KR100234489B1 - 신규의 니트릴히드라타제 - Google Patents

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KR100234489B1
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토시후미 야마키
테루오 아리이
미유키 쯔루오카
타케시 나카무라
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사토 아키오
미쯔이카가쿠 가부시기가이샤
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Abstract

본 발명은, 신규의 니트릴히드라타제를 제공하는 것을 과제로 하며, 그 해결 수단으로서 슈도노카르디아ㆍ서모필라(Pseudonocardia thermophila) JCM 3095에서 유래되며, 헤테로의 2종의 서브유닛으로부터 구성되는 니트릴히드라타제의 아미노산서열 및 이 유전자의 염기서열을 제공한다. 또, 이 유전자가 삽입된 재결합플라스미드를 제작하고, 이 재결합플라스미드를 도입한 형질전환균체를 사용해서 니트릴화합물을 대응하는 아미드화합물로 변환한다. 이로써, 니트릴화합물을 대응하는 아미드화합물로 효율좋게 변환하는 것이 가능해지는 효과를 얻을 수 있다.

Description

신규의 니트릴히드라타제
본 발명은, 슈도노카르디아ㆍ서모필라(Pseudonocardia thermophila JCM3095, 이하 단지 슈도노카르디아ㆍ서모필라로 호칭)유래의 니트릴히드라타제의 α서브유닛 및 β서브유닛을 코딩하는 신규의 아미노산배열, 이 효소의 α서브유닛 및 β서브유닛을 코딩하는 신규의 유전자배열에 관한 것이다. 또, 이 유전자를 함유하는 재결합플라스미드, 이 재결합플라스미드에 의해 형질전환된 형질전환균주, 이 형질전환균주를 사용해서 니트릴히드라타제를 생산하는 방법 및 이 형질전환균주를 배양해서 얻어지는 배양액ㆍ균체ㆍ균체처리물을 사용해서 니트릴화합물로부터 대응하는 아미드화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
니트릴화합물의 니트릴기를 수화(水和)해서 아미드기로 변환해서 대응하는 아미드화합물을 제조하는 기술은, 산 또는 알칼리의 존재하에서나 구리촉매의 존재하에서 가열처리하는 화학적인 방법이 종래부터 알려져 있었다.
한편, 최근 니트릴기를 수화해서 아미드기로 변환하는 니트릴수화활성을 가진 효소인 니트릴히드라타제가 발견되어, 이 효소 또는 이 효소를 함유하는 미생물균체 등을 사용해서 니트릴화합물로부터 대응하는 아미드화합물을 제조하는 방법이 이미 개시되어 있다(일본국 특공소 56-17918호, 동 62-21519호, 동 62-31914호, 동 59-37951호, 일본국 특공평 4-4873호, 동 6-55148호). 상기 제조방법은 종래의 화학적인 방법과 비교해서, 니트릴화합물로부터 대응하는 아미드화합물로의 전화율 및 선택률이 높은 등의 장점이 알려져 있다.
니트릴히드라타제를 사용해서 니트릴화합물로부터 아미드화합물을 공업적으로 제조하기 위해서는, 아미드화합물의 제조비용을 점유하는 이 효소의 제조비를 낮추는 일이 중요하며, 보다 구체적으로는 단위 미생물중량ㆍ단위시간당의 아미드화합물의 생성속도(이하, 균체활성이라고 호칭)를 높게 할 필요가 있다. 그래서, 이 효소의 유전자를 사용해서 유전자공학의 수법에 의해 이 효소를 대량으로 발현시킬 것을 목적으로 해서, 이 효소의 유전자를 클로닝하는 시도가 검토되고 있다. 예를 들면, 코리네박테륨속(屬)(일본국 특개평 2-119778호), 슈도모나스속(일본국 특개평 3-251184호), 로드코카스속의 로드크로우스종(일본국 특개평 4-211379호), 리조븀속(일본국 특개평 6-25296호), 크레비시에라속(일본국 특개평 6-303971호)을 들 수 있다. 단, 코리네박테륨속 및 로드코카스속의 로드크로우스종의 경우는, 대장균에서의 형질전환균주의 니트릴히드라타제활성은 극미약한 것이였다는 보고(TIBTECH Vol. 10, pp402∼408, 1992년)가 있어, 유전자공학의 수법을 사용하면 높은 균체활성을 가진 형질전환균체를 반드시 얻어지는 것은 아니었다.
본 발명자들은, 니트릴히드라타제활성을 가진 미생물로서 본 발명자들에 의해 발견된 슈도노카르디아ㆍ서모필라 JCM3095로부터 니트릴히드라타제 유전자를 단리하여, 그 아미노산서열 및 유전자서열을 처음으로 명백히하는 데 성공하고, 또 이 유전자를 대량으로 발현하는 유전자재결합균주를 제작하는 데도 성공하여, 본원 발명을 완성시키게 되었다.
즉, 본 발명의 목적은, 슈도노카르디아ㆍ서모필라유래의 니트릴히드라타제의 아미노산서열 및 유전자서열을 제공하는 일이다. 또 이 유전자를 함유한 재결합플라스미드, 이 재결합플라스미드를 함유한 형질전환균주, 이 형질전환균주를 사용한 이 효소의 생산방법 및 이 형질전환균주를 사용한 니트릴화합물로부터의 대응하는 아미드화합물의 제조방법을 제공하는 일이다.
제1도는 플라스미드 pPT-B1의 제한효소절단점지도
제2도는 플라스미드 pPT-DB1의 제한효소절단점지도
〈도면의 주요부분에 대한 부호의 설명〉
Amp : β-락타마제를 코딩하는 유전자를 표시함
ORI : Co1E1계의 복제개시부를 표시함
lacPo : pUC18유래의 락토스 오페론의 프로모터 및 오페레이터 영역을 표시함
NHα : 슈도노카르디아ㆍ서모필라유래의 니트릴히드라타제의 α서브유닛을 코딩하는 유전자를 표시함.
NHβ : 슈도노카르디아ㆍ서모필라유래의 니트릴히드라타제의 β서브유닛을 코딩하는 유전자를 표시함
(XbaⅠ/NspV) : XbaⅠ 및 NapV사이트사이에서의 평활말단화후의 자체연결부위를 표시함.
이하 본 발명을 개설하면, 본 발명의 니트릴히드라타제는 서열목록의 서열번호 1 및 2에 표시한 아미노산배열에 의해 기본적으로 구성되나, 동일염기서열의 유전자의 주형(鑄型)으로 해서 전사ㆍ번역된 경우라도, 그것을 도입하는 숙주(宿主)의 종류, 배양에 사용하는 영양배지의 성분이나 조성, 배양시의 온도나 pH 등에 따라서는, 유전자발현후의 숙주내효소에 의한 수식 등에 의해, 소기의 효소작용은 유지되고 있으나 서열목록에 있어서의 N말단부근의 아미노산의 1개 또는 2개이상이 결실(缺失)되거나, N말단에 1개 또는 2개이상의 아미노산이 새로이 부가된 변이체를 생산하는 일이 있다. 또, 재결합 DNA기술의 진보에 따라 효소의 작용을 실질적으로 바꾸는 일없이 비교적 용이하게 그 구성아미노산의 1개 또는 2개이상을 다른 아미노산으로 치환, 결실, 삭제 혹은 삽입도 할 수 있게 되었다. 또, 그 구성아미노산의 1개 또는 2개이상을 다른 아미노산으로 치환, 결실, 삭제 혹은 삽입함으로써, 유기용매내성의 향상이나 기질특이성의 변화 등의 산업상의 이용가치가 높은 성질을 부가한 변이효소를 제작하는 시도도 행하여지고 있다. 그와 같은 기술 수준에 비추어, 본 발명에서 언급하는 니트릴히드라타제란, 서열목록에 있어서의 서열번호 1 및 2에 표시한 아미노산서열을 그대로 구비하는 것은 말할 것도 없고, 1개 또는 2개이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환, 결실, 삭제 혹은 삽입된 아미노산서열을 가진 변이체라도, 그것이 니트릴히드라타제활성을 가지고 있는 경우는 본 발명에 포함된 것으로 한다.
즉, 본 발명은, 서열목록의 서열번호 1에 표시되는 205개의 아미노산의 서열에 의해 표시되는 α서브유닛 및 서열목록의 서열번호 2에 표시되는 233개의 아미노산의 서열에 의해 표시되는 β서브유닛에 의해 구성되는 니트릴히드라타제이다. 또, 본발명에 있어서는, 서열목록의 서열번호 1 또는 2에 표시되는 아미노산 서열의 일부를 치환, 결실, 삭제 또는 삽입해서 얻어지는 α서브유닛과 β서브유닛의 어느 한 쪽 또는 쌍방을 구성요소로서 포함하고, 또한, 니트릴 수화활성을 유지하고 있는 경우는, 본 발명의 니트릴히드라타제에 포함되는 것으로 한다.
본 발명에 있어서는, 서열목록의 서열번호 1에 표시되는 205개의 아미노산의 배열에 의해 표시되는 α서브유닛을 코딩하고 있는 염기서열은, 본 발명의 니트릴히드라타제의 α서브유닛을 코딩하는 유전자의 범위에 포함된다. 또, 본 발명에 있어서는, 서열목록의 서열번호 1에 표시되는 아미노산서열의 일부가 치환, 결실, 삭제 또는 삽입되어 얻어지는 α서브유닛을 구성요소에 포함한 니트릴히드라타제가 니트릴수화활성을 유지하고 있는 경우에는, 이 α서브유닛을 코딩하는 염기서열도 본 발명의 니트릴히드라타제유전자의 범위에 포함된다. 마찬가지로, 서열목록의 서열번호 2에 표시되는 233개의 아미노산의 서열에 의해 표시되는 β서브유닛을 코딩하고 있는 염기서열은, 본 발명의 니트릴히드라타제의 β서브유닛을 코딩하는 유전자의 범위에 포함된다. 또, 본 발명에 있어서는, 서열목록의 서열번호 2에 표시되는 아미노산서열의 일부를 치환, 결실, 삭제 또는 삽입해서 얻어지는 β서브유닛을 구성요소로 함유한 니트릴히드라타제가 니트릴수화활성을 유지하고 있는 경우에는, 이 β서브유닛을 코딩하는 염기서열도 본 발명의 니트릴히드라타제유전자의 범위에 포함된다.
본 발명의 니트릴히드라타제유전자는, 서열목록의 서열번호 3 및 4에 표시한 염기서열에 의해 기본적으로 구성되나, 재결합 DNA기술의 진보에 따라 효소의 아미노산서열을 실질적으로 바꾸는 일없이 비교적 용이하게 번역때의 주형이 되는 DNA의 염기서열을 다른 염기서열로 치환할 수 있게 되었다. 또, 번역때의 주형이 되는 DNA의 염기서열을 치환, 결실, 삭제 혹은 삽입함으로써, 효소의 작용을 실질적으로 바꾸는 일없이 그 구성아미노산의 1개 또는 2개이상을 다른 효소의 작용을 실질적으로 바꾸는 일없이 그 구성아미노산의 1개 또는 2개이상을 다른 아미노산으로 치환, 결실, 삭제 또는 삽입시킬 수도 있게 되었다. 그와 같은 기술수준에 비추어, 본 발명에서 언급하는 니트릴히드라타제유전자란, 서열목록에 있어서의 서열번호 3 및 4에 표시한 DNA염기서열을 그대로 구비한 것은 말할 것도 없고, 그 DNA염기서열의 1개 또는 2개이상의 염기가 다른 염기로 치환, 결실, 삭제 혹은 삽입된 변이체라도, 그것이 니트릴히드라타제활성을 가진 단백질의 주형으로서 기능할 수 있는 한 본 발명에 포함되는 것으로 한다. 즉, 본 발명은, 니트릴히드라타제를 코딩하는 유전자로서, α서브유닛이 서열목록의 서열번호 3에 표시되는 618개의 염기서열에 의해 구성되고, β서브유닛이 서열목록의 서열번호 4에 표시되는 702개의 염기서열에 의해 구성되는 것을 포함하고 있다. 또, 본 발명에 있어서는, 서열목록의 서열번호 3의 염기서열의 일부를 치환, 결실, 삭제 또는 삽입해서 얻어지는 염기서열에 의해 코딩되는 아미노산서열에 의해 얻어지는 α서브유닛 또는 서열목록의 서열번호 4의 염기서열의 일부를 치환, 결실, 삭제 또는 삽입해서 얻어지는 염기서열에 의해 코딩되는 아미노산서열에 의해 얻어지는 β서브유닛의 어느 한 쪽 또는 쌍방을 구성요소로서 함유한 단백질이 니트릴수화활성을 가지고 있는 경우에는, 본 발명의 니트릴히드라타제를 코딩하는 유전자에 포함되는 것으로 한다.
본 발명은, 본 발명의 니트릴히드라타제를 코딩하는 유전자가 삽입된 재결합플라스미드를 구축하는, 이 재결합플라스미드를 임의의 미생물에 도입해서 형질전환체를 얻는 것을 포함하고 있다. 또, 얻어진 형질전환체를 일반적인 영향배지에서 배양해서 이 효소를 생산시키고, 이 효소를 생산하고 있는 이 형질전환체를 수성매체속에서 니트릴화합물과 접촉시켜서 대응하는 아미드화합물을 제조시키는 것을 포함하고 있다.
본 발명에 있어서의 재결합플라스미드란, 니트릴히드라타제를 코딩하는 유전자가 이 유전자의 발현에 필요한 제어영역 및 자율복제에 필요한 영역을 포함한 플라스미드벡터에 삽입된 플라스미드이며, 또 임의의 숙주에 도입됨으로써 이 효소의 생산이 가능해지는 플라스드를 말한다. 여기서 말하는 임의의 숙주란, 후술하는 실시예와 같이 대장균을 들 수 있으나, 특히 대장균에 한정되는 것은 아니고 마른 풀균 등의 바실루스속균, 효모나 방선균 등의 다른 미생물도 사용할 수 있다. 발현에 필요한 제어영역이란, 프로모터서열(전사를 제어하는 오퍼레이터서열을 포함)ㆍ리보솜결합서열(SD서열)ㆍ전사종결서열 등을 표시하고 있다. 구체적인 프로모터서열로서는, 대장균유래의 트립토판오페론의 trp프로모터ㆍ락토스오페론의 lac프로모터ㆍ람다파아지유래의 PL프로모터 및 PR프로모터나, 마른 풀균유래의 글루콘산합성효소프로모터(gnt)ㆍ알칼리프로테아제프로모터(apr)ㆍ중성프로테아제프로모터(npr)ㆍα-아밀라제프로모터(amy)등을 들 수 있다. 또, tac프로모터와 같이 독자적으로 개변ㆍ설계된 서열도 이용할 수 있다. 리보솜결합서열로서는, 대장균유래 또는 마른 풀균유래의 서열이나 본 발명과 같이 슈도노카르디아본래의 서열을 들 수 있으나, 대장균이나 마른 풀균 등의 소망의 숙주내에서 기능하는 서열이면 특히 한정되는 것은 아니다. 가령, 16S리보솜 RN4의 3'말단영역에 상호보조적인 서열이 4염기이상 연속한 컨센서스서열을 DNA합성에 의해 작성해서 이것을 이용해도 된다. 전사종결서열은 반드시 필요하지 않으나, ρ인자비 의존성의 것, 예를 들면 리포프로테인터미네이터ㆍtrp오페론터미네이터 등을 이용할 수 있다. 이들 제어영역의 재결합플라스미드위에서의 서열순서는, 5'말단쪽 상류로부터 프로모터서열, 리보솜결합서열, 니트릴히드라타제를 코딩하는 유전자, 전사종결서열의 순서로 나란히 하는 것이 바람직하다. 또, 그와 같은 제어영역에 의해 α서브유닛유전자 및 β서브유닛유전자가 각각 독립된 시스트론으로서 발현되어도 되고, 공통의 제어영역에 의해 폴리시스트론로서 발현되어도 된다.
이상의 요건을 충족하고 있는 플라스미드벡터의 예로서는, 대장균속에서의 자율복제가능한 영역을 가지고 있는 pBR322, pUC18, Bluescript Ⅱ SK(＋), pKK223-3, pSC 101이나, 마른 풀균속에서의 자율복제가능한 영역을 가지고 있는 pUB110, pTZ 4, pC 194, ρ11, ψ105 등을 들 수 있다. 또, 2종류이상의 숙주 내에서의 자율복제가 가능한 플라스미드벡터의 예로서, pHV 14, TRp 7,YEp 7 및 pBS 7을 들 수 있다.
상기 플라스미드벡터에 본 발명의 니트릴히드라타제를 코딩하는 유전자를 이 유전자의 발현에 필요한 영역을 가진 플라스미드벡터에 삽입해서 본 발명의 재결합플라스미드를 구축하는 방법, 이 재결합플라스미드를 소망하는 숙주로 형질전환하는 방법 및 이 형질전환균체내에서 니트릴히드라타제를 생산시키는 방법으로서는, 「Molecular Cloning 2nd Edition」(T. Maniatis 등; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 등에 기재되어 있는 분자생물학ㆍ생물공학ㆍ유전자공학의 분야에 있어서 공지의 일반적인 방법과 숙주를 이용하면 된다. 또한, 이 형질전환균주를 배양하는 배지로서 LB배지나 M9배지 등이 일반적으로 사용되나, 보다 바람직하게는 그와 같은 배지성분에 Fe이온 및 Co이온을 0.1㎍/㎖이상 존재시키면 된다.
또, 본 발명의 니트릴히드라타제 또는 형질전환균주를 이용해서 니트릴화합물로부터 대응하는 아미드화합물을 제조하는 데는, 소망의 니트릴화합물을 이 형질전환균주의 배양액, 이 형질전환균주를 배양해서 얻어지는 형질전환균체, 형질전환균체의 처리물 또는 형질전환균체로부터 분리ㆍ정제된 니트릴히드라타제와 수성매체속에서 접촉시키면 된다. 접촉시키는 온도는 특히 한정되지 않으나, 바람직하게는 이 니트릴히드라타제가 열화하지 않는 온도범위내이며, 보다 바람직하게는 0℃∼50℃이다. 니트릴화합물로서는, 본 발명의 니트릴히드라타제가 기질로서 작용할 수 있는 화합물이면 특히 한정되지 않으나, 바람직하게는 아세토니트릴, 프로피오니트릴, 아크릴로니트릴, 메타크릴로니트릴, n-부티로니트릴, 이소부티로니트릴, 크로토노니트릴, α-히드록시이소부티로니트릴 등이라고 하는 탄소수 2∼4의 니트릴화합물을 그 대표예로서 들 수 있다. 이 니트릴화합물의 수성매체속에서의 농도는, 이 니트릴화합물의 수성매체속에서의 최대용해도를 초과하지 않는 범위내이면 특히 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 이 니트릴화합물에 의한 이 효소의 열화를 고려해서 5중량%이하, 보다 바람직하게는 2중량%이하이다.
본 발명의 서열목록의 서열번호 1∼4에 표시한 슈도노카트디아ㆍ서모필라유래의 니트릴히드라타제의 아미노산서열 및 염기서열을 해명하기에 이르른 일련의 공정을 이하에 요약하였다. 또한, 슈도노카르디아ㆍ서모필라 JCM3095주인데, 본 균주는 이화학연구소미생물계통보존시설(일본국 사이타마켄 와코시 히로자와 2-1)에 번호 JCM3095로서 보관되어, 누구에게나 청구에 의해 자유로이 분양된다.
(1)이 균주를 배양해서 얻은 균체를 파쇄후, 황산암모늄분획ㆍ음이온교환크로마토그래피ㆍ겔여과크로마토그래피ㆍ소수크로마토그래피에 의해 니트릴히드라타제를 정제하여, α서브유닛 및 β서브유닛의 N말단의 7잔기의 아미노산서열을 결정하였다.
(2)결정된 N말단의 아미노산서열에 의거해서 유전자증폭용 올리고뉴클레오티드프라이머를 제작하여, 이 균체로부터 조제한 염색체 DNA를 주형으로 해서 PCR을 행하여 증폭 DNA산물을 얻었다.
(3)이 염색체DNA를 제한효소에 의해 부분적으로 절단해서 약 1,500bp∼4,000bp로 이루어진 DNA단편을 채취하였다. 이 DNA단편을 플라스미드벡터에 연결하여, 대장균으로 형질전환해서 플라스미드라이브러리를 제작하였다.
(4)상기 (2)의 증폭DNA산물을 프로브로 한 콜로니하이브리다이제이션에 의해, 니트릴히드라타제를 코딩하는 DNA단편을 함유한 양성클론을 플라스미드라이브러리로부터 선택하였다.
(5)이 양성클론으로부터 플라스미디DNA를 추출하여, 그 삽입단편의 전체염기서열을 결정하고, 니트릴히드라타제의 α서브유닛ㆍβ서브유닛을 코딩하는 유전자의 염기서열을 특정하였다. 이 염기서열에서 추정되는 α서브유닛 및 β서브유닛의 아미노산 서열과 상기 (1)에서 얻어진 양쪽서브유닛의 7잔기의 N말단의 아미노산서열을 비교하여, 이 염기서열이 니트릴히드라타제를 코딩하고 있는 것을 확인하였다.
(6)니트릴히드라타제유전자를 함유한 DNA단편을, 상기 (4)의 양성클론의 플라스미드로부터 재조제하여, 적당한 프로모터를 함유한 플라스미드벡터에 삽입하였다.
(7)상기 (6)에서 얻어진 플라스미드를 적당한 숙주균에 도입해서 형질전환체를 얻었다. 또, 그 형질전환체를 배양해서 얻은 균체와 아크릴로니트릴을 수성매체속에서 접촉시킴으로써 아크릴아미드가 생성하는 것을 확인하였다.
이하의 실시예에 의해 본 발명을 더 상세히 설명하나, 본 발명은 이하의 실시예에 의해서 하등 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 슈도노카르디아ㆍ서모필라 JCM3095주유래의 니트릴히드라타제의 정제
슈도노카르디아ㆍ서모필라 JCM3095주를 0.2%의 메타크릴아미드를 함유하는 보통 부이욘배지(pH7.5)를 사용해서 50℃에서 3일간 배양하여, 원심분리(8000×G, 30분간)에 의해 습균체 3g을 얻었다. 이것을 7g의 KPB(0.1M인산칼륨용액 : pH7.0)에 재현탁해서, 초음파파쇄기를 사용해서 균체파쇄액을 조제하였다. 균체파쇄액에 2.7g의 황산암모늄을 첨가해서 4℃에서 1시간 완만하게 교반한 후에, 원심분리(25, 000×G, 30분간)에 의해 불용물을 제거하였다. 원심상청(上淸)액 90g에 1.2g의 황산암모늄을 첨가해서 1시간 완만히 교반한 후에, 원심분리(25,000×G, 30분간)에 의해 침전물을 얻었다. 이 침전물을 1㎖의 KPB에 용해하고, 2L의 동일액에 대해서 4℃에서 48시간 투석을 행하였다. 피투석액을 일본국 토소회사의 DEAE-TOYOPEARL650M(컬럼사이즈 5×6φ㎝)를 사용한 음이온교환크로마토그래피에 제공하였다. 전개액은 KPB를 사용해서, 염화칼륨에 의한 OM에서 0.5M까지의 농도기울기용출을 행하여 니트릴히드라타제활성을 함유한 분획을 얻었다. 다음에 이 활성분획액을 팔마시어회사제의 SUPERDEX200-26/20을 담체로 한 겔여과크로마토그래피에 제공하였다. 전개액은 0.2M염화칼륨을 함유한 KPB를 사용하여, 니트릴히드라타제활성을 함유한 분획만을 회수하였다. 계속해서 이 활성분획액을 일본국 토소회사제의 TSKgel phenyl-5PW칼럼(HPLD용)을 사용한 소수크로마토그래피에 제공하였다. 20%포화농도의 황산암모늄을 함유한 KPB에 의해 평형화시킨 칼럼에 시료를 흡착시키고, 황산암모늄농도를 20%포화에서 50%포화까지 일정한 기울기로 감소시켜서 활성분획을 얻었다.
이상의 크로마토그래피에 있어서의 니트릴히드라타제활성의 측정은, 이하와 같이 행하였다. 각 분획액을 KPB에 의해 적당히 희석하고, 이것에 1중량%의 아크릴로니트릴을 첨가해서 10℃에서 10분간 반응시켰다. 반응액에 이것과 동등량의 1M인산수용액을 첨가해서 반응을 정지시키고, 생성된 아크릴아미드농도를 HPLC분석에 의해 측정하였다. HPLC컬럼은 ULTRON 80HG(50×8ψ㎜)를 사용하고, 10mM인산수용액을 전개액으로서 사용하였다. 아크릴아미드는 220㎚의 흡광도에 의해 검출하였다.
소수크로마토그래피에서의 활성분획액을 사용해서 환원조건하에서의 SDS-PAGE를 행하였던 바, 29K달톤 및 32K달톤의 2개의 주요한 폴리펩티드사슬과 45K달톤이상의 3개의 얇은 폴리펩티드사슬의 존재가 인정되었다. 다른 니트릴히드라타제의 환원조건하에서의 SDS-PAGE에서는, 일반적으로 30±3K달톤의 폴리펩티드사슬이 2종류 관찰된다. 그래서, SDS-PAGE겔의 29K달톤과 32K달톤의 2개의 주요한 폴리펩티드사슬을 더나트륨회사제의 세미드라이형 블로팅장치를 사용해서 바이오래드회사제의 PVDF막에 흡착시켰다. PVDF막으로부터 목적하는 폴리펩티드사슬이 흡착하고 있는 부분만을 잘라내고, 각각의 N말단의 아미노산서열을 일본국 시마쯔세이사쿠쇼회사제의 펩티드시퀀서 PSQ-1을 사용해서 해석하였다. 그 결과, 29K달톤의 폴리펩티드사슬의 N 말단의 아미노산서열은, 서열목록의 서열번호 1개기재의 아미노산서열의 2번째로부터 8번째에 상당하는 Thr-Glu-Asn-Ile-Leu-Arg-Lys이며, 32K달톤의 폴리펩티드사슬의 N말단의 아미노산서열은, 서열목록의 서열번호 2기재의 아미노산서열의 1번째로부터 7번째에 상당하는 Met-Asn-Gly-Val-Tyr-Asp-Val이었다.
[실시예 2] 슈도노카르디아ㆍ서모필라 JCM3095주유래의 니트릴히드라타제유전자의 취득
슈도노카르디아ㆍ서모필라 JCM3095주를 실시예 1과 마찬가지 방법에 의해 배양하고, 원심분리(8000×G, 30분간)에 의해 습균체 2g을 얻었다. 이것을 0.15M의 NaCl을 함유한 50mM의 EDTAㆍ2Na수용액(pH8.0)을 40㎖ 첨가해서 균체를 현탁하고, 90℃에서 10분간 자비처리하였다. 이 처리액을 37℃까지 냉각한 후에, 난백(卵白)리소자임을 100㎎첨가하고, 37℃에서 1시간 보온하였다. 다음에 20,000U/㎎의 자이모리레이스를 30㎎ 첨가해서 37℃에서 1시간 보온하였다. 계속해서 20U/㎎의 프로테이네스 K를 5㎎ 첨가하여 37℃에서 보온하였다. 또, 10% SDS용액을 2㎖ 첨가해서 65℃에서 1시간 보온한 후, 즉시 페놀/클로로포름추출을 행하였다. 먼저, TE(1mM의 EDTAㆍ2Na를 함유한 10mM의 트리스염산수용액; pH8.0)에 의해 포화시킨 페놀액 42㎖를 첨가하여 완만히 교반하였다. 원심분리(3,000rpm, 10분)에 의해 수상(水相)과 유기상을 분리하여, 수상만을 분취하였다. 이 수상에 상기의 TE포화페놀액 21㎖와 클로로포름 21㎖를 첨가해서 다시 완만히 교반한 후, 원심분리(3,000rpm, 10분)에 의해 수상과 유기상을 재차 분리해서, 수상만을 분취하였다. 이 수상에 1.1M의 NaCl을 함유한 TE용액 4㎖와 메탄올 92㎖를 첨가해서 잠깐동안 실온에서 방치한 후, 석출된 실형상의 DNA를 유리막대에 감았다. 70%, 80%, 90%의 에탄올수용액으로 순차 탈수를 행한 후에 바람건조시킨 이 DNA를 40㎖의 TE용액에 재용해시켰다. RNaseA를 30㎍ 첨가해서 37℃에서 1시간 보온한 후, 제한효소 BamHI에 의해 부분절단하였다. 페놀추출/클로로포름추출 및 에탄올침전에 의해서 부분절단된 이 DNA를 재정제하여, 최종적으로 1.0㎍/㎕가 되도록 TE용액에 용해시켰다.
실시예 1에서 결정한 29K달톤 및 32K달톤의 폴리펩티드사슬의 N말단의 아미노산서열에 기초해서, 이하의 4종류의 PCR용 프라이머를 합성하였다.
프라이머1 : 5'-ACNGARAAYATNYTNMGNAA-3'
프라이머2 : 5'-TTNCKNARNATRTTYTCNGT-3'
프라이머3 : 5'-ATGAAYGGNGTNTAYGANGT-3'
프라이머4 : 5'-ACNTCRTANACNCCRTTCAT-3'
서열목록의 서열번호 5기재의 프라이머 1 및 서열목록의 서열번호 6기재의 프라이머 2는, 29K달톤의 N말단아미노산서열에 역대응하는 DNA사슬의 각 상보사슬에 상당한다. 서열목록의 서열번호 7기재의 프라이머 3 및 서열목록의 서열번호 8기재의 프라이머 4는, 32K달톤의 N말단아미노산서열에 역대응하는 DNA사슬의 각 상보사슬에 상당한다. 또한, N은, A, C, G 또는 T를 표시하고 있다.
앞서 조제한 부분절단된 염색체 DNA 3㎍을 주형으로 해서 PCR을 행하였다. PCR반응 No.1에서는, 프라이머 1 및 4를 각각 200ng과 TaqDNA폴리메라제를 5U 함유한 전체량 100㎕의 계에서, 열변성(94℃) 1분, 어닐링(37℃) 1분, 신장반응(72℃) 1분의 조건으로 PCR을 40사이클 행하였다. PCR반응 No. 2에서는, 프라이머 2 및 3을 각각 200ng과 TaqDNA폴리메라제를 5U 함유한 전체량 100㎕의 계에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 사이클로 행하였다. 각 PCR반응의 종료액 5㎕를 사용해서 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, PCR반응 No.2의 경우에만 약 700bp의 증폭DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이에 의해, 슈도노카르디아ㆍ서모필라에서는 5'말단쪽상류로부터 32K달톤의 유전자와 29K달톤의 유전자가 이 순번으로 인접해서 존재하고 있는 것이 판명되었다.
앞서 조제한 BamHI에 의해 부분절단된 염색체 DNA용액을 사용해서, 아가로우즈겔전기영동(시그머회사제 타입 VⅡ저융점아가로우즈사용; 아가로우즈농도 0.6중량%)를 행하고, 아가로우즈겔로부터 약 1500bp에서 4000bp의 DNA단편을 포함한 아가로우즈조각을 잘라냈다. 이 아가로우즈조각(약 0.5g)을 미세하게 분쇄하여 5㎖의 TE용액에 현탁후, 55℃에서 1시간 보온해서 아가로우즈를 완전 융해시키고, 이 융해액에 대해서 상기와 마찬가지의 페놀/클로로포름추출과 에탄올침전을 행하여 DNA단편을 정제하였다. 이와 같이 해서 얻어진 DNA단편을 적어도 10pmol 준비하고, DNA라이게이션키트(일본국 타카라주조회사제)를 사용해서 pUC18플라스미드벡터(일본국 타카라주조회사제)의 멀티클로닝사이트내에 있는 BamHI사이트에 삽입하였다. 이때 라이게이션에 사용한 pUC18플라스미드벡터 DNA는, 제한효소 BamHI에 의해 절단한 후 페놀/클로로포름처리 및 에탄올침전에 의한 정제를 행하고, 계속해서 알칼리포스파타제(일본국 타카라주조회사제)를 사용한 5'말단의 탈인산화처리후에 페놀/클로로포름처리 및 에탄올침전에 의한 재정제를 행한 것을 20ng 사용하였다.
라이게이션반응후의 DNA용액을 사용해서, 일본국 토요보세키회사제의 대장균 HB101의 콤피텐트셀(COMPETENT HIGH)에의 형질전환을 행하고, 50㎍/㎖의 임피실린을 함유하는 LB한천배지(0.5중량%바트효모엑스트럭트, 1중량%박토트리톤, 0.5중량%염화나트륨, 1.5중량%한천; pH7.5)위에 형질전환처리후의 균액을 약 10㎕ 도포하였다. 그 결과, 1매당 100개에서 1000개의 콜로니가 출현하고 있는 샬레를 복수매 얻을 수 있었다.
이들 염색체DNA의 플라스미드라이브러리에 대해서, 앞서 조제한 PCR에 의한 증폭 DNA산물을 프로브에 사용한 플로니하이브리다이제이션을 실시하여, 목적하는 니트릴히드라타제유전자를 함유하는 클론을 스크리닝하였다.
먼저, 플라스미드라이브러리의 샬레위에 아마샴회사제의 나일론멤브레인 Hybond-N을 조용히 놓고, 약 1분간 천천히 제거하였다. 벗겨진 멤브레인을 변성용액(1.5M의 NaCl을 함유하는 0.5M의 NaOH수용액)에 7분간 침지한 후, 중화용액(1.5M의 NaCl과 1mM의 EDTAㆍ2Na를 함유한 0.5M트리스염산수용액; pH7.2)에 의해 3분간씩 2회 처리하였다. 다음에, 2×SSC용액(1×SSC는 염화나트륨 8.76g, 시트르산나트륨 4.41g을 함유한 1ℓ의 수용액)에 의해 1회 세정을 행한 후, 건조된 여과지위에서 이 멤브레인을 바람건조하였다. 또 120mJ/㎤의 UV조사를 행함으로써 멤브레인위의 DNA의 고정을 행하였다. 이와 같이 해서 처리한 멤브레인을 1매당 30㎖의 하이브리다이제이션버퍼(5×SSC에 이하의 성분을 함유. 1중량 스킴밀크, 0.1중량% N-라우로일자르코신, 0.02중량%SDS, 50중량%포름아미드)에 적시고, 42℃에서 2시간 프레하이브리다이제이션을 행하였다. 한편, 앞서 조제한 PCR에 의한 증폭DNA산물을 주형으로 사용해서 베링거만하임회사제의 DIG-DNA라벨링키드를 사용해서 형광표식 프로브의 조제를 행하였다. 100ng의 형광표식프로브와 300ng의 pUC18플라스미드 DNA를 95℃에서 10분간의 자비처리에 의해 열변성시키고, 프레하이브리제이션을 행한 멤브레인과 함께 10㎖의 하이브리다이제이션버퍼에 옮겼다. 42℃에서 24시간의 하이브리다이제이션을 행한 후에, 멤브레인을 150㎖의 0.1중량%SDS를 함유한 2×SSC속에서 실온에서 2회 세정하였다. 다음에 150㎖의 0.1중량%SDS를 함유한 1×SSC속에서 68℃/5분간의 세정을 2회 행하였다. 계속해서 100㎖ 버퍼A(0.3중량%의 트윈 20 및 0.15M의 NaCl을 함유한 0.1M말레산 버퍼; pH7.5)속에서 5분간 세정후, 버퍼B(0.3중량%의 트윈 20, 0.15M의 NaCl 및 1중량%의 스킴밀크를 함유한 0.1M말레산버퍼; pH7.5)속에서 실온에서 30분간의 블록킹처리를 행하였다. 또 300㎖의 버퍼A에서 실온으로 15분간의 세정을 2회 행한 후, 60㎖의 버퍼C(0.1M의 NaCl 및 50mM의 염화마그네슘을 함유한 0.1M트리스염산염수용액; pH9.5)에서 5분간 평형화처리를 행하였다. 발광기질인 베링거만하임회사제의 AMPPD를 버퍼C에서 100배로 희석한 용액 30㎖속에 이 멤브레인을 실온에서 10분간 적신 후, 건조한 여과지위로 옮겨서 여분의 AMPPD를 빨아들였다. 이상의 조작을 거친 멤브레인을 폴리에틸렌필름으로 싼 후, X선 필름을 사용해서 형광시그널의 위치를 확인하였다. 그 결과, 이 메브레인위에 포지티브한 시그널을 1개소 발견하여, 그 위치와 겹치는 포지티브콜로니를 원래의 샬레위에서 확인하였다.
확인된 포지티브콜로니를 샬레위로부터 암피실린을 함유하는 10㎖의 LB액체 배지에 접종하여, 37℃ㆍ250rpm에서 하룻밤 배양을 행하였다. 배양균체로부터 상법에 의해 플라스미드 DNA를 추출하고, 제한효소 BamHI에 의해 처리를 행한 후에, 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 0.7중량%)에 의해 삽입단편의 사이즈확인을 행하였던 바, 약 3.1Kbp의 크기였다. 본 플라스미드를 pPT-B1(도 1)로 명명하고, ABI회사제의 시퀀싱키드와 오토시퀀서 373A를 사용해서 플라이머엑스텐션법에 의해 삽입단편의 전체염기서열을 결정하였다. 그 결과, 삽입단편속에 720bp와 618bp의 염기서열로 이루어진 오프리딩프레임(각각 ORF1과 ORF2로 호칭)이 5'말단쪽으로부터 이 순번으로 확인되었다. 번역정지코돈을 포함한 ORF1의 가장 3'말단쪽의 4염기와 ORF2의 가장 5'말단쪽의 4염기는 중복되어 있고, PCR에서의 결과와 일치하고 있었다. 또, ORF1의 염기서열로부터 추정되는 N말단쪽 7개의 아미노산서열과 실시예1에서 표시된 32K달톤의 폴리펩티드사슬의 N말단쪽의 아미노산서열은 아주 일치되고 있었다. 이 서열영역은, 서열목록의 서열번호 2기재의 아미노산서열의 1번째로부터 7번째까지의 서열에 상당한다. 한편, ORF2의 염기서열에서 추정되는 서열목록의 N말단쪽 2번째에서 8번째까지 7개의 아미노산서열과 실시예1에서 표시된 29K달톤의 폴리펩티드사슬의 N말단쪽의 7개의 아미노산서열도 아주 일치하고 있었다. 이 서열영역은, 서열목록의 서열번호 1기재의 아미노산서열의 2번째에서 8번째까지의 서열에 상당한다. 또, ORF1과 ORF2의 아미노산서열은, 각각 다른 니트릴히드라타제의 β서브유닛 및 α서브유닛의 아미노산서열과 높은 호모로지가 인정되었다. 이상에서, ORF1은 니트릴히드라타제의 β서브유닛전자이며, ORF2는 α서브유닛유전자인 것이 확인되었다.
[실시예 3] 형질전환균주의 조성
pPT-B1위의 1ac프로모터의 전사방향과 ORF1 및 ORF2의 전사방향은 완전히 일치하고 있었다. 그래서, pPT-B1위의 니트릴히드라타제유전자의 5'말단쪽상류에 위치하고, 또한 pPT-B1위의 유일한 제한효소사이트인 XbaⅠ 및 NspV에 의해 pPT-B1을 절단하고, 아가로우즈겔전기영동(시그머회사제, 타입 Ⅶ 저융점아가로우즈사용; 아가로우즈농도 0.7%)을 행하고, 아가로우즈겔로부터 약 4.6Kbp의 DNA단편만을 잘라냈다. 잘라낸 아가로우즈조각(약0.1g)을 미세하게 분쇄하여 1㎖의 TE용액에 현탁후, 55℃에서 1시간 보온해서 아가로우즈를 완전히 융해시키고, 이 융해액에 대해서 실시예 2와 마찬가지의 페놀/클로로포름추출과 에탄올침전을 행하여 DNA단편을 정제하였다. DNA브랜팅키드(일본국 타가라주조회사제)에 의해 평활말단처리를 행한 후, DNA라이게이션키트(일본국 타카라주조회사제)에 의해 자체연결시켜서 플라스미드pPT-DB1(도 2)을 구축하였다. 일본국 토요보세키회사제의 대장균HB101의 콤피텐트셀을 사용해서 pPT-DB1을 HB101주에 도입하고, 형질전환균주 MT-10822주를 얻었다. 이에 의해, 본 균주에 있어서 니트릴히드라타제유전자가 pUC18위의 1ac프로모터에 의해 전사ㆍ번역되게 되었다. MT-10822주는 수탁번호 FERMP-15426호로서 일본국 이바라기켄 쯔쿠바시 히가시 1쪼메 1반 3고에 있는 일본국 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 기탁되어 있다.
[실시예 4] 형질전환균주에 의한 니트릴화합물의 아미드화합물로의 변환예 1
500㎖의 배플부착 삼각플라스크에 100㎍/㎖의 황산제 2철ㆍ7수화물 및 10㎍/㎖의 염화코발트ㆍ2수화물을 함유한 100㎖의 LB액체배지를 조제하여, 121℃ㆍ20분간의 오토클레이브에 의해 멸균하였다. 이 배지에 최종농도가 100㎍/㎖가 되도록 암피실린을 첨가한 후, 실시예 3에서 얻어진 MT-10822주를 일백균이 식균(一白菌耳 植菌)하여 37℃ㆍ130rpm에서 약 20시간 배양하였다. 원심분리(5, 000G×15분)에 의해 균체만을 배양액으로부터 분리하고, 계속해서, 50㎖의 생리식염수의 이 균체를 재현탁한 후에, 재차 원심분리를 행하여 습균체를 얻었다. 이 습균체 100㎎을 200㎎의 50mM의 인산칼륨수용액(pH7.0)에 현탁하고, 이 현탁액에 아크릴로니트릴을 10㎖ 첨가하여, 10℃에서 완만히 교반하면서 1시간 반응을 행하였다. 반응종료 후, 실시예 1과 마찬가지의 HPLC분석에 의해 반응액의 분석을 행하였던 바, 반응액 속에는 아크릴아미드만이 존재해있고, 아크릴로니트릴 및 아크릴산은 확인되지 않았다. 즉, 전환율 및 선택률은 100%였다.
[실시예 5] 형질전환균주에 대한 니트릴화합물의 아미드화합물로의 변환예 2
500㎖의 배플부착 삼각플라스크에 40㎍/㎖의 황산 제 2철ㆍ7수화물 및 10㎍/㎖의 염화코발트ㆍ2수화물을 함유한 100㎖의 LB액체배지를 조제하고, 121℃ㆍ2분간의 오토클레이브에 의해 멸균하였다. 이 배지에 최종농도가 100㎍/㎖가 되도록 암피실린을 첨가한 후, 실시예 3에서 얻어진 MT-10822주를 일백균 식균하고, 37℃ㆍ130rpm에서 약 20시간 배양하였다. 계속해서 원심분리(5,000G×15분)에 의해 균체만을 배양액으로부터 분리하였다. 50㎖의 생리식염수에 이 균체를 재현탁한 후에, 재차 원심분리를 행하여 습균체를 얻었다. 이 습균체 100㎎을 200㎖의 50mM의 인산칼륨수용액(pH2.0)에 현탁하고, 이 현탁액에 메타크릴로니트릴을 5㎖ 첨가하여, 10℃에서 완만히 교반하면서 2시간 반응을 행하였다. 반응종료후, 실시예 1과 마찬가지의 HPLC분석에 의해 반응액의 분석을 행하였던 바, 반응액속에는 메타크릴아미드만이 존재해 있고, 메타크릴로니트릴 및 메타크릴산은 확인되지 않았다. 즉, 전환율 및 선택률은 100%였다.
[실시예 6] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(1)
α서브유닛의 6번째의 Leu를 Met로 치환하기 위해, 실시예 3에서 얻어진 pPT-DB1플라스미드 DNA를 주형으로 해서, 일본국 타카라주조회사제의 「LA PCR in vitro mutagenesis Kit」를 간단히 키트라고 호칭한다. 이하의 실시예에서는 기본적으로 키트의 원리 및 조작방법을 답습하였다.
30㎖의 시험관에 10㎖의 LB액체배지를 조제하여, 121℃ㆍ20분간의 오토클레이브에 의해 멸균하였다. 이 배지에 최종농도가 100㎍/㎖가 되도록 암피실린을 첨가한 후, 실시예 3에서 얻어진 MT-10822주를 일백균이 식균하여 37℃ㆍ300rpm에 의해 약 20시간 배양하였다. 이 배양액 1㎖를 적당한 원심튜브에 분취한 후, 원심분리(15, 000rpm×5분)에 의해 이 균체를 분리하였다. 계속해서 알칼리 SDS추출법에 의해 이 균체로부터 pPT-DB1의 플라스미드 DNA를 조제하였다.
pPT-DB1의 플라스미드 DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 9기재의 프라이머 및 M13프라이머M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. Microcon100(일본국 타카라주조회사제)을 사용해서 각각의 PCR반응종료액으로부터 과잉의 프라이머 및 dNTP를 제거한 후, TE를 첨가해서 각 50㎍의 용액을 조제하였다. 이 TE용액을 각 0.5㎕씩 함유한 전체량 47.5㎕의 어닐리용액(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)을 조제하여, 열변성처리(98℃)를 10분간 행한 후, 37℃까지 60분간에 걸쳐서 일정한 속도로 냉각을 행하고, 계속해서 37℃에서 15분간 유지함으로써 어닐링처리를 행하였다. 어닐링처리액에 TAKARALA Taq를 0.5㎕ 첨가해서 72℃에서 3분간 가열처리를 행하고, 헤테로 2본쇄를 완성시켰다. 이것에 M13프라이머M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재) 및 M13프라이머RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 첨가해서 전체량을 50㎕로 한 후, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로 인한 PCR반응 No.3을 행하였다. PCR반응 No.3의 반응종료액 5㎕를 사용한 아가로스전기영동(시그머회사제 타입 Ⅶ저융점아가로우즈사용; 아가로우즈농도 0.8중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 약 2.0Kbp의 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 계속해서, 아가로우즈겔로부터 약 2.0kbp의 DNA 단편만을 잘라내고, 이 아가로우즈조각(약 0.1g)을 미세하게 분쇄하여 1㎖의 TE용액에 현탁후, 55℃에서 1시간 보온해서 아가로우즈를 완전 융해시켰다. 이 융해액에 대해서 실시예 2와 마찬가지의 페놀/클로로포름추출과 에탄올침전을 행하여 이 DNA단편을 정제하고, 최종적으로 10㎕의 TE에 용해하였다. 정제한 약 2.0Kbp의 증폭DNA단편을 제한효소 EcoRI 및 Hind Ⅲ에 의해 절단한 후, 이 제한효소처리액에 대해서 실시예 2와 마찬가지의 페놀/클로로포름추출과 에탄올 침전을 행하여 이 DNA단편을 정제하여, 최종적으로 10㎕의 TE에 용해하였다. 마찬가지로, pPT-DB1위의 유일한 제한효소사이트인 EcoRI 및 Hind Ⅲ에 의해 pPT-DB1을 절단하여, 아가로우즈겔전기영동(시그머회사제, 타입 Ⅶ저융점아가로우즈사용; 아가로우즈농도0.7%)을 행하고, 아가로우즈겔로부터 약 2.7Kbp의 DNA단편만을 잘라냈다. 잘라낸 아가로우즈조각(약 0.1g)을 미세하게 분쇄해서 1㎖의 TE용액에 현탁후, 55℃에서 1시간 보온해서 아가로우즈를 완전히 융해시켰다. 이 융해액에 대해서 실시예 2와 마찬가지의 페놀/클로로포름추출과 에탄올침전을 행하여 이 DNA단편을 정제하고, 최종적으로 10㎕의 TE에 용해하였다. 이와 같이 해서 얻어진 증폭 DNA산물과 pPT-DB1단편을 DNA라이게이션키트(일본국 타카라주조회사제)를 사용해서 연결시킨 후, 대장균HB101의 콤피텐트셀(일본국 토요보세키회사제)을 형질 전환하여, 대장균뱅크를 조제하였다.
30㎖의 시험관에 40㎍/㎖의 황산제 2철ㆍ7수화물 및 10㎍/㎖의 염화코발트ㆍ2수화물을 함유한 10㎖의 LB액체배지(이후, 활성발현배지라고 호칭)를 조제하고, 121℃ㆍ20분간의 오토클레이브에 의해 멸균하였다. 이 배지에 최종농도가 100㎍/㎖가 되도록 암피실린을 첨가한 후, 이 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심듀브에 분취한 후, 원심분리(15,000rpm×5분)에 의해 균체를 분리하였다. 이 균체를 200㎕의 인산칼륨버퍼(pH 7.0)에 현탁하고, 이것에 1중량%의 아크릴로니트릴을 첨가해서 10℃에서 2분간 반응시켰다. 반응액에 이것과 동등량의 1M인산수용액을 첨가해서 반응을 정지시키고, 생성된 아크릴아미드농도를 실시예 1과 마찬가지의 HPLC분석에 의해 측정하였다. 그 결과, 5클론중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지의 ABI회사제의 시퀀싱키트와 오트시퀀서 373A를 사용한 프라이머엑스텐션법에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제 구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 1에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 α서브유닛의 6번째의 Leu가 Met로 치환되어 있었다.
Figure kpo00002
[실시예 7] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(2)
α서브유닛의 6번째의 Leu를 Thr로 치환하기 위해, pPT-DB1플라스미드 DNA를 주형으로 해서, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 부위특이적인 변이도입을 행하였다.
실시예 6에서 조제한 pPT-DB1의 플라스미드DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 13기재의 프라이머 및 M13프라이머M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 7의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트리히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 4균체를 각각 분리하여, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기배열을 결정하였다. 그 결과 표 2에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 α서브유닛의 6번째의 Leu가 Thr로 치환되어 있었다.
Figure kpo00003
[실시예 8] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(3)
α서브유닛의 6번째의 Leu를 Ala로 치환하기 위해, pPT-DB1플라스미드 DNA를 주형으로 해서, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 부위특이적인 변이도입을 행하였다.
실시예 6에서 조제한 pPT-DB1의 플라스미드 DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 14기재의 프라이머 및 M13프라이머M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양 종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트리히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하여, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기배열을 결정하였다. 그 결과 표 3에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 α서브유닛의 6번째의 Leu가 Ala로 치환되어 있다.
Figure kpo00004
[실시예 9] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(4)
α서브유닛의 6번째의 Leu를 Thr로 치환하기 위해, pPT-DB1플라스미드 DNA를 주형으로 해서, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 부위특이적인 변이도입을 행하였다.
실시예 6에서 조제한 pPT-DB1의 플라스미드DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 15기재의 프라이머 및 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양 종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트리히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하여, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기배열을 결정하였다. 그 결과 표4에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 α서브유닛의 6번째인 Leu가 Val로 치환되어 있었다.
Figure kpo00005
[실시예 10] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(5)
α서브유닛의 19번째의 Leu를 Val로 치환하기 위해, pPT-DB1플라스미드 DNA를 주형으로 해서, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 부위특이적인 변이도입을 행하였다.
실시예 6에서 조제한 pPT-DB1의 플라스미드DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 16기재의 프라이머 및 M13프라이머M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트리히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 5에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 α서브유닛의 19번째의 Ala가 Val로 치환되어 있었다.
Figure kpo00006
[실시예 11] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(6)
α서브유닛의 38번째의 Met를 Leu로 치환하기 위해, pPT-DB1플라스미드 DNA를 주형으로 해서, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 부위특이적인 변이도입을 행하였다.
실시예 6에서 조제한 pPT-DB1의 플라스미드DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 17기재의 프라이머 및 M13프라이머M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지의 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지의 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 6에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 α서브유닛의 38번째의 Met가 Leu로 치환되어 있었다.
Figure kpo00007
[실시예 12] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(7)
α서브유닛의 77번째의 Thr을 Ser로 치환하기 위해, pPT-DB1플라스미드 DNA를 주형으로 해서, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 부위특이적인 변이도입을 행하였다.
실시예 6에서 조제한 pPT-DB1의 플라스미드DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 18기재의 프라이머 및 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제 활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA을 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 7에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 α서브유닛의 77번째의 Thr이 Ser로 치환되어 있었다.
Figure kpo00008
[실시예 13] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(8)
α서브유닛의 90번째의 Gly를 Ala로 치환하기 위해, pPT-DB1플라스미드 DNA를 주형으로 해서, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 부위특이적인 변이도입을 행하였다.
실시예 6에서 조제한 pPT-DB1의 플라스미드DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 19기재의 프라이머 및 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 8에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 α서브유닛의 90번째의 Gly가 Ala로 치환되어 있었다.
Figure kpo00009
[실시예 14] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노치환체의 취득(9)
α서브유닛의 102번째의 Val을 Ala로 치환하기 위해, pPT-DB1플라스미드 DNA를 주형으로 해서, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 부위특이적인 변이도입을 행하였다.
실시예 6에서 조제한 pPT-DB1의 플라스미드DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 20기재의 프라이머 및 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 9에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 α서브유닛의 102번째의 Val가 Ala로 치환되어 있었다.
Figure kpo00010
[실시예 15] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(10)
α서브유닛의 106번째의 Val를 Ile로 치환하기 위해, pPT-DB1플라스미드 DNA를 주형으로 해서, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 부위특이적인 변이도입을 행하였다.
실시예 6에서 조제한 pPT-DB1의 플라스미드DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 21기재의 프라이머 및 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 10에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 α서브유닛의 106번째의 Val이 Ile로 치환되어 있었다.
Figure kpo00011
[실시예 16] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(11)
α서브유닛의 126번째의 Phe를 Tyr로 치환하기 위해, pPT-DB1플라스미드 DNA를 주형으로 해서, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 부위특이적인 변이도입을 행하였다.
실시예 6에서 조제한 pPT-DB1의 플라스미드DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 22기재의 프라이머 및 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 11에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 α서브유닛의 126번째의 Phe가 Tyr로 치환되어 있었다.
Figure kpo00012
[실시예 17] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(12)
α서브유닛의 130번째의 Gln를 Glu로 치환하기 위해, pPT-DB1플라스미드 DNA를 주형으로 해서, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 부위특이적인 변이도입을 행하였다.
실시예 6에서 조제한 pPT-DB1의 플라스미드DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 23기재의 프라이머 및 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 12에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 α서브유닛의 130번째의 Gln이 Glu로 치환되어 있었다.
Figure kpo00013
[실시예 18] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(13)
α서브유닛의 142번째의 Leu를 Val로 치환하기 위해, pPT-DB1플라스미드 DNA를 주형으로 해서, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 부위특이적인 변이도입을 행하였다.
실시예 6에서 조제한 pPT-DB1의 플라스미드DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 24기재의 프라이머 및 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 13에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 α서브유닛의 142번째의 Leu가 Val로 치환되어 있었다.
Figure kpo00014
[실시예 19] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(14)
α서브유닛의 146번째의 Glu를 Asp로 치환하기 위해, pPT-DB1플라스미드 DNA를 주형으로 해서, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 부위특이적인 변이도입을 행하였다.
실시예 6에서 조제한 pPT-DB1의 플라스미드DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 25기재의 프라이머 및 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 14에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 α서브유닛의 146번째의 Glu가 Asp로 치환되어 있었다.
Figure kpo00015
[실시예 20] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(15)
α서브유닛의 187번째의 Ala를 Thr로 치환하기 위해, pPT-DB1플라스미드 DNA를 주형으로 해서, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 부위특이적인 변이도입을 행하였다.
실시예 6에서 조제한 pPT-DB1의 플라스미드 DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 26기재의 프라이머 및 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재가 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 15에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 α서브유닛의 187번째의 Ala가 Thr로 치환되어 있었다.
Figure kpo00016
[실시예 21] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(16)
α서브유닛의 194번째의 Ser을 Leu로 치환하기 위해, pPT-DB1플라스미드 DNA를 주형으로 해서, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 부위특이적인 변이도입을 행하였다.
실시예 6에서 조제한 pPT-DB1의 플라스미드 DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 27기재의 프라이머 및 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 16에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 α서브유닛의 194번째의 Ser이 Leu로 치환되어 있었다.
Figure kpo00017
[실시예 22] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(17)
α서브유닛의 203번째의 Ala를 Glu로 치환하기 위해, pPT-DB1플라스미드 DNA를 주형으로 해서, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 부위특이적인 변이도입을 행하였다.
실시예 6에서 조제한 pPT-DB1의 플라스미드 DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 28기재의 프라이머 및 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 17에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 α서브유닛의 203번째의 Ala가 Glu로 치환되어 있었다.
Figure kpo00018
[실시예 23] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(18)
β서브유닛의 20번째의 Ala를 Val로 치환하기 위해, pPT-DB1플라스미드 DNA를 주형으로 해서, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 부위특이적인 변이도입을 행하였다.
실시예 6에서 조제한 pPT-DB1의 플라스미드DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 29기재의 프라이머 및 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 18에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 β서브유닛의 20번째의 Ala이 Val로 치환되어 있었다.
Figure kpo00019
[실시예 24] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(19)
β서브유닛의 21번째의 Asp을 Asn로 치환하기 위해, pPT-DB1플라스미드 DNA를 주형으로 해서, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 부위특이적인 변이도입을 행하였다.
실시예 6에서 조제한 pPT-DB1의 플라스미드 DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 30기재의 프라이머 및 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 19에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 β서브유닛의 21번째의 Asp가 Asn로 치환되어 있었다.
Figure kpo00020
[실시예 25] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(20)
β서브유닛의 108번째의 Glu을 Asp로 치환하기 위해, pPT-DB1플라스미드 DNA를 주형으로 해서, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 부위특이적인 변이도입을 행하였다.
실시예 6에서 조제한 pPT-DB1의 플라스미드 DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 31기재의 프라이머 및 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 20에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 β서브유닛의 108번째의 Glu이 Asp로 치환되어 있었다.
Figure kpo00021
[실시예 26] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(21)
β서브유닛의 108번째의 Glu를 Pro로 치환하기 위해, pPT-DB1플라스미드 DNA를 주형으로 해서, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 부위특이적인 변이도입을 행하였다.
실시예 6에서 조제한 pPT-DB1의 플라스미드 DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 32기재의 프라이머 및 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 21에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 β서브유닛의 108번째의 Glu가 Pro로 치환되어 있었다.
Figure kpo00022
[실시예 27] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(22)
β서브유닛의 108번째의 Glu를 Ser로 치환하기 위해, pPT-DB1플라스미드 DNA를 주형으로 해서, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 부위특이적인 변이도입을 행하였다.
실시예 6에서 조제한 pPT-DB1의 플라스미드 DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 33기재의 프라이머 및 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 22에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 β서브유닛의 108번째의 Glu가 Ser로 치환되어 있었다.
Figure kpo00023
[실시예 28] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(23)
β서브유닛의 108번째의 Glu를 Arg로 치환하기 위해, pPT-DB1플라스미드 DNA를 주형으로 해서, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 부위특이적인 변이도입을 행하였다.
실시예 6에서 조제한 pPT-DB1의 플라스미드 DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 34기재의 프라이머 및 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 23에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 β서브유닛의 108번째의 Glu가 Arg로 치환되어 있었다.
Figure kpo00024
[실시예 29] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(24)
β서브유닛의 108번째의 Glu를 Cys로 치환하기 위해, pPT-DB1플라스미드 DNA를 주형으로 해서, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 부위특이적인 변이도입을 행하였다.
실시예 6에서 조제한 pPT-DB1의 플라스미드 DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 35기재의 프라이머 및 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 24에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 β서브유닛의 108번째의 Glu가 Cys로 치환되어 있었다.
Figure kpo00025
[실시예 30] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(25)
β서브유닛의 108번째의 Glu를 Leu로 치환하기 위해, pPT-DB1플라스미드 DNA를 주형으로 해서, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 부위특이적인 변이도입을 행하였다.
실시예 6에서 조제한 pPT-DB1의 플라스미드 DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 36기재의 프라이머 및 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 25에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 β서브유닛의 108번째의 Glu가 Leu로 치환되어 있었다.
Figure kpo00026
[실시예 31] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(26)
β서브유닛의 108번째의 Glu를 Thr로 치환하기 위해, pPT-DB1플라스미드 DNA를 주형으로 해서, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 부위특이적인 변이도입을 행하였다.
실시예 6에서 조제한 pPT-DB1의 플라스미드 DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 37기재의 프라이머 및 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 26에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 β서브유닛의 108번째의 Glu가 Thr로 치환되어 있었다.
Figure kpo00027
[실시예 32] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(27)
β서브유닛의 200번째의 Ala를 Asp로 치환하기 위해, pPT-DB1플라스미드 DNA를 주형으로 해서, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 부위특이적인 변이도입을 행하였다.
실시예 6에서 조제한 pPT-DB1의 플라스미드 DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 38기재의 프라이머 및 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 27에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 β서브유닛의 200번째의 Ala가 Asp로 치환되어 있었다.
Figure kpo00028
[실시예 33] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(28)
β서브유닛의 200번째의 Ala를 Ile로 치환하기 위해, pPT-DB1플라스미드 DNA를 주형으로 해서, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 부위특이적인 변이도입을 행하였다.
실시예 6에서 조제한 pPT-DB1의 플라스미드 DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 39기재의 프라이머 및 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 28에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 β서브유닛의 200번째의 Ala가 Ile로 치환되어 있었다.
Figure kpo00029
[실시예 34] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(29)
β서브유닛의 200번째의 Ala를 Val로 치환하기 위해, pPT-DB1플라스미드 DNA를 주형으로 해서, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 부위특이적인 변이도입을 행하였다.
실시예 6에서 조제한 pPT-DB1의 플라스미드 DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 40기재의 프라이머 및 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 29에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 β서브유닛의 200번째의 Ala가 Val로 치환되어 있었다.
Figure kpo00030
[실시예 35] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(30)
β서브유닛의 200번째의 Ala를 Glu로 치환하기 위해, pPT-DB1플라스미드 DNA를 주형으로 해서, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 부위특이적인 변이도입을 행하였다.
실시예 6에서 조제한 pPT-DB1의 플라스미드 DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 41기재의 프라이머 및 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 30에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 β서브유닛의 200번째의 Ala가 Glu로 치환되어 있었다.
Figure kpo00031
[실시예 36] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(31)
β서브유닛의 212번째의 Ser을 Tyr로 치환하기 위해, pPT-DB1플라스미드 DNA를 주형으로 해서, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 부위특이적인 변이도입을 행하였다.
실시예 6에서 조제한 pPT-DB1의 플라스미드 DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 42기재의 프라이머 및 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 31에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 β서브유닛의 212번째의 Ser이 Tyr로 치환되어 있었다.
Figure kpo00032
[실시예 37] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(32)
클론 No.5주의 아미노산변이(α서브유닛의 19번째 : Ala가 Val)와 클론 No.11주의 아미노산변이(α서브유닛의 126번째 : Phe가 Tyr)를 함께 가지고 있는 아미노산치환체에 있어서도 니트릴히드라타제활성이 유지되고 있는 것을 확인하였다.
30㎖의 시험관에 10㎖의 LB액체배지를 조제하여, 121℃ㆍ20분간의 오토클레이브에 의해 멸균하였다. 이 배지에 최종농도가 100㎍/㎖가 되도록 암피실린을 첨가한 후, 실시예 16에서 얻어진 클론 No.11주를 일백균이 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양액 1㎖를 적당한 원심튜브에 분취한 후, 원심분리(15, 000rpm×5분)에 의해 균체를 분리하였다. 계속해서 알칼리 SDS추출법에 의해 이 균체로부터 클론 No.11주의 플라스미드 DNA를 조제하였다.
클론 No.11주의 플라스미드 DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 16기재의 프라이머 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 32에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 α서브유닛의 19번째의 Ala가 Val로 α서브유닛의 126번째의 Phe가 Tyr로 각각 치환되어 있었다.
Figure kpo00033
[실시예 38] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(33)
클론 No.1주의 아미노산변이(α서브유닛의 6번째 : Leu가 Met)와 클론 No.32주의 아미노산변이(α서브유닛의 19번째의 Ala가 Val : α서브유닛의 126번째 : Phe가 Tyr)를 함께 가지고 있는 아미노산치환체에 있어서도 니트릴히드라타제활성이 유지되고 있는 것을 확인하였다.
30㎖의 시험관에 10㎖의 LB액체배지를 조제하여, 121℃ㆍ20분간의 오토클레이브에 의해 멸균하였다. 이 배지에 최종농도가 100㎍/㎖가 되도록 암피실린을 첨가한 후, 실시예 37에서 얻어진 클론 No.32주를 일백균이 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양액 1㎖를 적당한 원심튜브에 분취한 후, 원심분리(15, 000rpm×5분)에 의해 균체를 분리하였다. 계속해서 알칼리 SDS추출법에 의해 이 균체로부터 클론 No.32주의 플라스미드 DNA를 조제하였다.
클론 No.32주의 플라스미드 DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 9기재의 프라이머 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론 중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 33에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 α서브유닛의 6번째의 Leu가 Met로 α서브유닛의 19번째의 Ala가 Val로, α서브유닛의 126번째의 Phe가 Tyr로 각각 치환되어 있었다.
Figure kpo00034
[실시예 39] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(34)
클론 No.2주의 아미노산변이(α서브유닛의 6번째 : Leu가 Thr)와 클론 No.32주의 아미노산변이(α서브유닛의 19번째의 Ala가 Val : α서브유닛의 126번째의 Phe가 Tyr)를 함께 가지고 있는 아미노산치환체에 있어서도 니트릴히드라타제활성이 유지되고 있는 것을 확인하였다.
실시예 37에서 조제한 클론 No.32주의 플라스미드 DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 13기재의 프라이머 및 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론 중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 34에 표시한 바와 같이 야생형의 니트릴히드라타제의 α서브유닛의 6번째의 Leu가 Thr로 α서브유닛의 19번째의 Ala가 Val로, α서브유닛의 126번째의 Phe가 Tyr로 각각 치환되어 있었다.
Figure kpo00035
[실시예 40] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(35)
클론 No.3주의 아미노산변이(α서브유닛의 6번째 : Leu가 Ala)와 클론 No.32주의 아미노산변이(α서브유닛의 19번째의 Ala가 Val ; α서브유닛의 126번째의 Phe가 Tyr)를 함께 가지고 있는 아미노산치환체에 있어서도 니트릴히드라타제활성이 유지되고 있는 것을 확인하였다.
실시예 37에서 조제한 클론 No.32주의 플라스미드 DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 14기재의 프라이머 및 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론 중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 35에 표시한 바와 같이 야생형의 니트릴히드라타제의 α서브유닛의 6번째의 Leu가 Ala로 α서브유닛의 19번째의 Ala가 Val로, α서브유닛의 126번째의 Phe가 Tyr로 각각 치환되어 있었다.
Figure kpo00036
[실시예 41] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(36)
클론 No.20주의 아미노산변이(β서브유닛의 108번째 : Glu가 Asp)와 클론 No.31주의 아미노산변이(β서브유닛의 212번째의 Ser가 Tyr)를 함께 가지고 있는 아미노산치환체에 있어서도 니트릴히드라타제활성이 유지되고 있는 것을 확인하였다.
30㎖의 시험관에 10㎖의 LB액체배지를 조제하여, 121℃ㆍ20분간의 오토클레이브에 의해 멸균하였다. 이 배지에 최종농도가 100㎍/㎖가 되도록 암피실린을 첨가한 후, 실시예 36에서 얻어진 클론 No.31주를 일백균이 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양액 1㎖를 적당한 원심튜브에 분취한 후, 원심분리(15, 000rpm×5분)에 의해 균체를 분리하였다. 계속해서 알칼리 SDS추출법에 의해 이 균체로부터 클론 No.31주의 플라스미드 DNA를 조제하였다.
클론 No.31주의 플라스미드 DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 31기재의 프라이머 및 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론 중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 36에 표시한 클론에 있어서 니트릴히드라타제의 β서브유닛의 108번째의 Glu가 Asp로,β서브유닛의 212번째의 Ser이 Tyr로 각각 치환되어 있었다.
Figure kpo00037
[실시예 42] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(37)
클론 No.23주의 아미노산변이(β서브유닛의 108번째 : Glu가 Arg)와 클론 No.31주의 아미노산변이(β서브유닛의 212번째 : Ser이 Tyr)를 함께 가지고 있는 아미노산치환체에 있어서도 니트릴히드라타제활성이 유지되고 있는 것을 확인하였다.
실시예 41에서 조제한 클론 No.31주의 플라스미드 DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 34기재의 프라이머 및 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론 중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 37에 표시한 바와 같이 야생형의 니트릴히드라타제의 β서브유닛의 108번째의 Glu가 Arg로, β서브유닛의 212번째의 Ser이 Tyr로 각각 치환되어 있었다.
Figure kpo00038
[실시예 43] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(38)
클론 No.30주의 아미노산변이(β-서브유닛의 200번째 : Ala가 Asp)와 클론 No.31주의 아미노산변이(β서브유닛의 212번째의 Ser이 Tyr)를 함께 가지고 있는 아미노산치환체에 있어서도 니트릴히드라타제활성이 유지되고 있는 것을 확인하였다.
실시예 41에서 조제한 클론 No.31주의 플라스미드 DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 38기재의 프라이머 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론 중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 38에 표시한 바와 같이 야생형의 니트릴히드라타제의 β서브유닛의 200번째의 Ala가 Asp로, β서브유닛의 212번째의 Ser이 Tyr로 각각 치환되어 있었다.
Figure kpo00039
[실시예 44] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(39)
클론 No.30주의 아미노산변이(β서브유닛의 200번째 : Ala가 Glu)와 클론 No.31주의 아미노산변이(β서브유닛의 212번째 : Ser이 Tyr)를 함께 가지고 있는 아미노산치환체에 있어서도 니트릴히드라타제활성이 유지되고 있는 것을 확인하였다.
실시예 41에서 조제한 클론 No.31주의 플라스미드 DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 41기재의 프라이머 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론 중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 39에 표시한 바와 같이 야생형의 니트릴히드라타제의 β서브유닛의 200번째의 Ala가 Glu로, β서브유닛의 212번째의 Ser이 Tyr로 각각 치환되어 있었다.
Figure kpo00040
[실시예 45] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(40)
클론 No.23주의 아미노산변이(β서브유닛의 108번째 : Glu가 Arg)와 클론 No.39주의 아미노산변이(β서브유닛의 200번째의 Ala가 Glu : β서브유닛의 212번째의 Ser이 Tyr)를 함께 가지고 있는 아미노산치환체에 있어서도 니트릴히드라타제활성이 유지되고 있는 것을 확인하였다.
30㎖의 시험관에 10㎖의 LB액체배지를 조제하여, 121℃ㆍ20분간의 오토클레이브에 의해 멸균하였다. 이 배지에 최종농도가 100㎍/㎖가 되도록 암피실린을 첨가한 후, 실시예 36에서 얻어진 클론 No.39주를 일백균이 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양액 1㎖를 적당한 원심튜브에 분취한 후, 원심분리(15, 000rpm×5분)에 의해 균체를 분리하였다. 계속해서 알칼리 SDS추출법에 의해 이 균체로부터 클론 No.39주의 플라스미드 DNA를 조제하였다.
클론 No.32주의 플라스미드 DNA 1㎍을 주형으로 해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. PCR반응 No.1은, 서열목록의 서열번호 34기재의 프라이머 및 M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 행하였다. PCR반응 No.2는 MUT4프라이머(서열목록의 서열번호 11에 서열을 기재) 및 M13프라이머 RV(서열목록의 서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 함유한 전체량 50㎕의 계(조성은 키트에 기재된 조건에 의함)에서, PCR반응 No.1과 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. PCR반응 No.1 및 No.2의 반응종료액 각 5㎕를 사용한 아가로우즈전기영동(아가로우즈농도 1.0중량%)에 의해 DNA증폭산물의 분석을 행하였던 바, 증폭 DNA산물의 존재를 확인할 수 있었다. 이후, 실시예 6과 아주 똑같은 조작에 의해 대장균뱅크를 조제하였다.
상기 대장균뱅크로부터 임의로 선별한 5클론을 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5클론 중 4클론에서 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 이 4클론의 균체를 각각 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 40에 표시한 바와 같이 야생형의 니트릴히드라타제의 β서브유닛의 108번째의 Glu가 Arg로, β서브유닛의 200번째의 Ala가 Glu로, β서브유닛의 212번째의 Ser이 Tyr로 각각 치환되어 있었다.
Figure kpo00041
[실시예 46] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(41)
클론 No.34의 아미노산변이와 클론 No.36 의 아미노산변이를 함께 가지고 있는 아미노산치환체에 있어서도 니트릴히드라타제활성이 유지되고 있는 것을 확인하였다.
30㎖의 시험관에 10㎖의 LB액체배지를 조제하여, 121℃ㆍ20분간의 오토클레이브에 의해 멸균하였다. 이 배지에 최종농도가 100㎍/㎖가 되도록 암피실린을 첨가한 후, 실시예 36에서 얻어진 클론 No.34주 및 실시예 41에서 얻어진 클론 No.36주를 일백균이 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양액 1㎖를 적당한 원심튜브에 분취한 후, 원심분리(15,000rpm×5분)에 의해 균체를 분리하였다. 계속해서 알칼리 SDS추출법에 의해 이 균체로부터 클론 No.34주 및 클론 No.36주의 플라스미드 DNA를 조제하였다.
클론 No.36주의 플라스미드 DNA위의 유일한 제한효소사이트인 EcoRI 및 NotⅠ에 의해 이 플라스미드 DNA를 절단한 후, 아가로우즈겔(시그머회사제타입 Ⅶ저융점아가로우즈사용; 아가로우즈농도 1.0%)을 행하여, 아가로우즈겔로부터 약 770bp의 DNA단편을 잘라냈다. 마찬가지로, 클론No.34주의 플라스미드DNA위의 유일한 제한효소사이트인 EcoRI 및 NotⅠ에 의해 이 플라스미드 DNA를 절단한 후, 아가로우즈겔전기영동(시그머회사제, 타입 Ⅶ저융점아가로우즈사용; 아가로우즈농도 0.7%)을 행하여, 아가로우즈겔로부터 약 3.8Kbp의 DNA단편을 잘라냈다. 잘라낸 양 아가로우즈조각(약 0.1g)을 미세하게 분쇄하여 1㎖의 TE용액에 각각 현탁후, 55℃에서 1시간 보온해서 아가로우즈를 완전 용해시켰다. 이 융해액에 대해서 실시예 2와 마찬가지의 페놀/클로로포름추출과 에탄올침전을 행하여 각 DNA단편을 정제하여, 최종적으로 10㎕의 TE에 융해하였다.
이와 같이 해서 얻어진 클론 No.36주 유래의 약 770bp의 DNA단편과 클론No.34주 유래의 약 3.8Kbp의 DNA단편을 DNA라이게이션키트(일본국 타카라주조회사제)를 사용해서 연결시켜서, pPT-DB41을 구축하였다. 이 pPT-DB41플라스미드 DNA를 대장균 HB101의 콤피텐트셀(일본국 토요보세키회사제)에 도입하여, 대장균클론 No.41주를 얻었다.
클론No.41주를 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 클론No.41주는, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 균체를 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론No.41주의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 41에 표시한 바와 같이 야생형의 니트릴히드라타제의 α서브유닛의 6번째의 Leu가 Thr로, α서브유닛의 19번째의 Ala가 Val로, α서브유닛의 126번째의 Phe가 Tyr로, β서브유닛의 108번째의 Glu가 Asp로, β서브유닛의 212번째의 Ser이 Tyr로 각각 치환되어 있었다.
Figure kpo00042
[실시예 47] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(42)
클론 No.34 의 아미노산변이와 클론 No.37의 아미노산변이를 함께 가지고 있는 아미노산치환체에 있어서도 니트릴히드라타제활성이 유지되고 있는 것을 확인하였다.
30㎖의 시험관에 10㎖의 LB액체배지를 조제하여, 121℃ㆍ20분간의 오토클레이브에 의해 멸균하였다. 이 배지에 최종농도가 100㎍/㎖가 되도록 암피실린을 첨가한 후, 실시예 42에서 얻어진 클론 No.37주를 일백균이 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양액 1㎖를 적당한 원심튜브에 분취한 후, 원심분리(15, 000rpm×5분)에 의해 균체를 분리하였다. 계속해서 알칼리 SDS추출법에 의해 이 균체로부터 클론 No.37주의 플라스미드 DNA를 조제하였다.
클론 No.37주의 플라스미드 DNA위의 유일한 제한효소사이트인 EcoRI 및 NotⅠ에 의해 이 플라스미드 DNA를 절단한 후, 아가로우즈겔전기영동(시그머회사제, 타입 Ⅶ저융점아가로우즈사용; 아가로우즈농도 1.0%)을 행하여, 아가로우즈겔로부터 약 770bp의 DNA단편을 잘라냈다. 마찬가지로, 실시예 46조에서 조제한 클론No.34주의 플라스미드DNA이의 유일한 제한효소사이트인 EcoRI 및 NotⅠ에 의해 이 플라스미드 DNA를 절단한 후, 아가로우즈겔전기영동(시그머회사제, 타입 Ⅶ저융점아가로우즈사용; 아가로우즈농도 0.7%)을 행하여, 아가로우즈겔로부터 약 3.8Kbp의 DNA단편을 잘라냈다. 잘라낸 양 아가로우즈조각(약 0.1g)을 미세하게 분쇄하여 1㎖의 TE용액에 각각 현탁후, 55℃에서 1시간 보온해서 아가로우즈를 완전 용해시켰다. 이 융해액에 대해서 실시예 2와 마찬가지의 페놀/클로로포름추출과 에탄올침전을 행하여 각 DNA단편을 정제하여, 최종적으로 10㎕의 TE에 융해하였다.
이와 같이 해서 얻어진 클론 No.37주 유래의 약 770bp의 DNA단편과 클론No.34주 유래의 약 3.8Kbp의 DNA단편을 DNA라이게이션키트(일본국 타카라주조회사제)를 사용해서 연결시켜서, pPT-DB42을 구축하였다. 이 pPT-DB42플라스미드 DNA를 대장균 HB101의 콤피텐트셀(일본국 토요보세키회사제)에 도입하여, 대장균클론 No.42주를 얻었다.
클론No.42주를 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 클론No.42주는, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 균체를 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론No.42주의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 42에 표시한 바와 같이 야생형의 니트릴히드라타제의 α서브유닛의 6번째의 Leu가 Thr로, α서브유닛의 19번째의 Ala가 Val로, α서브유닛의 126번째의 Phe가 Tyr로, β서브유닛의 108번째의 Glu가 Arg로, β서브유닛의 212번째의 Ser이 Tyr로 각각 치환되어 있었다.
Figure kpo00043
[실시예 48] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(43)
클론 No.34 의 아미노산변이와 클론 No.39주의 아미노산변이를 함께 가지고 있는 아미노산치환체에 있어서도 니트릴히드라타제활성이 유지되고 있는 것을 확인하였다.
30㎖의 시험관에 10㎖의 LB액체배지를 조제하여, 121℃ㆍ20분간의 오토클레이브에 의해 멸균하였다. 이 배지에 최종농도가 100㎍/㎖가 되도록 암피실린을 첨가한 후, 실시예 44에서 얻어진 클론 No.39주를 일백균이 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양액 1㎖를 적당한 원심튜브에 분취한 후, 원심분리(15, 000rpm×5분)에 의해 균체를 분리하였다. 계속해서 알칼리 SDS추출법에 의해 이 균체로부터 클론 No.39주의 플라스미드 DNA를 조제하였다.
클론 No.39주의 플라스미드 DNA위의 유일한 제한효소사이트인 EcoRI 및 NotⅠ에 의해 이 플라스미드 DNA를 절단한 후, 아가로우즈겔(시그머회사제, 타입 Ⅶ저융점아가로우즈사용; 아가로우즈농도 1.0%)을 행하여, 아가로우즈겔로부터 약 770bp의 DNA단편을 잘라냈다. 마찬가지로, 실시예 46에서 조제한 클론No.34주의 플라스미드DNA위의 유일한 제한효소사이트인 EcoRI 및 NotⅠ에 의해 이 플라스미드 DNA를 절단한 후, 아가로우즈겔전기영동(시그머회사제, 타입 Ⅶ저융점아가로우즈사용; 아가로우즈농도 0.7%)을 행하여, 아가로우즈겔로부터 약 3.8Kbp의 DNA단편을 잘라냈다. 잘라낸 양 아가로우즈조각(약 0.1g)을 미세하게 분쇄하여 1㎖의 TE용액에 각각 현탁후, 55℃에서 1시간 보온해서 아가로우즈를 완전 용해시켰다. 이 융해액에 대해서 실시예 2와 마찬가지의 페놀/클로로포름추출과 에탄올침전을 행하여 각 DNA단편을 정제하여, 최종적으로 10㎕의 TE에 용해하였다.
이와 같이 해서 얻어진 클론 No.39주 유래의 약 770bp의 DNA단편과 클론No.34주 유래의 약 3.8Kbp의 DNA단편을 DNA라이게이션키트(일본국 타카라주조회사제)를 사용해서 연결시켜서, pPT-DB43을 구축하였다. 이 pPT-DB43플라스미드 DNA를 대장균 HB101의 콤피텐트셀(일본국 토요보세키회사제)에 도입하여, 대장균클론 No.43주를 얻었다.
클론No.43주를 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 아크릴아미드의 생성이 검출되어, 클론 No.43주는, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 균체를 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론No.43주의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 43에 표시한 바와 같이 야생형의 니트릴히드라테제의 α서브유닛의 6번째의 Leu가 Thr로, α서브유닛의 19번째의 Ala가 Val로, α서브유닛의 126번째의 Phe가 Tyr로, β서브유닛의 200번째의 Ala가 Glu로, β서브유닛의 212번째의 Ser이 Tyr로 각각 치환되어 있었다.
Figure kpo00044
[실시예 49] 니트릴히드라타제활성을 유지한 아미노산치환체의 취득(44)
클론 No.34 의 아미노산변이와 클론 No.40 의 아미노산변이를 함께 가지고 있는 아미노산치환체에 있어서도 니트릴히드라타제활성이 유지되고 있는 것을 확인하였다.
30㎖의 시험관에 10㎖의 LB액체배지를 조제하여, 121℃ㆍ20분간의 오토클레이브에 의해 멸균하였다. 이 배지에 최종농도가 100㎍/㎖가 되도록 암피실린을 첨가한 후, 실시예 45에서 얻어진 클론 No.40주를 일백균이 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양액 1㎖를 적당한 원심튜브에 분취한 후, 원심분리(15, 000rpm×5분)에 의해 균체를 분리하였다. 계속해서 알칼리 SDS추출법에 의해 이 균체로부터 클론 No.40주의 플라스미드 DNA를 조제하였다.
클론 No.40주의 플라스미드 DNA위의 유일한 제한효소사이트인 EcoRI 및 NotⅠ에 의해 이 플라스미드 DNA를 절단한 후, 아가로우즈겔(시그머회사제, 타입 Ⅶ저융점아가로우즈사용; 아가로우즈농도 1.0%)을 행하여, 아가로우즈겔로부터 약 770bp의 DNA단편을 잘라냈다. 마찬가지로, 실시예 46조에서 조제한 클론No.34주의 플라스미드DNA위의 유일한 제한효소사이트인 EcoRI 및 NotⅠ에 의해 이 플라스미드 DNA를 절단한 후, 아가로우즈겔전기영동(시그머회사제, 타입 Ⅶ저융점아가로우즈사용; 아가로우즈농도 0.7%)을 행하여, 아가로우즈겔로부터 약 3.8Kbp의 DNA단편을 잘라냈다. 잘라낸 양 아가로우즈조각(약 0.1g)을 미세하게 분쇄하여 1㎖의 TE용액에 각각 현탁후, 55℃에서 1시간 보온해서 아가로우즈를 완전 용해시켰다. 이 융해액에 대해서 실시예 2와 마찬가지의 페놀/클로로포름추출과 에탄올침전을 행하여 각 DNA단편을 정제하여, 최종적으로 10㎕의 TE에 용해하였다.
이와 같이 해서 얻어진 클론 No.40주 유래의 약 770bp의 DNA단편과 클론No.34주 유래의 약 3.8Kbp의 DNA단편을 DNA라이게이션키트(일본국 타카라주조회사제)를 사용해서 연결시켜서, pPT-DB44을 구축하였다. 이 pPT-DB44플라스미드 DNA를 대장균 HB101의 콤피텐트셀(일본국 토요보세키회사제)에 도입하여, 대장균클론 No.44주를 얻었다.
클론No.44주를 실시예 6의 활성발현배지 10㎖에 각 일백균이씩 식균하여, 37℃ㆍ300rpm에서 약 20시간 배양하였다. 이 배양종료액 1㎖를 각각 적당한 원심튜브에 분취한 후, 실시예 6과 마찬가지 조작에 의해 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 아크릴아미드의 생성이 검출되고, 클론No.41주는, 니트릴히드라타제활성을 유지하고 있는 것이 확인되었다.
니트릴히드라타제활성의 측정에 제공한 상기 배양액의 나머지부 1㎖로부터 균체를 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 조제하였다. 계속해서, 실시예 2와 마찬가지 조작에 의해 각 클론 No.44주의 니트릴히드라타제구조유전자의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 표 44에 표시한 바와 같이 야생형의 니트릴히드라테제의 α서브유닛의 6번째의 Leu가 Thr로, α서브유닛의 19번째의 Ala가 Val로, α서브유닛의 126번째의 Phe가 Tyr로, β서브유닛의 108번째의 Glu가 Asp로, β서브유닛의 200번째의 Ala이 Glu로, β서브유닛의 212번째의 Ser이 Tyr로 각각 치환되어 있었다.
Figure kpo00045
본 발명에 의해 슈도노카르디아ㆍ서모필라유래의 니트릴히드라타제의 아미노산서열 및 유전자서열이 제공된다. 또, 이 니트릴히드라타제의 기능을 실질적으로 변화시키지 않고, 그 염기서열 및 아미노산서열을 변화시키는 방법 및 이 방법에 의거한 염기서열 및 아미노산서열이 변화한 니트릴히드라타제가 제공된다. 또, 이 유전자를 함유한 재결합플라스미드, 이 재결합플라스미드를 함유한 형질전환균주, 이 형질전환균주를 사용한 이 효소의 생산방법 및 이 형질전환균주를 사용한 니트릴화합물로부터의 대응하는 아미드화합물의 제조방법이 제공된다.
[서열 목록]
서열번호 : 1
서열길이 : 205
서열의 타입 : 아미노산
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 단백질
기원
생물명 : 슈도노카르디아ㆍ서모필라(Psuedonocardia thermophila)
주명 : JCM3095
직접의 기원
클론명 : pPT-DBI
서열의 특징
특징을 결정하는 방법 : E
다른 정보 : 니트릴히드라타제 α서브유닛
Figure kpo00046
서열번호 : 2
서열의 길이 : 2 3 3
서열의 타입 : 아미노산
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 단백질
기원
생물명 : 슈도노르디아 서모필라
주명 : JCM3095
직접이 기원
클론명 : pPT-DBI
서열의 특징
특징을 결정하는 방법 : E
다른 정보 : 니트릴히드라타제 β서브유닛
Figure kpo00047
서열번호 : 3
서열의 길이 : 6 1 8
서열의 타입 : 핵산
사슬의 수 : 2본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 게놈 DNA
기원
생물명 : 슈도노카르디아ㆍ서모필라
주명 : JCM3095
직접의 기원
클론명 : pPT-DBI
서열의 특징
특징을 결정하는 방법 : E
다른 정보 : 니트릴히드라타제 α서브유닛
Figure kpo00048
서열번호 : 4
서열의 길이 : 7 0 2
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 2본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 게놈 DNA
기원
생물명 : 슈도노카르디아ㆍ서모필라
주명 : JCM3095
직접의 기원
클론명 : pPT-DBI
서열의 특징
특징을 결정하는 방법 : E
다른 정보 : 니트릴히드라타제 β서브유닛
Figure kpo00049
서열번호 : 5
서열의 길이 : 2 0
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 :1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
서열의 특징 : N은, A 또는 C 또는 G 또는 T
Figure kpo00050
서열번호 : 6
서열의 길이 : 2 0
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
서열의 특징 : N은, A 또는 C 또는 G 또는 T
Figure kpo00051
서열번호 : 7
서열의 길이 : 2 0
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
서열의 특징 : N은, A 또는 C 또는 G 또는 T
Figure kpo00052
서열번호 : 8
서열의 길이 : 2 0
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
서열의 특징 : N은, A 또는 C 또는 G 또는 T
Figure kpo00053
서열번호 : 9
서열의 길이 : 18
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00054
서열번호 : 10
서열의 길이 : 17
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00055
서열번호 : 21
서열의 길이 : 10
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00056
서열번호 : 12
서열의 길이 : 17
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00057
서열번호 : 13
서열의 길이 : 18
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00058
서열번호 : 14
서열의 길이 : 18
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류: 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00059
서열번호 : 15
서열의 길이 : 18
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00060
서열번호 : 16
서열의 길이 : 18
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00061
서열번호 : 17
서열의 길이 : 18
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00062
서열번호 : 18
서열의 길이 : 18
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00063
서열번호 : 19
서열의 길이 : 18
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00064
서열번호 : 20
서열의 길이 : 18
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00065
서열번호 : 21
서열의 길이 : 18
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00066
서열번호 : 22
서열의 길이 : 18
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00067
서열번호 : 23
서열의 길이 : 18
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00068
서열번호 : 24
서열의 길이 : 18
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00069
서열번호 : 25
서열의 길이 : 18
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00070
서열번호 : 26
서열의 길이 : 18
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00071
서열번호 : 27
서열의 길이 : 18
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00072
서열번호 : 28
서열의 길이 : 18
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00073
서열번호 : 29
서열의 길이 : 18
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00074
서열번호 : 30
서열의 길이 : 18
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00075
서열번호 : 31
서열의 길이 : 18
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00076
서열번호 : 32
서열의 길이 : 18
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00077
서열번호 : 33
서열의 길이 : 18
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00078
서열번호 : 34
서열의 길이 : 18
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00079
서열번호 : 35
서열의 길이 : 18
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00080
서열번호 : 36
서열의 길이 : 18
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00081
서열번호 : 37
서열의 길이 : 18
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00082
서열번호 : 38
서열의 길이 : 18
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00083
서열번호 : 39
서열의 길이 : 18
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00084
서열번호 : 40
서열의 길이 : 18
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00085
서열번호 : 41
서열의 길이 : 18
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00086
서열번호 : 42
서열의 길이 : 18
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직사슬상
서열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA
Figure kpo00087

Claims (16)

  1. 서열목록의 서열번호 1기재의 아미노산 서열에 의해 표시되는 α서브유닛 및 서열목록의 서열번호 2기재의 아미노산서열에 의해 표시되는 β서브유닛으로 구성되는 것을 특징으로 하는 니트릴히드라타제.
  2. 제1항에 있어서, 슈도노카르디아ㆍ서모필라(Pseudonocardia thermophila JCM3095) 유래인 것을 특징으로 하는 니트릴히드라타제.
  3. 서열목록의 서열번호 1기재의 아미노산서열의 6번째, 19번째, 38번째. 77번째, 90번째, 102번째, 106번째, 126번째, 130번째, 142번째, 146번째, 187번째, 194번째 및 203번째의 아미노산의 어느 한 개 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환해서 얻어지는 α서브유닛을 구성요소로서 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 니트릴히드라타제.
  4. 서열목록의 서열번호 2기재의 아미노산서열의 20번째, 21번째, 108번째, 200번째, 212번째의 아미노산의 어느 한 개이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환해서 얻어지는 β서브유닛을 구성요소로서 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 니트릴히드라타제.
  5. 제1항에 기재된 니트릴히드라타제의 α서브유닛을 코딩하는 것을 특징으로 하는 유전자.
  6. 서열목록의 서열번호 3에 기재된 염기서열로 표시되는 니트릴히드라타제의 α서브유닛을 코딩하는 것을 특징으로 하는 유전자
  7. 서열목록의 서열번호 3에 기재된 염기서열의 16번째로부터 18번째, 55번째로 부터 57번째, 112번째로부터 114번째, 229번째로부터 231번째, 268번째로부터 270번째, 304번째로부터 306번째, 316번째로부터 318번째, 376번째로부터 378번째, 388번째로부터 390번째, 424번째로부터 426번째, 436번째로부터 438번째, 559번째로부터 561번째, 580번째로부터 582번째, 607번째로부터 609번째의 어느 한 개이상의 염기서열을 다른 서열로 치환해서 얻어지는 염기서열로 표시되는 니트릴히드라타제의 α서브유닛을 코딩하는 것을 특징으로 하는 유전자.
  8. 제1항에 기재된 니트릴히드라타제의 β서브유닛을 코딩하는 것을 특징으로 하는 유전자.
  9. 서열목록의 서열번호 4에 기재된 염기서열로 표시되는 니트릴히드라타제의 β서브유닛을 코딩하는 것을 특징으로 하는 유전자.
  10. 서열목록의 서열번호 4에 기재된 염기서열의 58번째로부터 60번째, 61번째로부터 63번째, 322번째로부터 324번째, 598번째로부터 600번째, 634번째로부터 636번째의 어느 한 개이상의 염기서열을 다른 염기서열로 치환해서 얻어지는 염기서열로 표시되는 니트릴히드라타제의 β서브유닛을 코딩하는 것을 특징으로 하는 유전자.
  11. 제5항, 제6항 또는 제7항에 기재된 니트릴히드라타제의 α서브유닛을 코딩하는 유전자 또는 제11항, 제13항 또는 제15항에 기재된 니트릴히드라타제의 β서브유닛을 코딩하는 유전자의 어느 것을 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 재결합플라스미드.
  12. 제5항, 제6항, 또는 제7항에 기재된 니트릴히드라타제의 α서브유닛을 코딩하는 유전자 및 제8항, 제9항 또는 제10항에 기재된 니트릴히드라타제의 β서브유닛을 코딩하는 유전자를 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 재결합플라스미드.
  13. 제11항에 기재된 재결합플라스미드를 유지하는 것을 특징으로 하는 형질전환주
  14. 제12항에 기재된 재결합플라스미드를 유지하는 것을 특징으로 하는 형질전환주.
  15. 제13항 또는 제14항에 기재된 형질전환주를 배양해서, 배양에 의해 얻어진 형질전환주, 배양액 및 그들의 처리물로부터 니트릴히드라타제를 회수하는 것을 특징으로 하는 니트릴히드라타제의 생산방법.
  16. 제13항 또는 제14항에 기재된 형질전환주를 배양해서, 배양에 의해 얻어진 형질전환주, 배양액 및 그들의 처리물, 혹은 그것으로부터 얻어지는 니트릴히드라타제와 니트릴화합물을 수성매체속에서 접촉시켜서 이 니트릴화합물에 대응하는 아미드화합물을 제조하는 방법.
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