CN104962594B - 一种提高黑曲霉糖化酶葡萄糖转化率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高黑曲霉糖化酶葡萄糖转化率的方法。利用失活agdB基因后的黑曲霉分泌的糖化酶与脱支酶复合对淀粉糖进行转化。通过失活α葡萄糖苷酶agdB基因，不仅不降低黑曲霉发酵糖化酶活力，且可以直接用于与脱支酶复合应用于葡萄糖转化，显著提高DX值。

Description

一种提高黑曲霉糖化酶葡萄糖转化率的方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种提高黑曲霉糖化酶葡萄糖转化率的方法。

背景技术

糖化酶(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC 3.2.1.3)是催化淀粉或寡糖等多糖分子的非还原端释放出D-葡萄糖的酶。在商业上，糖化酶是由包括黑曲霉和米曲霉在内的几种丝状真菌和酵母生产的。丝状真菌作为细胞工厂生产有价值的产品(如酶)为人们熟知，其中尤以黑曲霉和米曲霉由于‘通常认为安全的’(Generally Recognized As Safe，GRAS)的特征而被广泛用于表达宿主，从而用于生产食品添加剂。

现有的高浓度葡萄糖浆及果糖浆都是通过酶法水解淀粉得到的。具体地，在中温或高温淀粉酶液化淀粉后，使用糖化酶及脱支酶(如普鲁兰酶或异淀粉酶)协同作用，可获得高浓度葡萄糖浆，接着通过异构酶转化为果糖。糖浆中葡萄糖含量占干物质的百分率可以用DX来表示。毫无疑问，DX值越高淀粉转化率越高，这也是众多企业及研究机构的共同追求。中国年产淀粉糖已经超过2000万吨，因此DX即使提高0.1所带来的经济效益也是十分巨大的。研究发现，在淀粉液化液相同的情况下，糖化酶及脱支酶的性质、加入量及反应时间决定DX值的大小。一般地，商业化应用于淀粉糖的糖化酶是黑曲霉经发酵，后处理获得。但是，发酵和后处理过程工艺不同，最终的产品会影响DX值大小。这是由于发酵过程中，黑曲霉除表达大量糖化酶外，还会表达其他酶，如蛋白酶，淀粉酶和α葡萄糖苷酶(工业上称为转苷酶或异麦芽糖合酶)等，这些酶对于糖浆生产的作用各不相同，如酸性淀粉酶是有利的，会提高DX值；而转苷酶对糖化是不利的，会降低DX值。专利CN 100443589C提供一种高转化率高纯度糖化酶浓缩液的生产方法，最终提高淀粉转化率。这种方法涉及到新的发酵培养基，以及除掉转苷酶的方法。但是，发明人注意到，在需要额外处理设备的同时，这种除转苷酶方法需要在发酵液中加入酸使得pH为2.8-3.2，并要加入钠基膨润土进行吸附转苷酶。在增加设备占用率及处理成本同时，也会降低糖化酶回收率，且其他有利酶如中性和酸性淀粉酶也会被少量去除。此外，处理后的酸水对环境也有潜在危害。丝状真菌表达的α葡萄糖苷酶可以水解麦芽糖及其他寡糖，从而生成葡萄糖，但是在产物葡萄糖浓度较高的条件下，一些α葡萄糖苷酶又会有合成功能，具有转苷酶作用，从而生成异麦芽糖等寡糖，因此某些α葡萄糖苷酶对于制备高浓度糖浆是有害的。研究发现构巢曲霉中有5至7个α葡萄糖苷酶(Takashi NAKAMURA等，Biosci.Biotechnol.Biochem.,70(10),2363–2370,2006)，而黑曲霉中的同源物至少有5个(Takashi NAKAMURA等Mol Genet Genomics(2008)279:545–561)，分别为agdA，agdB，agdE，agdF，agdG。在商业上，大量表达产生的黑曲霉agdA，以商品形式如Transglucosidase L-500(丹尼斯科)出售，以应用于异麦芽低聚糖生产，证明agdA有较强的转苷能力，有可能对于生产高浓度葡萄糖是有害的。

CN1705742A公开了一类真菌类微生物，其中主要的异麦芽糖合酶的基因缺失。在导入外源基因时，能够有效提高该基因的表达，从而提高目的蛋白的生产率。但是该专利中没有记载异麦芽糖合酶的基因缺失将使得其产生的目的蛋白用于葡萄糖转化时，能显著提高DX值。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，对表达糖化酶的黑曲霉失活对糖化有害的α葡萄糖苷酶agdB基因，在任何发酵培养基中都不会表达agdB，也省去后期除转苷酶工艺，从而降低生产成本并提高淀粉糖转化率。

失活α葡萄糖苷酶agdB基因的丝状真菌在提高淀粉糖转化率中的应用。

其中，所述的丝状真菌选自黑曲霉。

所述的α葡萄糖苷酶agdB基因编码SEQ ID NO.1所示的α葡萄糖苷酶。

一种提高黑曲霉糖化酶葡萄糖转化率的方法，利用失活agdB基因后的黑曲霉分泌的糖化酶对淀粉糖进行转化；优选利用失活agdB基因后的黑曲霉分泌的糖化酶与脱支酶复合对淀粉糖进行转化。通过失活α葡萄糖苷酶agdB基因，不仅不降低黑曲霉发酵糖化酶活力，且可以直接用于葡萄糖转化或与脱支酶复合应用于葡萄糖转化，显著提高DX值。

具体地，通过失活agdB基因，如SEQ ID NO.1所示蛋白序列失去表达能力，达到提高淀粉糖转化率目的。基因失活是指通过对基因表达盒完全或部分缺失、通过插入失活或通过使得基因对于它的预期目的无功能化的任何其他手段而实现，这样基因被阻止而不能表达功能蛋白。

一方面，agdB的失活可以通过部分或完全缺失agdB启动子序列(SEQ ID NO.2所示)，也可以通过部分或完全缺失agdB编码序列(SEQ ID NO.3所示)，还可以通过插入无意序列(如抗性基因序列)到agdB启动子或编码序列来完成；另一方面，也可以通过RNA干扰的方式消除agdB的表达。

为了失活agdB基因，优选的方法是使用同源重组方法，即包含有选择标记agdB表达盒5’及3’端侧翼序列及选择标记的线状或环化片段，通过转化及标记物筛选获得agdB失活菌株。曲霉转化技术原理遵循非同源断裂修复机理，造成利用同源重组进行定点敲除/插入基因比例很低，成功率低下。更优选的方案是改进后的同源重组方法，即Kim(Kim等,Biochem.Biophys.Res.Commun 390(3):983–988,2009)等人描述的方法(Double-JointPCR with Split DominantSelectable Markers)。具体地，为完成同源重组，需两段序列共同转化。第一段序列由agdB 5’侧翼序列与第一段选择标记基因链接，第二段序列由agdB表达盒3’侧翼序列与及第二段选择标记基因顺序链接。第一段与第二段在选择标记部分具有至少100bp的同源序列，优选100-1000bp。将两段序列共同转化，只有侧翼序列及选择标记三段同源序列同时发生重组，才会出现阳性转化子。大大提高了同源重组的转化率。更优选的方案如Delmas(Appl Environ Microbiol.2014,80(11):3484-7)等人描述的方法，具体地，利用环状DNA载体，包含有agdB 5’及3’侧翼序列，选择标记，反向选择标记(或称为负向选择标记)，以及大肠杆菌复制序列。将环状载体转入到黑曲霉中，通过正向选择比较获得重组菌株，再经过反向选择标记获得无痕敲除(或失活)的菌株。

本发明所述同源重组载体优选地含有一个或多个(几个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))或编码上述同源蛋白的基因。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉(Aspergillusnidulans)的amdS和细菌hph。

选取黑曲霉agdB侧翼5’及3’100-5000bp序列作为同源侧翼序列，优选选取黑曲霉agdB侧翼侧翼5’及3’1000-3000bp序列作为同源侧翼序列，进一步优选选取黑曲霉agdB侧翼侧翼5’及3’2000bp序列作为同源侧翼序列。

所述的同源重组方法包括同源重组质粒的克隆，以及原生质体的转化。本发明中原生质体转化为本领域常规方法。

有益效果：

本发明人发现，失活基因agdA后的黑曲霉分泌的糖化酶在应用于淀粉糖转化时，并没有提高转化率DX。然后，本发明人惊奇地发现，通过失活黑曲霉agdB基因后，黑曲霉糖化酶发酵液可直接用于淀粉液化液的糖化反应，并显著提高DX值，从而省去去除转苷酶过程。

本发明通过对表达糖化酶的黑曲霉失活对糖化有害的α葡萄糖苷酶agdB基因，在任何发酵培养基中都不会表达agdB，也省去后期除转苷酶工艺，从而降低生产成本并提高淀粉糖转化率。

附图说明

图1 pHphtk质粒图谱

图2 pAgdAhphtk质粒图谱

图3 pAgdBhphtk质粒图谱

具体实施方式

实施例1 pHphtk质粒的构建

该质粒包含以下3部分，由GenScript公司构建完成，质粒图谱见图1。

(1)pUC57质粒XbaI-PciI双酶切后得到的2305bp片段；

(2)hph基因表达盒，序列见SEQ ID NO.4；

(3)HSV-tk表达盒，序列见SEQ ID NO.5。

实施例2整合质粒pAgdAhphtk和pAgdBhphtk的构建

用于agdA基因敲除的整合质粒称为：pAgdAhphtk，其构建方法如下：

将pHphtk质粒通过vector-F与vector-R引物进行线性化；同时分别以agdA-5’-F与agdA-5’-R、agdA-3’-F与agdA-3’-R为引物，以黑曲霉基因组DNA为模板，PCR扩出带有40bp重组臂的agdA 5’端侧翼2kb DNA片段和agdA 3’端侧翼2kb DNA片段；然后将线性化的pHphtk载体与agdA 5’端侧翼2kb DNA片段、agdA 3’端侧翼2kb DNA片段通过GibsonMaster Mix Kit(E2611，New England Biolabs)进行重组，得到整合质粒pAgdAhphtk，质粒图谱见图2。

用于agdB基因敲除的整合质粒称为：pAgdBhphtk，其构建方法如下：

将pHphtk质粒通过vector-F与vector-R引物进行线性化；同时分别以agdB-5’-F与agdB-5’-R、agdB-3’-F与agdB-3’-R为引物，以黑曲霉基因组DNA为模板，通过PCR扩出带有40bp重组臂的agdB 5’端侧翼2kb DNA片段和agdB 3’端侧翼2kb DNA片段；然后将线性化的pHphtk载体与agdB 5’端侧翼2kb DNA片段、agdB 3’端侧翼2kb DNA片段通过GibsonMaster Mix Kit(E2611，New England Biolabs)进行重组，得到整合质粒pAgdBhphtk，构建好的质粒图谱见图3。

agdA、agdB基因侧翼序列PCR引物是以GeneBank公布的AspergillusnigerCBS513.88基因组序列为基础设计的。agdA 5’端侧翼2kb DNA序列见SEQ ID NO.6，agdA 3’端侧翼2kb DNA序列见SEQ ID NO.7；agdB 5’端侧翼2kb DNA序列见SEQ ID NO.8，agdB 3’端侧翼2kb DNA序列见SEQ ID NO.9。

相关引物序列如下：

实施例3 pAgdAhphtk/pAgdBhphtk质粒的转化

本实施例出发菌株为CBS513.88，来自于购自荷兰真菌菌种保藏中心(CBS-KNAWFungal Biodiversity Centre)。

采用原生质体转化法，具体操作步骤如下：

原生质体的制备：在营养丰富的TZ液体培养基(牛肉膏粉0.8％；酵母浸膏0.2％；蛋白胨0.5％；NaCl 0.2％；蔗糖3％；pH5.8)中培养黑曲霉菌丝体。通过mira-cloth(Calbiochem公司)从培养液中过滤菌丝体并用0.7M NaCl(pH5.8)洗涤，菌丝体滤干后转移至含纤维素酶1％(Sigma)、蜗牛酶1％(Sigma)和溶壁酶(Sigma)0.2％的酶解液(pH5.8)中，30℃，65rpm酶解3h。然后将含有原生质体的酶解液置于冰上并用四层擦镜纸过滤，得到的滤液经3000rpm，soft&4℃离心10min后，弃上清；附着在管壁上的原生质体用STC溶液(1MD-Sorbitol、50mM CaCl₂、10mM Tris，pH7.5)洗涤一次，最后把原生质体重悬于适量的STC溶液中。

原生质体的转化：将环状pAgdAhphtk/pAgdBhphtk质粒10μl(浓度为：1μg/μl)加入到100μl原生质体悬浮液中混匀后室温放置25min；然后分3次共加入900μl PEG溶液，混匀后室温放置25min；3000rpm，常温离心10min，弃上清，原生质体附着于管壁上，将其重悬于1ml STC溶液中。把该悬浮液与预先降温至45℃左右的TB3培养基(酵母浸膏0.3％、酸水解酪蛋白0.3％、蔗糖20％、琼脂0.7％)混合并铺平板；待平板凝固后放入34℃培养箱中培养；24h后在平板上再铺一层含300ng/μl潮霉素(Hygromycin)的TB3固体培养基(琼脂1％，其余成分同上)，继续将平板置于34℃培养箱中培养4-5天后，长出上层培养基的转化子称为整合转化子。

实施例4整合转化子的传代与鉴定

随机挑取几个整合转化子分别传代于含300ng/μl潮霉素的TB3固体培养基上，34℃恒温培养3天后，收集菌丝体用液氮冷冻后研磨粉碎，然后用真菌基因组提取试剂盒(杭州博日)提取整合转化子基因组DNA，最后对整合转化子基因组DNA进行PCR鉴定，从而得到阳性整合转化子。pAgdAhphtk质粒整合转化子鉴定引物为：agdA-upstream-F与hph-inside-R、puc57-inside-F与agdA-downstream-R；pAgdBhphtk质粒整合转化子鉴定引物为：agdB-upstream-F与hph-inside-R、puc57-inside-F与agdB-downstream-R。

相关引物序列如下：

实施例5阳性整合转化子5-F2dU筛选与敲除转化子的鉴定

从传代后的阳性整合转化子平板上挑取适量碎菌丝放于含1ml无菌水的离心管中，涡旋振荡使之形成菌丝悬液，取100μl涂布于含10μM 5-F2dU(5-氟-2-脱氧尿嘧啶核苷，厂家：Sigma)的TB3固体平板上，34℃恒温培养4-5天，即有敲除转化子长出。

敲除转化子在10μM 5-F2dU平板上传两代(防止转化子不纯)后，在300ng/μl潮霉素平板上应不能生长；然后对敲除转化子基因组DNA进行PCR鉴定，引物序列及基因组提取方法同实施例4。

agdA敲除转化子鉴定引物为agdA-upstream-F与agdA-downstream-R，若PCR产物大小为4.3kb且测序正确，则agdA基因敲除成功，得到ΔagdA型菌株。

agdB敲除转化子鉴定引物为agdB-upstream-F与agdB-downstream-R，若PCR产物大小为4.3kb且测序正确，则agdB基因敲除成功，得到ΔagdB型菌株。

实施例6ΔagdA型菌株和ΔagdB型菌株的摇瓶发酵

将实施例5中的ΔagdA型菌株和ΔagdB型菌株分别接种至含50ml YPM培养基(2g/l酵母提取物，2g/1蛋白胨，2％的麦芽糖)的摇瓶中，34℃，220rpm培养六天。按照国标法测试上清液的糖化酶活性，同时以出发菌株糖化酶活力作为对照。如表1所示，失活agdA和agdB后，糖化酶活力并没有受到影响。

表1ΔagdA型菌株、ΔagdB型菌株与出发菌株糖化酶活力对比

实施例7ΔagdA型菌株和ΔagdB型菌株的发酵液用于糖化实验

使用32％DS的液化淀粉，pH 4.3和60℃进行糖化实验。使用的糖化酶分别来自于实施例6中的发酵液以及HighDEX^TM Ultra 3.0高效复合糖化酶(以下称Ultra 3.0)，Ultra3.0由南京百斯杰生物工程有限公司生产，由黑曲霉发酵，经除转苷酶工艺而纯化的糖化酶与普鲁兰酶(一种脱支酶)复配而成的商品。Ultra 3.0的加量为0.45kg/tds(450BGU/g)，发酵液与脱支酶的添加活力总量与Ultra 3.0相同。将所述试验一式三份进行反应，不同时间段取样检测糖化DX值(即DP1)，数据如表2显示。ΔagdB菌株发酵液与Ultra 3.0复合糖化酶显示出相似的性能，显著优于出发菌株和ΔagdA。在48h，DX值(即葡萄糖对干固形物(DS)的百分比值DP1)要比出发菌株高约2.0左右。由于淀粉糖生产量十分巨大，故对于企业来说，DX高出0.1即可产生可观的经济利益，因此失活agdB基因后，对于淀粉糖转化具有直接的有益效果。

表2实施例6中的发酵液、出发菌株发酵液及Ultra 3.0应用结果表

表中，DP1表示葡萄糖对干固形物(DS)的百分比值，DP2表示二糖对干固形物(DS)的百分比值。

本发明通过对黑曲霉α葡萄糖苷酶失活，确定对糖化有害的α葡萄糖苷酶agdB基因。agdB失活的菌株发酵后，直接应用于淀粉糖转化。可达到与商品化产品相同的转化率，省去后期除转苷酶工艺，从而降低生产成本并提高淀粉糖转化率。

Claims (12)

1.失活α葡萄糖苷酶agdB基因的丝状真菌在提高淀粉糖转化率中的应用，其特征在于，所述的丝状真菌是黑曲霉;失活α葡萄糖苷酶agdB基因是指通过对基因表达盒完全或部分缺失、通过插入失活或通过使得基因对于它的预期目的无功能化的任何其他手段而实现，这样基因被阻止而不能表达功能蛋白。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的α葡萄糖苷酶agdB基因编码SEQ IDNO.1 所示的α葡萄糖苷酶。

3.一种提高黑曲霉糖化酶葡萄糖转化率的方法，其特征在于，利用失活agdB基因后的黑曲霉分泌的糖化酶对淀粉糖进行转化; 失活α葡萄糖苷酶agdB基因是指通过对基因表达盒完全或部分缺失、通过插入失活或通过使得基因对于它的预期目的无功能化的任何其他手段而实现，这样基因被阻止而不能表达功能蛋白。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，利用失活agdB基因后的黑曲霉分泌的糖化酶与脱支酶复合对淀粉糖进行转化。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，失活agdB基因是使SEQ ID NO.1所示蛋白序列失去表达能力。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，agdB基因的失活通过以下任意一种方法实现：部分或完全缺失agdB启动子序列，部分或完全缺失agdB编码序列，插入无意序列到agdB启动子或编码序列，或通过RNA干扰的方式消除agdB的表达；所述的无意序列选自抗性基因序列。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，通过同源重组方法失活agdB基因，选自以下方法：包含有选择标记agdB表达盒5’及3’端侧翼序列及选择标记的线状或环化片段，通过转化及标记物筛选获得agdB失活菌株。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，为完成同源重组，需两段序列共同转化，第一段序列由agdB 5’侧翼序列与第一段选择标记基因链接，第二段序列由agdB表达盒3’侧翼序列与及第二段选择标记基因顺序链接，第一段与第二段在选择标记部分具有100-1000bp的同源序列；将两段序列共同转化，只有侧翼序列及选择标记三段同源序列同时发生重组，才会出现阳性转化子。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，利用环状DNA载体，包含有agdB 5’及3’侧翼序列，选择标记，反向选择标记，以及大肠杆菌复制序列；将环状载体转入到黑曲霉中，通过正向选择比较获得重组菌株，再经过反向选择标记获得无痕敲除或失活的菌株。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性；选自包括乙酰胺酶amdS基因、鸟氨酸氨甲酰基转移酶argB基因、草铵膦乙酰转移酶bar基因、潮霉素磷酸转移酶hph基因、硝酸还原酶niaD基因、乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶pyrG基因、硫酸腺苷酰转移酶sC基因和邻氨基苯甲酸合酶trpC基因或编码上述同源蛋白的基因。

11.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，选取黑曲霉agdB侧翼5’及3’1000-3000bp序列作为同源侧翼序列。

12.根据权利要求11所述方法，其特征在于，选取黑曲霉agdB侧翼5’及3’2000bp序列作为同源侧翼序列。