ES2629390T3

ES2629390T3 - Luciferasas de Oplophorus sintéticas con mayor emisión de luz

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Publication number: ES2629390T3
Application number: ES15186652.2T
Authority: ES
Inventors: Lance P. Encell; Keith V. Wood; Monika G. Wood; Mary Hall; Paul Otto; Gediminas Vidugiris; Kristopher Zimmerman
Original assignee: Promega Corp
Current assignee: Promega Corp
Priority date: 2009-05-01
Filing date: 2010-05-03
Publication date: 2017-08-09
Anticipated expiration: 2030-05-03
Also published as: EP2990478A1; US20200248228A1; SG10201601281WA; ES2691539T3; US20140120548A1; ES2559505T3; IL265263A; EP2456864A1; AU2010242771B2; US9777311B2; CN102459579B; SG175180A1; EP2456864B1; PT2456864E; EP3181687B1; PL3181687T3; US8557970B2; BRPI1010019A2; CN108192950B; PL2990478T3

Abstract

Un polipéptido que tiene al menos 60% de identidad de secuencia de aminoácidos con una luciferasa de Oplophorus de tipo salvaje, y que comprende al menos una sustitución de un aminoácido en una posición seleccionada de las posiciones de 2, 4, 11, 20, 23, 28, 33, 34, 44, 45, 51, 54, 68, 72, 75, 76, 77, 89, 90, 92, 99, 104, 115, 124, 135, 138, 139, 143, 144, 164, 166, 167 y 169 correspondientes a SEQ ID NO:1, en el que el polipéptido tiene al menos una de una mayor luminiscencia, una mayor estabilidad de la señal y una mayor estabilidad de las proteínas con relación a la luciferasa de Oplophorus de tipo salvaje.

Description

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En la presente se describe una luciferasa modificada (variante) sintética, así como sus fragmentos, por ejemplo, los que son útiles en ensayos de complementación, que tiene al menos una sustitución de un aminoácido con relación a la correspondiente luciferasa de tipo salvaje en una región que es estructuralmente homóloga con un miembro de la superfamilia de proteínas de la calicina, por ejemplo, la familia de las proteínas de unión a ácidos grasos. En la presente se describe una luciferasa de crustáceo modificada, por ejemplo, una luciferasa de decápodo modificada, así como sus fragmentos, por ejemplo, los que son útiles en ensayos de complementación, que tiene al menos una sustitución de un aminoácido con relación a la correspondiente luciferasa de crustáceo de tipo salvaje en una región que es estructuralmente homóloga con un miembro de la superfamilia de proteínas de la calicina, por ejemplo, la familia de las proteínas de unión a ácidos grasos. En la presente se describe una luciferasa modificada de un flagelado unicelular eucariota, así como sus fragmentos, por ejemplo, los que son útiles en ensayos de complementación, que tiene al menos una sustitución de un aminoácido con relación a la correspondiente luciferasa de flagelado unicelular eucariota de tipo salvaje, por ejemplo, luciferasas de Dinoflagellata, que incluyen Dinophyceae, Noctiluciphyceae, o Syndiniophycea, en una región que es estructuralmente homóloga con un miembro de la superfamilia de proteínas de la calicina, por ejemplo, la familia de las proteínas de unión a ácidos grasos. Una molécula de ácido nucleico que codifica la luciferasa modificada puede o no codificar un péptido señal secretor unido a la luciferasa modificada.

En la presente, una sustitución en la luciferasa modificada sintética, o uno de sus fragmentos, es en un resto aminoácido en la correspondiente posición en la región que es estructuralmente homóloga con un miembro de la superfamilia de proteínas de la calicina, por ejemplo, la familia de las proteínas de unión a ácidos grasos, y dicho resto puede participar en la formación de enlaces de hidrógeno o iónicos intramoleculares, y está asociado con una mayor luminiscencia en la luciferasa modificada. Una mayor luminiscencia incluye, pero no se limita a una mayor emisión de luz, una cinética alterada de la emisión de luz, por ejemplo, mayor estabilidad de la intensidad de luz, o un color alterado de la luminiscencia, por ejemplo, un desplazamiento hacia longitudes de onda más cortas o más largas, o una de sus combinaciones. En una realización, el resto en la luciferasa modificada en la correspondiente posición puede interaccionar con un resto en una región que se corresponde con los restos 1 a 10 o 144 a 148 de OgLuc, por ejemplo, uno en SEQ ID NO:1 (nótese que la numeración de estas posiciones se basa en un Phe en el resto 1 de la secuencia madura, no una Met; sin embargo, otros restos pueden preceder al Phe, tal como una Val en la posición -1, que pueden ser introducidos mediante la inserción de un sitio de clonación) o un resto con átomos que están de 4 a 8 Å, por ejemplo, a 6 Å, del resto en la correspondiente posición (posición 166). Las correspondientes posiciones pueden identificarse mediante el alineamiento de las secuencias empleando, por ejemplo, programas de alineamiento de secuencias, programas de predicción de la estructura secundaria, o métodos de reconocimiento de plegamiento, o una de sus combinaciones. La luciferasa modificada según la invención puede incluir otras sustituciones de aminoácidos que alteren el color de la luminiscencia, por ejemplo, una

o más sustituciones que produzcan una luminiscencia desplazada al rojo, que alteren la estabilidad de la señal, que alteren la estabilidad de las proteínas, o cualquiera de sus combinaciones.

En la presente se describe una luciferasa de decápodo modificada con tiene una mayor luminiscencia, con relación a la correspondiente luciferasa de decápodo de tipo salvaje, o una luciferasa de decápodo modificada que emplea coelenteracina. Las coelenteracinas incluyen, pero no se limitan a las coelenteracinas naturales, así como a sus derivados (análogos), tales como las descritas en la patente de EEUU n.º 7.118.878, así como EnduRen, ViviRen, coelenteracina n, coelenteracina h, coelenteracina c, coelenteracina cp, coelenteracina e, coelenteracina f, coelenteracina fcp, coelenteracina hh, coelenteracina i, coelenteracina icp, 2-metil-coelenteracina, y las descritas en el documento WO/040100 y en la solicitud U.S. n.º de serie 12/056.073, cuyas descripciones se incorporan como referencia en la presente.

Una luciferasa modificada según la presente descripción puede tener un resto distinto de la asparagina en la posición que se corresponde con el resto 166 en SEQ ID NO:1, que produce una mayor luminiscencia y, opcionalmente, un ácido aspártico en la posición que se corresponde con el resto 5 en SEQ ID NO:1, una glicina en la posición que se corresponde con el resto 8 en SEQ ID NO:1, un ácido aspártico en la posición que se corresponde con el resto 9 en SEQ ID NO:1, un triptófano, una tirosina o una fenilalanina en la posición que se corresponde con el resto 10 es SEQ ID NO:1, una asparagina en la posición que se corresponde con el resto 144 en SEQ ID NO:1 y/o una glicina en la posición que se corresponde con el resto 147 en SEQ ID NO:1, o cualquiera de sus combinaciones. En una realización, el resto en la luciferasa modificada que corresponde al resto 166 en SEQ ID NO:1 es lisina. En otra realización, el resto en la luciferasa modificada que corresponde al resto 166 en SEQ ID NO:1 es arginina. En una realización, el resto en la luciferasa modificada que corresponde al resto 166 en SEQ ID NO:1 es capaz de formar uno o más enlaces de hidrógeno o iónicos intramoleculares con los carbonilos o la cadena lateral en la posición que se corresponde con el resto 9 en SEQ ID NO:1 cerca del N-terminal de la luciferasa modificada. En una realización, la luciferasa modificada carece de una secuencia de péptido señal. En una realización, la luciferasa modificada tiene al menos 60%, por ejemplo, al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%, pero menos del 100% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO:1.

En una realización, la correspondiente luciferasa de tipo salvaje es una luciferasa de Oplophorus, por ejemplo, Oplophorus gracilirostris, Oplophorus grimaldii, Oplophorus spinicauda, Oplophorus foliaceus, Oplophorus noraezeelandiae, Oplophorus typus, Oplophorus noraezelcmdiae u Oplophorus spinous, una luciferasa de

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Heterocarpus, una luciferasa de Systellapis o una luciferasa de Acanthephyra. En una realización, la luciferasa modificada tiene al menos 2 veces o más, por ejemplo, al menos 4 veces más emisión de luminiscencia en una célula procariota y/o una célula eucariota con relación a la correspondiente luciferasa de tipo salvaje.

En otra realización, una luciferasa de dinoflagelado modificada puede tener una mayor luminiscencia con relación a la correspondiente luciferasa de dinoflagelado de tipo salvaje, por ejemplo, una luciferasa de dinoflagelado, tal como una luciferasa de Lingulodinium polyedrum, una luciferasa de Pyrocystis lunula, o una luciferasa que tiene la SEQ ID NO:21. La luciferasa modificada puede tener un resto distinto a la asparagina en la posición que corresponde al resto 166 en SEQ ID NO:1, por ejemplo, una arginina, y opcionalmente una prolina en la posición que corresponde al resto 5 en SEQ ID NO:1, una glicina en la posición que corresponde al resto 8 en SEQ ID NO:1, una arginina en la posición que corresponde al resto 9 en SEQ ID NO:1, un triptófano, una tirosina o una fenilalanina en la posición que corresponde al resto 10 en SEQ ID NO:1, una fenilalanina en la posición que corresponde al resto 144 en SEQ ID NO:1 y/o una treonina en la posición que corresponde al resto 147 en SEQ ID NO:1, o cualquiera de sus combinaciones. En una realización, el resto en la luciferasa modificada que se corresponde con el resto 166 en SEQ ID NO:1 es lisina. En otra realización, el resto en la luciferasa modificada que corresponde al resto 166 en SEQ ID NO:1 es arginina. En una realización, el resto en la luciferasa modificada que corresponde al resto 166 en SEQ ID NO:1 es capaz de formar uno o más enlaces de hidrógeno o iónicos intramoleculares con los carbonilos o la cadena lateral en la posición que se corresponde con el resto 9 en SEQ ID NO:1 cerca del N-terminal de la luciferasa modificada. En una realización, la luciferasa modificada carece de una secuencia de péptido señal.

En una realización, la luciferasa modificada tiene al menos 60%, por ejemplo, al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%, pero menos del 100% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO:21. La luciferasa modificada, que incluye una luciferasa con otras sustituciones de aminoácidos que alteran el color de la luminiscencia, puede emplearse con una luciferina modificada en una reacción luminogénica que produzca un color alterado de la luminiscencia.

También se describe una luciferasa modificada que tiene un dominio estructural tridimensional relacionado con el barril-beta de FABP, y dicha luciferasa modificada tiene una sustitución que resulta en la unión no covalente, por ejemplo, a través de enlaces de hidrógeno o iónicos intramoleculares, de las láminas-beta terminales del barril-beta, y opcionalmente con otros enlaces no covalentes, por ejemplo, a través de enlaces de hidrógeno o iónicos intramoleculares, con estructuras secundarias adyacentes.

También se describe una luciferasa de decápodo o de dinoflagelado modificada que tiene mayor luminiscencia y una arginina, lisina, alanina, leucina, prolina, glutamina o serina en la posición que corresponde al resto 166 en SEQ ID NO:1, y al menos una sustitución de un aminoácido con relación a la correspondiente luciferasa de decápodo o de dinoflagelado de tipo salvaje. En una realización, dicha al menos una sustitución de un aminoácido en la luciferasa modificada es una sustitución en la posición que se corresponde con el resto 4, 11, 33, 44, 45, 54, 75, 104, 115, 124, 135, 139, 167 o 169, o una de sus combinaciones, en SEQ ID NO:1, por ejemplo, una sustitución que resulta en una mayor luminiscencia con relación a una luciferasa modificada que tiene una mayor luminiscencia y una arginina, lisina, alanina, leucina, prolina, glutamina o serina en la posición que corresponde al resto 166 en SEQ ID NO:1.

En una realización, la luciferasa modificada tiene una o más secuencias de aminoácidos heterólogas en el Nterminal, C-terminal o ambos (un polipéptido de fusión, tal como un polipéptido de fusión con un marcador de epítopo o de fusión), que opcionalmente interacciona, directa o indirectamente, con una molécula de interés. En una realización, la presencia de dicha una o más secuencias heterólogas no altera sustancialmente la luminiscencia de la luciferasa modificada antes o después de la interacción con la molécula de interés. En una realización, la secuencia de aminoácidos heteróloga es un marcador de epítopo. En otra realización, la secuencia de aminoácidos heteróloga es una secuencia que durante la interacción, o después de esta, con una molécula de interés sufre un cambio conformacional, que a su vez altera la actividad de la luciferasa, por ejemplo, una OgLuc modificada con dicha secuencia de aminoácidos es útil para detectar interacciones alostéricas. La luciferasa modificada o una fusión con la luciferasa modificada, o uno de sus fragmentos, puede emplearse como indicador.

En una realización, un fragmento de una luciferasa de la invención se fusiona con una secuencia de aminoácidos heteróloga, formando con ello la fusión un barril-beta, y dicha proteína de fusión es capaz de generar luminiscencia a partir de una luciferina natural o uno de sus derivados.

También se describe un polinucleótido que codifica una luciferasa modificada de la invención, o una fusión de esta, una célula hospedante aislada que presenta el polinucleótido o la luciferasa modificada, o una fusión de esta, y métodos para utilizar el polinucleótido, la luciferasa modificada, o una fusión de esta, o la célula hospedante de la invención.

También se describe un método para identificar posiciones de aminoácidos en una proteína de interés que se encuentran en diferentes estructuras secundarias, por ejemplo, estructuras separadas por 5 o más aminoácidos que no son parte de cualquiera de las estructuras secundarias, y que son capaces de formar enlaces de hidrógeno o iónicos entre sí. El método incluye comparar las estructuras secundarias predichas para la secuencia de aminoácidos de una proteína de interés con las estructuras secundarias de una o más proteínas sin similitud de

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Una mayor luminiscencia, tal como se emplea en la presente, puede incluir cualquiera de lo siguiente: una mayor emisión de luz, una cinética alterada de la emisión de luz, por ejemplo, mayor estabildad de la intensidad de luz, o un color alterado de la luminiscencia, por ejemplo, un desplazamiento hacia longitudes de onda más cortas o más largas.

El término “homología” se refiere a un grado de complementariedad entre dos o más secuencias. Puede existir una homología parcial o una homología completa (es decir, identidad). La homología a menudo se mide empleando un programa de análisis de secuencias (por ejemplo, “GCG” y el paquete informático de análisis de secuencias “Seqweb”, anteriormente comercializado por the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Estos programas aparean secuencias similares asignando grados de homología a diversas sustituciones, deleciones, inserciones y otras modificaciones. Las sustituciones conservativas generalmente incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina.

El término “aislado”, cuando se emplea en relación con un ácido nucleico o un polipéptido, tal como en “oligonucleótido aislado”, “polinucleótido aislado”, “proteína aislada” o “polipéptido aislado”, se refiere a un ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos que se identifica y se separa de al menos un contaminante con el que normalmente está asociado en su origen. Así, un ácido nucleico aislado o un polipéptido aislado está presente en una forma o en un emplazamiento que es diferente del que se encuentra en la naturaleza. Por contraste, los ácidos nucleicos no aislados (por ejemplo, ADN y ARN) o los polipéptidos no aislados (por ejemplo, proteínas y enzimas) se encuentran en el estado en el que existen en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia dada de ADN (por ejemplo, un gen) se encuentra en el cromosoma de la célula hospedante cerca de genes vecinos; las secuencias de ARN (por ejemplo, una secuencia de ARNm específica que codifica una proteína específica) se encuentran en la célula como una mezcla con numerosos otros ARNm que codifican una multitud de proteínas. Sin embargo, un ácido nucleico aislado incluye, por ejemplo, dicho ácido nucleico en células que normalmente expresan este ácido nucleico, en donde el ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente que la de las células naturales,

o bien está flanqueado por una secuencia de ácido nucleico diferente que la que se encuentra en la naturaleza. El ácido nucleico u oligonucleótido aislado puede estar presente en forma monocatenaria o bicatenaria. Cuando el ácido nucleico u oligonucleótido aislado se va a utilizar para expresar una proteína, el oligonucleótido contiene, como mínimo, la hebra sentido o codificadora (es decir, un ácido nucleico monocatenario), pero puede contener hebras sentido y antisentido (es decir, un ácido nucleico bicatenario).

Las expresiones y el término “molécula de ácido nucleico”, “polinucleótido” o “secuencia de ácido nucleico”, tal como se emplean en la presente, se refieren a un ácido nucleico, ADN o ARN, que comprende las secuencias codificadoras necesarias para la producción de un polipéptido o precursor de proteína. El polipéptido codificado puede ser un polipéptido de longitud completa, uno de sus fragmentos (más pequeño que la longitud completa), o una fusión del polipéptido de longitud completa, o de uno de sus fragmentos, con otro polipéptido, produciendo un polipéptido de fusión.

La “luciferasa de Oplophorus” es un complejo de proteínas de 35 kDa y 19 kDa nativas. La proteína de 19 kDa es el componente catalítico más pequeño (GenBank n.º de registro BAB13776, 196 aminoácidos). Tal como se emplea en la presente, OgLuc es la proteína de 19 kDa sin el péptido señal (169 aminoácidos, restos 28 a 196 de BAB13776).

Un “péptido”, una “proteína” y un “polipéptido” significa cualquier cadena de aminoácidos, independientemente de la longitud o la modificación postraduccional (por ejemplo, glicosilación o fosforilación). Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención codifican un variante de una proteína natural, o un fragmento polipeptídico de esta, que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60%, por ejemplo, al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%, pero menos del 100% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la proteína natural (nativa o de tipo salvaje) a partir de la cual se deriva. La expresión “polipéptido de fusión” o “proteína de fusión” se refiere a una proteína quimérica que contiene una proteína de referencia (por ejemplo, luciferasa) unida en el N-y/o C-terminal a una o más secuencias heterólogas (por ejemplo, un polipéptido que no es de luciferasa).

La estructura primaria de la proteína (secuencia primaria, secuencia peptídica, secuencia de proteína) es la secuencia de aminoácidos. En general se indica comenzando a partir del extremo amino-terminal (N) hasta el extremo carboxilo-terminal (C). La estructura secundaria de la proteína puede describirse como la conformación local de la cadena peptídica, independiente del resto de la proteína. Existen elementos de la estructura secundaria “regulares” (por ejemplo, hélices, láminas o cadenas) que en general están estabilizados mediante interacciones de enlaces de hidrógeno entre los átomos del esqueleto de los restos participantes, y elementos de la estructura secundaria “irregulares” (por ejemplo, curvas, vueltas, bucles, espirales, segmentos desordenados o no estructurados). La estructura secundaria de la proteína puede predecirse con diferentes métodos/programas, por ejemplo, PSIPRED (McGuffin et al., Bioinformatics, 16:404 (2000)), PORTER (Pollastri et al., Bioinformatics, 21:1719

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de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una luciferasa modificada opcionalmente se une operablemente a secuencias reguladoras de la transcripción, por ejemplo, uno o más potenciadores, un promotor, una secuencia de terminación de la transcripción o una de sus combinaciones, para formar un módulo de expresión. La molécula de ácido nucleico o el módulo de expresión puede introducirse en un vector, por ejemplo, un vector plasmídico o vírico, que opcionalmente incluye un gen de un marcador seleccionable, y el vector se introduce en una célula de interés, por ejemplo, una célula procariota, tal como E. coli, Streptomyces spp., Bacillus spp., Staphylococcus spp. y similares, así como células eucariotas que incluyen células vegetales (de dicotiledóneas o de monocotiledóneas), fúngicas, de levadura, por ejemplo, Pichia, Saccharomyces o Schizosaccharomyces, o una célula de mamífero, sus lisados, o como una mezcla de transcripción/traducción in vitro. Las células de mamífero incluyen, pero no se limitan a células bovinas, caprinas, ovinas, caninas, felinas, de primate no humano, por ejemplo de simio, y humanas. Las líneas de células de mamífero incluyen, pero no se limitan a células CHO, COS, 293, HeLa, CV-1, SH-SY5Y, HEK293, y NIH3T3.

La expresión de una luciferasa modificada codificada puede ser controlada por cualquier promotor capaz de expresarse en células procariotas o en células eucariotas, incluyendo promotores sintéticos. Los promotores de procariotas incluyen, pero no se limitan los promotores SP6, T7, T5, tac, bla, trp, gal, lac o de maltosa, e incluyen cualquier fragmento que tenga actividad de promotor. Los promotores de eucariotas incluyen, pero no se limitan a promotores constitutivos, por ejemplo, promotores víricos, tales como promotores de CMV, SV40 y RSV, así como promotores regulables, por ejemplo, un promotor inducible o reprimible, tal como el promotor tet, el promotor hsp70 y un promotor sintético regulado por CRE, incluyendo cualquier fragmento que tenga actividad de promotor. La molécula de ácido nucleico, el módulo de expresión y/o el vector de la invención puede introducirse en una célula mediante cualquier método que incluye, pero no se limita a una transformación mediada por calcio, una electroporación, una microinyección, una lipofección y similares.

III. Secuencias optimizadas y vectores y células hospedantes que codifican la luciferasa modificada

También se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada (polinucleótido) que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una luciferasa modificada de la invención, uno de sus fragmentos o una fusión de esta. En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de ácido nucleico que está optimizada para la expresión en al menos un hospedante seeleccionado. Las secuencias optimizadas incluyen secuencias que tienen codones optimizados, es decir, los codones que se emplean con más frecuencia en un organismo con relación a otro organismo, por ejemplo, un organismo con parentesco lejano, así como modificaciones para añadir o modificar secuencias Kozak y/o intrones y/o para eliminar secuencias no deseables, por ejemplo, sitios potenciales de unión a factores de transcripción. Estas secuencias optimizadas pueden producir una mayor expresión, por ejemplo, un mayor nivel de expresión de proteínas, cuando se introducen en una célula hospedante.

En una realización, el polinucleótido incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica una luciferasa modificada de la invención, y dicha secuencia de ácido nucleico está optimizada para la expresión en una célula hospedante de mamífero. En una realización, un polinucleótido optimizado ya no se hibrida con la correspondiente secuencia no optimizada, por ejemplo, no se hibrida con la secuencia no optimizada bajo condiciones de rigurosidad alta o intermedia. El término “rigurosidad” se emplea para referirse a condiciones de temperatura, fuerza iónica y la presencia de otros compuestos, bajo las cuales se realizan las hibridaciones de los ácidos nucleicos. Con unas condiciones de “alta rigurosidad”, el apareamiento de las bases de los ácidos nucleicos solo se producirá entre fragmentos de ácidos nucleicos que tengan una alta frecuencia de secuencias de bases complementarias. Así, a menudo son necesarias condiciones de rigurosidad “altas” o “intermedias” cuando se desea que unos ácidos nucleicos que no son completamente complementarios entre sí se hibriden o se asocien entre ellos. En la técnica se conocen numerosas condiciones equivalentes que pueden emplearse para obtener condiciones de rigurosidad intermedias o bajas.

En otra realización, el polinucleótido tiene menos del 90%, por ejemplo, menos del 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico con la correspondiente secuencia no optimizada, y opcionalmente codifica un polipéptido que tiene al menos 60%, por ejemplo, al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%, pero menos del 100% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido codificado por la secuencia no optimizada. También se proporcionan construcciones, por ejemplo, módulos de expresión, y vectores que comprenden la molécula de ácido nucleico aislada, por ejemplo, con una secuencia de ácido nucleico optimizada, así como kits que comprenden la molécula de ácido nucleico aislada, la construcción o el vector.

Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una luciferasa modificada de la invención, uno de sus fragmentos o una fusión de esta, opcionalmente está optimizada para la expresión en una célula hospedante concreta y también opcionalmente está unida operablemente a secuencias reguladoras de la transcripción, por ejemplo, uno o más potenciadores, un promotor, una secuencia de terminación de la transcripción o una de sus combinaciones, para formar un módulo de expresión.

En una realización, una secuencia de ácido nucleico que codifica una luciferasa modificada de la invención, uno de sus fragmentos o una fusión de esta, se optimiza mediante la sustitución de codones, por ejemplo, al menos 25% de

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lo largo de esta solicitud para identificar restos sustituidos se ofrece con relación a la secuencia del polipéptido de OgLuc maduro de tipo salvaje de SEQ ID NO:1. La secuencia de OgLuc de tipo salvaje natural puede sintetizarse inicialmente con otros aminoácidos que luego se escinden, lo cual resulta en la generación de un polipéptido maduro de tipo salvaje, tal como el que aparece en SEQ ID NO:1. Por ejemplo, puede estar presente una secuencia señal

5 (por ejemplo, para dirigir a la proteína naciente hacia un orgánulo concreto, tal como el retículo endoplásmico y/o para dirigir la proteína para la secreción) al principio de la proteína naciente, y después puede escindirse para producir la proteína madura de tipo salvaje.

A continuación se muestra un ejemplo de alineamiento de OgLuc y tres FABP: 10

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Ejemplo 3: 15 Generación de variantes de luciferasa modificada con mayor luminiscencia

A menos que se indique lo contrario, se generaron variantes de una secuencia de OgLuc de partida con sustituciones aleatorias empleando el sistema basado en PCR mutagénico propenso a errores GeneMorph II 20 Random Mutagenesis Kit (Stratagene; Daughtery, PNAS USA, 97(5):2029 (2000)), según las instrucciones del fabricante, y una saturación NNK según se conoce en la técnica. Los variantes resultantes se construyeron en el contexto del vector pF1K Flexi para la expresión basada en T7 (Promega Corp.) y se emplearon para transformar

E. coli KRX empleando técnicas conocidas en la técnica. El banco resultante se expresó en E. coli y se seleccionó para los variantes que presentaban una mayor emisión de luz, comparado con la proteína OgLuc de partida. Se

25 utilizaron técnicas de secuenciación convencionales conocidas en la técnica para identificar las sustituciones de aminoácidos en cada clon de interés.

Se generaron variantes de una secuencia de OgLuc de partida con mutaciones específicas empleando el kit de mutagénesis dirigida a sitio basada en oligos QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene; Kunkel, PNAS 30 USA, 82(2):488 (1985)), según las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 4:

Métodos para medir la emisión de luz y la estabilidad de la señal

35 Se cultivaron clones de E. coli que contenían el ADN plasmídico que codifica los variantes de luciferasa modificada con sustituciones de aminoácidos en OgLuc en una placa de 96 pocillos y se indujeron con una inducción de alejamiento, es decir, una autoinducción (Shagat et al., “KRX Autoinduction Protocol: A Convenient Method for Protein Expression,” Promega Notes, 98:17 (2008)) durante 17 horas. A cada variante y a la correspondiente

40 luciferasa de partida le corresponden 6 pocillos replicados. Las células se lisaron empleando un tampón de lisis que

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consiste en HEPES 150 mM, pH 8,0, tiourea 100 mM, 0,1x PLB (Promega Corp., n.º de catálogo E194A), lisozima 0,1 mg/ml y ADNasa RQ1 0,001 U/l, y se midió la luminiscencia empleando reactivos de sustrato de luciferasa de Renilla (Promega Corp.) en un luminómetro Infinite 500 Tecan. Las mediciones se tomaron inmediatamente después de la adición con una inyección de un tampón de ensayo de tergitol al 0,5% “Glo” (“tergitol al 0,5%”), que contiene KCl 100 mM, CDTA 1 mM, DTT 10 mM, tergitol al 0,5%, coelenteracina 20 M (Promega Corp.), o un tampón RLAB “Flash” (Promega Corp.) que contiene coelenteracina 20 M (Promega Corp.) (“RLAB”) a la muestra de lisado. Esta medición de la luminiscencia, tomada inmediatamente después de la adición, es la medición en el momento “T = 0” y, en diversas realizaciones, se toma como la medición de la emisión de luz total (luminiscencia) generada por la muestra. El promedio de la luminiscencia de los 6 replicados se comparó entre los variantes con la de la correspondiente luciferasa de partida. En diversas realizaciones, las mediciones de luminiscencia se normalizaron a la correspondiente luciferasa de partida de interés, por ejemplo, OgLuc sintética, y se indican en ciertas realizaciones como una mejora, un aumento o similares “en X veces” (es decir, en 2 veces, en 3 veces, en 4,5 veces, etc.).

La estabilidad de la señal de un clon variante se determinó volviendo a leer la placa múltiples veces después de la adición del tampón de ensayo a la muestra, por ejemplo, midiendo la luminiscencia cada 30 segundos o cada minuto, durante una longitud de tiempo. La semivida de la señal se determinó empleando estas mediciones, y el promedio de los 6 pocillos replicados se comparó entre los variantes con la correspondiente luciferasa de partida. La semivida que indica la estabilidad de la señal se normalizó a la correspondiente luciferasa de partida de interés, por ejemplo, OgLuc.

Ejemplo 5:

Método para medir la estabilidad de la proteína, concretamente la termoestabilidad

Se prepararon muestras de lisados a partir de cultivos inducidos tal como se describe en el ejemplo 4. Las muestras de lisado en placas de 96 pocillos replicadas se incubaron a diversas temperaturas, que incluyen, por ejemplo a 22, 30, 37, 42, 50 o 54 ºC. En diferentes momentos, las placas se cultivaron a -70 ºC. Antes de medir la luminiscencia según se describe en el ejemplo 4, cada placa se descongeló a temperatura ambiente, es decir, 22 ºC, durante 10 minutos. Las muestras se ensayaron con el tampón de ensayo de tergitol al 0,5% descrito en el ejemplo 4. La medición “T = 0”, según se describe en el ejemplo 4, para cada placa del momento del tiempo, se empleó para determinar la semivida de la proteína. La semivida, que indica la estabilidad de la proteína, se normalizó a la correspondiente luciferasa de partida de interés, por ejemplo, OgLuc.

Ejemplo 6:

Generación de una luciferasa modificada con mayor emisión de luz

Para estudiar si el restablecimiento de la firma estructural de la calicina en OgLuc puede mejorar la actividad y la estabilidad globales de las proteínas, se diseñaron versiones sintéticas de la secuencia de OgLuc. Las versiones sintéticas incluyen el uso optimizado de codones para E. coli y células de mamífero, y codones para Arg o Lys que sustituyen a Asn en la posición 166. Tal como se mencionó previamente, la numeración se basa en SEQ ID NO:1. La optimización de codones (para E. coli) y los cambios de nucleótidos para el codón 166 a Arg o Lys se realizaron por medios sintéticos (Gene Dynamics, LLC). En el clon OgLuc+N166R, el codón AAC se cambió a CGT (que codifica Arg). En el clon OgLuc+N166K, el codón AAC se cambió a AAA (que codifica Lys).

Los genes de OgLuc sintéticos se subclonaron en un vector adecuado para la sobreexpresión en bacterias o lisados de reticulocitos de conejo TnT (Promega Corp.; vector pF1K Flexi para sistemas de expresión basados en T7), y se empleó para transformar E. coli KRX. Se seleccionaron colonias individuales, se cultivaron, se indujeron con ramnosa, se lisaron empleando lisozima y una única congelación-descongelación, y se midieron para la luminiscencia empleando reactivos de sustrato de luciferasa de Renilla (Promega Corp.) en un luminómetro Veritas. Las reacciones de reticulocitos de conejo TnT se realizaron según los protocolos del fabricante (Promega Corp.) y se midieron de la misma forma que los lisados bacterianos.

Los mutantes se compararon con la proteína OgLuc parental (es decir, de partida) sintética para la producción de emisión de luz total (luminiscencia). En E. coli, se observó una mejora en 5 veces y 10 veces (N166K y N166R, respectivamente) en la luminiscencia con coelenterazina como sustrato. En los lisados de TnT, la mejora fue entre 4 veces y 7 veces (N166K y N166R). Estas secuencias (que contienen Arg o Lys en la posición 166) representan variantes de OgLuc que producen una mayor estabilidad.

Se analizaron diversos variantes de OgLuc con una sustitución de un aminoácido en la posición 166 para el brillo, es decir, se seleccionaron variantes que eran al menos 1,2 veces más brillantes que la OgLuc de tipo salvaje. Las siguientes sustituciones produjeron un variante que era al menos 1,2 veces más brillante que OgLuc de tipo salvaje: N166K; N166R; N166A; N166L; N166P; N166Q; y N166S (véase la tabla 1). La tabla 1 muestra el variante más brillante, indicado por la mejora en número de veces con respecto a OgLuc de tipo salvaje, que tiene la sustitución

del aminoácido N166R.

Tabla 1 -Resumen de la mejora en número de veces de la luminiscencia en variantes de OgLuc con una sustitución de un aminoácido en la posición 166 frente a OgLuc de tipo salvaje

Sustitución del aminoácido en la posición 166: Mejora en el plegamiento

R: 10

K: 4

A: 3

L: 3

P: 2

Q: 2

S: 2

Una mutagénesis empleando PCR propensa a errores y saturación NNK, según se describe en el ejemplo 3, del

variante OgLuc+N166R produjo variantes con mayor brillo, por ejemplo, al menos 1,2 veces más brillantes, con

relación al variante OgLuc+N166R. La tabla 2 resume estos variantes que comprenden la sustitución N166R, así 10 como una de las siguientes sustituciones en los restos 2 (S), 4 (E, S, R, G, D, T o L), 11 (R, V, I, L, K o T), 33 (K), 44

(I o L), 45 (E), 54 (F, T, V, G, W, S, o L), 68 (V, Y), 75 (R, K, Q, G, T o A), 104 (L), 115 (E, I, Q, L, V, G, H, R, S, C, A,

o T), 124 (K), 135 (K), 138 (V, I, N, T, L, C, R, M o K), 139 (E), 167 (V), o 169 (L). La tabla 2 muestra la mejora del plegamiento en forma de la mejora en número de veces de la luminiscencia del variante frente al correspondiente variante OgLuc+N166R de partida empleando RLAB y utilizando el promedio de la señal en el intervalo de 4-6

15 minutos después de comenzar la reacción, por ejemplo, después de la inyección del sustrato. Para cada sustitución de aminoácido listada, la sustitución que produce la mayor mejora se lista en primer lugar y la sustitución que produce la menor mejora se lista al final. Los variantes que muestran la mayor mejora incluyen variantes que contienen una sustitución en el resto 4, 54, o 138.

20 Tabla 2 -Resumen de la mejora en número de veces de la luminiscencia de los variantes de OgLuc+N166R frente al correspondiente OgLuc+N166R de partida

Posición: Aminoácido Codón Mejora en n.º de veces del brillo (RLAB), promedio de 4-6 min (con rel. a N166R)

2: S TCC 9

4: E GAG 20

4: S AGT 7

4: R AGG 6

4: G GGG
4

4: D GAT
4

4: T ACG 3

4: L CTG 3

11: R CGG 13

11: V GTG 6

11: I ATT 6

11: L CTT 3

11: K AAG 3

11: T ACT 2

33: K AAG 10

44: I ATT 25

44: L CTT 2

45: E GAG 2

54: F TTT 10

54: T ACT 8

54: V GTT 6

54: G GGG 5

54: S AGT 4

54: W TGG 3

54: L TTG 2

68: V GTT 2

68: Y TAT 3

72: Q CAG 3

75: R AGG 6

75: K AAG 5

75: Q CAG 5

75: G GGT 4

75: T ACG 4

75: A GCG 4

104: L CTT 10

115: E GAG 20

115: I ATT 4

115: Q CAG 3

115: L CTT 3

115: V GTT 3

115: G GGG 3

115: H CAT 3

115: R CGG 2

115: S AGT 2

115: C TGT 2

115: A GCT 2

124: K AAA 8

135: K AAG 10

138: V GTG 10

138: I ATT 8

138: T ACG 6

138: L CTG 5

138: C TGT 6

138: R CGG 5

138: M ATG 4

138: K AAG 3

139: E GAG 13

167: V GTT 40

169: L TTG 10

Otros variantes del variante OgLuc+N166R presentan más de una sustitución de un aminoácido. Estos otros variantes se listan en la tabla 2 en la que se listan las sustituciones de aminoácidos y la mejora en número de veces de la luminiscencia del variante OgLuc+N166R frente al correspondiente OgLuc N166R de partida. Se encontraron otros variantes que incluían mutaciones silenciosas, es decir, cambios en nucleótidos que no alteran el aminoácido codificado por ese codón.

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5

15

25

35

45

55

65

Se generaron otros variantes de OgLuc sintéticos con sustituciones en los sitios 33 y 68. De modo específico, se realizaron las sustituciones A33K y F68Y en la secuencia de OgLuc WT (identificadas como “WT A33K” y “WT F68Y” en las figuras 13A-13B, 14A-14B, 15A-15B, 16A-16B, 17, y 33A-33E) y del variante OgLuc+N166R (identificadas como “N166R A33K” y “N166R F68Y” en las figuras 13A-13B, 14A-14B, 15A-15B, 16A-16B, 17, y 33A-33E) y se compararon con la correspondiente OgLuc WT de partida (identificado como “WT” en las figuras 13A-13B, 14A-14B, 15A-15B, 16A-16B, 17, y 33A-33E) y el variante OgLuc+N166R (identificado como “N166R” en las figuras 13A-13B, 14A-14B, 15A-15B, 16A-16B, 17, y 33A-33E). El promedio de la luminiscencia en T = 0 de los variantes de OgLuc A33K y F68Y empleando tergitol al 0,5% y RLAB se muestra en las figuras 13A y 13B, respectivamente. Los variantes A33K y F68Y tienen mayor luminiscencia, comparado con la respectiva y correspondiente OgLuc de partida, tal como se muestra por el aumento en número de veces de la luminiscencia de los variantes frente a OgLuc WT en las figuras 14A (tergitol al 0,5%) y 14B (RLAB). Los A33K y F68Y por separado sobre el fondo de tipo salvaje mostraron un aumento en 1,6 y 1,7 veces frente a WT empleando RLAB (véase la figura 14B) y en 3,8 y 3,9 veces frente a WT con tergitol al 0,5% (figura 14A). Los A33K y F68Y por separado sobre el fondo de OgLuc+N166R mostraron un aumento en 5,1 y 3,3 veces frente a OgLuc WT empleando RLAB (véase la figura 14B) y un aumento en 9,2 y 5 veces frente a OgLuc WT empleando tergitol al 0,5% (figura 14A).

El aumento en número de veces de la luminiscencia de los variantes frente al variante OgLuc+N166R se muestra en las figuras 33A (RLAB) y 33B (tergitol al 0,5%). La sustitución A33K sobre el fondo de tipo salvaje mostró un aumento en 2,6 (tergitol al 0,5%) y en 0,6 (RLAB) veces de la luminiscencia frente al variante OgLuc+N166R (véase la figura 33A y 33B). La sustitución F68Y sobre el fondo de tipo salvaje mostró un aumento en 2,7 (tergitol al 0,5%) y en 0,7 (RLAB) veces frente al variante OgLuc+N166R (véase la figura 33A y 33B). La sustitución A33K sobre el fondo del variante OgLuc+N166R mostró un aumento en 6,3 (tergitol al 0,5%) y en 2,0 (RLAB) veces frente al variante OgLuc+N166R (véase la figura 33A y 33B). La sustitución F68Y sobre el fondo de OgLuc+N166R mostró un aumento en 3,4 (tergitol) y en 1,3 (RLAB) veces frente a N166R (véase la figura 33A y 33B).

Se midió la estabilidad de la señal de los variantes A33K y F68Y según se describió en el ejemplo 4 empleando tergitol al 0,5% (figuras 15A-15B) y RLAB (figuras 16A-16B). La semivida de la señal del variante A33K sobre el fondo de OgLuc WT fue mayor que la semivida de OgLuc WT, pero menor que sobre el fondo del variante OgLuc+N166R cuando se emplea tergitol al 0,5% (figura 15B) o RLAB (figura 16B). La semivida de la señal del variante F68Y sobre el fondo de OgLuc WT fue mayor que la semivida de OgLuc WT empleando tergitol al 0,5% (figura 16B), pero menor que sobre cualquier fondo empleando RLAB (figura 15B).

La estabilidad de las proteínas (concretamente, la termoestabilidad) de los variantes A33K y F68Y se midió como se describió en el ejemplo 5 a 22 ºC y se muestra en la figura 17. Las sustituciones A33K y F68Y sobre el fondo del variante N166R presentan una mayor semivida, de modo específico 72 y 78 minutos, comparado con OgLuc WT y el variante N166R, que es de 55 y 67 minutos, respectivamente (figura 17). Las sustituciones A33K y F68Y sobre el fondo de OgLuc WT presentan unas semividas de 58 y 57 minutos, respectivamente (figura 17).

Ejemplo 9:

Evaluación de combinaciones centrales específicas de sustituciones en luciferasas modificadas y emisión de luz

Para determinar si una combinación de dos o más sustituciones de aminoácidos en OgLuc proporciona una mayor mejora en la luminiscencia, se generaron diferentes variantes (denominados C1-C3) de OgLuc que contenían las siguientes sustituciones de aminoácidos: C1: N166R, Q11R, A33K, A54F, P115E, Q124K, Y1381 y V44I (el resto 44 puede ponerse en contacto con el sustrato), C2: V45E, N135K, I167V, P104L, y D139E (nótese que dos de estas están en sitios que pueden ponerse en contacto con el sustrato); C3; S28P, L34M, G51V, I99V, e I143L. Estos variantes de combinación central se generaron mutando T2T OgLuc mediante mutagénesis específica dirigida a sitio según se describió en el ejemplo 3. El variante C1 se volvió a mutar para que contuviese una sustitución del aminoácido A4E para crear el variante C1+A4E. También se crearon combinaciones de estos variantes con la sustitución A4E, por ejemplo, C1+C2+A4E y C1+C3+A4E. Estos clones recombinantes se construyeron empleando una mutagénesis específica dirigida a sitio basada en oligonucleótidos, seguido de una subclonación en el vector pF4Ag (que contiene los promotores de T7 y CMV, pF4A disponible en el mercado modificado para que contenga un sitio de unión a ribosomas de E. coli). Todos los variantes se seleccionaron en células de E. coli. Brevemente, los clones se sobreexpresaron en E. coli KRX, tras lo cual las células se lisaron y se midió la luminiscencia empleando colenteracina como sustrato. También se seleccionaron el variante OgLuc N166R y la luciferasa de Renilla. Los variantes C1, C1+A4E y C1+C3+A4E fueron aproximadamente 4 log más brillantes que el variante OgLuc N166R y al menos tan brillantes como la luciferasa de Renilla (figura 4A-4D). La emisión de luz total (es decir, la luminiscencia) de estos variantes de combinaciones centrales en T = 0 se midió según se describió en el ejemplo 4 empleando tergitol al 0,5% “Flash” (figura 4A) y RLAB “Glo” (figura 4B).

Se muestra un alineamiento de las secuencias de las proteínas (figura 31) y de nucleótidos (figura 32) de la proteína nativa, WT, N166R, C1, C1+C2, C1+A4E, C1+C2+A4E y C1+C3+A4E.

Se introdujo otra sustitución en C1+A4E y C1+C3+A4E. De modo específico, el resto A54F de estos variantes se cambió a F54T. Estos variantes, C1+A4E+F54T y C1+C3+A4E+F54T, se compararon con los correspondientes

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Claims

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