PL205348B1

PL205348B1 - Nieprzetrwalnikujący szczep Bacillus subtilis, sposób wytwarzania nieprzetrwalnikującego szczepu Bacillus subtilis, zastosowanie nieprzetrwalnikującego szczepu Bacillus subtilis i sposób wytwarzania biologicznie przygotowanego preparatu

Info

Publication number: PL205348B1
Application number: PL370064A
Authority: PL
Inventors: Pertti Koski; Susanna Kaariainen
Original assignee: Ipsat Therapies Oy
Priority date: 2001-11-06
Filing date: 2002-11-05
Publication date: 2010-04-30
Also published as: CA2465828C; WO2003040352A9; JP2005508184A; NZ532865A; CA2465828A1; PL370064A1; US20050158843A1; HUP0402070A3; FI20012143L; US7319030B2; EP1451292A1; AU2002340536B2; EP1451292B1; JP5486142B2; ES2452292T3; AU2002340536C1; WO2003040352A1; HUP0402070A2; FI112666B; FI20012143A0

Description

Opis wynalazku

Zakres wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest nieprzetrwalnikujący szczep Bacillus subtilis, sposób wytwarzania nieprzetrwalnikującego szczepu Bacillus subtilis, zastosowanie nieprzetrwalnikującego szczepu Bacillus subtilis i sposób wytwarzania biologicznie przygotowywanego preparatu.

Tło wynalazku

Bakterie z rodzaju Bacillus są stosowane na szeroką skalę w produkcji różnych ważnych w przemyśle enzymów. Najważniejszymi gospodarzami produkcyjnymi, których się wykorzystuje jako produkujących proteazy i amylazy są B. amyloliquefaciens i B. licheniformis. Procesy przemysłowe prowadzą do otrzymania znacznych ilości masy bakteryjnej, która musi ulec inaktywacji przed usunięciem do środowiska naturalnego, zwłaszcza jeśli te bakterie są genetycznie zmodyfikowane. Zniszczenie przetrwalnikujących komórek produkcyjnych wymaga znacznie intensywniejszej obróbki niż w przypadku komórek nieprzetrwalnikują cych. Przetrwalniki Bacillus znoszą ciepł o znacznie lepiej niż komórki wegetatywne i dlatego inaktywacja ich wymaga wyższych temperatur oraz dłuższych czasów ekspozycji. Zwiększa to koszty sprzętu i jego obsługi w procesie produkcji. W związku z powyższym, pożądane jest użycie nieprzetrwalnikującego szczepu Bacillus. Niniejszy wynalazek dostarcza rozwiązania problemu przetrwalników, co znacząco usprawnia wykorzystanie B. subtilis jako organizmu produkcyjnego.

Tworzenie przetrwalników jest wieloetapowym (od I do VII) procesem zapoczątkowanym w okreś lonych warunkach wzrostu powstaniem pre-przetrwalnika wewną trz komórki macierzystej. Ostatecznie, komórka macierzysta umiera a dojrzały przetrwalnik jest uwalniany na zewnątrz. Przetrwalnik wytrzymuje suszę i podwyższoną temperaturę lepiej niż komórka macierzysta, co zapewnia bakteriom przeżycie w niekorzystnych warunkach. W korzystnych warunkach, przetrwalnik ulega aktywacji i rozpoczęty zostaje podział komórek bakteryjnych. Dzięki mutacjom wpływającym na tworzenie przetrwalników w chwili obecnej znane jest ponad 125 genów wpływających na powstawanie przetrwalników (Stragier i Losick, 1996).

Produkcja białek przy użyciu bakterii Bacillus pozbawionych zdolności do produkcji przetrwalników została przykładowo opisana w WO97/03185, gdzie opisano uniknięcie przetrwalnikowania poprzez mutowanie genów odpowiedzialnych za ten proces. Publikacja opisuje gen przetrwalnikowania spollAC z Bacillus licheniformis. Delecję wykonano poprzez zastosowanie temperaturo-wrażliwego plazmidu, do którego wprowadzono produkt PCR przygotowany techniką SOE (składanie nakładających się odcinków), w którym regiony zlokalizowane po obu stronach genu spollAC zostały połączone tak, aby znajdujący się w środku gen spollAC został usunięty.

Technikę SOE opisano przykładowo w opisie patentowym St. Zjedn. Am, 5,023,171. Struktura delecjna może zostać wprowadzona in vitro do komórki bakteryjnej za pomocą plazmidu, zaś replikacji pustego plazmidu można zapobiec poprzez zwiększenie temperatury, prowadząc do ujawnienia się obecności rekombinowanych bakterii z plazmidem wstawionym do chromosomu. Delecja wybranego genu następuje w chwili, gdy plazmid odłącza się od chromosomu w określony sposób. We wspomnianej publikacji WO, autorom nie udało się wydelegować genu spollAC z B. subtilis. Rekombinacja na poziomie odłączania się plazmidu zawsze zachodziła w taki sposób, że gen spollAC pozostawał niezmieniony.

Nieprzetrwalnikujące szczepy B. subtilis opisano również gdzie indziej: EP 164,117 opisuje szczep B. subtilis z mutacją w genie spollA, EP 492,274 opisuje szczep B. subtilis z mutacją w genie spollD, zaś US 4,450,235 i US 4,450,236 obejmuje szczep B. subtilis z delecja w genie spoOA. Wspomniane geny są związane z II etapem przetrwalnikowania, bądź z etapem wcześniejszym.

Jeden ze znanych genów następnego etapu przetrwalnikowania stanowi gen sigG (=spolllG) kodujący czynnik sigma-G, wiążący się z polimerazą RNA, która w dalszej kolejności wiąże się z promotorem pewnych genów przetrwalnikowania w pre-przetrwalniku. Czynnik sigma G jest niezbędny na trzecim etapie przetrwalnikowania i kontroluje transkrypcję co najmniej 19 genów (Ishii i wsp., 2001). Produkty genów związanych z systemem kontroli sigma-G zwiększają zdolność do przeżycia i dojrzewania przetrwalników (Haldenwang, 1995).

Fougler i Errington (1989) opisali szczep B. subtilis 646 będący spontanicznym mutantem sigG. Mutacja ta znajduje się poza promotorem i pierwszymi 30 kodonami. Informację tą uzyskano na podstawie aktywnej fuzji spolllG-lacZ wstawionego do chromosomu. W przypadku tego rodzaju spontanicznych lub przypadkowych mutacji, lokalizacja lub dokładny mechanizm mutacji jest zazwyczaj niePL 205 348 B1 znany. Możliwość odwrócenia mutacji, tj. przywrócenie przetrwalnikowania nie może być kontrolowane, zaś częstotliwość różnych mutacji supresorowych jest również wysoka. Ponieważ lokalizacja mutacji jest nieznana, zazwyczaj niemożliwe jest poznanie zmienionego białka. Dodatkowo, mutacja w innym genie moż e, przykł adowo, zahamować efekt mutacji oryginalnej. Dokonano również wiele prób inaktywacji genu sigG poprzez wprowadzanie insercji. Przykładowo, Illing i wsp. (1990), sklonowali fragment Hindlll-Pstl o wielkości 320 pz z genu sigG do plazmidu integrującego i w wyniku integracji otrzymali nieprzetrwalnikujący szczep B. subtilis N15 (trpC2 spoIIIG::pSGMU422). Jednakże, plazmid integracyjny odłączał się od chromosomu bez presji selekcyjnej chloramfenikolu, a w rezultacie ten typ szczepu nie nadawał się na szczep produkcyjny.

Karmazyn-Campelli i wsp. (1989) opisali inaktywację genu sigG poprzez wstawienie 1.5-kb kasety odporności na chloramfenikol (cat) pomiędzy kodonami 166 a 167 (spoIIItG::cat). Insercja została wykonana w taki sposób, aby gen sigG pozostał na chromosomie. Tym samym, istnieje zagrożenie wystąpienia mutacji odwrotnej. Chociaż szczep inaktywowany za pomocą insercji cat nie może podlegać rekombinacji, delecja może przywrócić aktywność genu sigG, a tym samym przywrócić normalne przetrwalnikowanie.

Karmazyn-Campelli i wsp. (1989) wydeletowali następnie fragment genu sigG o długości 70 par zasad, pomiędzy kodonami 18 i 42. Wpływ tej delecji (spoIIIGAl) na przetrwalnikowanie pozostaje jednak niejasny, ponieważ podczas delecji pomiędzy wspomnianymi kodonami pojawia się dodatkowy fragment Haelll o długości 18 par zasad, pochodzący z pUC8 użytego jako wektor do klonowania. Ten dodatkowy fragment zawiera na samym początku kodon stop, a zatem nie ma pewności czy delecja 70 par zasad wystarcza do zatrzymania przetrwalnikowania. Bez tego dodatkowego fragmentu, po delecji mógłby powstać częściowo funkcjonujący czynnik sigma, zwłaszcza jeśli delecja nie obejmuje regionów mających znaczenie podczas wiązania z docelowymi promotorami. Innymi słowy, nie jest pewnym czy inaktywacja genu sigG została spowodowana delecją czy zaledwie obecnością dodatkowego kodonu stop.

Kim J.-H. i wsp. 2001 opisali mutanta B. subtilis z delecja genu spoIIIG. Omawiana delecja obejmowała tylko jeden nukleotyd i znajdowała się poza funkcjonalnymi regionami genu (gen sigG, wydeletowany nukleotyd 397, tymidyna (T)). Za miejscem delecji wprowadzono blok oporności na kanamycynę (kana^r). W ten sposób powstałe mutanty miały zredukowaną zdolność do przetrwalnikowania ale nie ma żadnych informacji na temat stabilności szczepu. Jednakże, częstotliwość rewersji nukleotydu jest wysoka, a zatem tego rodzaju szczepu nie poleca się jako gospodarza do produkcji obcych białek.

Opublikowane wcześniej badania zazwyczaj obejmowały różne etapy przetrwalnikowania i skupiały się na mutacjach, nie kładąc nacisku na ich stabilność. W wyniku tego, żaden z przedstawionych mutantów sigG B. subtilis nie stanowił odpowiedniego szczepu produkcyjnego, dla którego wymagany jest brak przetrwalnikowania. Niniejszy wynalazek dostarcza w pełni nieprzetrwalnikującego, stabilnego szczepu B. subtilis, odpowiedniego do celów produkcyjnych. Dodatkowo, przetrwalnikowanie jest wyeliminowane w taki sposób, że nie ma ono żadnego niekorzystnego wpływu na wytwarzanie pożądanego produktu, bądź na jego właściwości.

Streszczenie wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest nieprzetrwalnikujący szczep Bacillus subtilis, który charakteryzuje się tym, że z jego genu sigG wydeletowano co najmniej 150 nukleotydów.

Delecja ta korzystnie obejmuje co najmniej część jednego z regionów funkcjonalnych genu sigG, które kodują aminokwasy 67 do 80 lub 229 do 248 białka sigG. Możliwa jest także taka delecja, która obejmuje co najmniej część obu regionów funkcjonalnych genu sigG. W najkorzystniejszej odmianie wynalazku ze szczepu B. subtilis jest wydeletowany cały gen sigG.

W innym korzystnym rozwiązaniu w szczepie Bacillus subtilis według wynalazku gen markera selekcyjnego jest wstawiony do miejsca delecji, a bardziej korzystnie powyżej tego genu markera selekcyjnego znajduje się co najmniej 20-nukleotydowy nakładający się region, który jest homologiczny z co najmniej 20 nukleotydowym nakładającym się regionem poniżej genu markera selekcyjnego.

W bardziej korzystnym wykonaniu wynalazku Szczep B. subtilis zawiera Seq. ID Nr 9.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania nieprzetrwalnikującego szczepu Bacillus subtilis, charakteryzujący się tym, że deletuje się co najmniej 150 nukleotydów z genu sigG szczepu Bacillus subtilis.

W bardziej korzystnym rozwiązaniu z genu sigG deletuje się co najmniej część jednego z regionów funkcjonalnych genu sigG kodujących aminokwasy 67 do 80 lub 229 do 248 białka sigG, lub

PL 205 348 B1 jeszcze bardziej korzystnie z genu sigG deletuje się co najmniej oba wspomniane regiony funkcjonalne genu sigG.

W kolejnym korzystnym rozwiązaniu sposobu według wynalazku za pomocą techniki SOE przygotowuje się wstawki zawierające regiony flankujące genu podlegającego delecji oraz gen markera selekcyjnego; transformuje się podlegający delecji szczep B. subtilis za pomocą wspomnianej wstawki i selekcjonuje się transformanty, w których wstawka zosta ł a wintegrowana do chromosomu bakterii, w taki sposób, że pożądany region genu zostaje wydeletowany.

W innej jeszcze odmianie sposobu według wynalazku za pomocą techniki SOE przygotowuje się liniową wstawkę DNA, która zawiera gen markera selekcyjnego pomiędzy regionami flankującymi region genu podlegający delecji; transformuje się szczep B. subtilis podlegający delecji za pomocą tej wstawki i następnie dokonuje się selekcji transformantów, w których wstawka została wintegrowana w wyniku podwójnej rekombinacji homologicznej, przez co pożądany region genu zostaje wydeletowany.

Korzystnie w technice SOE stosuje się startery mające co najmniej około 20-nukleotydowe regiony nakładające się.

W następnym korzystnym rozwiązaniu sposobu według wynalazku stosuje się liniową wstawkę DNA posiadającą przed genem markera selekcyjnego co najmniej 20 nukleotydowy region nakładający się, który jest powtórzony za genem markera selekcyjnego lub ewentualnie stosuje się liniową wstawkę DNA, w której region flankujący powyżej regionu podlegającego delecji, gen markera selekcyjnego oraz region flankujący poniżej regionu podlegającego delecji są zasadniczo tej samej długości.

W bardziej korzystnej realizacji stosuje się liniową wstawkę DNA o długości 3 kb.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie nieprzetrwalnikującego szczepu Bacillus subtilis zdefiniowanego powyżej, jako organizmu produkcyjnego. Nieprzetrwalnikujący szczep Bacillus subtilis stosuje się według wynalazku do produkcji rekombinowanego polipeptydu.

Korzystnie nieprzetrwalnikujący szczep Bacillus subtilis stosuje się do produkcji β-laktamazy.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania biologicznie przygotowywanego preparatu, który polega na tym, że produkt wytwarza się przy zastosowaniu nieprzetrwalnikującego szczepu Bacillus subtilis zdefiniowanego powyżej.

W sposobie tym szczep Bacillus subtilis według wynalazku jest transformowany DNA kodującym pożądany polipeptyd i to DNA ulega w nim ekspresji a powstający rekombinowany polipeptyd jest odzyskiwany. Korzystnie w sposobie tym produkowanym polipeptydem jest β-laktamaza.

Wynalazek opisuje nieprzetrwalnikujący szczep B. subtilis, który charakteryzuje się tym, że co najmniej 150 nukleotydów zostało wydeletowane z genu sigG. Przedstawiona w opisie delecja jest pierwszą mutacją, dla której bezdyskusyjnie można wykazać wpływ delecji sigG na zahamowanie przetrwalnikowania. Co więcej, w przypadku delecji genu trudno jest wykazać wpływ delecji na inne funkcje organizmu lub na jego zdolność do przeżywania jako całości. Niniejszy wynalazek pokazuje, że delecja genu sigG nie wpływa na inne istotne funkcje bakterii, takie jak zdolność do produkcji rekombinowanych polipeptydów.

Krótki opis rycin

Rycina Fig. 1 stanowi schemat delecji genu sigG, Fig. 2 przedstawia sekwencję nukleotydową regionu delecji nieprzetrwalnikującego szczepu B. subtilis RS303, Rycina Fig. 3 przedstawia wzrost (----) przetrwalnikującego (RS201) i nieprzetrwalnikującego (RS310) szczepu B. subtilis oraz produkcję (—) β-laktamazy (BLP) w 100-ml hodowli wytrząsanej.

Szczegółowy opis wynalazku

B. subtilis według wynalazku został utworzony jako nieprzetrwalnikujący poprzez usunięcie znacznego fragmentu genu sigG, co w niniejszym kontekście oznacza co najmniej około 150, a korzystnie 300 nukleotydów. Gen sigG ma co najmniej dwa regiony funkcjonalne, tj. regiony ważne dla aktywności białka, z których jeden koduje domenę prawdopodobnie wiążącą się z rdzeniem fragmentu polimerazy RNA i rozciąga się od aminokwasu nr 67 do aminokwasu nr 80. Domena ta została zdefiniowana poprzez porównanie sekwencji aminokwasowej czynnika sigma-G B. subtilis z innymi, znanymi sekwencjami czynnika sigma. Kolejny ważny region funkcjonalny stanowi motyw H-T-H (helisaskręt-helisa) obecny w białkach wiążących DNA, został zdefiniowany na podstawie podobieństwa i obejmuje aminokwasy 229 do 248 białka SigG. Region korzystny do delecji znajduje się w regionach pomiędzy nukleotydami kodującymi aminokwasy nr 67 i 248 białka SigG. Bardziej korzystnie, delecja jest zlokalizowana w taki sposób, że zawiera co najmniej część jednego z dwóch funkcjonalnych rePL 205 348 B1 gionów genu sigG, aminokwasy od 67 do 80 lub 229 do 248 białka sigG, odpowiednio oraz w szczególności, delecja obejmuje co najmniej część obu wspomnianych regionów funkcjonalnych genu sigG. Alternatywnie, delecja może również być zlokalizowana pomiędzy regionami funkcjonalnymi w taki sposób, że ekspresja jednego z nich jest wstrzymana a/lub odległość pomiędzy nimi zmienia się w obrębie cząsteczki natywnej czynnika-G w taki sposób, że wiązanie czynnika G do polimerazy RNA oraz DNA jest wstrzymane. Według jednego z wykonań, co najmniej 600, a w szczególności co najmniej 670 nukleotydów ulega delecji z genu sigG. Korzystne jest wydeletowanie, przykładowo, 39 do 715 nukleotydów. Możliwe jest również wydeletowanie całego genu sigG oraz regionu promotora tego genu.

Gen sigG może zostać usunięty na wiele sposobów. Korzystnie, wstawka jest przygotowywana techniką SOE (składanie genów przez nakładające się odcinki) co oznacza, że fragmenty wymagane do insercji są w pierwszej kolejności amplifikowane za pomocą reakcji PCR, do której startery są projektowane tak, aby fragmenty amplifikowane w reakcji PCR mogły być ligowane podczas drugiej reakcji PCR przy użyciu sekwencji komplementarnej, tj. regionu nakładającego się. Stosowana wstawka zawiera flankujące regiony genu, który będzie wydeletowany i zawiera co najmniej jeden gen markera selekcyjnego. Region flankujący wspomniany w niniejszym opisie odnosi się do nie podlegających usunięciu regionów przylegających powyżej i poniżej części wydeletowanej. Gen markera selekcyjnego jest genem kodującym jakikolwiek marker selekcyjny, taki jak enzym, który związany jest z powstawaniem specyficznego metabolitu lub oporności na antybiotyk.

Przygotowywana wstawka może stanowić albo plazmid albo korzystnie, liniowy DNA. W ostatnim przypadku, marker selekcyjny znajduje się pomiędzy regionami flankującymi. Następnie, B. subtilis jest transformowany za pomocą tej wstawki, tj. „kasety wymiennej, której końce są homologiczne z regionami flankującymi wydeletowany gen. W wyniku dwóch jednoczesnych „crossing-over pomię dzy regionami homologicznymi, wstawka integruje się z chromosomem bakterii w miejscu wydeletowanego genu sigG. Delecja przy użyciu tego rodzaju podwójnej homologicznej rekombinacji została opisana przykładowo w patencie St. Zjedn. Am. 4,963,487. Gen markera selekcyjnego zastępuje wydeletowany region genu sigG. Pożądane transformanty, z których usunięto gen sigG mogą być następnie wyszukiwane poprzez poddawanie bakterii presji selekcyjnej określonej genem markera selekcyjnego. Nieprzetrwalnikujące bakterie według wynalazku są stabilne i nie mogą odzyskać zdolności do sporulacji nawet jeśli wstawiony gen markera selekcyjnego ulegnie delecji z chromosomu.

Opisana powyżej delecja genu sigG została bardziej szczegółowo opisana na Fig. 1 i zostanie przedstawiona w szczegółach. Trzy produkty DNA, AB, CD i EF zostały przygotowane przy użyciu reakcji PCR i starterów A, B, C i D, oraz E i F, odpowiednio. Produkty AB i EF zostały przykładowo przygotowane z chromosomalnego DNA B. subtilis, zaś produkt CD z odpowiedniego plazmidu. AB zawiera region flankujący (koniec spoIIGA i sigE) powyżej genu sigG, zaś EF zawiera region flankujący (początek ylmA) poniżej genu sigG. Produkt CD zawiera marker selekcyjny, w tym przypadku gen oporności na chloramfenikol (cat) otrzymany z plazmidu pHV14 (Ehrlich, 1978) lub pC194 (Horinouchi i Weisblum, 1982). Startery uż yte w PCR są dobrane w taki sposób, ż e otrzymane produkty PCR: AB, CD i EF mogą zostać zligowane za pomocą częściowej komplemetarności sekwencji. Startery B i C oraz startery D i E są częściowo komplementarne. Trzy produkty PCR mogą zostać zligowane w dwóch etapach. Według Fig. 1, zligowane zostają najpierw AB+CD oraz CD+EF, a następnie ligowane są produkty AD oraz CF przy użyciu homologicznych regionów o długości produktu CD w celu otrzymania pożądanej wstawki AF, zawierającej (w kolejności 5' > 3') region flankujący gen sigG (na przykład, sigE), gen odporności na chloramfenikol (cat) oraz drugi region flankujący (początek ylmA) genu sigG. Odpowiednia wstawka może zostać alternatywnie skonstruowana poprzez przygotowanie w pierwszej kolejności AD, i zligowanie z produktem EF, lub poprzez przygotowanie CF i zligowanie z produktem AB. B. subtilis są następnie transformowane za pomocą otrzymanej wstawki AF, zaś pożądane transformaty są identyfikowane w obecności chloramfenikolu.

Powyżej opisane startery mogą również zostać zaprojektowane w taki sposób, aby region nakładający się powyżej genu markera selekcyjnego był homologiczny z regionem nakładającym się poniżej genu markera selekcyjnego. Pozwala to na delecję wstawionego genu cat z regionu delecji. Delecja genu cat może przebiegać w taki sposób, że produkty AB i EF są ligowane za pomocą reakcji PCR przy użyciu regionu nakładającego się celem powstania produktu ABEF to jest takiego produktu stosowanego w transformacji powyższego SigG, Cat⁺ w celu wydeletowania genu cat w transformancie. Wspomniane homologiczne regiony nakładające się pozwalają również na delecję genu cat za pomocą rekombinacji homologicznej przy użyciu regionów nakładających się w sekwencji.

PL 205 348 B1

Przy projektowaniu starterów wykorzystywanych w technice SOE postępuje się zgodnie z ogólnymi zasadami przedstawionymi w Sambrook i Russell (2001). Szczególną uwagę należy zwrócić na to, aby fragmenty DNA ulegały połączeniu, zaś regiony nakładające się miały co najmniej 20 do 25 nukleotydów w celu zapewnienia dostatecznie wysokich temperatur przyłączania starterów PCR a tym samym, wysokiej specyficzności (McPherson i Moller, 2000). Krótsze nakładające się regiony o długości około 15 nukleotydów mogą zostać użyte w sytuacji, gdy mniej złożone DNA, takie jak plazmid, jest używane jako matryca zamiast chromosomalnego DNA. W przypadku gdy stosowane są startery syntetyczne, ich maksymalna długość może wynosić około 100 nukleotydów, zgodnie z niniejszą techniką. Jako startery mogą również zostać użyte fragmenty DNA denaturowane do postaci jednoniciowej oraz wykonane przy użyciu PCR lub cięte enzymami restrykcyjnymi bądź mechanicznie z wielkocząsteczkowego DNA, choć w tym przypadku maksymalna długość starterów nie może zostać dokładnie zdefiniowana i może wynosić nawet kilkaset tysięcy nukleotydów. Powodzenie w użyciu fragmentów DNA do delecji zależy również od czystości produktów PCR-u. Jeśli gen lub jego część ma ulec delecji, ważne jest aby końcowa reakcja PCR dla produktu SOE nie zawierała matrycy zastosowanej na samym początku, w której kompletny gen jest nienaruszony.

W B. subtilis ma miejsce wydajna rekombinacja pomię dzy chromosomem a homologicznym regionem DNA w plazmidzie. Uważa się, że do integracji wystarczające jest 150 par zasad z homologicznego DNA w plazmidzie, nie ulegających replikacji w B. subtilis, (Ferrari i Hoch, 1989). Khasanov i wsp. (1992) użyli plazmidu z termowrażliwym replikonem i pokazali, że 70 nukleotydów wystarcza do integracji zachodzącej podczas rekombinacji homologicznej. Powyżej wspomniane plazmidy integrowały z chromosomem na drodze pojedynczego crossing-over, w przeciwieństwie do liniowego DNA, którego integracja zachodzi jednocześnie w dwóch miejscach. W trakcie transformacji DNA wyprodukowanym techniką SOE, regiony homologiczne powinny być dłuższe niż 70 do 150 nukleotydów, aby możliwe było wykrycie integracji fragmentu SOE z chromosomem odpowiednimi metodami transformacji. Region homologiczny z regionami flankującymi gen podlegający delecji z liniowej wstawki DNA zawiera co najmniej kilkaset par zasad lub nawet co najmniej tysiąc par zasad.

Maksymalna długość regionu homologicznego jest określana głównie na podstawie właściwości polimerazy DNA wykorzystywanej do reakcji PCR. Obecne enzymy do PCR mogą powielać fragmenty DNA o długości kilkudziesięciu tysięcy par zasad, jednak wraz z długością powstających fragmentów DNA rośnie prawdopodobieństwo wystąpienia mutacji. Praktyczna maksymalna długość regionu homologicznego wynosi około 5 tysięcy par zasad (kb). Zaleca się, aby region flankujący powyżej wydeletowanego regionu wstawki DNA, gen markera selekcyjnego oraz region flankujący poniżej wydeletowanego regionu były zasadniczo tej samej długości. Bardziej korzystnie, długość regionu homologicznego wynosi około 1 kb, zaś długość całej wstawki liniowej wynosi około 3 kb.

Delecja genu może być również wykonana za pomocą dwuetapowej rekombinacji homologicznej. Metodę opisano dla Lactococcus lactis (Biswas i wsp., 1993), oraz genu spoIIAC B. licheniformis, który jest deletowany tą samą metodą (W097/03185). W obu przypadkach użyte mogą zostać plazmidy, których replikacja jest temperaturowrażliwa oraz obecny jest marker oporności na antybiotyki. Regiony flankujące regionu podlegającego delecji są w pierwszej kolejności sekwencyjnie wstawiane w tym samym kierunku do plazmidu, np. pE194, w sposób odpowiedni dla B. subtilis. Plazmid jest transformowany do bakterii kompetentnych w temperaturze 32°C, pozwalającej na replikację, zaś otrzymane transformanty są hodowane w 45°C, w której tylko bakterie z integracją w chromosomie mogą rosnąć na podłożu z chloramfenikolem. W wyniku integracji, powstają dwie pary homologicznych regionów w chromosomie, pomiędzy którymi może zajść druga rekombinacja, w wyniku której transformaty rosną bez chloramfenikolu w 32°C. Rekombinacja pomiędzy jedną parą homologiczną prowadzi do zarówno uwolnienia plazmidu, jak i delecji regionu pomiędzy homologicznymi regionami plazmidu i chromosomu. Długość wykorzystywanych regionów homologicznych może wynosić od 70 do 2500 par zasad. W opisanym sposobie możliwe jest wykonanie kilku kolejnych delecji z tego samego szczepu, ponieważ w chromosomie nie pozostają żadne elementy dodatkowe, np. antybiotykowy marker selekcyjny.

W dalszej kolejnoś ci, pożądana delecja moż e zostać wykonana przy uż yciu dwóch homologicznych regionów w plazmidzie. Struktura delecji, która obejmuje regiony flankujące po obu stronach delecji oraz marker selekcyjny pomiędzy nimi może zostać wstawiona do plazmidu, który nie ulega replikacji w B. subtilis (np. pJH1O1) lub, którego replikacja zależy od temperatury (pE194). Otrzymany plazmid jest transformowany do bakterii kompetentnych i wyszukiwane są oporne transformanty. MePL 205 348 B1 tody te wymagają zazwyczaj użycia dwóch markerów selekcyjnych w celu rozróżnienia transformatów, w których rekombinacja zaszł a poprzez jeden region homologiczny, nie zaś przez obydwa.

Niezarodnikująca bakteria B. Subtilis, z której usunięto gen sigG, jest szczepem odpowiednim do produkcji różnych preparatów biologicznych. Preparat biologiczny jest to związek produkowany przez organizm i zazwyczaj posiadający aktywność biologiczną. Produkt ten jest korzystnie wydzielany na zewnątrz komórki. Produkt może stanowić zarówno produkt naturalny jak i produkt wytworzony w wyniku działań inżynierii genetycznej. Inż ynieria genetyczna moż e również być użyta do zmiany szlaków metabolicznych lub wprowadzenia nowych enzymów do bakterii w taki sposób, aby dochodziło do akumulacji istniejących lub całkowicie nowych metabolitów, a ich izolacja była ułatwiona.

Przygotowane produkty mogą stanowić polipeptydy, które są przykładowo przeznaczone do celów medycznych, takich jak polipeptydy bakteryjne (β-laktamazy), ssacze substancje transmiterowe, takie jak hormony peptydowe i interferony. Niezarodnikujące szczepy są również korzystne do produkcji enzymów przemysłowych, takich jak proteazy, amylazy, pullulanazy, ksylanazy, pektynazy, β-laktamazy, izomerazy ksylozy i betaglukanazy. Dodatkowo, możliwa jest produkcja cukrów, nukleozydów, aminokwasów, witamin, kwasów oraz surfaktantów, tj. lipopeptydów lub lipidów ramnozowych, zmniejszających napięcie powierzchniowe.

Według jednego z wykonań, DNA kodujący pożądany polipeptyd, taki jak β-laktamaza, jest wstawiany do niezarodnikującego szczepu B. subtilis, następnie DNA ulega w komórce ekspresji, a otrzymany polipeptyd jest odzyskiwany z komórki lub podłoża wzrostowego. Wprowadzenie DNA wymaganego do ekspresji pożądanego polipeptydu lub metabolitu może zostać wykonane za pomocą techniki, np. transformacji metodą naturalnej kompetencji lub elektroporacji, lub jakąkolwiek metodą odpowiednią dla bakterii B. subtilis.

P r z y k ł a d

Szczepy bakterii i plazmidy

Właściwości szczepów bakteryjnych i plazmidów użytych w tym przykładzie są podane w tabeli 1. Sekwencja genu 168 sigG B. subtilis 168 organizmu gospodarza oraz jej regiony flankujące została otrzymana z bazy danych (Micado database, http://locus/jouy.inra.fr). Region kodujący gen cat pochodzi z plazmidu pSJ2739E i jest identyczny z regionem plazmidu pC194 Staphylococcus aureus (GenBank accession no. V01277). Wektor produkcyjny pRSHIO stanowi plazmid kodujący β-laktamazę pen P z Bacillus licheniformis. We wspomnianym plazmidzie, pen P jest wstawiony w miejscu klonowania Hindlll wektora sekrecyjnego pKTH-141 (Lundstrom, 1985). Promotor α-amylazy wektora oraz fragment kodujący sekwencje sygnałową został otrzymany z bakterii Bacillus amyloliquefaciens.

T a b e l a 1. Szczepy bakteryjne i plazmidy

SZCZEP	REGION DELECJI	WŁAŚCIWOŚCI	MARKER SELECYJNY	PLAZMID	SELEKCJA
168		B. subtilis 168 szczep dziki^a
RS303	SigG	Niezarodnikujący	Cat		Cm
RS310	SigG	Niezarodnikujący	Cat	pRSHIO	Cm, Km;
RS201		B. subtilis 168 szczep dziki^a		pRSHIO	Km

^aRef. Kunst, F i wsp., 1997

Warunki hodowli

Szczepy bakteryjne hodowano w bulionie odżywczym Lurii (LB) (Harwood i Cutting, 1991), zawierającym 5 g/l wyciągu z drożdży (Difco), 10 g/l tryptonu (Oxoid) i 10g/l NaCI (Merck), z wytrząsaniem, +37°C, 250 rpm. W trakcie monitoringu produkcji białka, komórki hodowano w stężonym podłożu LB (10 g/l wyciągu z drożdży, 20 g/l tryptonu i 10 g/l NaCI). Do selekcji wzrostu bakteryjnego stosowano chloramfenikol (Cm) 5 μg/ml i kanamycynę (Km) 10 μg /ml.

Techniki DNA

Zastosowano konwencjonalne techniki DNA (Sambrook i wsp., 1989). Chromosomalne DNA izolowano według wskazówek Marmura (1961). Plazmidowe DNA izolowano z komórek bakteryjnych na kolumnie jonowymiennej (QIAGEN Plasmid Midi Kit) według wskazówek producenta (Qiagen Pla8

PL 205 348 B1 smid Purification Handbook July/1999). Inaczej, niż w instrukcjach, traktowanie lizozymowe było dodane do protokołu w celu degradacji warstwy peptydoglukanu, i w tym dodawaniu 1 mg/ml lizozymu dodano do buforu P1 i komórki inkubowano w +37°C przez 30 minut. Oczyszczony plazmid rozpuszczano w 30 do 100 μΐ sterylnej wody. Zawartość preparatów DNA wynosiła 50 do 500 ng/μΐ.

Testy zarodnikowania

Wpływ delecji sigG na zarodnikowanie badano hodując komórki bakteryjne w podłożu sporulacyjnym oraz ogrzewając komórki (+85°C, 10 min) (Harwood i Cutting, 1991). Zastosowane warunki zabijają komórki wegetatywne, lecz nie wystarczają do zabicia przetrwalników. Liczba kolonii wyrastających po zadziałaniu takich warunków oznacza liczbę przetrwalników.

Komórki bakteryjne w fazie logarytmicznej inokulowano 1:100 w podłożu sporulacyjnym (podłoże sporulacyjne Schaeffera, SS: 8 g podłoża wzrostowego, 1 g KCL, 0,12 g MgSO4x7H2O, 0,5 ml 1M NaOH, 1 ml Ca (NO3)2x4H2O, 1 ml 0,01 M MnCl2x4H2O, 1 ml 0,0001 M FeSO4 x7H2O) i hodowano przez 24 godziny (+37°C, 250 rpm). W celu wyliczenia gęstości wzrostu bakterii, wykonano seryjne rozcieńczenia (10^-1 do 10^-9) w buforze do rozcieńczeń (5 ml 0.1 M bufor K-foranowy, pH 7,4; 2,5 ml roztworu 1M KCI, 5 ml roztworu 10 mM MgSO4, 37,5 ml jałowej wody), a rozcieńczenia 10^-5 do 10^-9wysiewano na płytki LB (100 μl/płytkę). Płytki inkubowano przez noc w +37°C w cieplarce, liczbę kolonii przeliczano na mililitr. W celu określenia ilości przetrwalników, komórki poddawano działaniu wysokiej temperatury. Komórki podgrzewano przez 10 minut w +85°C w łaźni wodnej. Po szoku termicznym, komórki wysiewano na płytki LB. Płytki inkubowano przez 17 godzin w +37°C. Liczono liczbę kolonii wyrosłych na płytkach (na ml). W testach zarodnikowania, jako szczep kontrolny zastosowano dziki szczep 168 i poddawano go działaniu tych samych warunków co szczepy badane.

Przygotowanie delecji genu sigG

Delecji genu sigG dokonano poprzez transformację dzikiego szczepu B. subtilis 168 za pomocą liniowego rekombinowanego fragmentu DNA skonstruowanego przy użyciu PCR-u i techniki SOE (Horton i wsp., 1989, i US 5,023,171). Kolejność wykonania delecji przedstawiono na Fig. 1. Startery do reakcji PCR zaprojektowano w taki sposób, aby produkty PCR-u mogły zostać połączone w drugiej reakcji PCR przy użyciu sekwencji komplementarnej. Tabela 2 przedstawia startery użyte w reakcji PCR. W tabeli tej regiony wzajemnie komplementarne w starterach zaznaczono tłustym drukiem i podkreślono. Region komplementarny użyty w starterach jest regionem 20 nukleotydowym rozpoczynający się od nukleotydu 19 genu sigG. Starter B koduje ten region od kodonu startowego dla genu sigG. Startery B, D, C i E, są częściowo homologiczne, odpowiednio.

Tabela 2. Startery użyte w reakcjach SOE

A 5' CCGGAATTCGCTGTCGGCAGATGGAGAG3' (Seq. ID Nr 1)

B 5' GTATCCACCCCGCAGATTTCGACTTTATTTCTCGACAC3' (Seq. ID Nr 2)

C 5' GAAATCTGCGGGGTGGATACCCGGCAATAGTTACCCTT3' (Seq. ID Nr 3)

D 5' GTATCCACCCCGCAGATTTCCCTTCTTCAACTAACGGG3' (Seq. ID Nr 4)

E 5' GAAATęTGCGGGGTGGATACCTCAAGCGCAGGTGTCCA3' (Seq. ID Nr 5)

F 5' CCGGAATTCGCACCCCTAGGATGAATCT3' (Seq. ID Nr 6)

W mieszaninie reakcyjnej PCR (100 μθ, użyto od 20 do 50 ng DNA jako matrycy, 30 pmola każdego startera, 0,2 mM dNTP (Boehringer Mannheim GmbH, Niemcy), 0,5 μl enzymu wydłużającego, (Expand enzyme, Boehringer Mannheim GmbH, Niemcy) i 10 μl 10xeExpand buffer. Na wierzch mieszaniny odpipetowywano 50 μl oleju mineralnego, a reakcje przeprowadzano przy użyciu urządzenia PTC-100 Programmable Thermal Controller (MJ Research, Inc.). Reakcje PCR przeprowadzono przy użyciu programu składającego się z etapu denaturacji (94°C, 4 min) oraz dwóch kolejnych cykli (94°C, 1min; 50°C, 45 s; 72°C, 4 min) i 26 cykli (94°C, 1 min; 70°C, 45 s; 72°C, 4 min), po których następowała 10 minutowa inkubacja w 72°C. Temperatury przyłączania optymalizowano dla każdej reakcji. Końcowe produkty PCR-u oczyszczano z mieszaniny reakcyjnej (zestaw Qiagen Giaquick PCR purification, Qiagen GmbH, Niemcy) zgodnie z instrukcjami producenta (QIAquick Spin Handbook/kwiecień 2000) i rozcieńczano wodą (50 μ^. Końcowe stężenie DNA oczyszczonego produktu wynosiło 30 do 50 ng/μΗ Produkty końcowej reakcji PCR analizowano w 1% żelu agarozowym.

W trakcie przygotowania delecji genu sigG, pierwszym etapem było przygotowanie za pomocą PCR-u produktów AB (1047 nukleotydów, nt) i EF (1069 nt) kodujących regiony flankujące sigG za pomocą starterów A i B oraz E i F, odpowiednio. Jako matrycy w reakcji PCR użyto 20 ng oczyszczonego chromosomalnego DNA dzikiego szczepu 168. 1054-nukleotydowy długi region CD kodujący gen cat amplifikowano przy użyciu starterów C i D. 50 ng oczyszczonego plazmidowego pSJ2739E,

PL 205 348 B1 zawierającego wstawiony gen cat z pHV14 zastosowano jako matrycę w reakcji PCR. Produkt PCR amplifikowany z pSJ2793E użyty w tym wynalazku zawiera ten sam region genu cat oraz otaczające go sekwencje jak opisano w sekwencji V01277 (GenBank), począwszy od nukleotydu 973 do nukleotydu 1985. Produkty AB i CD amplifikowano przy użyciu programu podstawowego. W przypadku reakcji EF, temperatura przyłączania programu podstawowego była obniżana do 45°C.

W kolejnych etapach, produkty PCR-u o długości 2,1 kilopar zasad AD (2081 nt) oraz CF (2103 nt) przygotowywano w dwóch różnych reakcjach. Produkty PCR-u oczyszczone z mieszaniny reakcyjnej służyły jako matryce do reakcji SOE. Produkty PCR-u AB i CD ligowano przy użyciu komplementarnego regionu 20 nukleotydów. Mieszanina reakcyjna zawierała około 30 ng produktów obu końców a reakcję PCR-u przeprowadzono z uż yciem starterów A i D oraz programu podstawowego. W drugiej reakcji SOE, CD i EF ligowano przy użyciu regionu komplementarnego do produktu CF. W mieszaninie reakcyjnej, około 30 ng obu produktów CD i EF użyto jako matrycy, zaś stężenie starterów C i F wynosiło 30 pmoli każdy. Podczas tej reakcji, 25 cykli programu podstawowego przeprowadzano w innych warunkach (94°C, 1 min; 76°C, 45 s; 72°C, 4 min).

Rekombinowane DNA AF (3130 nt) przygotowywano z produktów końcowych AD i CF, które łączono razem przy użyciu regionu kodującego gen cat o tej samej długości co produkt CD. Ten region o długości tysiąca par zasad jest komplementarny w produktach AD i CF. W reakcji PCR, mieszaninę reakcyjną przygotowywano tak aby zawierała około 100 ng produktów końcowych AD i CF oczyszczonych z mieszaniny reakcyjnej reakcji PCR opisanych powyżej oraz 30 pmol starterów A i F. Produkt AF amplifikowano za pomocą programu podstawowego.

Delecję genu sigG przeprowadzono transformując komórki kompetentne dzikiego szczepu przy użyciu liniowego rekombinowanego AF DNA. Przygotowanie komórek kompetentnych (Gryzan et al.,

1978) zaczynano od zawieszenia komórek B. subtilis 168 z płytki w 600 μΐ podłoża GMI (zmodyfikowane podłoże minimalne: 0,5 ml 20% glukoza, 0,1 ml 10% kwasy kazeinowe, 0,12 ml 10% ekstraktu drożdżowego, 2,0 ml 500-ng/ml tryptonu, 0,03 ml 1M MgCI₂, 17,25 ml SMS (Spizizen Minimal Salts)), które wykorzystywano do inokulacji 10 ml podłoża GMI w taki sposób, aby gęstość optyczna (fotometr Klett-Summerson) wynosiła około 30. Komórki inkubowano z wytrząsaniem do wczesnej fazy stacjonarnej (37°C, 250 rpm). Hodowlę przenoszono do 100 ml podłoża minimalnego GMII (zmodyfikowane podłoże minimalne: 0,5 ml 20% glukoza, 0,1 ml 10% kwasy kazeinowe, 0,12 ml 10% ekstraktu drożdżowego, 1,875 ml 200-mM Ca(NO3)2, 143,1 ml SMS) i hodowano w tych samych warunkach przez 90 minut. Komórki wirowano (7000xg, 5 min) i zawieszano w 7 ml supernatantu.

Komórki kompetentne dzikiego szczepu B. subtilis transformowano przy użyciu liniowego produktu PCR AF, do transformacji używano 10 l1 (DNA>2 Lg) produktu reakcji PCR. Podczas transformacji, 10 l1 rekombinowanego AF DNA oraz 0,05 Lg/ml chloramfenikolu do indukcji genu cat dodawano do 500 l1 roztworu do transformacji (Gryczan i wsp., 1978). Komórki inkubowano w +37°C, 30 min (180 rpm) i wysiewano na płytki LB zawierające 5 Lg/ml chloramfenikolu. Transformacja doprowadziła do otrzymania trzech kolonii. Niezarodnikujący szczep z wydeletowanym sigG został nazwany RS303.

Kontrola delecji genu SigG przez sekwencjonowanie

Stabilność regionu delecji została sprawdzona poprzez sekwencjonowanie chromosomalnego DNA bakterii w regionie delecji oraz regionach flankujących. Produkty PCR-u przygotowano z chromosomalnego DNA i zsekwencjonowano. Liofilizowane startery (Amersham Pharmacia Biotech) rozpuszczano w 100 Ll wody zaś 3 LM (3-pmol/Ll) roztwór przygotowywano ze starterów do reakcji PCR. Roztwór starterów do sekwencjonowania był 5-LM (5-pmol/Ll).

Kontrola stabilności regionów delecji niezarodnikujących szczepów RS202 i RS310

Startery użyte dla produktów PCR niezbędne do zsekwencjonowania regionu delecji w chromosomalnym DNA szczepów RS303 i RS310 pokazano poniżej. Lokalizację starterów w sekwencji pokazano na Rycinie 2.

SQ1-F 5'TGCGTTAAACCGGATCACGT3'

SQ2-R 5'TGCACTGCACTCAGACCGA3'

SQ3-F 5' GTAGCGGATATGATGGGGA3'

SQ4-R 5'CCTGCTGTAATAATGGGTAGA3'

SQ5-F 5'CATGGACTTCATTTACTGGG3

SQ6-F 5' GGTATCCTAGTTCGTACAAAG3'

SQ7-R 5'GGAGTCCGATGTACTCCGC3'

PL 205 348 B1

Stabilność regionu delecji sigG nieprzetrwalnikujących szczepów RS303 i RS310 sprawdzano poprzez sekwencjonowanie trzech produktów PCR amplifikowanych za pomocą starterów SQ1-F do SQ7-R: SRS12, SRS34 i SRS567. Następująca tabela pokazuje rozmiar produktów PCR oraz starterów użytych do sekwencjonowania w reakcjach PCR.

Zsekwencjonowany produkt	Rozmiar (bp)	Startery	Zsekwencjonowany za pomocą startera
SRS12	1024	SQ1-F/SQ2-R	SQ1-F/SQ2-R
SRS34	1070	SQ3-F/SQ4-R	SQ3-F/SQ4-R
SRS567	1450	SQ5-F/SQ7-R	SQ5-F/SQ6-F/SQ7-R

Produkty PCR-ów analizowano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (żel 1%). Produkt SRS 12 oczyszczano z mieszaniny reakcyjnej (zestaw do oczyszczania Qiagen Qiaquick PCR, Qiagen GmbH, Niemcy) zgodnie z instrukcjami producenta (QIAquick Spin Handbook/kwiecień 2000) i rozcieńczano w wodzie (50 gl). Produkty SRS34 i SRS567 izolowano z żelu agarozowego ze względu na zanieczyszczenia w produkcie. Oczyszczanie z żelu wykonywano na kolumnie komercyjnej (zestaw Qiagen Gel Extraction) zgodnie z instrukcjami producenta (QIAquick Spin Handbook/kwiecień 2000) i rozcieńczano w wodzie (50 gl). Końcowe stężenie DNA oczyszczonego produktu wynosiło 30 do 50 ng/gl.

Sekwencja nukleotydowa regionu delecji szczepów nieprzetrwalnikujących RS303 i RS310 stanowi Seq. ID Nr 9. Fig. 2 pokazuje również sekwencje nieprzetrwalnikującego szczepu B. subtilis w regionie genu sigG. Region wdeletowany z chromosomu odpowiada regionowi 1605063-1605739 (Micado database, http://locus/jouy.inra.fr) z sekwencji dzikiego szczepu 168. Z 780 nukleotydów regionu kodującego gen sigG, na drodze delecji usunięto 677 nukleotydów. Region zawierający gen cat (zaznaczony na szaro) wstawiono w regionie delecji odpowiadającym nukleotydom 973 do 1985 w sekwencji plazmidu pC194 (Genbank acc. Nr V01277). Fragment SOE sporządzony w celu przeprowadzenia delecji zawierał sekwencję powtarzalną o długości 21 par zasad (wytłuszczony druk) w regionach flankujących region cat. Zsekwencjonowany region zaczyna się od nukleotydu 1603961 (i), zaś ostatnim zsekwencjonowanym nukleotydem jest 1606851 (t). Do sekwencjonowania szczepu RS303 stosowano startery SQ1 do SQ7. Startery te użyto do przygotowania produktów PCR, które zsekwencjonowano za pomocą tych samym starterów. Sekwencje odpowiadające (startery F) i komplementarne (startery R) użyte do amplifikacji produktu PCR-u zostały podkreślone. Startery A do F użyte w reakcjach SOE są zaznaczone kreskowaną linią powyżej. Kodony start sigG i genu cat są podane kursywą, kodon stop genu sigG zaznaczono (*END), zaś kodon stop genu cat za pomocą (*). Pojedyncze nukleotydy, różniące się od sekwencji z banku genów zostały zaznaczone podwójną linią. Po delecji, pozostaje pierwsze 38 nukleotydów i ostatnie 65 z genu sigG. Po wstawieniu genu cat, nakładający się region 21-nukleotydów jest powtórzony, podobnie jak w początku genu sigG.

Podczas sekwencjonwania odnaleziono różnice w stosunku do opublikowanej sekwencji B. subtilis (Kunst i wsp., 1997). Te same różnice w sekwencji otrzymano po zsekwencjonowaniu regionów flankujących genu sigG z chromosomu dzikiego szczepu 168. Różnice sekwencji zaznaczono w sekwencji wydeletowanego regionu na Rycinie 2. Regiony homologiczne użyte do integracji były jednak identyczne z sekwencjami dzikiego szczepu B. subtilis 168.

Wpływ delecji genu sigG na sporulację

Wpływ delecji sigG na przetrwalnikowanie badano hodując szczep RS303 B. subtilis z wydeletowanym sigG w podłożu do sporulacji oraz poprzez poddawanie komórek wegetatywnych temperaturze +85°C. Stabilność delecji badano hodując RS303 pod presją selekcyjną (chloramfenikol 5 gg/ml podłoża SS) i bez presji selekcyjnej. Po zadziałaniu temperatury, komórki wysiewano na płytki LB. Dziki szczep 168 użyto jako kontroli i poddawano działaniu identycznych warunków. Wzrost dzikiego szczepu 168 prowadził do powstania 2,1x10⁸ przetrwalników na mililitr. RS303 nie produkował żadnych przetrwalników (Tabela 3). Bez selekcji na podłożu SS komórki RS303 nie produkowały przetrwalników. Można wyciągnąć wniosek, że delecja genu sigG zapobiega powstawaniu przetrwalników oraz, że delecja ta jest stabilna.

PL 205 348 B1

T a b e l a 3. Wpływ genu sigG na produkcję przetrwalników

	B.subtilis 168	RS303	RS303
Podłoże wzrostowe	SS	SS+Cm	SS
Komórki/ml	3,9 x 10⁸	1 x 10⁸	8 x 10⁷
Przetrwalniki/ml	2,1 x 10⁸	0	0

Konstrukcja plazmidu produkcyjnego β-laktamazy, pRSH10

Wydzielanie obcego białka do podłoża wzrostowego badano poprzez wstawienie genu β-laktamazy z B. licheniformis 749/C do wektora sekrecyjnego pKTH141 (Lundstróm, 1985). W obrębie wektora, wydzielanie obcych białek jest kontrolowane za pomocą promotora α-amylazy oraz sekwencji sygnałowej z B. amyloliquefaciens. Fragment regionu kodującego obce białko może zostać wstawiony w miejscu klonowania Hindlll we właściwej ramce odczytu z sekwencją sygnałową, zaś białko jest wydzielane do podłoża wzrostowego. Insercja została wykonana jak opisano: chromosomalne DNA (Marmur, 1961) wyizolowano z Bacillus licheniformis 749/C i użyto jako matrycy w reakcji PCR. Produkt PCR o długości 817 par zasad był amplifikowany za pomocą starterów PEL-141 F (Seq. ID Nr 7) i PEN-141R (Seq. ID Nr 8), a produkt zawierał region kodujący tak zwaną małą egzopenicylinazę odpowiadająca nukleotydom 129 do 921 sekwencji V00093 z GenBank (oraz aminokwasom 43 do 307 sekwencji P00808 Swiss-Prot). 100 μl mieszaniny reakcyjnej PCR zawierało 10 ng matrycy DNA, 0,3 iM startera, 0,2 mM dNTP, 10 μl buforu enzymatycznego, 1,5 μl enzymu Expand (3.5 U/il, Boehringer Mannheim). Program PCR składał się z inicjacyjnego 4-minutowego ogrzewania w 94°C, a następnie 28 razy 40 s w 94°C, 20 s w 50°C, 1 min w 72°C, i końcowo 5 min w 72°C. Otrzymany produkt PCR oczyszczano za pomocą regionów restrykcyjnych HindIII dodanych do pKTH141 w celu otrzymania plazmidu produkcyjnego pRSHIO. Region kodujący β-laktamaze plazmidu pRSHIO sekwencjonowano, i ta sekwencja nie różniła się od sekwencji z banku genów. B. subtilis 168 i RS303 transformowano (Gryczan i wsp., 1978) za pomocą pRSHIO w celu otrzymania szczepów bakteryjnych RS201 i RS310, odpowiednio.

Wpływ delecji genu sigG na niewytwarzanie przetrwalników oraz stabilność delecji w szczepie nadprodukującym β-laktamazę

Transformowanie nieprzetrwalnikującego szczepu RS303 za pomocą wektora produkcyjego pRSHIO prowadziło do powstania szczepu RS310. Delecja genu sigG nie wpływała na kompetencję bakterii. Przetrwalnikowanie nowego szczepu produkcyjnego oraz stabilność genu sigG monitorowano poprzez wzrost szczepu RS310 w podłożu sporulacyjnym bez selekcji chloramfenikolem. Rozwój zarodnikowania monitorowano w dalszej kolejności podczas kilku cykli wzrostowych w 24-godzinnej hodowli w podłożu SS. Cykl wzrostowy odnosi się do 24-godzinnej hodowli inokulowanej 1:100 w nowym podłożu do sporulacji. Zarodnikowanie monitorowano podczas trzech cykli wzrostu. Komórki do działania temperaturą pobierano z I do III hodowli. Po zadziałaniu temperaturą, komórki wysiewano na płytki LB lub płytki LB z chloramfenikolem.

W trakcie hodowli, dziki szczep 168 produkował 2,8 x 10⁸ przetrwalników. Szczep po delecji RS310 nie produkował żadnych przetrwalników (Tabela 4). Brak przetrwalnikowania pozostający bez zmian dla szczepu RS310 w trakcie hodowli komórek w podłożu SS bez chloramfenikolu świadczył o stabilności delecji. Liczba komórek wegetatywnych na wybiórczych płytkach LB (chloramfenikol 5 ig/ml) była taka sama jak dla płytek LB. Test pokazał, że konstrukcja delecji oraz insercja genu cat są stabilne.

T a b e l a 4. Wpływ delecji genu sigG na przetrwalnikowanie i stabilność delecji szczepu produkcyjnego RS310

RS310	B.subtilis 168
	Komórki wegetatywne/ml	Przetrwalniki/ml	Komórki/ml	Przetrwalniki/ml
Hodowla	LB	LB+Cm	LB	LB	LB
I	1,4 X 10⁸	1,1 x 10⁸	0	6 x 10⁸	3,3 x 10⁸
II	2,7 x 10⁸	1,6 x 10⁸	0	5,9 x 10⁸	4,5 x 10⁸
III	2,0 x 10⁸	6,0 x 10⁸	0	2,3 x 10⁸	7,1 x 10⁸

PL 205 348 B1

Tabela 5 pokazuje liczbę komórek wegetatywnych oraz komórek przetrwalnikujących w hodowli, w której monitorowano produkowanie przetrwalników przez szczep RS310. W tym przypadku, liczba komórek wegetatywnych była określana w hodowlach RS310 na płytkach o obniżonej zawartości chloramfenikolu. Redukując ilość chloramfenikolu w podłożu, zredukowano presję selekcyjną ponieważ przy wyższym stężeniu wzrost bakterii był bardzo wolny. Kolonie były małe i nie wszystkie komórki wegetatywne były w pełni rozwinięte. Aby otrzymać bardziej porównywalne wyniki, selekcję na płytkach redukowano do μg/ml chloramfenikolu. Liczba komórek wegetatywnych na płytkach z chloramfenikolem pozostawała taka sama jak na płytkach LB. Dziki szczep 168 użyty jako szczep kontrolny produkował przeciętnie 3,5 x 10⁸ przetrwalników/ml. Szczep RS310 nie produkował przetrwalników w trakcie wzrostu. Tym samym, wyniki te dobrze pokazują wpływ delecji genu sigG. Szczep produkcyjny jest całkowicie nieprzetrwalnikujący i bardzo stabilny.

T a b e l a 5. Wpływ delecji genu sigG na przetrwalnikowanie i stabilność delecji w szczepie produkcyjnym RS310

RS310 B.subtilis 168
Komórki wegetatywne/ml Przetrwalniki/ml Komórki/ml Przetrwalniki/ml
Hodowla I II III	LB 1,3 x 10⁸ 1,6 x 10⁸ 3,8 x 10⁸	LB+Cm 1,3 x 10⁸ 1.6 x 10⁸ 5.6 x 10⁸	LB LB 0 4 x 10⁸ 0 4,5 x 10⁸ 0 4,5 x 10⁸	LB 3,6 x 10⁸ 4,5 x 10⁸ 2,4 x 10⁸

Produkcja β-laktamazy przez szczep nieprzetrwalnikujący

Produkcję β-laktamazy (BLP) przez nowy nieprzetrwalnikujący szczep bakteryjny, RS310, porównywano z poziomem produkcji β-laktamazy w dzikim szczepie 168 transformowanym plazmidem produkcyjnym pRAH10, t.j. w szczepie RS201. Produkcję β-laktamazy monitorowano w 100 ml hodowli z wytrząsaniem. Aktywność β-laktamazy w podłożu wzrostowym mierzono metodą spektrofotometryczną według metody opracowanej przez O'Callaghan i wsp., (1972) przez zastosowanie substratu chromogenicznego, nitrocefiny. Zmianę absorbancji przy 486 nm przekształcano w jednostkę aktywności BU: 1 μmol zdegradowanej benzylopenicyliny na godzinę, 30°C, przy użyciu eksperymentalnie określonego współczynnika 26,3. Jednostki aktywności były z kolei przekształcane na jednostki β-laktamazy w μg/ml przy użyciu specyficznej aktywności β-laktamazy 340 BU/ag białka (Simons i wsp.,1978). Jako podłoża wzrostowego użyto stężonego podłoża LB z kanamycyną 10 ag/ml. 0,1 ml komórek w fazie logarytmicznej inokulowano do 100 ml podłoża wzrostowego a komórki hodowano w 2L kolbie z wytrząsaniem (+37°, 250 rpm). Wzrost monitorowano przez 25 godzin poprzez pomiar gęstości optycznej (OD600nm). Wyniki pokazano na Rycinie 3. Szczepy bakteryjne RS310 i RS201 miały podobny wzrost w fazie logarytmicznej, zaś najwyższą wartość OD600nm osiągały po 11 godzinach. Hodowle obu szczepów zawierały około 250 ag/ml β-laktamazy. Po 11 godzinach, gęstość bakterii malała, zaś pod koniec wzrostu wartość OD600nm dla szczepu RS310 wynosiła 7,6, zaś dla szczepu RS201-8,1. Jednakże, ilość β-laktamazy w podłożu wzrostowym wzrastała i wynosiła pod koniec wzrostu 430 ag/ml dla nowego szczepu nieprzetrwalnikującego RS 310, zaś dla szczepu RS201 - 380 ag/ml. Dodatkowo, wpływ delecji genu sigG na profil wydzielanych białek do podłoża wzrostowego badano za pomocą elektroforezy SDS-PAGE i nie wykryto różnic w barwieniu Coomassie-blue (15% żele akrylamidowe) pomiędzy szczepem przetrwalnikującym a dzikim szczepem. Na podstawie otrzymanych wyników, wydaje się, że delecja sigG nie wpływa na wzrost bakteryjny lub na produkcję wydzielanych białek.

Bibliografia

Biswas, I., A. Gruss, S.D. Ehrlich, and E. Maguin. 1993. High-efficiency gene inactivation and replacement system for gram-positive bacteria. J. Bacteriol. 175:3628-3635.

Ehrlich, S.D. 1978. DNA cloning in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Ssci. USA, 75:1433-6. Ferrari, E. and J.A. Hoch. 1989. Genetics. In: Bacillus, Biotechnology handbooks; v. 2. C. Harwood (ed.). Plenum Press, New York. A Division of Plenum Publishing corporation. New York.) pp.57-72.

Fougler, D. and J. Errington (1989) The role of the sporulation gene spolllE in the regulation of prespore-specific gene expression in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol.3:1247-1255.

PL 205 348 B1

Gryczan, TJ., S. Contente, D. Dubnau. 1978. Characterization of Staphylococcus aureus plasmids introduced by transformation into Bacillus subtilis. J. Bact. 134:318-329.

Haldenwang, W. 1995. The sigma factors of Bacillus subtilis. Microbiol. Rev. 59:1-30.

Harwood, C. R. and S. M. Cutting (edit), Molecular Biological Methods for Bacillus. 1991. Wiley-Interscience Publications.

Horinouchi S., and B. Weisblum. 1982. Nucleotide sequence and functional map of pC194, a plasmid that specifies inducible chloramphenicol resistance. J.Bacteriol. 150:815-825.

Horton, Robert M., Henry D. Hunt, Steffan N. Ho, Jeffrey K. Pullen and Larry R. Pease. 1989. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene, 77:61-68.

Illing N., Young M. & Errington J., 1990. Use of Integrational Plasmid Excision to Indentity Cellular Localization of Gene Expression during Sporulation in Bacillus subtilis. J. Bactriol. 172:6937-6941.

Ishii, T., K. Yoshida, G. Terai, Y. Fujita, and K. Nakai. 2001 DBTBS: a database of Bacillus subtilis promoters and transcription factors. Nucleic Acids Res. 29: 278 - 280.

Izui, K., J.B.K. Nielsen, M.P. Gaulifield, and J.O. Lampen. 1980. Large exopenicillinase, initial extracellular form detected in growths of Bacillus licheniformis. Biochemistry 19:1882-1886.

Karmazyn-Campbelli, C, Bonamy, C, Savelli, B., and Stragier, P. 1989. Tandem genes encoding a-factors for consecutive steps of development in Bacillus subtilis. Genes Dev. 3:150-157.

Khasanov, F.K., D.J. Zvingila, A.A. Zainullin, and A.A. Prozorov. 1992. Homologous recombination between plasmid and chromosomal DNA in Bacillus subtilis requires approximately 70 bp of homology. Mol. Gen. Genet. 234:494-497.

Kunst F, Ogasawara N, Moszer I, Albertini AM, Alloni G, Azevedo V, Bertero MG, Bessieres P, Bolotin A, Borchert S, Borriss R, Boursier L, Brans A, Braun M, Brignell SC, Bron S, Brouillet S, Bruschi CV, Caldwell 25 B, Capuano V, Carter NM, Choi SK, Codani JJ, Conner-ton IF, Danchin A, et al. The complete genome sequence of the gram-positive bacterium Bacillus subtilis. Nature. 1997 Nov 20:390 249-256 Lundstrom, K. 1985. Expression of viral membrane protein genes in Bacillus subtilis. Ph.D. Thesis, University of Helsinki, 1985.

Marmur, J. 1961. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms. J. Mol. Biol. 3:208-218.

McPherson, M.J., and S.G. M0ller. 2000.PCR:the Basics. BIOS Scientific Publishers, Oxford.

O'Callaghan C.H, A. Morris, S.M. Kirby, and A.H. Shingler. 1972. Novel method for detection of beta-lactamases by using a chromogenic cephalosporin substrate. Antimicrob. Agents Chemother.

1:283-288.

Pedraza-Reyes M., Gutierrez-Corona F. & Nicholoson W L. 1994. Temporal regulation and forespore-specific expression of the spore photoproduct lyase gene by sigma-G RNA polymerase during Bacillus subtilis sporulation. J. Bacteriol. 176:3983-9193.

Sambrook, J. and D.W. Russell. 2001. Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbour Laboratory press, Cold Spring Harbour, New York.

Sambrook, J., Fritch, E.F. and Maniatis,T. 1989. Molecular cloning. A laboratory Manual. Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

Simsons K., M. Sarvas, H. Garoff, and A. Helenius. 1978. Membrane-bound and secreted forms of penicillinase from Bacillus licheniformis. J. Mol.Biol. 126:673-690.

Stragier, P., and Losick, R. 1996. Molecular genetics of sporulationin Bacillus subtilis. Annu.

Claims

1. Nieprzetrwalnikujący szczep Bacillus subtilis, znamienny tym, że z jego genu sigG wydeletowano co najmniej 150 nukleotydów.

2. Szczep B. subtilis według zastrz. 1, znamienny tym, że delecja obejmuje co najmniej część jednego z regionów funkcjonalnych genu sigG, które kodują aminokwasy 67 do 80 lub 229 do 248 białka sigG.

3. Szczep B. subtilis według zastrz. 2, znamienny tym, że delecja obejmuje co najmniej część obu regionów funkcjonalnych genu sigG.

PL 205 348 B1

4. Szczep B. subtilis według zastrz. 3, znamienny tym, że wydeletowany został cały gen sigG.

5. Szczep B. subtilis według zastrz. od 1 do 4, znamienny tym, że gen markera selekcyjnego jest wstawiony do miejsca delecji.

6. Szczep B. subtilis według zastrz. 5, znamienny tym, że powyżej genu markera selekcyjnego znajduje się co najmniej 20-nukleotydowy nakładający się region, który jest homologiczny z co najmniej 20 nukleotydowym nakładającym się regionem poniżej genu markera selekcyjnego.

7. Szczep B. subtilis według zastrz. 6 znamienny tym, że zawiera Seq. ID Nr 9.

8. Sposób wytwarzania niezarodnikującego szczepu Bacillus subtilis, znamienny tym, że deletuje się co najmniej 150 nukleotydów z genu sigG szczepu Bacillus subtilis.

9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że co najmniej część jednego z regionów funkcjonalnych genu sigG kodujących aminokwasy 67 do 80 lub 229 do 248 białka sigG deletuje się z genu sigG.

10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że co najmniej oba wspomniane regiony funkcjonalne genu sigG deletuje się z genu sigG.

11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że przygotowuje się za pomocą techniki SOE wstawki zawierające regiony flankujące genu podlegającego delecji oraz gen markera selekcyjnego; transformuje się podlegający delecji szczep B. subtilis za pomocą wspomnianej wstawki i selekcjonuje się transformanty, w których wstawka została wintegrowana do chromosomu bakterii, w taki sposób, że pożądany region genu zostaje wydeletowany.

12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przygotowuje się za pomocą techniki SOE liniową wstawkę DNA, która zawiera gen markera selekcyjnego pomiędzy regionami flankującymi region genu podlegający delecji; transformuje się szczep B. subtilis podlegający delecji za pomocą wstawki i następnie dokonuje się selekcji transformantów, w których wstawka została wintegrowana w wyniku podwójnej rekombinacji homologicznej, przez co pożądany region genu zostaje wydeletowany.

13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że w technice SOE stosuje się startery mające co najmniej około 20-nukleotydowe regiony nakładające się.

14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że stosuje się liniową wstawkę DNA posiadającą przed genem markera selekcyjnego co najmniej 20 nukleotydowy region nakładający się, który jest powtórzony za genem markera selekcyjnego.

15. Sposób według zastrz. 13 albo 14, znamienny tym, że stosuje się liniową wstawkę DNA, w której region flankujący powyżej regionu podlegającego delecji, gen markera selekcyjnego oraz region flankujący poniżej regionu podlegającego delecji są zasadniczo tej samej długości.

16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że stosuje się liniową wstawkę DNA o długości 3 kb.

17. Zastosowanie niezarodnikującego szczepu Bacillus subtilis zdefiniowanego w zastrz. od 1 do 7, jako organizmu produkcyjnego.

18. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że nieprzetrwalnikujący szczep Bacillus subtilis stosuje się do produkcji rekombinowanego polipeptydu.

19. Zastosowanie według zastrz. 18, znamienne tym, że nieprzetrwalnikujący szczep Bacillus subtilis stosuje się do produkcji β-laktamazy.

20. Sposób wytwarzania biologicznie przygotowywanego preparatu, znamienny tym, że produkt wytwarza się przy zastosowaniu niezarodnikującego szczepu Bacillus subtilis zdefiniowanego w zastrz. od 1 do 7.

21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że szczep Bacillus subtilis jak zdefiniowano w zastrz. od 1 do 7 jest transformowany DNA kodującym pożądany polipeptyd i to DNA ulega w nim ekspresji a powstający rekombinowany polipeptyd jest odzyskiwany.

22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że produkowanym polipeptydem jest β-laktamaza.