CN111206024A - 一种表达果胶酸内切水解酶的工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种表达果胶酸内切水解酶的工程菌及其应用，属于食品工程领域、生物工程和微生物工程领域。本发明使用食品安全级的枯草杆菌B.subtilis800为宿主，在果胶酸内切水解酶基因(npg)的上下游分别融合编码特定多肽(SSSSHHHHHHHHSSS和SSHHHHSS)的核苷酸序列，并整合至枯草芽孢杆菌表达载体pBSCWZ，构建高效表达果胶酸内切水解酶的表达质粒(npg/pBSCWZ)和工程菌(npg/pBSCWZ/B.subtilis 800)，工程菌(npg/pBSCWZ/B.subtilis 800)表达食品级果胶酸内切水解酶的活性可达350U/mL。

Description

一种表达果胶酸内切水解酶的工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种表达果胶酸内切水解酶的工程菌及其应用，属于食品工程领域、生物工程和微生物工程领域。

背景技术

果胶酸内切水解酶在食品工业、生物能源工业和植物活性物质药物成分提取过程中，具有降解果胶酸、促进植物多糖和纤维素糖化、促进植物细胞壁降解提高活性物质释放等多种应用。

目前果胶酸内切水解酶的工业生产工艺，主要采取丝状真菌固态发酵生产，常用的真菌有黑曲霉、米曲霉和木霉等。传统的黑曲霉和米曲霉等真菌发酵产果胶酸内切水解酶工艺的主要缺点是产量较低，在自然条件下，真菌需要在果胶酸或果胶酸酯等底物的诱导下，才能产生果胶酸内切水解酶和其他果胶酶，在其他碳源如葡萄糖或蔗糖存在的条件下，果胶酶的表达会受到抑制。

基因重组技术是解决葡萄糖或蔗糖等碳源抑制真菌果胶酶自然表达的有效方法，真菌果胶酸内切水解酶已经在丝状真菌中实现同源重组表达和在酵母菌中实现表达质粒重组表达，但表达效果比较差，产酶量约40U/mL medium左右；相对于真菌表达系统而言，大肠杆菌表达系统是常用的、更为方便的表达系统，申请人在2007年用大肠杆菌表达系统实现了米曲霉果胶酸内切水解酶在大肠杆菌中的表达，表达效率70U/mL medium，高于真菌表达系统，但是用大肠杆菌重组表达果胶酸内切水解酶工艺的主要缺点是产品容易混有内毒素，难以在食品工业进行广泛的应用，而且现有大肠杆菌表达米曲霉果胶酸内切水解酶的效率还有待进一步提高。

发明内容

本发明针对缺乏能够高效表达食品级果胶酸内切水解酶的质粒及工程菌，提供了一种高效原核表达食品级果胶酸内切水解酶的质粒及工程菌。

本发明提供了一种能够在枯草芽孢杆菌中高效表达的果胶酸内切水解酶GSHS-NPG-SHS，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了编码果胶酸内切水解酶的基因，所述基因核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明提供了一种表达所述果胶酸内切水解酶NPG或含有所述编码果胶酸内切水解酶蛋白NPG基因的表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体以pBSCWZ为出发载体，pBSCWZ载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

在本发明的一种实施方式中，所述pBSCWZ载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明提供了一种表达所述果胶酸内切水解酶GSHS-NPG-SHS的工程菌或细胞系。

在本发明的一种实施方式中，所述工程菌或细胞系是以枯草芽孢杆菌B.subtilis800为宿主，表达如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明提供了一种制备果胶酸内切水解酶的方法，所述方法是以表达果胶酸内切水解酶NPG的工程菌或细胞系为发酵菌株进行发酵产酶。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为将所述表达果胶酸内切水解酶NPG的基因工程菌或转基因细胞系的菌株接入含80～200μg/mL卡那霉素的LB培养基中35～40℃液体培养8h～16h得到菌液，将培养得到的菌液接入TB发酵液体培养基，35～40℃、150～250rpm培养至OD₆₀₀到0.7～1.0，加入终浓度为0.3～0.5mM IPTG进行诱导，18～22℃培养，表达23～25h得到发酵液，将发酵液进行纯化得到所述果胶酸内切水解酶。

本发明提供了一种所述果胶酸内切水解酶GSHS-NPG-SHS、表达果胶酸内切水解酶GSHS-NPG-SHS的基因工程菌或转基因细胞系在食品工业、生物能源工业和植物活性物质药物成分提取过程中的应用。

本发明的有益效果：

(1)提供了一种米曲霉果胶酸内切水解酶的食品级产品的原核重组表达的方法，本发明优化设计并合成了适合枯草芽孢杆菌表达系统的米曲霉果胶酸内切水解酶基因npg，构建高效表达果胶酸内切水解酶的表达质粒(npg/pBSCWZ)和工程菌(npg/pBSCWZ/B.subtilis 800)。

(2)NPG对宿主细胞生长影响较小。摇瓶发酵表达结果表明，30℃条件下表达24h后，npg/pBSCWZ/B.subtilis 800工程菌OD₆₀₀可以达到2.5，高于原始果胶酸内切水解酶独立表达的工程菌(OD₆₀₀为1.30)。

(3)本发明的工程菌表达的NPG具有较高的可溶性蛋白产量，表达蛋白的活性产量达到350U/ml。

附图说明

图1是npg/pBSCWZ表达质粒结构图。

图2是npg/pBSCWZ双酶切的电泳图；泳道1为DNA marker，泳道2为npg/pBSCWZ双酶切。

图3是NPG蛋白电泳图；泳道1为蛋白Mark，泳道2为来自npg/pBSCWZ/B.subtilis800的上清蛋白，泳道3为来自npg/pBSCWZ/B.subtilis 800的胞内沉淀，泳道4为来自pBSCWZ/B.subtilis 800的胞内沉淀，泳道5为来自pBSCWZ/B.subtilis 800的上清蛋白；箭头指向为目标蛋白。

图4是NPG蛋白处理马铃薯块根组织块图；1是实验组，带杆箭头指向马铃薯块根组织块中被NPG水解中胶层果胶后释放的单细胞，2是对照组，箭头指向马铃薯块根组织块中细胞的之间未发生变化的中胶层，图中标尺长度代表50μm。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。

LB培养基：在1L去离子水中加入10g胰化蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl，用1mol/L NaOH调节pH至7.4，121℃高压下蒸汽灭菌20min。

TB培养基：甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K₂HPO₄12.54 g/L，KH₂PO₄2.31g/L。

果胶酶水解酶酶活测定方法(详细步骤参照王小敏等，分光光度计法测定果胶酶活力的方法研究，食品工业科技分析检测Vol.28,No.05,2007)：0.5ml反应体系含有50mMHAc/NaAc(pH 5.5)，1mg/mL果胶酸，适量的酶37℃条件下反应10min，为了检测反应体系中产生的还原糖的量，加0.5mL二硝基水杨酸(dinitrosalicylic acid，DNS)试剂终止反应，然后检测在520nm处的吸收值，再根据标准曲线回归方程，换算得到还原糖浓度，然后计算裂解细胞上清的每毫升体积所含的总酶活，再计算相对于每毫升菌体培养液体积的总酶活。一个酶活单位定义为每分钟释放的产物等同于1μmol半乳糖醛酸的酶量。

实施例1 npg基因设计及npg/PMD18T质粒构建

利用来源于米曲霉果胶酸内切水解酶A的npg基因，对其基因序列进行35个密码子优化，使其适合枯草芽孢杆菌表达系统，并在其上下游分别融合编码特定多肽GSHS和SHS(SSSSHHHHHHHHSSS和SSHHHHSS)的核苷酸序列，在5’端添加NdeⅠ位点序列，在3’端加上SalⅠ位点序列，化学合成如SEQ ID NO.1所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

将合成的片段与PMD18T载体连接，转化DH5α(具体转化步骤参见全式金DH5α说明书)，转化产物涂布含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板，经过37℃培养过夜(10h～14h)得到单克隆转化子，挑取单克隆至含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中在37℃、200rpm下培养8h得到菌液，将菌液进行菌落PCR鉴定，将鉴定通过的菌液提取质粒(步骤详见OMEGA质粒提取试剂盒)，质粒酶切鉴定和测序验证，得到质粒npg/PMD18T。

菌落PCR所用引物：

F1：5’CATATGTCTTCTTCTTCTCACC3’(SEQ ID NO.5)，

R1：5’GTCGACTTAA GAAGAGTGGT GGTGGTGAG3’(SEQ ID NO.6)。

实施例2npg/pBSCWZ表达载体结构设计和构建

设计表达质粒(npg/pBSCWZ)的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，质粒结构如图1所示。

使用的载体为发明人构建的pBSCWZ载体(载体核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)，将pBSCWZ质粒和npg/PMD18T用NdeⅠ和SalⅠ进行酶切(图2)，酶切产物切胶后进行胶回收(步骤详见OMEGA胶回收试剂盒)，再用T4连接酶连接得到连接产物，将连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，经过37℃培养过夜(10h～14h)至长出单克隆，挑取单克隆至含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中在37℃、200rpm下培养8h得到菌液，将菌液进行菌落PCR鉴定，菌落PCR所用引物为实施例1中的F1和R1。将鉴定通过的菌株(npg/pBSCWZ/DH5α)的菌液提取质粒(步骤详见OMEGA质粒提取试剂盒)，质粒酶切鉴定和测序验证，验证通过的质粒即为npg/pBSCWZ。

实施例3npg/pBSCWZ/B.subtilis 800表达工程菌构建

将质粒npg/pBSCWZ转化B.subtilis 800，将转化液涂布于含100μg/ml卡那霉素的LB平板，经过37℃培养过夜(10h～14h)至长出单克隆，挑取单克隆至含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中在37℃、200rpm下培养8h得到菌液，将菌液进行菌落PCR鉴定并进行测序，菌落PCR所用引物为实施例1中的F1和R1。验证得到单克隆转化子npg/pBSCWZ/B.subtilis 800(即GSHS-NPG-SHS工程菌)。转化步骤：参照《分子克隆实验指南》(黄培堂等译，科学出版社2002年9月出版)。

实施例4蛋白NPG表达与酶活测定

将实施例3得到的菌株分别以体积比1％的量接种在含100μg/ml卡那霉素的LB培养基中37℃液体培养过夜(10h～14h)得到菌液，将培养得到的菌液接入TB发酵液体培养基，37℃、200rpm培养至OD₆₀₀到0.8，加入终浓度为0.5mM IPTG进行诱导，30℃培养，表达24h，得到发酵液。摇瓶发酵表达结果表明，30℃条件下表达24h后，GSHS-NPG-SHS工程菌OD₆₀₀可以达到2.5。

将酶进行纯化：将发酵液于4℃、6000rpm离心10min，取菌体。加入10mL结合液A(20mM磷酸钠、0.5mM NaCl、20mM咪唑、1％甘油，用HCl调pH至7.4)充分重悬菌体，然后将离心管置于冰浴中，放入超声波细胞破碎仪中，超声破碎的条件为：工作时间4s，间隔时间4s，共计10min。将获得的破碎液进行低温高速离心，4℃、8000rpm离心30min，得粗酶液。用0.45μm微孔滤膜过滤，备用。

准备镍离子亲和层析柱，首先，在4℃环境下利用恒流泵，向柱子里泵入去离子水冲洗柱子(约6～12倍柱体积)，然后用10mL结合液A平衡柱子环境。待柱子下端的流出液与泵入柱子的低盐浓度缓冲液(500mmol/L NaCl，50mM PBS调节pH至6.0)pH值一致时(约需5倍柱体积缓冲液)，将得到的过膜粗酶液加入到柱子中。先用结合液A冲洗杂蛋白至基线平衡，再用洗脱液B(20mM磷酸钠、0.5mM NaCl、500mM咪唑)洗脱。收集吸收峰的洗脱液，测定酶活，获得达到电泳纯的目的蛋白。

测定实施例3构建的工程菌表达米曲霉果胶酸内切水解酶的活性，结果显示，工程菌诱导表达24h后，所生产的米曲霉果胶酸内切水解酶产量达到350U/mL。

实施例5果胶酸内切水解酶处理食品材料实验

用1％(v/v)次氯酸钠对土豆块茎进行消毒，再用无菌的生理盐水清洗20g土豆，在室温条件下晾干。将土豆块茎切成2mm×2mm×2mm小块。2g土豆块茎小块用1mL反应溶液(50mmol L NaAC HAc，2μLNPG表达样品，pH 5.0)37℃下处理0.5h。

如图4所示，图4中的1是利用果胶酸内切水解酶处理后得到的马铃薯块茎单细胞，2是未用果胶酸内切酶处理的马铃薯块茎组织切片，结果表明：果胶酸内切水解酶可以降解植物细胞之间的中胶层果胶，植物细胞会相互分离，显微镜镜检发现有单细胞被有效释放。

对比例1

(1)npg独立表达的工程菌的构建

化学合成如SEQ ID NO.4(其与实施例1中SEQ ID NO.1的区别在于未在序列两端添加多肽GSHS和SHS的核苷酸序列)所示的核苷酸序列(酶切位点为Nde I和Sal I)，将其与pBSCWZ载体进行酶连后，转化B.subtilis 800，将转化液涂布于含100μg/mL卡那霉素的LB平板，经过37℃培养过夜(10h～14h)至长出单克隆，挑取单克隆至含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中在37℃、200rpm下培养8h得到菌液，将菌液进行菌落PCR鉴定并进行测序，验证得到单克隆转化子npg/pBSCWZ/B.subtilis 800。

菌落PCR所用引物：

F2：5’CATATGGACTCCTGTACATTCAC3’(SEQ ID NO.7)，

R2：5’GTCGACTTAA CATGAAGCACCTG3’(SEQ ID NO.8)。

(2)蛋白NPG表达与酶活测定

具体实施方式参照实施例4，摇瓶发酵表达结果表明，30℃条件下表达24h后，果胶酸内切水解酶npg独立表达的工程菌OD₆₀₀为1.30，活性产量为50U/mL。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 盐城师范学院

<120> 一种表达果胶酸内切水解酶的工程菌及其应用

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1080

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtcttctt cttctcacca ccaccaccac caccaccact cttcttctga ctcctgtaca 60

ttcacctcgg ctgccgacgc taagtcgggc aagacctcat gttcaaccat cacactgagc 120

aacatcgagg tgcccgctgg tgagaccctt gatctgaccg gtctcaacga tggcaccaca 180

gtcatcttct cgggtgagac cacattcggc tacaaggagt gggagggtcc tctcatctcc 240

gtgtccggaa ccaacatcaa agtccagcag gcttccggtg ccaagattga cggagacgga 300

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gcccacaagc tggactcctc atccatcacc ggcctccaga tctacaacac ccccgtccag 420

ggcttcagca tccagtcgga caacctgaac atcacagatg tcaccatcga taactccgct 480

ggtaccgctg agggccacaa caccgacgcc ttcgatgtcg gctcaagcac ctacatcaac 540

attgacggtg ccaccgtgta caaccaggat gactgtctcg ccatcaactc aggatcgcac 600

atcacattca ccaacggcta ctgtgacggt ggccatggtc tctccatcgg ttcggtcggt 660

ggtcgtagcg acaacaccgt cgaggacgtg accatctcca actccaaggt cgtcaactcc 720

cagaacggtg tccgtatcaa gaccgtctac gatgccaccg gtaccgtctc caacgtcaag 780

ttcgaggata tcactctttc cggtattacc aagtacggac tcatcgtcga gcaggattac 840

gagaacggca gccccacagg tacccctacc aacggtatca aggtctcaga tatcaccttc 900

gacaaggtca ccggtaccgt cgagagcgac gctacagaca tctacattct ctgtggatca 960

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<210> 2

<211> 359

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ser Ser Ser Ser His His His His His His His His Ser Ser Ser

1 5 10 15

Asp Ser Cys Thr Phe Thr Ser Ala Ala Asp Ala Lys Ser Gly Lys Thr

20 25 30

Ser Cys Ser Thr Ile Thr Leu Ser Asn Ile Glu Val Pro Ala Gly Glu

35 40 45

Thr Leu Asp Leu Thr Gly Leu Asn Asp Gly Thr Thr Val Ile Phe Ser

50 55 60

Gly Glu Thr Thr Phe Gly Tyr Lys Glu Trp Glu Gly Pro Leu Ile Ser

65 70 75 80

Val Ser Gly Thr Asn Ile Lys Val Gln Gln Ala Ser Gly Ala Lys Ile

85 90 95

Asp Gly Asp Gly Ser Arg Trp Trp Asp Gly Lys Gly Gly Asn Gly Gly

100 105 110

Lys Thr Lys Pro Lys Phe Phe Tyr Ala His Lys Leu Asp Ser Ser Ser

115 120 125

Ile Thr Gly Leu Gln Ile Tyr Asn Thr Pro Val Gln Gly Phe Ser Ile

130 135 140

Gln Ser Asp Asn Leu Asn Ile Thr Asp Val Thr Ile Asp Asn Ser Ala

145 150 155 160

Gly Thr Ala Glu Gly His Asn Thr Asp Ala Phe Asp Val Gly Ser Ser

165 170 175

Thr Tyr Ile Asn Ile Asp Gly Ala Thr Val Tyr Asn Gln Asp Asp Cys

180 185 190

Leu Ala Ile Asn Ser Gly Ser His Ile Thr Phe Thr Asn Gly Tyr Cys

195 200 205

Asp Gly Gly His Gly Leu Ser Ile Gly Ser Val Gly Gly Arg Ser Asp

210 215 220

Asn Thr Val Glu Asp Val Thr Ile Ser Asn Ser Lys Val Val Asn Ser

225 230 235 240

Gln Asn Gly Val Arg Ile Lys Thr Val Tyr Asp Ala Thr Gly Thr Val

245 250 255

Ser Asn Val Lys Phe Glu Asp Ile Thr Leu Ser Gly Ile Thr Lys Tyr

260 265 270

Gly Leu Ile Val Glu Gln Asp Tyr Glu Asn Gly Ser Pro Thr Gly Thr

275 280 285

Pro Thr Asn Gly Ile Lys Val Ser Asp Ile Thr Phe Asp Lys Val Thr

290 295 300

Gly Thr Val Glu Ser Asp Ala Thr Asp Ile Tyr Ile Leu Cys Gly Ser

305 310 315 320

Gly Ser Cys Thr Asp Trp Thr Trp Ser Gly Val Ser Ile Thr Gly Gly

325 330 335

Lys Thr Ser Ser Lys Cys Glu Asn Val Pro Thr Gly Ala Ser Cys Ser

340 345 350

Ser His His His His Ser Ser

355

<210> 3

<211> 8660

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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gcatccagtc ggacaacctg aacatcacag atgtcaccat cgataactcc gctggtaccg 780

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gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaac acgggataat accgcgccac atagcagaac 3780

tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc 3840

gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt 3900

tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg 3960

aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attatgtaag 4020

cagacagttt tattgttcat gatgatatat ttttatcttg tgcaatgtaa catcagagat 4080

tttgagacac aacgtggctt tgttgaataa atcgaacttt tgctgagttg actccccgcg 4140

cgcgatgggt cgaatttgct ttcgaaaaaa aagcccgctc attaggcggg ctaaaaaaaa 4200

gcccgctcat taggcgggct cgaatttctg ccattcatcc gcttattatc acttattcag 4260

gcgtagcaac caggcgttta agggcaccaa taactgcctt aaaaaaatta cgccccgccc 4320

tgccactcat cgcagtactg ttgtaattca ttaagcattc tgccgacatg gaagccatca 4380

caaacggcat gatgaacctg aatcgccagc ggcatcagca ccttgtcgcc ttgcgtataa 4440

tatttgccca tagtgaaaac gggggcgaag aagttgtcca tattcgccac gtttaaatca 4500

aaactggtga aactcaccca gggattggct gagacgaaaa acatattctc aataaaccct 4560

ttagggaaat aggccaggtt ttcaccgtaa cacgccacat cttgcgaata tatgtgtaga 4620

aactgccgga aatcgtcgtg gtattcactc cagagcgatg aaaacgtttc agtttgctca 4680

tggaaaacgg tgtaacaagg gtgaacacta tcccatatca ccagctcacc gtctttcatt 4740

gccatacgaa attccggatg agcattcatc aggcgggcaa gaatgtgaat aaaggccgga 4800

taaaacttgt gcttattttt ctttacggtc tttaaaaagg ccgtaatatc cagctaaacg 4860

gtctggttat aggtacattg agcaactgac tgaaatgcct caaaatgttc tttacgatgc 4920

cattgggata tatcaacggt ggtatatcca gtgatttttt tctccatttt agcttcctta 4980

gctcctgaaa atctcgataa ctcaaaaaat acgcccggta gtgatcttat ttcattatgg 5040

tgaaagttgg aacctcttac gtgccgatca acgtctcatt ttcgccaaaa gttggcccag 5100

ggcttcccgg tatcaacagg gacaccagga tttatttatt ctgcgaagtg atcttccgtc 5160

acaggtattt attcgaagac gaaagggcat cgcgcgcggg gaattcccgg gagagctcga 5220

tatcgcatgc ggtacctcta gaagagcttg gagacaggta aaggataaaa cagcacaatt 5280

cccagaaaaa cacgatttag aaccctaaaa gacgaatttg actaactcat aaccgagagt 5340

taaaaagaac gagtcgagat cagggatgag tttataaaat aaaaaaagca ctgaaaggtt 5400

tcttttttga tgatttgaac tgttctttct tatcttgata catatagaaa ataacgtcat 5460

ttttatttta gttgctgaaa ggtgcgttga agtgttggta tgtatgtgtt ttaaagtatt 5520

gaaaacctta aaattggttg cacagaaaaa ccccatctgt taaagttata agtgactaaa 5580

caaataacta aatagatggg ggtttctttt aatattatgt gtcctaatag tagcatttat 5640

tcagatgaaa aatcaagggt tttagtggac aagacaaaaa gtggaaaagt gagaccatgg 5700

agagaaaaga aaatcgctaa tgttgattac tttgaacttc tgcatattct tgaatttaaa 5760

aaggctgaaa gagtaaaaga ttgtgctgaa atattagagt ataaacaaaa tcgtgaaaca 5820

ggcgaaagaa agttgtatcg agtgtggttt tgtaaatcca ggctttgtcc aatgtgcaac 5880

tggaggagag caatgaaaca tggcattcag tcacaaaagg ttgttgctga agttattaaa 5940

caaaagccaa cagttcgttg gttgtttctc acattaacag ttaaaaatgt ttatgatggc 6000

gaagaattaa ataagagttt gtcagatatg gctcaaggat ttcgccgaat gatgcaatat 6060

aaaaaaatta ataaaaatct tgttggtttt atgcgtgcaa cggaagtgac aataaataat 6120

aaagataatt cttataatca gcacatgcat gtattggtat gtgtggaacc aacttatttt 6180

aagaatacag aaaactacgt gaatcaaaaa caatggattc aattttggaa aaaggcaatg 6240

aaattagact atgatccaaa tgtaaaagtt caaatgattc gaccgaaaaa taaatataaa 6300

tcggatatac aatcggcaat tgacgaaact gcaaaatatc ctgtaaagga tacggatttt 6360

atgaccgatg atgaagaaaa gaatttgaaa cgtttgtctg atttggagga aggtttacac 6420

cgtaaaaggt taatctccta tggtggtttg ttaaaagaaa tacataaaaa attaaacctt 6480

gatgacacag aagaaggcga tttgattcat acagatgatg acgaaaaagc cgatgaagat 6540

ggattttcta ttattgcaat gtggaattgg gaacggaaaa attattttat taaagagtag 6600

ttcaacaaac gggccagttt gttgaagatt agatgctata attgttatta aaaggattga 6660

aggatgctta ggaagacgag ttattaatag ctgaataaga acggtgctct ccaaatattc 6720

ttatttagaa aagcaaatct aaaattatct gaaaagggaa tgagaatagt gaatggacca 6780

ataataatga ctagagaaga aagaatgaag attgttcatg aaattaagga acgaatattg 6840

gataaatatg gggatgatgt taaggctatt ggtgtttatg gctctcttgg tcgtcagact 6900

gatgggccct attcggatat tgagatgatg tgtgtcatgt caacagagga agcagagttc 6960

agccatgaat ggacaaccgg tgagtggaag gtggaagtga attttgatag cgaagagatt 7020

ctactagatt atgcatctca ggtggaatca gattggccgc ttacacatgg tcaatttttc 7080

tctattttgc cgatttatga ttcaggtgga tacttagaga aagtgtatca aactgctaaa 7140

tcggtagaag cccaaacgtt ccacgatgcg atttgtgccc ttatcgtaga agagctgttt 7200

gaatatgcag gcaaatggcg taatattcgt gtgcaaggac cgacaacatt tctaccatcc 7260

ttgactgtac aggtagcaat ggcaggtgcc atgttgattg gtctgcatca tcgcatctgt 7320

tatacgacga gcgcttcggt cttaactgaa gcagttaagc aatcagatct tccttcaggt 7380

tatgaccatc tgtgccagtt cgtaatgtct ggtcaacttt ccgactctga gaaacttctg 7440

gaatcgctag agaatttctg gaatgggatt caggagtgga cagaacgaca cggatatata 7500

gtggatgtgt caaaacgcat accattttga acgatgacct ctaataattg ttaatcatgt 7560

tggttacgta tttattaact tctcctagta ttagtaatta tcatggctgt catggcgcat 7620

taacggaata aagggtgtgc ttaaatcggg ccattttgcg taataagaaa aaggattaat 7680

tatgagcgaa ttgaattaat aataaggtaa tagatttaca ttagaaaatg aaaggggatt 7740

ttatgcgtga gaatgttaca gtctatcccg gcattgccag tcggggatat taaaaagagt 7800

ataggttttt attgcgataa actaggtttc actttggttc accatgaaga tggattcgca 7860

gttctaatgt gtaatgaggt tcggattcat ctatgggagg caagtgatga aggctggcgc 7920

tctcgtagta atgattcacc ggtttgtaca ggtgcggagt cgtttattgc tggtactgct 7980

agttgccgca ttgaagtaga gggaattgat gaattatatc aacatattaa gcctttgggc 8040

attttgcacc ccaatacatc attaaaagat cagtggtggg atgaacgaga ctttgcagta 8100

attgatcccg acaacaattt gattagcttt tttcaacaaa taaaaagcta aaatctatta 8160

ttaatctgtt cagcaatcgg gcgcgattgc tgaataaaag atacgagaga cctctcttgt 8220

atctttttta ttttgagtgg ttttgtccgt tacactagaa aaccgaaaga caataaaaat 8280

tttattcttg ctgagtctgg ctttcggtaa gctagacaaa acggacaaaa taaaaattgg 8340

caagggttta aaggtggaga ttttttgagt gatcttctca aaaaatacta cctgtccctt 8400

gctgattttt aaacgagcac gagagcaaaa cccccctttg ctgaggtggc agagggcagg 8460

tttttttgtt tcttttttct cgtaaaaaaa agaaaggtct taaaggtttt atggttttgg 8520

tcggcactgc cgacagcctc gcagagcaca cactttatga atataaagta tagtgtgtta 8580

tactttactt ggaagtggtt gccggaaaga gcgaaaatgc ctcacatttg tgccacctaa 8640

aaaggagcga tttacataat 8660

<210> 4

<211> 1011

<212> DNA

<213> Aspergillus oryzae

<400> 4

atggactcct gtacattcac ctcggctgcc gacgctaagt cgggcaagac ctcatgttca 60

accatcacac tgagcaacat cgaggtgccc gctggtgaga cccttgatct gaccggtctc 120

aacgatggca ccacagtcat cttctcgggt gagaccacat tcggctacaa ggagtgggag 180

ggtcctctca tctccgtgtc cggaaccaac atcaaagtcc agcaggcttc cggtgccaag 240

attgacggag acggatcccg gtggtgggat ggcaagggtg gcaacggtgg aaagacaaag 300

cccaagttct tctacgccca caagctggac tcctcatcca tcaccggcct ccagatctac 360

aacacccccg tccagggctt cagcatccag tcggacaacc tgaacatcac agatgtcacc 420

atcgataact ccgctggtac cgctgagggc cacaacaccg acgccttcga tgtcggctca 480

agcacctaca tcaacattga cggtgccacc gtgtacaacc aggatgactg tctcgccatc 540

aactcaggat cgcacatcac attcaccaac ggctactgtg acggtggcca tggtctctcc 600

atcggttcgg tcggtggtcg tagcgacaac accgtcgagg acgtgaccat ctccaactcc 660

aaggtcgtca actcccagaa cggtgtccgt atcaagaccg tctacgatgc caccggtacc 720

gtctccaacg tcaagttcga ggatatcact ctttccggta ttaccaagta cggactcatc 780

gtcgagcagg attacgagaa cggcagcccc acaggtaccc ctaccaacgg tatcaaggtc 840

tcagatatca ccttcgacaa ggtcaccggt accgtcgaga gcgacgctac agacatctac 900

attctctgtg gatcaggcag ctgtacagac tggacctggt ccggtgtctc catcacaggt 960

ggtaagacaa gctccaagtg tgagaacgtc cctacaggtg cttcatgtta a 1011

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

catatgtctt cttcttctca cc 22

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtcgacttaa gaagagtggt ggtggtgag 29

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

catatggact cctgtacatt cac 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gtcgacttaa catgaagcac ctg 23

<210> 9

<211> 7670

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt 60

taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgctgcc gccggggctg 120

tttgcgtttt tgccgtgatt tcgtgtatca ttggtttact tatttttttg ccaaagctgt 180

aatggctgaa aattcttaca tttattttac atttttagaa atgggcgtga aaaaaagcgc 240

gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcgg taccattata gtaaggagga catatgaaaa 300

acatgtcttg ctaacttgtt gtatcagtca ctctgttttt cagttttctc accataggcc 360

ctctcgctca tgcggccgaa ttcgtcgacc ccgggaagct tgcggccgcg atatctctcg 420

agcaccacca ccaccaccac taataaggat ccattatgag ttatgcagtt tgtagaatgc 480

aaaaagtgaa atcaggggga tcctctagag tcgagctcaa gctagcttgg tacgtaccag 540

atctgagatc acgcgttcta gaggtcgaaa ttcacctcga aagcaagctg ataaaccgat 600

acaattaaag gctccttttg gagccttttt ttttggagat tttcaacgtg aaaaaattat 660

tattcgcaat tccaagctct gcctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca 720

catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgcagatc acgcgccctg 780

tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc 840

cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg 900

ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg 960

gcacctcgac cccaaaaact tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga 1020

tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc 1080

caaactggaa caacactcaa ccctatctcg gtctattctt ttgatttata agggattttg 1140

ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt 1200

aacaaaatat taacgcttac aatttgatct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt 1260

atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa 1320

gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc 1380

gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag 1440

gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt 1500

gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg 1560

aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg 1620

ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 1680

taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac 1740

tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg 1800

gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt 1860

taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg 1920

tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc 1980

tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 2040

ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 2100

taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag 2160

tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt 2220

cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc 2280

gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc 2340

cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg 2400

ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctgc 2460

aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg 2520

atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc 2580

tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact 2640

gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc 2700

aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaac 2760

acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc 2820

ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac 2880

tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 2940

aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact 3000

catactcttc ctttttcaat attatgtaag cagacagttt tattgttcat gatgatatat 3060

ttttatcttg tgcaatgtaa catcagagat tttgagacac aacgtggctt tgttgaataa 3120

atcgaacttt tgctgagttg actccccgcg cgcgatgggt cgaatttgct ttcgaaaaaa 3180

aagcccgctc attaggcggg ctaaaaaaaa gcccgctcat taggcgggct cgaatttctg 3240

ccattcatcc gcttattatc acttattcag gcgtagcaac caggcgttta agggcaccaa 3300

taactgcctt aaaaaaatta cgccccgccc tgccactcat cgcagtactg ttgtaattca 3360

ttaagcattc tgccgacatg gaagccatca caaacggcat gatgaacctg aatcgccagc 3420

ggcatcagca ccttgtcgcc ttgcgtataa tatttgccca tagtgaaaac gggggcgaag 3480

aagttgtcca tattcgccac gtttaaatca aaactggtga aactcaccca gggattggct 3540

gagacgaaaa acatattctc aataaaccct ttagggaaat aggccaggtt ttcaccgtaa 3600

cacgccacat cttgcgaata tatgtgtaga aactgccgga aatcgtcgtg gtattcactc 3660

cagagcgatg aaaacgtttc agtttgctca tggaaaacgg tgtaacaagg gtgaacacta 3720

tcccatatca ccagctcacc gtctttcatt gccatacgaa attccggatg agcattcatc 3780

aggcgggcaa gaatgtgaat aaaggccgga taaaacttgt gcttattttt ctttacggtc 3840

tttaaaaagg ccgtaatatc cagctaaacg gtctggttat aggtacattg agcaactgac 3900

tgaaatgcct caaaatgttc tttacgatgc cattgggata tatcaacggt ggtatatcca 3960

gtgatttttt tctccatttt agcttcctta gctcctgaaa atctcgataa ctcaaaaaat 4020

acgcccggta gtgatcttat ttcattatgg tgaaagttgg aacctcttac gtgccgatca 4080

acgtctcatt ttcgccaaaa gttggcccag ggcttcccgg tatcaacagg gacaccagga 4140

tttatttatt ctgcgaagtg atcttccgtc acaggtattt attcgaagac gaaagggcat 4200

cgcgcgcggg gaattcccgg gagagctcga tatcgcatgc ggtacctcta gaagagcttg 4260

gagacaggta aaggataaaa cagcacaatt cccagaaaaa cacgatttag aaccctaaaa 4320

gacgaatttg actaactcat aaccgagagt taaaaagaac gagtcgagat cagggatgag 4380

tttataaaat aaaaaaagca ctgaaaggtt tcttttttga tgatttgaac tgttctttct 4440

tatcttgata catatagaaa ataacgtcat ttttatttta gttgctgaaa ggtgcgttga 4500

agtgttggta tgtatgtgtt ttaaagtatt gaaaacctta aaattggttg cacagaaaaa 4560

ccccatctgt taaagttata agtgactaaa caaataacta aatagatggg ggtttctttt 4620

aatattatgt gtcctaatag tagcatttat tcagatgaaa aatcaagggt tttagtggac 4680

aagacaaaaa gtggaaaagt gagaccatgg agagaaaaga aaatcgctaa tgttgattac 4740

tttgaacttc tgcatattct tgaatttaaa aaggctgaaa gagtaaaaga ttgtgctgaa 4800

atattagagt ataaacaaaa tcgtgaaaca ggcgaaagaa agttgtatcg agtgtggttt 4860

tgtaaatcca ggctttgtcc aatgtgcaac tggaggagag caatgaaaca tggcattcag 4920

tcacaaaagg ttgttgctga agttattaaa caaaagccaa cagttcgttg gttgtttctc 4980

acattaacag ttaaaaatgt ttatgatggc gaagaattaa ataagagttt gtcagatatg 5040

gctcaaggat ttcgccgaat gatgcaatat aaaaaaatta ataaaaatct tgttggtttt 5100

atgcgtgcaa cggaagtgac aataaataat aaagataatt cttataatca gcacatgcat 5160

gtattggtat gtgtggaacc aacttatttt aagaatacag aaaactacgt gaatcaaaaa 5220

caatggattc aattttggaa aaaggcaatg aaattagact atgatccaaa tgtaaaagtt 5280

caaatgattc gaccgaaaaa taaatataaa tcggatatac aatcggcaat tgacgaaact 5340

gcaaaatatc ctgtaaagga tacggatttt atgaccgatg atgaagaaaa gaatttgaaa 5400

cgtttgtctg atttggagga aggtttacac cgtaaaaggt taatctccta tggtggtttg 5460

ttaaaagaaa tacataaaaa attaaacctt gatgacacag aagaaggcga tttgattcat 5520

acagatgatg acgaaaaagc cgatgaagat ggattttcta ttattgcaat gtggaattgg 5580

gaacggaaaa attattttat taaagagtag ttcaacaaac gggccagttt gttgaagatt 5640

agatgctata attgttatta aaaggattga aggatgctta ggaagacgag ttattaatag 5700

ctgaataaga acggtgctct ccaaatattc ttatttagaa aagcaaatct aaaattatct 5760

gaaaagggaa tgagaatagt gaatggacca ataataatga ctagagaaga aagaatgaag 5820

attgttcatg aaattaagga acgaatattg gataaatatg gggatgatgt taaggctatt 5880

ggtgtttatg gctctcttgg tcgtcagact gatgggccct attcggatat tgagatgatg 5940

tgtgtcatgt caacagagga agcagagttc agccatgaat ggacaaccgg tgagtggaag 6000

gtggaagtga attttgatag cgaagagatt ctactagatt atgcatctca ggtggaatca 6060

gattggccgc ttacacatgg tcaatttttc tctattttgc cgatttatga ttcaggtgga 6120

tacttagaga aagtgtatca aactgctaaa tcggtagaag cccaaacgtt ccacgatgcg 6180

atttgtgccc ttatcgtaga agagctgttt gaatatgcag gcaaatggcg taatattcgt 6240

gtgcaaggac cgacaacatt tctaccatcc ttgactgtac aggtagcaat ggcaggtgcc 6300

atgttgattg gtctgcatca tcgcatctgt tatacgacga gcgcttcggt cttaactgaa 6360

gcagttaagc aatcagatct tccttcaggt tatgaccatc tgtgccagtt cgtaatgtct 6420

ggtcaacttt ccgactctga gaaacttctg gaatcgctag agaatttctg gaatgggatt 6480

caggagtgga cagaacgaca cggatatata gtggatgtgt caaaacgcat accattttga 6540

acgatgacct ctaataattg ttaatcatgt tggttacgta tttattaact tctcctagta 6600

ttagtaatta tcatggctgt catggcgcat taacggaata aagggtgtgc ttaaatcggg 6660

ccattttgcg taataagaaa aaggattaat tatgagcgaa ttgaattaat aataaggtaa 6720

tagatttaca ttagaaaatg aaaggggatt ttatgcgtga gaatgttaca gtctatcccg 6780

gcattgccag tcggggatat taaaaagagt ataggttttt attgcgataa actaggtttc 6840

actttggttc accatgaaga tggattcgca gttctaatgt gtaatgaggt tcggattcat 6900

ctatgggagg caagtgatga aggctggcgc tctcgtagta atgattcacc ggtttgtaca 6960

ggtgcggagt cgtttattgc tggtactgct agttgccgca ttgaagtaga gggaattgat 7020

gaattatatc aacatattaa gcctttgggc attttgcacc ccaatacatc attaaaagat 7080

cagtggtggg atgaacgaga ctttgcagta attgatcccg acaacaattt gattagcttt 7140

tttcaacaaa taaaaagcta aaatctatta ttaatctgtt cagcaatcgg gcgcgattgc 7200

tgaataaaag atacgagaga cctctcttgt atctttttta ttttgagtgg ttttgtccgt 7260

tacactagaa aaccgaaaga caataaaaat tttattcttg ctgagtctgg ctttcggtaa 7320

gctagacaaa acggacaaaa taaaaattgg caagggttta aaggtggaga ttttttgagt 7380

gatcttctca aaaaatacta cctgtccctt gctgattttt aaacgagcac gagagcaaaa 7440

cccccctttg ctgaggtggc agagggcagg tttttttgtt tcttttttct cgtaaaaaaa 7500

agaaaggtct taaaggtttt atggttttgg tcggcactgc cgacagcctc gcagagcaca 7560

cactttatga atataaagta tagtgtgtta tactttactt ggaagtggtt gccggaaaga 7620

gcgaaaatgc ctcacatttg tgccacctaa aaaggagcga tttacataat 7670

Claims (10)

1.一种果胶酸内切水解酶，其特征在于，所述果胶酸内切水解酶氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

2.编码权利要求1所述果胶酸内切水解酶的基因。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体表达权利要求1所述果胶酸内切水解酶或含有权利要求2所述基因。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

5.一种工程菌或细胞系，其特征在于，所述工程菌或细胞系能够表达权利要求1所述果胶水解酶，或表达权利要求2所述基因，或含有权利要求3～5任一所述表达载体。

6.根据权利要求5所述的工程菌或细胞系，其特征在于，所述工程菌或细胞系是以枯草芽孢杆菌B.subtilis 800为宿主。

7.一种制备权利要求1所述果胶水解酶的方法，其特征在于，所述方法是以权利要求5或6所述工程菌或细胞系为发酵菌株进行发酵产酶。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法是将权利要求5或6所述工程菌或细胞系进行活化培养得到菌液，将菌液进行诱导培养后得到发酵液，将发酵液进行纯化即得到权利要求1所述果胶水解酶。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述诱导培养是在菌液中加入终浓度为0.3～0.6mM IPTG进行诱导，15～25℃培养22～26h。

10.权利要求1所述果胶水解酶，或权利要求2所述基因，或权利要求3～4任一所述表达载体，或权利要求5～6任一所述工程菌或细胞系在食品工业、生物能源工业和植物活性物质药物成分提取过程中破碎细胞壁的应用。

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