KR20120088548A - 광 출력이 향상된 합성 오플로포러스 루시퍼라제 - Google Patents

광 출력이 향상된 합성 오플로포러스 루시퍼라제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 변형된 루시퍼라제 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 변형된 루시퍼라제 폴리펩타이드는 야생형 오플로포러스 루시퍼라제에 대해 적어도 60%의 아미노산 서열 동일성을 가지며 서열번호 1의 야생형 오플로포러스 루시퍼라제내 아미노산에 상응하는 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 변형된 루시퍼라제 폴리펩타이드는 야생형 오플로포러스 루시퍼라제에 비해 향상된 발광성, 향상된 시그날 안정성 및 향상된 단백질 안정성 중의 적어도 하나를 갖는다.

Description

광 출력이 향상된 합성 오플로포러스 루시퍼라제{SYNTHETIC OPLOPHORUS RUCIFERASES WITH ENHANCED LIGHT OUTPUT}
관련 출원의 전후 참조
본 원은 2009년 5월 1일자로 출원된 미국 가특허원 제61/174,838호에 대해 우선권을 주장하며 이의 전문은 본원에서 참조로 인용된다.
본 발명은 야생형 오플로포러스(Oplophorus ) 루시퍼라제와 비교하여 향상된 특성을 갖는 합성 오플로포러스 루시퍼라제에 관한 것이다.
심해 새우 오플로포러스 그라실리로스트리스( Oplophorus gracilirostris )는 헤테로카르푸스(Heterocarpus ) 속, 시스텔라스피스(Systellaspis) 속 및 아칸테피라(Acanthephyra) 속의 것을 포함하는 다양한 다른 발광성 십각류 새우와 같이, 자극시 이의 더듬이의 기저로부터 청색 야광운(luminous cloud)을 내뿜는다[참조: Herring, J. Mar . Biol . Assoc . UK, 156:1029(1976)]. 오플로포러스의 발광성의 근본적인 메카니즘은 다음과 같이 오플로포러스 루시퍼라제에 의해 촉매된, 산소 분자를 사용한 오플로포러스 루시페린(코엘렌테라진)의 산화를 포함한다:
Figure pct00001
코엘렌테라진, 이미다조피라지논 화합물은 루시페린으로서 또는 광단백질의 기능성 잔기로서 광범위한 유기체의 생물발광에 관여한다. 예를 들어, 씨 팬시(sea pansy) 레닐라(Renilla)의 루시페린은 코엘렌테라진이며[참조: Inoue et al., Tetrahed . Lett ., 18:2685(1977)], 및 해파리 에쿠오레아(Aequorea)로부터의 칼슘-민감성 광단백질 에퀴오린도 이의 기능성 잔기로서 코엘렌테라진을 함유한다[참조: Shimomura et al., Biochem ., 17:994(1978); Head et al., Nature, 405:372(2000)].
하나의 양태에서, 본 발명은 변형된 루시퍼라제 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 변형된 루시퍼라제 폴리펩타이드는 야생형 오플로포러스 루시퍼라제에 대해 적어도 60%의 아미노산 서열 동일성을 가지며 서열번호 1의 야생형 오플로포러스 루시퍼라제에서의 아미노산에 상응하는 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 변형된 루시퍼라제 폴리펩타이드는 야생형 오플로포러스 루시퍼라제에 대하여 향성된 발광성, 향상된 시그날 안정성 및 향상된 단백질 안정성 중 어느 하나를 갖는다.
다른 양태에서, 본 발명은 변형된 루시퍼라제 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 변형된 루시퍼라제 폴리펩타이드는 야생형 오플로포러스 루시퍼라제에 비하여 향상된 발광성을 가지며 서열번호 1에 상응하는 2, 4, 11, 20, 23, 28, 33, 34, 44, 45, 51, 54, 68, 72, 75, 76, 77, 89, 90, 92, 99, 104, 115, 124, 135, 138, 139, 143, 144, 164, 166, 167, 또는 169번 위치에서 적어도 하나의 아미노산의 치환을 갖는다.
본 발명의 다른 측면은 상세한 설명 및 첨부되는 도면을 고려함으로써 명백해질 것이다.
도 1은 지방산 결합 단백질(FABP) 및 OgLuc의 2차 구조 정렬을 나타낸다.
도 2는 와편모충 루시퍼라제, FABP 및 OgLuc의 2차 구조 정렬을 나타낸다.
도 3은 FABP의 3D 구조를 기초로 한 OgLuc 및 각종 FABP(각각 서열번호 1, 3, 4, 5, 및 17 내지 20)의 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다.
도 4a 내지 도 4d는 N166R OgLuc 변이체 및 레닐라(Renilla) 루시퍼라제와 비교하여 OgLuc에 있어서 2개 이상의 아미노산 치환의 조합으로 변형된 OgLuc 변이체의 시간 경과에 따른 광 출력(즉, 발광성)을 나타낸다. 4a-4b) 시간(분)에 걸친 2개의 상이한 발광성 규모로 나타낸 "섬광" 발광성 검정을 사용한 상대적인 광 단위(RLU)에 있어서 발광성("lum"). 4c-4d) 시간(분)에 걸친 2개의 상이한 발광성 규모로 나타낸 "Glo" 0.5% 테르기톨 발광성 검정을 사용하는 RLU에 있어서 발광성("lum").
도 5a 내지 5c는 0.5% 테르기톨 검정 완충액을 사용하여, T=0("평균")에서 실시예 7에 기술된 각종 OgLuc 변이체("시료")의 RLU에 있어서 평균 발광성과, 표준 편차("Stdev") 및 WT OgLuc와 비교한 변이 계수("CV")를 도시한다.
도 6a 내지 6b는 도 5a 내지 5c에 나타낸 0.5% 테르기톨 검정 완충액 데이터로부터 측정된 WT OgLuc에 대한 OgLuc 변이체의 T=0에서 발광성의 증가 배율을 요약한다.
도 7a 내지 7c는 RLAB를 사용하여, T=0("평균")에서 OgLuc 변이체("시료")의 RLU에 있어서 평균 발광성과, 표준 편차("Stdev") 및 WT OgLuc와 비교한 변이 계수("CV")를 요약한다.
도 8은 도 7a 내지 도 7c에 나타낸 RLAB 데이터로부터 측정된 WT OgLuc에 대한 OgLuc 변이체의 T=0에서 증가 배율을 요약한다.
도 9a 내지 9d는 0.5% 테르기톨 검정 완충액을 사용하여 WT OgLuc와 비교한 OgLuc 변이체의 시그날 안정성을 나타낸다. 도 9a 내지 9c) 시간(분)에 걸친 RLU에서 측정된 발광성과, OgLuc 변이체("클론")의 시간 경과에 따른 광 출력. 도 9d) 도 9a 내지 9c에 나타낸 시간 경과에 따른 광 출력 데이터로부터 측정된 OgLuc 변이체의 시그날 반감기(분).
도 10a 내지 10c는 시간(분)에 걸친 RLU에서 측정된 발광성과, RLAB를 사용하여 WT OgLuc와 비교한 OgLuc 변이체의 시간 경과에 따른 광 출력(즉, 시그날 안정성)을 나타낸다.
도 11a 내지 11b는 도 10a 내지 10c에 나타낸 시간 경과에 따른 광 출력 데이터로부터 측정된 WT OgLuc와 비교한 OgLuc 변이체의 시그날 반감기(분)을 나타낸다.
도 12a 내지 12b는 WT OgLuc와 비교하여 OgLuc 변이체의 반감기(분)로서 22℃에서 단백질 안정성을 나타낸다.
도 13a 내지 13b는 0.5% 테르기톨 검정 완충액(13a) 또는 RLAB(13b)를 사용하여, T=0("평균")에서 A33K 및 F68Y OgLuc 변이체의 RLU에 있어서의 평균 발광성과, WT OgLuc와 비교한 변이 계수를 요약한다.
도 14a 내지 14b는 각각 0.5% 테르기톨 검정 완충액(14a) 또는 RLAB(14b)를 사용하여, 도 13a 내지 13b에 나타낸 데이터로부터 측정된, WT OgLuc에 대한 A33K 및 F68Y OgLuc 변이체의 T=0에서의 발광성에 있어서의 증가 배율을 요약한다.
도 15a 내지 15b는 0.5% 테르기톨 검정 완충액을 사용하여, WT OgLuc와 비교한 A33K 및 F68Y OgLuc 변이체의 시그날 안정성을 나타낸다. 15a) 시간(분)에 걸처 RLU에서 측정된 발광성과, A33K 및 F68Y OgLuc 변이체의 시간에 따른 광 출력. 15b) 도 15a에 나타낸 시간에 걸친 광 출력 데이터로부터 측정된 A33K 및 F68Y OgLuc 변이체의 시그날 반감기(분).
도 16a 내지 16b는 RLAB를 사용하여 WT OgLuc와 비교한 A33K 및 F68Y OgLuc 변이체의 시그날 안정성을 나타낸다. 16a) 시간(분)에 걸쳐 RLU에서 측정된 발광성과, A33K 및 F68Y OgLuc 변이체의 시간경과에 따른 광 출력. 16b) 도 16a에 나타낸 시간 경과에 따른 광 출력 데이터로부터 측정된 A33K 및 F68Y OgLuc 변이체의 시그날 반감기(분).
도 17은 A33K 및 F68Y OgLuc 변이체의 반감기(분)로서 22℃에서의 단백질 안정성을 나타낸다.
도 18a 내지 18b는 시간(분)에 걸친 RLU에서 측정한 발광성과, 0.5% 테르기톨 검정 완충액을 사용하여 N166R OgLuc 변이체 및 레닐라 루시퍼라제와 비교한 코어 조합 OgLuc 변이체의 시간 경과에 따른 광 출력(즉, 시그날 안정성)을 나타낸다.
도 19는 시간(분)에 걸친 RLU에서 측정한 발광성과, RLAB를 사용하여 N166R OgLuc 변이체 및 레닐라 루시퍼라제와 비교한 코어 조합 OgLuc 변이체의 시간 경과에 따른 광 출력(즉, 시그날 안정성)을 나타낸다.
도 20a 내지 20b는 시간(분)에 걸친 RLU에서 측정한 발광성과, 0.5% 테르기톨 검정 완충액(20a) 또는 RLAB(20b)를 사용하여 WT OgLuc("Og-Luc") 및 레닐라 루시퍼라제("hRL"), 및 T2T 및 A54F 변이체와 비교하여 C1+C2+A4E 및 C1+A4E OgLuc 변이체의 시간 경과에 따른 광 출력(즉, 시그날 안정성)을 나타낸다.
도 21은 시간(분)에 걸친 RLU에서 측정한 발광성과, 0.25% 테르기톨 검정 완충액을 사용하여, WT OgLuc("Og-Luc") 및 레닐라 루시퍼라제("hRL") 및 T2T 및 A54F 변이체와 비교하여 C1+C2+A4E 및 C1+A4E OgLuc 변이체의 시간 경과에 따른 광 출력(즉, 시그날 안정성)을 나타낸다.
도 22는 RLAB 완충액을 사용하여 HEK 293 세포에서, WT OgLuc("Og-Luc") 및 레닐라 루시퍼라제("hRL") 및 T2T 및 A54F 변이체와 비교하고, 개똥벌레에 대해 표준화시킨, C1+C2+A4E 및 C1+A4E OgLuc 변이체의 시간 경과에 따른 광 출력(즉, 시그날 안정성)을 나타낸다.
도 23은 0.25% 테르기톨 완충액을 사용하여 HEK 293 세포내에서, WT OgLuc("Og-Luc") 및 레닐라 루시퍼라제("hRL")와 비교하고, 개똥벌레에 대해 표준화시킨, C1+C2+A4E 및 C1+A4E OgLuc 변이체의 시간 경과에 따른 광 출력(즉, 시그날 안정성)을 나타낸다.
도 24는 22, 37, 42, 50 및 54℃와 같은 다양한 온도에서 WT OgLuc, 레닐라 루시퍼라제 및 N166R 변이체와 비교하여 C1, C1+A4E, C1+C2+A4E, 및 C1+C3+A4E OgLuc 변이체의 반감기(분)으로서 단백질 안정성을 나타낸다.
도 25는 시간(분)에 걸친 RLU("lum")에서 측정한 발광성 및 시간 경과 데이터로부터 측정된 반감기(분)를 지닌 RLAB를 사용하여, WT OgLuc("Og-Luc") 및 레닐라 루시퍼라제("hRL")와 비교하여 C1, C1+A4E, C1+C2+A4E, 및 C1+C3+A4E OgLuc의 시간 경과에 따른 광 출력(즉, 시그날 안정성)을 나타낸다.
도 26은 스펙트럼에 있어서 최대 RLU로 표준화시킨, 레닐라 루시퍼라제와 비교하여 N166R, C1+A4E 및 C1+C2+A4E 변이체에 대한 기질로서 코엘렌테라진을 사용하여, 최대 발광성을 지닌 최적 파장(nm)을 나타낸다.
도 27a 내지 27b는 0.5% 테르기톨 완충액을 사용하여 아미노산 변화를 나타내는 상응 개시 C1+A4E("시료 번호") 변이체에 대한 C1+A4E의 무작위로 돌연변이유도된 변이체의 T=0에서의 발광성에 있어서의 증가 배율을 요약한다.
도 28은 0.5% 테르기톨 완충액을 사용하여 아미노산 변화를 나타내는 상응 개시 C1+A4E 변이체에 대한 C1+A4E의 L92 변이체의 T=0에서의 발광성에 있어서의 증가 배율을 요약한다.
도 29는 0.5% 테르기톨 완충액을 사용하여 아미노산 변화를 나타내는 상응 개시 C1+A4E 변이체에 대한 C1+A4E("시료 번호")의 조합 변이체의 T=0에서의 발광성에 있어서의 증가 배율을 요약한다.
도 30은 50℃에서 상응 개시 C1+A4E OgLuc와 비교하여 변이체 C1+A4E+F54I의 반감기(분) 및 시간(분)에 걸친 RLU에서 측정된 발광성의 자연 로그(ln) 값의 시간 경과에 따른 광 출력을 나타낸다.
도 31은 서열번호 10(천연), 서열번호 13(합성 WT), 서열번호 15(N166R), 서열번호 25(C1), 서열번호 27(C1+C2), 서열번호 23(C1+A4E), 서열번호 29(C1+C2+A4E), 및 서열번호 31(C1+C3+A4E)과 컨센서스(consensus) 서열의 아미노산 서열 정렬을 나타낸다.
도 32는 서열번호 12(천연), 서열번호 2(합성 WT), 서열번호 14(N166R), 서열번호 18(C1), 서열번호 20(C1+C2), 서열번호 16(C1+A4E), 서열번호 22(C1+C2+A4E), 및 서열번호 24(C1+C3+A4E)와 컨센서스 서열의 뉴클레오타이드 서열 정렬을 나타낸다.
도 33a는 도 5a 내지 5c 및 도 14a에 나타낸 0.5% 테르기톨 검정 완충액 데이터로부터 측정한, N166R 변이체에 대한 OgLuc 변이체의 T=0에서의 발광성에 있어서 증가 배율을 요약한다.
도 33b는 도 7a 내지 7c 및 14b에 나타낸 RLAB 데이터로부터 측정한, N166R에 대한 OgLuc 변이체의 T=0에서의 발광성에 있어서 증가 배율을 요약한다.
도 33c는 도 9a 내지 9c 및 도 15b(0.5% 테르기톨 검정 완충액) 및 도 10a 내지 10c 및 도 16b(RLAB)에 나타내고 N166R 변이체에 대해 표준화시킨 시간 경과에 따른 광 출력로부터 측정한 OgLuc 변이체의 시그날 반감기(분)를 요약한다.
도 33d는 N166R 변이체에 대해 표준화시킨 도 12a 내지 12b 및 도 17에 나타낸 WT OgLuc와 비교한 OgLuc 변이체의 반감기(분)로서 22℃에서의 단백질 안정성을 요약한다.
도 33e는 도 33a 내지 33d에 나타낸 22℃에서의 발광성에 있어서의 증가 배율, 시그날 반감기 및 반감기를 요약한다.
도 34a는 0.5% 테르기톨을 사용하여 검정한 IV 변이체("IV"), 레닐라 루시퍼라제("레닐라") 및 C1+A4E("C1A4E")를 함유하는 이. 콜라이(E. coli) 분해물의 발광성 결과를 나타낸다.
도 34b는 VI 변이체("VI") 및 레닐라 루시퍼라제("레닐라")의 반감기(분)로서 50℃에서의 단백질 안정성을 나타낸다.
본 발명의 임의의 특정 양태를 상세히 설명하기 전에, 본 발명이 이의 적용에 있어 다음의 기술에 설정되거나 또는 다음의 도면에 나타낸 구조의 세부사항, 합성 및 성분들의 배열로 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명이 특수 양태 및 기술과 관련하여 기술되어 있으나, 본 발명은 다른 양태일 수 있으며 각종 방법으로 실시하거나 수행할 수 있다
본 발명의 방법의 다음 설명에서, 공정 단계는 달리 정의하지 않는 한, 실온(약 22℃) 및 대기압에서 수행된다. 또한, 본원에 인용된 특정의 수치 범위는 하한치 내지 상한치의 모든 값을 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 농도 범위 또는 유리한 효과 범위가 1% 내지 50%로 기술된 경우, 2% 내지 40%, 10% 내지 30%, 또는 1% 내지 3% 등도 본 명세서에서 표현적으로 열거하는 것으로 의도된다. 유사하게, 서열 동일성 범위가 예를 들어, 60% 내지 <100%로 제공되는 경우, 65%, 75%, 90% 등도 본 명세서에서 표현적으로 열거되는 것으로 의도된다. 이들은 단지 구체적으로 의도된 것의 예이며, 최저치 내지 최고치의 모든 가능한 수치가 본 명세서에서 표현적으로 기술되는 것으로 고려된다.
본 발명의 양태에서, 본원에 기술된 각종 기술을 사용하여 개선된 합성 오플로포러스 루시퍼라제 폴리펩타이드를 생산하기 위한 아미노산 치환 부위를 확인하였다. 폴리펩타이드의 발현을 향상시키기 위해서, 추가의 기술을 사용하여 각종 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 코돈을 최적화했다. 하나 이상의 아미노산 치환을 단독으로 또는 다양한 조합으로 제조하여 향상된 발광성, 향상된 시그날 안정성 및 향상된 단백질 안정성 중 적어도 어느 하나를 가진 오플로포러스-유형 루시퍼라제를 생산함이 밝혀졌다. 또한, 각종 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드내 하나 이상의 코돈 최적화 치환을 포함하는 것은 각종 진핵 세포 및 원핵 세포 발현 시스템에서 폴리펩타이드의 향상된 발현을 생산하였다.
발광성은 적절한 조건, 예를 들면, 코엘렌테라진과 같은 적합한 기질의 존재하에서 루시퍼라제 폴리펩타이드의 광 출력을 말한다. 광 출력은 코엘렌테라진 기질의 첨가시 개시할 수 있는, 발광성 반응의 개시시 광 출력(이는 때때로 "T=0" 발광성 또는 "섬광"으로 언급된다)의 순간적인 또는 거의-순간적인 척도로 측정될 수 있다. 각종 양태에서 발광성 반응은 예를 들면, 원핵 세포 또는 진핵 세포 발현 시스템에서의 세포 유래의 분해물을 함유하는 용액 중에서 수행하며; 다른 양태에서, 시험관내 시스템 내에서 발현이 일어나거나 또는 세포외 배지 내로 루시퍼라제 단백질이 분비되고, 후자의 경우, 분해물을 생산할 필요가 없다. 일부 양태에서, 반응은 적절한 물질, 예를 들면 코엘렌테라진을 루시퍼라제 단백질을 함유하는 반응 챔버(예를 들면, 96-웰 플레이트와 같은 다중웰 플레이트의 웰)내에 주입함으로써 개시된다. 반응 챔버는 예를 들면, 광도계 또는 광증배기를 사용하여 광 출력을 측정할 수 있는 판독 장치 속에 위치시킬 수 있다. 또한, 광 출력 또는 발광성은 시간에 걸쳐, 예를 들면, 동일한 반응 챔버 내에서 초, 분, 시간 등의 기간 동안 측정할 수 있다. 광 출력 또는 발광성은 시간에 걸친 평균, 시그날의 감쇠 반감기, 시간에 걸친 시그날의 합, 또는 피크 출력으로서 기록될 수 있다.
향상된 발광성은 비교가능하게 수득한 측정치의 적합한 비교로 측정된, 증가된 광 출력 또는 발광성을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 합성 오플로포러스 루시퍼라제 서열에 대한 하나 이상의 적합한 아미노산 치환은 향상된 발광성을 나타내는 변형된 루시퍼라제 폴리펩타이드를 생산한다. 야생형 오플로포러스 뉴클레오타이드 서열 유래의 뉴클레오타이드 서열내 변화는 아미노산 치환의 유도 및/또는 단백질 발현의 향상에 의해 향상된 발광성에 기여할 수 있다.
향상된 시그날 안정성은 예를 들면 시간 경과에 따른 시그날의 감괴의 반감기로 측정된 바와 같이, 루시퍼라제 유래의 시그날이 지속적으로 발광하는 시간에 있어서의 증가를 포함한다.
향상된 단백질 안정성은 증가된 열 안정성(예: 승온에서 안정성) 및 화학 안정성(예: 예를 들면, 트리톤 X-100을 포함하는 세제와 같은 변성제의 존재하에서의 안정성)을 포함한다.
용어 "OgLuc"는 오플로포러스 루시퍼라제 단백질 복합체의 성숙한 19kDa 소단위를 말하고; 즉 시그날 서열의 부재하에서 성숙한 OgLuc 폴리펩타이드 서열의 천연 형태는 서열번호 1로 제공된다. 용어 "OgLuc 변이체"는 하나 이상의 아미노산 치환을 가진 합성 OgLuc를 나타낸다. 예를 들어, "OgLuc N166R 변이체" 및 "OgLuc+N166R"은 서열번호 1에 대해 166번 위치에서 N의 R로의 아미노산 치환을 갖는 합성 OgLuc을 나타낸다. 용어 "WT", "WT OgLuc" 및 "야생형 OgLuc"는 서열번호 1에 대해 2번 위치에서 ACC를 갖는 합성 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 합성의 성숙한 OgLuc 단백질을 나타낸다. 용어 "T2T"는 서열번호 1에 대해 2번 위치에서 ACA를 갖는 합성 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 합성의 성숙한 OgLuc 단백질을 나타낸다. 실시예에서 하기 제공된 데이터의 경우, 합성된 야생형 단백질은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된, 서열번호 13의 합성의 야생형 단백질이다.
치환된 잔기를 확인하기 위한 본 명세서 전체에서 사용된 아미노산 번호매김은 서열번호 1의 성숙한 야생형 OgLuc 폴리펩타이드 서열에서의 위치에 대해 명시된다. 천연적으로 존재하는 야생형 OgLuc 서열은 후에 분리되는 다른 아미노산을 사용하여 초기에 합성되어 서열번호 1에 나타낸 것과 같은 성숙한 야생형 폴리펩타이드의 생성할 수 있다. 예를 들어, 시그날 서열(예를 들면, 소포체와 같은 특수 세포기관에 대한 신생의 단백질의 지시 및/또는 분비를 위한 단백질을 지시하기 위한)이 신생 단백질의 개시부에 존재할 수 있으며 이후에 분리되어 성숙한 야생형 단백질을 생산할 수 있다.
오플로포러스 루시퍼라제의 기질 특이성은 예상과는 다르게 광범위하다[참조: Inouye and Shimomura. BBRC 223:349(1997)]. 예를 들어, 코엘렌테라진의 유사체인 비스데옥시코엘렌테라진은 코엘렌테라진과 비교가능한 오플로포러스 루시퍼라제에 대한 탁월한 기질이다[참조: Nakamura et al., Tetrahed. Lett., 38:6405(1997)]. 더우기, 오플로포러스 루시퍼라제는 이미다조피라지논-유형 루시페린도 사용하여 광을 방출하는, 해양 오스트라코드(ostracod) 시프리디나(바르굴라) 힐겐도르피[Cypridina(Vargula) hilgendorfii)] [참조: Johnson and Shimomura, Meth . Enzyme, 57:331(1978)]와 같은 분비된 효소이다.
오플로포러스 루시퍼라제의 분자량은 천연 단백질 복합체의 경우 130 kDa(겔 여과에 의해), 및 SDS 처리 후 31kDa인 것으로 보고되었다[참조: Shimomura et al., Biochem ., 17:1994(1978)]. 또한, 루시퍼라제는 겔 여과시 대략 106 kDa의 분자량을 나타내었으며, 분자는 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 분석시 35 kDa 및 19 kDa 단백질로 분리되는 것으로 밝혀졌다[참조: Inouye et al., FEBS Lett ., 481:19(2000)]. Inouye et al.(2000)에는 35 kDa 및 19 kDa 단백질을 암호화하는 cDNA의 분자 클로닝 및, 발광성 반응을 촉진하는 단백질 성분의 동정이 보고되어 있다. 단백질을 암호화하는 cDNA는 코엘렌테라진의 발광성 산화를 촉진할 수 있는 19 kDa 단백질로서 세균 및 포유동물 세포내에서 발현되었다(참조: Inouye et al., 2000). 35kDa 단백질의 주요 서열은 류신이 풍부한 반복 서열을 나타내는 반면, 촉매성 19kDa 단백질은 각종 이미다조피라지논 루시퍼라제를 포함하는 임의의 공지된 루시퍼라제와도 상동성을 공유하지 않았다(참조: Inouye et al., 2000).
오플로포러스 루시퍼라제의 19 kDa 단백질(OgLuc)은 루시퍼라제 기능을 갖는 가장 작은 촉매 성분인 것으로 여겨지며, 이의 주요 구조는 이미다조피라지논 루시퍼라제를 포함하는 임의의 보고된 루시퍼라제와 현저한 상동성을 가지지 않는다[참조: Lorenz et al., PNAS USA, 88:4438(1991); Thompson et al., PNAS USA, 86:6567(1989)]. Inouye et al.(2000)은 19 kDa 단백질의 전체 아미노산 서열이 217 내지 392번 잔기(D3-S1의 도메인)의 영역 내에서 이. 콜라이(E. coli) 아민 옥시다제(757개 아미노산 잔기; pir 140924)의 것과 유사한 것으로 나타난 반면[참조: Parson et al. Structure 3:1171(1995)], 동일한 단백질의 아미노-말단 영역(3-49)은 지방산 결합 단백질(132개 아미노산 잔기; 진뱅크(GenBank), L23322)의 아미노 말단 영역과 상동성임을 보고하였다[참조: Becker et al., Gene, 148:321(1994)].
상동성 모델링은 적어도 하나의 적합한 3D 구조 주형, 일반적으로 표적 단백질에 대해 현저한 서열 유사성을 가진 동종 단백질의 실험적으로 측정된 3D 구조를 요구한다. OgLuc는 다른 공지된 단백질에 대해 현저한 서열 유사성을 갖지 않는다. 따라서, OgLuc에 대해 낮은 서열 유사성을 갖는 단백질과 같은, OgLuc의 분명한 동족체를 확인하기 위해 설계된 폴드(fold) 인식 방법을 사용하였다. 이러한 접근은 칼리신 단백질 상과의 일부인, 지방산 결합 단백질(FABP)의 단백질 계열에 속하는 몇몇의 잠재적 3D 구조 주형을 수득하였다. 당해 모델은, 수소 결합과 함께 N- 및 C-말단을 효과적으로 묶고, 적어도 3개의 FABP내에 존재하는, 칼리신 폴딩 구조 특징이 OgLuc내에서 완전하게 보존되어 있지 않음을 나타내었다. OgLuc 잔기 Asn166(C-말단 근처)는 N-말단 근처에서 주쇄 카보닐과 수소 결합할 수 없다. 그러나, OgLuc의 166번 위치에서 Arg 또는 Lys를 함유하는 돌연변이체의 모델은, 당해 구조 모티프(motif)의 회복이 OgLuc의 구조적 안정성 및 세포내 이의 발현/활성을 개선시킬 수 있음을 제안하였다.
본 발명의 양태는 합성의 변형된(변이체) 루시퍼라제 뿐만 아니라 이의 단편, 예를 들면, 칼리신 단백질 상과, 예를 들면, 지방산 결합 단백질의 계열의 구성원과 구조적으로 상동성인 영역내 상응하는 야생형 루시퍼라제와 관련하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 가진, 상보성 검정에 유용한 것도 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명은, 변형된 갑각류 루시퍼라제, 예를 들면 변형된 십각류 루시퍼라제 뿐만 아니라 이의 단편, 예를 들면 칼리신 단백질 상과, 예를 들면 지방산 결합 단백질의 계열의 구성원에 대해 구조적으로 상동성인 영역 내에서 상응하는 야생형 갑각류 루시퍼라제와 관련하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 상보성 검정에 유용한 것도 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명은 진핵 단세포 편모충의 변형된 루시퍼라제뿐만 아니라 이의 단편, 예를 들면, 상응하는 야생형 진핵 단세포 편모충 루시퍼라제, 예를 들면, 칼리신 단백질 상과, 예를 들면 지방산 결합 단백질의 계열의 구성원에 대해 구조적으로 상동성인 영역 내에서 디노피세아에(Dinophyceae), 녹티루시피세아에(Noctiluciphyceae ), 또는 신디니오피세아(Syndiniophycea)를 포함하는 디노플라겔라타(Dinoflagellata ) 유래의 루시퍼라제와 관련하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는, 상보성 검정에 유용한 것들을 제공한다. 변형된 루시퍼라제를 암호화하는 핵산 분자는 변형된 루시퍼라제에 연결된 분비 시그날 펩타이드를 암호화하거나 또는 암호화하지 않을 수 있다.
합성의 변형된 루시퍼라제, 또는 이의 단편에서 적어도 하나의 치환은 잔기가 분자내 수소 또는 이온 결합 형성에 관여할 수 있으며 변형된 루시퍼라제내에서 향상된 발광성과 관련되어 있는, 칼리신 단백질 상과, 예를 들면, 지방산 결합 단백질의 계열의 구성원에 대해 구조적으로 상동성인 영역내 상응하는 위치에서 아미노산 잔기에 대한 치환이다. 향상된 발광성은 증가된 광 방사, 광 방사의 변경된 역학(kinetic), 예를 들면, 광 강도의 보다 큰 안정성, 또는 변경된 발광 색상, 예를 들면, 좀더 짧거나 긴 파장으로의 이동, 또는 이의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 하나의 양태에서, 상응하는 위치에서 합성의 변형된 루시퍼라제내 잔기는 OgLuc의 1 내지 10번 또는 144번 내지 148번 잔기(이들 위치의 번호매김은 성숙한 서열의 1번 잔기에서 Met가 아닌 Phe를 기준으로 하지만, 다른 잔기는 클로닝 부위의 삽입으로 인해 유도될 수 있는 -1번 위치에서 Val과 같이 Phe의 앞에 있을 수 있다)에 상응하는 영역내 잔기 또는 상응하는 위치(166번 위치)에서 잔기의 4 내지 8Å내, 예를 들면, 6Å내인 원자를 지닌 잔기와 상호작용할 수 있다. 상응하는 위치는 예를 들면, 서열 정렬 프로그램, 제2 구조 예측 프로그램 또는 폴드 인식 방법, 또는 이들의 조합을 사용하여 서열을 정렬시킴으로써 확인할 수 있다. 본 발명에 따라서 변형된 루시퍼라제는 발광성의 색상을 변경시키는 추가의 아미노산 치환, 예를 들면, 적색-이동된 발광성을 생성하고, 시그날 안정성을 변경하며, 단백질 안정성을 변경하거나 또는 이들의 조합인 치환(들)을 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 상응하는 야생형 갑각류 루시퍼라제에 대해 향상된 발광성을 갖는 변형된 갑각류 루시퍼라제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 코엘렌테라진을 이용하는 변형된 갑각류 루시퍼라제를 제공한다. 코엘렌테라진은 미국 특허 제7,118,878호에 기재된 것과 같은, 천연적으로 존재하는 코엘렌테라진, 및 이의 유도체(동족체) 뿐만 아니라, EnduRen, ViviRen, 코엘렌테라진 n, 코엘렌테라진 h, 코엘렌테라진 c, 코엘렌테라진 cp, 코엘렌테라진 e, 코엘렌테라진 f, 코엘렌테라진 fcp, 코엘렌테라진 hh, 코엘렌테라진 i, 코엘렌테라진 icp, 2-메틸 코엘렌테라진, 및 이의 기재내용이 본원에 참조로 인용된 제WO/040100호 및 미국 특허원 일련 번호 제12/056,073호에 기재된 것들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 변형된 루시퍼라제는 향상된 발광성을 생성하며, 임의로 서열번호 1의 5번 잔기에 상응하는 위치에서 아스파르트산, 서열번호 1의 8번 잔기에 상응하는 위치에서 글리신, 서열번호 1의 9번 잔기에 상응하는 위치에서 아스파르트산, 서열번호 1의 10번 잔기에 상응하는 위치에서 트립토판, 타이로신 또는 페닐알라닌, 서열번호 1의 144번 잔기에 상응하는 위치에서 아스파라긴 및/또는 서열번호 1의 147번 잔기에 상응하는 위치에서 글리신, 또는 이의 특정 조합을 생성하는 서열번호 1의 166번 잔기에 상응하는 위치에서 아스파라긴 이외의 잔기를 갖는다. 하나의 양태에서, 서열번호 1의 166번 잔기에 상응하는 변형된 루시퍼라제내 잔기는 라이신이다. 다른 양태에서, 서열번호 1의 166번 잔기에 상응하는 변형된 루시퍼라제내 잔기는 아르기닌이다. 하나의 양태에서, 서열번호 1의 166번 잔기에 상응하는 변형된 루시퍼라제내 잔기는 변형된 루시퍼라제의 N-말단 근처의 서열번호 1의 9번 잔기에 상응하는 위치에서 카보닐 또는 측쇄와의 하나 이상의 분자내 수소 또는 이온 결합을 형성할 수 있다. 하나의 양태에서, 변형된 루시퍼라제는 시그날 펩타이드 서열을 결여하고 있다. 하나의 양태에서, 변형된 루시퍼라제는 서열번호 1에 대해 적어도 60%, 예를 들면 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 그러나 100% 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
하나의 양태에서, 상응하는 야생형 루시퍼라제는 오플로포러스 루시퍼라제, 예를 들면, 오플로포러스 그라실리로스트리스(Oplophorus gracilirostris), 오플로포러스 그리말디이(Oplophorus grimaldii), 오플로포러스 스피니카우다(Oplophorus spinicauda), 오플로포러스 폴리아세우스(Oplophorus foliaceus), 오플로포러스 노라에제엘란디아에(Oplophorus noraezeelandiae), 오플로포러스 타이푸스(Oplophorus typus), 오플로포러스 노라에젤란디아에(Oplophorus noraezelandiae) 또는 오플로포러스 스피노우스(Oplophorus spinous), 헤테로카푸스(Heterocarpus) 루시퍼라제, 시스텔라피스(Systellapis) 루시퍼라제 또는 아칸테피라(Acanthephyra) 루시퍼라제이다. 하나의 양태에서, 변형된 루시퍼라제는 상응하는 야생형 루시퍼라제와 비교하여 원핵 세포 및/또는 진핵 세포내에서 적어도 2배 이상, 예를 들면, 적어도 4배의 증가된 발광성 방사를 갖는다.
다른 양태에서, 본 발명은 상응하는 야생형 와편모충 루시퍼라제, 예를 들면, 린굴로디니움 폴리에드룸(Lingulodinium polyedrum) 루시퍼라제, 피로시스티스 루눌라(Pyrocystis lunula) 루시퍼라제 또는 서열번호 21을 갖는 것과 같은 와편모충 루시퍼라제와 비교하여 향상된 발광성을 갖는 변형된 와편모충 루시퍼라제를 제공한다. 변형된 루시퍼라제는 서열번호 1내 166번 잔기에 상응하는 위치에서 아스파라긴 이외의 잔기, 예를 들면 아르기닌, 및 임의로 서열번호 1의 5번 잔기에 상응하는 위치에서 프롤린, 서열번호 1의 8번 잔기에 상응하는 위치에서 글리신, 서열번호 1의 9번 잔기에 상응하는 위치에서 아르기닌, 서열번호 1의 10번 잔기에 상응하는 위치에서 트립토판, 타이로신 또는 페닐알라닌, 서열번호 1의 144번 잔기에 상응하는 위치에서 페닐알라닌 및/또는 서열번호 1의 147번 잔기에 상응하는 위치에서 트레오닌, 또는 이의 특정 조합을 가질 수 있다. 하나의 양태에서, 서열번호 1의 166번 잔기에 상응하는 변형된 루시퍼라제내 잔기는 라이신이다. 다른 양태에서, 서열번호 1의 166번 잔기에 상응하는 변형된 루시퍼라제내 잔기는 아르기닌이다. 하나의 양태에서, 서열번호 1의 166번 잔기에 상응하는 변형된 루시퍼라제내 잔기는 변형된 루시퍼라제의 N-말단 근처의 서열번호 1의 9번 잔기에 상응하는 위치에서 카보닐 또는 측쇄와의 하나 이상의 분자내 수소 또는 이온 결합을 형성할 수 있다. 하나의 양태에서, 변형된 루시퍼라제는 시그날 펩타이드 서열이 결여되어 있다.
하나의 양태에서, 변형된 루시퍼라제는 서열번호 21에 대해 적어도 60%, 예를 들면 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 그러나 100% 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 발광성의 색상을 변경시키는 추가의 아미노산 치환을 갖는 것을 포함하는, 본 발명의 변형된 루시퍼라제는 변경된 발광 색상을 생산하는 발광성 반응에서 변형된 루시페린과 함께 사용될 수 있다.
또한, FABP 베타-장벽 관련된 3D-구조 도메인을 갖는 변형된 루시퍼라제가 제공되며, 당해 변형된 루시퍼라제는 예를 들면, 베타 장벽의 말단 베타 시트의 분자간 수소 또는 이온 결합을 통한 비공유 결합, 및 임의로 예를 들면, 인접한 2차 구조와의 분자간 수소 또는 이온 결합을 통한 추가의 비공유 결합을 생성하는 치환을 갖는다.
또한, 본 발명의 양태는 또한 향상된 발광성을 가지고 서열번호 1의 166번 잔기에 상응하는 위치에서 아르기닌, 라이신, 알라닌, 류신, 프롤린, 글루타민 또는 세린을 가지며 상응하는 야생형 갑각류 또는 와편모충 루시퍼라제와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 변형된 갑각류 또는 와편모충 루시퍼라제를 제공한다. 하나의 양태에서, 변형된 루시퍼라제내 적어도 하나의 아미노산 치환은 서열번호 1의 4, 11, 33, 44, 45, 54, 75, 104, 115, 124, 135, 138, 139, 167, 또는 169번 잔기, 또는 이의 조합에 상응하는 위치에서 치환, 예를 들면, 향상된 발광성을 갖고 서열번호 1내 166번 잔기에 상응하는 위치에서 아르기닌, 라이신, 알라닌, 류신, 프롤린, 글루타민 또는 세린을 갖는 변형된 루시퍼라제와 비교하여 향상된 발광성을 생성하는 것이다.
하나의 양태에서, 본 발명의 변형된 루시퍼라제는 목적한 분자와 임의로 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는, N-말단, C-말단 또는 이들 둘다에서 하나 이상의 이종 아미노산 서열(에피토프 또는 융합 태그를 지닌 것과 같은 융합 폴리펩타이드)를 갖는다. 하나의 양태에서, 이종 서열(들)의 존재는 목적 분자와의 상호작용 전 또는 후에 변형된 루시퍼라제의 발광성을 실질적으로 변경시키지 않는다. 하나의 양태에서, 이종 아미노산 서열은 에피토프 태그이다. 다른 양태에서, 이종 아미노산 서열은 목적 분자와의 상호작용 동안 또는 후에 구조적 변화를 겪음으로써 궁극적으로 루시퍼라제의 활성을 변경시키는 것, 예를 들면, 이러한 아미노산 서열이 다른자리입체성 상호작용을 검출하는데 유용한 변형된 OgLuc이다. 변형된 루시퍼라제 또는 변형된 루시퍼라제 또는 이의 단편과의 융합체는 리포터로서 사용될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 루시퍼라제의 단편은 이종 아미노산 서열에 융합됨으로써, 베타-장벽을 형성하는 융합 단백질은 천연적으로 존재하는 루시페린 또는 이의 유도체로부터 발광성을 생성할 수 있다.
또한, 본 발명의 변형된 루시퍼라제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 융합체, 폴리뉴클레오타이드 또는 변형된 루시퍼라제 또는 이의 융합체를 지닌 분리된 숙주 세포, 및 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 변형된 루시퍼라제 또는 이의 융합체 또는 숙주 세포를 사용하는 방법이 제공된다.
또한, 상이한 2차 구조, 예를 들면, 2차 구조의 일부가 아닌 5개 이상의 아미노산에 의해 분리된 구조이며, 서로 수소 또는 이온 결합을 형성할 수 있는 목적 단백질내 아미노산 위치를 확인하는 방법이 제공된다. 당해 방법은 목적 단백질의 아미노산 서열에 대해 예측된 2차 구조를 전체 서열 유사성이 없는, 예를 들면, 목적 단백질에 대해 동일성이 30% 미만인 하나 이상의 단백질의 2차 구조와 비교함을 포함한다. 하나 이상의 단백질은 정의된 3D 구조를 가지며 단백질 중 적어도 하나는 제2의 2차 구조와 관련된 제2 잔기의 5 또는 10개 잔기 근처 또는 내에 주요 쇄 카보닐 또는 이의 측쇄 사이 또는 측쇄들 사이에 수소 또는 이온 결합, 예를 들면, 염 브릿지(salt bridge)를 각각 형성하는 적어도 하나의 제1의 2차 구조와 관련된 제1의 잔기를 갖는다. 하나의 양태에서, 제1의 2차 구조는 제2의 2차 구조에 대해 C-말단이다. 다른 양태에서, 제1의 2차 구조는 제2의 2차 구조에 대해 N-말단이다. 이후에, 목적 단백질이 하나 이상의 단백질내 적어도 제1의 2차 구조에 상응하는 하나 이상의 2차 구조를 가지는지, 그리고 그렇다면 하나 이상의 단백질내 제1의 잔기, 제2의 잔기 또는 이들 둘다에 상응하는 목적 단백질내 아미노산 위치를 측정한다. 하나의 양태에서, 하나의 2차 구조는 310 나선 또는 베타-장벽이다. 하나의 양태에서, 목적 단백질은 루시퍼라제이다. 하나의 양태에서, 제1의 잔기는 제2의 잔기의 5개 잔기내에서 하나 이상의 주쇄 카보닐에 대해 수소 또는 이온 결합을 형성할 수 있다. 하나의 양태에서, 하나 이상의 단백질은 지방산 결합 단백질이다.
정의
본 발명의 변형된 루시퍼라제내 아미노산 잔기는 노르류신, L-에티오닌, β-2-티에닐알라닌, 5-메틸트립토판 노르발린, L-카나바닌, p-플루오로페닐알라닌, p-(4-하이드록시벤조일)페닐알라닌, 2-케토-4-(메틸티오)부티르산, 베타-하이드록시 류신, 감마-클로로노르발린, 감마-메틸 D-류신, 베타-D-L 하이드록시류신, 2-아미노-3-클로로부티르산, N-메틸-D-발린, 3,4,디플루오로-L-페닐알라닌, 5,5,5-트리플루오로류신, 4,4,4-트리플루오로-L-발린, 5-플루오로-L-트립토판, 4-아지도-L-페닐알라닌, 4-벤질-L-페닐알라닌, 티아프롤린, 5,5,5-트리플루오로류신, 5,5,5,5',5',5'-헥사플루오로류신, 2-아미노-4-메틸-4-펜테노산, 2-아미노-3,3,3-트리플루오로-메틸펜타노산, 2-아미노-3-메틸-5,5,5-트리-플루오로펜타노산, 2-아미노-3-메틸-4-펜테노산, 트리플루오로발린, 헥사플루오로발린, 호모시스테인, 하이드록시라이신, 오르니틴과 같은 L-구조, D-구조의 것들 또는 비천연적으로 존재하는 아미노산, 및 당해 분야에 공지된 방법에 의해 --CH2NH--, --CH2S--, --CH2--CH2--, --CH=CH--(시스 및 트랜스), --COCH2--, --CH(OH)CH2--, 및 --CH2SO--와 같은 결합에 의해 임의로 대체된 펩타이드 결합을 갖는 것들일 수 있다. 표준 폴리펩타이드 명명법을 유지하는데 있어서, 천연적으로 존재하는 아미노산 잔기에 대한 약어는 다음의 대응성의 표에 나타낸 바와 같다.
대응성의 표
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본원에 사용된 것으로서 향상된 발광성은 다음 중 어느 것을 포함할 수 있다: 증가된 광 방사, 광 방사의 변경된 역학, 예를 들면, 광 강도의 보다 큰 안정성, 또는 변경된 발광 색상, 예를 들면, 보다 짧거나 긴 파장으로의 이동.
용어 "상동성"은 2개 이상의 서열 사이의 상보성의 정도를 나타낸다. 부분 상동성 또는 완전 상동성(예를 들면, 동일성)이 존재할 수 있다. 상동성은 흔히 서열 분석 소프트웨어[예를 들면, 미국 위스콘신주 53705 매디슨 유니버시티 애비뉴 1710 에 소재하는 유니버시티 오브 위스콘신의 바이오테크놀로지 센터의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group. University of Wisconsin Biotechnology Center)에 의해 앞서 시판된 "GCG" 및 "Seqweb" 서열 분석 소프트웨어 패키지)를 사용하여 종종 측정된다. 이러한 소프트웨어는 다양한 치환, 결손, 삽입 및 다른 변형에 대해 상동성의 정도를 지정함으로써 유사한 서열과 조화를 이룬다. 보존적 치환은 통상적으로 다음 그룹내 치환들을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 라이신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 타이로신.
"분리된 올리고뉴클레오타이드", '분리된 폴리뉴클레오타이드", "분리된 단백질" 또는 "분리된 폴리펩타이드"에서와 같이, 핵산 또는 폴리펩타이드와 관련하여 사용된 경우 용어 "분리된"은, 이것이 이의 공급원과 원래 관련된 적어도 하나의 오염물질로부터 확인되어 분리된 핵산 또는 아미노산 서열을 나타낸다. 따라서, 분리된 핵산 또는 분리된 폴리펩타이드는 천연적으로 이것이 발견된 것과는 상이한 형태 또는 셋팅으로 존재한다. 대조적으로, 분리되지 않은 핵산(예를 들면, DNA 및 RNA) 또는 분리되지 않은 폴리펩타이드(예를 들면, 단백질 및 효소)는 이들이 천연적으로 존재하는 상태로 발견된다. 예를 들어, 제공된 DNA 서열(예를 들면, 유전자)는 이웃하는 유전자: RNA 서열(예를 들면, 특이적인 단백질을 암호화하는 특이적인 mRNA 서열)은 다수의 단백질을 암호화하는 다수의 다른 mRNA들과의 혼합물로서 세포내에서 발견된다. 그러나, 분리된 핵산은, 예로서 핵산을 일반적으로 발현하는 세포내 이러한 핵산을 포함하며, 여기서, 핵산은 천연 세포의 것과는 상이한 염색체 위치내에 존재하거나, 달리는 천연적으로 발견된 것 이외의 상이한 핵산 서열에 의해 플랭킹(flanking)된다. 분리된 핵산 또는 올리고뉴클레오타이드는 단일쇄 또는 이중쇄 형태로 존재할 수 있다. 분리된 핵산 또는 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 단백질을 발현할 경우, 올리고뉴클레오타이드는 센스 또는 암호화 쇄(즉, 단일쇄 핵산)을 최소로 함유하지만, 센스 및 안티센스 쇄(즉, 이중쇄 핵산) 둘 다를 함유할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "핵산 분자", "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산 서열"은 폴리펩타이드 또는 단백질 전구체의 생산에 필수적인 암호화 서열을 포함하는 핵산, DNA 또는 RNA를 나타낸다. 암호화된 폴리펩타이드는 전장(full-length) 폴리펩타이드, 이의 단편(전장 미만), 또는 융합 폴리펩타이드를 수득하는 전장 폴리펩타이드 또는 이의 단편과 다른 폴리펩타이드의 융합체일 수 있다.
"오플로포러스 루시퍼라제"는 천연의 35 kDa 및 19 kDa 단백질의 복합체이다. 19 kDa 단백질은 최소 촉매 성분(진뱅크 수탁 번호 제BAB13776호, 196개 아미노산)이다. 본원에 사용된 것으로서, OgLuc는 시그날 펩타이드가 없는 19 kDa 단백질(169개 아미노산, BAB13776의 28 내지 196번 잔기)이다.
"펩타이드", "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 길이 또는 해독 후 변형(예를 들면, 글리코실화 또는 포스포릴화)에 상관없이 임의의 아미노산의 쇄를 의미한다. 본 발명의 핵산 분자는, 이것이 기원한 천연적으로 존재하는(천연 또는 야생형) 단백질의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들면, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 그러나 100% 미만의 아미노산 서열 동일성인 아미노산 서열을 갖는 천연적으로 존재하는 단백질 또는 이의 폴리펩타이드 단편의 변이체를 암호화한다. 용어 "융합 폴리펩타이드" 또는 "융합 단백질"은 N- 및/또는 C-말단에서 하나 이상의 이종 서열(예를 들면, 비-루시퍼라제 폴리펩타이드)에 연결된 참조 단백질(예를 들면, 루시퍼라제)을 함유하는 키메라 단백질을 나타낸다.
단백질 1차 구조(주요 서열, 펩타이드 서열, 단백질 서열)은 아미노산의 서열이다. 이는 일반적으로 아미노-말단(N) 끝으로부터 시작하여 카복시-말단(C) 끝까지로 보고되어 있다. 단백질 2차 구조는 단백질의 나머지와 독립적으로, 펩타이드 쇄의 국소적 형태로서 기재될 수 있다. 일반적으로 관여하는 잔기의 골격 원자 및 '불규칙적인' 2차 구조 성분(예를 들면, 회전, 굽힘, 루프, 코일, 흐트러진 또는 구조화되지 않은 분절) 사이의 수소 결합 상호작용에 의해 일반적으로 안정화되는 '규칙적인' 2차 구조 성분(예: 나선형 물질, 시트 또는 스트랜드)이 존재한다. 단백질 2차 구조는 상이한 방법/프로그램, 예를 들면, PSIPRED[참조: McGuffin et al., Bioinformatics, 16:404(2000)], PORTER[참조: Pollastri et al., Bioinformatics, 21:1719(2005)], DSC[참조: King and Sternberg, Protein Sci., 5:2298(1996)]으로 예측할 수 있다[목록에 대해 http://www.expasy.org/tools/#secondary 참조]. 단백질 3차 구조는 펩타이드 쇄의 전반적인 3-차원(3D) 구조이다. 이는 3-차원 공간내 원자 위치에 의해 기술되며, 이는 일반적으로 주요 구조내 떨어진 그룹들 사이의 상호작용을 포함할 수 있다. 단백질 3차 구조는 2차 구조 성분의 특이적인 3차원 정렬인 폴드로 분류된다. 때때로, 동일한 폴딩을 갖는 단백질들 사이에 식별불가능한 서열 유사성이 존재한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "야생형" 또는 "천연의"는 천연적으로 존재하는 공급원으로부터 분리된 유전자 또는 유전자 생성물의 특성을 갖는 유전자 또는 유전자 생성물을 나타낸다. 야생형 유전자는 집단내에서 가장 흔히 관측된 것이므로, 유전자의 "야생형" 형태로 임의적으로 지정된다. 대조적으로, 용어 "돌연변이체"는 야생형 유전자 또는 유전자 생성물과 비교하여, 서열내 변형 및/또는 구조적 특징(즉, 변경된 특성)에 있어서 변형을 나타내는 유전자 또는 유전자 생성물을 나타낸다. 천연적으로 존재하는 돌연변이체가 분리될 수 있으며; 이들은, 이들이 야생형 유전자 또는 유전자 생성물과 비교하는 경우 변경된 특성을 가진다는 사실에 의해 확인됨에 주목한다.
I. 예시적인 폴리뉴클레오타이드 및 단백질
본 발명은 변형된 루시퍼라제 또는 이의 단백질 단편, 예를 들면, 야생형 루시퍼라제와 비교하여 결손, 예를 들면 1 내지 약 5개 잔기의 결손을 갖는 것들, 및 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 이의 키메라(융합체)(참조: 이의 기재내용이 본원에 참조로 인용된 미국 특허 일련번호 제60/985,585호 및 제11/732,105호)를 포함하며, 당해 치환은 향상된 안정성, 향상된 발광성, 예를 들면, 증가된 발광성 방사, 발광성 역학의 보다 큰 안정성, 또는 변경된 발광 색상, 또는 이들 둘다를 갖는 변형된 루시퍼라제를 생성한다. 변형된 루시퍼라제의 루시퍼라제 서열은 상응하는 야생형 루시퍼라제의 아미노산 서열과 실질적으로 동일하다. 실질적으로 동일한 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 크게는 동일한, 그러나 전체적으로는 동일하지 않고, 이것이 관련된 서열의 기능적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 의미한다. 일반적으로, 2개의 아미노산 서열은, 이들이 적어도 60%, 예를 들면, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 그러나 100% 미만의 아미노산 서열 동일성이 있는 경우 동일하거나 실질적으로 상동성이다. 하나의 양태에서, 변형된 루시퍼라제는 재조합체 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된다.
상동성 또는 동일성은 흔히 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정될 수 있다. 이러한 소프트웨어는 다양한 결손, 치환 및 다른 변형에 대해 상동성 정도를 지정함으로써 유사한 서열과 조화를 이룬다. 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열과 관련하여 용어 "상동성" 및 "동일성"은 특정한 수의 서열 비교 알고리즘 또는 수동 정렬 또는 가시적 관측에 의해 측정된 것으로서 비교 윈도우 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대 상응성에 대해 비교하고 정렬한 경우 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 규정된 퍼센트를 가지거나 동일한 2개 이상의 서열 또는 아서열(subsequnce)을 나타낸다.
서열 비교의 경우, 통상적으로 하나의 서열은 이에 대해 시험 서열을 비교하는, 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 참조 서열은 컴퓨터내로 도입시키고, 필요에 따라 아서열 배위를 지정하며 서열 알고리즘 프로그램 매개변수를 지정한다. 디폴트 프로그램 매개변수를 사용하거나, 대안의 매개변수를 지정할 수 있다. 이후에, 서열 비교 알고리즘을 프로그램 매개변수를 기준으로 하여, 참조 서열에 대해 시험 서열에 대한 서열 동일성 퍼센트를 계산한다.
비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 문헌[참조: Smith et al.(1981)]의 국소 상동성 알고리즘에 의해, 문헌[참조: Needleman et al.(J. Mol. Biol., 48:443(1970)]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌[참조: Person et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444(1988)]의 유사성 방법에 대한 연구에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터처리된 실행[미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575에 소재하는, 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group)에서 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA]에 의해, 또는 수동적 정렬 및 육안 검사에 의해 수행할 수 있다.
이들 수학적 알고리즘의 컴퓨터 실행은 서열을 비교하여 서열 동일성을 측정하기 위해 이용될 수 있다. 이러한 실행은 다음을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: PC/유전자 프로그램에서 CLUSTAL[캘리포니아주 마운틴 뷰에 소재하는 인텔리제네틱스(Intelligenetics)에서 시판]; ALIGN 프로그램(버젼 2.0) 및 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지, 버젼 8내 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, 및 TFASTA(미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575에 소재하는 제네틱스 컴퓨터 그룹(GCG)에서 시판). 이들 프로그램을 사용한 정렬은 디폴트 매개변수를 사용하여 수행할 수 있다. CLUSTAL 프로그램은 문헌[참조: Higgins et al., Gene, 73:237(1988); Higgins et al., CABIOS, 5:157(1989); Corpet et al., Nucl. Acids Res., 16:1088(1988); Huang et al., CABIOS, 8:155(1992); and Pearson et al., Methods Mol. Biol., 24:307(1994)]에 잘 기술되어 있다. ALIGN 프로그램은 문헌[참조: Myers and Miller, LABIOS, 4:11(1988)]의 알고리즘에 기초한다. BLAST 프로그램[참조: Altschul et al.(J. Mol. Biol., 215:403(1990)]은 문헌[참조: Karlin and Altschul(PNAS USA, 90:5873(1993)]의 알고리즘에 기초한다.
BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 공공 이용가능하다. 당해 알고리즘은 문제의 서열내 W 길이의 짧은 단어를 확인함으로서 고 점수 서열 쌍(HSP)을 우선 확인하며, 이는 데이터베이스 서열내 동일한 길이의 단어와 정렬되는 경우 일부 양성-값의 한계 점수와 조화를 이루거나 만족한다. T는 이웃하는 단어 점수 한계로서 언급된다[참조: Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403(1990)]. 이들 초기 이웃하는 단어 히트(hit)는 이들을 함유하는 보다 긴 HSP를 발견하기 위해 조사를 개시하기 위한 씨드(seed)로서 작용한다. 이후에, 단어 히트는 각각의 서열을 따라 양 방향으로 누적 정렬 점수가 증가될 때가지 연장된다. 누적 점수는 뉴클레오타이드 서열의 경우, 매개변수 M(조화를 이룬 잔기의 쌍에 대한 보상 점수; 항상 > 0) 및 N(조화를 이루지 않은 잔기에 대한 벌칙 점수; 항상 < 0)를 사용하여 계산한다. 아미노산 서열의 경우, 점수매김 매트릭스를 사용하여 누적 점수를 계산한다. 각각의 방향에서 단어 히트의 연장은, 누적 정렬 점수가 이의 최대로 달성된 값으로부터 양 X에 의해 감소되는 경우 중단되며, 누적 점수는 하나 이상의 음성-점수 잔기 정렬의 누적, 또는 한쪽 서열의 끝이 도달함으로 인해 0 또는 그 이하로 된다.
서열 동일성 퍼센트를 계산하는 것 외에, BLAST 알고리즘을 또한 2개의 서열 사이의 유사성의 통계적 분석을 수행한다[참조: 예를 들면, Karlin and Altschul, PNAS USA, 90:5873(1993)]. BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성의 한 척도는 최저 합 가능성(P(N))이며, 이는, 2개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 사이의 조화가 우연히 발생할 가능성의 지표를 제공한다. 예를 들어, 시험 핵산 서열은, 참조 핵산 서열에 대한 시험 핵산 서열의 비교시 최저 합 가능성이 약 0.1 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 및 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우 참조 서열과 유사한 것으로 고려된다.
비교 목적을 위한 갭이 있는(gapped) 정렬을 수득하기 위하여, 갭이 있는 BLAST(BLAST 2.0에서)를 문헌[참조: Altschul et al.(Nuc. Acids Res., 25:3389(1997)]에 기술된 바와 같이 이용할 수 있다. 달리는, PSI-BLAST(BLAST 2.0내)를 사용하여 분자들 사이에 명백한 관계를 검출하는 반복된 조사를 수행할 수 있다. 참조: Altschul et al., supra를 참조한다. BLAST, 갭이 있는 BLAST, PSI-BLAST를 이용하는 경우, 각각의 프로그램(예를 들면, 뉴클레오타이드 서열의 경우 BLASTN, 단백질의 경우 BLASTX)의 디폴트 매개변수를 사용할 수 있다. BLASTN 프로그램(뉴클레오타이드 서열의 경우)은 디폴트로서, 11의 단어 길이(W), 10의 예측(E), 100의 컷오프(cutoff), M=5, N=-4, 및 양쪽 쇄를 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 단어길이(W), 10의 예측(E), 및 BLOSUM62 점수매김 매트릭스[참조: see Henikoff and Henikoff, PNAS USA, 89:10915(1989)]를 사용한다(참조: "www.ncbi.nlm.nih.gov").
특히, 폴리펩타이드는 실질적으로 다른(참조) 폴리펩타이드와 관련되지만 보존적 또는 비보존적 변이에 대해 관련될 수 있다. 보존적 변이는 아미노산 잔기의 천연적으로 존재하거나 비천연적으로 존재하는 아미노산 잔기를 포함하는 다른, 생물학적으로 유사한 잔기에 의한 치환을 나타낸다. 보존적 변이의 예는 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌과 같은 하나의 소수성 잔기의 다른 것으로의 치환, 또는 아르기닌의 라이신으로의 치환, 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환, 또는 글루타민의 아스파라긴으로의 치환 등과 같은 하나의 극성 잔기의 다른 것으로의 치환을 포함한다. 보존적 치환의 다른 예시적인 예는 알라닌에서 세린으로; 아르기닌에서 라이신으로; 아스파라긴에서 글루타민 또는 히스티딘으로; 아스파르테이트에서 글루타메이트로; 시스테인에서 세린으로; 글루타민에서 아스파라긴으로; 글루타메이트에서 아스파르테이트로; 글리신에서 프롤린으로; 히스티딘에서 아스파라긴 또는 글루타민으로; 이소류신에서 류신 또는 발린으로; 류신에서 발린 또는 이소류신으로; 라이신에서 아르기닌, 글루타민, 또는 글루타메이트로; 메티오닌에서 류신 또는 이소류신으로; 페닐알라닌에서 타이로신, 류신 또는 메티오닌으로; 세린에서 트레오닌으로; 트레오닌에서 세린으로; 트립토판에서 타이로신으로; 타이로신에서 트립토판 또는 페닐알라닌으로; 발린에서 이소류신에서 류신으로의 변화를 포함한다. 본 발명의 변형된 루시퍼라제는 향상된 안정성, 발광성 또는 이들 모두를 생성하는 보존적 또는 비보존적 치환을 갖는다.
본 발명의 변형된 루시퍼라제 단백질 또는 융합 단백질은 재조합체 방법 또는 고체 상 화학적 펩타이드 합성 방법에 의해 제조할 수 있다. 이러한 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
II. 변형된 루시퍼라제 또는 이의 융합체를 암호화하는 벡터 및 숙주 세포
발광성 활성을 가진 것 또는 다른 분자에 의해 보충되어 발광성 활성을 생성할 수 있는 것 또는, 발광성 활성과의 이의 융합체와 같은, 변형된 루시퍼라제를 암호화하는 바람직한 핵산 분자, 이의 단편이 제조되면, 변형된 루시퍼라제, 이의 단편, 예를 들면, 보충을 위한 것, 또는 발광성 활성을 갖는 이의 융합체를 암호화하는 발현 카세트를 제조할 수 있다. 예를 들어, 변형된 루시퍼라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 임의로 전사 조절 서열, 예를 들면, 하나 이상의 인핸서, 프로모터, 전사 종결 서열 또는 이의 조합에 작동적으로 연결시켜 발현 카세트를 형성시킨다. 핵산 분자 또는 발현 카세트는 벡터, 예를 들면, 선택가능한 마커 유전자를 임의로 포함하는 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 및 목적 세포, 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli), 스트렙토마이세스 아종(Streptomyces spp.), 바실러스 아종(Bacillus spp.), 스타필로코쿠스 아종(Staphylococcus spp.) 등과 같은 원핵 세포, 및 식물(쌍떡잎 또는 외떡잎), 진균, 효모, 예를 들면, 피키아(Pichia), 사카로마이세스(Saccharomyces) 또는 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 또는 포유동물 세포와 같은 진핵 세포, 또는 이의 분해물 또는, 시험관내 전사/해독 혼합물로 도입된 벡터내로 도입시킬 수 있다. 포유동물 세포는 소, 염소, 양, 개, 고양이, 비-인간 영장류, 예를 들면, 유인원 및 인간 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 포유동물 세포주는 CHO, COS, 293, HeLa, CV-1, SH-SY5Y, HEK293, 및 NIH3T3 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
암호화된 변형된 루시퍼라제의 발현은 합성 프로모터를 포함하는 원핵 세포 또는 진핵 세포내에서 발현할 수 있는 어떠한 프로모터에 의해서도 조절될 수 있다. 원핵세포 프로모터는 프로모터 활성을 갖는 임의의 단편을 포함하는, SP6, T7, T5, tac, bla, trp, gal, lac 또는 말토즈 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 진핵세포 프로모터는 프로모터 활성을 갖는 어떠한 단편도 포함하는, 구성적 프로모터, 예를 들면, CMV, SV40 및 RSV 프로모터와 같은 바이러스 프로모터뿐만 아니라, 조절가능한 프로모터, 예를 들면, tet 프로모터, hsp70 프로모터 및, CRE에 의해 조절되는 합성 프로모터와 같은 유도성 또는 억압성 프로모터도 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 핵산 분자, 발현 카세트 및/또는 벡터는 칼슘 매개된 형질전환, 전기천공, 미세주입, 지질감염 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 어떠한 방법에 의해서도 세포내로 도입될 수 있다.
III. 변형된 루시퍼라제를 암호화하는 최적화된 서열, 및 벡터 및 숙주 세포
본 발명의 변형된 루시퍼라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자(폴리뉴클레오타이드), 이의 단편 또는 이의 융합체가 또한 제공된다. 하나의 양태에서, 분리된 핵산 분자는 적어도 하나의 선택된 숙주내에서 발현을 위해 최적화된 핵산 서열을 포함한다. 최적화된 서열은 코돈 최적화된, 즉, 다른 유기체, 예를 들면, 밀접하게 관련된 유기체에 비해 하나의 유기체내에서 보다 흔히 사용되는 코돈, 및 또한 코작 서열(Kozak sequence) 및/또는 인트론을 가하거나 변형시키고/시키거나 바람직하지 않은 서열, 예를 들면, 잠재적인 전사 인자 결합 부위를 제거하기 위한 변형을 포함한다. 이러한 최적화된 서열은, 숙주 세포내로 도입되는 경우, 향상된 발현, 예를 들면, 증가된 수준의 단백질 발현을 생산할 수 있다.
하나의 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 변형된 루시퍼라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하며, 당해 핵산 서열은 포유동물 숙주 세포내에서 발현을 위해 최적화된다. 하나의 양태에서, 최적화된 폴리뉴클레오타이드는 상응하는 비-최적화된 서열에 더이상 하이브리드화하지 않는데, 예를 들면, 중간 또는 고 스트링전시(stringency) 조건하에서 비-최적화 서열에 하이브리드화되지 않는다. 용어 "스트링전시"는, 핵산 하이브리드화가 수행되는 온도 조건, 이온 강도 및, 다른 화합물의 존재의 조건을 참조하여 사용된다. "고 스트링전시" 조건을 사용하면, 핵산 염기 쌍화(pairing)는 상보성 염기 서열의 높은 빈도를 갖는 핵산 단편들 사이에서만 일어날 것이다. 따라서, "중간" 또는 "저" 스트링전시는 흔히, 서로에 대해 완전한 상보성이 아닌 핵산이 함께 하이브리드화되거나 어닐링되는 것이 요구되는 경우에 흔히 필요하다. 당해 분야에는, 다수의 동등한 조건을 사용하여 중간 또는 저 스트링전시 조건을 포함시킬 수 있다는 것이 알려져 있다.
다른 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 상응하는 최적화되지 않은 서열에 대해 90% 미만, 예를 들면, 80% 미만의 핵산 서열 동일성을 가지며 최적화되지 않은 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드와 적어도 60%, 예를 들면, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 그러나 100% 미만의 폴리펩타이드를 임의로 암호화한다. 예를 들면, 최적화된 핵산 서열을 갖는 분리된 핵산 분자를 포함하는 작제물, 예를 들면, 발현 카세트 및 벡터뿐만 아니라 분리된 핵산 분자, 작제물 또는 벡터를 포함하는 키트가 또한 제공된다.
본 발명의 변형된 루시퍼라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자, 이의 단편 또는 이의 융합체는 특수한 숙주 세포에서 발현을 위해 최적화되며 또한 전사 조절 서열, 예를 들면, 하나 이상의 인핸서, 프로모터, 전사 종결 서열 또는 이의 조합에 임의로 작동적으로 연결되어 발현 카세트를 형성한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 변형된 루시퍼라제를 암호화하는 핵산 서열, 이의 단편 또는 이의 융합체는 야생형 루시퍼라제 서열내 코돈, 예를 들면, 적어도 25%의 코돈을 특수(선택된) 세포내에서 우선적으로 사용된 코돈으로 대체함으로써 최적화된다. 바람직한 코돈은 선택된 세포내에서 비교적 높은 코돈 사용 빈도를 가지며, 바람직하게 이들의 도입은 선택된 숙주 세포내 존재하는 전사 인자에 대한 비교적 적은 전사 인자 결합 부위의 도입, 및 비교적 적은 다른 바람직하지 않은 구조적 기여물을 유도한다. 따라서, 최적화된 핵산 생성물은 개선된 코돈 사용 빈도에 기인한 개선된 발현 수준, 및 감소된 수의 바람직하지 않은 전사 조절 서열로 인한 부적절한 전사 거동의 감소된 위험을 가질 수 있다.
분리되고 최적화된 핵산 분자는 30%, 35%, 40% 이상 또는 45% 이상, 예를 들면, 50%, 55%, 60% 이상의 코돈에서 상응하는 야생형 핵산 서열의 것과는 상이한 코돈 조성물을 가질 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 예시적인 코돈은 특수 유기체내에서 동일한 아미노산에 대해 적어도 하나의 다른 코돈보다 더 흔하게 사용되는 것들이며, 하나의 양태에서 또한 유기체내에서 낮은-사용 코돈이 아니고 핵산 분자의 발현을 위해 클로닝하거나 스크리닝하기 위해 사용된 유기체내에서 낮은-사용 코돈이 아니다. 또한, 특정 아미노산(즉, 3개 이상의 코돈을 가진 아미노산)에 대한 코돈은 다른(바람직하지 않은) 코돈(들)보다 더 흔히 사용되는 2개 이상의 코돈을 포함할 수 있다. 다른 유기체에서 보다 하나의 유기체내에서 보다 흔히 사용되는 핵산 분자내 코돈의 존재는, 이들 코돈을 보다 흔히 사용하는 유기체의 세포내로 도입되는 경우, 이들 세포내에서 야생형 또는 모 핵산 서열의 발현보다 더 높은 수준에서 이들 세포내에서 발현되는 핵산 분자를 생성한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 상이한 코돈은 포유동물에서 보다 흔히 사용된 것들인 반면, 다른 양태에서, 상이한 코돈은 식물에서 보다 흔히 사용된 것들이다. 상이한 유기체에 대한 바람직한 코돈은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, 참조: www.kazusa.or.jp./codon/). 특수 유형의 포유동물, 예를 들어, 인간은 포유동물의 다른 유형보다 바람직한 코돈의 상이한 세트를 가질 수 있다. 유사하게, 특수 유형의 식물은 다른 유형의 식물보다 바람직한 코돈의 상이한 세트를 가질 수 있다. 본 발명의 하나의 양태에서, 상이한 코돈의 대부분은 바람직한 숙주 세포내에서 바람직한 코돈이다. 포유동물(예를 들면, 인간) 및 식물을 포함하는 유기체에 대한 바람직한 코돈은 당해 분야에 공지되어 있다[참조: 예를 들면, Wada et al., Nucl. Acids Res., 18:2367(1990); Murray et al., Nucl. Acids Res., 17:477(1989)].
IV. 안정성 향상을 위한 예시적인 루시퍼라제
심해 새우 오플로포러스 그리실리로스트리스로부터 분비된 루시퍼라제는 고 활성, 고 양자 수율 및 광범위한 기질 특이성(코엘렌테라진, 코엘렌테라진 동족체)와 같은 많은 흥미있는 특성을 소유하는 것으로 밝혀졌다. 오플로포러스의 생발광성 반응은, 코엘렌테라진(루시페린)의 분자 산소를 사용한 산화가 오플로포러스 루시퍼라제에 의해 촉매되는 경우, 발생하여 462 nm에서 최대 강도의 광 및 생성물 CO2 및 코엘렌테라미드를 생성한다[참조: Shimomura et al., Biochemistry, 17:994(1978); 이는 454nm를 언급하는 문헌(참조: Inouye 2000)과 상이하다]. 최적 발광성은 pH 9에서 0.05 내지 0.1M NaCl의 존재하에 40℃에서 일어나며, 열에 대한 당해 효소의 특수한 내성으로 인하여, 가시적인 발광성은, 고도로 정제된 효소가 사용되는 경우, 50℃ 초과의 온도에서, 또는 부분 정제된 효소가 사용되는 경우 70℃ 초과에서 일어난다. pH 8.7에서, 천연의 루시퍼라제는, 명백하게 31,000의 4개 단량체를 포함하여, 대략 130,000의 분자량을 가지며; 보다 낮은 pH에서, 천연의 루시퍼라제는 중합하는 경향이 있다.
성숙한 단백질은 19 kDa 및 35 kDa 단백질(2개의 19 kDa 성분 및 2개의 35 kDa 성분으로 이루어진 이종사합체)로 이루어진다. 19 kDa 단백질(OgLuc)은 이. 콜라이내에서 단량체로서 과발현되며 활성인 것으로 밝혀졌으나, 이는 봉입체(inclusion body)로서 주로 생산된다. 봉입체의 형성은 세포내 단백질의 불안정성에 기인하는 것 같다.
OgLuc의 3D 구조는 이용가능하지 않다. 또한, OgLuc가 다른 루시퍼라제에 대해 어떠한 서열 상동성도 가지지 않고 다른 공지된 단백질에 대해 현저한 전체적인 서열 유사성이 없기 때문에, 이용가능한 공지된 상동성에 기초한 모델은 존재하지 않는다. 모델을 생성시키기 위하여, 명백한 동종 단백질을 확인하기 위해 설계한 폴드 인식 방법을 사용하였다. 본원의 하기에 기술된 바와 같은 접근을 사용하여, 칼리신 단백질 상과에 속하는 지방산 결합 단백질(FABP)의 세트를 확인하였고, OgLuc 상동성 모델을 이들 FABP 중의 3개의 3D 구조를 기초로 생성하였다.
칼리신은, 이의 구성원이 유사한 β-장벽 구조를 공유하는 단백질 상과이다. 구성원은 지방산 결합 단백질(FABP) 및 리포칼린을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. FABP 단백질 계열은 10개 쇄 불연속 β-장벽 구조를 가지며, 아비딘 및 MPI 장벽은, 비록 8개 쇄라고 해도, 리포칼린의 것보다 교차-단면에서 더 환형이며 C-말단 나선 또는 쇄 I를 가지지 않지만, 트리아빈은 유사한 장벽 기하학을 가지며 여전히 변형된 위상을 갖는다. FABP 및 리포칼린의 N- 및 C-말단 쇄는 하나에서 다른 것으로의 형질전환을 수행하는데 필수적인 2개의 중심 쇄의 손실(리포칼린에 대해 FABP) 또는 획득(FABP에 대해 리포칼린)과 함께 밀접하게 겹쳐질 수 있다[참조; Flower et al., Protein Science, 2:753(1993)]. 또한, 일부 기능적 유사성(소수성 리간드 결합 및/또는 거대분자 상호작용)을 초과하여, 이들 계열들은, 당해 계열들이 전반적인 서열 유사성을 공유하지 않는다고 해도, 이들의 구조내 대부분이 구조적으로 등가일 수 있는 유사한 폴딩 패턴(크게 +I 위상으로 우세한 역평행 β-장벽)으로 특징화된다.
선행 연구[참조: Flower, Protein Pept. Lett., 2:341(1995)]는, 또한 칼리신 상과의 구성원이 또한 명백한 구조적 패턴을 공유함을 나타낸다. 수소 결합을 형성하는 아르기닌 또는 라이신 잔기(β-장벽의 마지막 쇄로부터)는 N-말단 310-유사 나선형의 주 쇄 카보닐 그룹에 결합하고 보존된 트립토판(β-장벽의 제1 쇄로부터)을를 가로질러 채운다. 당해 패턴은, 또한 루프 L6 및 보다 구조적으로 다양한 외부(outlier) 리포칼린에서 보존된 상호작용을 공유하는, 견과류 리포칼린의 구조에서 둘다 관측될 수 있다. 이는 또한 칼리신을 포함하는 다른 4개의 계열에서 명백하다. 스트렙타비딘 및 닭 아비딘의 이용가능한 구조, 어위니아 크리산테미(Erwinia chrysanthemi) 유래의 메탈로프로티나제 억제제, 및 트리아빈의 구조의 실험 모두는, 상호작용하는 잔기의 매우 유사한 정렬을 나타낸다. 공지된 FABP의 대부분은 상기 기술한 것과 유사한 측쇄 상호작용의 정렬을 가지며, 여기서, FABP 장벽의 제1 쇄로부터의 트립토판은 최종의 것의 말단 근처로부터의 아르기닌에 대해 채워진다. 그러나, 당해 특징은 곤충 근육 FABP에 의해 전형화된 보다 고도로 다양화된 FABP의 그룹으로부터 결여되어 있다.
OgLuc 상동성 모델은, 칼리신이 N- 및 C-말단을 수소 결합과 함께 효과적으로 묶고, 3개의 FABP내에 존재하는, 칼리신 폴드 구조적 신호가 OgLuc내에 완전하게 보존되지 않음을 나타낸다. 명백한 구조적 신호(여기서, 아르기닌 또는 라이신은 짧은 310 나선의 주 쇄 카보닐과 다수의 강력한 수소 결합을 형성할 수 있으며 구조적으로 겹쳐질 수 있는, 비-무작위적 방식으로 보존된 트립토판을 채운다)는 칼리신 구성원 계열에 일반적인 서열 결정인자: 특징적인 N-말단 서열 패턴, 주요 잔기의 디스플레잉 보존, 및 보다 약한 C-말단 모티프에 상응한다. 구성원 계열을 통한 특수 잔기 및 상호작용의 보존은 칼리신 상과에 대하여 일반적이었고, 매우 명백한 경우, 진화 기원이었다는 시각을 일부 지지한다. 본 OgLuc 모델은, C-말단 근처의 OgLuc 잔기 Asn166이 N-말단 근처의 주 쇄 카보닐과 수소결합할 수 없음을 예측한다. 그러나, 166번 위치에서 Arg 또는 Lys을 함유하는 돌연변이체의 모델은, 당해 구조 모티프의 복원이 세포내에서 OgLuc의 구조적 안정성 및 이의 발현/활성을 개선시킬 수 있음을 제안한다.
본 발명을 이제 하기의 비-제한적인 실시예로 추가로 기술할 것이다.
실시예 1
OgLuc의 단점은 단백질 가공에 의해 지적될 수 있었으나, 효율적인 방식으로 이렇게 하는 것은 OgLuc의 3-차원(3D)에 대한 지식을 필요로 한다. OgLuc의 공지된 실험적인 3차 구조 또는 3차 구조 모델은 존재하지 않는다. 상동성 모델링을 사용하여 OgLuc의 3차 구조 모델을 생성하였다. 상동성 모델의 작제는 3D 구조적 주형(들)의 확인, 표적 서열(예를 들면, OgLuc) 및 주형 구조(들)의 정렬, 및 모델 품질 평가를 포함하는 수개의 단계를 포함한다. OgLuc에 대한 하나 이상의 3D 구조적 주형의 확인은, 표준 서열 조사 방법이 공지된 3차 구조를 지닌 단백질에 대해 현저한 전체 유사성을 확인하지 않았기 때문에, 직관적이지 않았다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 2개의 접근을 사용하여 공지된 3차 구조를 가진 원격 OgLuc 동족체를 확인하였다.
접근 1:
주형 라이브러리 조사[참조: Karplus et al., Bioinformatics, 14:846(1998)]에 기초한 숨겨진 마르코브 모델(Hidden Markov Model: HMM)을 사용하여 http://swissmodel.expasy.org//SWISS-MODEL.html[참조: Arnold et al., Bioinformatics, 22:195(2006)]에서 SWISS-MODEL 주형 확인 도구를 사용하여 명백하게 관련된 주형 구조를 검출하였다.
당해 접근을 사용하여 OgLuc에 대해 확인된 가장 우수한(최대 E-값 점수) 구조 주형은 지방산 결합 단백질(FABP)(단백질 데이터 뱅크(PDB) 수탁 번호 제1VYF호)이었다[참조: Angelucci et al., Biochemistry, 43:13000(2004)]. PDB 수탁 번호 제1PMP호 및 제1CRB호를 포함하는, 보다 낮은 점수를 갖는 추가의 FABP를 또한 확인하였다.
표적 서열(OgLuc, 잔기 1-2 및 168-169번은 삭제)의 예시적 정렬 및 확인된 3D 구조 주형의 서열(1VYF, 1PMP, 1CRB)은 하기 나타낸다. 낮은 서열 유사성으로 인하여, 정렬내 갭의 위치가 변할 수 있음에 주목한다.
Figure pct00003
접근 2:
또한, https://genesilico.pl/meta2[참조: Kurowski et al., Nucl . Acids Res., 31:3305(2003)]에서 "GeneSilico meta-server"를 사용하는 폴드 인식 방법을 사용하여 공지된 3차 구조를 가진 원격 OgLuc 동족체를 확인하였다.
단백질 폴드는 3D 구조 분류이다. 동일한 폴드를 공유하는 단백질은 단백질 서열 수준에서 진화 관련성의 증거를 필수적으로 나타내지 않고 규칙적인 2차 구조의 유사한 배열을 갖는다.
당해 방법을 사용하여, 3개의 최대 점수매김 3D 구조 주형을 확인하였다(PDB 수탁 번호 제1VYF호, 제1PMP호, 및 제1CRB호). 표적 서열(OgLuc) 및 3D 구조 주형(1VYF, 1PMP, 1CRB)의 서열의 예시적인 정렬은 하기 나타낸다. 낮은 서열 유사성으로 인하여, 정렬내 갭의 정확한 위치는 확실하게 예측하기 어렵다.
OgLuc 및 1PMP:
Figure pct00004
OgLuc 및 FABP:
Figure pct00005
상기 접근에서 생성된 정보를 사용하여, OgLuc 상동성 모델을 3개의 FABP 3D 구조 주형(1PMP, 1CRB, 및 1VYF)을 기초로 하여 디스커버리 스튜디오(Discovery Studio) 및 모델러 소프트웨어(MODELER software)[제조원: 악셀리스 소프트웨어 인코포레이티드(Accelrys Software Inc.)]를 사용하여 생성하였다.
도 1은 또한 FABP 및 OgLuc의 2차 구조 정렬을 나타낸다. 1PMP, 1CRB, 1VYF는 공지된 3D 구조를 갖는 예시적인 FABP 서열을 암호화하는 단백질 데이터 뱅크(www.rcsb.org) 수탁 암호이다. "PDB"는 3D 구조 정보를 단백질 데이터 뱅크로 기탁한 저자가 제공한 2차 구조 지정을 의미한다. "DSC"는 DSC 방법[참조: King et al., Protein Science, 5:2298(1996)]을 기초로 한 2차 구조 예측을 의미한다. "카바슈 및 산더(Kabasch and Sander)"는 카바슈 및 산더 방법[참조: Kabasch and Sander, Biopolymers, 22:2577(198)]을 기초로 한 2차 구조 예측을 의미한다. 적색 박스는 나선 2차 구조 성분의 대략적인 연장을 나타내며, 청색 화살표는 베타-시트 2차 구조의 대략적인 연장을 나타내며, 회색 바(bar)는 나선형 또는 베타-시트 이외의 2차 구조를 나타낸다. 칼리신 구조 신호의 보존된 잔기 상의 중심에 있는 서열 모티프[참조: Flower et al., Biochem. Biophys. Acta., 16:1088(2000)]는 정렬내에서 관측될 수 있다. 보다 고도로 보존된 N-말단 MOTIF1은 OgLuc 잔기 Trp10을 포함하고 덜 보존된 C-말단 MOTIF2는 OgLuc 잔기 N166을 포함한다. 2차 정렬을 위해, 대략적인 쌍 방식의 단백질 서열 동일성 퍼센트는 OgLuc-1PMP 14%, OgLuc-1CRB 9%, 및 OgLuc-1VYF 15%이다.
도 2는 와편모충 루시퍼라제, FABP 및 OgLuc의 2차 구조 정렬을 나타낸다. 1VPR 및 1HMR은 공지된 3D 구조를 지닌 서열에 대한 단백질 데이터 뱅크(www.rcsb.org) 수탁 암호이다. 1VPR은 와편모충 루시퍼라제 도메인 3이고 1HMR은 인간 근육 FABP, 즉 와편모충 루시퍼라제에 대해 가장 밀접하게 관련된 단백질이다[참조: Schultz et al., PNAS USA, 102:1378(2005)]. "카바슈 및 산더"는 카바슈 및 산더 방법[참조: Kabasch and Sander, Biopolymers, 22:2577(1983)]을 기초로 한 2차 구조 예측을 의미한다. 적색 박스는 나선 2차 구조 성분의 대략적인 연장을 나타내며, 청색 화살표는 베타-시트 2차 구조 성분의 대략적인 연장을 나타내고, 회색 바는 나선형 또는 베타-시트 이외의 2차 구조를 나타낸다. 1VPR은 서열번호 21을 갖고; 1HMR은 서열번호 22를 갖는다.
도 3은 FABP의 3D 구조 중첩을 기초로 한 OgLuc 및 각종 FABP(각각 서열번호 1, 3, 4, 5, 및 17-20)의 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다.
실시예 2
지방산 결합 단백질(FABP)은 칼리신 단백질 상과에 속한다. 칼리신은 서열 수준에서 현저한 전체적인 유사성을 가지고 있지 않지만, 명백한 구조적 신호: 짧은 310 나선형의 주 쇄 카보닐과 다수의 강력한 수소 결합을 형성할 수 있고 보존된 트립토판(N-말단 근처)을 가로질러 채우는 아르기닌 또는 라이신(C-말단 근처)을 가진 관련된 베타-장벽 구조를 공유한다[참조: Flower et al., Biochem. Biophys. Acta, 1482:9(2000)]. 실시예 1에서 생성된 OgLuc 모델에서, 칼리신 구조적 신호는 단지 부분적으로만 존재한다. N-말단 근처의 보존된 트립토판(Trp10)(예: 베타-장벽의 N-말단 베타-시트중 하나)은 C-말단 근처의 아르기닌 또는 라이신(예: 베타-장벽의 C-말단 베타-시트내 하나) 대신 아스파라긴(Asn166)을 가로질러 채운다. 현재의 모델은, 보다 짧은 아스파라긴 측쇄가 N-말단(베타-장벽의 N-말단 베타-시트내) 근처의 잔기와 수소결합을 형성할 수 없는 것으로 보인다. 치환 Asn166Arg 및 Asn166Lys이 이루어진 OgLuc 모델은, OgLuc내 보다 긴 아르기닌 및 라이신 측쇄가 N-말단 근처의 주 쇄 카보닐 및/또는 잔기의 측쇄와 하나 이상의 결합, 예를 들면 하나 이상의 수소 결합을 형성할 수 있음을 입증하였다. 예를 들어, 이들은 N-말단 근처의 OgLuc 잔기 Asp9 및/또는 Gly8 및/또는 Asp5와 하나 이상의 수소 결합을 형성할 수 있다. 또한, 이들은 166번 위치에 대해 밀접한 공간 근접성에 있는 다른 2차 구조 성분내 하나 이상의 잔기, 예를 들면, Asn144 및/또는 Gly147와 하나 이상의 수소 결합을 형성할 수 있다. 따라서, Asn166Arg 또는 Asn166Lys 돌연변이를 가진 OgLuc내 칼리신 구조적 신호의 복원은 베타-장벽(또는 베타-장벽의 말단 베타-시트) 및 가능하게는 다른 2차 구조 성분의 2개 말단을 함께 효과적으로 묶을 수 있다. 이는 단백질 구조의 전체적인 안정성 및 따라서, OgLuc 활성을 개선시킬 수 있었다.
예시적인 OgLuc 단백질 서열은 다음과 같다:
Figure pct00006
예시적인 OgLuc 뉴클레오타이드 서열은 다음과 같다;
Figure pct00007
상기 목록에서 문자화된 서열번호 2의 AAC 코돈은 서열번호 1의 야생형 OgLuc 서열내 166번 아미노산 위치에 상응한다. 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열은 또한 ATG 코돈(메티오닌/출발 신호) 및 발현 시스템에서 사용 편의를 위한 개시부의 GTG 코돈(발린)을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 치환된 잔기를 확인하기 위해 본 명세서 전체에서 사용된 아미노산 번호매김은 서열번호 1의 성숙한 야생형 OgLuc 폴리펩타이드 서열에 대해 제공된다. 천연적으로 존재하는 야생형 OgLuc 서열은 후에 분해되어 서열번호 1에 나타낸 것과 같은 성숙한 야생형 폴리펩타이드의 생성을 유도하는 다른 아미노산을 사용하여 초기에 합성될 수 있다. 예를 들면, 시그날 서열(예를 들면, 소포체와 같은 특수 세포기관에 대해 ㅅ;stpd 단백질을 지시하고/하거나 분비용 단백질을 지시하기 위함)은 신생 단백질의 개시부에 존재할 수 있으며 이후에 분해되어 성숙한 야생형 단백질을 생산할 수 있다.
OgLuc 및 3개의 FABP의 예시적인 정렬은 하기 나타낸다.
Figure pct00008
실시예 3
발광성이 증가된 변형된 루시퍼라제 변이체의 생성
달리 기술하지 않는 한, 무작위적인 치환을 가진 출발하는 OgLuc 서열의 변이체를 오류-유발(error-prone), 돌연변이유발성 PCR-계 시스템 진모르프 II 무작위 돌연변이유발 키트(GeneMorph II Random Mutagenesis Kit)[Stratagene; Daughtery, PNAS USA 97(5):2029(2000)]를 사용하여 제조업자의 지시, 및 당해 분야에 공지된 NNK 포화에 따라 생성시켰다. 수득되는 변이체를 T7계 발현[제조원: 프로메가 코포레이션(Promega Corp.)]을 위해 pF1K Flexi® 벡터와 관련하여 작제하고 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 KRX 이. 콜라이를 형질전환시키는데 사용하였다. 수득되는 라이브러리를 이. 콜라이내에서 발현시키고 출발하는 OgLuc 단백질과 비교하여 광 방사가 증가된 변이체에 대해 스크리닝하였다. 당해 분야에 공지된 표준 서열분석 기술을 사용하여 목적한 클론 각각에서 아미노산 치환을 확인하였다.
특이적인 돌연변이를 가진 출발하는 OgLuc 서열의 변이체를 올리고-계 부위-지시된 돌연변이유발 키트 퀵체인지 부위-지시된 돌연변이유발 키트(QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit)[제조원: Stratagene; Kunkel, PNAS USA 82(2):488(1985)]를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 생성시켰다.
실시예 4
광 방사 및 시그날 안정성을 측정하는 방법
OgLuc내에 아미노산 치환이 있는 변형된 루시퍼라제 변이체를 암호화하는 플라스미드 DNA를 함유하는 이. 콜라이 클론을 96-웰 플레이트 속에서 성장시키고 방치 유도(walk away induction), 예를 들면, 자동유도[참조: Shagat et al., "KRX Autoinduction Protocol: A Convenient Method for Protein Expression," Promega Notes 98:17(2008)]를 사용하여 17시간 동안 유도하였다. 각각의 변이체 및 상응하는 출발 루시퍼라제는 6개 웰 복제물을 갖는다. 세포를 150 mM HEPES pH 8.0, 100 mM 티오우레아, 0.1X PLB(제조원; 프로메가 코포레이션, 제품 번호 E194A), 0.1 mg/mL 라이소자임 및 0.001 U/μL RQ1 DNase로 이루어진 분해 완충액을 사용하여 분해하고, 인피니트 500 테칸 광도계(Infinite 500 Tecan luminometer) 상에서 레닐라 루시퍼라제 기질 시약(제조원: 프로메가 코포레이션)을 사용하여 발광성에 대해 측정하였다. 측정은 150 mM KCl, 1 mM CDTA, 10 mM DTT, 0.5% 테르기톨, 20μM 코엘렌테라진(제조원: 프로메가 코포레이션)을 함유하는 "Glo" 0.5% 테르기톨 검정 완충액("0.5% 테르기톨"), 또는 20μM 코엘렌테라진(제조원: 프로메가 코포레이션)("RLAB")을 함유하는 "섬광" RLAB 완충액(제조원: 프로메가 코포레이션)을 분해 시료에 주입하면서 첨가 직후에 수행하였다. 첨가 직후에 수행한 당해 발광성 측정은 "T=0" 시점 측정이며, 다양한 양태에서 시료에 의해 생성된 총 광 출력(발광성)의 척도로서 수행하였다. 6개 복제물의 평균 발광성을 상응하는 출발 루시퍼라제의 발광성을 지닌 변이체들 사이에서 비교하였다. 다양한 양태에서, 발광성 측정을 상응하는 출발 목적 루시퍼라제, 예를 들면, 합성 OgLuc에 대해 표준화하고, 특정 양태에서 "배"(예를 들면, 2배, 3배, 4.5배 등) 개선, 증가 등으로 언급하였다.
변이체 클론의 시그날 안정성은 검정 완충액을 시료에 첨가한 후 플레이트를 다수회 재-판독함으로써, 예를 들면, 일정 시간 동안 매 30초 또는 매 1분마다 발광성을 측정함으로써 측정하였다. 시그날 반감기를 이들 측정을 사용하여 측정하고 6개의 복제물의 평균을 상응하는 출발 루시퍼라제를 지닌 변이체들 사이에서 비교하였다. 시그날 안정성을 나타내는 반감기는 상응하는 출발 목적 루시퍼라제, 예를 들면, OgLuc에 대해 표준화하였다.
실시예 5
단백질 안정성, 즉 열안정성을 측정하는 방법
분해물 시료를 실시예 4에 기술된 바와 같이 유도된 배양물로부터 제조하였다. 복제물 96웰 플레이트내 분해물 시료를 예를 들면, 22, 30, 37, 42, 50 또는 54℃를 포함하는 다양한 온도에서 항온처리하였다. 상이한 시점에서, 플레이트를 -70℃에서 두었다. 실시예 4에 기술된 바와 같이 발광성을 측정하기 전에, 각각의 플레이트를 실온에서, 즉, 22℃에서 10분 동안 해동시켰다. 시료를 실시예 4에 기술된 0.5% 테르기톨 검정 완충액을 사용하여 검정하였다. 각각의 시점 플레이트에 대해, 실시예 4에 기술된 바와 같은 "T=0" 측정을 사용하여 단백질의 반감기를 측정하였다. 단백질 안정성을 나타내는 반감기를 상응하는 출발 목적 루시퍼라제, 예를 들면, OgLuc에 대해 표준화하였다.
실시예 6
증가된 광 방사를 갖는 변형된 루시퍼라제의 생성
OgLuc내 칼리신 구조적 신호를 복원하는 것이 전체 단백질 안정성 및 활성을 개선시키는지를 시험하기 위해서, OgLuc 서열의 합성 버젼을 설계하였다. 합성 버젼은 이. 콜라이 및 포유동물 세포에 대한 최적화된 코돈 사용 및 166번 위치에서 Asn에 대해 치환된 Arg 또는 Lys에 대한 코돈을 포함하였다. 앞서 언급한 바와 같이, 번호매김은 서열번호 1을 기초로 한다. 코돈 최적화(이. 콜라이의 경우) 및 166번 코돈에 대한 Arg 또는 Lys로의 뉴클레오타이드 변화는 합성 수단[제조원: 진 다이나믹스, 엘엘씨(Gene Dynamics, LLC)]로 가공하였다. 클론 OgLuc+N166R에서, AAC 코돈은 CGT(Arg에 대한 암호)로 변화되었다. 클론 OgLuc+N166K에서, AAC 코돈은 AAA(Lys에 대한 암호)로 변화되었다.
합성 OgLuc 유전자를 세균 또는 TnT® 토끼 망상 적혈구 용해질(제조원: 프로메가 코포레이션; T7 계 발현 시스템용 pF1K Flexi® 벡터) 내에서 과발현에 적합한 벡터내로 서브클로닝하고, KRX 이. 콜라이를 형질전환하는데 사용하였다. 개개의 콜로니를 집어서, 성장시키고, 람노즈로 유도시키고, 라이소자임을 사용하여 분해하고, 단일 동결-해동시키고, 레닐라 루시퍼라제 기질 시약(제조원: 프로메가 코포레이션)을 사용하여 베리타스(Veritas) 광도계를 사용하여 발광성에 대해 측정하였다. 토끼 망상적혈구 TnT® 반응을 제조업자의 프로토콜(제조원: 프로메가 코포레이션)에 따라 수행하고 세균 분해물과 동일한 방식으로 측정하였다.
돌연변이체를 총 광 출력(발광성)의 생산에 대해 합성의 모(즉, 개시) OgLuc 단백질에 대해 비교하였다. 이. 콜라이내에서, 발광성에 있어서 5배 및 10배 개선(각각 N166K 및 N166R)이 기질로서 코엘렌테라진을 사용하여 관측되었다. TnT® 분해물에서 4배와 7배(N166K 및 N166R) 사이에서 개선되었다. 이들 서열(166번 위치에서 Arg 또는 Lys 함유)은 향상된 안정성을 유도하는 OgLuc의 변이체를 나타낸다.
166번 위치에서 아미노산 치환된 각종 OgLuc 변이체를 밝기에 대해 분석, 예를 들면, 야생형 OgLuc보다 적어도 1.2배 더 밝은 변이체에 대해 스크리닝하였다. 다음의 치환은 야생형 OgLuc도다 적어도 1.2배 더 밝은 변이체를 수득하였다: N166K; N166R; N166A; N166L; N166P; N166Q; 및 N166S(참조: 표 1). 표 1은, 야생형 OgLuc보다 배 개선으로 나타나는 바와 같이, 가장 밝은 변이체가 아미노산 치환 N166R을 가졌음을 나타낸다.
[표 1]
야생형 OgLuc보다 166번 위치에서 아미노산 치환을 갖는 OgLuc 변이체의 발광성에 있어서 배 개선의 요약
Figure pct00009
실시예 3에 기술된 바와 같이 OgLuc+N166R 변이체의 오류-유발 PCR 및 NNK 포화를 사용한 돌연변이유발은 향상된 밝기, 예를 들면, OgLuc+N166R 변이체에 대해 적어도 1.2x 더 밝은 변이체를 수득하였다. 표 2는 N166R 치환 및 2번(S), 4번(E, S, R, G, D, T 또는 L), 11번(R, V, I, L, K 또는 T), 33번(K), 44번(I 또는 L), 45(E), 54번(F, T, V, G, W, S, 또는 L), 68번(V, Y), 75(R, K, Q, G, T 또는 A), 104번(L), 115번(E, I, Q, L, V, G, H, R, S, C, A, 또는 T), 124번(K), 135번(K), 138번(V, I, N, T, L, C, R, M 또는 K), 139번(E), 167번(V), 또는 169번(L) 잔기에서 상기 치환체들 중 하나를 포함하는 이들 변이체를 요약한다. 표 2는 반응 개시 후, 예를 들면, 기질의 주입 후 4 내지 6분의 범위내에서 시그날의 평균을 사용하는 RLAB를 사용하여 상응하는 출발 OgLuc+N166R 변이체에 비한 변이체의 발광성 배-개선에 있어서의 배 개선을 나타낸다. 나열한 각각의 아미노산 치환의 경우, 가장 개선된 치환은 처음에 나열하고 최소한으로 개선된 치환은 마지막에 나열한다. 가장 우수한 개선을 나타낸 변이체는 4, 54, 또는 138번 잔기에서 치환을 함유하는 변이체를 포함하였다.
[표 2]
상응하는 출발 OgLuc+N166R에 비한 OgLuc+N166R 변이체의 발광성에 있어서 배 개선의 요약
Figure pct00010
Figure pct00011
OgLuc+N166R 변이체의 추가의 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환을 가졌다. 이들 추가의 변이체는 나열된 아미노산 치환 및 상응하는 출발 N166R OgLuc에 비한 OgLuc+N166R 변이체의 발광성에 있어서 배 개선과 함께 표 2에 나열한다. 사일런트 돌연변이, 즉, 코돈에서 암호화된 아미노산을 변경시키지 않는 뉴클레오타이드내 변화를 포함하는 추가의 변이체가 발견되었다.
[표 3]
상응하는 출발 gLuc + N166R 에 비한 하나 이상의 아미노산 치환 및/또는 사일 런트 돌연변이를 갖는 OgLuc + N166R 변이체의 발광성에 있어서 배 개선의 요약
Figure pct00012
실시예 7
변형된 루시퍼라제에서 특이적인 치환의 평가
추가의 OgLuc 변이체는 실시예 3에 기술된 바와 같은 부위-지시된 돌연변이유발에 의해 다음 위치들 중 하나에서 치환을 갖도록 생성시켰다: 서열번호 1에 대해 2번, 4번, 11번, 44번, 54번, 90번, 115번, 124번 또는 138번. N166R과 함께 이들 위치에서의 치환은 실시예 6에서 WT OgLuc와 비교하여 증가된 총 광 출력(발광성)을 가지는 것으로 밝혀졌다. 도 5a-5c, 6a-6c, 7a-7c, 8, 9a-9d, 10a-10c,11a-11b, 12a-12b 및 33a-33e에서, "WT", "N166R", 및 "T2T"는 각각 서열번호 2, 14 및 32에 의해 암호화된 단백질을 나타낸다. "T2T+N166R"은, 각각 도 5a에서 "시료" 컬럼에 나타낸 각각의 잔기에서 치환을 갖는 서열번호 2에 의해 암호화된 단백질을 나타내는, "N166R", "A4E", "Q11R", "V44I", "A54F", "A54F + N166R", "A54I", "P115E", "P155E+N166R", "Y138I", "Q124K", "Y138C+N166R" 및 "I90V"에서의 치환을 갖는, 서열번호 32에 의해 암호화된 단백질을 나타낸다. 이들 변이체는 실시예 4에 기술된 바와 같은 발광성을 측정함으로써 평가하였다. 도 5a-5c 및 7a-7c는 0.5% 테르기톨(도 5a-5c) 또는 RLAB(도 7a-7c)를 사용하는 WT OgLuc 변이체의 T=0에서 평균 발광성을 요약한다. WT OgLuc에 비한 변이체의 발광성에 있어서 증가 배율은 도 6a-b(0.5% 테르기톨) 및 도 8(RLAB)에 나타낸다. N166R 변이체에 비한 변이체의 발광성에 있어서의 증가 배율은 도 33a (0.5% 테르기톨) 및 33b (RLAB)에 대하여 나타낸다. 도 5b, 6b 및 7b는 각각 도 5c, 6c, 및 7c에서와 동일한 데이터를 나타내지만, 상이한 규모에서 보다 명확하게 관측될 보다 작은 바(bar)를 허용한다.
상이한 변이체에서 아미노산 치환이 시그날 안정성에 있어 효과를 가졌는지를 측정하기 위하여, 시그날 안정성을 각각의 변이체에 대해 측정하였다. 변이체의 시그날 안정성은 실시예 4에 기술된 바와 같이 측정하고 도 9a-9c(0.5% 테르기톨) 및 도 10a-10c(RLAB)에 시간에 대한 총 광 출력(발광성)으로 나타내었다. 각각의 변이체의 시그날 반감기는 당해 데이터로부터 측정하였으며 도 9d(0.5% 테르기톨) 및 도 11a-11b(RLAB)에 나타내었다. 각각의 변이체에 대한 시그날 반감기는 N166R 변이체에 대해 표준화하고 도 33c에 나타내었다.
상이한 변이체에서 아미노산 치환이 단백질 안정성(예를 들면, 열안정성)에 있어서 효과를 가졌는지를 측정하기 위하여, 22℃에서 각각의 변이체의 단백질 안정성을 실시예 5에 기술된 바와 같이 측정하고 도 12a-12b에 나타내었다. 22℃에서, 38분의 반감기를 갖는 WT OgLuc와 비교하여, OgLuc A54F+N166R 변이체 단백질은 178분의 반감기를 가진 반면, OgLuc P115E+N166R 변이체는 거의 120분의 반감기를 가졌다.
도 33d는 N166R 변이체에 대해 표준화시킨 도 12a-b 및 17에 나타낸 WT OgLuc와 비교하여 OgLuc 변이체의 22℃에서 반감기(분)를 요약한다.
도 33e는 도 a-d에 나타낸 22℃에서 발광성에 있어서의 증가 배율, 시그날 반감기 및 반감기를 요약한다.
실시예 8
변형된 루시퍼라제에서 특이적인 치환의 평가
추가의 합성 OgLuc 변이체를 33번 및 68번 부위에서의 치환으로 생성시켰다. 상세하게는, A33K 및 F68Y 치환을 WT OgLuc(도 13a-13b, 14a-14b, 15a-15b, 16a-16b, 17, 및 33a-33e에서 "WT A33K" 및 "WT F68Y"로 확인됨) 및 OgLuc+N166R(도 13a-13b, 14a-14b, 15a-15b, 16a-16b, 17, 및 33a-33e) 변이체 서열에서 수행하고 상응하는 출발 WT OgLuc(도 13a-13b, 14a-14b, 15a-15b, 16a-16b, 17, 및 33a -33e에서 "WT"로 확인됨) 및 OgLuc+N166R 변이체(도 13a-13b, 14a-14b, 15a-15b, 16a-16b, 17, 및 33a-33e에서 "N166R"로 확인됨)와 비교하였다. 0.5% 테르기톨 및 RLAB를 사용하는 OgLuc A33K 및 F68Y의 T=0에서 평균 발광성은 각각 도 13a 및 13b에서 나타낸다. A33K 및 F68Y 변이체는 도 14a(0.5% 테르기톨) 및 14b(RLAB)에서 WT OgLuc에 비한 변이체의 발광성에 있어 증가 배율을 추가로 나타낸 바와 같이, 각각의 상응하는 출발 OgLuc와 비교하여 보다 높은 발광성을 가졌다. 야생형 배경에서 별도로 A33K 및 F68Y는 RLAB를 사용하는 WT에 비해 1.6 및 1.7배 증가를 나타내었고(참조: 도 14b) WT 0.5% 테르기톨에 비해 3.8 및 3.9배 증가를 나타내었다(도 14a). OgLuc+N166R 배경에서 별도로 A33K 및 F68Y는 RLAB를 사용하는 WT OgLuc에 비해 5.1 및 3.3배 증가를 나타내었고(참조: 도 14b) 0.5% 테르기톨을 사용하는 WT OgLuc에 비해 9.2 및 5배 증가를 나타내었다(도 14a).
OgLuc+N166R 변이체에 비한 변이체의 발광성에 있어서의 증가 배율은 도 33a(RLAB) 및 33b(0.5% 테르기톨)에 나타낸다. 야생형 배경에 있어서 치환 A33K는 OgLuc+N166R 변이체에 비한 발광성에 있어서 2.6(0.5% 테르기톨) 및 0.6(RLAB)배 증가를 나타내었다(참조: 도 33a 및 33b ). 야생형 배경에 있어서 치환 F68Y는 OgLuc+N166R 변이체에 비해 2.7(0.5% 테르기톨) 및 0.7(RLAB)배 증가를 나타내었다(참조: 도 33a 및 33b). OgLuc+N166R 변이체 배경에서 치환 A33K는 OgLuc+N166R 변이체에 비해 6.3(0.5% 테르기톨) 및 2.0(RLAB)배 증가를 나타내었다(참조: 도 33a 및 33b). OgLuc+N166R 배경에서 치환 F68Y는 N166R에 비해 3.4(테르기톨) 및 1.3(RLAB)배 증가를 나타내었다(참조: 도 33a 및 33b).
A33K 및 F68Y 변이체의 시그날 안정성은 실시예 4에 기술된 바와 같이 0.5% 테르기톨(도 15a-15b) 및 RLAB(도 16a-16b)를 사용하여 측정하였다. WT OgLuc 배경에서 A33K 변이체의 시그날 반감기는 WT OgLuc 반감기보다 높았지만, 0.5% 테르기톨(도 15b) 또는 RLAB(도 16b)를 사용하는 경우 OgLuc+N166R 변이체 배경에서 더 낮았다. WT OgLuc 배경에서의 F68Y 변이체의 시그날 반감기는 0.5% 테르기톨을 사용하는 WT OgLuc 반감기보다 더 높았지만(도 16b), RLAB를 사용하는 배경에서 더 낮았다(도 15b).
A33K 및 F68Y 변이체의 단백질 안정성(즉, 열안정성)을 실시예 5에 기술된 바와 같이 22℃에서 측정하여 도 17에 나타내었다. N166R 변이체 배경에서 A33K 및 F68Y 치환은 각각 55 및 67분이었던 WT OgLuc 및 N166R과 비교하여 보다 긴 반감기, 상세하게는 72 및 78분을 가졌다(도 17). WT OgLuc 배경에서 A33K 및 F68Y 치환은 각각 58 및 57분이었다(도 17).
실시예 9
변형된 루시퍼라제에서 치환의 특이적인 코어 조합의 평가 - 광 방사
OgLuc내 2개 이상의 아미노산 치환의 조합이 발광성에 있어서의 추가의 개선을 제공하는지를 측정하기 위하여, OgLuc의 상이한 변이체(C1-C3로 지정)를 다음 아미노산 치환을 함유하도록 생성시켰다: C1: N166R, Q11R, A33K, A54F, P115E, Q124K, Y138I 및 V44I(잔기 44는 기질과 접촉될 수 있다), C2: V45E, N135K, I167V, P104L, 및 D139E(이들 중 2개는 기질과 접촉할 수 있는 부위에 있다); C3; S28P, L34M, G51V, I99V, 및 I143L. 이들 코어 조합 변이체는 T2T OgLuc를 실시예 3에 기술된 바와 같이, 부위-지시된 돌연변이유발에 의해 생성시켰다. C1 변이체를 추가로 돌연변이시켜 A4E 아미노산 치환을 함유하도록 함으로써 C1+A4E 변이체를 생성시켰다. 이들 변이체의 조합을 또한 A4E 치환, 예를 들면, C1+C2+A4E 및 C1+C3+A4E로 생성시켰다. 이들 재조합체 클론을 올리고뉴클레오타이드-계 부위-지시된 돌연변이유발을 사용한 후 pF4Ag 벡터(T7 및 CMV 프로모터 함유; 이. 콜라이 리보소옴-결합 부위를 함유하도록 변형된 시판되는 pF4A)내로 서브클로닝시킴으로써 작제하였다. 모든 변이체를 이. 콜라이 세포내에서 스크리닝하였다. 요약하면, 클론이 KRX 이. 콜라이내에서 과발현된 후, 세포를 분해하고 기질로서 콜렌테라진을 사용하여 발광성에 대해 측정하였다. OgLuc N166R 변이체 및 레닐라 루시퍼라제를 또한 스크리닝하였다. C1 둘다, C1+A4E 및 C1+C3+A4E 변이체는 OgLuc N166R 변이체보다 대략 4log 더 밝았으며 적어도 레닐라 루시퍼라제 정도로 밝았다(도 4a-4d). T=0에서 이들 코어 조합 변이체의 총 광 출력(예를 들면, 발광성)은 실시예 4에 기술된 바와 같이 "섬광" 0.5% 테르기톨(도 4a) 및 "Glo" RLAB(도 4b)를 사용하여 측정하였다.
천연, WT, N166R, C1, C1+C2, C1+A4E, C1+C2+A4E, 및 C1+C3+A4E의 단백질(도 31) 및 뉴클레오타이드(도 32) 서열의 정렬을 나타낸다.
추가의 치환을 C1+A4E 및 C1+C3+A4E 내로 도입하였다. 상세하게는, 이들 변이체내 A54F 잔기를 F54T로 변화시켰다. 이들 변이체, C1+A4E+F54T 및 C1+C3+A4E+F54T를 상응하는 출발 C1+A4E 및 C1+C3+A4E, 및 또한 레닐라 및 WT OgLuc 루시퍼라제와 실시예 4의 방법을 사용하여 비교하였다. 도 18a, 18b 및 19에서 알수 있는 바와 같이, F54T 치환을 가진 변이체는 WT와 비교하여 0.5% 테르기톨을 사용하여 50 내지 75% 감소되었고 RLAB를 사용한 발광성에 있어서 약 2 내지 5배 증가되었다(참조: 각각 도 18a 및 19에서 T=0 측정). F54T 치환의 첨가는 RLAB를 사용한 총 광 출력이 증가된 것으로 나타났지만 시간에 걸쳐 빠른 소멸을 나타내었다(도 19). 0.5% 테르기톨을 사용할 때, 시간에 걸친 소멸은 C1+A4E와 유사하지만, RLU는 C1+A4E와 비교하여 더 낮다(도 18a-18b).
레닐라 루시퍼라제, WT OgLuc, T2T 및 A54F 변이체와 비교한 것으로서, C1, C1+A4E, C1+C2, 및 C1+C2+A4E 변이체의 발광성은 실시예 4에 기술된 방법을 사용하여 측정하였다(도 20a 및 20b). C1+A4E 및 C1+C2+A4E 변이체는 0.5% 테르기톨을 사용한 WT에 비하여 각각 4 및 2-log 증가를 가졌다(도 20a). C1+A4E, C1+C2+A4E, 및 C1+C3+A4E 변이체는 RLAB를 사용하는 WT에 비하여 각각 3, 1.5, 및 3-log 증가를 가졌다(도 20b). 0.25% 테르기톨 완충액을 0.5% 테르기톨 대신 사용하여 테르기톨에 의존하지 않고 시그날의 안정성을 측정하였다. 도 21은 0.25% 테르기톨을 사용하는 WT에 비하여 각각 4, 4, 2, 및 2-log 증가를 갖는 C1, C1+A4E, C1+C2, 및 C1+C2+A4E 변이체를 나타낸다.
레닐라 루시퍼라제, WT OgLuc, T2T 및 OgLuc+A54F 변이체와 비교한 것으로서, C1, C1+A4E, C1+C2, 및 C1+C2+A4E 변이체를 또한 HEK 293 세포내에서 평가하였다. 요약하면, 96-웰 플레이트 속에 15,000 세포/웰로 플레이팅한 HEK293 세포를 TransIT-LTI(mirus Bio)을 사용하여 각종의 변이체 및/또는 대조군 서열을 암호화하는 플라스미드 DNA와 함께 일시적으로 형질감염시켰다. 동일한 플라스미드는 또한 개똥벌레 루시퍼라제의 구성적 발현을 위한 유전자를 수반하여 형질감염 대조군으로서 작용하였다. 요약하면, 세포를 실시예 4에 기술된 바와 같이 성장시키고, 분해하며 처리하였다. 세포를 개똥벌레 형질감염 대조군(0.04㎍/형질감염 또는 10%의 형질감염된 총 DNA가 사용됨)에 대해 pGL4.13으로 공-형질감염시켰다. 발광성을 실시예 4에 기술된 바와 같이, RLAB(도 22) 또는 0.25% 테르기톨(도 23)을 사용하여 측정하였다. 모든 변형된 루시퍼라제 데이터를 이후에 형질감염 효율에 대해 개똥벌레 루시퍼라제 발광성(루시페린 기질)을 사용하여 표준화하였다(도 22 및 23). C1, C1+A4E, C1+C2, 및 C1+C2+A4E 변이체 모두는 0.5% 테르기톨에서 OgLuc와 비교하여 보다 큰 발광성을 가졌다(도 22). C1+A4E 및 C1+C2+A4E 변이체는 또한 0.25% 테르기톨에서 OgLuc와 비교하여 보다 큰 발광성을 가진다(도 23).
실시예 10
변형된 루시퍼라제에서 치환의 특이적인 조합의 평가 - 단백질 안정성
상이한 변이체내 아미노산 치환이 또한 단백질 안정성에 있어 효과를 가졌는지를 측정하기 위하여, 상이한 변이체를 상이한 온도에서 스크리닝하고 안정성에 있어서의 효과를 측정하였다. 도 24에 나타낸 바와 같이, 실온(약 22℃)에서, 야생형 OgLuc는 1시간의 단백질 반감기를 나타낸 반면, C1 변이체는 9.4 시간의 단백질 반감기를 나타내었다. 도 24에 나타낸 바와 같이, 30℃에서 OgLuc N166R 변이체는 21분의 단백질 반감기를 가진 반면, C1+A4E 변이체는 6시간 후에 쇠퇴를 나타내었다. 30℃에서, 레닐라 루시퍼라제에 대한 단백질 반감기는 7.9시간이었다. 30℃에서 안정성 순위는 OgLuc C1+A4E > 레닐라 루시퍼라제 > OgLuc N166R이었다. 도 24에 나타낸 바와 같이, 37℃에서, OgLuc N166R 변이체의 단백질 반감기는 2분인 반면, C1+A4E 변이체에서 쇠퇴는 관측되지 않았다. 54℃에서, 상이한 변이체의 단백질 반감기는 다음과 같았다: C1: 7분, C1+A4E: 8분, C1+C2+A4E: 128분, 및 C1+C3+A4E: 24분. 야생형 OgLuc 및 OgLuc N166R 변이체의 반감기는, 이들이 너무 불안정하므로 54℃에서 측정할 수 없었다.
실시예 11
변형된 루시퍼라제에서 치환의 특이적인 조합의 평가 - 시그날 안정성
상이한 변이체에서 아미노산 치환이 또한 시그날 안정성에 영향을 미치는지를 측정하기 위하여, 상이한 변이체를 시그날 안정성에 대해 스크리닝하였다. 시그날 안정성은 실시예 4에 기술된 바와 같이 RLAB를 사용하여 측정하였다. 다음 시그날 반감기를 상이한 변이체에 대해 측정하였다. 야생형 OgLuc: 1.8분, 레닐라 루시퍼라제: 0.8분, C1: 1.7분, C1+A4E: 1.7분, C1+C2+A4E: 12.6분 및 C1+C3+A4E: 3.3분(도 25).
실시예 12
변형된 루시퍼라제에서 치환의 특이적인 조합의 평가 - 발광 색상
기질로서 코엘렌테라진(제조원: 프로메가 코포레이션)을 사용하여 최대 발광성을 가진 최적 파장을 OgLuc+N166R, C1+A4E 및 C1+C2+A4E 변이체에 대해, 레닐라 루시퍼라제와 비교하여 측정하였다. 시료를 실시예 4에 기술된 바와 같이 제조하였다. 스펙트럼 피크는 바리오스칸 발광계(Varioskan luminometer)를 사용한 파장 및 0.5% 테르기톨에서 5nm 증분에서 발광성을 측정함으로써 측정하였다. 데이터를 스펙트럼내에서 최대 RLU에 의해 표준화하였다. 도 26에 나타낸 바와 같이, 레닐라는 480 nm에서 스펙트럼 피크를 가진 반면, OgLuc+N166R, C1+A4E 및 C1+C2+A4E는 앞서 455nm인 것으로 보고된, 천연의 OgLuc로부터 이동한 465nm에서 스펙트럼 피크를 갖는다[참조: Inouye, FEBS Letters, 481(1):19-25(2000)].
실시예 13
증가된 발광성을 갖는 변형된 루시퍼라제의 생성
추가의 변이체를 실시예 3에 기술된 바와 같이 C1+A4E 변이체의 무작위적 돌연변이유발에 의해 생성시켰다. 총 광 출력을 실시예 4에 기술된 바와 같이 측정하였다. 예시적인 C1+A4E 변이체(즉, C1+A4E보다 적어도 1.2배 더 밝은 것들), 그러나 이에 한정되지 않는 것들은 시료 확인번호 및 아미노산 치환에 의해 도 27a 및 27b에 나열한다. 서열번호 1에 대해 20, 54, 72, 77, 79, 89, 90, 또는 164번 위치에서 아미노산 치환을 갖는 C1+A4E 변이체는 상응하는 출발 C1+A4E 변이체에 비해 발광성에 있어 적어도 1.9배 증가를 나타내었다.
C1+A4E+F54I 변이체를 함유한 클론 29H7을 50℃에서 단백질 안정성에 대해 실시예 5에 기술된 방법을 사용하여 추가로 시험하였다. 클론 29H7은 상응하는 출발 C1+A4E 변이체보다 더 긴 반감기를 가졌다(도 30).
92번 위치에서 아미노산 치환을 가진 다양한 C1+A4E 변이체를 밝기에 대해 분석, 예를 들면, C1+A4E 변이체보다 적어도 1.2배 더 밝은 변이체에 대해 스크리닝하였다. 다음 치환은 C1+A4E: L92G; L92Q; L92S; 및 L92A보다 적어도 1.2배 더 밝은 변이체를 수득하였고, 각각 C1+A4E에 비한 2.2, 2, 2.9 및 2.5배 증가를 가졌다.
추가의 변이체를 실시예 3에 기술된 바와 같이, C1+A4E 변이체의 부위-지시된 돌연변이유발에 의해 생성시켜 치환 F54I, F68S, M75K 및 I90V의 특정 조합을 갖도록 하였다. 변이체("시료 확인 번호") 및 각각의 변이체에서 발견된 아미노산 치환을 나열하는 도 29에서 나타낸 바와 같이, 치환의 이들 조합은 상응하는 출발 C1+A4E 변이체에 비해 적어도 17.5 내지 19.3배의 발광성에 있어서의 현저한 증가를 나타낸다.
모든 공보, 특허 및 특허원은 본원에 참조로 도입된다. 앞서의 명세서에서, 본 발명은 이의 특정의 바람직한 양태와 관련하여 기술되었고, 많은 세부사항은 설명할 목적으로 나타내었지만, 당해 분야의 숙련가에게는, 본 발명이 추가의 양태에 허용되며 본원의 특정 세부사항이 본 발명의 기본 원리로부터 벗어남이 없이 상당히 변할 수 있음이 명백할 것이다. C1+A4E의 추가의 특이적인 조합 변이체는 I90V 및 F54I("IV")를 포함하도록 생성되었다. 도 34a에 나타낸 바와 같이, IV는 실시예 4의 방법을 사용하여 측정한 상응하는 출발 C1+A4E 변이체와 비교하여 발광성에 있어 약 20배 증가를 가졌다. 도 34b에 나타낸 바와 같이, IV 단백질은, IV에 대한 반감기가 실시예 5의 방법을 사용하여 9.6분이었던 레닐라와 비교하여 27.2분이었으므로, 50℃에서 레닐라 루시퍼라제보다 더 안정하였다.
본 발명의 각종 특징 및 장점은 하기 특허청구범위에 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> Promega Corporation <120> SYNTHETIC OPLOPHORUS LUCIFERASES WITH ENHANCED LIGHT OUTPUT <130> 016026-9500 WO00 <140> PCT/US2010/033449 <141> 2010-05-03 <150> 61/174838 <151> 2009-05-01 <160> 32 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 169 <212> PRT <213> Oplophorus gracilirostris <400> 1 Phe Thr Leu Ala Asp Phe Val Gly Asp Trp Gln Gln Thr Ala Gly Tyr 1 5 10 15 Asn Gln Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Leu Ser Ser Leu Phe Gln 20 25 30 Ala Leu Gly Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Lys Val Val Leu Ser Gly 35 40 45 Glu Asn Gly Leu Lys Ala Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr Glu Gly 50 55 60 Leu Ser Gly Phe Gln Met Gly Leu Ile Glu Met Ile Phe Lys Val Val 65 70 75 80 Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Ile Ile Leu His Tyr Gly Thr 85 90 95 Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Ile Asp Tyr Phe Gly Arg 100 105 110 Pro Tyr Pro Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Gln Ile Thr Val Thr 115 120 125 Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Tyr Asp Glu Arg Leu Ile Asn 130 135 140 Pro Asp Gly Ser Leu Leu 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tacactcgtt 300 attgacggtg tgacaccaaa catgattgac tactttggac gcccttacga gggaattgct 360 gtgtttgacg gcaagaagat cacagttact ggaactctgt ggaacggcaa caagatcatt 420 gatgagcgcc tgatcaaccc agatggttca ctcctcttcc gcgttactat caatggagtc 480 accggatggc gcctttgcga gcgtattctt gcc 513 <210> 17 <211> 133 <212> PRT <213> Locusta migratoria <400> 17 Val Lys Glu Phe Ala Gly Ile Lys Tyr Lys Leu Asp Ser Gln Thr Asn 1 5 10 15 Phe Glu Glu Tyr Met Lys Ala Ile Gly Val Gly Ala Ile Glu Arg Lys 20 25 30 Ala Gly Leu Ala Leu Ser Pro Val Ile Glu Leu Glu Val Leu Asp Gly 35 40 45 Asp Lys Phe Lys Leu Thr Ser Lys Thr Ala Ile Lys Asn Thr Glu Phe 50 55 60 Thr Phe Lys Leu Gly Glu Glu Phe Asp Glu Asp Thr Leu Asp Gly Arg 65 70 75 80 Lys Val Lys Ser Ile Ile Thr Gln Asp Gly Pro Asn Lys Leu Val His 85 90 95 Glu Gln Lys Gly Asp His Pro Thr Ile Ile Ile Arg Glu Phe Ser Lys 100 105 110 Glu Gln Cys Val Ile Thr Ile Lys Leu Gly Asp Leu Val Ala Thr Arg 115 120 125 Ile Tyr Lys Ala Gln 130 <210> 18 <211> 125 <212> PRT <213> Bufo arenarum <400> 18 Ala Phe Asn Gly Thr Trp Asn Val Tyr Ala Gln Glu Asn Tyr Glu Asn 1 5 10 15 Phe Leu Arg Thr Val Gly Leu Pro Glu Asp Ile Ile Lys Val Ala Lys 20 25 30 Asp Val Asn Pro Val Ile Glu Ile Glu Gln Asn Gly Asn Glu Phe Val 35 40 45 Val Thr Ser Lys Thr Pro Lys Gln Thr His Ser Asn Ser Phe Thr Val 50 55 60 Gly Lys Glu Ser Glu Ile Thr Ser Met Asp Gly Lys Lys Ile Lys Val 65 70 75 80 Thr Val Gln Leu Glu Gly Gly Lys Leu Ile Cys Lys Ser Asp Lys Phe 85 90 95 Ser His Ile Gln Glu Val Asn Gly Asp Glu Met Val Glu Lys Ile Thr 100 105 110 Ile Gly Ser Ser Thr Leu Thr Arg Lys Ser Lys Arg Val 115 120 125 <210> 19 <211> 134 <212> PRT <213> Echinococcus granulosus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (64)..(64) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 19 Xaa Met Glu Ala Phe Leu Gly Thr Trp Lys Met Glu Lys Ser Glu Gly 1 5 10 15 Phe Asp Lys Ile Met Glu Arg Leu Gly Val Asp Phe Val Thr Arg Lys 20 25 30 Met Gly 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(265)..(265) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (286)..(286) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 21 Glu Lys Gly Phe Glu Ala Gly Asp Asn Lys Leu Gly Gly Ala Leu Asn 1 5 10 15 Ala Lys His Val Glu Lys Tyr Gly Asp Asn Phe Lys Asn Gly Xaa His 20 25 30 Lys Pro Glu Phe His Glu Asp Gly Leu His Lys Pro Xaa Glu Val Gly 35 40 45 Gly Lys Lys Phe Glu Ser Gly Phe His Tyr Leu Leu Glu Cys His Glu 50 55 60 Leu Gly Gly Lys Asn Ala Ser Gly Gly Tyr Gly Gly Pro Leu Cys Glu 65 70 75 80 Asp Pro Tyr Gly Ser Glu Val Gln Ala Xaa Thr Glu Lys Leu Leu Lys 85 90 95 Glu Ala Asp Ser Asp Arg Thr Leu Cys Phe Asn Asn Phe Gln Asp Pro 100 105 110 Cys Pro Gln Leu Thr Lys Glu Gln Val Ala Xaa Cys Lys Gly Phe Asp 115 120 125 Tyr Gly Asp Lys Thr Leu Lys Leu Pro Cys Gly Pro Leu Pro Trp Pro 130 135 140 Ala Gly Leu Pro Glu Pro Gly Tyr Val Pro Lys Thr Asn Pro Leu His 145 150 155 160 Gly Arg Trp Ile Thr Val Ser Gly Gly Gln Ala Ala Phe Ile Lys Glu 165 170 175 Ala 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Lys Ile Ile Leu His Tyr 85 90 95 Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Ile Asp Tyr Phe 100 105 110 Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile Thr 115 120 125 Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu 130 135 140 Ile Asn Pro Asp Gly Ser Leu Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Gly Val 145 150 155 160 Thr Gly Trp Arg Leu Cys Glu Arg Ile Leu Ala 165 170 <210> 24 <211> 513 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 24 atggtgttta cattggcaga tttcgttgga gactggcggc agacagctgg atacaaccaa 60 gatcaagtgt tagaacaagg aggattgtct agtctgttcc aaaagctggg agtgtcagtc 120 accccaatcc agaaaattgt gctgtctggg gagaatgggt taaaatttga tattcatgtc 180 atcatccctt acgagggact cagtggtttt caaatgggtc tgattgaaat gatcttcaaa 240 gttgtttacc cagtggatga tcatcatttc aagattattc tccattatgg tacactcgtt 300 attgacggtg tgacaccaaa catgattgac tactttggac gcccttacga gggaattgct 360 gtgtttgacg gcaagaagat cacagttact ggaactctgt ggaacggcaa caagatcatt 420 gatgagcgcc tgatcaaccc agatggttca ctcctcttcc gcgttactat caatggagtc 480 accggatggc gcctttgcga gcgtattctt gcc 513 <210> 25 <211> 171 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 25 Met Val Phe Thr Leu Ala Asp Phe Val Gly Asp Trp Arg Gln Thr Ala 1 5 10 15 Gly Tyr Asn Gln Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Leu Ser Ser Leu 20 25 30 Phe Gln Lys Leu Gly Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Lys Ile Val Leu 35 40 45 Ser Gly Glu Asn Gly Leu Lys Phe Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr 50 55 60 Glu Gly Leu Ser Gly Phe Gln Met Gly Leu Ile Glu Met Ile Phe Lys 65 70 75 80 Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Ile Ile Leu His Tyr 85 90 95 Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Ile Asp Tyr Phe 100 105 110 Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile Thr 115 120 125 Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu 130 135 140 Ile Asn Pro Asp Gly Ser Leu Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Gly Val 145 150 155 160 Thr Gly Trp Arg Leu Cys Glu Arg Ile Leu Ala 165 170 <210> 26 <211> 513 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 26 atggtgttta cattggcaga tttcgttgga gactggcggc agacagctgg atacaaccaa 60 gatcaagtgt tagaacaagg aggattgtct agtctgttcc aaaagctggg agtgtcagtc 120 accccaatcc agaaaattga gctgtctggg gagaatgggt taaaatttga tattcatgtc 180 atcatccctt acgagggact cagtggtttt caaatgggtc tgattgaaat gatcttcaaa 240 gttgtttacc cagtggatga tcatcatttc aagattattc tccattatgg tacactcgtt 300 attgacggtg tgacacttaa catgattgac tactttggac gcccttacga gggaattgct 360 gtgtttgacg gcaagaagat cacagttact ggaactctgt ggaacggcaa gaagatcatt 420 gaggagcgcc tgatcaaccc agatggttca ctcctcttcc gcgttactat caatggagtc 480 accggatggc gcctttgcga gcgtgttctt gcc 513 <210> 27 <211> 171 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 27 Met Val Phe Thr Leu Ala Asp Phe Val Gly Asp Trp Arg Gln Thr Ala 1 5 10 15 Gly Tyr Asn Gln Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Leu Ser Ser Leu 20 25 30 Phe Gln Lys Leu Gly Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Lys Ile Glu Leu 35 40 45 Ser Gly Glu Asn Gly Leu Lys Phe Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr 50 55 60 Glu Gly Leu Ser Gly Phe Gln Met Gly Leu Ile Glu Met Ile Phe Lys 65 70 75 80 Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Ile Ile Leu His Tyr 85 90 95 Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Leu Asn Met Ile Asp Tyr Phe 100 105 110 Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile Thr 115 120 125 Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Lys Lys Ile Ile Glu Glu Arg Leu 130 135 140 Ile Asn Pro Asp Gly Ser Leu Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Gly Val 145 150 155 160 Thr Gly Trp Arg Leu Cys Glu Arg Val Leu Ala 165 170 <210> 28 <211> 513 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 28 atggtgttta cattggagga tttcgttgga gactggcggc agacagctgg atacaaccaa 60 gatcaagtgt tagaacaagg aggattgtct agtctgttcc aaaagctggg agtgtcagtc 120 accccaatcc agaaaattga gctgtctggg gagaatgggt taaaatttga tattcatgtc 180 atcatccctt acgagggact cagtggtttt caaatgggtc tgattgaaat gatcttcaaa 240 gttgtttacc cagtggatga tcatcatttc aagattattc tccattatgg tacactcgtt 300 attgacggtg tgacacttaa catgattgac tactttggac gcccttacga gggaattgct 360 gtgtttgacg gcaagaagat cacagttact ggaactctgt ggaacggcaa gaagatcatt 420 gaggagcgcc tgatcaaccc agatggttca ctcctcttcc gcgttactat caatggagtc 480 accggatggc gcctttgcga gcgtgttctt gcc 513 <210> 29 <211> 171 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 29 Met Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Arg Gln Thr Ala 1 5 10 15 Gly Tyr Asn Gln Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Leu Ser Ser Leu 20 25 30 Phe Gln Lys Leu Gly Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Lys Ile Glu Leu 35 40 45 Ser Gly Glu Asn Gly Leu Lys Phe Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr 50 55 60 Glu Gly Leu Ser Gly Phe Gln Met Gly Leu Ile Glu Met Ile Phe Lys 65 70 75 80 Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Ile Ile Leu His Tyr 85 90 95 Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Leu Asn Met Ile Asp Tyr Phe 100 105 110 Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile Thr 115 120 125 Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Lys Lys Ile Ile Glu Glu Arg Leu 130 135 140 Ile Asn Pro Asp Gly Ser Leu Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Gly Val 145 150 155 160 Thr Gly Trp Arg Leu Cys Glu Arg Val Leu Ala 165 170 <210> 30 <211> 513 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 30 atggtgttta cattggagga tttcgttgga gactggcggc agacagctgg atacaaccaa 60 gatcaagtgt tagaacaagg aggattgcct agtctgttcc aaaagatggg agtgtcagtc 120 accccaatcc agaaaattgt gctgtctggg gagaatgtgt taaaatttga tattcatgtc 180 atcatccctt acgagggact cagtggtttt caaatgggtc tgattgaaat gatcttcaaa 240 gttgtttacc cagtggatga tcatcatttc aagattattc tccattatgg tacactcgtt 300 gttgacggtg tgacaccaaa catgattgac tactttggac gcccttacga gggaattgct 360 gtgtttgacg gcaagaagat cacagttact ggaactctgt ggaacggcaa caagatcatt 420 gatgagcgcc tgctcaaccc agatggttca ctcctcttcc gcgttactat caatggagtc 480 accggatggc gcctttgcga gcgtattctt gcc 513 <210> 31 <211> 171 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 31 Met Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Arg Gln Thr Ala 1 5 10 15 Gly Tyr Asn Gln Asp Gln Val Leu Glu 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acgagggact cagtggtttt caaatgggtc tgattgaaat gatcttcaaa 240 gttgtttacc cagtggatga tcatcatttc aagattattc tccattatgg tacactcgtt 300 attgacggtg tgacaccaaa catgattgac tactttggac gcccttaccc tggaattgct 360 gtgtttgacg gcaagcagat cacagttact ggaactctgt ggaacggcaa caagatctat 420 gatgagcgcc tgatcaaccc agatggttca ctcctcttcc gcgttactat caatggagtc 480 accggatggc gcctttgcga gaacattctt gcc 513

Claims (37)

  1. 서열번호 1의 야생형 오플로포러스(Oplophorus) 루시퍼라제에서 아미노산에 상응하는 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 야생형 오플로포러스 루시퍼라제에 대해 적어도 60%의 아미노산 서열 동일성을 가지며, 야생형 오플로포러스 루시퍼라제에 비해 향상된 발광성, 향상된 시그날 안정성, 및 향상된 단백질 안정성 중의 적어도 하나를 갖는 변형된 루시퍼라제 폴리펩타이드를 암호화하는, 폴리뉴클레오타이드.
  2. 제1항에 있어서, 암호화된 변형된 루시퍼라제 폴리펩타이드가, 야생형 오플로포러스 루시퍼라제에 비해 향상된 발광성을 가지며, 서열번호 1에 상응하는 2, 4, 11, 20, 23, 28, 33, 34, 44, 45, 51, 54, 68, 72, 75, 76, 77, 89, 90, 92, 99, 104, 115, 124, 135, 138, 139, 143, 144, 164, 166, 167 또는 169번 위치 중의 적어도 하나에서 아미노산 치환을 갖는, 폴리뉴클레오타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 변형된 루시퍼라제 폴리펩타이드가, 야생형 오플로포러스 루시퍼라제에 비해 향상된 시그날 안정성을 가지며, 서열번호 1에 상응하는 4, 11, 20, 28, 33, 54, 68, 75, 115, 124, 138, 143 또는 166번 위치 중의 적어도 하나에서 아미노산 치환을 갖는, 폴리뉴클레오타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 암호화된 변형된 루시퍼라제 폴리펩타이드가, 야생형 오플로포러스 루시퍼라제에 비해 향상된 단백질 안정성을 가지며, 서열번호 1에 상응하는 11, 20, 28, 33, 34, 44, 45, 51, 54, 68, 72, 75, 77, 89, 90, 92, 99, 104, 115, 124, 135, 138, 139, 143, 144, 164, 166, 167 또는 169번 위치 중의 적어도 하나의 위치에서 아미노산 치환을 갖는, 폴리뉴클레오타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 암호화된 변형된 루시퍼라제 폴리펩타이드가, 서열번호 10의 야생형 오플로포러스 루시퍼라제의 N-말단에 상응하는 루시퍼라제 잔기의 결손을 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  6. 제5항에 있어서, 결손이 루시퍼라제 서열 중 최대 27개 잔기인, 폴리뉴클레오타이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 야생형 오플로포러스 루시퍼라제가 오플로포러스 그라실리로스트리스( Oplophorus gracilirostris ), 오플로포러스 그리말디이(Oplophorus grimaldii), 오플로포러스 스피니카우다(Oplophorus spinicauda), 오플로포러스 폴리아세우스(Oplophorus foliaceus), 오플로포러스 노라에제엘란디아에(Oplophorus noraezeelandiae ), 오플로포러스 타이푸스(Oplophorus typus) 또는 오플로포러스 스피노우스(Oplophorus spinous)로부터 기원한, 폴리뉴클레오타이드.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 암호화된 변형된 루시퍼라제 폴리펩타이드가 서열번호 1에 상응하는 T2S, A4E/S/R/G/D/T/L, Q11R/V/I/L/K/T, Q20R, E23V, S28P, A33K, L34M, V44I/L, V45E, G51V, A54F/T/V/G/S/W/L/I, F68S/Y/V, L72Q, M75R/K/Q/G/T/A, I76V, F77W, V79I, K89E, I90T/V, L92S/A/G/Q, I99V, P104L, P115E/I/Q/L/V/G/H/R/S/C/A/T, Q124K, N135K, Y138V/I/N/T/L/C/R/M/K, D139E, I143L, N144K, C164S, N166R/K/A/L/P/Q/S, I167V, 또는 169L 중의 적어도 하나에 상응하는 치환을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 암호화된 변형된 루시퍼라제 폴리펩타이드가 서열번호 1에 상응하는 11, 33, 44, 54, 115, 124, 138, 및 166번 위치에서 아미노산 치환을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  10. 제9항에 있어서, 치환이 Q11R, A33K, V44I, A54F, P115E, Q124K, Y138I, 및 N166R을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 암호화된 변형된 루시퍼라제가 서열번호 1에 상응하는 4번 위치에서 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  12. 제11항에 있어서, 4번 위치에서 아미노산이 글루탐산인, 폴리뉴클레오타이드.
  13. 제9항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 암호화된 변형된 루시퍼라제가 서열번호 1에 상응하는 45, 135, 104, 139, 및 167번 위치에서 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  14. 제13항에 있어서, 45번 위치에서 아미노산이 글루탐산이고, 104번 위치가 류신이고, 135번 위치가 라이신이며, 139번 위치가 글루탐산이고, 167번 위치가 발린인, 폴리뉴클레오타이드.
  15. 제9항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 암호화된 변형된 루시퍼라제가 서열번호 1에 상응하는 28, 34, 51, 99 및 143번 위치에서 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  16. 제16항에 있어서, 28번 위치에서 아미노산이 프롤린이고, 34번 위치가 메티오닌이며, 51번 위치가 발린이고, 99번 위치가 발린이며, 143번 위치가 류신인, 폴리뉴클레오타이드.
  17. 제11항 또는 제12항에 있어서, 서열번호 1에 상응하는 20, 54, 68, 72, 77, 79, 89, 90, 92, 또는 164번 위치에서 적어도 하나의 아미노산의 치환을 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  18. 제17항에 있어서, 20번 위치에서 아미노산이 아르기닌이고, 54번 위치가 이소류신이며, 68번 위치가 세린이고, 72번 위치가 글루타민이며, 75번 위치가 라이신이고, 77번 위치가 트립토판이며, 79번 위치가 이소류신이고, 89번 위치가 글루탐산이며, 90번 위치가 트레오닌 또는 발린이고, 92번 위치가 글리신, 글루타민, 세린 또는 알라닌이고, 164번 위치가 세린인, 폴리뉴클레오타이드.
  19. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 암호화된 변형된 루시퍼라제 폴리펩타이드가 서열번호 1에 상응하는 23, 28, 143, 및 166번 위치에서 아미노산 치환을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  20. 제19항에 있어서, 치환이 E23V, S28P, I143V, 및 N166R을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  21. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 암호화된 변형된 루시퍼라제 폴리펩타이드가 서열번호 1에 상응하는 4, 34, 76, 및 166번 위치에서 아미노산 치환을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  22. 제21에 있어서, 치환이 A4S, L34M, I76V, 및 N166R을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  23. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 암호화된 변형된 루시퍼라제 폴리펩타이드가 서열번호 1에 상응하는 51, 99, 및 166번 위치에서 아미노산 치환을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  24. 제23항에 있어서, 치환이 G51V, I99V, 및 N166R을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  25. 제1항 내지 제24항 중의 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 변형된 루시퍼라제 폴리펩타이드, 목적 폴리펩타이드, 및 융합 단백질로서 발현될 수 있는 변형된 루시퍼라제 폴리펩타이드에 연결된 목적 폴리펩타이드를 추가로 암호화하는, 폴리뉴클레오타이드.
  26. 제1항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 벡터.
  27. 제26항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 프로모터에 작동적으로 연결된, 벡터.
  28. 제1항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 제26항 또는 제27항에 따른 벡터를 포함하는, 세포.
  29. 제28항에 따른 세포를 포함하는, 비-인간 유전자삽입 동물.
  30. 제1항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드, 또는 제26항 또는 제27항에 따른 벡터를 포함하는, 비-인간 유전자삽입 동물.
  31. 제1항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 변형된, 루시퍼라제.
  32. 제1항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된, 폴리펩타이드.
  33. 제1항 내지 제24항 중의 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 변형된 루시퍼라제를 포함하는, 융합 단백질.
  34. 변형된 루시퍼라제의 발현을 허용하는 조건하에서 제28항에 따른 세포를 성장시킴을 포함하는, 변형된 루시퍼라제의 생산 방법.
  35. 변형된 루시퍼라제의 발현을 허용하는 조건하에서 제26항 또는 제27항에 따른 벡터를 세포내로 도입시킴을 포함하는, 변형된 루시퍼라제의 생산 방법.
  36. 제1항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드, 또는 제26항 또는 제27항에 따른 벡터를 포함하는, 키트.
  37. 제31항에 따른 변형된 루시퍼라제를 포함하는, 키트.
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