WO2001021808A2 - Bacteries lactiques transformees pour leur conferer un metabolisme respiratoire - Google Patents

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WO2001021808A2
WO2001021808A2 PCT/FR2000/002611 FR0002611W WO0121808A2 WO 2001021808 A2 WO2001021808 A2 WO 2001021808A2 FR 0002611 W FR0002611 W FR 0002611W WO 0121808 A2 WO0121808 A2 WO 0121808A2
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lactic acid
metabolism
gene
acid bacteria
genes
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PCT/FR2000/002611
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Inventor
Alexandra Gruss
Yves Le Loir
Philippe Gaudu
Patrick Duwat
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Institut National De La Recherche Agronomique (Inra)
DUWAT, Charlotte
DUWAT, Coralie
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Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C2220/00—Biochemical treatment
    • A23C2220/20—Treatment with microorganisms
    • A23C2220/202—Genetic engineering of microorganisms used in dairy technology

Definitions

  • the present invention relates to the improvement of the preservation and acidification properties of lactic starter cultures.
  • lactic sourdough any preparation intended for sowing a medium to be fermented, and comprising at least one strain of lactic acid bacteria belonging in particular to one of the genera Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, Propionibacteria , or Bifidobacteria, or a mixture of strains belonging to one or more of the genera mentioned above.
  • the lactic acid starter used in particular to produce fermented foods and silage products are usually prepared in batch culture, and are then concentrated and packaged for later use in order to inoculate different food products for fermentation.
  • One of the concerns of the producers of sourdoughs is to obtain a high bacterial biomass, and to maintain a good viability of the bacteria during storage so that, during inoculation, the fermentation starts quickly and gives food products having characteristics. reproducible.
  • culture media buffered around pH 6 with cations associated with carbonates, hydroxides, phosphates or oxides are usually used for the production of sourdoughs of lactic acid bacteria.
  • these additions to the culture medium can cause problems for subsequent productions, for example by promoting the development of phages, or by increasing the solubility of caseins.
  • the preparation and storage of sourdoughs is usually carried out anaerobically; for example, during the preparation of starter cultures in batches, certain steps are carried out under nitrogen, in order to remove traces of oxygen.
  • certain steps are carried out under nitrogen, in order to remove traces of oxygen.
  • they are frequently exposed to high levels of oxygen.
  • the milk that is used for the preparation of fermented milk products is highly aerated during the transfer process and therefore rich in oxygen. This could be a cause of slower restarting of the leaven.
  • the inventors have now shown that the improvements in bacterial yield and viability during storage are due to the acquisition of respiratory metabolism by L. lactis during culture under aeration and in the presence of a porphyritic compound. During the inoculation of the product to be fermented, the bacteria are also capable of immediately restoring a fermentative metabolism, which results in an increase in restarting performance.
  • Respiratory metabolism requires the presence of enzyme equipment involved in different metabolic pathways, including synthesis and the use of heme, the synthesis of cytochromes, and probably the synthesis of at least part of the cycle of t ⁇ carboxylic acids (Krebs cycle).
  • the inventors' results demonstrate in particular that the lactic acid bacteria, represented by L. lactis, have the capacity to grow via a fermentative or respiratory mechanism.
  • the growth mode depends on the culture conditions, but also on the signals transmitted by the cell itself.
  • the metabolism seems rather fermentative at the beginning of growth, then becomes respiratory once the bacteria are in late exponential growth.
  • the inventors have further hypothesized that there is a regulation of this transition exerted by the bacteria, and that an alteration of this regulation, effected by mactivation or by the overexpression of a regulatory gene which controls the transition between fermentative and respiratory growth, can result in more efficient breathing.
  • the object of the present invention is to provide means of conferring a respiratory metabolism on lactic acid bacteria, or of promoting it, in particular in order to improve the performance of lactic starter cultures in a manner comparable to that observed previously during the addition of 'heme (or other molecules derived from porphynnes).
  • this object can be achieved by causing or promoting the expression, in a lactic acid bacterium of at least one protein participating in this metabolism, by modifying the genomic profile of the lactic acid bacteria, or by transferring to a lactic acid bacteria one or more of the genes of respiratory metabolism, cloned from an aerobic bacterium, either by inactivating or overexpressing a gene of the initial bacteria, in order to switch metabolism towards the respiratory tract.
  • the present invention relates to a lactic acid bacterium genetically modified in order to confer on it a respiratory metabolism, or to activate said metabolism.
  • a modification resulting from the addition of at least one gene encoding or promoting a protein involved in respiratory metabolism can be obtained by transforming said lactic acid bacterium with at least one heterologous gene (i.e. gene which is not naturally present in said bacteria), involved in respiratory metabolism. It may in particular be a gene derived from an aerobic bacterium and involved in respiratory metabolism. Said gene can in particular be chosen from:
  • a modification resulting in the over-activation of a protein intervening in the respiratory metabolism or promoting it can for example be obtained by introduction, in the gene coding for this protein, of a mutation resulting in a more active protein.
  • a modification resulting in the overexpression of at least one gene coding for a protein involved in respiratory metabolism, or promoting it can for example be obtained by transforming said lactic acid bacterium with at least one additional copy of said gene, and / or by acting on the cis or trans regulation of this gene, for example by placing said gene under the control of expression regulation elements allowing greater expression (for example strong promoter, constitutive promoter, transcription enhancer, etc.) and / or by inactivating negative regulation elements of expression associated with said gene (for example repressor, attenuator, etc.).
  • a modification resulting in the maccivation, total or partial, of at least one gene coding for a protein intervening in the fermentative metabolism, or promoting it, can be obtained in particular by deletion of all or part of said gene, or by introduction of a mutation resulting in the production of a less active or inactive protein.
  • a modification resulting in the under-expression of at least one gene coding for a protein involved in fermentation metabolism, or promoting it can for example be obtained by acting on the cis or trans regulation of this gene, for example by placing said gene under the control of elements for the negative regulation of expression (for example repressor, attenuator, etc.) and / or by partially or totally inactivating the elements for the positive regulation of expression (for example promoter, enhancer of transcription, etc.) associated with said gene, or by making this expression mutable.
  • elements for the negative regulation of expression for example repressor, attenuator, etc.
  • partially or totally inactivating the elements for the positive regulation of expression for example promoter, enhancer of transcription, etc.
  • activation or overexpression of a gene coding for a protein intervening in respiratory metabolism or favoring it, there may be mentioned in particular: an activation of one or more genes intervening in assimilation of heme, or a modification increasing the expression of said gene (s) and / or making it constitutive.
  • the switching between a fermentative metabolism and a respiratory metabolism can be controlled by modification of the oxygen content of the culture medium and by the presence of heme.
  • Non-limiting examples of mactivation or under-expression of genes coding for proteins involved in fermentation metabolism, or promoting it are in particular: an activation of the ccpA gene, or a modification which attenuates its expression or makes it inducible.
  • the ccpA gene regulates the expression of several genes involved in the catabolism of sugars [LUESINK et al. , Molecular Microbiology 30: 789-798, (1998)].
  • the inventors have hypothesized that its mactivation could promote the expression of the genes necessary for respiration.
  • said lactic acid bacterium is chosen from bacteria of the genera Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, Propionibacteria, or Bifidobacteria.
  • Preferred bacteria are those of the various species of the genus Lactococcus, as well as streptococci of the species Streptococcus thermophilus.
  • the gene (s) suitable for conferring on bacteria all or part of the enzymatic equipment necessary for acquiring a respiratory metabolism or for improving respiration may be for certain genes identified by a person skilled in the art from the information on the sequences of the bacterial genomes available on the databases, which makes it possible to identify the genes already present in a given microorganism and the metabolic pathways in which these genes may participate.
  • the sequence (s) of one or more neighboring species is (are) usable (s) to determine which genes are probably present
  • streptococcus Streptococcus mutans and Enterococcus [previously Streptococcus] faecalis
  • Other gram-positive bacteria are currently available, and reveal the presence of several of the genes required for respiration.
  • streptococcus mutans and Enterococcus [previously Streptococcus] faecalis are currently available, and reveal the presence of several of the genes required for respiration.
  • These species are quite phylogenetically close to lactic bacteria commonly used in the food industry such as thermophilic streptococci, and are also related to lactococci.
  • the transformation of bacteria of the species Lactococcus or Streptococcus by one or more gene (s) coding for one or more protein (s) of the heme biosynthesis pathway can make it possible to obtain bacteria having a respiratory metabolism without the need to add porphyry derivatives to the culture medium.
  • the desired genes can be obtained from a strict aerobic bacteria, or from an optional aerobic bacteria. They can easily be identified from the bacterial genomes available on the databases. For example, one can use genes obtained from Bacillus subtilis, which is an aerobic bacterium, and whose complete genomic sequence has been published.
  • a lactic acid bacterium possessing all the genes encoding the proteins of the Krebs cycle and all the genes of the cytochromes, but devoid of all or part of the genes of the heme biosynthesis pathway; switching from a fermentative metabolism to a respiratory metabolism will then require, in addition to aeration of the medium, the addition of heme or one of its precursors.
  • the desired gene (s) can be introduced separately, or at least part of them can be grouped into one or more operons ( s).
  • one or two of the heme operons from B can be transferred to L. lactis. subtili s or just some of the genes present on these operons.
  • lactic acid bacteria in accordance with the invention it is also possible to promote the expression of genes involved in the respiratory metabolism naturally already present in said bacteria. This can be done for example by acting on the cis or trans regulation of the activity of these genes.
  • the lactic acid bacteria in accordance with the invention may also comprise other modifications, in particular the introduction of one or more nucleic acid sequences allowing them to produce substances of interest.
  • Lactic acid bacteria according to the invention can be obtained by implementing conventional techniques of genetic engineering, known in themselves to those skilled in the art.
  • the desired gene or genes can be associated with functional transcription and translation control sequences in the lactic acid bacteria which it is desired to transform.
  • the constructs produced are placed in an appropriate vector to introduce them into the lactic acid bacteria concerned.
  • Vectors which can be used to transform lactic acid bacteria of different species, and which make it possible either to maintain the genetic information introduced in the form of a stable independent replicon, or to integrate it into the bacterial chromosome, are known in themselves.
  • Integration into the bacterial chromosome can in particular be carried out by transposition, or by a method of replacement of genes by homologous recombination, according to methods known in themselves to those skilled in the art.
  • methods known in themselves to those skilled in the art By way of nonlimiting examples of usable methods and vectors allowing the implementation of these methods, mention will be made in particular of the methods and vectors described in PCT application WO 93/18164 in the name of INRA.
  • techniques of protoplast fusion or bacterial conjugation can be used.
  • Lactic acid bacteria according to the invention can also be produced by selection of mutants, natural or obtained by random mutagenesis, in which the activity and / or the expression of a protein intervening in the fermentative metabolism, or promoting it, is reduced or nonexistent, or the selection of mutants in which the activity and / or expression of a protein involved in respiratory metabolism is increased.
  • the functioning of the respiratory metabolism in the modified bacterium according to the invention can be verified by carrying out the culture of said bacterium under conditions allowing the induction of a respiratory metabolism (that is to say under aeration, and possibly under conditions of induction of one or more mductible promoters optionally controlling the expression of one or more of the transferred genes and / or in the presence of heme or one of its precursors in the case where the transformed bacterium does not include the all the genes of the heme biosynthesis pathway, etc.), and by measuring the following parameters: i) the pH of the final culture, n) the products consumed or formed during the duration of the culture (for example l oxygen consumed, the production of fumarate or that of lactate, the amount of total carbon at the end of culture, which makes it possible in particular to evaluate the production of C0 2 during respiration, etc.), m) the population Bacterial ion at the end of growth, iv) survival during long storage, and v) re-acidification properties when the transformed strain is
  • the present invention also relates to a process for the cultivation of lactic acid bacteria, characterized in that it comprises the culture of at least one strain of lactic acid bacteria according to the invention under conditions allowing the induction of a respiratory metabolism in said strain.
  • Said conditions for induction of respiratory metabolism include aeration of the culture; advantageously, this aeration is carried out so as to maintain, throughout the duration of the culture, an oxygen supply equal to at least 5 millimoles per liter of culture medium.
  • said conditions of induction of respiratory metabolism may also include the addition of a porphyric derivative in the culture medium, as described in Application PCT / IB99 / 01430.
  • the strains of lactic acid bacteria according to the invention can be used for obtaining lactic starter cultures.
  • the process according to the invention further comprises the harvesting of the bacteria at the end of said culture, and optionally, their conditioning and their preservation, by any appropriate means.
  • the bacteria can be harvested by any means known in themselves; one can for example distribute the culture in suitable packaging and keep it in this form until use; generally, however, it is preferable to separate the bacteria from the culture medium and to concentrate them by centrifugation or by filtration. The collected bacteria can then be packaged for storage.
  • the present invention also includes lactic sourdoughs comprising at least one strain of modified lactic acid bacteria according to the invention, and in particular leaveners capable of being obtained by the process according to the invention. These leaven can also include one or more other bacterial strains, of the same species or of different species. Several species or several different strains may have been cultivated simultaneously (if their optimal growth conditions are compatible), or else cultivated separately and brought together after harvest.
  • the lactic starters in accordance with the invention can be harvested and stored under the same conditions as the lactic starters of the prior art, and in particular as the lactic starters which are the subject of PCT / IB99 / 01430 Application; they have conservation and restart properties at least comparable to those of the latter.
  • the invention also encompasses the use of lactic starters in accordance with the invention for obtaining fermented products.
  • the subject of the invention is a process for the preparation of a fermented product, characterized in that it comprises the inoculation of a medium to be fermented using a lactic acid starter in accordance with the invention.
  • the invention will be further illustrated with the aid of the additional description which follows, which refers to non-limiting examples of obtaining lactic acid bacteria according to the invention.
  • EXAMPLE 1 OBTAINING A STRAIN OF L. LACTIS EXPRESSING THE GENES NECESSARY TO PRODUCE PROTOHEM IX
  • hewA NADP (H) genes: glutamyl-tRNA reductase, SWISS-PROT access number: P16618), hemL (GSA 2, 1-aminotransferase, SWISS-PROT access number: P30949), hemB (Porphobilinogen synthase, SWISS-PROT access number: P30950), hemC (Hydroxymethylbilane synthase, SWISS-PROT access number: P16616), hemD (Uroporphyrinogen III synthase, SWISS-PROT access number: P21248), and hemE (Uroporphyrinogen decarboxylase, SWISS-PROT access number: P32395), hemY (functions
  • Bacillus subtilis allow the synthesis of protoheme IX from glutamyl-tRNA.
  • the hemACDBL genes contained in a single operon in B. subtilis are amplified by PCR from the strain 3G18 (pLUG1301) [HANSSON AND HEDERSTEDT, J. Bacteriol. , 174 (24): 8081, (1992)] using primers allowing the coding sequence of the genes to be obtained with the promoter, the ribosome binding site and the terminator: Primer sense: 5 '-GGGGAGCTCGGTATTGTCAATAGGAATGC-3', Antisense primer:
  • Amplification [5 min 96 ° C, (30 s. 96 ° C, 1 min. 55 ° C, 5 min 72 ° C) 30 times] is carried out with 5 units of high-fidelity Taq polymerase (Promega) in the presence of 4 mM MgC12.
  • a fragment of 6500 bp is obtained. This fragment is then cloned on the plasmid pCR-TOPO (INVITROGEN) in the E. coli TOP10 strain (INVITROGEN).
  • the plasmid obtained, called pTHem1 is digested with Spel and treated with DNA polymerase, a Klenow fragment, in order to obtain a blunt end.
  • the plasmid pTHeml is then digested with Sac1 and the hemAXCDBL fragment is purified. It is integrated into the plasmid pIL252 previously digested with Xhol, treated with Klenow and then with Sacl [SIMON AND CHOPIN, Biochemistry, 70: 559-566, (1988)].
  • the resulting plasmid called pILHeml is introduced into the strain of L. lacti s MG1363
  • the hemEHY genes contained in a single operon in B. subtilis are amplified by PCR from the strain 3G18 (pLUG1301) using primers allowing the coding sequence of the genes to be obtained, with or without the promoter, with the ribosome binding site and the terminator: primer sense:
  • Amplification [5 min 96 ° C, (30 s. 96 ° C, 1 min. 55 ° C, 5 min 72 ° C) 30 times] is carried out with 5 units of high-fidelity Taq polymerase (Promega) in the presence of 4 mM MgC12. A fragment of 3600 bp is obtained. This fragment turns out to be unclonable in the cloning systems used in E. coli or in L. lactis. This may be due, according to the literature, to the toxicity of the hemY gene product in E. coli. By extension, it is not excluded that HemY is also toxic in L. lacti s.
  • the he EH genes contained in the hemEHY operon at B. subtilis are amplified by PCR from the strain 3G18 (pLUG1301) using primers allowing the coding sequence of the genes to be obtained with the ⁇ bosome binding site. primer meaning:
  • the plasmid obtained, called pTHem is linearized by Xbal, then the ends are made blunt by the Klenow fragment of the DNA polymerase.
  • the plasmid pTHem4 is then digested with ClaI and the hemEH fragment is purified. This fragment is then placed under the dependence of the promoter P ⁇ s , mductible with nisin (NICE system, patent EP0712935 by VOS and KUIPERS) on a plasmid derived from pNZ8020 previously cut with BamHI, treated with Klenow polymerase, then cut with Clal .
  • the resulting plasmid called pGHeml is introduced into the strain of L.
  • lactis NZ9000 containing the plasmid pILHeml The production of protoheme IX by this strain is determined as described by SHIBATA, [Methods of biochemical analysis, D. Glick (Ed.), Interscience, New York, Vol. VII, 77-109, (1959)].
  • the operons hemACDBL and hemEH are used to complement corresponding mutants of B. subtilis (Bacillus Genetic Stock Center) to ensure their functionality.
  • the strains obtained are tested for their capacity to breathe autonomously under aeration culture conditions, with or without hemme and by inducing the expression of the hemEH operon at nism.
  • the strain used in negative control is a strain NZ9000 containing the vector plasmids alone respectively pIL252 and pGK: CmR: P ⁇ s .
  • Optical density of cultures is followed at 600 nm. In aeration condition, with hemme, the DO SO o values obtained are 2.87 for the negative control and 3.23 for the strain containing the hem genes.
  • EXAMPLE 2 SCREENING FOR ISOLATION OF A STRAIN OF L. LACTIS HAVING A BETTER ABILITY TO BREATHE.
  • Random mutagenesis is performed on the L. lacti s MG1363 strain according to the procedure of MAGUIN et al. [J. Bacte ⁇ ol., 178: 931-935, (1996)]. Cells are spread on a box containing congo red at 30 ⁇ g / ml. The mother strain is used as a control.
  • Mutants redder than the control are also isolated. These mutants, having an easier time assimilating the heme, will potentially be more able to breathe than the control.
  • EXAMPLE 3 OBTAINING A STRAIN OF L. LACTIS EXPRESSING THE GENES NECESSARY TO PRODUCE QUINONES.
  • vitamin B2 riboflavin
  • L. lactis MG1363 increase in the biomass.
  • vitamin K2 menaqumone
  • This vitamin is also an essential element of the respiratory chains. Based on the chromosomal sequence of IL1403, close to MG1363, we notice that certain genes are absent compared to what is known in gram-positive bacteria (Bacillus subtilis).
  • menFBytxMmenBEC comprises five genes (Bacillus Subtilis and others gram positive bacteria, Ed. Sonenshe, AL, Hoch JA and Losick R., ASM, W. DC): menF: menaqumone-specific 2 -ketoglutarate dehydrogenase, access number SWISS-PROT 23973 enD: 2-succinyl-6-hydroxy-2, 4-cyclohexadiene-l- carboxylate synthase, access number SWISS-PROT 23970 menB .- 1, 4 -dihydroxy-2 -naphtoic acid synthase, access number SWISS- PROT 23966 menE .- o-succinylbenzoic acid coenzyme A synthetase, SWISS-PROT access number 23971 menC: o-succinylbenzoic acid synthase, no SWISS-PROT access number.
  • the genes are amplified by PCR from the strain 168 [ANAGNOSTOPOULOS et al. , J. Bacteriol. 81: 741-747, (1961)] using the primers making it possible to obtain the coding sequence of the genes with the promoter and its terminator.
  • Sense primer 5 'GTACTGCTGCCATCAGCCC 3'
  • Antisense primer 5 'CCACGTCCTGTGACGAATACTCCGC 3'
  • the approximately 8 kilobase fragment is cloned into a multicopy plasmid of the pIL253 type (SIMON et al. Biochemistry 559-566 1988).
  • the functionality of the genes is determined by complementation of mutants in B. subtilis [MILLER et al. , J. Bacteriol., 170: 2735-2741, (1988)].
  • the production of quinone is determined according to the procedure of MORISHITA et al. [J. Diary. Sci. 82: 1879-1903, (1999)].
  • EXAMPLE 4 ISOLATION OF MUTANT STRAINS OF L. LACTIS HAVING A BETTER ABILITY TO BREATHE.
  • the ability to breathe is characterized by the presence of heme in the cell.
  • the gene coding for the catalase of a strain of Bacillus subtilis was previously cloned into L. lactis (application PCT / FR00 / 00885 in the names of 1 INRA and CEA; Inventors BRAVARD and DUWAT). Catalase needs heme for its activity.
  • L. lactis strain containing the cloned catalase gene a transposition tool, pGhost9: ISS1 (PCT application WO 93/18164) is introduced. Mutagenesis is carried out and the mutants resulting from the mutagenesis are screened for their catalase activity in the presence of a small amount of hemin.
  • Colonies showing strong catalase activity are selected.
  • the mutation responsible for the increase in catalase activity is identified by techniques known to those skilled in the art, for example, according to the procedure of MAGUIN et al. , [J. Bacteriol., 178: 931-935, (1996)].
  • the respiratory activity is tested for all mutant strains having an increased catalase activity compared to the wild strain.
  • those with more efficient respiration can be identified by an increase in biomass, high final pH, and / or respiration in the presence of a smaller amount of hemin. Mutants will be reconstructed, and / or the plasmid containing the catalase can be eliminated.
  • EXAMPLE 5 OBTAINING A STRAIN OF L. LACTIS WHOSE METABOLISM IS DRIVEN TOWARDS BREATHING.
  • the enzymes that catalyze the breakdown of sugars for energy production are under the control of regulators.
  • the CcpA regulator regulates the expression of several glycolytic enzymes, including phosphofructokinase, pyruvate kinase, and L-lactate dehydrogenase.
  • a ccpA mutant characterized in fermentation conditions, produces a reduced amount of lactate, but a greater amount of acetate and ethanol, which confirms the regulatory role of CcpA [LUESINK et al. , Molecular Microbiology 30: 789-798, (1998)].
  • the strain used in this example contains a ccpA gene inactivated by the insertion of a transposon, (but it is likely that any ccpA mutant gives rise to with similar results).
  • the growth and the final biomass are determined in M17 medium plus glucose (1%) or BHI medium plus glucose (1%), and containing or not containing heme (10 ⁇ g / ml) and aerated or non-aerated.
  • the mocula are prepared in M17 glucose.
  • FIG. 1 represents the growth of the ccpA mutant, compared with that of the wild strain IL1403, in BHI medium containing 1% of glucose, and under aeration conditions, in the presence or in the absence of hemin. Symbols:, ccpA + hemme; D, ccpA without hemme, - *, IL1403 + hemme; ⁇ , IL1403 without hemme.
  • the ccpA gene can also be placed under the control of a mductible promoter.
  • Culture of bacteria for leaven preparation is carried out under conditions which do not induce the promoter, and ccpA is not expressed.
  • the use of the leaven can be carried out under conditions inducing the promoter, and thus allowing the restoration of the expression of ccpA, producing a strain having activities equivalent to those of the wild strain.

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Abstract

L'invention concerne des bactéries lactiques auxquelles on a conféré un métabolisme respiratoire, notamment par des modifications génétiques, tel que l'expression d'au moins un gène, soit hétérologue soit homologue, codant pour une protéine intervenant dans ledit métabolisme respiratoire, est altérée. Lesdites bactéries sont utilisables notamment pour la production de levains lactiques.

Description

BACTERIES LACTIQUES TRANSFORMEES POUR LEUR CONFERER UN METABOLISME RESPIRATOIRE, ET LEVAINS COMPRENANT LESDITES BACTERIES .
La présente invention concerne l'amélioration des propriétés de conservation et d'acidification des levains lactiques.
Par « levain lactique », on désigne toute préparation destinée à l'ensemencement d'un milieu à fermenter, et comprenant au moins une souche de bactéries lactiques appartenant notamment à l'un des genres Lactococcus, Streptococcus , Enterococcus, Leuconostoc, Lactobacillus , Propionibacteria, ou Bifidobacteria, ou un mélange de souches appartenant à un ou plusieurs des genres mentionnés ci-dessus. Les levains lactiques utilisés notamment pour produire des aliments fermentes et des produits d'ensilage sont habituellement préparés en culture par lots, et sont ensuite concentrés et conditionnés pour une utilisation ultérieure afin d'inoculer différents produits alimentaires en vue de leur fermentation. L'une des préoccupations des producteurs de levains est d'obtenir une biomasse bactérienne importante, et de maintenir une bonne viabilité des bactéries pendant le stockage afin que, lors de l'inoculation, la fermentation démarre rapidement et donne des produits alimentaires possédant des caractéristiques reproductibles.
Or, de nombreuses causes de stress peuvent intervenir lors des différentes étapes de préparation des levains et altérer la survie des bactéries lactiques. En particulier, la viabilité bactérienne peut être rapidement perdue si les cultures sont maintenues en phase stationnaire . L'une des causes en est l'accumulation dans le milieu de produits naturels du métabolisme bactérien, notamment des acides organiques comme l'acide lactique qui entraînent une diminution de pH préjudiciable à la croissance bactérienne. Une autre cause de perte de viabilité pendant la préparation et le stockage est la présence d'oxygène, qui est naturellement toxique pour les bactéries lactiques ; ces bactéries ont en effet en commun un métabolisme des hydrates de carbone basé sur la fermentation. BERGEY'S manuel, 9eme édition, édité par HOLT et al. (1994) WILLIAMS et WILKINS Eds .
Pour limiter la baisse de pH, on utilise habituellement pour la production de levains de bactéries lactiques, des milieux de culture tamponnés autour de pH 6 avec des cations associés à des carbonates, des hydroxydes, des phosphates ou des oxydes. Cependant, ces apports dans le milieu de culture peuvent entraîner des problèmes pour les productions ultérieures, par exemple en favorisant le développement de phages, ou en augmentant la solubilité des caséines.
Pour éviter les effets toxiques de l'oxygène, la préparation et le stockage des levains sont habituellement effectués en anaérobiose ; par exemple, pendant la préparation des cultures de levains par lots, certaines étapes sont effectuées sous azote, afin d'éliminer les traces d'oxygène. Cependant, lors de l'utilisation des levains, ceux-ci sont fréquemment mis en présence de niveaux élevés d'oxygène. Par exemple, le lait qui est utilisé pour la préparation des produits laitiers fermentes est fortement aéré pendant les processus de transfert et donc riche en oxygène. Ceci pourrait constituer une cause de ralentissement du redémarrage des levains.
Il a été rapporté [A.K. SIJPESTEIJN, Antoni e von Leeuwenhoek 36 :335, 1970] que des Lactococcus et Leuconostoc cultivés en présence d'hème et sous aération produisent des cytochromes et possèdent un métabolisme respiratoire .
Des travaux plus récents [KANEKO et al . Appl . Environ. Microbiol . , 56 :9, 2644-2649 (1990)], font état d'une amélioration de la prolifération d'une souche de Lactococcus lactis diacetylactis, cultivée en présence d'hémme et/ou de Cu2+ . Ces auteurs n'ont pas attribué cet effet à l'apparition d'un métabolisme respiratoire, mais à l'activation de la diacétyl-synthase par 1 ' hémine et/ou le Cu2+, ce qui orienterait préférentiellement le métabolisme fermentaire vers la production de diacétyle, au détriment du lactate.
L'équipe des Inventeurs a récemment découvert que dans le cadre de la préparation de levains lactiques, l'utilisation d'un composé porphyrique associé à une culture en aérobiose permettait d'obtenir une croissance bactérienne plus importante que celle obtenue lors des procédés classiques, et qu'en outre, le pourcentage de bactéries viables dans la population bactérienne et la durée de la survie étaient également beaucoup plus importants. Qui plus est, lorsque les levains obtenus de la sorte sont utilisés pour inoculer un produit à fermenter, on observe un redémarrage très rapide de la croissance et de la fermentation bactérienne, se traduisant par une acidification du produit beaucoup plus rapide que celle observée avec des levains classiques. Ces travaux sont décrits dans la Demande Internationale PCT/IB99/01430 (PCT WO 00/05342) au nom de l'INRA.
Les Inventeurs ont maintenant montré que les améliorations du rendement bactérien et de la viabilité pendant le stockage étaient dues à l'acquisition d'un métabolisme respiratoire par L . lactis lors de la culture sous aération et en présence d'un composé porphyrique. Lors de l'inoculation du produit à fermenter, les bactéries sont en outre capables de restaurer immédiatement un métabolisme fermentaire, ce qui se traduit par l'augmentation des performances de redémarrage .
Le métabolisme respiratoire nécessite la présence de l'équipement enzymatique impliqué dans différentes voies métaboliques, notamment la synthèse et l'utilisation d'hème, la synthèse de cytochromes, et probablement la synthèse d'au moins une partie du cycle des acides tπcarboxyliques (cycle de Krebs) .
En utilisant des amorces dérivées de l'alignement de séquences de gènes connus comme impliqués dans la respiration chez d'autres bactéries, les Inventeurs ont recherché la présence de gènes homologues chez L. lactis . Ils ont ainsi identifié trois gènes codant respectivement pour la ferrochélatase (enzyme intervenant dans la biosynthèse de 1 ' hème en catalysant la formation d'un complexe entre le fer et un composé porphyrique précurseur de l'hème, le complexe ainsi formé pouvant être incorporé dans les cytochromes bactériens) , la cytochrome D oxydase (une hémoprotéine nécessaire pour la respiration), et l'aconitase (enzyme intervenant dans le cycle de Krebs) .
Ils ont en outre montré que les gènes codant la cytochrome D oxydase et la ferrochélatase étaient fonctionnels chez L. lactis . Ils ont en effet constaté que des bactéries dans lesquelles le gène de la cytochrome D oxydase est inactivé ne présentent plus de métabolisme respiratoire lorsqu'elles sont cultivées en aérobiose et en présence d'un composé porphyrique contenant du fer. De même, ils ont observé que 1 ' inactivation du gène codant la ferrochélatase entraînait la perte des capacités de métabolisme respiratoire de L. lacti s dans le cas de cultures effectuées en présence d'un composé porphyrique ne contenant pas de fer, tel que la protoporphyπne, mais pas dans le cas de cultures effectuées en présence d'un composé porphyrique contenant du fer, tel que l'hème.
Ces observations confirment que l'amélioration des performances des levains lactiques obtenue en préparant ces levains en aérobiose et en présence d'un composé porphyrique, décrite dans la Demande PCT/IB99/01430, est liée à l'apparition d'un métabolisme respiratoire dans ces conditions de culture.
Les résultats des inventeurs démontrent notamment que les bactéries lactiques, représentées par L. lactis, possèdent la capacité de croître via un mécanisme fermentaire ou respiratoire.
Le mode de croissance dépend des conditions de culture, mais aussi des signaux transmis par la cellule elle-même. La métabolisme semble plutôt fermentaire au début de la croissance, puis devient respiratoire une fois que les bactéries sont en croissance exponentielle tardive. Les Inventeurs ont en outre émis l'hypothèse qu'il existait une régulation de cette transition exercée par la bactérie, et qu'une altération de cette régulation, effectuée par 1 ' mactivation ou par la surexpression d'un gène régulateur qui contrôle la transition entre croissance fermentaire et respiratoire, peut avoir comme résultat une respiration plus efficace.
La présente invention a pour but de fournir des moyens de conférer un métabolisme respiratoire à des bactéries lactiques, ou de favoriser celui-ci, notamment afin d'améliorer les performances des levains lactiques de manière comparable à celle observée précédemment lors de l'addition d'hème (ou d'autres molécules dérivées des porphynnes) .
Conformément à la présente invention, ce but peut être atteint en provoquant ou en favorisant l'expression, chez une bactérie lactique d'au moins une protéine participant à ce métabolisme, par modification du profil génomique de la bactérie lactique, soit en transférant chez une bactérie lactique un ou plusieurs des gènes du métabolisme respiratoire, clones à partir d'une bactérie aérobie, soit en inactivant ou sur- exprimant un gène de la bactérie de départ, afin de basculer le métabolisme vers la voie respiratoire. La présente invention a pour objet une bactérie lactique modifiée génétiquement afin de lui conférer un métabolisme respiratoire, ou d'activer ledit métabolisme . Ceci englobe notamment toute bactérie lactique ayant subi au moins une modification consistant en l'addition d'au moins un gène codant pour une protéine intervenant dans le métabolisme respiratoire ou favorisant ledit métabolisme, et/ou au moins une modification résultant en 1 ' activation d'au moins une protéine intervenant dans le métabolisme respiratoire ou favorisant ledit métabolisme, et/ou au moins une modification résultant en la sur-expression d'au moins un gène codant pour une protéine intervenant dans le métabolisme respiratoire ou favorisant ledit métabolisme, et/ou au moins une modification résultant en 1 ' mactivation totale ou partielle, d'au moins un gène codant pour une protéine intervenant dans le métabolisme fermentaire ou favorisant ledit métabolisme, et/ou au moins une modification résultant en la sous-expression, d'au moins un gène codant pour une protéine intervenant dans le métabolisme fermentaire ou favorisant ledit métabolisme .
Une modification résultant en l'addition d'au moins un gène codant pour une protéine intervenant dans le métabolisme respiratoire, ou le favorisant, peut être obtenue en transformant ladite bactérie lactique par au moins un gène hétérologue (c'est-à-dire un gène qui n'est pas présent naturellement dans ladite bactérie) , impliqué dans le métabolisme respiratoire. Il peut s'agir en particulier d'un gène issu d'une bactérie aérobie et impliqué dans le métabolisme respiratoire. Ledit gène peut notamment être choisi parmi :
- les gènes codant pour des protéines de la voie de biosynthèse de l'hème ; - les gènes codant pour des protéines de la voie de biosynthèse des cytochromes ; les gènes codant pour des protéines héminiques ; - les gènes codant pour des protéines du cycle de Krebs .
Une modification résultant en la suractivation d'une protéine intervenant dans le métabolisme respiratoire ou le favorisant, peut par exemple être obtenue par introduction, dans le gène codant cette protéine, d'une mutation résultant en une protéine plus active. Une modification résultant en la surexpression d'au moins un gène codant pour une protéine intervenant dans le métabolisme respiratoire, ou le favorisant, peut par exemple être obtenue en transformant ladite bactérie lactique par au moins une copie supplémentaire dudit gène, et/ou en agissant sur la régulation en cis ou en trans de ce gène, par exemple en plaçant ledit gène sous contrôle d'éléments de régulation de l'expression permettant une expression plus importante (par exemple promoteur fort, promoteur constitutif, amplificateur de transcription, etc.) et/ou en inactivant des éléments de régulation négative de l'expression associés audit gène (par exemple répresseur, atténuateur, etc.) . Par exemple, on peut ainsi suractiver et/ou surexpπmer un ou plusieurs gènes choisis parmi :
- des gènes régulateurs des voies métaboliques favorisant la voie respiratoire ;
- des enzymes de la voie de biosynthèse des cytochromes ; des gènes codant pour des protéines héminiques .
Une modification résultant en 1 ' maccivation, totale ou partielle, d'au moins un gène codant pour une protéine intervenant dans le métabolisme fermentaire, ou le favorisant, peut être obtenue notamment par délétion de tout ou partie dudit gène, ou par introduction d'une mutation résultant en la production d'une protéine moins active ou inactive. Une modification résultant en la sous-expression d'au moins un gène codant pour une protéine intervenant dans le métabolisme fermentaire, ou le favorisant, peut par exemple être obtenue en agissant sur la régulation en cis ou en trans de ce gène, par exemple en plaçant ledit gène sous contrôle d'éléments de régulation négative de l'expression (par exemple répresseur, atténuateur, etc.) et/ou en inactivant partiellement ou totalement, les éléments de régulation positive de l'expression (par exemple promoteur, amplificateur de transcription, etc.) associés audit gène, ou en rendant cette expression mductible. A titre d'exemple non-limitatif d'activation ou de sur-expression d'un gène codant pour une protéine intervenant dans le métabolisme respiratoire, ou le favorisant, on citera notamment : une activation d'un ou plusieurs gènes intervenant dans l'assimilation de l'hème, ou une modification augmentant l'expression dudit ou desdits gènes et/ou la rendant constitutive.
Ceci permet l'obtention d'une souche ayant une assimilation de l'hème plus précoce et/ou plus efficace, ce qui est souhaitable dans les cas où la disponibilité de l'hème constitue une étape limitante pour un métabolisme respiratoire.
Dans ce cas, la commutation entre un métabolisme fermentaire et un métabolisme respiratoire peut être contrôlée par modification de la teneur en oxygène du milieu de culture et par la présence d'hème.
Des exemples non-limitatifs d' mactivation ou de sous -expression de gènes codant pour des protéines intervenant dans le métabolisme fermentaire, ou le favorisant sont notamment : une mactivation du gène ccpA, ou une modification atténuant son expression ou la rendant mductible. Le gène ccpA régule l'expression de plusieurs gènes impliqués dans le catabolisme des sucres [LUESINK et al . , Molecular Microbiology 30 : 789-798, (1998)]. Les Inventeurs ont émis l'hypothèse que son mactivation pourrait favoriser l'expression des gènes nécessaires à la respiration. une mactivation du gène gls24 ou une modification atténuant son expression ou la rendant mductible. Une étude chez Enterococcus faecalis décrit le gène gls24 , qui réprime l'expression des gènes codant la L-lactate déshydrogénase, la lipoamide déshydrogénase, et la pyruvate décarboxylase, dont tout sont impliquées dans le métabolisme [GIARD et al . J. Bacteriol . 182 : 4512-4520, (2000)]. Un gène analogue à gls24 existe chez L. lactis . Les Inventeurs ont émis l'hypothèse qu'un mutant de L. lactis où gls24 est mactivé pourrait être avantagé vis à vis de la respiration. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, ladite bactérie lactique est choisie parmi les bactéries des genres Lactococcus, Streptococcus , Enterococcus, Leuconostoc, Lactobacillus , Propionibacteria , ou Bifidobacteria . Des bactéries préférées sont celles des différentes espèces du genre Lactococcus, ainsi que des streptocoques de l'espèce Streptococcus thermophilus .
Pour une espèce bactérienne donnée, le ou les gène (s) approprié (s) pour conférer aux bactéries tout ou partie de l'équipement enzymatique nécessaire à l'acquisition d'un métabolisme respiratoire ou pour améliorer la respiration peuvent être pour certains gènes identifiés par l'homme du métier à partir de l'information sur les séquences des génomes bactériens disponible sur les bases de données, qui permet d'identifier les gènes déjà présents dans un microorganisme donné et les voies métaboliques auxquelles peuvent participer ces gènes . A défaut de la séquence génomique de l'espèce bactérienne d'intérêt, la ou les séquence (s) d'une ou plusieurs espèces voisine est (sont) utilisable (s) pour déterminer quels gènes sont probablement présents Par exemple, les séquences complètes ou quasi complètes du génome de plusieurs espèces de streptocoques (Streptococcus mutans et Enterococcus [précédemment Streptococcus] faecalis) , ainsi que d'autres bactéries à gram positif sont actuellement disponibles, et révèlent la présence de plusieurs des gènes requis pour la respiration. Ces espèces sont assez proches phylogénétiquement de bactéries lactiques couramment utilisées dans l'industrie alimentaire telles que les streptocoques thermophiles , et sont également apparentées aux lactocoques .
Ainsi, la transformation de bactéries de l'espèce Lactococcus ou Streptococcus par un ou plusieurs gène (s) codant pour une ou plusieurs protéine (s) de la voie de biosynthese de l'hème peut permettre d'obtenir des bactéries possédant un métabolisme respiratoire sans qu'il soit nécessaire d'ajouter de dérivés porphyπques au milieu de culture.
Les gènes souhaités peuvent être obtenus à partir d'une bactérie aérobie stricte, ou d'une bactérie aérobie facultative. Ils peuvent aisément être identifiés à partir des génomes bactériens disponibles sur les bases de données. Par exemple, on peut utiliser des gènes obtenus à partir de Bacillus subtilis, qui est une bactérie aérobie, et dont la séquence génomique complète a été publiée.
On peut ainsi apporter à une bactérie lactique la totalité des gènes nécessaires pour conférer un métabolisme respiratoire. On peut également, si on le souhaite, n'apporter qu'une partie de ces gènes, par exemple afin d'être en mesure de contrôler de différentes manières les conditions dans lesquelles la bactérie sera capable de respirer.
On peut ainsi construire, à titre d'exemples non-limitatifs : - une bactérie lactique possédant la totalité des gènes nécessaires au métabolisme respiratoire ; la commutation entre un métabolisme fermentaire et un métabolisme respiratoire peut être contrôlée par modification de la teneur en oxygène du milieu de culture ;
- une bactérie lactique possédant la totalité des gènes codant les protéines du cycle de Krebs et la totalité des gènes des cytochromes, mais dépourvue de tout ou partie des gènes de la voie de biosynthese de l'hème ; la commutation d'un métabolisme fermentaire à un métabolisme respiratoire, nécessitera alors, outre l'aération du milieu, l'addition d'hème ou de l'un de ses précurseurs .
Pour l'obtention d'une bactérie lactique transformée conforme à l'invention, le ou les gène (s) souhaité (s) peuvent être introduits séparément, ou au moins une partie d'entre eux peut être regroupée en un ou plusieurs opéron(s) .
Par exemple, pour conférer à L. lactis une capacité totale ou partielle de biosynthèse de l'hème, on peut transférer dans L. lactis l'un ou les deux opérons de l'hème de B . subtili s ou bien seulement certains des gènes présents sur ces opérons.
Pour obtenir des bactéries lactiques conformes à l'invention on peut aussi favoriser l'expression de gènes intervenant dans le métabolisme respiratoire naturellement déjà présents chez lesdites bactéries. Ceci peut être effectué par exemple en agissant sur la régulation en cis ou en trans de l'activité de ces gènes. Outre les modifications génétiques, mentionnées ci -dessus, permettant de leur conférer un métabolisme respiratoire, ou de favoriser ledit métabolisme, les bactéries lactiques conformes à l'invention peuvent comprendre en outre d'autres modifications, notamment l'introduction d'une ou plusieurs séquences d'acide nucléique leur permettant la production de substances d'intérêt.
Des bactéries lactiques conformes à l'invention peuvent être obtenues en mettant en œuvre des techniques classiques de génie génétique, connues en elles-mêmes de l'homme de l'art.
Pour le clonage des gènes, le ou les gènes souhaités peuvent être associés à des séquences de contrôle de la transcription et de la traduction fonctionnelles dans la bactérie lactique que l'on souhaite transformer. On peut notamment, si on le souhaite, placer un ou plusieurs des gènes transférés sous contrôle transcπptionnel d'un promoteur mductible, afin de permettre le contrôle de la commutation entre métabolisme fermentaire et métabolisme respiratoire. Les constructions réalisées sont placées dans un vecteur approprié pour les introduire dans la bactérie lactique concernée. Des vecteurs utilisables pour transformer des bactéries lactiques de différentes espèces, et permettant soit de maintenir l'information génétique introduite sous forme d'un replicon indépendant stable, soit de l'intégrer au chromosome bactérien, sont connus en eux-mêmes. L'intégration au chromosome bactérien peut notamment s'effectuer par transposition, ou par une méthode de remplacement de gènes par recombinaison homologue, selon des méthodes connues en elles-mêmes de l'homme de l'art. A titre d'exemples non limitatifs de méthodes utilisables et de vecteurs permettant la mise en œuvre de ces méthodes, on citera notamment les méthodes et vecteurs décrits dans la Demande PCT WO 93/18164 au nom de l'INRA. Dans les cas où la quantité d' information génétique à transférer nécessite l'introduction de grands segments d'ADN, on peut utiliser les techniques de fusion de protoplastes ou de conjugaison bactérienne. Des bactéries lactiques conformes à l'invention peuvent également être produites par sélection de mutants, naturels ou obtenus par mutagénèse aléatoire, chez lesquels l'activité et/ou l'expression d'une protéine intervenant dans le métabolisme fermentaire, ou le favorisant, est réduite ou inexistante, ou bien de la sélection des mutants chez lesquels l'activité et/ou l'expression d'une protéine intervenant dans le métabolisme respiratoire, est augmentée . Le fonctionnement du métabolisme respiratoire chez la bactérie modifiée conforme à l'invention peut être vérifié en effectuant la culture de ladite bactérie dans des conditions permettant l' induction d'un métabolisme respiratoire (c'est à dire sous aération, et éventuellement, en conditions d' induction d'un ou plusieurs promoteurs mductibles contrôlant éventuellement l'expression d'un ou plusieurs des gènes transférés et/ou en présence d'hème ou de l'un de ses précurseurs dans le cas où la bactérie transformée ne comprend pas la totalité des gènes de la voie de biosynthèse de l'hème, etc.), et en mesurant les paramètres suivants : i) le pH de la culture finale, n) les produits consommés ou formés pendant la durée de la culture (par exemple l'oxygène consommé, la production de fumarate ou celle de lactate, la quantité de carbone totale en fin de culture, qui permet notamment d'évaluer la production de C02 pendant la respiration, etc.), m) la population bactérienne en fin de croissance, îv) la survie pendant un stockage long, et v) les propriétés de ré-acidification lorsque la souche transformée est utilisée comme levain (démarreur de culture) pour une fermentation. Si on le souhaite, une détection d'hème au sein des cellules, ou de l'activité des protéines nécessitant l'hème pour fonctionner (comme par exemple les cytochromes), peut être réalisée. Des souches de bactéries lactiques modifiées conformes à l'invention, lorsqu'elles sont cultivées en aérobiose, présentent une croissance importante, ce qui permet de proposer leur utilisation comme cellules-hôtes dans le cadre des procédés classiques de production de substances d'intérêt par génie génétique.
La présente invention a aussi pour objet un procédé de culture de bactéries lactiques, caractérisé en ce qu'il comprend la culture d'au moins une souche de bactérie lactique conforme à 1 ' invention en conditions permettant l' induction d'un métabolisme respiratoire chez ladite souche.
Lesdites conditions d' induction du métabolisme respiratoire comprennent l'aération de la culture ; avantageusement, cette aération est effectuée de manière à maintenir, pendant toute la durée de la culture, un apport en oxygène égal à au moins 5 millimoles par litre de milieu de culture.
Selon les caractéristiques de la souche conforme à l'invention utilisée, et notamment selon sa capacité à assimiler l'hème, ou à en effectuer la biosynthèse, lesdites conditions d' induction du métabolisme respiratoire peuvent également comprendre l'addition d'un dérivé porphyrique au milieu de culture, comme décrit dans la Demande PCT/IB99/01430. Très avantageusement, les souches de bactéries lactiques conformes à l'invention peuvent être utilisées pour l'obtention de levains lactiques.
Dans ce cas, le procédé conforme à 1 ' invention comprend en outre la récolte des bactéries à l'issue de ladite culture, et éventuellement, leur conditionnement et leur conservation, par tous moyens appropriés. La récolte des bactéries peut être effectuée par tous moyens connus en eux-mêmes ; on peut par exemple répartir la culture dans des conditionnements appropriés et la conserver sous cette forme jusqu'à utilisation ; généralement, on préférera toutefois séparer les bactéries du milieu de culture et les concentrer par centrifugation ou par filtration. Les bactéries récoltées peuvent ensuite être conditionnées en vue de leur conservation . La présente invention englobe également les levains lactiques comprenant au moins une souche de bactérie lactique modifiée conforme à l'invention, et notamment, des levains susceptibles d'être obtenus par le procédé conforme à l'invention. Ces levains peuvent également comprendre une ou plusieurs autres souches bactériennes, d'une même espèce ou d'espèces différentes. Plusieurs espèces ou plusieurs souches différentes peuvent avoir été cultivées simultanément (dans le cas où leurs conditions optimales de croissance sont compatibles) , ou bien cultivées séparément et réunies après la récolte.
Les levains lactiques conformes à l'invention peuvent être récoltés et conservés dans les mêmes conditions que les levains lactiques de l'art antérieur, et .notamment que les levains lactiques qui font l'objet de la Demande PCT/IB99/01430 ; ils possèdent des propriétés de conservation et de redémarrage au moins comparables à celles de ces derniers.
L'invention englobe également l'utilisation des levains lactiques conformes à l'invention pour l'obtention de produits fermentes. En particulier, l'invention a pour objet un procédé de préparation d'un produit fermenté, caractérisé en ce qu'il comprend l'ensemencement d'un milieu à fermenter à l'aide d'un levain lactique conforme à l'invention. L'invention sera davantage illustrée à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs d'obtention de bactéries lactiques conformes à l'invention. EXEMPLE 1 : OBTENTION D'UNE SOUCHE DE L . LACTIS EXPRIMANT LES GENES NECESSAIRES POUR PRODUIRE DU PROTOHEME IX
Les gènes hewA (NADP (H) :glutamyl-tRNA reductase, numéro d'accès SWISS-PROT : P16618), hemL (GSA 2 , 1-aminotransférase, numéro d'accès SWISS-PROT : P30949) , hemB (Porphobilinogen synthase, numéro d'accès SWISS-PROT : P30950) , hemC (Hydroxymethylbilane synthase, numéro d'accès SWISS-PROT : P16616) , hemD (Uroporphyrinogène III synthase, numéro d'accès SWISS- PROT : P21248), et hemE (Uroporphyrinogène decarboxylase, numéro d'accès SWISS-PROT : P32395) , hemY (fonctions
Coproporphyrinogène III oxydase et Protoporphyrinogène oxydase numéro d'accès SWISS-PROT : P32397) et hemH
(ferrochélatase, numéro d'accès SWISS-PROT : P32396) de
Bacillus subtilis permettent la synthèse du protoheme IX à partir du glutamyl-tRNA.
Les gènes hemACDBL contenus dans un seul opéron chez B . subtilis sont amplifiés par PCR à partir de la souche 3G18 (pLUG1301) [HANSSON ET HEDERSTEDT, J. Bacteriol . , 174(24) : 8081, (1992)] en utilisant des amorces permettant d'obtenir la séquence codante des gènes avec le promoteur, le site de fixation des ribosomes et le terminateur : Amorce sens : 5' -GGGGAGCTCGGTATTGTCAATAGGAATGC-3' , Amorce antisens :
5 ' -GGGGATCCGTGGGAGAGCACGAAAAA -3'.
L'amplification [5 mn 96°C, (30 s. 96°C, 1 mn. 55°C, 5 mn 72°C) 30 fois] est effectuée avec 5 unités de Taq polymérase haute fidélité (Promega) en présence de 4 mM de MgC12.
Un fragment de 6500 pb est obtenu. Ce fragment est ensuite clone sur le plasmide pCR-TOPO (INVITROGEN) dans la souche E. coli TOP10 (INVITROGEN) . Le plasmide obtenu, dénommé pTHeml , est digéré par Spel et traité par l'ADN polymérase, fragment de Klenow, afin d'obtenir un bout franc. Le plasmide pTHeml est ensuite digéré par Sacl et le fragment hemAXCDBL est purifié. Il est intégré au plasmide pIL252 préalablement digéré par Xhol, traité à la Klenow puis par Sacl [SIMON ET CHOPIN, Biochimie, 70 : 559-566, (1988)] . Le plasmide résultant dénommé pILHeml est introduit dans la souche de L. lacti s MG1363
[GASSON, J. Bacteriol., 154 : 1-9, (1983)]. La production d ' uroporphyrinogène III par cette souche est déterminée comme précédemment décrit par ANDERSON et IVANOVICS, [J.
Gen. Microbiol., 49 : 31-40, (1967)]. Les gènes hemEHY contenus dans un seul opéron chez B . subtilis sont amplifiés par PCR à partir de la souche 3G18 (pLUG1301) en utilisant des amorces permettant d'obtenir la séquence codante des gènes avec ou sans le promoteur, avec le site de fixation des ribosomes et le terminateur : amorce sens :
5' -GGGATCCGTATGAAAGGTGGAAATC-3 ' , sans promoteur 5' -GGGGGATCCGGCGATTTTTTGAACTTTGAGCTACA-3' , avec promoteur amorce antisens : 5 ' -GGGCTCGAGACACAATATTGCCATTGCACATC-3 ' .
L'amplification [5 mn 96°C, (30 s. 96°C, 1 mn. 55°C, 5 mn 72°C) 30 fois] est effectuée avec 5 unités de Taq polymérase haute fidélité (Promega) en présence de 4 mM de MgC12. Un fragment de 3600 pb est obtenu. Ce fragment se révèle inclonable dans les systèmes de clonage utilisés chez E. coli ou chez L. lactis . Ceci peut être dû, d'après la littérature à la toxicité du produit de gène hemY chez E . coli . Par extension, il n'est pas exclu que HemY soit aussi toxique chez L. lacti s .
Les gènes he EH contenus dans 1 ' opéron hemEHY chez B . subtilis sont amplifiés par PCR à partir de la souche 3G18 (pLUG1301) en utilisant des amorces permettant d'obtenir la séquence codante des gènes avec le site de fixation des πbosomes . amorce sens :
5' -GGGGTACCTCTAGACCGTATGAAAGGTGGAAATCAG-3 ' amorce antisens :
5 ' -CCATCGATCTTTAACGTCCTAATTTTTTTAATAC
Ce fragment est ensuite clone sur le plasmide pCR-TOPO (INVITROGEN) dans la souche E. coli TOP10
(INVITROGEN). Le plasmide obtenu, dénommé pTHem , est linéarisé par Xbal , puis les extrémités sont rendues franches par le fragment Klenow de l'ADN polymérase. Le plasmide pTHem4 est ensuite digéré par Clal et le fragment hemEH est purifié. Ce fragment est ensuite placé sous la dépendance du promoteur Pπιs, mductible à la nisine (système NICE, brevet EP0712935 de VOS et KUIPERS) sur un plasmide dérivé de pNZ8020 préalablement coupé par BamHI, traité à la polymérase de Klenow, puis coupé par Clal. Le plasmide résultant dénommé pGHeml est introduit dans la souche de L. lactis NZ9000 contenant le plasmide pILHeml. La production de protohème IX par cette souche est déterminée comme décrit par SHIBATA, [Methods of biochemical analysis, D. Glick (Ed.), Interscience, New York, Vol. VII, 77-109, (1959)].
Les opérons hemACDBL et hemEH sont utilisés pour complémenter des mutants correspondants de B . subtilis (Bacillus Genetic Stock Center) afin de s'assurer de leur fonctionnalité. Les souches obtenues sont testées pour leur capacité à respirer de façon autonome dans des conditions de culture en aération, avec ou sans hémme et en induisant l'expression de l' opéron hemEH à la nisme. La souche utilisée en contrôle négatif est une souche NZ9000 contenant les plasmides vecteurs seuls respectivement pIL252 et pGK: CmR : Pπιs . La densité optique des cultures est suivie à 600 nm. En condition d'aération, avec hémme, les valeurs de DOSOo obtenues sont de 2,87 pour le contrôle négatif et de 3,23 pour la souche contenant les gènes hem . Sans hémme, les valeurs sont de 2,10 pour le contrôle négatif et 2,78 pour la souche contenant les gènes hem. Ces résultats montrent que l'introduction des gènes hemA, he L, hemB, hemC, hemD, hemE et hemH de B . subtilis chez L. lacti s semble suffisante pour assurer la biosynthèse d'hème et aboutir à un phénotype partiel de respiration.
Les résultats obtenus lors du suivi de la croissance de la souche de L. lacti s contenant les gènes hemA, hemL, he B , hemC, he D, hemE et hemH de B . subtilis, comparée à une souche contrôle, sont récapitulés dans le Tableau I ci-dessous.
Tableau I
Figure imgf000020_0001
EXEMPLE 2 : CRIBLAGE POUR L'ISOLEMENT D'UNE SOUCHE DE L . LACTIS AYANT UNE MEILLEURE CAPACITE DE RESPIRER.
La respiration de L. lactis repose notamment sur la capacité de la cellule à assimiler l' hémme, un cofacteur essentiel de l'activité respiratoire. D'après les travaux de KAY et al . [J. Bacteπol . 164 : 1332-1336, (1985)] et ISHIGURO et al . [J Bacteπol . 164 :1233-1237, (1985)], les bactéries qui accumulent 1 ' hémme sont aussi capables de fixer un colorant, le rouge congo . L'utilisation du rouge congo permet d'isoler des souches fixant le colorant plus ou moins bien que le témoin.
Une mutagénèse aléatoire est réalisée sur la souche L. lacti s MG1363 selon la procédure de MAGUIN et al . [J. Bacteπol., 178 :931-935, (1996)]. Les cellules sont étalées sur boite contenant du rouge congo à 30 μg/ml . La souche mère est utilisée comme témoin.
Des mutants blancs (fixant moins le colorant) sont isolés. Ces mutants assimilent 1 ' hémme moins efficacement que le témoin et sont défectueux pour la respiration.
Des mutants plus rouges que le témoin sont également isolés. Ces mutants possédant plus de facilité à assimiler l' hémme, seront potentiellement plus aptes à respirer que le témoin.
Les gènes mutés peuvent ensuite être identifiés par des techniques connues de l'homme de l'Art par exemple, selon la procédure de MAGUIN et al . [J. Bacteπol., 178 :931-935, (1996)]. EXEMPLE 3 : OBTENTION D'UNE SOUCHE DE L. LACTIS EXPRIMANT LES GENES NECESSAIRES POUR PRODUIRE DES QUINONES .
L'addition de la vitamine B2 (riboflavine) dans le milieu M17 glucose, peut stimuler la respiration de L. lactis MG1363 (augmentation de la biomasse) . Dans cette optique, on peut augmenter la biomasse en respiration par la production de vitamine K2 (ménaqumone) . Cette vitamine est également un élément essentiel des chaînes respiratoires. En se basant sur la séquence chromosomique de IL1403, proche de MG1363, on s'aperçoit que certains gènes sont absents par rapport à ce qui est connu chez les bactéries à gram positif {Bacillus subtilis) .
Le clonage de l' opéron men de Bacillus subtilis chez L . lactis peut donc favoriser la respiration chez ce dernier.
L' opéron menFBytxMmenBEC comprend cinq gènes (Bacillus Subtilis and others gram positive bacteria, Ed. Sonenshe , A.L., Hoch J.A. and Losick R., ASM, W. DC) : menF : ménaqumone-spécifîque 2 -ketoglutarate déshydrogénase, numéro d'accès SWISS-PROT 23973 enD : 2-succinyl-6-hydroxy-2 , 4-cyclohexadiene-l- carboxylate synthase, numéro d'accès SWISS-PROT 23970 menB .- 1 , 4 -dihydroxy-2 -naphtoic acid synthase, numéro d'accès SWISS-PROT 23966 menE .- o-succinylbenzoic acid coenzyme A synthetase, numéro d'accès SWISS-PROT 23971 menC : o-succinylbenzoic acid synthase, pas de numéro d'accès SWISS-PROT.
Les gènes sont amplifiés par PCR à partir de la souche 168 [ANAGNOSTOPOULOS et al . , J. Bacteriol . 81 : 741-747, (1961)] en utilisant les amorces permettant d'obtenir la séquence codante des gènes avec le promoteur et son terminateur. Amorce sens : 5' GTACTGCTGCCATCAGCCC 3' Amorce antisens : 5' CCACGTCCTGTGACGAATACTCCGC 3'
Le fragment d'environ 8 kilobases est clone dans un plasmide multicopie du type pIL253 (SIMON et al . Biochimie 559-566 1988) . La fonctionnalité des gènes est déterminée par complémentation de mutants en chez B . subtilis [MILLER et al . , J. Bacteriol., 170 : 2735- 2741, (1988)]. La production de quinone est déterminée selon la procédure de MORISHITA et al . [J. Diary. Sci . 82 :1879-1903, (1999)].
EXEMPLE 4 : ISOLEMENT DES SOUCHES MUTANTES DE L . LACTIS AYANT UNE MEILLEURE CAPACITE DE RESPIRER.
La capacité de respirer est caractérisée par la présence d'hème dans la cellule. Le gène codant la catalase d'une souche de Bacillus subtilis a été précédemment clone dans L. lactis (demande PCT/FR00/00885 aux noms de 1 ' INRA et du CEA ; Inventeurs BRAVARD et DUWAT) . La catalase a besoin de l'hème pour son activité. Dans la souche de L. lactis contenant le gène clone de la catalase, un outil de transposition, le pGhost9 :ISS1 (Demande PCT WO 93/18164) est introduit. Une mutagenèse est effectuée et les mutants issus de la mutagenèse sont criblés pour leur activité catalase en présence d'un faible quantité d'hémine. Les colonies démontrant une forte activité catalase sont sélectionnées. La mutation responsable de l'augmentation de l'activité catalase est identifiée par des techniques connues par l'homme de l'Art, par exemple, selon la procédure de MAGUIN et al . , [J. Bacteriol., 178 : 931-935, (1996)] . L'activité respiratoire est testée pour toutes souches mutantes ayant une activité catalase augmentée par rapport à la souche sauvage. Parmi les souches mutantes, celles présentant une respiration plus efficace, peuvent être identifiées par une augmentation de biomasse, pH final élevé, et/ou une respiration en présence d'une quantité plus faible d'hémine. Des mutants seront reconstruits, et/ou le plasmide contenant la catalase peut être éliminé .
EXEMPLE 5 : OBTENTION D'UNE SOUCHE DE L . LACTIS DONT LE METABOLISME EST DETOURNE VERS LA RESPIRATION. Les enzymes qui catalysent la dégradation des sucres pour la production d'énergie sont sous contrôle de régulateurs. Le régulateur CcpA régule l'expression de plusieurs enzymes glycolytiques, y compris la phosphofructokinase, la pyruvate kinase, et la L-lactate déshydrogénase. Un mutant ccpA , caractérisé en conditions fermentaires, produit une quantité réduite de lactate, mais une quantité plus importante en acétate et en éthanol , ce qui confirme le rôle régulateur de CcpA [LUESINK et al . , Molecular Microbiology 30 :789-798, (1998)] . Aucun travail auparavant ne décrit le comportement d'un mutant ccpA des bactéries lactiques en conditions de respiration. Les Inventeurs ont émis l'hypothèse qu'un mutant ccpA pourrait adopter un métabolisme respiratoire dès le démarrage de la culture, améliorant ainsi l'acquisition de biomasse. La capacité de respirer d'une souche portant une mutation dans le gène ccpA est testée. Des mutants ccpA sont obtenus soit par un remplacement de gène
[LUESINK et al . , Mol. Microbiol . 30 :789-798, (1998)], soit par insertion de transposon.
La souche utilisée dans cet exemple (décrite par ALEKSANDRZAK et al . , Food Biotechnology 17 :61-66, 2000) contient un gène ccpA inactivé par l' insertion d'un transposon, (mais il est probable que tout mutant de ccpA donne lieu à des résultats semblables) . La croissance et la biomasse finale sont déterminées dans du milieu M17 plus glucose (1%) ou du milieu BHI plus glucose (1%) , et contenant ou non de 1 ' hémme (10 μg/ml) et aérés ou non- aérés. Les moculums sont préparés dans du M17 glucose.
Les résultats montrant la capacité respiratoire du mutant par rapport à la souche sauvage sont illustrés par le Tableau II ci-dessous, et par la Figure 1. Ces données indiquent que le mutant ccpA présente en fm de culture une biomasse et un pH supérieurs à la souche sauvage.
TABLEAU II
Figure imgf000024_0001
ND non détermine
La Figure 1 représente la croissance du mutant ccpA, par rapport à celle de la souche sauvage IL1403, en milieu BHI contenant 1% de glucose, et en conditions d'aération, en présence ou en absence d'hémine. Symboles : , ccpA + hémme ; D, ccpA sans hémme , - *, IL1403 + hémme ; Δ, IL1403 sans hémme.
Pour la préparation de levains, le gène ccpA peut également être placé sous contrôle d'un promoteur mductible. La culture des bactéries en vue de la préparation du levain est effectuée en conditions n'induisant pas le promoteur, et ccpA n'est pas exprimé. L'utilisation du levain peut s'effectuer dans des conditions induisant le promoteur, et permettant ainsi la restauration de l'expression de ccpA, produisant une souche ayant des activités équivalentes à celles de la souche sauvage.

Claims

REVENDICATIONS 1) Bactérie lactique recombinante modifiée génétiquement afin de lui conférer un métabolisme respiratoire, ou d'activer ledit métabolisme. 2) Bactérie lactique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle a subi au moins une modification génétique consistant en l'addition d'au moins un gène codant pour une protéine intervenant dans le métabolisme respiratoire ou favorisant ledit métabolisme.
3) Bactérie lactique selon une quelconque des revendications 1 ou 2 , caractérisée en ce qu'elle a subi au moins une modification résultant en la surexpression d'au moins un gène codant pour une protéine intervenant dans le métabolisme respiratoire et/ou une modification résultant en l'activation d'au moins une protéine intervenant dans le métabolisme respiratoire ou favorisant ledit métabolisme.
4) Bactérie lactique selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle a subi au moins une modification résultant en 1 ' mactivation totale ou partielle, d'au moins un gène codant pour une protéine intervenant dans le métabolisme fermentaire ou favorisant ledit métabolisme, et/ou au moins une modification résultant en la sous-expression, d'au moins un gène codant pour une protéine intervenant dans le métabolisme fermentaire ou favorisant ledit métabolisme.
5) Bactérie lactique selon la revendication 2, caractérisée en ce que ledit gène est choisi parmi : - les gènes codant pour des protéines de la voie de biosynthèse de l'hème ;
- les gènes codant pour des protéines de la voie de biosynthèse des cytochromes ;
- les gènes codant pour des protéines du cycle de Krebs. 6) Bactérie lactique selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit gène est choisi parmi :
- des gènes régulateurs des voies métaboliques favorisant la voie respiratoire ; - des enzymes de la voie de biosynthese des cytochromes ; des gènes codant pour des protéines hémimques .
7) Bactérie lactique selon la revendication 4, caractérisée en ce que ledit gène est choisi parmi le gène ccpA et le gène gls24 .
8) Bactérie lactique selon une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les bactéries des genres Lactococcus , Lactobacillus , Leuconostoc, Streptococcus ,
Propionibacterium, Bifidobacterium, ou Enterococcus .
9) Bactérie lactique selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche de l'espèce Lactococcus ou Streptococcus transformée par au moins un gène codant pour une protéine de la voie de biosynthèse de l'hème.
10) Procédé de culture bactérienne, caractérisé en ce qu'il comprend la culture d'au moins une souche de bactérie lactique selon une quelconque des revendications 1 à 9, en conditions permettant 1' induction d'un métabolisme respiratoire chez ladite souche .
11) Procédé de culture selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est mis en œuvre pour la production d'un levain lactique, et qu'il comprend la récolte des bactéries à l'issue de ladite culture.
12) Levain lactique comprenant au moins une souche de bactérie lactique transformée selon une quelconque des revendications 1 à 9. 13) Procédé de préparation d'un produit fermenté, caractérisé en ce qu'il comprend l'ensemencement d'un milieu à fermenter à l'aide d'un levain lactique selon la revendication 12.
14) Utilisation d'un levain lactique selon la revendication 12 pour la préparation d'un produit fermenté .
15) A partir d'un levain lactique recombinant, ayant les propriétés de respiration selon les revendications 1 à 9, l'introduction d'un gène codant une protéine d'intérêt quelconque. 16) Utilisation de la souche décrite dans la revendication 15 sous conditions de respiration pour la production de ladite protéine hétérologue.
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