978）参照）、pTP4，pTP5（以上Microbiol
Letters，５，55（1978）参照）、枯草菌由来の
pLS15，pLS28（以上、J.Bacteriol.，131，699
（1977）参照）、pLS13（J.Bacteriol.，129，1487
（1977）参照）、pPL1，pPL2（以上、J.
Bacteriol.，124，484（1975）参照）、テンペレー
トフアージとしても知られるrho11（Gene.，５，
89（1979）），phi105（Gene.，５，87（1979）），
SPO2（Gene.，７，51（1979））等がある。更に上
記プラスミドをもとにして構築した複合プラスミ
ドも当然のことながらベクターDNAとして利用
できうる。 染色体DNA及びベクターDNAはそれぞれ制限
エンドヌクレアーゼを用いて切断する。それぞれ
のベクターには適した制限エンドヌクレアーゼが
あるが、それは上記ベクターについての記載があ
る文献等に示されてある。染色体DNAについて
は制限エンドヌクレアーゼによる切断が部分的に
行なわれるように反応条件を調節すれば多くの種
類の制限酵素が利用できる。 かくして得られた染色体DNA断片と、切断さ
れたベクターDNAとを連結せしめる方法は、リ
ガーゼを用いる通常の方法が使用できる。一方、
ターミナルトランスフエラーゼを用いて染色体
DNA断片と開裂したベクターDNAとにデオキシ
アデニール酸とデオキシシチジル酸をそれぞれ付
加し、混合した後アニーリングして連結せしめる
方法も利用し得る。 かくして得られた染色体DNA断片を組み込ん
だ組換えベクターDNAの受容菌はバチルス属の
アデニン要求性を有する変異株ならどのようなも
のでもよいが、プリンアナログ耐性又はデコイニ
ン耐性を有していない菌株を用いれば、形質転換
株を選択する際に好都合である。更に組換え
DNA受容菌としてプリンアナログ耐性又はデコ
イニン耐性を有し、より高いグアノシン生産能を
有する菌株を用いれば、よりグアノシン生産性の
高い形質転換株を得ることができる。受容菌とし
ては当然グアノシン分解能がより低いものを用い
なければならない。 染色体DNAとベクターの混合物をDNA受容菌
に導入するには例えばMalec.Gene.Genet.，168，
111（1979）に記載されているような通常の形質転
換法が利用できる。 グアノシン生産能を有し、プリンアナログ耐性
又はデコイニン耐性に関与する遺伝子領域が組み
込まれているベクターを含有する形質転換株を選
択するには、例えばベクター受容菌としてアデニ
ン要求性変異株を用いて形質転換し、プリンアナ
ログ又はデコイニンを含有する培地で生育してく
る菌株を選択すればよい。又、ベクターDNA上
の抗生物質耐性等の性質を併せもつ菌株を選択で
きるような培地を用いればより選別が容易であ
る。 このようにして、一旦選別されたプリンアナロ
グ耐性等に関与する遺伝子領域が組み込まれてい
る組換えベクターDNAは、形質転換株より抽出
後、他の組換えベクターDNA受容菌、例えばグ
アノシン生産能を有する菌株に導入することによ
りグアノシン蓄積量をさらに増大させることがで
きる。 かくして得られたグアノシン生産菌を培養して
グアノシンを製造する方法は従来知られている方
法と特に変らない。 即ち、このような微生物を培養する培地は、炭
素源、窒素源、無機塩類、アデニンおよび必要な
らば更にその他の微量栄養素を含有する通常の液
体培地である。炭素源としては、グルコース、糖
蜜、デンプン加水分解液などの炭水化物が望まし
い。窒素源としては硫安、硝安、塩安、リン安等
のアンモニウム塩、硝安等の硝酸塩、尿素、アン
モニアガス等が使用できる。また栄養要求物質と
してのアデニンはアデニン、アデニン鉱酸塩、ア
デノシン、アデニル酸等のいずれも使用可能であ
る。また必要に応じてビタミン類、アミノ酸、ア
デニン以外の核酸塩基などの微量栄養素を添加す
ればグアノシン蓄積量を増すことができる場合が
多い。 培養方法は好気的条件がよく、また、培養温度
は27ないし38℃の範囲が好適である。場合によつ
ては培養途中にて培養温度を変更させてもよい。
培養開始時および培養中に培養液のPHを5.0ない
し9.0に調節し培養するのが望ましい。PHの調整
には無機酸、有機酸あるいはアルカリさらに尿
素、炭酸カルシウム、アンモニア水、アンモニア
ガスなどを使用することが出来る。かくして２な
いし５日間培養すれば著量のグアノシンが培地中
に蓄積される。 培養液からグアノシンを採取する方法は、イオ
ン交換樹脂を用いる等通常の方法でよい。 実施例 バチルス・ズブチリスAJ11711（アルギニン、
ロイシン複要求株）からＮ−メチル−Ｎ−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニン変異処理（500μｇ／ml
のＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグア
ニジンに０℃にて30分間10⁸個／mlの菌体を接触
せしめた）によつてアデニン要求株の中からグア
ノシン生産能を有する菌株AJ11862（FERM−
P6492）（アルギニン要求性、ロイシン要求性、
アデニン要求性）を得た。さらにこのアデニン要
求株から同様の変異処理によつて誘導したグアノ
シン生産菌AJ11863（FERM−P6493）（アルギニ
シン要求性、ロイシン要求性、アデニン要求性、
８−アザグアニン耐性）、AJ11864（FERM−
P6494）（アルギニン要求性、ロイシン要求性、
アデニン要求性、デコイニン耐性）、AJ11865（ア
ルギニン要求性、ロイシン要求性、アデニン要求
性、８−アザグアニン耐性、デコイニン耐性）を
得た。 (1) 染色体DNAの調製 AJ11863、AJ11864、AJ11865を各々１の
「Bacto−Penassay Broth」（Difco社製）中で
30℃、約２時間振盪培養を行い、対数増殖期の
菌体を集菌後、通常のDNA抽出法（J.
Bacteriol.，89，1065（1965））により染色体
DNAを抽出、精製し、最終AJ11863から2.9
mg、AJ11864から3.6mg、AJ11865から3.3mgを
得た。 (2) 染色体DNA断片のベクターへの挿入 プリンアナログ耐性又はデコイニン耐性を支
配する遺伝子領域をクローニングするため、そ
のベクターとして自律増殖性のプラスミド
pUB110（カナマイシン耐性、ネオマイシン耐
性を発現する）を用いた。(1)で用いた染色体
DNAを各々5μｇずつとプラスミドpUB110 5μ
ｇずつをそれぞれ制限エンドヌクレアーゼ
EcoRIを37℃にて60分作用させてDNA鎖を切
断した。65℃で10分間熱処理後、各両反応液を
混合し、ATPおよびジチオスライトール存在
下、T₄フアージ由来のDNAリガーゼにて10℃
にて24時間、DNA鎖の連絡反応を行なつた。 (3) 組換えプラスミドDNAによる形質転換バチ
ルス・ズブチリスAJ11862を「Penassay−
Broth」（Difco社製）に接種して30℃で１晩振
とう培養を行ない、第１培養培地（グルコース
5g／、（NH₄）₂SO₄ 2g／、KH₂PO₄
6g／、K₂HPO₄ 14g／、MgSO₄・7H₂Ｏ
0.2g／、クエン酸ナトリウム1g／、酵母
エキス2g／、Ｌ−アルギニン250mg／、Ｌ
−ロイシン50mg／、アデニン50mg／を含
む）に接種し、37℃にて４時間振盪培養を行な
つた後、さらに第培養培地（グルコース
5g／、（NH₄）₂SO₄ 2g／、KH₂PO₄
6g／、K₂HPO₄ 6g／、K₂HPO₄ 14g／
、MgSO₄・7H₂Ｏ 1.2g／、クエン酸ナト
リウム1g／、酵母エキス0.2g／、Ｌ−アル
ギニン50mg／、Ｌ−ロイシン５mg／、アデ
ニン50mg／を含む）へ接種し、37℃にて1.5
時間振盪培養を行なうことによつて、いわゆる
コンピテントな（DNA取込能を有する）細胞
を調製した（参考文献 J.Bacteriol.，81，741
（1961））。このコンピテント細胞懸濁液に(2)で
得たDNA溶液を各々、別々に加えて37℃でさ
らに２時間振盪培養を行なつて形質転換反応を
完了させた。 次に菌株AJ11862のDNA形質転換株を含む
懸濁液をカナマイシン5μｇ／ml、８−アザグ
アニン100μｇ／ml含有する最小培地（最小培
地）、カナマイシン5μｇ／ml及びデコイニン
含有する最小培地（最小培地）、カナマイシ
ン5μｇ／ml及び８−アザグアニン100μｇ／ml
及びデコイニン1000μｇ／ml含有する最小培地
（最小培地）のプレート上に塗沫し37℃で培
養した。（最小培地はグルコース5g／、
（NH₄）₂SO₄ 2g／、KH₂PO₄ 6g／、K₂
HPO₄ 14g／、MgSO₄・7H₂Ｏ 0.2g／、
クエン酸ナトリウム1g／、Ｌ−アルギニン
100mg／、Ｌ−ロイシン100mg／、アデニン
50mg／及び寒天20g／、（PH7.2）の組成を
有するものである。培養３日後には上記最小培
地上に４個のコロニーが、最小培地上に３
個のコロニーが、最小培地上に５個のコロニ
ーがそれぞれ出現したので、これらを釣菌し各
クローンをそれぞれ純粋に分離した。 得られた形質転換株の性質はいずれもアルギ
ニン要求性、ロイシン要求性、アデニン要求
性、カナマイシン耐性を有し、かつ最小培地
から得られた形質転換株は８−アザグアニン耐
性、最小培地から得られた形質転換株はデコ
イニン耐性、最小培地から得られた形質転換
株は８−アザグアニン耐性及びデコイニン耐性
の性質をそれぞれ併せもつ菌株であつた。 このようにして最小培地上のクローン
AJ11866（FERM−P6496）、最小培地上のク
ローンAJ11867（FERM−P6497）、最小培地
上のクローンAJ11868（FERM−P6498）を得
た。 (4) 組換えプラスミドDNAの抽出 AJ11868を用いてC.I.Kadoらの方法（J.
Bacteriol.，145，1365（1981））に基づいた
DNA抽出法により各々別々に菌体DNAを抽出
し、アガロース電気泳動によつてプラスミド
DNAと染色体DNAを分離し、プラスミド
DNA区分を各々分画、採取し、精製した。得
られたプラスミドを(3)で述べたのと同様の方法
によつてAJ11865へ形質転換法により再導入
し、対応するカナマイシン耐性株AJ11869
（FERM−P6499）を得た。 (5) グアノシンの生産 AJ11862、AJ11863、AJ11864、AJ11865、
AJ11866、AJ11867、AJ11868、AJ11869を培
養した結果を第１表に示す。培養方法は500ml
容肩付フラスコにグアノシン生産培地（グルコ
ース80g／、NH₄NO₃15g／、KH₂PO₄
0.2g／、MgSO₄・7H₂Ｏ 0.4g／、
FeSO₄・7H₂Ｏ 10mg／、MnSO₄・7H₂O10
mg／、CaCl₂・2H₂Ｏ 2g／、アデニン200
mg／、大豆蛋白加水分解液40mg／、アルギ
ニン100mg／、ロイシン100mg／及びＬ−グ
ルタミン酸10g／を含みPH6.5にKHOで調製
した。）を20mlずつ分注し、115℃で10分間加圧
殺菌した後、予め斜面培地で培養して得た各種
菌体を接種後、34℃で３日間振盪培養を行つ
た。

【表】

【表】

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. バチルス属のプリンアナログ耐性又はデコイニ
   ン耐性を有する変異株の染色体遺伝子より得たプ
   リンアナログ耐性又はデコイニン耐性に関与する
   遺伝子領域が組み込まれているベクターをバチル
   ス属のアデニン要求性変異株に含有せしめたグア
   ノシン生産性微生物を培養し、培地中に蓄積され
   たグアノシンを採取することを特徴とするグアノ
   シンの製造法。