JPH02504226A - 枯草菌のｓａｃＵ座及びｓａｃＵ↑ｈ座の機能部を含むＤＮＡ配列、かかる配列を含むベクター、及び、タンパク質産生方法におけるこれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 草　の５ａｅＵ座　び５ｉｃｋ”　　の　ｍ　　むＤＮＡ　　　かかベ　　−　 　び　　ンバ　　　　　　　におＣ１二ｊＪロ医１月 本発明は、枯草菌（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ）のゲノムに存在する何座及び註残 １座の機能部を含むＤＮＡ配列、かかる配列を含むベクター、及び、これらの配 列及びベクターの使用、即ちこれらの配列及びベクターが予め組み込まれた枯草 菌及びその他の適当な微生物によるタンパク質の産生刺激に係る。 「辻什遺伝子」なる呼称が枯草菌の分解酵素をコードする構造遺伝子の発現調節 遺伝子を意味することは公知である（ＬＥＰＥＳＡＮＴ等、Ｍｏ１．Ｃｅｎ、Ｇ ｅｎｅｔ、：１１８：１３５〜１６０（１９７２）；ＫＵＮＳＴ等、Ｂｉｏｃｈ ｉｍｉｅ　５６：１４８１〜１４８９（１９７４）；５ＴＥＩＮＮＥＴ２等、Ｍ ｏｌ。 Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、１４８　：２８１〜２８５（１９７６）　、ＺＵＫＯ ｌＩＳＫｌ等、Ｃｅｎｅ、４６：２４７〜２５５（１９８６））。 また枯草菌中には、分解酵素をコードする構造遺伝子のクラスの発現を調節する 少なくとも２つの別の遺伝子、即ち旺■遺伝子（ＮＡＣ＾旧等、　Ｊ、　Ｂａｃ ｔｅｒｉｏｌ、、１６６：２０〜２８（１９８６）：ＹＡＮＧ等、Ｊ、　Ｂｉｅ ｔｅｒｉｏｌ、１６９：４３４〜４３７（１９８７））、及び５３３Ｊ遺伝子（ ＬＥＰＥＳＡＮＴ等（１９７２）、前出；にＵＮＳＴ等（１９）４）、前出；Ｔ ＯＭＩＯに八等、Ｊ、　Ｂｉｏｔｅｅｂｎｏｌ、、３：８５〜９６（１９８５） ；ＹＡＮＩＩ；等、Ｊ。 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１６６．１１３〜１１９（１９８６）　：＾ＭＯＲＹ等 、Ｊ、Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、、１６９；３２４〜３３３（１９８７））が存在す る。 これらの３つのタイプの調節遺伝子は多面発現性遺伝子であり、種々のバチルス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌中で分解酵素産生をコードする多数の遺伝子の発現をコ ントロールする。 社１、回及び肛」のコントロール下に構造遺伝子によってコードされ枯草菌によ って培地中に分泌される酵素の例は、レバン−サッカラーゼ、アルカリ性及び中 性のプロテアーゼ、α−アミラーゼ、グリカナーゼ（ＰＲＩＥＳＴ、Ｂａｅｔｅ ｒｉｏｌ　。 Ｒｅｖ　、、４１ニア１１〜７５３（１９７７））である。 枯草菌のゲノムの■旦及び回のレベルに発生した突然変異は枯草菌による前記酵 素の過剰産生な誘発する。 遺伝子型■ｍ１２ｈ及び回１によって示されるこれらの突然変異は、枯草菌に表 現型Ｌｖｓ’″、Ｐｒｔｈ及びＡｎｙ’を与える。これらの表現型は夫々、レバ ン−サッカラーゼ、プロテアーゼ及びα−アミラーゼの過剰産生として発現する 。 これに反して、５ａｅＬＩ座のレベルにのみ発生する別のタイプの突然変異は、 枯草菌におけるレバン−サッカラーゼ及びプロテアーゼの合成率をかなり低下さ せる。この後者の突然変異は枯草菌に表現型Ｌｖｓ−及びｆ’ｒｔ−を与え、遺 伝子型５ｕｅ（１−によって示される。 要約すると、面圧及び辻蚊座は、枯草菌標準株Ｍａｒｂｕｒｇ１６８及びその誘 導体の合成レベルを示す鉄住°、ｄ’、合成レベルの増加を示す突然変異遺伝子 型５ａｃｋ”、■掴１またはかなり低下した合成レベルを示す■旦−とじて表記 される。 ｓａｃ’ｌＪ座のレベルで突然変異５ａｅＵ−及び銭蛯１は密接に関連しく形質 転換毎に６〜９％の組換え）、従って、同一遺伝子または密接に関連する２つの 遺伝子に担持されている（Ｓ丁ＥＩＮＮＥＴ２等、Ｍｏ１．　Ｇｅｎ＝　Ｃｅｎ ｅｔ、、１４８：２Ｂ１〜２８５、（１９７６））。 ■ｌ座及び■≦座は依存的に作用すると考えられる。染色体突然変異μｒ、また はプラスミドに含まれたＬＬＪもしくは旺■の多数コピーの存在によって宿主細 胞中で酵素を過剰産生ずる表現型（即ち、高レベルの分解酵素合成を示す表現型 Ｄｅｇ”）が与えられるが、この表現型は、突然変異５ｉｃＵ−の存在によって 相殺される（ＨＥＮＮＥＲ等、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ　ｔｈｅ　ｆｉｆｔ ｈ　１ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｅｎ ｅｔｉｃｓｏｆ　　１ｎｄｕｓｔｒｉａｌ　　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、 　５ｐｌｉｔ、　　Ｙｕｇｏｓｌａｖｉａ、　　ｐｐ８１〜９０．１９８６）　 、へＭＯＲＹ等（１９８７）、前出；ＴＡＮＡＫＡ　＆　ＫＡＩＩＩＡＴ＾、Ｊ 。 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　、、　１フＯ：３５９３〜３６００（１９８Ｂ））。 従って、バチルス菌の種々の菌株に由来の■１座、■」座または同等の活性をも つ別のＤＮＡ配列は、バチルス菌中の種々の酵素の合成の転写レベルに前記のご とき作用を与えるという理由によって注目され、特に、工業レベルでの酵素合成 の分野で重要視されていることが理解されよう。 バチルス菌の種々の菌株がらＤＮＡフラグメントをクローニングすることは最近 いくつかの研究グループによって発表された。これらのフラグメントは枯草菌中 でプロテアーゼまたはその他の酵素を過剰産生させ得る。 １９８３年７月１９日出願の０ＫＡＤ＾等による日本特許出願第６０−３０．６ ８５号は、Ｂ、　１ｉｃｂｅｎｉｆｏｒ＋ｓｉｓのプロテアーゼをコードしＢ、 　１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒ＋＋ｉｓのゲノムに由来する挿入配列を含む組換えＤＮ Ａを開示している。該特許の発明者等は、枯草菌培養物を形質転換させてアルカ リ性及び中性のプロテアーゼの産生能を増加させるために前記組換えＤＮＡを使 用した。 ０ＫＡＤ＾等（＾ｐｐ１．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌ、、 ２０：４０６〜４１２（１９８４））は、Ｂ、　ｌｉｅｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓに 由来の３．６ｋｂのＥｃｏＲｌフラグメントをクローニングした。該フラグメン トは中性プロテアーゼ及びアルカリ性プロテアーゼの分泌を十分に測部するが（ ７０ｘ）、α−アミラーゼ型酵素に対しては微弱な効果しか示さない（２Ｘ）、 ｉ！！察された表現型は、１．２５ｋｂのＰｖｕ■フラグメントのクローニング の際に維持され、また、ＥｅｏＲｌフラグメントから得られた０、３７ｋｂの畢 ３＾１フラグメントのクローニングの際にも維持された。 また、ＴＯＭＩＯＫ八等（Ｊ、　Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌ、、３：８５〜９Ｂ（１ ９８５））は、Ｂ、　ａｍ　１ｏｌｉ　ｕｅｆａｅｉｅｎｓに由来の４ｋｂのＥ ｃｏＲｌフラグメントによる中性プロテアーゼ（１０ｘ）及びアルカリ性プロテ アーゼ（９Ｘ）の産生刺激を記載している。このフラグメントは未同定の読取り 枠（ｐｈａｓｅ　ｏｕｖｅｒｔｅ　ｄｅ　１ｅｅｔｕｒｅ）を含む１．７５の合 成を刺激することはできない。 Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｎａｔｔｏに由来のＤＮＡフラグメントが、アルカリ性及び 中性のプロテアーゼ及びレバン−サッカラーゼを過剰産生させることも発表され た（Ｊ、　Ｂｉｅｔｅｒｉｏｌ、、１６６：２０〜２Ｂ（１９８６））、著者等 は、６０個のアミノ酸から成るポリペプチドが該産生の刺激に関与すると予想し た。 枯草菌の払並遺伝子（ポリペプチド５ａｅＱｘ）（Ｊ、Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、、 １６６：１１３〜１１９（１９８６））、Ｂ、　ａｍ　１ｏｌｉ　ｕｅｆｉｃｉ ｅｎｓの回遺伝子（ポリペプチド５ａｅＱＡ）（Ｊ、Ｂｉｏｔｅｅｂｎｏｌ、、 ３．８５〜９６（１９８５））によってコードされる４６個のアミノ酸を含むポ リペプチドは、分解酵素合成の活性化物質であると説明されている。 １９８６年８月１８日出願のＬ’　ｌＮ５ＴＩＴＵＴ　ＰＡＳＴＥＵＲｅｔ　ｄ ｕ　ＣＥＮＴＲＥＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＤＥ　ＬＡ　ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ　５ＣＩ ＥＮＴＩＦＩＱＵＥ−８義のフランス特許第８６．１１８２６号の記載によれば 、Ｂ、　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのＵｌ遺伝子及び該鈷」遺伝子によってコ ードされるポリペプチド５ｉｅＱ、が同定され、所定ポリペプチドをコードし且 っ５ａｅＱＬをコードするＤＮＡフラグメントが予め組み込まれたＤＮＡ配列を 染色体中に取り込むかまたはプラスミド上に担持する変性ゲノムを有する枯草菌 の菌株によって所定のポリペプチドの産生を刺激する方法が開示されている。 しかしながら、■ｌ座及び■１１座がクローニングされたことはなく、従って、 酵素の過剰産生方法においてこれらの座が、酵素を産生じ得るかまたは酵素を産 生じ得るように処理された宿主細胞に再導入されることによって使用されたこと もない、かかる方法では、これらの座の機能配列を前記のごとき酵素産生に対す る刺激特性として使用している。 本発明の目的は、枯草菌またはその他の適当な微生物による酵素またはその他の タンパク質の過剰産生方法をできるだけ高い効率で実施するために、５ａｅｌＪ 座及び回１座またはその機能配列を使用すべく　５ａｃＵ遺伝子及び■娃１遺伝 子をクローニングすることである。 実際、■娃遺伝子のクローニング試験はこれまではすべて失敗してきた。１９８ ５年のＪ、Ｂｉｃｔｅｒｉｏｌ、、１６１：１１８２〜１１８７に発表された＾ ＵＢＥＲＴ等の論文は、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ及び枯草菌の 双方で複製され得るｎａｖｅｔｔｅプラスミドを用いた■旦のクローニング試験 を記載しているが、この試験は１９８７年のＪ、　Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、、１６ ９：３３９３に収載の同一著者の別の論文で誤りであったとして著者自身によっ て撤回された。 ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｌｅｔｔ、、４１　：１３７〜１４０（１９ ８７）にＤＥＢＡＲ−ＢＯＵＩＬＬＥ等によって記載された戦略は、５ｉｅＳ遺 伝子のクローニングには成功したが、■■のクローニング及び同定に応用するこ とはできなかった。レバン−サッカラーゼをコードする５ｉｅＢ遺伝子のプロモ ーターのコントロール下のカナマイシン耐性遺伝子と突然変異５ａｅＵ−とを担 うゲノムを有する枯草菌の菌株に遺伝子バンクを（その遺伝子を含み大腸菌中で 得られた組換えプラスミドの形態で）導入した。 ■娃−の作用下では、■ｌ遺伝子及びカナマイシン耐性をコードする遺伝子の発 現は極めて微弱である。　５ａｅＵ座を含レベルのカナマイシン耐性を与え、こ の菌株中でのレバン−サッカラーゼの産生を復活させると期待された。しかしな がら、この方法では、■ｄ座を含むプラスミドを単離することは不可能であった 。 本発明は、これらの種々の失敗の原因が、大腸菌に対して■ｌ座が障害性（ｔｏ ｘｉｃｉｔｅ）を有することに起因するという仮説（この仮説はやがて検証され る）から生まれた。 また、本発明の目的の１つは、枯草菌中で５ａｅＵ座を直接クローニングする方 法を提案することであった。 本発明に到達するための処理手順の本質的な特徴は、添付図面を参照することに よって容易に理解されよう。 −第１図は、５ａｃＵ座の近傍にトランスポゾンＴｎ９１７１ａｅＺを含む枯草 菌ＢＤ１２３８に由来の１３．５ｋｂのＢａｗ＝ＨＩフラグメントを図の上部に 示し、該ＴｏｍＨ１フラグメントのクローニングに使用されるプラスミドベクタ ーを図の下部に示すプラスミドｐＢＵ３の概略図、 一第２図は、５ａｅＵ座を含む第１図のプラスミドｐＢＵ３に由来の３．９ｋｂ の５ａｉｌフラグメントを図の上部に示し、該Ｓａｌ　Ｉフラグメントのクロー ニングに使用されるプラスミドベクターを図の下部に示すプラスミドｐＢＵ１４ の概略図、−第３図は、回のクローニングに使用されるプラスミドｐＢＶ１４３ １及びｐＨＶ１４３６（７）　ＩＥ　１１１２、−第４図は、５ａｃＵ座を含む ２５５０ｂ、のフラグメントの完全配列及び制限地図を制限部位の標示と共に示 す図、−第５図は、ポリペプチド５ｉｃｔｌｓ＋（またはＤｅｇＳ）のアミノ酸 配列、 一第６図は、ポリペプチド５ａｃｌＪｓ２（またはＤｅｇＵ）のアミノ酸配列、 一第７図は、枯草菌（Ｂｓ）の頭座の０ＲＦＩによってコードされるポリペプチ ド５ｉｃＵ−＋（またはＤｅｇＳ）のＣ末端部と払」工■ｈｉｍｕｒｉｕｍ（Ｓ ｔ）のタンパク質Ｃｈｅ＾と大腸菌（Ｅｅ）のタンパク質Ｃｐｘ＾との比較を示 す説明図、 一第８図は、枯草菌の回圧の０ＲＦ２によってコードされるポリペプチド５ａｅ ｌｌｓ２（またはＤｅ４Ｕ）と大腸菌の（ＯＲＦ２によってコードされる）タン パク質Ｄｙｅ、　ＵｖｒＣｌＯｍｐＲ及び枯草菌の５ｐｏＯ＾、５ｐｏＯＦとの 比較、 −第９図は、枯草菌のポリペプチド５ａｅＬＩｓｚのＣ末端部と大腸菌の（ＯＲ ＦＩ及び０ＲＦ２によってコードされる）タンパク質υＶｒＣ及びＭａｌＴとの 比較、 一第１０図は、■１座を含むＤＮＡフラグメントの詳細なヌクレオチド配列、並 びに、読取り枠０ＲＦ１及び０ＲＦ２の上方に夫々示されたポリペプチド５ａｃ Ｕｓ＋　（ＤｅｇＳ）及びＳａｃＵｓ２（ＤｅｇＵ）、−第１１図は、プラスミ ドｐＢｔ１１４、ｐＢＵ１６、ｐＢＵｌｏｏ、ｐＢＵＩＯＩ、ｐＢυ１０２及び ｐＢＵ１０３に夫々挿入されたｕ１座を含む２．５５ｋｂのフラグメントに由来 のＤＮＡフラグメントの制限地図、−第１２図は、電気泳動及びオートラジオグ ラフィーを順次行なって得られたポリペプチド５ａｅＬＩｓ＋及びＳａｃＵｍｚ の同定、−第１３区は、突然変ｌ害ｒを含む枯草菌の菌株によって分泌されたポ リペプチドＤｅｇＳ、及びポリペプチドＤｅｇＳ２２０、ＤｅｇＳ２００．　Ｄ ｅｇＳｌｏｏ及びＤｅｇＳ３９　（またはＤｅｇＳ４２）の説明図、−第１４図 は、突然変異５ａｃＬＩ”を含む枯草菌の菌株によって分泌されたポリペプチド ＤｅｇＬｌ、及びポリペプチドＤｅＨＵ３２、ＤｅｇＵ２４（またはＤｅｇＵ５ ００）、ＤｅｇＵ１４６、ＤｅｇＵ９（ＤｅｇＵ１１８）、ＤｅｇＵ３１、Ｄｅ ｇＬ１１４３、Ｄｅｇｔ１２００、ＤｅｇＵ１２２及びＤｅｇＵ１９３の説明図 、−第１５図は、枯草菌のμＦ菌株によって分泌された種々のポリペプチド間の ヌクレオチド及びアミノ酸の変化を示す。 枯草菌Ｍａｒｂｕｒｇ１６Ｂ株及びその誘導体（ＬＥＰＥＳＡＮＴ等、Ｍｏｌ。 Ｇｅｎ、　にｅｎｅｔ、、１１８：１３５〜１６０（１９７２））に対して行な った遺伝分析中に、発明者等は、■牡領域がマーカー−」の近傍のゲノムに存在 し得ることを証明した。 この成果に基づいて発明者等は、マーカーｈｉｓＡ１の近傍に導入されたトラン スポゾンＴｎ９１７１ａｃＺを含む枯草菌ＢＤ１２３８株に注目した（ＨＡＩＩ Ｎ等、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１６９：３１０４〜３１０９（１９８７） 及び＾ＬＢＡＮＯ等、Ｊ、　Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、、１６９：３１１０〜３１１ ７（１９８）））。 実際、枯草菌ＢＤ１２３Ｂのゲノムの特徴は、第１図の制限地図に示すようにト ランスポゾンＴｎ９１７１ａｃＺがゲノムに挿入されたことによってｈｉｓＡｌ の近傍に突然変異ｃｏｗ−５２４が発生したことにある。このＴｎ９１７１ａｅ Ｚ領域はエリスロマイシン（ｅｒａ）耐性マーカーを含む゛（ＰＥＲＫＩＮＳ等 、Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、＾ｅａｄ。 Ｓｅｉ、、ＬＩＳ＾、８３：１４０〜１４４（１９８６）；５ＥＡ−等、Ｊ、　 Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、、１６４ニア８２〜７９６（１９８５））、発明者等はこ の結果から、遺伝子型５ａｅＬＩ’を有する枯草菌ＢＤ１２３Ｂ中で５ａｃｔｌ ’座がＴｎ９１７１ａｅＺ領域の近傍に存在するに違いないと推定した。 エリスロマイシン耐性マーカーを選択手段として使用し、枯草菌中で複製され得 るプラスミド中で枯草菌ＢＤ１２３８のゲノムの対応領域をクローニングすると 、この仮説の有効性を確認できる。 Ｔｎ９１７１ａｅＺの左端に単一のＢａｇ）１１部位が存在するため。 発明者等は、対応する制限酵素を使用して枯草菌ＢＤ１２３８のゲノムをフラグ メントに分割した。得られたＢａｍＲＩフラグメントを適当なプラスミドに結合 した（第１図）、これらの１ラスミドを使用してエリスロマイシン耐性でない枯 草菌の細胞を形質転換させ、エリスロマイシン耐性になった枯草菌細胞を選択し た。 発明者等はこのようにしてプラスミド（プラスミドｐＢＵ３）を単離し、これを 使用して突然変異５ａｃｔｌ−（表現型Ｌｖｓ−）（第１図）を含む枯草菌細胞 を形質転換した。 この結果発明者等は、このプラスミドが、突然変異銭藏−（表現型Ｌｖｓ−）を 含む枯草菌中でレバン−サッカラーゼ（表現型Ｌｖｓ”）の合成を復パ８させ得 る枯草菌ＢＤ１２３８に由来の１３．５ｋｂのＢａ５ｔｌ　Ｉフラグメントを含 むと判断した。 ３．６ｋｂノ枯草菌ＢＤ１２３８ノＤＮＡニ由来ノＳａｌ　ｌ　−ＢａｍＢ　Ｉ 　７　ラクメントとｐＢＲ３２２の０．２８ｋｂの膿１１１−Ｓ料Ｉフラグメン トとを含む５ａｌｌフラグメントの最初のサブクローニングによって、プラスミ ドｐＢＵ１４（第２図）が得られた。このプラスミドも突然変異体柱１−中でレ バン−サッカラーゼの合成を復活させ得る。このフラグメントから２つのＥｅｏ Ｒ１部位間の配列を除去して再結合すると、すべての活性を喪失し５ｕｅＵ−菌 株を相補しないプラスミドが得られる。他方、２つのヒｏＲ１部位間のフラグメ ントをベクターｐＨＶ１４３２（Ｓ、　Ｄ。 ＥＨＲＬＩＣ［＋等、ＩＮＲ＾、Ｊｏｕｙ−ｅｎ−Ｊｏｓａｓ、フランス）中テ クローシングすると、同じく■鱈−菌株を相補しないプラスミドが得られる。上 記実験とは逆に、制限酵素鋤Ｉで消化することによってプラスミドｐＢＵ１４か らサブクローニングすると、枯草菌ＢＤ１２３８に由来の２．５５ｋｂの５ａｌ ｌ−江Ｉフラグメントを含むプラスミドｐＢ０１６が得られた。このプラスミド も突然変異体面−中でレバン−サッカラーゼの合成を復活させ得る。従って、プ ラスミドｐＢＬ１１Ｂが担う２．５５ｋｂの凪ｌ−７１７ラグメントは■砂圧を 含み、特に枯草菌のｕ砂圧の機能領域を含む、このフラグメントのヌクレオチド 配列は第４図の配列に対応する。 更に、適当なベクターを介して表現型Ｌｖｓ”の枯草菌の菌株に前記２．５５ｋ ｂのフラグメントを導入すると、該菌株が正常に合成する細胞外酵素の過剰産生 が該菌株中で得られる。 言い替えると、この配列は枯草菌の前記菌株に表現型Ｄｅｇｌ′を与える能力を 有する。 前記の５ａｅＵ遺伝子のクローニング方法はまた、突然変異ｓｍｅｌｌ’を含む 枯草菌の菌株、特に後述する枯草菌ＱＢ１３６株を使用した５ａｃｔｌ”遺伝子 のクローニングに応用できる。 従って本発明は、枯草菌の菌株の染色体に由来の２．５５ｋｂのＳｔ　ｌ　Ｉ　 −５３ｆｉ　！フラグメントに含まれるヌクレオチド配列であって、枯草菌の菌 株または該フラグメントが担う情報を利用し得るその他の微生物に導入されると 細胞内酵素、細胞外酵素またはその他のタンパク質の過剰産生を誘発し得るすべ てのヌクレオド配列に係る。 概括的には本発明は、前記２．５５ｋｂのＳａｔ　１−５ｐｆｉ　１フラグメン トの相同配列であって、それ自体が枯草菌の菌株に表現型ＤｅｇＩ′を与える機 能配列であり、特に前記に定義した２、５５ｋｂの７ラグメントと容易にハイブ リダイズするすべての配列に係る。特に以下のＦＩＬ階を含むハイブリダイゼー ション処理を使用するとよい。 一被検核酸のフラグメントを支持するニトロセルロースフィルターをハイブリダ イゼーションバッファ（５ＸＳＳＣ１ＩＸＤｅｎｂａｒｄｔ、０．１％５ＤＳ） と共に４２℃で１時間前処理（プレハイブリダイゼーション）する。 一核酸フラグメントが固定された担体と接触したハイブリダイゼーションバッフ ァを同じ組成のハイブリダイゼーションバッファで交換し、特に放射性標識し且 つ１００℃で５分間処理して予め変性した２、５５ｋｂの配列をプローブとして 添加する。 一担体に固定された前記核酸フラグメントを２．５５ｋｂのフラグメントと共に インキュベーションバッファ中で４２℃で１６〜２４時間インキュベートする。 −Ｉ　Ｘ　５０ｍ１の５ＸＳＳＣ５０，１％のＳＤＳを用いて４２℃で２０分間 及び２Ｘ５（ｈｌの２ＸＳＳＣ１０，１％のＳＤＳを用いて４２℃で２０分間ず つ２回順次洗浄することによって非固定プローブを含むバッファを除去する。 留意すべきは、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液が、１％のＦｉｅｏｌｌ、１％のポリビニ ルピロリドン、１％のＢＳ＾（ウシ血清アルブミン）から成る組成を有し、Ｉ　 Ｘ　ＳＳＣが、０．１５ＨのＮａＣ１と０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐ ｌ’１７とから成ることである。 前記条件は特に非緊縮性条件（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｎｏｎ　ｓｔｒｉｎｇｅ ｎｔｅｓ）に対応する。 より特定的には本発明は、枯草菌に表現型Ｄｅｇ”を与え且つ緊縮性条件（ｃｏ ｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｓｔｒｉｎｇｅ＋＋ｔｅｓ）下に２．５５ｋｂのフラグメン トとハイブリダイズする相同配列に係る。緊縮性条件下のハイブリダイゼーショ ンは以下の段階を含む。 −被検核酸フラグメントを支持するニトロセルロースフィルターを５０％ホルム アミド、５ｘＳＳＣ１Ｉ　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔから成る組成のバッファで４２ ℃で１時間プレハイブリダイゼーション処理する。 一核酸フラグメントが固定された担体と接触したハイブリダイゼーションバッフ ァを同じ組成のハイブリダイゼーションバッファで交換し、特に放射性標識し且 つ１００℃で５分間処理して予め変性した２、５５ｋｂの配列をプローブとして 添加する。 ＝４２℃で１６〜２４時間インキュベートする。 −以下の溶液で順次洗浄する。 Ｉ　Ｘ　５０ｚ１ノ５　Ｘ　５ＳＣ１５０％ホルムアミドで４２℃で２０分間を １回、 ２Ｘ５０ｉ１の２ＸＳＳＣ１０，１％ＳＤＳで４２℃で２０分間を２回、及び、 Ｉ　Ｘ　５０ｙ１の０．２ｘＳＳＣ１０，１％ＳＤＳで４２℃で２０分間の順次 洗浄を行なう。 この処理後に、第４図で特に詳細に示す２．５５ｋｂのＤＮＡ配列にハイブリダ イズした状態のＤＮＡ配列があれば、これら２つの配列がある程度の相同性を有 することを示す。 ２．５５ｋｂのＳａ　ｌ　ｌ　−５３３１フラグメントのハイブリダイゼーショ ン実験以前に行なうべきプロトコルに関しては、当業者に公知の手順でよい。 ＤＮＡをフィルターに固定させる処理条件の一例を以下に示す。 一ニックートランスレーションによってフラグメントを放射性標識する。 一被検ＤＮＡをニトロセルロースフィルターに移ス。 −０，５ＨのＮａ０Ｂ、０．９ＭのＮａＣ１を含浸させた一ｂｉｔｍｍｏｎ　Ｎ ｏ、３紙にフィルターをのせ、室温で２０分間インキュベートする。 −ＬＨのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７を含浸させた紙で処理を１ｏ分間繰り返す。 一素早く乾燥させる。 一２ｘＳＳＣを含浸させた紙で同じ処理を繰り返す。 −紙にのせて乾燥させ、次いで８０’Ｃのオーブンで２時間乾燥させて被検ＤＮ Ａをフィルターに固定する。 注目すべきは、枯草菌の菌株中の５ａｃｋ配列または吐蛯１配列を同定するため には前記ハイブリダイゼーション処理を緊縮性条件下に直接性なうのが有利なこ とである。この方法は特に枯草菌の■住１菌株の■１１１００単離に適用される 。 逆に、別の微生物、特にバチルス種（ｔｙｐｅ）例えばＢ、　１ｉｅｈｅｎｉｆ ｏｒｅ＋ｉｓから機能配列を単離するためには常に非緊縮性条件下に処理するの が好ましい。 銭１遺伝子のレベルに突然変異を有する枯草菌の菌株は、特に前記に引用したＬ ｅｐｅｓａｎｔ等（１９７２）に記載の方法を用いる突然変異誘発で得られた。 突然変異の配列決定はＭｕｌｌｉｓ　Ｋ、　Ｂ、等、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙ ｖｏｌ。 １５５．３３５〜３５０（１９８７）に記載のＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　 Ｃｈａｉｎ　Ｒｅ−ａｅｔｉｏｎ）法によって行なわれる。 前記のごとく得られた突然変異体のゲノムは第１５図に示す突然変異を有する。 これらの突然変異体のうちの２つが特に重要であることが判明した。即ち、表現 型ＬＪ”を誘発する遺伝子型組Ｕハ（または仙泗」）と虹吐菖（または±？亘） である。 本発明はまたより特定的に、５ａｅＵ”座を含む核酸、特に突然変異５ａｅｔｌ ’を担う枯草菌の菌株に由来の約１４ｋｂのフラグメントに係る。 該フラグメントは、特に前記に定義した緊縮性条件下に前記対立遺伝子５ａｅＵ °を担う２．５５ｋｂのＤＮ＾フラグメントにハイブリダイズし得る。 対立遺伝子５ａｃｋ’のクローニングは、突然変異μｒ３２を担う枯草菌０８１ ３６株に枯草菌８０１２３８株の突然変異ｃｏｗ−５２４を導入することによっ て行なわれた。突然変異μｊＵ”３２を保持したエリスロマイシン耐性（ｌｈ” ）の形質転換体を単離した。従って、ＱＢ４２０９と命名されたこの菌株は突然 変異誘発と突然変異■ｃＵｈ３２との双方を含む。 ＱＢ４２０９株の染色体ＤＮＡのＢａｍＨｌ制限フラグメントをｐ［１Ｖ１４３ ６のＢａ＋ｓＢ　１部位に挿入した。クロラムフェニコール耐性（Ｃ＋ｍ’）及 びエリスロマイシン耐性（Ｅｍ’）の双方を有する組換えプラスミドを選択し、 ｐＢＵＩＩＩと命名した。このプラスミドは、（枯草菌ＱＢ２５４の）突然変異 体５ｉｅＵ−中でレバンサッカラーゼの合成を復活させ得る。 従って本発明はまた、突然変異…ｒを含み、ヌクレオチドの機能配列を含み、最 大１４ｋｂの長さを有し、前記突然変異の結果としてヌクレオチドの少なくとも １つが変化した２、５５ｋｂの配列を含む枯草菌の菌株に由来の核酸フラグメン トであって、前記機能配列が以下の特徴をもつこと、即ち、 一該機能配列は、遺伝子型５ａｃｋ’をコードする５ａｃｋ”座を含む、 −該機能配列は一前記ブラグメントが突然変異面−を含む枯草菌の菌株に組み込 まれたときにこの菌株中でレバンサッカラーゼの合成活性を復活させ得る、−該 機能配列は、この機能配列が導入された枯草菌または前記フラグメントに含まれ た情報を利用し得る別の微生物中でタンパク質の過剰産生を誘発し得るかまたは 表現型Ｄｅｇ″を与え得る、 一該機能配列は、特に前記条件下に枯草菌ＢＤ１２３Ｂに由来の２．５５ｋｂの Ｓａｌ　１−５３４１のＤＮＡフラグメントとハイブリダイズし得、且つハイブ リダイズした状態を維持し得ることを特徴とする核酸フラグメントを提供する。 前記の２．５５ｋｂ及び１４ｋｂのフラグメントまたはこれらのフラグメントに 相同な配列を適当な制限酵素で相補的に処理することによって、特にｈ１３１の ごときエキソヌクレアーゼ型の酵素で消化することによって、これらのフラグメ ントからより小さいフラグメントを生成し、得られた小さいフラグメントが特に 後述の条件下に枯草菌の菌株に表現型Ｄｅｇ′′を与える能力を再度試験し得る ことは当業者に容易に理解されよう、言い替えると、当業者は５ａｅＵ座及び回 １座の活性部の正確な位置を直接に検出することも可能である。 突然変異５ａｃＬＩ”を含まない枯草菌由来の前記２．５５ｋｂのＤＮＡフラグ メントの完全ヌクレオチド配列の解析結果は、該ＤＮＡフラグメントが２つの読 取り枠を含むことを示す。 第１の読取り枠は、第１０図の２２０位〜１３７４位のヌクレオチドから形成さ れ、３８５個のアミノ酸から成るポリペプチド（以後、５ａｃＵ＊１またはＤｅ ｇＳと指称する）をコードする。以後の記載中、この読取り枠を０ＲＦＩと呼ぶ 。 （以後０ＲＦ２と呼ぶ）第２の読取り枠は、第１０図の１４６０位〜２１４６位 のヌクレオチドから形成され、２２９個のアミノ酸から成るポリペプチド（以後 ５ｉｃＬ２またはＤｅｇＵと指称する）をコードする。（これは、本出願の優先 権出願である１９８８年３月２２日出願のフランス特許出願第８８０３７３６号 に記載されたポリペプチド５ａｅＵ、に対応する）。 これらの２つの読取り枠０ＲＦＩ及び０ＲＦ２の上流に、リポソームに結合する メツセンジャーＲＮ＾の典型的シグナルを供給すると推定されるヌクレオチド配 列（所謂シャインーダルガルノＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏの配列）が存在す る。これらの配列は、第１０図の２０９位〜２１５位のヌクレオチドから形成さ れる領域、及び１４４５位〜１４５１位のヌクレオチドから形成される領域に夫 々存在する。 ０ＲＦＩと０ＲＦ２との間で転写終了シグナルは決定できなかった。従って、０ ＲＦＩ及び０ＲＦ２はオペロンを形成するかまたはオペロンの一部であると考え てよい、　０ＲＦ２の下流の第１０図の２１５９位及び２１８４位のヌクレオチ ド間に転写終了シグナルが存在すると考えられる。 第２の読取り枠は１つの旺１１部位の両側に存在することに注目されたい、従っ て、これらの２つの部位間の配列が欠失するとクローンフラグメントの辻１活性 が消滅する。 この欠失によってコード配列の半分以上が除去される。 結局、（ＥｃｏＲ１部位のレベルへの挿入によって起こる）ＯＲＦ２の失活は、 表現型Ｌｖｓ−（レバンサッカラーゼの欠如）に帰着するので、ポリペプチド５ ａｃＵ−□は枯草菌における分解酵素合成の活性化に必要であると推定される。 ０ＲＦＩは突然変異面−４２を含む枯草菌の菌株に導入されても分解酵素の合成 活性を復活させないように思われる。 しかしながら、枯草菌の辻１°株における（ＯＲＦＩに外来ＩＩＮ＾を挿入する ことによって生じた）ＯＲＦＩの失活も表現型Ｌｖｓ−に帰着する。 結局、枯草菌中で表現型Ｄｅｇ＆を得るためには、０ＲＦ２によってコードされ る産生物に加えて０ＲＦＩによってコードされる産生物も必要であると推定され る。 ０ＲＦＩによってコードされるポリペプチド５ａｃＵｓ＋のアミノ酸配列の解析 によれば、該配列は、シグナルセンサとして機能し且つ転写の活性化に必要な情 報を活性化物質特に前記活性化物質に伝達するタンパク質、特にＬ」■■ｍｕｒ ｉｕｍのタンパク質Ｃｈｅ＾のアミノ酸配列とある程度の相同性を有することが 判明した（第７図）。 ０ＲＦ２によってコードされるポリペプチド５ａｅＵｓｚのアミノ酸配列の解析 によれば、該配列は、転写活性化物質として機能する複数のタンパク質、特に大 腸菌のタンパク質Ｄｙｅ、ＯｍｐＲまたは枯草菌のタンパク質５ｐｏＯ＾、５ｐ ｏＯＦのアミノ酸配列とある程度相同であることが判明した（ＴＲＡＣＢ等、Ｐ ｒｏｃ　。 Ｎａｔｌ、＾ｃｕｄ、　Ｓｃｉ、、８２ニア２６０〜７２６４（１９８５）　（ 第９区）、従って、タンパク質５ａｃＵ＊２は特異的な転写活性化物質として機 能するタンパク質のファミリーに所属するであろうと推定できる。 ポリペプチド５ａｃＬ＋及び５ａｅｔｌｓ２の機能体系は、ＳａｅＵｍｌが環境 の特殊変化のセンサであり、この情報が５ｉｅＵｓｔを介して転写系のレベルに 伝達されると推定される。 ５ａｃＵｓ＋及びＳａｅＵｍ２と第７図から第９図に示す別のタンパク質との間 の部分的構造の相同がはっきり分かるように、これらの部分的相同を（枠で囲ん で）対応させた。従っていくつかのアミノ酸は正常な間隔よりも離して示した。 枯草菌の種々の５ａｃＵ”菌株に由来の２．５５ｋｂのＤＮＡフラグメントのヌ クレオチド配列の研究は、これらのフラグメントがまた、５ａｃＵｓ＋及び３ａ ｅＬＩｓｉにほぼ等しいが少なくとも１つのアミノ酸差異を含むポリペプチドを コードする２つの読取り枠を含むことを証明する。 一般には、突然変異は、５ａｃＵｓ＋をコードするヌクレオチド配列またはＳａ ｃＵｇ＊をコードするヌクレオチド配列のレベルで生じる。 （特にＤｅｇＳと共同して）表現型Ｄｅｇ”を発生するこれらのポリペプチドと して特に、前記１４ｋｂのフラグメントによってコードされるポリペプチドＤｅ ｇＵ２４、またはＤｅＨＬ１３２（第１４図に示す）がある。 本発明は、突然変異５ａｃｕ”を含むかまたは含まない枯草菌の菌株に由来の２ ．５５ｋｂのＳａ　ｌ　Ｉ−鋤’フラグメントまたは前記１４ｋｂのフラグメン トに由来するすべてのＤＮＡ配列、特に、表現型Ｄｅｇ！′を与え得るポリペプ チド５ａｅＬ＋及び５ａｃＵ１、並びに５ａｃＵ”によってコードされるすべて のポリペプチド（ポリペプチド５ａｅｕ、、”、５ａｃｔｌａ２”＊たは５ａｃ ｋ−１１）をコードする配列、並びにこれらのポリペプチドの発現調節要素を含 むヌクレオチド配列に係る。 本発明の目的はまた、突然変Ｊｌ。困１′″を含まない枯草菌の菌株に由来する ２、５５ｋｂのＳａｔ　Ｉ　−５３ｊ　ｌフラグメントかまたは逆に突然変異社 」１を含む枯草菌の菌株に由来する（特に前記１４ｋｂのフラグメントに由来の ）、特に表現型Ｄｅｇ”を発生するポリペプチド、特にポリペプチド５ａｃｋｓ 　、及びＳａｃＵＭ２または５ａｅＵ−をコードする前記タイプのフラグメント に夫々含まれた５ａｅＵまたは５ａｅＬｌ”のＷ能部を含むすべての組換え核酸 に係る０本発明のフラグメントは、前記フラグメントに対して異種の核酸フラグ メント、即ち前記ポリペプチドをコードする配列と共に作用し得る核酸フラグメ ント、例えば強いプロモーターまたは使用宿主中で野性型または修飾型の前記ポ リペプチドの産生増進効果をもつ調節配列を含み得る核酸配列と結合し得る。 以下の記載では説明の便宜上、ｒ本発明のＤＮＡフラグメント」なる用語は、実 際にサイズ２．５５ｋｂまたは１４ｋｂを有するフラグメントまたは配列、並び に、５ａｃＬＩＨ，５ａｃＵＢもしくは５ａｃｋ、ｈをコードする配列または前 記条件下に機能性のポリペプチドの一部をコードする配列を夫々含むサブフラグ メントまたはサブセグメントを包含する。 本発明の目的はまた、前記のごときＤＮＡフラグメントにおいて、対応する１つ または複数のポリペプチドの活性を変化させることなくいくつかのヌクレオチド が別のヌクレオチドで置換されていることを特徴とするＤＮＡフラグメントに係 る。 本発明は、表現型Ｄｅ４ｂを与える本発明のＤＮＡフラグメントと該ＤＮＡフラ グメントが由来する細胞以外の宿主細胞によって認識され得る転写プロモーター とを含む組換えＤＮＡに係る。好ましくは、使用される前記プロモーターは、払 １遺伝子のプロモーター（＾、ＫＬＩＥＲ等、Ｍｏｌｅｅ９Ｍｉｅｒｏｂｉｏ１ ．．１：２３３〜２４１　（１９８７）　）またはバクテリオファージＴ％のプ ロモーターＰｎ２５（Ｍ、　ＺＵＫＯＮＳＫＩ　＆　Ｌ、　ＭＩＬＬＥＲ，Ｇｅ ｎｅ、４６：２４７〜２５５（１９８６））のごとき強いプロモーターである。 好ましくは該組換えＤＮＡは、本発明のＤＮＡフラグメントと、プロモーター特 に強いプロモーターと、必要に応じて枯草菌のｔｌＮ＾に対して異種の転写終結 因子とを含み、該プロモーター及び必要に応じて該終結因子は前記組換えＤＮＡ が導入された宿主細胞中で本発明のＤＮＡフラグメントが発現し得る条件下に宿 主細胞によって認識され得る０例えば、該組換えＤＮＡはプロモーターと必要に 応じて別の微生物の終結因子とを含む。 この点でより特定的には本発明は、複製に必須でない部位の１つに本発明のＤＮ Ａフラグメントを含み、■鱈座または■■１座の機能部に活性を発揮させ特にポ リペプチド５ａｃｕｓ＋、　ＳａｃＬＩｍ２またはＳａｃＬＩｍ′′をコードす る配列を発現させながら宿主細胞中で複製され得るベクター、特にプラスミドタ イプのベクターから成る組換えＤＮＡに係る。 好ましくは前記転写プロモーターは誘発プロモーターである。誘発プロモーター の例は、サッカロースによって誘発され得る■１プロモーター（ＳＥＩＭＯＴＳ Ｕ　＆　ｌ’１ＥＮＮＥＲ，Ｊ、　Ｂａａｔｅｒｉｏｌ　、、１６８，３８０〜 ３８Ｂ（１９８６）、ＫＬＩＥＲ等、Ｍｏ１ｅｅ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　＜ １９８７）、前出）及びＩＰＴに（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド）に よって誘発され得る基プロモーター（Ｐｒｏｃ　。 Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８１，４３９〜４４３　（１９８４ ））である。 本発明のベクターは、宿主細胞中で複製され得るベクター、即ち該細胞の染色体 を変化させないベクター（例えば宿主細胞の内部で多数コピーに増殖し得る多数 コピープラスミド）から選択され得る。前記複製型（ｔｙｐｅ　ｒｅｐｌｉｅｉ ｔｉＤのベクターによる宿主細胞の形質転換によれば、補足遺伝情報が細胞のゲ ノムに導入されるが染色体には導入されない。 また、宿主細胞の染色体を変化させ得る組込み型（ｔｙｐｅｉｎｔｅｇｒｉｔｉ ｆ）ベクターを使用してもよい、かがるベクターは特に単純または重複組換えメ カニズムによって本発明のＤＮＡフラグメントを宿主細胞の染色体に挿入させ得 る。 一般的に、以下の記載の種々のベクターは複製型でもよくまたは組込み型でもよ い。 本発明はまた、第５図及び第６図に示すポリペプチド５ａｅＵｓ＋ｂ及び５ｉｃ Ｌｌｓ２″並びにががるポリペプチドに由来し組み込まれた微生物特にバチルス 科（ｔｙｐｅ　Ｂ龜ｅｉｌｌａｃｅｅｓ）の１つまたは複数の構造遺伝子の発現 を活性化できる活性ペプチドフラグメントに係る。 本発明はまた、第１３図及び第１４図に示すポリペプチド５ａｃｋｓ　＋　″及 び５ａｅＵｓ２’並びにかかるポリペプチドに由来し組み込まれた微生物特にバ チルス科の１つまたは複数の構造遺伝子の発現を活性化できる活性ペプチドフラ グメントに係る。 本発明の目的はまた、本発明のＤＮＡフラグメントの全部または一部によってコ ードされるポリペプチド特にＳａｅＵｍ＋、または５ａｅＵ−□または５ａｅＵ ｓ″′の全部または一部と異種のアミノ酸配列とから構成されたハイブリッドポ リペブチドラ宿主細胞中で産生ずるように、本発明のＤＮＡフラグメントの全部 または一部、特にＳａｅＵｍ＋または５ａｃ（Ｉｎ２または５ａｅＬ”をコード する配列の全部または一部と、異種のＤＮＡフラグメントとを、宿主細胞中で融 合させて得られたハイブリッドポリペプチドを提供することである。 従って本発明は、適当な微生物によるタンパク質特に酵素またはポリペプチドの 産生能力を増進させる方法に係る。 該方法は、本発明のＤＮＡフラグメントを含む前記プラスミドの１つを用いて前 記微生物の細胞を形質転換させ、形質転換した宿主細胞を適当な培地中で培養し 、（特に細胞内タンパク質の産生の場合には細胞溶解によって）細胞からまたは く細胞外酵素の産生の場合には）培地から前記タンパク質を回収する処理を含む 。 前記方法及び後述する本発明方法の別の実施態様で形質転換可能な微生物は特に 、ダラム陽性菌、例えばバチルス属（ｇｅｎｒｅ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ）及びクロ ストリジウム属（ｇｅｎｒｅ　Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｉｕ−である。 前記のごとく産生されるタンパク質は、本発明方法を実施するために使用された 細菌細胞の染色体中で構造遺伝子が当然５ａｅＵ遺伝子または…ｒ遺伝子のコン トロール下にあるようなタンパク質である。 例えば、前記のごとき本発明方法によれば、多数の細胞内酵素または細胞外酵素 、例えば１０テアーゼ、レバン−サッカラーゼ、α−アミラーゼ及びグリヵナー ゼを枯草菌によって過剰産生じ得る。 本発明はまた、産生を刺激すべき所定のポリペプチドをコードするヌクレオチド 配列をゲノムまたは染色体に含むようにゲノムまたは染色体を変性した適当な微 生物によって所定のポリペプチドを産生させる方法を提供する。該方法は、本発 明のＤＮＡフラグメントを含む前記プラスミドの１つを用いて前記微生物の細胞 を形質転換させ、前記のごとく形質転換された微生物の細胞を適当な培地中で培 養し、前記細胞または培地から前記ポリペプチドを回収する処理を含む。 前記本発明方法を実施するために使用される微生物中で酵素の合成がｖ１座また は５ａｃｋ’座によってコントロールされる理由は、前記微生物のゲノムに含ま れた標的配列に本発明のＤＮＡフラグメントによってコードされたポリペプチド の１個以上、特にポリペプチドＳａｅＵｍ＋、５ａｅＵｓｚまたは５ａｃｋｓ’ ｈ及び５ａｃＵｓｚ’″が作用するがまたは前記ポリペプチドのコントロール下 に発現される別の産生物＜ｐｒｏｄｕｉｔ）が作用する結果であろうと推定され る。 前記標的配列は御飯に、枯草菌によって分泌される酵素をコードする構造遺伝子 の上流に存在する。 標的配列の例は特に、 一制限部位５ａｕ３＾１−Ｒｓｄによって規定されリポソーム結合部位及び枯草 菌のレバン−サッカラーゼをコードするＤＮＡ配列の上流に存在する４４０ｂｐ のフラグメントに含まれる配列、または、 −アルカリ性プロテアーゼの遺伝子の転写の起点の上流に存在する約２００ｂ、 の領域に含まれる配列（ＢＥＮＮＥＲ等、Ｊ、Ｂａｃ−ｔｅｒｉｏｌ、、１７０ ：２９６〜３００（１９８８））である。 従って、前記方法の実施によって使用される宿主細胞は、一方では、複製に必須 でない部位の１つに所定のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、 その上流に標的配列と所定のポリペプチドをコードする配列の発現に必要な要素 とを含むヌクレオチド配列を含むベクター特にプラスミドを用いて形質転換され 、他方では本発明のＤＮＡフラグメントを含む前記ベクターの１つを用いて形質 転換される。 本発明による所定のポリペプチドの産生方法の異なる実施態様によれば、該方法 で使用される宿主細胞を、複製に必須でない部位の１つに本発明のＤＮＡフラグ メントと所定のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との双方を含み、そ の上流に標的配列と所定ポリペプチドの合成をコードする配列を特に細胞内部で 発現させるために必要な必須要素とを含むヌクレオチド配列を含むプラスミドを 用いて形質転換する。 一般的に、ゲノム陽性菌特にバチルス属によって天然に分泌されるすべてのタン パク質は、まず分泌タンパク質の配列の上流のシグナルペプチド配列に対応する アミノ酸配列を有するポリペプチド前駆体の形態に翻訳される。細胞分泌の際に はタンパク質自体に対応する成熟形だけが細胞外に分泌される。 従って本発明はまた。所定のポリペプチドをコードする配列及びその上流のシグ ナル配列と本発明のＤＮＡフラグメントとをゲノムまたは染色体に含むように宿 主細胞を形質転換させ、前記細胞を適当な培地で培養し、方法に使用された微生 物によって分泌された所定ポリペプチドを培地から回収する段階を含む所定ポリ ペプチドの産生方法を提供する。 かかる方法の実施に使用される宿主細胞は、一方では、複製に必須でない部位の １つに所定ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列とその上流のシグナル配列とを 含み、該シグナル配列の上流に標的配列とシグナル配列及び所定のポリペプチド をコードする配列の発現に必要な要素を含むヌクレオチド配列とを含むベクター 特にプラスミドを用いて形質転換され、他方では本発明のＤ貼フラグメントを含 む前記プラスミドの１つを用いて形質転換される。 本発明の目的はまた、複製に必須でない部位の１つに、表現型Ｄｅｇｂを誘発す る活性化物質をコードする本発明のＤＮＡフラグメントと所定のポリペプチドを コードするＤＮＡ配列との双方を含み、後者のＤＮＡ配列の上流にシグナル配列 が存在し、該シグナル配列の上流に標的配列とシグナル配列及び所定のポリペプ チドをコードする配列の発現に必要な要素を含むヌクレオチド配列とを含むベク ターを用いて適当な微生物の細胞を形質転換させ、前記形質転換細胞を適当な培 地で培養し、前記ポリペプチドを培地から回収する段階を含む前記微生物による 所定ポリペプチドの産生方法を提供する。 好ましくは、前記タンパク質産生方法すべての実施に使用される宿主細胞はまた 、複製に必須でない部位の１つに、本発明のＤＮＡフラグメントによってコード される活性化物質とは別のもので表現型Ｄｅｇ”を誘発する活性化物質をコード する１つまたは複数のＤＮＡ配列と、前記ＤＮＡ配列の発現に必要な要素とを含 むベクター特にプラスミドを用いて形質転換される。 前記に示した表現型Ｄｅｇ”の活性化物質として、特にＬ１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒ ｅ＋ｉｓ、枯草菌及びＢ、　ａ＋ｍ　１ｏｌｉ　ｕｅｆａｃｉｅｎｓの７遺伝子 によって夫々コードされるポリペプチド５ａｅＱｂ、５ａｃＱｓ、５ｉｅＱ＾、 並びに１３．１ａｔｔｏの旺匹道伝子によってコードされる６０個のアミノ酸か ら成るポリペプチドがある。 好ましくは、前記ベクターはポリペプチド５ａｅＱ、をコードするＤＮＡ配列を 含む。 本発明のＩｌｌ貼フラグメントによってコードされる活性化物質以外の活性化物 質をコードする１つまたは複数のＤＮＡ配列をゲノムまたは染色体に含むような 宿主細胞の形質転換はまた、前述の本発明の方法すべてを実施するために使用さ れるベクターを用いて行なわれ得る。該ベクターは、１つまたは複数の前記活性 化物質をコードする別のＤＮＡフラグメントを含む。 このために、本発明は、複製に必須でない部位の１つに、本発明のＤＮＡフラグ メントと本発明のＤＮＡフラグメントによってコードされる活性化物質以外の表 現型Ｄｅｇ”を誘発する（１つ以上の）活性化物質をコードするＤＮＡフラグメ ント及び該ＤＮＡフラグメントの発現に必要な要素とを含むベクター特にプラス ミドに係る。　　。 本発明はまた、所定のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含みその上流に標 的配列と前記ポリペプチドをコードする配列の発現に必要な要素とを含むＤＮＡ 配列を含むＤＮＡフラグメントも含む前記ベクターに係る。 より特定的には本発明は、所定のポリペプチドをコードする配列の上流に、シグ ナル配列とシグナル配列及び前記ポリペプチドをコードする配列の発現に必要な 要素と−を含む前記のごときベクターに係る。 好ましくは前記のベクターは活性化物質ポリペプチド５ａｅＱＬをコードするＤ ＮＡ配列を含む。 本発明のベクターの構築に使用されるシグナル配列の例は、アルカリ性１０テア ーゼ、レバン−サッカラーゼ、セルラーゼ及びα−アミラーゼを分泌させ得る配 列である。 −殻に、適当な微生物中で酵素をコードするＤＮＡ配列の上流のシグナル配列の 機能を果たし得るすべての配列を本発明のシグナル配列として使用し得る。 本発明はまた、表現型Ｄｅｇｌ′を誘発する本発明のＤＮＡフラグメント、特に ポリペプチド５ａｃＬ１．、及び／またはＳａｃＵｍ２または５ａｃｋｓｈをコ ードするＤＮＡフラグメントを含み細胞中で複製され得る前記プラスミドによっ て形質転換された枯草菌またはその他の適当な微生物の細胞に係る。 より特定的には本発明は、本発明のＤＮＡフラグメントと本発明のＤＮＡフラグ メントによってコードされる活性化物質以外の表現型Ｄｅｇｔｈを誘発する活性 化物質をコードする１つ以上の配列とを含むプラスミドによって形質転換された 前記細菌細胞に係る。 本発明の目的はまた、任意に上流にシグナル配列を有する所定ポリペプチド配列 をコードする配列も含み、該シグナル配列の上流に前記のごとき標的配列を含む 前記のごときプラスミドによって形質転換された細菌細胞を提供することである 。 これらの細胞の培養物は増加量のタンパク質、特に酵素及び／または所定ポリペ プチドを産生じ得る。 所望のポリペプチド、特に所定のポリペプチドを公知の任意の方法、例えばゲル 電気泳動によって精製し所望のポリペプチドを回収し得ることは当業者に勿論明 らかであろう、また、例えば高圧液体クロマトグラフィーのごとき他の方法も任 意に使用できる。 本発明はまた、ポリペプチド５ｉｅＵｓ　ｌをコードするＤＮＡフラグメント、 及びポリペプチドＳａｃυ１．をコードするＤＮＡフラグメントに係る。これら のフラグメントは前記２．５５ｋｂのＤＮＡフラグメントに含まれる。より特定 的には本発明は、５ａｃＵ、　、をコードするＤＮＡフラグメントまたは５ａｃ ｋｓ□をコードするＤＮＡフラグメントを前記２．５５ｋｂのＤＮＡフラグメン トの代わりに含む前記タイプのベクター、及び前記のごときタンパク質の産生方 法におけるかかるベクターの使用に係り、かかる産生方法で使用される宿主細胞 のゲノムは、ポリペプチド５ａｃＵｓ＋または５ａｃＵｓｚにｍ包中で表現型Ｄ ｅｇｂをｙ４発させるために必要な要素を含む、特に、前記ベクターが５ａｅＬ Ｉｓ＋をコードするＤＮＡフラグメントを含むとき、前記方法で使用される宿主 細胞のゲノムは、ポリペプチド５ａｅＵ１１が担う情報を回収し得る活性化物質 ポリペプチド（例えば５ａｃＵ−□）をコードするＤＮＡフラグメントを含むの が有利であろう。 また前記ベクターが５ａｅＵｓ２をコードするＤＮＡフラグメントを含むときは 、前記細胞のゲノムは転写を活性化するためにポリペプチド５ａｃＵｓ２に情報 を伝達し得るセンサポリペプチド（例えば５ａｃＵｓ＋）をコードするＤＮＡフ ラグメントを含むのが有利であろう。 タンパク質を産生ずる本発明方法のこの実施！ｌＩ！様も、ＳａｃＵｍ＋”（ま たはＤｅｇＳ″）または５ａｅＵａｉ”（またはＤｅｇＵｈ）タイプのポリペプ チドをコードするＤＮＡフラグメントを夫々含むベクターを用いて実施され得る 。 最後に本発明は、５ａｃＵ”座を含むベクターが該５ａｅＵＩ′座を利用できる 受容性（ｃｏｍｐｅｔｅｎｅｅ）を有する細胞に導入されたときに該５ａｃＵ’ 座によって産生されるポリペ１チドが示す機能特性と同様の機能特性を有するポ リペプチドを提供する。該ポリペプチドは５ｉｃＵｈ領域自体に含まれる読取り 粋に対応するいかなるポリペプチドでもよい。 本発明の付加的な特徴は好ましいベクター及び該ベクターの使用条件に関する以 下の詳細な記載より明らかであろう、しかしながら、本発明の範囲が以下の記載 に限定されないことを理解されたい。 （１）礼乳及Ｕ】韮 −びブースミド 以下の枯草菌の菌株を使用した。枯草菌の標準株１６８代■Ｃ２）　（ｓａｃＵ ”、表現型Ｌｖｓ’　Ｐｒｔ’）；レバン−サッカラーゼ及びプロテアーゼを合 成しない突然変異体５ａｅＵ−ＱＢ２５４（ｓａｅＵ４２、ＱＢ１３６（ｓａｅ Ｕ３２、ＩｅｕＡ８．ｕ且整）（ＫυＮＳＴ等、１９７４、前出）；分子間組換 えの欠失した菌株１Δ５１０（μμ、１ｅｕｌ＾８、ＬＬ長、ｔｈｒＡ５．５ｌ ）（ＯＳＴＲＯＦＦ　ＥＴ　ＰＥＮＥ、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１５６： ９３４〜９３６（１９８３））；ＢＤ１２３８株（ｃｏｗ−５２４：Ｔｎ９１７ １ａｃＺ　　ｈｉｓＡｌ　　１ｅｕリエ８５）　（ＢＡＲＮ等、Ｊ、　Ｂａｃｔ ｅｒｉｏｌ、、１６９：３１０４〜３１０９（１９８７）　；＾ＬＢＡＮＯ等、 Ｊ、　Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、、１６９：３１１０〜３１１７（１９８７））。 ＪＡＮＮＩＥＲＥ　Ｌ、及びＥＨＲＬＩＣＩＩ　Ｓ、　Ｄ、　（ＩＮＲ＾、Ｊｏ ｕｙ−ｅａ−Ｊｏｓａｓ、フランス）によって構築された第３図に示すクローニ ングベクターｐｔｌＶ１４３１及びｐＲＶ１４３６は枯草菌で大きいＤＮＡフラ グメントを安定に維持し得る。プラスミドｐ！１Ｖ１４３１（１０，８ｋｂ。 クロラムフェニコール耐性Ｃ＋＊’の遺伝子を担う）はプラスミドｐＡ＋４β１ （ＬＥＢＬＡＮＣｅｔ　ＬＥＥ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１５７：４４ ５〜４５３（１９８４））に由来の複製起点を有しており枯草菌で多数コピーで 維持される。 プラスミドｐＢＶ１４３１ｄは、ｐＨＶ１４３１の２つのＥｅｏＲ１部位を含む ＤＮＡフラグメントを除去する大腸菌の自発的欠失によって得られたｐＨＶ１４ ３１の８．３ｋｂの誘導体である。 ７５　スミＦ　ｐ［］Ｖ１４３６（８，７ｋｂ、　Ｃｍ’）は７　ラスミＦ　ｐ ＴＢ１９（ＩＭＡＮＡＫ＾等、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１４６：１０９１ 〜１０９７（１９８１））に由来の複製起点を含み枯草菌で少数コピーで維持さ れる。 大腸菌をＬ培地（トリプトン１０１Ｆ／１、酵母エキス５ｙ／１、ＮａＣｌ３１ Ｆ＃）で培養し、枯草菌をへＨ１培地（Ｐｅｎａｓｓｉｙ、　ＤＩＦＣＯ）また はＭＭＣＩ！培地で培養する。　ＭＭＣＩＩ培地は、６０ｍＭのに、ＨＰＯ，と ４４−のＫｎ２ＰＯ，と１５−Ｈの（ＮＨ−）２５０４と３ｍＭのクエン酸Ｈａ ５と２＋ｎＭのとから成る。 ＬブイヨンまたはＳＰ培地に１フｔｔ／１のＢａｃｔｏ−ａｇａｒ（ＤＩＦＣＯ ）を添加してＬまたはＳＰのベトリ皿を調製した（ＡＭＯＲＹ等、Ｊ。 Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、、１６９：３２４〜３３３（１９８７）、ＬＥＰＥＳＡＮ Ｔ等（１９７２）、前出）。 選択培地は以下の濃度の抗生物質を含む。 ２５μｇ／ｗ（のアンピシリン（＾ｐ）：５μｇ７ｘｉのクロラムフェニコ−１ しくＣｍ）：１μｇ７ｘＩのエリスロマイシン（Ｅ−）及び２５μｓ／１１のリ ンのトリプトン（ＤＩＦＣＯ＞と１７９７Ｎの精製寒天（ＤＩＦＣＯ）と１３ｍ ＭのＫＣｌと１ｍＭのＭｇＳＯ４とを含む５７皿で同定した。　ＳＴＣ蒙培地及 びＳＴＥｍ培地は夫々、２５μｔｐ／（ｌのリンコマイシンを添加した５μｇ／ ｌ１１のクロラムフェニコール及び１μｇ／ｘｉのエリスロマイシンを含む、５ ７皿でＬｖｓ”クローンを包囲するレバンの粘液相はＬｖｓ−クローンからＬｖ ｓ　’クローンを識別するのを助ける。 −レバン−ツ　−−ゼのゞ　の ＭＭＣＨ培地の培養上滑の適当な希釈物を最終容量１１１中でを停止させる。　 Ｃ０Ｄ−Ｐｅｒｉｄ（ＢＯＥＨＲＩＮＣＥＲ）試薬を用いてグルコースの量を測 定する。１単位は１μｍｏ１／分のグルコースの産生量に対応する。培養物の光 学密度からタンパク質の総量を算定する。 −六組　の′ これらの形質転換は大腸菌の形質転換に関する方法（ＣＯＢＥＮ等、Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、＾ｅａｄ、　Ｓｅｉ、、ＵＳＡ、６９：２１１０〜２１１４（１９ 〕２））または枯草菌の形質転換に関する方法（ＡＮＡＣＨＯＳＴＯ−［ＡυＤ ＥＴ　＆　ＥＨＲＬＩＣＢ、　Ｐｌａｓｍｉｄ、２：４Ｂ　〜５１３（１９７９ ））を用いて行なわれる。 供与体ＤＮＡを枯草菌の受容細胞と共に３７’Ｃで２０分間イン酵母エキス及び 湊＃栄養因子を夫々最終濃度１０ｘｇ／１１１及び５０μｇ／ｘｉまで添加する 。３７℃で攪拌を伴って抗生物質の存在下（０，５μｇ／ｘｌのクロラムフェニ コールの存在下に４５分間、０．５μｇ７ｘｉのクロラムフェニコールと０．１ ５μｇｌ論チエリスロマイシンとの存在下に９０分間）にインキュベーション後 、細胞をクロラムフェニコール単独またはクロラムフェニコールとエリスロマイ シンとリンコマイシンとを添加した８１皿に展開する。 −ＤＮＡの操作　びクローニングの　順プラスミドＤＮＡはアルカリ性溶菌方法 （Ｍ＾ＮＩＡＴＩＳ等、Ｍｏ１ｅ−ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ。 Ｃｏ１ｃｌ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ、　（１ ９８２）、ＡＭＯＲＹ等、　（１９８７）、前出）で処理し、次いで多量の培養 物から分取抽出する場合には塩化セシウム勾配遠心で処理することによって大腸 制限酵素及びＴ４　ＤＮＡリガーゼを夫々の製造元の処方に従って使用した。 枯草菌の細胞を有効に形質転換させるＤＮＡ多量体の形成を促進するために、高 濃度のＤＮＡ（１００μｔｔ／ｘｉ＞を使用した１ｎｖｉｔｒｏ結合によって、 枯草菌９１１１２３８株のＤＮＡフラグメントを含む組換えプラスミドの遺伝子 バンクを構築した。 単量体の形態のプラスミドは弱い形質転換活性を有するかまたは形質転換活性を 全く有していない（ＣＡＮＯＳｌ等、暦０１゜されたＢＤ１２３Ｂに由来の２幻 のＩｔ）ｌ＾とを湯溝反応容量２０１１１でＴ４ＤＮ＾リガーゼの存在下に結合 した。プラスミドベクターに挿入されたＤＮＡフラグメントと枯草菌の受容菌株 の染色体−！１ とが相同なので１両者間の組換え、ｇＲｅｃ”菌株中で生じ得る。 このような理由から、１＾５１０株を使用した。実際、この菌株の突然変異ｒｅ ｃＥ４は分子開祖撓え（Ｒｅｃ−）を欠失させるが、（細胞内に入る）多量体プ ラスミドを単量体プラスミドに形質転換させ得る分子内組換えに影響を与えない （ＭＩＣＨＥＬ等、ｐ　ＢＩＪ　３　ハ、ｐＢＬＩ２）ＢａｍＨＩインサー）　 （１３，４ｋｂ）をへｙタール）ＩＶ１４３１ｄに移入することによってｐＢｔ １２から誘導される。２０μ！メされたｐＢＵ１４のＤＮＡの結合によってｐＢ υ１４から構築される。 これらのプラスミドはい−ずれも枯草菌の２つの菌株、即ちＱＢ２５４株及び１ ＾５１０株に導入される。　ＱＢ２５４株への導入は、させる能力を試験するた め、１＾５１０株への導入はプラスミドの維持及び分取抽出を行なうために行な われる。 （２）ブースミド　の５ｈｃＩＪ　　の単突然ＸＩｃｏｍ−５２４（ＨＡ）ＩＮ Ｆ、（１９８７）　：ＡＬＢＡＮＯ等、＜１９８７）、ングを行なう、この突然 変異は５ａｃＵ座の近傍領域にトランスポゾンＴｎ９１７１ａｅＺ（ＰＥＲＫＩ ＮＳ等、（１９８６）　、ＳＲＡＭ等（１９８５）、前出）を挿入することによ って出現する。 ｃｏｗ−５２４とｓａＪとの間に存在する遺伝結合を測定するために、ＢＤ１２ ３８株のＤＮＡを抽出し、不飽和最終濃度で使用して旦≦−ＱＢ２５４株を形質 転換した。エリスロマイシン耐性を継承していた。これは、５ａｃＵ座とｃｏ− ５２４エリスロマイシン耐性マーカーとが極めて近いことの指標となる。 この遺伝結合の定量は、Ｔｎ９１７１ａｅＺの制限地図が既知である事実と相俟 って、５ａｃＬｌ座のクローニングに極めて有利であり、特にＢａｍＨ１部位は Ｔｎ９１７１ａｃＺの左端メ近傍に局限される（第１図）。 従って、ＢＤ１２３Ｂの染色体ＤＨへのＢ＋ｕｅＨｌフラグメントをプラスミド ｐＨＶ１４３６に挿入することによってクローニング手順を実施した。受容菌と して１＾１５１０を使用し宿主細胞にエリスロマイシン耐性（Ｅｍ’）を与えた 組換えプラスミドを選択した。得られたＣｍ’Ｅｍ’の組換えプラスミドをｐＢ υ２と命名した。 プラスミドｐＢυ２はｐＥＶ１４３６のＢａｍｔｌ　１部位のレベルに挿入され たＢＤ１２３８のＤＮＡのＢａｍＨ１フラグメントを含む、該フラグメントはほ ぼ完全なトランスボゾンＴｎ９１７１ａｃＺとＴｎ９１７１ａｅＺの右に存在す るＤＮＡ配列とを含む。 ｐＢｔ１２がＴｎ９１７！ａｃＺの近傍に対立遺伝子５ａｃＵを含むか否かを決 定するために、このプラスミドを使用して突然変異体５ａｃＵ−ＱＢ２５４を形 質転換した。クロラムフェニコール耐性の細胞を選択した。この結果、プラスミ ドｐＢｔ１２はＱＢ２５４株に表現型Ｌｖｓ”を与えることができるので、該プ ラスミドが対立遺伝子５ｕｅｄ”の少なくとも一部を含むと判断できた。 しかしながら、プラスミドｐＢｔｉ２の操作は２つの理由から難しい、第１の理 由は、このプラスミドの収率が極めて低いことにある。塩化セシウム勾配で遠心 後に得られるプラスミドＤＮＡは培養物１１当たり約３μｇである。第２の理由 は、このプラスミド全体を大腸菌に移入させることができないことにある。 従って、Ｔｎ９１７１ａｅＺと５ａｅＬＩ座とを含むＢａｗｌ　ｌフラグメント を枯草菌中で多数コピーに維持され得るベクターに移入する。このベクターは第 ３図のプラスミドｐｉ（Ｖ１４３１に対応する。しかしながら、プラスミドｐ） ｌＶ１４３１は大腸菌中で不安定であるため、結局は該プラスミドをプラスミド ｐｌ’１Ｖ１４３１ｄによって代替した。後者のプラスミドはｐＨＶ１４３１の ２つのＥｃｏＲ１部位にオーバーラツプするフラグメントを除去することによっ て得られたプラスミドであり、大腸菌及び枯草部位のレベルで直線化しｐＢｔ１ ２の■１座を含むＴｏｗｎ　１フラグメントに結合してｐＢＩ］３を作製する。 プラスミドｐＢＵ３の収率はｐＢｔ１２の収率よりもよい（培養物１１当たり５ ０〜１００μｇ）。 ｐＢＵ３の３．９ｋｂの５ａｌｌフラグメントをサブクローニングす質転換に使 用した。８つのＣｍ’Ｌｖｓ’のクローンを選択し、む組換えプラスミドの１つ 、ｐＢＵ１４を特に丁寧に検討した。 ３．９ｋｂのむ」ｌフラグメントはｐＢＲ３２２の０．２８ｋｂのむ、１１−Ｂ 門ＨＩフラグメントと３．６ｋｂのＳａｌ　Ｉ−ＢａｍＢ　ｌフラグメント（第 ２図）とを含む、第２のサブクローニング処理後にプラスミドｐＢ０１６を単離 した。該プラスミドは枯草菌のＩＩＮへの約２．５５ｋｂのＳａ　Ｉ　Ｉ−鋤１ フラグメントを含む、このプラスミドはまた突然変異株５ａｅＵ　ＱＢ２５４中 でレバン−サッカラーゼ合成活性を復活させる。更に、Ｒｅｃ　１＾５１０株に ｐＢ０１４またはｐＢＵ１６を導入すると、レバン−サッカラーゼの過剰産生が 誘発される（表■）、これらのデータは、回遺伝子または該遺伝子の少なくとも 機能部が２．５５ｋｂのＳａ　Ｉ　Ｉ−鏑１フラグメントの内部に検出されるこ とを証明する。 表土 以下の組換えプラスミドを含む１＾５１０株によるレバン−サッカラーゼの分泌 クロラムフェニコールと１％（重量／容量）のグリセロールまたは２％（重量／ 容量）のサッカロースとを添加したＭＭＣＨ培地で前記プラスミドを含む枯草菌 ｌＡ３１０株を培養する。対ゼの酵素活性を測定した。総タンパク質１νｇあた りのレバン−サッカラーゼの単位によって比活性を定量した。 −プラスミドｐＢυ１６からむ］■−ジ止Ｉフラグメント（２，５５ｋｂ）を精 製する、 一ニックートランスレーションによって該フラグメントを放射性標識する、 一？を検ＤＮＡをニトロセルロースフィルターに移す、−該フィルターを、０． ５ＨのＮａＯＨと０．９ＨのＮａＣ１とを含浸させた一ｂｉｔｍａｎ　Ｎｏ、３ （出願商標）ペーパーにのせ、室温で２０分間維持する、 一ペーパー上で素早く乾燥させる、 −１８のＴｒｉｓ−ＢＣＩ、　ｐＨ７を含浸させたペーパーで処理を１０分間繰 り返す、 −素早く乾燥させる、 −２ｘ　５ＳＣ（１ｘ　５ＳＣ＝　０．１５ＨのＮａＣ１，０，０１５Ｍのクエ ン酸Ｎｉ３、ｐＨ７）を含浸させたペーパーで処理を繰り返す。 −ペーパー上で乾燥させ、次いで８０℃のオーブンで２時間乾燥させる。 相同系：以下の条件＾（緊縮性条件）で処理する。 異種系二辺下の条件Ｂ（非緊縮性条件）で処理する。 ＾）ｌ監ユゑ豆 一フイルターを２０〜４０ｚｌのハイブリダイゼーションバッファ（５０％ホル ムアミド、５ｘｓｓｃ、ＬＸ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ）とハイブリダイズする。４２ ℃で２時間プレハイブリダイズする。 −ハイブリダイゼーションバッファを交換し、約４Ｘ　１０’ｃｐｍの変性プロ ーブを添加する（１００℃で５分間）。 −４２℃で１６〜２４時間インキュベートする。 −以下の物質で順次洗浄する。 ｌ　Ｘ　５０ｘｌの５ｘＳＳＣ１５０％ホルムアミドで４２℃で２０分間、２Ｘ ５０ｚｊの２ｘＳＳＣ１０，１％ＳＤＳで４２℃で２０分間ずつ２回。 ｌ　Ｘ　５０ｗ１の０．２ｘＳＳＣ１０，１％ＳＤＳで４２℃で２０分間。 Ｂ）Ｌ乳星並ぶ弁 一フイルターを２０〜４０１１のハイブリダイゼーションバッファ（５ｘＳＳＣ １ＩＸＤｅｎｈａｒｄｔ、　０．１％５ＤＳ）とハイブリダイズする。 −４２℃で１６〜２４時間インキュベートする。 −以下の物質で順次洗浄する。 １×５０Ｒ１の５ＸＳＳＣ１０，１％ＳＤＳで４２℃で２０分間、２Ｘ５（ｈｌ の２ｘＳＳＣ１０，１％ＳＤＳで４２℃で２０分間ずつ２回。 Ｄｅｎｂａｒｄｔ溶液＝１％Ｆｉｅｏｌｌ、１％ポリビニルピロリドン、１％Ｂ Ｓ八。 ０１１１ＡＬ等、Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、＾ｅａｄ、　Ｓｃｉ、、ＵＳＡ：す、 ３６８３〜３６８７（１９７９）　：Ｍ＾ＮＩＡＴＩＳ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇｐＢｔｌ１６に挿入されたフラグ メント内部の５ａｅｌＪ座の所在を決定するために、該フラグメントのレベルで 欠失を生起し、以下のプラスミドを構築した。プラスミドｐＢ０１０１はプラス ミドｐＢＵ１４から２．４ｋｂのＥｅｏＲ１フラグメントを除去して得られた。 プラスミドｐＢｔｌｌｏｏは該ＥｃｏＲｌフラグメントをベクタすることによっ て構築された。２つのプラスミドｐＢＵ１００及びｐＢＵｌｏｌは遺伝子型ｓ＋ ｃｃｌｌの０８２５４株を遺伝子型５ａｅｔｌ責Ｌｖｓ”）ＤＮＡカセットをｐ ＢＵ１６の…Ｒ１及びＢｓｔＢ　Ｉのレベルに導入しプラスミドｐＢＵ１０２及 びｐＢＵ１０３に夫々帰着することによって確認された。　ｐＢＵ１４及びｐＢ Ｕ１６は大腸菌中に維持されることはできなかったので、これらの１ラスミドｐ Ｂｔｌ１０２及びｐＢＵ１０３は枯草菌中で直接クローニングすることによって 得られた。　ｐＢｔｌ１０２を作製するために、■？及びつを含む４．５ｋｂイ ーシ のＤＮ＾配列をｐＢＵ１６の者ホ墳［ｅ　ｏ　Ｒ１部位のレベルに挿入した。 胞が自然に出現する（染色体に１ａｅＺ　ｅｒｓを取り込む二重乗換メカニズム ）、同様の方法でストレプトコッカス・フエカーリス江１匹匹匹匹とｈ見料ｎに 由来のカナマイシン耐性マーカーｕ工醪を含む１．５５ｋｂのＣＩａ１７ラグメ ントをｐＢｔｌ１６ドｐＢＵ１０３を構築した（ＴＲＩＥｔｌ−ＣＵＯＴ　Ｐ、 等、（１９８３）　、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅ　　ｏｆ　　ｔｈ ｅ　　５ｔｒｅｐｔｏｅｏｅｅｕｓ　　ｐｌａｓｍｉｄ　　ｇｅｎｅ　　ｅｎｃ ｏｄｉｎｇ３’５’−ａｓｉｎｏ−ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａ ｎｓｆｅｒａｓｅ　ｔｙｐｅｍ　、Ｇｅｆｆ１ｅ。 ２３：３３１〜３４１）、　ｎ記のごとく、枯草菌１６８４：ｐＢＵ１０３を導 入後、□１座の内部にＫｍ’マーカーを挿入することによってに一’Ｃ−１８１ １１が出現する。プラスミドｐＢｔｌ１０２及びｐＢＵ１０３を夫々介してＥｅ ｏＲＩ及びＢｓｔＢ　１部位のレベルにこのように挿入された］ｉｃＺ　ｅｒｖ ａ及びリエ醪フラグメントはこのように形質転換された枯草菌細胞に表現型Ｌｖ ｓを与える。 （５）ｓａｅＵ　　のヌクレオ　ド ジデスオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（ＳＡＮＧＥＲＦ、等、 （１９７７）、ＤＡＮ　５ｅｑｕｅｎｃｉＢ　ｃｈａｉｎ　ｔｅｒ＋ａｉｎａｔ ｉｎｇｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 ＵＳＡ、７４　：５４Ｂ３〜５４６７）によってｐＢ０１６の２．５５ｋｂの躍 １−５ａｌ　！フラグメントを２つのストランドのレベルで配列決定した。この 結果、以ｔＩｉＯＲＦＩ（３８５コドン）及び０ＲＦ２　（２２９コドン）と指 称する２つの読取り枠が検出された（第１０図）。これらの読取り枠の上流には 、配列ＣＧＡＣＣＧ＾（ΔＧ＝　−７８ｋＪ／＋５ｏｆ）及び＾＾ＧＣＡＧＧ　 （Δ（：　＝　−７４ｋＪ／ｍｏ１）に夫々対応するリポソーム結合部位が存在 した。　０ＲＦＩと０ＲＦ２との開に転写終了シグナルは検出されなかった。 ０ＲＦＩ及び０ＲＦ２は夫々分子量４４，９０６ダルトン及び２５，８３３ダル トンのポリペプチドをコードする。 ＜６　）ｓａｅＵによってコードされるボ１ベプ　ドのｉｎ　ｖｉｔｒ。 ■ ５ａｃＵ座を含むプラスミドｐＢｔｌ１６を大腸菌の存在下に１ｎｖｉｔｒｏで インキュベートした。ポリペプチドを３ｓＳメチオニンで標識しく比活性３９Ｔ Ｂｑ／ｍｍｏ１以上）、５ＤＳ−ＰＡにＥで分離し、オートラジオグラフで表示 した（第１２図）０組換えプラスミドによって合成されたポリペプチドとプラス ミドｐＢｖ１４３１ｄによってコードされたポリペプチドとを比較すると新しい バンドの存在が判明し、２つのバンドは０ＲＦＩ及び０ＲＦ２から推定されたポ リペプチドの見掛は分子量と一致する見掛は分子量（夫々４５，０００ダルトン 及び３０，０００ダルトン）を有しての−ンパ　　の　ミノ　　　　の データリサーチによって別のタンパク質との相同性を検索すると、０ＲＦＩによ ってコードされるポリペプチド５ａｅＬ　＋は、「センサ」タンパク質のクラス のタンパク質、即ち、扛ｔ　　ｈｉｍｕｒｉｕｍのＣｈｅＡ、大腸菌のＣｐｘ＾ 、＾、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＶｉｒ＾、大腸菌のＰｈｏＲ，に、　　ｎｅ ｕｍｏｎｉｉｅのＮｔｒＢと相同であることが判明した（第７図＞（ＤＲＵＭＭ ＯＮＤ　Ｈ，等、（１９８６）、５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄｄｏ＋５ａｉｎ　ｒ ｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ｏｆ　ｎｔｒＣａｎｄ　ｎ１ｆＡ　ｆｒｏ＋＊　Ｋ ｌｅｂｓｉｅｌｌａ肚μ復射土ａｅ：ｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓ　ｔｏ　ｏｔｈｅｒ 　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ＥＭＢＯ，Ｊ、、５：４４１〜４ ７７、ＮｌＸ０Ｎ　　Ｂ、Ｔ、等（１９８６）　、ｔｗｏ−ｅｏｅ＋ｐｏｎｅｎ ｔｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　　ｓｙｓｔｅｍｓ　　ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　　ｔｏ 　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　　ｓｔｉ−ｍｕｌｉ　　５ｈａｒｅ　　５ｔｒ ｏｎ４１ｙ　　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　　ｄｏ＋＊ａｉｎｓ　　ｗｉｔｈ　　ｔｈ ｅ　　ｎｉｔ−ｒｏｇｅｎ　　ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ　　ｒｅｇｕｌａｔｏ ｒｙ　　ｇｅｎｅｓ　　ｎｔｒＢ　　ａｎｄ　　ｎｔｒｃ。 Ｐｒｏｅ、　　Ｎａｔｌ、　＾ｅａｄ、　　Ｓｅｉ、、ＵＳＡ、８３ニア８５０ 〜７８５４．ＲＯＮＳＯＮ　Ｃ。 −１等、（１９８７）、Ｃｏｎ５ｅｒｖｅｄ　ｄｏｍａｉｎｓ　ｉｎ　ｂａｃｔ ｅｒｉａｌ　ｒｅｇｕｌａ−ｔｏｒｙ　　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　　ｔｈａｔ　　ｒ ｅｓｐｏｎｄ　　ｔｏ　　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　　ｓｔｉｍｕｌｉ＋Ｃ ｅ１ｌ、４９：５７９〜５８１））、これらのタンパク質のＣ末端部においては 、（Ｎ末端側からＣ末端側に）１がら５までの番号を付けた５つの保存アミノ酸 領域が既に記載されていた（Ｓｔｏｃｋ八等、（１９８８）、ＣｈｅＡ　ｐｒｏ ｔｅｉｎ、　ａ　ｃｅｎｔｒａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｏｆ　ｂａａｔｅｒｉ ａｌ　ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ、　ｂｅｌｏｎｇｓ　ｔｏ　＊　ｆａｍｉｌｙ　ｏ ｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓｔｈａｔ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉ ｏｎ　ｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｃｈａｎｇｉｎｇ８５：１４０３〜１４ ０７）　。 ０ＲＦ２によってコードされるタンパク質Ｓａｃυ１ｚは１つのクラスの調節タ ンパク質（または「活性化物質」ポリペプチド）と相同性を有する。大腸菌のタ ンパク質ＯｍｐＲ及びＤｙｅと枯軍曹のタンパク質５ｐｏＯ＾及び５ｐｏＯＦと はＮ末端レベルの■す座のタンパク質０ＲＦ２と相同性を有する（第８図）、大 腸菌のタンパクＭａｌＴ（Ｃｏｌｅ　Ｓ、　Ｔ、等、＜１９８６）、Ｔｈｅ　ｎ ｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍａｌＴ　ｇｅｎｅ　 ｅｎｅｏｄｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒｅｇｕｌａｔａｒ　ｏｆ　ｔ ｈｅ　Ｅｓｅｈｅｒｉｃｈｉｉ　ｅｏｌｉ　＋ａａｌｔｏｓｅ　ｒｅｇｕｌａｔ ｉｏｎ＋Ｇｅｎｅ。 ４２：２０１〜２０８）、及び肚匹座の０ＲＦ１によってコードされる調Ｎ物質 （ＳＷＡＲＭ＾Ｓ１等、（１９８６）、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｅ ｌｅｍｅｎｔｓｆｏｒ　ｔｈｅ　ｕｖｒＣｇｅｎｅ　ｕｎｉｔ　ｏｆ　Ｅｓｅｈ ｅｒｉｅｈｉａ　ｃｏｌｉ、　Ｎｕｃｌｅｉｅ＾ｅｉｄｓ　Ｒｅｓ、、１４　： ２３０１〜２３１８）は、Ｃ末端レベルの５ａｃＵ座の０ＲＦ２によってコード されるタンパク質と相同性を有する（第９図）、ｕ匹座（参考文献は前出）の０ ＲＦ２はＣ末端部及びＮ末端部のレベルで０ＲＦ２によってコードされるポリペ プチドと相同性を有するので特殊ケースである（第８図及び第９図）。 オスｔル 前記タンパク質の多くは、栄養素の不足またはホ会≠４虫キ壬濃度（ｏｓｍｏｌ ａｒｉｔｅ）の変化のごとき環境変化の１つに対応して転写のレベルで遺伝子の 発現を調節するために対合して機能する（Ｍ＾ＴＳＬＩＹＡＭ＾Ｓ、　１．等、 （１９８６）、Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎ　　ｔｗｏ　　ｒｅｇｕ ｌａｔｏｒｙ　　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　　ｉｎ　　色匹 且旦ｅｔ　７　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｅｈｉａ　ｅｏｌｉ：　ａ　 ｎｏｖｅｌ　７　ｍｕｔａｔｉｏｎ　５ｕｐｐｒｅｓｓｅｓ　ｐｌｅｉｏｔｒｏ ｐｉｃ　ｄｅｆｅｃｔｓ　ｃａｕｓｅｄ　ｂｙ　ａｎ　ｅｎｖＺ　ｍｕｔａｔｉ ｏｎ；Ｊ、　Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、、１６８：１３０９〜１３１４）、　５ａｃ Ｕ座の０ＲＦＩ及び０ＲＦ２によって夫々コードされるポリペプチド５ａｃｔｒ ｉｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｎｅｌ）と相互作用し陽性調節機能即ち転写活性化機能 を与える。またはこの機能がＣ末端部に局在することもある。その理由は、０Ｒ Ｆ２が大腸菌のＭａｌＴのごとき調節物質と相同性をもっためである。 センサタンパク質と調節タンパク質との相互作用は、対合タンパク質Ｃｈｅ＾／ ＣｂｅＹ、ＮｔｒＢ／ＮｔｒＣ及びＥｎｖＺｌｏｍｐＲの場合に（活性化物質ま たは調節物質とも呼ばれる）エフェクターＣｏｖａｌｅｎｔ　ｍｏｄｉｆｉｃａ ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　７　ｐｒｏｄｕｃｔ、　ＮＲｌ　、　ｂｙｔｈｅ　已 ｐｒｏｄｕｃｔ、　ＮＲＩｒ　＋　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｃ ｒｉｐｔｉｏｎｏｆ　ｔｈｅ　Ｌ旦匹ｏｐｅｒｏｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｅｈｉａ　 ｃｏｌｉ＋Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ。 ＾ｅａｄ、　Ｓｅｉ、、ＵＳＡ、旺、５９０９〜５９１３．ＷＹＬＩＥ　Ｍ、　 Ｅ、等、＜１９８８）、５ｅｎｓｏｒｙ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｂ ａｅｔｅｒｉａｌ　ｅｈｅｍｏｔａｘｉｓ　１ｎｖｏｌｖｅｓｐｈｙｓ、　Ｒｅ ｓ、　Ｃｏ＋ｍｓ＋、、１５１：８９１〜８９６；Ｍ、　Ｍ、　ＩＣＯｅｔ　Ｔ 、　Ｊ。 ５ＩＬＩＩ＾ＶＹ（１９８８）　　ＥｎｖＺ、　　ａ　　ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒ ａｎｅ　　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｓｅｎｓｏｒ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｅ ｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ−１２ｉｓ　ｐｂｏｓｐｂｏｒｙｌａｔｅｄ　１ｎｖｉｔ ｒｏ、１７０：５９７１〜５９７３））、センサタンパク質Ｃｂｅ＾は＾ＴＰの 存在下に自動的にホスホリル化しホスホ−Ｃｈｅ＾を産生することも教示されて いる（Ｊ、　Ｆ、　ＢＥＳＳ、Ｒ，Ｂ、　ＢＯＵＲＲＥＴ、Ｍ、　Ｉ。 ＳＩＭＯＮ（１９８Ｂ＞、ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏ ｎ　ａｎｄ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｇｒｏｕｐ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｉｎ　ｂａ ｅｔｅｒｉｉｌ　ｅｈｅｍｏｔａｘｉｓ＋Ｎａｔｕｒｅ、　３３６：１３９〜１ ４３）　、ホスホリル化したセンサタンパク質は活性化物質ＣｈｅＹにホスホリ ル基を与える。これは糖のホスホトランスフェラーゼ系のホスホトランスフェラ ーゼ反応と同様である（ＮＹＬＩＥ　Ｄ、等、前出）０何座の構成に関しては、 別のセンサ／活性化物質系（ＮｔｒＢ、　ＮｔｒＣ）の場合に提案されたように ０ＲＦＩ及び０ＲＦ２が同一オペロンに所属し得る（ＮＩＸＯＮ　Ｂ。 Ｔｏ等（１９８６）、前出）。 ５ａｃＵ系は窒素源及び炭素源を分解する酵素（例えばレバン−サッカラーゼ、 α−アミラーゼ、（１種以上の）β−グルカナーゼ、プロテアーゼ）の産生に影 響を与える。センサタンパク質に伝達されるシグナルは炭素及び／または窒素の 不足を反映する。■１座によってコードされる２つのポリペプチドのいずれにお いてもトランスメンブランセグメントは検出されなかった。従って、ｓｍｅｌｌ 系は細胞内の栄養物不足シグナルに応答する公算が大きい。 （８）前記上０１座を含む１４ｋｂのＤＮ＾フラグメントの特性をより詳細に以 下に説明する。 突然変異５ｉｃＵ−４２とく肚ハ座の「二重乗換」によって枯草菌の染色体にレ バナーゼの構造遺伝子を取り込んだ）転写融合７との双方を含む枯草菌０８４１ ８１株を構築した。 カナマイシン耐性遺伝子吐■」ｔ　ｓ　ａ　ｃ　Ｒ領域の転写シグナルカラーゼ の構造遺伝子５ａｅＢのプロモーター、ｕｌの発現を活性化する調節遺伝子５ａ ｅｌｌの標的及びサッカロースによるレバン−サッカラーゼの誘発に関与する調 節遺伝子■づの標的を含む。 菌株ＱＢ４０８１中に対立遺伝子５ａｃｋ−４２が存在するので、旺４の発現及 びｕｄ１吐門の発現が欠失する。従って、’　０８４１８１株は、サッカロース （２０ｙ＃）　、カゼイン加水分解物（０，５ｇ＃）。 トリプトファン（２０μｙ／ｉ１）、カナマイシン（１００μｇｏａｌ＞を添加 した培地ＳＭＭＨＣＫ＠１ＯＯ（Ｓｐｉｚｉｚｅｎのミネラル培地）（Ｊ、　Ｂ ａｅ−ｔｅｒｉｏｌ、、８１．７４１〜７５６（１９８１））の容器でカナマイ シンの存在下に増殖できない、逆に、ＱＢ４０８１中の対立遺伝子ｓａｃ［ｌ− ４２に５ａｃＵ”３２が置換すると回−駐工醗の発現が活性化されカナマイシン 耐性が得られる。 受容株として０８４１８１株を使用し供与株として突然変異体５ｉｅＵ”３２か ら抽出された染色体［ＩＮ八を使用する形質転換実験において、形質転換体（形 質転換細胞）ｓａｃＵ”３２をカナマイシン耐性（Ｋｍ’）に基づいてＳＭＭＢ ＣＫｍｌＯＯ培地から直接選択する。 比較のために、プラスミドｐＢＵｔｌｌを用いた０８４１８１株の形質転換実験 で形質転換体に−８を得た。これらの形質転換体は表現型「分泌酵素の過剰産生 」を完全に発現するので対立遺伝子５ａｃＵＩ′３２を含む、使用された方法に よって、プラスミドから染色体に移入できる突然変異５ｕｅｄ’″３２を有する 組換え体が選択されたと説明することができよう、これはまた、ＤＡＮ供与体と して使用されるプラスミドが突然変異工ペトリ皿で行った試験によれば、プラス ミドｐＢＵＩＩＩを含むＱＢ２５４株またはＲｅｃ　（１＾５１０）株は、染色 体突然変異ｓａｃ［ｌ’３２を含む０８１３６株よりもプロテアーゼ及びレバン −サラカラー使用した実験条件では、該プラスミドが担う突然変異±Ｕ”３２が 分泌酵素過剰産生表現型を部分的にしが発現しないと考えられる。 ２．５５ｋｂのフラグメントを用いて受容細胞特にバチルス科の細胞を形質転換 するために使用された前述のすべての技術は勿論、これらの技術が応用できる範 囲で１４ｋｂのフラグメントにも応用でき、また、５ａｃＬＩ座の特性を十分に 活用するように上記フラグメントがら誘導された±Ｕｈ座を含むサブフラグメン トにも応用できる。主として２．５５ｋｂのフラグメント及び１４ｋｂのフラグ メントのヌクレオチド構造の差異に起因するこれらの応用は通常の知識をもつ当 業者には勿論明らかであろう。 前記の実験及び観察の結果を示す７面について以下に簡単に説明する。 一第１図ニ プラスミドｐＢＵ３の制限地図６図の上部は、枯草菌ＢＤ１２３８のＤＮＡのＴ ｏｍＨｌフラグメントを示す、　ＩａｃＺ遺伝子、エリスロマイシン（ｅｒａ） 耐性マーカー及びＴａ２０５の所在は夫々斜線帯、黒色帯及びもう１つの斜線帯 で示す。註鱈座を含む鎮ｌ−７１フラグメントは白色帯で示す０図の下部は、枯 草菌中の複製起点（黒色帯）、クロラムフェニコール（Ｃｍ）耐性マーカー及び ｐＢＲ３２２の配列（白色帯）をもつプラスミドベクターを示す。 一第２図ニ プラスミドｐＢＵ１４の制限地図１口の上部は、枯草菌の３．６ｋｂのシｔｌ　 Ｉ　−Ｂａｗｌ　ＩのＩＩＮ＾フラグメント（点線帯）とｐＢＲ３２２の０．２ ８ｋｂのＢａｍＥ　Ｉ−似Ｉフラグメント（黒実線）とを含む鎮Ｉフラグメント を示す、　ｐＢ０１４から誘導されたプラスミドｐＢｔｌ１６は、白色帯で示さ れるＳａｔ　Ｉ　−５Ｂ４　Ｉ部位間の２．５５ｋｂの枯草菌フラグメントだけ を含む０図の下部は、プラスミドベクターを示す（記号は第１図と同義）。 −第３図： 少数コピーで複製するプラスミドｐＥＶ１４３６（８，７ｋｂ）及び多数コピー で複製するプラスミドｐＢＶ１４３１　（１０，８ｋｂ）の概略図。 枯草菌中での機能複製起点は点線帯（ｐＥＶ１４３６）または黒色帯（ｐＢＶ１ ４３１）で示される。クロラムフェニコール耐性マーカーは斜線帯で示され、ｐ ＢＲ３２２配列は白色帯で示される。 −第４図： 枯草菌の５ｉｅｌＪ座を含むＤＮＡフラグメントの詳細なヌクレオチド配列及び 制限地図（ヌクレオチド番号は第１０図のヌクレオチド番号よりも１つずつずれ ている０例えば第１０図の１０位のヌクレオチドＴは第４図では１１位に存在す る）。 −第５図： ポリペプチドＳａｃＬＩｍ＋の３８５個のアミノ酸の配列の読取り枠。 一第７図： 枯草菌の５ａｃＵ座の０ＲＦＩによってコードされるポリペプチド５ａｃｋｓ　 ＋のＣ末端部とＳ、　ｔｈ　　ｂｉｓｕｒｉ■のタンパク質Ｃｈｅ＾と大腸菌の タンパク質Ｃｐｘ＾との比較。 −第８図： 枯草菌の凹座の０ＲＦ２によってコードされるポリペプチドＳａｅＬＩｍ２のＮ 末端部と大腸菌のタンパク質Ｄｙｅ、（ＯＲＦ２によってコードされる）Ｕｖｒ Ｃ１Ｏ論ｐＲと、枯草菌のタンパク質５ｐｏＯ＾、５ｐｏＯＦとの比較。 一第９図： 枯草菌のポリペプチド５ａｃＵｓｔのＣ末端部と大腸菌の（ＯＲＦＩ及び０ＲＦ ２によってコードされる）タンパク質ＵｖｒＣ及び大腸菌のタンパク質ＭａｌＴ どの比較。 −第１０図ニ 一本発明の５ａｃＬＩ座を含むＤＮＡフラグメントの詳細なヌクレオチド配列、 ポリペプチド５ａｃＵａ＋及び５ａｃＵａｚが、これらのポリペプチドを夫々コ ードする読取り枠０ＲＦＩ及び０ＲＦ２の上方に示されている。　０ＲＦｌは２ ２０位〜１３７４位のヌクレオチドによって形成され、０ＲＦ２は１４６０位〜 ２１４６位のヌクレオチドによって形成される。 一第１１図ニ プラスミドに挿入されるＤＮＡの簡単な制限地図、遺伝子型ｇｉｅＬＩ’Ｔｈ枯 草菌ＱＢ２５４の菌株中でレバン−サッカラーゼの合成を復活させ得るプラスミ ドｐＢＵ１４、ｐＢｌ１１６、ｐＢυ］００＋　ｐＢυ】０１、ｐＢυ１０２及 びｐＢＵ１０３の能力を示す、　０ＲＦＩ及び０ＲＦ２の位置を斜線帯で示す、 転写方向は左→在である。プラスミドｐＢＵ−第１２図： ポリペプチド５ａｅＵａ＋及びＳａｃυ１２の同定：共有結合した閉鎖環状の１ μ９のプラスミドＤＮＡを使用してｉｎ　ｖｉｔｒｏ操作した。翻訳産物を３ｓ Ｓメチオニンで標識し、５ＤＳ−ＰＡにＥで分離し、オートラジオグラフィーで 検出した。 ライン１はベクターｐＨＶ１４３１ｄに対応し、ライン２は０ＲＦ１及び３０， ０００に対応するバンドを示す。 −第１３図： ンパク　Ｄｅ　５（ｓａｃｔｌ−）のアミノ分解酵素を過剰産生する突然変異体 または産生能の欠失した突然変異体中で夫々合成された修飾タンパク質を上向き または下向きの矢印で示す０例えば突然変異物ｙ沢（Ｈｌ）はタンパク質Ｄｅｇ Ｕ２００の２１８位のアミノ酸Ｇがアミノ酸Ｅで置換されることによって分解酵 素を過剰産生じ得る。 下線を施した部分は、ＮｔｒＢ、Ｃｈｅ＾及びＥｎｖＺとの類似性を有する口末 端ドメインである。 この図では、遺伝子型物ｙ君、βｙ月及び勤山工を夫々誘発するタンパク質Ｄｅ ＨＳ２２０．　ＤｅｇＳ２００及びＤｅＨＳｌｏｏを示した。 一第１４図： ンパク！″ＤｅＵ　び″線素　　ｄｅＵに・　つて合　されｔ・−飾　ンバク　 のアミノ　　　（１３゛参明図中の下線を施した対応する遺伝子型を夫々誘発す るタンパク質ＤｅｇＬ１３２、ＤｅｇＵ２４、ＤｅｇＵ１４６．　ＤｅｇＵ９、 ＤｅｇＵ３１、ＤｅｇＵ１４３、ＤｅｇＵ２００、ＤｅｇＵ１２２及びＤｅｇＵ １９３を示す。 −第１５図： 遣口　ＤｅＳ（ＳａＣＵｓ　　　びＤｅＵ（ＳａＣＵｓ　　　の　坊１　　び突 然変異むｄハ、む４１四、鼓ｄ旦及び旺ｇは分解酵素の過剰産生を誘発する。そ の他の突然変異はこれらの酵素の産生欠如を誘発する。　ＱＢ２６０．２６１． ２６４．２６６及び２６９のごとき菌株は２つの突然変異、即ち突然変異体中ｕ （Ｂ　ｙ　）と、突然変異体中録の逆の作用を生じる第２の突然変異とを含む、 第２の突然変異は分解酵素の産生欠如を誘発する。 本発明のＤＮＡフラグメントのクローニングに使用された遺伝子型５ａｅＵ”及 び銭娃１の枯草菌の菌株はパリ、パスツール研究所（１’　ｌＮ５ＴＩＴＵＴ　 ＰＡＳＴＥＵＲｄｅ　ＰＡＲＩＳ）のＣ０ＬＬＥＣＴＩＯＮＮＡＴＩＯＮＡＬＥ 　ＤＥ　ＣＵＬＴＵＲＥＳ　ＤＥ　ＭＩＣＲＯ−ＯＲＧＮＩＳＭＥＳ（Ｃ，Ｎ、 Ｃ，Ｍ、）に夫々受託番号ｌ−７４１及びｌ−７４４で寄託された。 プラスミドｐＢＵｔｌｌを含む枯草菌の菌株は１９８８年７月１３日にフランス 、パリのパスツール研究所のＣ０ＬＬＥＣＴＩＯＮ　ＮＡＴＩＯＮＡＬＥＤＥ　 ＣＵＬＴＵＲＥＳ　ＤＥ　ＭＩＣＲＯ−ＯＲにＮＩＳＭＥＳ（Ｃ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、 ）に受託番号ｌ−７８２で寄託された。 言うまでもなく、本特許請求の範囲内で行なわれたプラスミドの寄託は、該プラ スミドを構成するヌクレオチド配列に間する記載と全く同等の価値をもつ、従っ て第三者はブダペスト条約で規定された条件下でのみこれらのプラスミドを入手 し配列決定することができる。 浄ｒｃ内六に変更なし） Ｓｐｈｌ ｓｔＩ Ｆｉｇｕｒｅ　　３ 手続補正書動式） 平成２年９月ｌｓ日　τにか 特許庁長官　　植　松　　敏　殿 １、要件の表示　　ＰＣＴ／ＦＲ８９１００１３４３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名　称　　　アンステイテユ・バストウール５、補正命令の日付　平成２年９月 ４Ｅ！６、補正の対象　　　図面の翻訳文 ７、補正の内容 国際調査報告 ｍ−１−−＾−−−−−、■−／Ｆ”Ｒ８９１００１３４

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．突然変異を含まない枯草菌の菌株または突然変異特に突然変異ｓａｃＵｈを 含む枯草菌の菌株の染色体に由来の２．５５ｋｂのＳａｌＩ−ＳｐｈＩフラグメ ントに含まれたヌクレオチドの機能配列を含む核酸フラグメントであって、前記 配列が、枯草菌（または前記フラグメントが担う情報を利用し得る別の微生物） に導入されると該枯草菌（または該微生物）中でタンパク質の過剰産生を誘発し 得るかまたは該枯草菌（または誠微生物）に表現型Ｄｅｇｈを与え得ることを特 徴とする核酸フラグメント。
2. ２．機能配列が、突然変異ｓａｃＵｈを含まない枯草菌の菌株の染色体に由来の ２．５５ｋｂのフラグメントに含まれており、前記配列が遺伝子型ｓａｃＵ＋を コードするｓａｃＵ座を含むことを特徴とする請求項１に記載のフラグメント。
3. ３．第１０図のヌクレオチド配列に含まれることを特徴とする請求項２に記載の フラグメント。
4. ４．第１０図の２２０位〜１３７４位のヌクレオチドによって形成されるヌクレ オチド配列がポリペプチドＳａｃＵｓ１をコードすること、及び、第１０図の１ ４６０位〜２１４６位のヌクレオチドによって形成されるヌクレオチド配列がポ リペプチドＳａｃＵｓ２をコードすることを特徴とする請求項２または３に記載 のフラグメント。
5. ５．対応ポリペプチドＳａｃＵｓ１及びＳａｃＵｓ２の活性を変化させることな くいくつかのヌクレオチドが別のヌクレオチドによって置検されていることを特 徴とする請求項２から４のいずれか一項に記載のフラグメント。
6. ６．第１０図のヌクレオチド配列を有することを特徴とする２．５５ｋｂのＳａ ｌＩ−ＳｐｈＩフラグメントとハイブリダイズ可能な核酸フラグメントであって 、前記ハイブリダイゼーション処理が以下の段階、即ち、 −前記核酸フラグメントを支持するニトロセルロースフィルターをハイブリダイ ゼーションバッファ（５×ＳＳＣ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ、０．１％ＳＤＳ）と 共に４２℃で１時間前処理（プレハイブリダイゼーション）し、 −核酸フラグメントが固定された担体と接触したハイブリダイゼーションバッフ ァを同じ組成のハイブリダイゼーションバッファで交換し、特に放射性標識し且 つ１００℃で５分間処理して予め変性した２．５５ｋｂの配列をプローブとして 添加し、 −担体に固定された前記核酸フラグメントをインキュベーションバッファ中で２ ．５５ｋｂのフラグメントと共に４２℃で１６〜２４時間インキュベートし、 −非固定プローブを含むバッファを除去するために、非緊縮性条件下に１×５０ ｍｌの５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで４２℃で２０分間、２×５０ｍｌの２×Ｓ ＳＣ、０．１％ＳＤＳで４２℃で２０分間ずつ２回の洗浄を順次行なうか、また は、 緊縮性条件下に１×５０ｍｌの５×ＳＳＣ、５０％ホルムァミドで４２℃で２０ 分間、２×５０ｍｌの２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで４２℃で２０分間ずつ２回 、１×５０ｍｌの０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで４２℃で２０分間の洗浄を 順次行なう段階を含むことを特徴とする核酸フラグメント。
7. ７．突然変異ｓａｃＵｈを含む枯草菌の菌株に由来の２．５５ｋｂのＤＮＡフラ グメントに含まれるヌクレオチドの機能配列を含む請求項１の核酸フラグメント であって、前記配列が、−遺伝子型ＳａｃＵｈをコードするＳａｃＵｈ座を含む こと、−突然変異ＳａｃＵ−を有する枯草菌の菌株に前記フラグメントが組み込 まれると前記前列が前記菌株中でレバン−サッカラーゼの合成活性を復活させ得 ること、−枯草菌（または前記フラグメントが担う情報を利用し得る別の微生物 ）に導入されると前記配列が該枯草菌（または該微生物）中でクンパク質の過剰 産生を誘発し得るかまたは表現型Ｄｅｇｈを与え得ること、 −請求項６に記載の条件下に請求項１に記載の枯草菌に由来の２．５５ｋｂのＳ ａｌＩ−ＳｐｈＩのＤＮＡフラグメントとハイブリダイズし得且つハイブリダイ ズ状態を維持し得ることを特徴とする請求項１に記載の核酸フラグメント。
8. ８．表現型Ｄｅｇｈを誘発する少なくとも１つのポリペプチド、特にポリペプチ ドＳａｃＵｓ１及び／またはＳａｃＵｓ２及び／またはＳａｃＵｓｈをコードす る配列を、前記配列の転写をコントロールし得るプロモーターと、任意に存在す る転写終了シグナルをコードする配列と共に含むことを特徴とする請求項１から ７のいずれか一項に記載のフラグメント。
9. ９．プロモーターと任意に存在する転写終了シグナルをコードする配列とが、表 現型Ｄｅｇｈを誘発する（１つまたは複数の）ポリペプチドをコードする配列に 対して異種（ｈｅｔｅｒｏ−ｌｏｇｕｅ）であることを特徴とする請求項８に記 載のフラグメント。
10. １０．適当な微生物特に枯草菌の菌株を形質転換させ得る複製型または組込み型 の組換えベクター特に組換えプラスミドであって、前記ベクターが、前記微生物 菌株のポリメラーゼによって認識されるプロモーターのコントロール下に請求項 １から９のいずれか一項に記載のフラグメントを含むことを特徴とする組換えベ クター。
11. １１．適当な微生物による酵素、タンパク質またはポリペプチドの産生能力を増 進する方法であって、該方法が請求項１から９のいずれか一項に記載のフラグメ ントまたは請求項１０に記載のベクター特にプラスミドを用いて前記微生物の細 胞を形質転換させ、形質転換された宿主細胞を適当な培地中で培養し、前記細胞 または培地から前記タンパク質を回収することを特徴とする方法。
12. １２．適当な微生物がバチルス菌、特に枯草菌の菌株であり、産生が刺激される タンパク質がｓａｃＵ及び／またはｓａｃＵｈ遺伝子によって活性化される前記 バチルス菌の菌株の天然構造遺伝子によってコードされるタンパク質であること を特徴とする請求項１１に記載の方法。
13. １３．産生が刺激される所定ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む ように使用微生物株の細胞のゲノムまたは染色体を修飾し、前記配列の上流に、 請求項１から９のいずれか一項に記載のＤＮＡフラグメントによってコードされ る１つまたは複数のポリペプチドに対する標的配列が存在することを特徴とする 請求項１に記載の方法。
14. １４．標的配列が、Ｓａｕ３Ａ１−Ｒｄａ１制限部位によって規定された配列で あり、リボソーム結合部位及び枯草菌中のレバンーサッカラーゼをコードするＤ ＮＡ配列の上流に存在する４４０ｂｐのフラグメントに通常含まれている配列で あることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
15. １５．産生を刺激すべきポリペプチドが、通常まずタンパク質の前駆体の形態で 合成される分泌タンパク質であり、該分泌タンパク質をコードするヌクレオチド 配列の上流に、シグナルペプチドをコードするシグナル配列が存在し、該シグナ ルペプチドの機能は前記ポリペプチドを分泌させることであり、前記シグナル配 列自体の上流に標的配列を含むヌクレオチドフラグメントが存在することを特徴 とする請求項１１から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. １６．使用される微生物の細胞のゲノムまたは染色体が、請求項１から９のＤＮ Ａフラグメントによってコードされる１つまたは複数のポリペプチド以外の表現 型Ｄｅｇｈを誘発するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むように 修飾されていることを特徴とする請求項１１から１５のいずれか一項に記載の方 法。
17. １７．請求項１から１１のＤＮＡフラグメントによってコードされる１つまたは 複数の活性化物質以外の活性化物質がポリペプチドＳａｃＱＬであることを特徴 とする請求項１６に記載の方法。
18. １８．請求項１から９のいずれか一項のフラグメントまたは請求項１１のベクタ ーによって形質転換されることを特徴とする微生物特に枯草菌の菌株。
19. １９．所定のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を、標的配列と前記所定のポ リペプチドの細胞内合成をコードする配列の発現に必要な要素とを含むヌクレオ チド配列の下流に含むＤＮＡフラグメントによって形質転換されることを特徴と する請求項１８に記載の細菌株。
20. ２０．所定のポリペプチドをコードする配列の上流にシグナル配列が存在し、該 シグナル配列の上流に、標的配列と前記所定のポリペプチドの細胞外合成をコー ドする配列の発現に必要な要素とを含むヌクレオチド配列が存在することを特徴 とする請求項１９に記載の細菌株。
21. ２１．第５図のアミノ酸精造を有することを特徴とするポリペプチドＳａｃＵｓ １。
22. ２２．第６図のアミノ酸精造を有することを特徴とするポリペプチドＳａｃＵｓ ２。