CN110592051A - 木聚糖酶T-Xyn的突变体及其应用 - Google Patents

木聚糖酶T-Xyn的突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种木聚糖酶T‑Xyn的突变T‑XynT(38)S(50)C(122)C(166)。该突变体具有更好的耐热性和水解性能，其用于从玉米芯中产生的木寡糖的产率非常高，而且反应时间短至2个小时，远远短于已知的酶解反应时间，因此可用于从农业废弃物生产低聚木糖，具有很大应用潜力。

Description

木聚糖酶T-Xyn的突变体及其应用
技术领域
本发明属于酶工程领域，具体涉及木聚糖酶的突变，及其在利用农业废弃物生产木寡糖中的应用。
背景技术
全球每年从农产品生产和加工中产生的大量农业废弃物是木质纤维素生物质的主要组成部分。这种木质纤维素生物质是未充分利用资源，富含纤维素(40–50wt.％)，半纤维素 (20–40wt.％)和木质素(10–30wt.％)，它们是有用的可再生资源。纤维素、半纤维素和木质素形成了致密的结构网络，阻碍了它们的有效利用，因此大多数木质纤维素生物质通过不加控制的燃烧而被丢弃或破坏。此外，化石燃料的枯竭以及对环境和健康的日益关注促进基于农业废物的技术的发展，以生产生物化学物质(例如低聚木糖，聚合物)、生物复合材料和生物能源。寻找一种利用纤维素、半纤维素或木质素的有效方法对于充分利用农业废弃物至关重要(Hendriks,A.T.W.M.,Zeeman,G.,2009.Pretreatments to enhancethe digestibility of lignocellulosic biomass.Bioresource Technol.100,10-18.https://doi.org/10.1016/j.biortech. 2008.05.027.)。在农业废物中，半纤维素的主要成分是木聚糖。在半纤维素中充分利用木聚糖有助于缓解环境、生态和能源问题，并增加农业废物的附加值(Ahmed,A.Q.A.,Babalola, O.O.,McKay,T.,2018.Cellulase-andXylanase-Producing bacterial isolates with the ability to saccharify wheatstraw and their potential use in the production of pharmaceuticals andchemicals from lignocellulosic materials.Waste Biomass Valori.9,765-775.https://doi.org/10.1007/s12649-017-9849-5；Cherubini,F.,Stromman,A.H.,2011.Chemicals from lignocellulosic biomass:Opportunities,perspectives,andpotential of biorefinery systems.Biofuel. Bioprod.Bior.5,548-561.https:// doi.org/10.1002/bbb.297；Cunha,F.M.,Vasconcellos,V.M., Florencio,C.,Badino,A.C.,Farinas,C.S.,2017.On-Site production of enzymatic cocktails using a non-conventional fermentation method with agro-industrial residues as renewablefeedstocks. Waste Biomass Valori.8,517-526.https://doi.org/10.1007/s12649-016-9609-y.)。
木聚糖酶(endo-1,4-β-D-木聚糖酶，EC 3.2.1.8)是一类水解酶，可水解木聚糖的β-1,4- 连接的糖苷键以产生高附加值的产品，例如木寡糖(XOS)和木糖(X1)。低聚木糖(XOS) 作为一种功能性非消化性低聚糖，具有健康益处，例如有利于益生菌的繁殖，减少肠道干扰，改善生长性能和脂质代谢。化学和高温蒸煮热水解方法可用于XOS生产中，但XOS生产的最佳选择是使用酶。因此，木聚糖酶由于其裂解木聚糖内部连接的能力而在XOS生产中起着关键作用(F.Tang,et al.Improving the thermostability of Trichoderma reeseixylanase 2 by introducing disulfide bonds,Electron.J.Biotechn.26(2017)52-59.)。然而，将木聚糖酶用于 XOS生产得益于对木聚糖的酶促降解中所选木聚糖酶的特点。产生大量XOS的木聚糖酶，如木二糖和木三糖，并且不再进一步将XOS降解为木糖的木聚糖酶，被认为是产生XOS 的最佳酶。尽管一些木聚糖酶符合这些标准，但木聚糖酶的水解机理仍未解决，成为当前重要的研究课题(Q.Li,et al.Improving special hydrolysischaracterization into Talaromyces thermophilus F1208 xylanase by engineeringof N-terminal extension and site-directed mutagenesis in C-terminal,Int.J.Biol.Macromol.96(2017)451-458.)。此外，木聚糖酶的热稳定性是在XOS生产中使用这些酶时要考虑的重要属性，因为更高的温度会增加底物溶解度和水解速率，同时抑制微生物污染并降低生产成本(M.Watanabe,T.Matsuzawa,K.Yaoi, Rational proteindesign for thermostabilization of glycoside hydrolases based on structuralanalysis,Appl.Microbiol.Biot.102(20)(2018)8677-8684.)。因此，可以使用随机突变，定点突变或合理的蛋白质工程来改善木聚糖酶的特性和特征。
大多数研究已发现，不管采用何种突变方法，蛋白质修饰通常会导致疏水残基的亲水性、蛋白质折叠形成的大空腔、空间位阻或形成未配对的氢键供体或受体，或者一个二硫键发生变化，这种变化会影响木聚糖酶的特性(Y.F.Bu,Y.L.Cui,Y.Peng,M.R.Hu,Y.E.Tian,Y.Tao, B.Wu,Engineering improved thermostability of the GH11xylanase from Neocallimastix patriciarum via computational library design,Appl.Microbiol.Biot.102(8)(2018)3675-3685.)。通常，二硫键通过降低未折叠状态的熵来增强蛋白质的稳定性。目前，仅有少数报道研究了嗜热踝节菌木聚糖酶的水解产物特性和XOS产生。先前的研究表明，N末端或C末端对木聚糖酶的热稳定性有重要影响，尤其是当这些末端存在二硫键时(W.H.Yang,Y.Z.Yang,L.D. Zhang,H.Xu,X.J.Guo,X.Yang,B.Dong,Y.H.Cao,Improved thermostability of an acidic xylanase from Aspergillussulphureus by combined disulphide bridge introduction and proline residuesubstitution,Sci Rep-Uk 7(1587)(2017)；C.Li,J.F.Li,R.Wang,X.Q.Li,J.P.Li,C.Deng,M.C.Wu,Substituting both the N-terminal and"cord"regions of a xylanasefrom Aspergillus oryzae to improve its temperature characteristics,Appl.Biochem.Biotech.185(4) (2018)1044-1059.)。本发明人研究N和C末端对T-Xyn的热稳定性的影响时，无意间显示了N-末端和C-末端也影响Talaromyces thermophilus(T.thermophilus)F1208木聚糖酶T-Xyn 的水解特性(Q.Li,B.G.Sun,K.Xiong,C.Teng,Y.Q.Xu,L.J.Li,X.T.Li,Improving special hydrolysis characterization intoTalaromyces thermophilus F1208 xylanase by engineering of N-terminalextension and site-directed mutagenesis in C-terminal,Int.J.Biol.Macromol.96(2017)451-458.)。为研究获得更优异的木聚糖酶，本发明在上述基础上对此前获得的Talaromyces thermophilus F1208 xylanase(Q.Li,et al.Int.J.Biol.Macromol.96(2017) 451-458.)进行更深入的研究。
发明内容
本发明人进一步研究改变N-末端或C-末端的二硫键对嗜热踝节菌木聚糖酶突变体(木聚糖酶T-Xyn)的热稳定性和水解特性的影响，以努力改善木聚糖酶的性能并增加XOS的产量。所述木聚糖酶T-Xyn的原始序列如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
本发明人在深入研究的突变体中，木聚糖酶T-Xyn的第122位和第166位的氨基酸均替换为Ser比野生型T-Xyn具有更好的耐热性和水解性能。进而系统地分析了该嗜热踝节菌木聚糖酶突变体产生的水解产物的特性，并优化了通过高温蒸煮热水解预处理的玉米芯制备 XOS的水解条件，优化的条件可以有效地利用农业废料生产XOS。如此，最终完成了本发明。
因此，本发明首先提供一种木聚糖酶T-Xyn的突变体，在相应于以SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列所示木聚糖酶而言，第122位和第166位的氨基酸均替换为Ser。优选地的，所述木聚糖酶来自嗜热踝节菌。在一个具体的实例中，其具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
本发明进一步提供一种编码上述木聚糖酶T-Xyn的突变体的基因。包括所述基因的表达载体、或重组细胞系或重组菌。优选的是诱导表达载体。
本发明还提供一种利用上述突变体降解木聚糖的应用。具体地，将底物和酶液进行温育而降解。其所述木聚糖是榉木木聚糖、桦木木聚糖和燕麦木聚糖。
进一步本发明还提供利用上述突变体降解农业废弃物生产木寡糖中的应用。具体是将酶液与农业废弃物进行温育振荡反应。
具体的所述农业废弃物是作物秸秆，如谷物类作物秸秆，更具体地是玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆，最优选的是玉米秸秆，或玉米芯。
反应是在pH4.5-7.0的条件下进行，最优选pH值为5.5。
反应温度在30-70℃，进一步40-60℃，更优选45-55℃，最优选为50℃的条件下进行。
反应时振揺速度为100-200rpm，进一步120-180rpm，140-160rpm，最优为150rpm。
突变体的酶用量为3-25U/mL，进一步为4-15U/mL，最优选5-6U/mL。
在一个实施方式中，以玉米芯为原料。在进行反应前，对玉米芯进行预处理，具体的将玉米芯和蒸馏水在加热器内加热，于150-210℃，或160-200℃，或170-190℃，更优选175-185℃，具体最佳值为180℃进行预处理，预处理时间为20-40分钟，优选25-35分钟，最优选30分钟。
更进一步地，上述预处理后通过过滤分离固体部分(SF)和液体部分(LF)，用于反应的可以是其液体部分，也可以液体部分和固体部分的混合物，优选采用后者。
上述应用中的突变体优选通过重组方法获得，例如通过培养含有所述突变体基因的表达载体的重组菌，诱导表达所述突变体，再经纯化后使用。
本发明研究表明，XOS是通过高温蒸煮热水解工艺从玉米芯中获得的，XOS的收率为 13.9％。不使用催化剂进行高温蒸煮热水解被认为是生产XOS的一种环境友好策略，已被用于从各种木质纤维素生物质中获得XOS。此外，高温蒸煮热水解是释放半纤维素并引起木质素形态变化的有效预处理，半纤维素的这种释放促进木聚糖酶发挥降解作用。本发明的实验中，用本发明的突变体水解后，XOS产率达到21.8％，增幅为56.8％。因此，高温蒸煮热水解结合酶水解是生产XOS的有效方法；本发明突变体的酶解时间可以大大缩短，在优化的条件下，反应2小时后，XOS的产率更是高达26.6％。由于本发明突变具有更好的热稳定，且在酶促水解效率方面有明显的优势，酶促水解所需的时间(本发明中为2小时) 比大多数报道中所用的时间(≥12小时)要短得多，并且仅需少量的酶量也具有明显的优势。因此，基于产品组成和酶促水解效率，本发明的突变体T-XynC(122)C(166)在从玉米芯生产XOS方面具有很大的应用前景和应用价值。
附图说明
图1：图1A.T-xyn的二级结构序列对比(▲:Mutants；★：Active site)；图1B.T-xyn的三维结构；图1C.T-xyn的二级结构。
图2：(A)纯化的T-Xyn及其突变体的SDS-PAGE分析。泳道1,3,5,7：T-XynC(122)C(166)， T-XynT(38)S(50)，T-XynT(38)S(50)C(122)C(166)，T-Xyn；Lane2,4,6,8：纯化的T-XynC(122)C(166)，T-XynT(38)S(50)，T-XynT(38)S(50)C(122)C(166)，T-Xyn；
(B)验证二硫键形成。M道：低MW标准；泳道1和2：纯化的T-Xyn；泳道3和4：纯化的T-XynT(38)S(50)；泳道5和6：纯化的T-XynC(122)C(166)；泳道7和8：纯化的 T-XynT(38)S(50)C(122)C(166)。泳道1、3、5、7：具有10mM DTT的酶；2、4、6、8泳道：未处理的酶。
图3(A)以榉木木聚糖为底物的T-Xyn和突变体的最适pH和(B)pH稳定性。
图4(A)以榉木木聚糖为底物的T-Xyn和突变体最佳温度和(B)温度稳定性。
图5 T-Xyn和突变体水解木聚糖
图6 T-Xyn和突变体水解低聚木糖(X2、X3、X4)
图7使用T-XynC(122)C(166)水解玉米芯木聚糖产生XOS。(a)pH值对玉米芯木聚糖XOS产量的影响；(b)温度对玉米芯木聚糖生产XOS的影响；(c)酶浓度对玉米芯木聚糖产生XOS的影响；(d)时间对玉米芯木聚糖产生XOS的影响；(e)底物状态对玉米芯木聚糖产生XOS的影响；控制SF-LF，SF和LF以原始比例混合；SF-LF，经T-XynC(122)C(166) 水解后的SF和LF的混合物；控制LF，高温蒸煮热水解的液体部分；LF，经 T-XynC(122)C(166)水解后的液体部分。
具体实施方式
下面通过具体的实施方式或实施例对本发明作进一步的阐述，以便更好的理解本发明。
一.材料与方法
1.基因、菌株、培养基、载体和试剂
使用来自嗜热踝节菌F1208的T-Xyn(Q.Li,B.G.Sun,K.Xiong,C.Teng,Y.Q.Xu,L.J.Li, X.T.Li,Improving special hydrolysis characterization into Talaromycesthermophilus F1208 xylanase by engineering of N-terminal extension and site-directed mutagenesis in C-terminal,Int. J.Biol.Macromol.96(2017)451-458.)，构建了重组pET-28a-Ttxyn表达载体。
玉米芯(半纤维素含量为27.0％)购自中国山东省，保存在干燥处；大肠杆菌(DH3α)、大肠杆菌BL21(DE3)、质粒pMD18-T和pET28a(+)、Taq聚合酶、DNA凝胶提取试剂盒、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、氨苄青霉素和卡那霉素从Takara(日本东京)购买；限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶和高保真DNA聚合酶购自NEB Inc.(美国) 公司；NiSepharose HP亲和柱购自GE Healthcare Life Sciences；牛血清白蛋白购自Roche 公司；桦木、榉木和燕麦木聚糖购自Sigma-Aldrich公司；木二糖(X2)、木三糖(X3)、木四糖(X4)和木五糖(X5)购自Megazyme公司。大肠杆菌细胞在Luria-broth(LB，5g/L 酵母提取物，10g/L胰蛋白胨和10g/L NaCl)培养基中生长，用于基因克隆和蛋白质过表达。除非另有说明，否则所有其他化学品均为分析纯，可商购。
2.定点诱变和重组载体的构建
以pET-28a-Ttxyn为模板，突变基因T-xynC(122)C(166)，T-xynT(38)S(50)和 T-xynT(38)S(50)C(122)C(166)通过重叠延伸PCR扩增，这是用含有突变密码子的引物完成的(表S1和图1)。T-Xyn的Cys(122)和Cys(166)氨基酸替换为Ser，得到T-XynC(122)C(166)。T-XynT(38)S(50)由Thr(38)Cys和Ser(50)Cys突变产生，而T-XynT(38)S(50)C(122)C(166)具有四个突变位点：Thr(38)Cys，Ser(50)Cys，Cys(122)Ser和Cys(166)Ser(图1)。PCR反应条件为：94℃持续5分钟；94℃30s，55℃30s，72℃45s的30个循环；然后在72℃延伸10分钟。将突变基因插入NcoI和XhoI限制性酶切位点的pET-28a载体中，并将该载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，然后在含有40μg/mL卡那霉素的LB培养基上进行筛选，通过DNA测序证实了转化体。
表S1引物设计
F1208T(38)S(50)-r和F1208T(38)S(50)-f用于将Cy(50)和Thr(38)都替换为Cys。F1208C(122)-r和F1208C(122)-f，F1208C(1660-r和F1208C(166)-f用于分别用Ser取代Cys(122)和Cys(166)。突变位点以红色显示。引物Ttxyn11F和Ttxyn11R用于克隆嗜热Talaromyces thermophilus的T-Xyn全长。
3.序列和结构分析
使用BLAST软件比对核苷酸和蛋白质序列。用ClustalW进行多个序列比对。同源性建模是使用Discovery Studio 2.6(DS2.6)软件，其中使用得自嗜热霉菌的GH11木聚糖酶(PDB ID：9753433)作为模板(Gruber,K.,Klintschar,G.,Hayn,M.,Schlacher,A.,Steiner,W.,Kratky, C.,1998.Thermophilic xylanase from Thermomyceslanuginosus:High-resolution X-ray structure and modeling studies.Biochemistry37,13475-13485.https://doi.org/10.1021/bi980864l.)。DS2.6 的建模模块用于构建本研究中使用的木聚糖酶的三维模型。“模型数量”参数设置为10，其余参数为默认值。使用DS2.6中的PROCHECK程序和Verify Protein(Profiles-3D)程序，通过Ramachandran分析评估了木聚糖酶的最佳拟合模型。使用Discovery studio软件显示木聚糖酶T-Xyn、T-xynC(122)C(166)、T-XynT(38)S(50)、T-XynT(38)S(50)C(122)C(166)的结构。
4.木聚糖酶的表达和纯化
将转化体在含40μg/mL卡那霉素的LB培养基中于37℃、200rpm摇动培养。当菌液在600nm处的吸光度达到0.6-0.8时，向培养基中添加500mmol/L IPTG以诱导木聚糖酶表达。通过在4℃下以10000rpm离心10分钟收获细胞，将其重悬于50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5)中，并通过超声破碎。使用FPLC纯化系统(GE Healthcare)纯化粗酶样品，收集含有木聚糖酶活性的组分，并通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)检查样品的均一性。如Laemmi所述，使用12.5％的分离胶和4.5％的浓缩胶进行SDS-PAGE(U.K.Laemmli,Cleavage of structural proteins during the assembly of the headof bacteriophage T4.,Nature 227(5259)(1970)680-685.)。如Wakarchuk所述，确定了二硫键的形成(W.W.Wakarchuk,W.L.Sung,R.L.Campbell,A.Cunningham,D.C.Watson,M.Yaguchi, Thermostabilization of the Bacillus circulans xylanase by theintroduction of disulfide bonds, Protein engineering 7(11)(1994)1379-1386.)。
5.木聚糖酶活力测定和蛋白质含量测定
木聚糖酶活性根据Bailey报道的方法进行了稍加修改(M.J.Bailey,P.Biely,K.Poutanen, Interlaboratory testing of methods for assay of xylanaseactivity,J.Biotechnol.23(3)(1992) 257-270)。将含有0.9mL 1.0％(w/v)的榉木木聚糖和0.1mL适当稀释的酶溶液的反应混合物(50mmol/L柠檬酸盐缓冲液，pH 6.5)在55℃孵育10分钟。以木糖(X1)为标准，通过3,5-二硝基水杨酸(DNS)方法确定释放的还原糖的量(G.L.Miller,Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination ofreducing sugar,Anal.Chem.31(1959)426-428.)。木聚糖酶的活力(U)定义为：在上述条件下，每分钟水解木聚糖生成1μmol木糖所需要的酶量。牛血清白蛋白(BSA)被用作考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度的标准(Q.Li,B.G.Sun,K.Xiong, C.Teng,Y.Q.Xu,L.J.Li,X.T.Li,Improving special hydrolysis characterization into Talaromycesthermophilus F1208 xylanase by engineering of N-terminal extension and site-directed mutagenesis in C-terminal,Int.J.Biol.Macromol.96(2017)451-458)。
6.酶学性质的测定
最适pH通过研究55℃下pH4.0–8.0之间的酶活性来确定，使用的两种pH缓冲液(50mmol/L)为：pH 4.0-6.5的柠檬酸盐缓冲液和pH 7.0-8.0的磷酸盐缓冲液。为了确定pH稳定性，将木聚糖酶在上述不同缓冲液中于37℃孵育30分钟，置于冰水混合物中30分钟，按照酶活测定方法测定酶活力，以未处理的各重组木聚糖酶活力为100％，计算剩余酶活力，绘制剩余酶活力随pH值的变化曲线。通过在50mmol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 6.5)中于不同温度(40–95℃)下孵育酶来确定木聚糖酶活性的最佳温度。酶的热稳定性是通过将蛋白质在pH6.5(50mmol/L柠檬酸盐缓冲液)的不同温度(30–70℃)下孵育30分钟，然后在冰上冷却30分钟，并用酶活测定方法测量残留的木聚糖酶活性。相对活性计算为残余活性相对于初始活性的百分比，并用于评估pH或温度稳定性。为了确定T-XynC(122)C(166) 热变性半衰期，将T-XynC(122)C(166)在55℃下孵育4h，在各个时间点取出样品，并根据标准测定方法测定残留活性。
7.底物特异性，动力学参数和水解特性
纯酶以50mM pH 6.5的柠檬酸盐缓冲液配制的浓度为1％的榉木木聚糖、桦木木聚糖、燕麦木聚糖为底物，55℃下反应10min，按照上述描述的标准方法测定木聚糖酶对不同底物的酶活，以榉木木聚糖为底物时测定的酶活力为100％，分别计算木聚糖酶对各种底物的比酶活和相对酶活。
选取六个不同浓度的以50mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.5)制备的榉木木聚糖底物，并与纯化的木聚糖酶在55℃反应5分钟。所有实验进行三次平行。运用GraphPad Prism软件，使用动力学数据模拟米氏方程，计算Km和kcat值。
为了表征木聚糖酶的水解作用，将含有10mg/mL底物和5U/mL木聚糖酶的反应混合物在pH 6.5(50mmol/L柠檬酸盐缓冲液)、30℃和120rpm下孵育4h，然后在沸水浴中煮沸10分钟，然后在冰上冷却。将榉木木聚糖、桦木木聚糖和燕麦木聚糖用作底物。为了水解不同的XOS(X2-X4)，将反应混合物调整为包含1mg/mL的每种XOS和10U/mL木聚糖酶。样品用0.22μm的滤膜进行过滤，通过高效液相色谱(HPLC)和薄层色谱(TLC)分析每个样品。
8.玉米芯的高温蒸煮热水解预处理
所述高温蒸煮热水解反应器是带有温度控制器1.5L不锈钢高压釜(BR-300，JULABO，德国)。将玉米芯(100g)和蒸馏水(1L)装入反应器，然后使用电罩加热器将其加热。在达到目标温度时开始于180℃进行30分钟的预处理，通过过滤分离固体部分(SF)和液体部分(LF)，测量SF重量(包含一定量的水)和LF最终体积，获得了高温蒸煮热水解后 SF和LF之间的比例关系，根据比例，所需的SF计算为15mL LF。根据计算的重量，使用四等分方法将SF分为小部分。通过将各部分与15mL的LF充分混合而获得的混合物(SF-LF) 用于酶促水解反应。
9.使用预处理玉米芯优化木聚糖酶T-XynC(122)C(166)生产XOS的条件
为了生产XOS，使用上述方法将预处理的玉米芯(15mL SF-LF)通过T-XynC(122)C(166) 水解1h。考察不同条件(例如pH，温度，酶浓度，水解时间和底物状态)对酶促水解产率的影响。定期取出三个样品(每个15mL)，并在100℃下煮沸以使酶失活。使用HPLC检测XOS的形成。
10.HPLC和TLC分析XOS
样品离心和过滤后，通过HPLC(Waters e2695Alliance HPLC-2414 System，Waters)，Shodex Sugar KS-802填充柱(8mm ID×300mm，F6378020)和示差折光检测器(RID)对样品进行分析。用去离子水作为流动相，以1.0mL/min的流速将色谱柱保持在65℃，持续 20分钟。将样品点样到硅胶板(Merck)上，并在丁醇-乙酸-水(2：1：1，v/v/v)的溶剂中两次展开，然后用甲醇和硫酸的混合物(95：5，v/v)的溶液喷洒数秒钟，然后在105℃加热数秒钟。X1，X2，X3，X4和X5被用作标准。
11.数据分析
使用等式(1)计算XOS产率(％，w/w)：
P(Xi)(％)＝C(Xi)(g/L)×V(L)×100％/W(g)(1)
其中P(Xi)是XOS的收率(i＝2-3)，C(Xi)是反应混合物中XOS的浓度(i＝2-3)， V是LF的体积(L)，W是玉米芯中的半纤维素重量(g)。
每种处理一式三份进行，结果表示为平均值±标准偏差。所有统计分析均使用OriginPro 9.1和Excel 2016进行。
二、实验结果
1.定点诱变和结构建模
使用引物(表S1)和以pET-28a-Ttxyn模板进行诱变以生成T-XynC(122)C(166)、T-xynT(38)S(50)和T-xynT(38)S(50)C(122)C(166)。突变的氨基酸残基在图1A和图1B中突出显示。二硫键C38-50和C122-166显示在DS2.6根据PDB中1YNA预测的突变体的三维结构(图1C)(K.Gruber,G.Klintschar,M.Hayn,A.Schlacher,W.Steiner,C.Kratky,Thermophilic xylanase from Thermomyces lanuginosus:High-resolution X-raystructure and modeling studies., Biochemistry-Us 37(39)(1998)13475-13485.)。
2.野生型T-Xyn及其突变体的表达与纯化
用500mmoL/L的IPTG诱导转化体表达木聚糖酶，SDS-PAGE分析揭示了所有转化体的预期蛋白分子量为22.7kDa，表明转化的细胞产生了突变的木聚糖酶(图2A)。通过Ni2+亲和层析纯化后，SDS-PAGE分析表明蛋白纯化达到电泳纯，每种酶均以单条带迁移(图2A)。经DTT处理的情况下，变性的酶比含完整二硫键的相应酶结合更多的SDS，并且迁移速度更慢。如预期的那样，在10mmol/L DTT处理的情况下，T-XynT(38)S(50)和 T-XynT(38)S(50)C(122)C(166)的迁移速度比不经DTT处理时观察到的迁移慢，这是对T-Xyn 观察到的相似结果(图2B)。这些突变体的迁移模式不同于T-XynC(122)C(166)，因为该突变体不包含二硫键。值得注意的是，观察到了两个强度不同的谱带(图2B，泳道2和4)，由于存在二硫键，这两个泳道中较强的蛋白带迁移较快，而较弱的蛋白带迁移较慢，后者的迁移率与用DTT处理蛋白的迁移率一致，这可能是由于在样品制备过程中少量蛋白质样品二硫键断裂所致。这些结果验证了T-XynT(38)S(50)和T-XynT(38)S(50)C(122)C(166)中二硫键的形成以及T-XynC(122)C(166)中不存在二硫键。
3.野生型T-Xyn和突变体的最适pH和稳定性
T-XynT(38)S(50)和T-XynT(38)S(50)C(122)C(166)的最适pH值为6.0，低于T-Xyn(6.5) 和T-XynC(122)C(166)(6.5)(图3A)。所有木聚糖酶在酸性环境中均显示出稳定性。在pH 4.0-6.5下孵育30分钟后，除了野生型T-Xyn在pH 4.0外，它们的残留活性超过70％(图3B)。野生型和突变型酶的不同pH依赖性活性特征表明，在N端引入二硫键会影响酶在酸性环境中的pH适应性和稳定性。仅在少数蛋白质上显示了在N端使用二硫键改善酶在酸性条件下的稳定性。因此，在N-末端引入二硫键是提高木聚糖酶在低pH条件下稳定性的有效方法，并提高了该酶在涉及XOS生产的应用中的潜在用途。
4.最适温度和热稳定性
T-XynT(38)S(50)和T-XynT(38)S(50)C(122)C(166)的最佳温度为55℃，低于野生型T-Xyn (70℃)和T-XynC(122)C(166)(75℃)(图4A)。T-XynC(122)C(166)比野生型T-Xyn高约5℃， T-XynT(38)S(50)和T-XynT(38)S(50)C(122)C(166)比野生型T-Xyn低约15℃(图4A)。 T-XynT(38)S(50)C(122)C(166)的热稳定性最低，T-XynT(38)S(50)的稳定性比野生型T-Xyn弱，而T-XynC(122)C(166)最稳定。当在65℃下孵育时，T-XynT(38)S(50)(72.8％)表现出超过 70％的活性，而T-XynT(38)S(50)C(122)C(166)仅拥有约43.7活性％(图4B)。这两个突变体的热稳定性都比T-Xyn(90.7％)和T-XynC(122)C(166)(93.3％)弱。因此，引入二硫键可能不会改善蛋白质的热稳定性。
对T-Xyn的热稳定性有负面影响的二硫键(图4)可能会影响酶结构的稳定性，例如结构刚度增加或局部结构发生微小变化的结果。二硫键对酶热稳定性的贡献取决于它们在3D 结构中的位置。对于木聚糖酶T-Xyn与位于C端的二硫键相比，在N端的二硫键对热稳定性的负面影响更大，这表明木聚糖酶的结构在N端的二硫键比位于C末端的二硫键会影响热稳定性更多。因此，当试图改善酶的热稳定性时，必须仔细考虑二硫键的位置。
5.底物特异性和动力学参数
通过使用酶活标准测定方法系统和底物榉木木聚糖、桦木木聚糖和燕麦木聚糖来测定突变体的比活性(表2)。以榉木木聚糖为底物时，与野生型T-Xyn(525.9U/mg)和 T-XynC(122)C(166)(549.9U/mg)相比，T-XynT(38)S(50)和T-XynT(38)S(50)C(122)C(166)比活性较低，分别为299.6U/mg和179.7U/mg。使用其他两种底物时，观察到比酶活的相似趋势(表2)。结果表明，C末端的二硫键(T-Xyn中的C122-C166)对比酶活性的影响最小，而N末端的二硫键(T-XynT(38)S(50)C(122)C(166)中的C38-C50)导致比酶活性降低。因此，尽管C端的二硫键对比酶活性的影响较小，但C端二硫键的存在确实降低了N端的二硫键对酶的比活性的影响(T-XynT(38)S(50))。该结果表明，N-端和C-端二硫键之间存在某种形式的协同作用。总之，不同位置的二硫键对木聚糖酶活性的影响可能不同，这可能是由于对木聚糖酶催化域的影响不同。
与野生型T-Xyn相比，突变体的底物特异性没有变化。当以燕麦木木聚糖为底物时，所有木聚糖酶的活性最高，其次是榉木和桦木木聚糖。因此，尽管二硫键，特别是在N-末端，影响了特定的酶活性，但是对底物特异性没有显着影响。二硫键可以改变酶结合底物形成过渡态的速率，但是对酶和不同底物之间的相对亲和力或不同底物的相对催化速率影响最小。
测定了木聚糖酶对榉木木聚糖的动力学参数。所有突变体均显示底物亲和力增加，但催化速度降低。发现T-XynT(38)S(50)C(122)C(166)具有较高的底物亲和力，但催化速度较低，而野生型T-Xyn具有相反的特性。T-XynC(122)C(166)和T-XynT(38)S(50)具有相似的底物亲和力，但T-XynC(122)C(166)的反应速度高于T-XynT(38)S(50)(表3)。这些结果表明，C 末端的二硫键降低了底物亲和力并提高了反应速度，而N末端的二硫键增加了底物亲和力并降低了反应速度，当两个末端都存在二硫键时，效果很好，底物亲和力和反应速度被抵消。因此，C末端和N末端的二硫键对底物亲和力和反应速度的影响是不同的，这些结果表明末端之间存在协同作用。二硫键的引入降低了突变体的催化效率，尤其是当二硫键是在N 端引入时。这些结果与酶对榉木木聚糖的比活性一致。含二硫键的酶的柔性较小，与酶活性直接相关，并可以解释T-XynC(122)C(166)的催化效率要高于其他突变体。根据该原理，与 C末端的二硫键相比，N末端的二硫键对木聚糖酶的柔韧性影响更大，并且两者之间的协同作用削弱了N末端的二硫键对木聚糖酶柔韧性的影响。
表2原酶及突变体底物特异性的测定
表3原酶及突变体动力学参数的测定
6.水解特性
在木聚糖酶上添加二硫键可提高其热稳定性和酸碱耐受性。然而，二硫键对木聚糖酶水解特性的影响较少关注。在本发明中使用三种商业木聚糖(榉木木聚糖，桦木木聚糖和燕麦拼木聚糖)和三种XOS(X2，X3和X4)作为底物，以确定野生型T-Xyn和相应的突变体水解特性。为了更好地反映它们之间水解特性的差异，基于先前的热稳定性结果，研究了这些酶在30℃下的稳定性。结果表明，这些酶在30℃下12h相对稳定。因此，在30℃下研究了这些酶的水解特性，以避免水解产物之间的差异，因为在较高温度下酶促水解过程中酶的失活程度不同。
如图5所示，观察到这些木聚糖酶之间的水解特性差异。通常，当四种木聚糖酶水解相同的底物时，产物的组成和比例不同。二硫键的引入影响木聚糖酶的水解特性，以榉木木木聚糖为底物时，T-XynT(38)S(50)产生的X1量最高，而野生型T-Xyn产生的X2量最高(3.11 mg/mL)，分别比T-XynC(122)C(166)，T-XynT(38)S(50)和T-XynT(38)S(50)C(122)C(166)所产生的值高103.3％，47.4％和63.7％。T-XynT(38)S(50)C(122)C(166)水解榉木木聚糖产生最高水平的X3，比T-XynT(38)S(50)产生的高2.35倍。因此，对于榉木木聚糖，T-Xyn的C 或N端的二硫键增加了X1、X2和高聚合度(DP≥5)的含量，而减少了X4产生(图5A)。尽管观察到X3和X4的生成量减少了，但是与T-XynC(122)C(166)生成的XOS相比，在两个末端添加二硫键增加了额外XOS的生成，与野生型T-Xyn或T-XynT(38)S(50)C(122)C(166) 相比，DP≥5。但是，T-XynT(38)S(50)产生的X2的增加量少于野生型T-Xyn的增加量，大于T-XynT(38)S(50)C(122)C(166)的增加量(图5A)。结果表明，木聚糖酶的水解受到二硫键之间协同作用的影响。当以桦木木聚糖为底物时，在T-Xyn中引入二硫键可增加X1的含量，并降低X3和DP≥5的XOS含量。当两个末端均具有二硫键(即T-XynT(38)S(50))时，这一点尤其明显(图5B)。对于X2的产生，在N端添加二硫键会导致X2的生成减少，而在 C端添加二硫键对X2生成的影响可忽略不计。两个末端的二硫键增加了X2的含量，这可能是由于两个末端的二硫键的协同作用所致(图5B)。当使用燕麦木聚糖作为底物时，在两个末端引入二硫键均增加了X1和X2的含量，而DP≥3的XOS降低，当将榉木木聚糖用作底物时也观察到了这一点(图5C)。结果表明，二硫键之间存在协同作用。C末端的二硫键降低了产生的XOS的含量，这与以桦木木聚糖为底物时相似。尽管 T-XynT(38)S(50)C(122)C(166)减少了X2的含量，但与野生型T-Xyn相比，X2的产量减少了，当N末端引入二硫键时X3的产量增加了(图5C)。对于X3产生，两个二硫键的存在产生 X3，表明N和C末端的二硫键的作用不同，并且在它们之间具有抗性作用。两个末端的二硫键通过协同型效应促进了X2的产生(图5C)。显然，由于底物的结构和组成的差异，由同一酶水解的不同底物产生的水解产物的组成和比例将有所不同。二硫键的引入或去除影响木聚糖酶的水解特性，并且被发现取决于二硫键的位置和底物的类型，并且底物与二硫键的位置和存在之间存在相关性。这是因为通过引入或去除二硫键对酶的微变化对木聚糖底物具有不同的影响。与T-XynC(122)C(166)相比，当在两个末端都添加二硫键时，三个底物都产生X1，而T-XynC(122)C(166)仅在将榉木木聚糖用作底物时才产生X1(图5A-C)。N和C 末端的二硫键之间可能存在协同作用，这可能是因为引入二硫键会增强酶的刚性，这会影响底物结合或酶-底物复合物形成过程中酶发生的构象变化。在两个末端引入二硫键可增加X2 的产生，并降低DP≥3的XOS，这表明高DP XOS降解为较低DP或X1的XOS(图5A-C)。在C末端具有二硫键的木聚糖酶产生具有不同底物的不同水解产物。
突变型和野生型T-Xyn不会降解X2，并且在N端或C端引入二硫键的突变体显示的X3降解率高于T-XynC(122)C(166)(图6A和B)。当在两个末端都引入二硫键时，这种作用更加明显。与两个末端都带有二硫键的突变体的结果相比，当在N或C端引入二硫键时， X3的水解速率较低，表明二硫键具有协同作用，以促进X3水解(图5B)。在四种木聚糖酶之间，X4的降解没有差异。X4迅速降解为X3和X2，然后X3逐渐降解为X2(图6C)。
7.T-XynC(122)C(166)从玉米芯生产XOS
7.1初始pH值对XOS生产的影响
在pH4.5-7.0下，在50℃和150rpm的条件下研究了初始pH对XOS产量的影响。此过程的最适pH值可能受到多种现象的影响，包括木聚糖酶活性和木聚糖溶解度。在pH 4.5-7.0 之间未观察到明显变化，在pH 5.5下获得了最大的XOS产量(图7a)。这归因于 T-XynC(122)C(166)在此pH范围内稳定的活性。值得注意的是，XOS是通过高温蒸煮热水解工艺从玉米芯中获得的，XOS的收率为13.9％。不使用催化剂进行高温蒸煮热水解被认为是生产XOS的一种环境友好策略，已被用于从各种木质纤维素生物质中获得XOS。此外，高温蒸煮热水解是释放半纤维素并引起木质素形态变化的有效预处理。半纤维素的这种释放促进木聚糖酶活性。用T-XynC(122)C(166)水解后，XOS产率为21.8％，增幅为56.8％。因此，高温蒸煮热水解结合酶水解是生产XOS的有效方法。
7.2温度对XOS生产的影响
温度是酶作用的重要参数，研究了温度对XOS生产的影响。如图7b所示，在不同温度下反应1小时的XOS产量没有显着差异，表明T-XynC(122)C(166)表现出较宽的活性温度范围。这些结果可能归因于T-XynC(122)C(166)表现出高水解效率。
7.3酶量对XOS产生的影响
评估了酶量(5-25U/mL)的影响(图7c)。将底物与酶孵育1小时后，木聚糖酶浓度从5U/mL增加到15U/mL，XOS产量从21.8％增加到22.6％。用较高的酶量温育提高了产量，但没有实质性提高，表明增加负荷是不利的。过量的酶负载可能会阻碍底物与酶之间的相互作用，从而导致产物收率降低。酶浓度大于5U/mL时，XOS产量仅略有增加，进一步证明了该酶的高效率。因此，在随后的实验中，选择5.0U/mL作为XOS产生的酶浓度。
7.4水解时间对XOS生产的影响
图7d显示了使用5.0U/mL木聚糖酶在50℃下从SF-LF混合物中生产XOS。增加水解时间，产生更高水平的XOS。2小时的水解时间足以实现最高的XOS产量。孵育2小时后， XOS的产率高达26.6％。XOS的产生速率在2小时后下降，在孵育8小时后XOS的产量仅增加到26.7％。在2小时后观察到的活性降低可能是由于木聚糖链中易于接近的水解位点数量减少或由于终产物抑制导致木聚糖酶活性降低。生产XOS的时间较短可以减少释放单体糖(不需要的木糖)的机会，而不会显着影响XOS的产量。与大多数以前的报道相比，由于使用了热稳定的木聚糖酶，该研究的水解时间短(2h)。
7.5底物状态对XOS生产的影响
按照原始比例，水解的底物是SF和LF的混合物。图7e比较了两种不同的水解底物SF-LF和LF的XOS产率。当LF用作水解底物时，XOS的产率为19.6％，当使用SF-LF 作为水解底物时，XOS产率较高(26.4％)，与仅使用LF的产率相比增加了34.7％。本发明的突变体在酶促水解效率方面有明显的优势。酶促水解所需的时间(本发明中为2小时) 比大多数报道中所用的时间(≥12小时)要短得多，并且仅需少量的酶量是关键优势。因此，基于产品组成和酶促水解效率，T-XynC(122)C(166)在从玉米芯生产XOS方面具有潜在的商业价值。
序列表
<110> 北京工商大学
<120>木聚糖酶T-Xyn的突变体及其应用
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<400> 7
gtcgataggt gctaccgtcg ctctc 25
<210>8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列：F1208C(122)-f
<220>
<223>
<400>8
gagagcgacg gtagcaccta tcgac 25
<210>9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列：F1208C(166)-r
<220>
<223>
<400>9
cgaagtggct gcccgtctgg acggt 25
<210>10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列：F1208C(166)-f
<220>
<223>
<400>10
accgtccaga cgggcagcca cttcg 25
<210>11
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列：Ttxyn11F
<220>
<223>
<400>11
catgccatgg gtttcccgac agggaatact acggagct 38
<210>12
<211>34
<212> DNA
<213> 人工序列：Ttxyn11R
<220>
<223>
<400>12
ccgctcgagg ccgacgtcag cgacggtgat gcga 34

Claims (10)

1.一种木聚糖酶的突变体，其特征在于，在相应于以SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列所示木聚糖酶而言，其第122位和第166位的氨基酸均替换为Ser，优选地的，所述木聚糖酶来自嗜热踝节菌。
2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，其具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
3.编码如权利要求1或2所述的突变体的基因。
4.含有如权利要求3所述的基因的表达载体、或重组细胞系，或重组菌。
5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，其是诱导表达载体。
6.如权利要求1或2所述的突变体在降解木聚糖中的应用。优选地，将底物和酶液进行温育而降解，所述木聚糖是榉木木聚糖、桦木木聚糖和燕麦木聚糖之一或其组合。
7.如权利要求1或2所述的突变体在降解农业废弃物生产木寡糖中的应用，优选地，所述的突变体通过基因重组方法获得。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，是将酶液与农业废弃物进行温育振荡反应。其中，优选地所述农业废弃物是作物秸秆，如谷物类作物秸秆，更具体地是玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆，最优选的是玉米秸秆，或玉米芯。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述反应在pH4.5-7.0的条件下进行，最优选pH值为5.5；反应温度在30-70℃，进一步40-60℃，更优选45-55℃，最优选为50℃的条件下进行；反应时振揺速度为100-200rpm，进一步120-180rpm，140-160rpm，最优为150rpm；突变体的酶用量为3-25U/mL，进一步为4-15U/mL，最优选5-6U/mL。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，在进行反应前，对玉米芯进行高温蒸煮热水解预处理，具体的是将玉米芯和蒸馏水在加热器内加热，于150-210℃，或160-200℃，或170-190℃，更优选175-185℃，具体最佳值为180℃进行预处理，预处理时间为20-40分钟，优选25-35分钟，最优选30分钟；更进一步地，上述预处理后通过过滤分离固体部分和液体部分，用于反应的是其液体部分，或液体部分和固体部分的混合物，最优选为液体部分和固体部分的混合物。
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