CN105767016A - 一种抑食金球藻抑藻剂及其制备方法 - Google Patents
一种抑食金球藻抑藻剂及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种抑食金球藻抑藻剂及其制备方法。一种所述的抑食金球藻抑藻剂的制备方法,包括如下步骤:(1)将三角褐指藻培养至指数生长后期,得到藻液;(2)将所述的藻液进行真空抽滤,得到无藻细胞滤液;(3)将所述的无藻细胞滤液进行萃取、减压浓缩、氮气吹干后,得到抑食金球藻抑藻剂。本发明所述的抑食金球藻抑藻剂来源于天然微藻,环境亲和性强,抑藻起效快且效果持久;同时,本发明所述的制备方法简单,制备成本低廉,可广泛地规模化应用于近岸海域、养殖池塘等抑食金球藻的抑杀。
Description
技术领域
本发明属于水体污染控制技术领域,尤其是涉及一种抑食金球藻抑藻剂及其制备方法。
背景技术
抑食金球藻(Aureococcusanophagefferens),属于金藻门(Chrysophyta),海金藻纲(Pelagophyceae),是一种微微型藻,个体大小2-3微米,因此只能通过分子生物学手段监测其数量。从20世纪80年代至今,抑食金球藻多次在美国形成大范围有害藻华,因藻华期间细胞密度极高(109个/升)藻华水体呈黄褐色而被称作褐潮,该命名被美国研究与管理部门应用,也为国际有害藻华研究界所接受。我国是继美国及南非后第三个发生褐潮的国家。自2009年以来,由抑食金球藻诱发的褐潮已每年春夏季节在我国北方海域连续暴发。
褐潮的发生对海洋渔业及近岸生态环境产生多方面的危害。首先,抑食金球藻能产生一种类似多巴胺的生物活性物质,能抑制贝类侧纤毛的活动,从而对滤食性贝类产生负面影响,具体表现为抑制贝类摄食、贝类停止生长、死亡等;其次,由褐潮发生时抑食金球藻的优势度极高,最高时抑食金球藻细胞密度占据近岸海域浮游植物总密度的99.98%,严重危害近岸海域海洋生物多样性;最后,褐潮衰退时抑食金球藻在短时间内大量死亡,造成近岸海域有机耗氧量急剧升高、溶解氧急剧下降,导致大量海洋动物死亡。
现有抑食金球藻的去除方法主要有粘土吸附藻细胞及过氧化氢抑杀藻细胞等。但终因生态安全性低等诸多局限,难以在发生褐潮的海域进行规模化地应用。我们前期在实验室内研究发现共培养体系中的三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum,一种贝类饵料微藻)对抑食金球藻生长具有显著的抑制效应,推测三角褐指藻可能通过分泌有效的抑藻化感物质对抑食金球藻生长产生显著的抑制效应。因此,若能将有效化感物质提取并应用于由抑食金球藻暴发形成的褐潮,将对我国褐潮的防治具有非常重要的意义。
发明内容
有鉴于此,本发明旨在提出一种抑食金球藻抑藻剂及其制备方法,制备方法简单、生产成本低廉,对近岸海域和海水养殖池塘由抑食金球藻暴发形成褐潮的防控。
为达到上述目的,本发明的技术方案是这样实现的:
一种抑食金球藻抑藻剂,该抑食金球藻抑藻剂由包括如下的步骤制得:将三角褐指藻的藻液经过抽滤、萃取、浓缩、干燥后制得。
一种所述的抑食金球藻抑藻剂的制备方法,包括如下步骤:
(1)将三角褐指藻培养至指数生长后期,得到藻液;
(2)将所述的藻液进行真空抽滤,得到无藻细胞滤液;
(3)将所述的无藻细胞滤液进行萃取、减压浓缩、氮气吹干后,得到抑食金球藻抑藻剂。
进一步,所述的步骤(1)中藻液的藻细胞密度为5×1010个/升-1×1011个/升;所述的步骤(1)中培养步骤的培养液选择f/2培养液。
进一步,所述的步骤(2)中真空抽滤步骤选择孔径为2微米的滤膜。
进一步,所述的步骤(3)中萃取步骤选择乙醚和石油醚进行避光萃取3次,萃取时间为6-8小时;所述的步骤(3)中减压浓缩步骤采用旋转蒸发仪,在45-50℃下进行减压浓缩。
一种所述的抑食金球藻抑藻剂的应用,所述的抑食金球藻抑藻剂在防治褐潮中应用。
进一步,所述的防治褐潮通过抑制抑食金球藻生长实现。
进一步,所述的应用为当抑食金球藻的藻细胞密度达1×105-1×106个/升时,将所述的抑食金球藻抑藻剂投放于养殖贝类密集的水域中,以抑制抑食金球藻生长。
进一步,所述的抑食金球藻抑藻剂注入饵料微藻浓缩液缓释仪后投放于养殖贝类密集的水域中。所述的饵料微藻浓缩液缓释仪是指实用新型专利ZL201520754681.0。
进一步,所述的饵料微藻浓缩液缓释仪的容积为40-100升;所述的饵料微藻浓缩液缓释仪的投放密度为10-25个/亩;所述的饵料微藻浓缩液缓释仪的释放频率为9-15分钟/次;所述的饵料微藻浓缩液缓释仪的单次释放时间为1-3分钟;所述的饵料微藻浓缩液缓仪的更换频率为20-40天/次。
相对于现有技术,本发明所述的抑食金球藻抑藻剂及其制备方法具有以下优势:
本发明所述的抑食金球藻抑藻剂来源于天然微藻,环境亲和性强,抑藻起效快且效果持久;同时,本发明所述的制备方法简单,制备成本低廉,可广泛地规模化应用于近岸海域、养殖池塘等抑食金球藻的抑杀。另外,施用该抑食金球藻抑藻剂后不会造成水体颜色的改变,且使用时不受地域、节气、温度等的限制。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1为本发明实施例所述的抑食金球藻抑藻剂的制备方法的流程图;
图2为本发明实施例所述的抑食金球藻密度对数值与Ct值的标准曲线图;
图3为本发明实施例所述的抑食金球藻抑藻剂对抑食金球藻的抑制率变化图。
具体实施方式
除非另外说明,本文中所用的术语均具有本领域技术人员常规理解的含义,为了便于理解本发明,将本文中使用的一些术语进行了下述定义。
所有的数字标识,例如pH、温度、时间、浓度,包括范围,都是近似值。要了解,虽然不总是明确的叙述所有的数字标识之前都加上术语“约”。同时也要了解,虽然不总是明确的叙述,本文中描述的试剂仅仅是示例,其等价物是本领域已知的。
本发明实施例中所述的f/2培养液的配方:硝酸钠75毫克,磷酸二氢钠4.4毫克,f/2微量元素混合溶液1毫升,f/2维生素混合溶液1毫升,灭菌的滤膜过滤海水998毫升。
其中,f/2微量元素混合溶液的配方:Zn2SO423毫克,CuSO4 .5H2O178毫克,柠檬酸钠3.9克,钼酸钠7.3毫克,乙二胺四乙酸钠4.35克,氯化钴12毫克,纯水1000毫升。
其中,f/2维生素混合溶液的配方:维生素B12(VB12)0.5毫克,维生素B1(VB1)100毫克,生物素(VH)0.5毫克,纯水1000毫升。
下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
实施例1
一种抑食金球藻抑藻剂,该抑食金球藻抑藻剂由包括如下的步骤制得:将三角褐指藻的藻液经过抽滤、萃取、浓缩、干燥后制得。
一种所述的抑食金球藻抑藻剂的制备方法,如图1所示,包括如下步骤:
(1)将三角褐指藻培养至指数生长后期;三角褐指藻的扩大培养:采用1000毫升f/2培养液培养,培养条件为光照强度为2000勒克斯,光暗周期D:L=12小时:12小时,温度为20℃。每天将藻液摇匀3次,将三角褐指藻培养至指数生长后期,藻细胞密度为6.8×1010个/升,即三角褐指藻的藻细胞总数为6.8×1010个;
(2)将所述的藻液经孔径2微米的滤膜进行真空抽滤,得到无藻细胞滤液;
(3)将所述的无藻细胞滤液选择乙醚和石油醚进行避光萃取3次,萃取时间为6小时,采用旋转蒸发仪,在45℃下进行减压浓缩,然后氮气吹干,得到干燥粉末状的抑食金球藻抑藻剂。以每1.0×1010个藻细胞的有机溶剂萃取物计为1个活性单位,即此次萃取共获取6.8个活性单位的抑食金球藻抑藻剂。
取对数生长期的抑食金球藻藻液100毫升分别放入200毫升锥形瓶中,共设置添加0.02、0.04、0.06、0.08、0.1活性单位/升的5个抑藻实验组及1个未添加抑藻剂的空白对照组,每组设3个平行。各组抑食金球藻的初始浓度均为3.0×109个/升,各组置于相同条件下培养。每24小时进行藻细胞密度的测定,共监测96小时。
抑食金球藻细胞计数采用荧光定量PCR技术进行测定,步骤如下:
(1)藻细胞的收集及基因组DNA提取:在光学显微镜下记录稳定期藻细胞密度后稀释,使藻细胞密度最终分别达到为8,8×101,8×102,8×103,8×104,8×105,8×106个/毫升,经0.45微米的微孔滤膜过滤来获取微藻细胞,收集藻液的0.45微米的滤膜作为基因组DNA提取介质。藻细胞基因组DNA提取所用的试剂盒为TaKaRaMiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKitVer.5.0。提取流程按照试剂盒说明进行。
(2)特异性荧光探针定量PCR反应
上游引物5‘-GCGGAGGTCGTGGAGAGG-3’
下游引物5‘-GGGTGCGTCCGTAGACTTGA-3’
探针5‘-CTCGGCTTCACGGGCGGCTTCC-3’
反应体系:基因组DNA模板约4微升、2×PremixEXTaqBufferMix(TaKaRa)5微升、探针0.4微升(10微摩/升)、引物各0.2微升(10微摩/升),最后加灭菌去离子水至10微升。
反应条件:95℃预变性10分钟,95℃变性15秒,60℃退火/延伸1分钟,40个循环。
藻细胞基因组DNA样品在ABI7500荧光定量PCR仪上进行扩增和数据分析。
(3)绘制标准曲线
将特异性荧光探针定量PCR反应所得的Ct值与细胞的对数值通过线性回归拟合形成标准曲线,并得到标准曲线方程,标准曲线如图2所示。
本发明实施过程中获得的藻细胞DNA模板PCR扩增后所得的Ct值与藻细胞数目的对数值通过线性回归方程为y=-2.6711x+42.134,相关系数(R2)为0.9519,显示出良好的线性关系,且有较宽藻细胞数目检测范围,完全适用于抑食金球藻细胞数目的定量分析。
抑藻率的计算公式为I(%)=(N0-NS)/N0×100,式中IR为抑制率,NS加入抑藻剂组的藻细胞密度值,N0为对照组的藻细胞密度值;将抑食金球藻抑藻剂浓度与生长抑制率做一元线性回归,求出半效应浓度EC50(活性单位/L)。
本实施例的抑食金球藻抑藻剂对抑食金球藻生长的抑制效应如表1所示,变化规律图示见图3。
表1抑食金球藻抑藻剂对抑食金球藻生长的抑制效应
实施例2
一种抑食金球藻抑藻剂,该抑食金球藻抑藻剂由包括如下的步骤制得:将三角褐指藻的藻液经过抽滤、萃取、浓缩、干燥后制得。
一种所述的抑食金球藻抑藻剂的制备方法,包括如下步骤:
(1)将三角褐指藻培养至指数生长后期;三角褐指藻的扩大培养:采用1000毫升f/2培养液培养,培养条件为光照强度为2500勒克斯,光暗周期D:L=12小时:12小时,温度为20℃。每天将藻液摇匀3次,将三角褐指藻培养至指数生长后期,藻细胞密度为6.8×1010个/升,即三角褐指藻的藻细胞总数为6.8×1010个;
(2)将所述的藻液经孔径2微米的滤膜进行真空抽滤,得到无藻细胞滤液;
(3)将所述的无藻细胞滤液选择乙醚和石油醚进行避光萃取3次,萃取时间为6小时,采用旋转蒸发仪,在45℃下进行减压浓缩,然后氮气吹干,得到干燥粉末状的抑食金球藻抑藻剂。以每1.0×1010个藻细胞的有机溶剂萃取物计为1个活性单位,即此次萃取共获取6.8个活性单位的抑食金球藻抑藻剂。
一种所述的抑食金球藻抑藻剂的应用,所述的抑食金球藻抑藻剂在防治褐潮中应用。所述的防治褐潮通过抑制抑食金球藻生长实现。
2015年5月26日至8月25日,使用本发明所述的抑食金球藻抑藻剂在河北秦皇岛市昌黎县扇贝养殖基地面积为18亩扇贝养殖海区开展防控褐潮的应用实例:
(a)在2015年5月26日监测到该扇贝养殖海区水体中的抑食金球藻细胞密度达到2.9×106个/升时,开始以下操作;
(b)将1个活性单位的抑食金球藻抑藻剂溶于100升饵料微藻浓缩液缓释仪中;
(c)按照10个/亩的放置频率将抑食金球藻抑藻剂的饵料微藻浓缩液缓释仪吊装于养殖扇贝密集生活的水域;
(d)设定饵料微藻浓缩液缓释仪中抑食金球藻抑藻剂的释放频率为每隔19分钟释放1分钟;
(e)饵料微藻浓缩液缓释仪中抑食金球藻抑藻剂的更换频率为20天/次;
(f)使用本发明所述的抑食金球藻抑藻剂对扇贝养殖海区进行了为期90天的褐潮防控。
2015年5月26日至8月25日,使用抑食金球藻抑藻剂的扇贝养殖水域的抑食金球藻密度一直维持在4.6×103个/升以下,而抑食金球藻抑藻剂的扇贝养殖水域抑食金球藻密度为2015年5月26日至7月21日期间一直维持在8.3×106个/升以上,最高时密度可达7.1×107个/升,7月22日至8月25日期间一直维持在7.6×105个/升以上。
在当年8月25日随机抽取300粒扇贝进行称重。经检测使用本发明的扇贝养殖区,扇贝平均软组织生长速度为10.46毫克/天,平均干贝壳生长速度为47.89毫克/天,显著高于对照养殖区的软组织生长速度为1.92毫克/天,平均干贝壳生长速度为6.39毫克/天。因此,使用本发明在扇贝养殖海区开展防控褐潮,可有效降低褐潮对贝类养殖的危害,提高褐潮发生的前提条件下贝类养殖产量。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种抑食金球藻抑藻剂,其特征在于:该抑食金球藻抑藻剂由包括如下的步骤制得:将三角褐指藻的藻液经过抽滤、萃取、浓缩、干燥后制得。
2.权利要求1所述的抑食金球藻抑藻剂的制备方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)将三角褐指藻培养至指数生长后期,得到藻液;
(2)将所述的藻液进行真空抽滤,得到无藻细胞滤液;
(3)将所述的无藻细胞滤液进行萃取、减压浓缩、氮气吹干后,得到抑食金球藻抑藻剂。
3.根据权利要求2所述的抑食金球藻抑藻剂的制备方法,其特征在于:所述的步骤(1)中藻液的藻细胞密度为5×1010个/升-1×1011个/升;所述的步骤(1)中培养步骤的培养液选择f/2培养液。
4.根据权利要求2所述的抑食金球藻抑藻剂的制备方法,其特征在于:所述的步骤(2)中真空抽滤步骤选择孔径为2微米的滤膜。
5.根据权利要求2所述的抑食金球藻抑藻剂的制备方法,其特征在于:所述的步骤(3)中萃取步骤选择乙醚和石油醚进行避光萃取3次,萃取时间为6-8小时;所述的步骤(3)中减压浓缩步骤采用旋转蒸发仪,在45-50℃下进行减压浓缩。
6.权利要求1-5中任一项所述的抑食金球藻抑藻剂的应用,其特征在于:所述的抑食金球藻抑藻剂在防治褐潮中应用。
7.权利要求6所述的抑食金球藻抑藻剂的应用,其特征在于:所述的防治褐潮通过抑制抑食金球藻生长实现。
8.权利要求6或7所述的抑食金球藻抑藻剂的应用,其特征在于:所述的应用为当抑食金球藻的藻细胞密度达1×105-1×106个/升时,将所述的抑食金球藻抑藻剂投放于养殖贝类密集的水域中,以抑制抑食金球藻生长。
9.根据权利要求8所述的抑食金球藻抑藻剂的应用,其特征在于:所述的抑食金球藻抑藻剂注入饵料微藻浓缩液缓释仪后投放于养殖贝类密集的水域中。
10.根据权利要求9所述的抑食金球藻抑藻剂的应用,其特征在于:所述的饵料微藻浓缩液缓释仪的容积为40-100升;所述的饵料微藻浓缩液缓释仪的投放密度为10-25个/亩;所述的饵料微藻浓缩液缓释仪的释放频率为9-15分钟/次;所述的饵料微藻浓缩液缓释仪的单次释放时间为1-3分钟;所述的饵料微藻浓缩液缓仪的更换频率为20-40天/次。
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