JP4628960B2 - リンカー化合物及びリガンド複合体、並びにそれらの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、表面プラズモン共鳴のセンサチップ等のタンパク質分析用の支持体にオリゴ糖等の糖鎖を固定することが可能なリンカー化合物、及び該リンカー化合物に糖鎖を導入してなるリガンド複合体、リガンド担持体、並びにこれらの製造方法に関するものである。

生体内に存在する種々の糖鎖は、生物の活動や生命を維持するためのメカニズムの中で重要な役割を果たしている。このような糖鎖の機能を精密に解明するためには、糖鎖の複雑な構造に基づいてそれらの機能を解析する必要がある。糖鎖の機能解析には、構造が解明されているオリゴ糖を用いて、糖鎖の構造を一部ずつ再現し、これによって糖鎖全体の構造と機能との関係を明らかにする手法が用いられる。

上記糖鎖の機能解析の手法としては、例えば、表面プラズモン共鳴（以下、ＳＰＲと記載する）法が知られている。すなわち、糖鎖の一部を模擬したオリゴ糖を含んでなるリガンド複合体をセンサチップ表面上に固定化し、それによってオリゴ糖が固定化されてなるセンサチップを用いて、オリゴ糖と特異的に相互作用するタンパク質等の物質を特定する。これにより、オリゴ糖の構造に基づく生物活性の正しい評価を行うことができる。

ところが、オリゴ糖は、１分子だけでは活性がそれほど高くないため、オリゴ糖の生物活性を評価する場合には、オリゴ糖鎖をセンサチップ上に集合化させることが必要となる。つまり、集合化したオリゴ糖鎖を用いて、タンパク質との相互作用を解析することにより、オリゴ糖鎖の生物活性の評価を行うことが可能になる。

そこで、本発明者らは、これまでに、センサチップ表面に固定可能な部位及びオリゴ糖鎖を導入可能な部位を分子内に有するリンカー化合物を得、このリンカー化合物に１単位又は２単位のオリゴ糖鎖を導入してなるリガンド複合体を得ている。そして、このリガンド複合体を用いることによって、センサチップ上に、オリゴ糖鎖を集合化して導入することができることを見出している（例えば、特許文献１、非特許文献１等を参照）。

特開２００３−８３６９６９号公報（２００３年３月１９日公開）
「日本化学会第７９回春季年会−講演予稿集ＩＩ」、社団法人日本化学会、２００１年３月１５日、ｐ．１０４２
しかしながら、上記特許文献１や非特許文献１に記載のリガンド複合体では、オリゴ糖の糖鎖をセンサチップ表面に２次元的に配列させることは可能であるが、その配列を再現性よく得ることが困難であるという技術的課題が残されている。

すなわち、上記のように、センサチップ表面に複数分子のオリゴ糖鎖を集合化させ、オリゴ糖鎖の生物活性を解析する場合には、オリゴ糖の糖鎖の集合化状態を同一にし、オリゴ糖鎖とタンパク質との間の相互作用を再現性よく観測することが求められる。特に、オリゴ糖鎖の生物活性を観測するためには、センサチップ表面に３単位以上のオリゴ糖鎖を集合化し、これらのセンサチップ上にて再現性よく２次元的に配列させることによって、オリゴ糖鎖の生物活性を再現性よく評価することが重要になる。

ところが、上記非特許文献１に記載のリガンド複合体では、１つのリガンド複合体が有するオリゴ糖鎖は１単位又は２単位となっている。言い換えれば、上記のリガンド複合体は、１つのリンカー化合物に対して、１つ又は２つのオリゴ糖鎖が結合してなるものである。そのため、オリゴ糖鎖の生物活性を観測するためには、上記リガンド複合体をセンサチップ表面に配列させる際に、リガンド複合体濃度を高めてリガンドである糖鎖同士を集合化させることによって、センサチップ表面上に３単位以上のオリゴ糖鎖を集合化させる必要がある。

このような手法によってオリゴ糖鎖を集合化させた場合、オリゴ糖の糖鎖間を所定の間隔にて制御してオリゴ糖の配列を再現性よく得ることは困難である。それゆえ、上記従来のリガンド複合体では、オリゴ糖の生物活性を再現性よく観測することができず、糖の構造の解明や、オリゴ糖の生物活性の評価を行う場合に困難を伴う可能性がある。

本発明は、上記の課題を解決するためになされたものであって、その目的は、センサチップ表面上の糖鎖間距離を制御し、オリゴ糖を再現性よく２次元的に配列し得る新規なリンカー化合物、及び、該リンカー化合物に糖分子が導入されてなる新規なリガンド複合体、リガンド担持体、並びにこれらの製造方法を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、３単位以上の糖分子を導入可能な部位を有し、かつ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のセンサチップやアフィニティクロマトグラフィの担体等のタンパク質分析用の支持体に結合可能な部位を有する新規なリンカー化合物を用いることによって、上記支持体に３単位以上の糖分子を再現性よく２次元的に配列させることができることを見出した。

なお、本願発明者らは、先出願（出願番号：特願２００３−１９０５６８、公開番号：特開２００４−１５７１０８（公開日：２００４年６月３日）、本願の優先日（２００４年２月５日）の時点で未公開）において、上記の問題点を解決することを目的として見出された他のリンカー化合物を開示している。しかしながら、この他のリンカー化合物は、疎水性が非常に強いタンパク質などを分析する際に、リンカー部のアルキル基と非特異的に結合相互作用してしまうという問題点がある。また、この他のリンカー化合物は、リンカー部を形成しているアルキル基の長さが十分ではなく、固定化するオリゴ糖鎖が大きい場合には、オリゴ糖鎖類の立体障害のために効率よく金属−硫黄結合が形成しないという問題点を有している。

そこで、本願発明者らは、さらに、リンカー部にオリゴエチレンオキシド基を導入し、非特異的な疎水性相互作用を極力抑え、かつ、金属結合に供されるジスルフィド基までの長さを容易に調整可能にして、効率よく金属−硫黄結合を形成することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明にかかるリンカー化合物は、上記の課題を解決するために、一般式（１）

（式中、ａ，ｂ，ｄ，ｅは、それぞれ独立して、０以上６以下の整数）にて表される構造を備え、上記Ｘが、末端に芳香族アミノ基を有するとともに主鎖に炭素−窒素結合を有していてもよい炭化水素誘導鎖を、３鎖以上含んでなる多分岐構造部位である構造を備えていることを特徴としている。

また、本発明にかかるリンカー化合物は、一般式（２）

（式中、ｎは１以上６以下の整数）にて表される構造を備え、上記Ｘが、末端に芳香族アミノ基を有するとともに主鎖に炭素−窒素結合を有していてもよい炭化水素誘導鎖を、３鎖以上含んでなる多分岐構造部位である構造を備えているものでもよい。

ここで上記炭化水素誘導鎖とは、炭素及び水素からなる炭化水素鎖にて、一部の炭素や水素が、他の原子や置換基に置き換わっていてもよいものを指すものとする。すなわち、上記炭化水素誘導鎖とは、末端に芳香族アミノ基を有し、炭化水素鎖の主鎖構造である炭素−炭素結合（Ｃ−Ｃ結合）の一部が、炭素−窒素結合（Ｃ−Ｎ結合）、炭素−酸素結合（Ｃ−Ｏ結合）、アミド結合（ＣＯ−ＮＨ結合）に置き換わっていてもよいものを指す。

上記の構成によれば、上記リンカー化合物は、糖分子を簡便に導入できる部位として、芳香族アミノ基を有している。上記芳香族アミノ基は、各炭化水素誘導鎖に含まれているので、上記リンカー化合物には、３単位以上の糖分子を導入することができる。また、上記タンパク質分析用の支持体に固定可能な部位として、Ｓ−Ｓ結合を有している。

従って、上記リンカー化合物を介して、上記支持体に３単位以上の糖分子を集合化させて導入することができる。また、３単位以上の糖分子が１つのリンカー化合物に導入されているので、上記支持体表面に、３単位以上の糖分子を再現性よく配列させることができる。これにより、上記支持体表面上にて、糖分子とタンパク質との相互作用の観測が可能になるとともに、糖分子の生物活性を再現性よく評価することが可能になる。

さらに、上記リンカー化合物は、リンカー部にオリゴエチレンジオキシド基を有しているため、リンカー部にアルキル基を有している場合に比べ、疎水性の高い分析対象物と非特異的な相互作用を起こす可能性を大幅に低下させることができる。また、上記リンカー部がオリゴエチレンジオキシドで構成されていることによって、金属結合に供されるジスルフィド基からアミノ末端に結合するオリゴ糖鎖までの長さを容易に調節することができる。これによって、ジスルフィド基がオリゴ糖鎖の影響を受けることなく、効率よく金属−硫黄結合を形成することができる。

上記一般式（１）または一般式（２）で表される構造を備えているリンカー化合物において、上記Ｘは、一般式（３）

（式中、ｍ^１，ｍ^２，ｍ^３，ｍ^４，ｐ^１，ｐ^２は、それぞれ独立して、１以上６以下の整数）にて表される構造を備えていることが好ましい。

また、上記一般式（１）または一般式（２）で表される構造を備えているリンカー化合物において、上記Ｘは、一般式（４）

（式中、ｑ^１，ｑ^２，ｑ^３，ｒ^１，ｒ^２，ｒ^３，ｔ^１，ｔ^２，ｔ^３，ｕ^１，ｕ^２，ｕ^３は、それぞれ独立して、０以上６以下の整数）にて表される構造を備えていることが好ましい。

上記リンカー化合物のＸは、上記炭化水素誘導鎖を３鎖以上有しているので、このリンカー化合物を介して、上記支持体上に３単位以上の糖分子の導入が可能である。そのため、上記支持体表面にて３単位以上の糖分子間の間隔を制御して、糖分子の配列を再現性よく得ることができるので、糖分子の生物活性を再現性よく評価することが可能になる。

また、本発明のリガンド複合体は、上記の課題を解決するために、上記したいずれかのリンカー化合物の芳香族アミノ基に、糖分子を導入してなるものであることを特徴としている。

そして、上記リガンド複合体が、具体的には、一般式（５）

（式中、ｍ^１，ｍ^２，ｍ^３，ｍ^４，ｎ，ｐ^１，ｐ^２は、それぞれ独立して、１以上６以下の整数。Ｒ’は水素（Ｈ）またはＲ。）にて表される構造を備え、上記Ｒが式（６−１）ないし式（６−６）

から選択されるオリゴ糖由来化合物であることが好ましい。
また、上記リガンド複合体が、具体的には、一般式（７）

（式中、ａ，ｂ，ｄ，ｅ，ｑ^１，ｑ^２，ｑ^３，ｒ^１，ｒ^２，ｒ^３，ｔ^１，ｔ^２，ｔ^３，ｕ^１，ｕ^２，ｕ^３は、それぞれ独立して、０以上６以下の整数。ただし、ｂが０のときはｔ^１，ｔ^２およびｔ^３は０ではなく、ｔ^１，ｔ^２およびｔ^３が０のときはｂは０ではない。また、Ｒ’は水素（Ｈ）またはＲ。）にて表される構造を備え、上記Ｒが上記式（６−１）ないし式（６−６）から選択されるオリゴ糖であることが好ましい。

上記リガンド複合体を用いることにより、上記タンパク質分析用の支持体表面に３単位以上または４単位以上（一般式（５）または一般式（７）に示される構造を備えているリガンド複合体を用いた場合）の糖分子を集合化して固定化することができる。このように、一つのリガンド複合体が３単位以上の糖分子を有しているので、上記リガンド複合体同士を上記支持体表面に集合化することなく、一つのリガンド複合体を用いることで、３単位以上の糖分子を集合化させることができる。そのため、糖分子の生物活性を再現性よく測定することが可能になる。また、上記支持体表面に２次元的に複数の糖分子を再現性よく配列することができる。従って、本発明のリガンド複合体が固定されてなるタンパク質分析用の支持体を用いることによって、糖分子の生物活性を再現性よく評価することが可能になる。

また、本発明のリンカー化合物の製造方法は、上記の課題を解決するために、チオクト酸と、芳香族アミノ基末端が保護基によって保護された分岐鎖を３鎖以上有するアミン化合物との縮合反応を行うステップと、上記芳香族アミノ基末端の保護基を脱保護するステップとを含んでいることを特徴としている。

上記の方法によれば、上記タンパク質分析用の支持体に固定可能な部位としてのＳ−Ｓ結合と、糖分子を簡便に導入できる部位としての芳香族アミノ基とを有している、本発明のリンカー化合物を得ることができる。

また、本発明のリガンド複合体の製造方法は、上記の課題を解決するために、上記のリンカー化合物と、糖分子とを用いて、還元アミノ化反応を行うことを特徴としている。

上記の方法によれば、還元アミノ化反応により、リンカー化合物に簡便に糖分子を導入して、本発明のリガンド複合体を得ることができる。

なお、上記糖分子としては、還元末端を有するあらゆる種類の糖分子を用いることができる。

上記糖分子として、具体的には、一般式（８）

にて表されるヘパリン部分二糖構造を有する硫酸化オリゴ糖を用いることが好ましい。

また、上記糖分子として、具体的には、群（９）

から選択されるオリゴ糖の少なくとも１つを用いることが好ましい。

また、本発明の糖分子の導入方法は、上記の課題を解決するために、上記リガンド複合体を含む溶液と、支持体表面の金属とを接触させることを特徴としている。

上記の方法によれば、上記リガンド複合体に含まれるリンカー化合物のＳ−Ｓ結合を、上記支持体表面の金属との結合に変換し、支持体表面にリガンドである糖鎖を固定することができる。従って、リガンド複合体を含む溶液と支持体とを接触させるという簡便な方法で、リンカー化合物に結合した糖分子を支持体の表面に配列させることができる。

また、本発明のリガンド担持体は、上記の課題を解決するために、上記リガンド複合体を、表面に金属を有する支持体上に、固定化させてなることを特徴としている。

上記の構成によれば、金属−硫黄結合を介して、支持体表面にリガンド複合体を強固に固定することができるので、支持体表面に複数の糖分子を再現性よく配列させてなるリガンド担持体を提供することができる。従って、上記リガンド担持体を用いれば、リガンド複合体に含まれる糖分子と、該糖分子と相互作用するタンパク質等の物質との相互作用を再現性よく観測することができるので、糖分子の生物活性の定量的な評価が可能になる。

本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるだろう。

本発明にかかるリンカー化合物（化合物１５）の合成経路の一例を示す模式図である。 本発明にかかるリガンド複合体（化合物１７）の合成経路の一例を示す模式図である。 ヘパリン共存下において、Ｍｏｎｏ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃを固定化したチップへのｂＦＧＦの結合挙動を示すグラフである。 Ｍｏｎｏ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ、Ｔｒｉ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ、Ｔｅｔｒａ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃをそれぞれ固定化したチップへのｂＦＧＦの結合相互作用に対するヘパリンの阻害率を示すグラフである。 溶液中の混合比を変えたＴｒｉ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃの全反射赤外吸収スペクトルを示すグラフである。 溶液中の混合比を変えたＴｅｔｒａ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃの全反射赤外吸収スペクトルを示すグラフである。 溶液中のＴｒｉ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃの混合比に対するチップ上の硫酸基の相対強度を示すグラフである。 溶液中のＴｅｔｒａ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃの混合比に対するチップ上の硫酸基の相対強度を示すグラフである。 Ｍｏｎｏ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−ＧｌｃとＭｏｎｏ−Ｇｌｃとの混合比が１００／０の場合のｈ−ｖＷＦの結合相互作用を、ＳＰＲ法によって観測した結果を示すグラフである。 Ｔｒｉ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−ＧｌｃとＭｏｎｏ−Ｇｌｃとの混合比が１００／０の場合のｈ−ｖＷＦの結合相互作用を、ＳＰＲ法によって観測した結果を示すグラフである。 Ｔｅｔｒａ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−ＧｌｃとＭｏｎｏ−Ｇｌｃとの混合比が１００／０の場合のｈ−ｖＷＦの結合相互作用を、ＳＰＲ法によって観測した結果を示すグラフである。 Ｍｏｎｏ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−ＧｌｃとＭｏｎｏ−Ｇｌｃとの混合比が２０／８０の場合のｈ−ｖＷＦの結合相互作用を、ＳＰＲ法によって観測した結果を示すグラフである。 Ｔｒｉ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−ＧｌｃとＭｏｎｏ−Ｇｌｃとの混合比が２０／８０の場合のｈ−ｖＷＦの結合相互作用を、ＳＰＲ法によって観測した結果を示すグラフである。 Ｔｅｔｒａ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−ＧｌｃとＭｏｎｏ−Ｇｌｃとの混合比が２０／８０の場合のｈ−ｖＷＦの結合相互作用を、ＳＰＲ法によって観測した結果を示すグラフである。 図７（ａ）および図８（ａ）に示す結果から得られた結合量を、ｈ−ｖＷＦの濃度ごとにプロットしたグラフである。 図７（ｂ）および図８（ｂ）に示す結果から得られた結合量を、ｈ−ｖＷＦの濃度ごとにプロットしたグラフである。 図７（ｃ）および図８（ｃ）に示す結果から得られた結合量を、ｈ−ｖＷＦの濃度ごとにプロットしたグラフである。 Ｍｏｎｏ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ／Ｍｏｎｏ−Ｇｌｃ＝１００／０の場合において、Ｍｏｎｏ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃを固定化したチップとｒｈｖＷＦ−Ａ１との相互作用を測定した結果を示すグラフである。 Ｍｏｎｏ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ／Ｍｏｎｏ−Ｇｌｃ＝５０／５０の場合において、Ｍｏｎｏ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃを固定化したチップとｒｈｖＷＦ−Ａ１との相互作用を測定した結果を示すグラフである。 Ｔｒｉ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ／Ｍｏｎｏ−Ｇｌｃ＝１００／０の場合において、Ｔｒｉ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃを固定化したチップとｒｈｖＷＦ−Ａ１との相互作用を測定した結果を示すグラフである。 Ｔｒｉ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ／Ｍｏｎｏ−Ｇｌｃ＝５０／５０の場合において、Ｔｒｉ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃを固定化したチップとｒｈｖＷＦ−Ａ１との相互作用を測定した結果を示すグラフである。 Ｔｅｔｒａ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ／Ｍｏｎｏ−Ｇｌｃ＝１００／０の場合において、Ｔｅｔｒａ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃを固定化したチップとｒｈｖＷＦ−Ａ１との相互作用を測定した結果を示すグラフである。 Ｔｅｔｒａ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ／Ｍｏｎｏ−Ｇｌｃ＝５０／５０の場合において、Ｔｅｔｒａ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃを固定化したチップとｒｈｖＷＦ−Ａ１との相互作用を測定した結果を示すグラフである。 本発明にかかるリンカー化合物（化合物２６）の合成経路の一例を示す模式図である。 本発明にかかるリガンド複合体（化合物２７）の合成経路の一例を示す模式図である。 本発明にかかるリンカー化合物（化合物３２）の合成経路の一例を示す模式図である。 Ｈ_２Ｎ−ＴＥＧ−ＮＨＢｏｃ（化合物３０）の合成経路の一例を示す模式図である。 本発明にかかるリガンド複合体（化合物３４）の合成経路の一例を示す模式図である。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明のリンカー化合物は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のセンサチップやアフィニティクロマトグラフィの担体等のタンパク質分析用の支持体とオリゴ糖等の糖（以下、糖分子と記載する）との間に介在して、上記支持体上に糖分子を固定化するために用いられる。そのため、上記リンカー化合物は、上記支持体に固定可能な部位、及び、糖分子を簡便に導入できる部位を分子内に有している必要がある。

また、上記ＳＰＲやアフィニティクロマトグラフィでは、糖分子と特異的に相互作用するタンパク質等の物質を特定することや分離することを目的としている。そのため、上記リンカー化合物は、タンパク質等の物質との非特異的な相互作用を有していないものでなければならない。

そこで、本発明のリンカー化合物は、上記支持体に固定可能な部位として、前記一般式（１）または一般式（２）にて示すように、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）を有している。このジスルフィド結合の硫黄（Ｓ）は、例えば、タンパク質分析用の支持体表面にコートされた金（Ａｕ）などの金属と、金属−硫黄結合を形成し、上記支持体に強固に結合することができる。

また、上記リンカー化合物は、タンパク質分析用の支持体表面に２次元的に複数の糖分子を配列するとともに、個々の糖分子の糖鎖間の距離を制御するために、糖分子を簡便に導入できる部位として、複数のアミノ基を含んでなる多分岐部位を有している。すなわち、本発明のリンカー化合物の多分岐部位は、前記一般式（１）または一般式（２）のＸで表される構造を備えている部位であり、該Ｘは、前記したように、末端に芳香族アミノ基を有するとともに主鎖に炭素−窒素結合やアミド結合を有していてもよい炭化水素誘導鎖を３鎖以上含んでいる構造を備えている。

上記芳香族アミノ基のアミノ基（−ＮＨ_２基）は、オリゴ糖等の糖分子との還元アミノ化反応により、上記リンカー化合物に糖分子を導入するための反応基となる。つまり、糖分子中の平衡によって生じるアルデヒド基（−ＣＨＯ基）又はケトン基（−ＣＲＯ基、Ｒは炭化水素基）と、上記リンカー化合物が有するアミノ基とが反応する。そして、この反応によって形成されたシッフ塩基を引き続き還元することによって、芳香族アミノ基に容易に糖分子を導入することができる。

従って、前記一般式（１）または一般式（２）のＸは、上記のような炭化水素誘導鎖を３鎖以上含むことにより、糖分子を導入可能な芳香族アミノ基を複数併せ持った多分岐型部位である構造を備えている。この多分岐型部位に含まれる各芳香族アミノ基に、オリゴ糖等の糖分子が導入されるので、前記一般式（１）または一般式（２）にて表される構造を備えているリンカー化合物を介して、タンパク質分析用の支持体表面に２次元的に複数の糖分子を再現性よく配列することが可能になる。

さらに、本発明のリンカー化合物は、前記一般式（１）または一般式（２）に示すように、ジスルフィド基と、芳香族アミノ基との間にオリゴエチレンオキシドを有している。これにより、非特異的な疎水性相互作用を極力抑え、かつ、金属結合に供されるジスルフィド基までの長さを容易に調整可能にして、効率よく金属−硫黄結合を形成することができる。なお、上記一般式（１）において、ａ，ｂ，ｄ，ｅは、それぞれ独立して、０以上６以下の整数であればよい。ただし、ｂが０の場合は、Ｘの内部にオリゴエチレンオキシドを有している必要がある。上記一般式（２）において、ｎは、１以上６以下の整数であれば限定されない。

具体的には、上記Ｘは、前記一般式（３）にて示すように、２鎖の炭化水素誘導鎖が、芳香族アミノ基とは反対側の末端にて、１つの窒素（Ｎ）に結合した２分岐構造を２つ有している構造を備えていてもよい。この場合、２つの２分岐構造の上記窒素が、例えば−ＣＯ−ＣＨ_２−を介して、１つの窒素（Ｎ）に結合することによって分岐構造を形成する。これにより、上記Ｘは、４鎖の炭化水素誘導鎖を備えた多分岐型部位である構造を備えることになる。なお、上記一般式（３）において、ｍ^１，ｍ^２，ｍ^３，ｍ^４は、１以上６以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数であってもよく、一部あるいは全てが同じ整数であってもよい。このうち、上記多分岐部位を有する化合物の製造時の簡便さの点から、上記ｍ^１〜ｍ^４は、互いに同じ整数であることが好ましく、特に２であることが好ましい。また、ｐ^１，ｐ^２は、１以上６以下の整数であれば特に限定されず、互いに異なる整数であってもよく、互いに同じ整数であってもよい。このうち、製造の簡便性の点から、ｐ^１，ｐ^２は、互いに同じ整数であることが好ましく、特に１であることが好ましい。

なお、前記一般式（３）に示される４鎖の炭化水素誘導鎖を備えたＸにおいて、各炭化水素誘導鎖中にオリゴエチレンオキシドを有する構造とすることもできる。例えば、前記一般式（４）のように、各炭化水素誘導鎖のＣＨ_２とＮＨの間にオリゴエチレンオキシドを有する構造とすることができる。

また、上記Ｘは、前記一般式（４）にて示すように、３鎖の炭化水素誘導鎖が、芳香族アミノ基とは反対側の末端にて、１つの炭素（Ｃ）に結合した３分岐構造を有している構造を備えていてもよい。この場合、３分岐構造の上記炭素が、例えば−Ｃ−Ｎ−を介して、１つの窒素（Ｎ）に結合することによって分岐構造を形成する。これにより、上記Ｘは、３鎖の炭化水素誘導鎖を備えた多分岐型部位である構造を備えることになる。

なお、上記一般式（４）において、ｑ^１，ｑ^２，ｑ^３は、０以上６以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数であってもよく、一部あるいは全てが同じ整数であってもよい。このうち、上記多分岐部位を有する化合物の製造時の簡便さの点から、上記ｑ^１〜ｑ^３は、互いに同じ整数であることが好ましく、特に２であることが好ましい。また、ｒ^１，ｒ^２，ｒ^３は、０以上６以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数であってもよく、一部あるいは全てが同じ整数であってもよい。このうち、製造の簡便性の点から、上記ｒ^１〜ｒ^３は、互いに同じ整数であることが好ましく、特に１であることが好ましい。また、ｕ^１，ｕ^２，ｕ^３は、０以上６以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数であってもよく、一部あるいは全てが同じ整数であってもよい。このうち、製造の簡便性の点から、上記ｕ^１〜ｕ^３は、互いに同じ整数であることが好ましく、特に１であることが好ましい。さらに、ｔ^１，ｔ^２，ｔ^３は、０以上６以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数であってもよく、一部あるいは全てが同じ整数であってもよい。ただし、前記一般式（１）においてＸが当該一般式（４）である場合、前記一般式（１）のｂが０のときは、ｔ^１，ｔ^２，ｔ^３は１以上６以下の整数であることが好ましい。製造の簡便性の点から、上記ｔ^１〜ｔ^３は、互いに同じ整数であることが好ましく、特に４であることが好ましい。

このように、上記Ｘは、炭素や窒素等の原子にて、上記炭化水素誘導鎖を複数結合して分岐構造を形成している多分岐型部位である構造を備えている。なお、上記Ｘに含まれる複数の炭化水素誘導鎖は、すべて同じであることが好ましいが、末端に芳香族アミノ基を有していれば、互いに異なる構造であってもよい。

以上のように、一般式（１）または一般式（２）にて表される構造を備えているリンカー化合物は、タンパク質分析用の支持体に結合可能なＳ−Ｓ結合と、オリゴ糖鎖等の糖分子に結合可能なアミノ基とを有している。従って、例えばＡｕ−Ｓ結合などの金属−硫黄結合により上記リンカー化合物が、タンパク質分析用の支持体上に固定されるので、上記リンカー化合物を介して、上記支持体上に糖分子を強固にかつ簡単に結合させることができる。

また、上記リンカー化合物は、多分岐型部位を有し、該多分岐型部位の各末端に芳香族アミノ基を有している。そのため、上記リンカー化合物に糖分子を導入してなるリガンド複合体（後述）を用いることにより、上記支持体表面に効率よく糖分子を集合化させることができる。また、多分岐型部位を有しているので、リンカー化合物を含んでなるリガンド複合体を支持体表面に結合させた場合に、２次元的に複数の糖分子を再現性よく配列させることができる。

さらに、上記リンカー化合物は、タンパク質との非特異的な相互作用の影響をほぼ無視することができる。それゆえ、本発明のリンカー化合物を用いることによって、糖分子の生物活性を再現性よく評価することが可能になる。

また、上記リンカー化合物は、前記一般式（１）または一般式（２）に示すように、ジスルフィド基と、芳香族アミノ基との間にオリゴエチレンオキシドを有している。これによって、非特異的な疎水性相互作用を極力抑え、かつ、金属結合に供されるジスルフィド基までの長さを容易に調整可能にして、効率よく金属−硫黄結合を形成することができる。

上記リンカー化合物は、以下に示す製造方法によって製造される。すなわち、上記リンカー化合物は、チオクト酸と、芳香族アミノ基末端が保護基によって保護された分岐鎖を３鎖以上有する多分岐構造を含んでなるアミン化合物との縮合反応を行い、上記芳香族アミノ基末端の保護基を脱保護することによって製造される。

上記チオクト酸は、下記一般式（１０）

にて表される構造を備えている。

また、上記アミン化合物は、保護基によって保護された芳香族アミノ基末端を有する分岐鎖を含んでいれば特に限定されるものではなく、上記したリンカー化合物の多分岐部位に相当する構造を含んでいればよい。

従って、上記分岐鎖は、上記した炭化水素誘導鎖に含まれる芳香族アミノ基の代わりに、保護基によって保護された芳香族アミノ基末端を有する以外は、上記炭化水素誘導鎖に含まれる構造を有していればよい。つまり、上記分岐鎖は、炭素及び水素からなる炭化水素鎖にて、一部の炭素や水素が他の原子や置換基に置き換わっていてもよいものである。より具体的には、上記分岐鎖は、保護基によって保護された芳香族アミノ基末端を有するとともに、炭化水素鎖の主鎖構造である炭素−炭素結合（Ｃ−Ｃ結合）の一部が炭素−窒素結合（Ｃ−Ｎ結合）、また炭素−酸素結合（Ｃ−Ｏ結合）に置き換わっていてもよいものである。

また、上記保護基とは、芳香族アミノ基のアミノ基が上記縮合反応によって反応しないように導入される置換基である。このような保護基は、二級アミノ基の保護基を脱保護する際に影響を受けないものであれば、特に限定されるものではない。上記保護基としては、例えば、ｔ−ブトキシカルボニル基（−ＣＯＯＣ（ＣＨ_３）_３基；Ｂｏｃ基と記載する）、ベンジル基、アリルカルバメート基（−ＣＯＯＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２、Ａｌｌｏｃ基）等を挙げることができる。

上記アミン化合物としては、例えば、下記一般式（１１）

にて表される構造を備えている化合物を挙げることができる。なお、上記一般式（１１）中のｎ，ｍ^１〜ｍ^４，ｐ^１，ｐ^２は、それぞれ独立して、１以上６以下の整数である。これらのアミン化合物の合成方法については、後の実施例にて詳述する。

上記チオクト酸とアミン化合物との縮合反応により、チオクト酸のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ基）と、アミン化合物のアミノ基（−ＮＨ_２基）とが縮合して、アミド結合が形成される。その後、芳香族アミノ基末端の保護基を脱保護して、保護基を取り外し、芳香族アミノ基にすることによって、上記したリンカー化合物を得ることができる。

なお、上記リンカー化合物は、上述のようにリンカー部分にオリゴエチレンオキシドを備えた構造となっているため、その製造方法においてはオリゴエチレンオキシド構造を含んでなる物質を原料として用いることが好ましい。この原料としては、例えば、ビス［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチル］エーテル（実施例の化合物１）、分子量の異なる市販のポリエチレングリコール（Ｍｗ：２００、３００、４００、６００、１０００）（Ｓｉｇｍａ社製）などを挙げることができ、この中でも特に、重合度が完全に制御された、すなわち、長さが制御された構造を有するという理由で、ビス［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチル］エーテル（実施例の化合物１）を用いることが好ましい。

次に、本発明のリガンド複合体について説明する。ここで、「リガンド複合体」とは、上記リンカー化合物の芳香族アミノ基に、糖分子が導入されてなるものを意味するものとする。本発明のリガンド複合体においては、リンカー化合物のアミノ基が、糖分子中の平衡によって生じるアルデヒド基又はケトン基と反応し、この反応によって形成されたシッフ塩基を引き続き還元することによって、芳香族アミノ基に糖分子を導入することができる。すなわち、この還元アミノ化反応により、上記リンカー化合物と糖分子とが結合する。

本発明のリガンド複合体に含まれる糖分子としては、還元末端を有する還元糖であれば、特に限定されることなくあらゆる種類のものを用いることができる。上記糖分子として具体的には、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース等の単糖類、結合している糖の数が２糖〜１０糖であるマルトース、ラクトース、後述する硫酸化オリゴ糖等のオリゴ糖類、単糖類やオリゴ糖類が組み合わされて糖数が１１以上であるヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸等の多糖類を挙げることができる。

また、上記オリゴ糖類として、抗血液凝固活性を有することで知られている硫酸化多糖ヘパリン中の下記一般式（８）

にて表される特定の部分二糖構造（「ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ」と呼ぶ）を有する硫酸化オリゴ糖、該硫酸化オリゴ糖の還元末端である水酸基にグルコースを導入してなる下記一般式（１２）

にて表される構造を備えているオリゴ糖を挙げることができる。

なお、上記オリゴ糖類や多糖類は、同一の単糖分子からなる単一オリゴ糖や単一多糖であってもよく、種々の単糖分子やその誘導体からなる複合糖質や、種々の単糖分子やその誘導体、オリゴ糖類を含んでなる複合多糖類であってもよい。また、上記糖分子は、いずれも、自然界から単離・精製して得られる種々の天然の糖であってもよく、人工的に合成された糖であってもよい。

具体的には、本発明のリガンド複合体は、前記一般式（５）にて表される構造を備えているものである。この一般式（５）にて表される構造を備えているリガンド複合体は、前記一般式（２）にて表され、Ｘが前記一般式（３）にて表される構造を備えているリンカー化合物に、糖分子を導入してなるものである。糖分子は、還元末端を有する還元糖であれば限定されないが、一般式群（９）や一般式（１２）から選択されるものであることが好ましい。一般式（３）にて表されるＸは、４鎖の炭化水素誘導鎖を有している構造を備えているので、一般式（５）にて表される構造を備えているリガンド複合体は、上記リンカー化合物に４単位以上の糖分子が結合したものである。なお、上記一般式（５）において、ｍ^１〜ｍ^４は、一般式（３）中のｍ^１〜ｍ^４と同様に、１以上６以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数であってもよく、一部あるいは全てが同じ整数であってもよい。また、ｎは１以上６以下の整数であれば特に限定されない。また、Ｒ’は水素（Ｈ）またはオリゴ糖由来化合物であればよい。

また、本発明のリガンド複合体は、前記一般式（７）にて表される構造を備えているものである。この一般式（７）にて表される構造を備えているリガンド複合体は、前記一般式（１）にて表され、Ｘが前記一般式（４）にて表される構造を備えているリンカー化合物に、糖分子を導入してなるものである。糖分子は、還元末端を有する還元糖であれば限定されないが、一般式群（９）や一般式（１２）から選択されるものであることが好ましい。一般式（７）にて表されるＸは、３鎖の炭化水素誘導鎖を有している構造を備えているので、一般式（７）にて表される構造を備えているリガンド複合体は、上記リンカー化合物に３単位以上の糖分子が結合したものである。

上記のリガンド複合体は、いずれもリンカー化合物と糖分子とを含んでなっているので、リンカー化合物内のＳ−Ｓ結合にて、タンパク質分析用の支持体表面の金属と、金属−硫黄（Ｓ）結合、例えば金−硫黄（Ａｕ−Ｓ）結合により結合することができる。これにより、このＡｕ−Ｓ結合を介して、上記支持体表面に３単位以上の糖分子を集合化して固定化されてなるリガンド担持体を提供することができる。それゆえ、上記リガンド複合体を用いることによって、例えばタンパク質分析用の支持体表面に２次元的に複数の糖分子を再現性よく配列してリガンド担持体を得、該リガンド担持体を用いることによって、糖分子の生物活性を再現性よく評価することが可能になる。なお、上記支持体表面の金属としては、上記Ａｕの他、Ｃｕ、Ａｇ、Ｐｔ等の金属を用いることができるが、特にＡｕを用いることが好ましい。

さらに、上記のリガンド複合体は、リンカー部にオリゴエチレンオキシドを有している。これにより、非特異的な疎水性相互作用を極力抑え、かつ、金属結合に供されるジスルフィド基までの長さを容易に調整可能にして、効率よく金属−硫黄結合を形成することができる。

このように、本発明のリガンド複合体を、金属−硫黄結合を介して支持体の表面に固定化させてなるリガンド担持体も本発明に含まれる。このリガンド担持体はタンパク質分析の用途に限定されず、糖分子との相互作用を調べるために、タンパク質以外の物質の分析用として用いることもできる。

上記リガンド担持体は、該リガンド複合体を含む溶液と表面に金属膜を有する支持体とを接触させることにより、リガンド複合体のＳ−Ｓ結合の各Ｓ原子が、支持体表面の金属と金属−硫黄結合によって結合して、支持体表面に上記リガンド複合体が導入される。具体的には、上記リガンド複合体溶液に、タンパク質分析用の支持体を所定時間浸漬する、あるいは、上記支持体にリガンド複合体溶液を注入する（支持体表面にリガンド複合体溶液を流す）ことによって、上記リガンド複合体に含まれるリンカー化合物のＳ−Ｓ結合を、上記支持体表面の金等とのＡｕ−Ｓ結合に変換して、支持体表面に上記リガンド複合体を固定することができる。

リガンド複合体溶液に用いる溶媒としては、特に限定されるものではないが、例えば、メタノール、水、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）や、これらの混合溶媒等を挙げることができる。また、浸漬時間は、０．５時間〜１２時間程度であればよく、注入濃度は、１μＭ〜１ｍＭ程度であればよい。

このように、本発明のリガンド複合体は、Ｓ−Ｓ結合を有しているので、タンパク質分析用の支持体表面に簡単に固定化することができ、上記支持体上に糖分子を簡単に導入することができる。

なお、上記のように支持体に糖分子を導入する方法も本発明に含まれる。

本発明のリガンド担持体は、糖分子と、例えばタンパク質等の他の物質との相互作用の分析に、利用可能である。具体的には、上記リガンド担持体は、ＳＰＲ測定、アフィニティクロマトグラフィ等に適用することができる。

例えば、タンパク質分析として、ＳＰＲ測定を行うには、以下のようにすればよい。すなわち、金薄膜等の金属薄膜を蒸着した支持体に、本発明のリガンド複合体を固定化してなるリガンド担持体を用い、該リガンド担持体とタンパク質とを接触させ、常法に従って、表面プラズモン共鳴装置を用いて共鳴角度を測定すれば、該リガンド担持体とタンパク質との結合挙動を観測することができる。なお、ＳＰＲ測定に用いる上記支持体（センサチップ）としては、例えば、ガラス、プラスチック等を用いることができ、特にガラスが好適に用いられる。また、リガンド担持体とタンパク質の接触は、例えば、タンパク質をランニングバッファーに溶解した溶液を、該リガンド担持体の表面に流入することにより行えばよい。このランニングバッファーとしては、例えば、リン酸緩衝溶液等を挙げることができる。

本発明のリガンド担持体は、上記リガンド複合体を有しているので、支持体表面に２次元的に複数の糖分子が再現性よく配列されている。それゆえ、糖分子の生物活性を再現性よく観測でき、糖分子の構造の解明や、糖分子の生物活性について定量的な評価を行うことができる。

また、本発明のリガンド担持体として、糖鎖を固定化したセンサチップは、例えば、以下のようなＳＰＲ測定に使用することができる。すなわち、第１の糖分子が支持体表面に固定化されてなる第１のセンサチップと、上記第１の糖分子とは末端構造が異なる第２の糖分子が支持体表面に固定化されてなる第２のセンサチップとを用いて、第１のセンサチップを用いて得られたＳＰＲ測定の検出結果と、第２のセンサチップを用いて得られたＳＰＲ測定の検出結果との差を検出し、糖分子の相互作用を観測することができる。これらのセンサチップは、固定化される糖分子が異なっているリガンド複合体を用いればよい。比較する糖分子には、例えば、ラクトースとグルコース、マルトースとグルコース、コージビオースとグルコース等が挙げられる。ここでは、２つのセンサチップを用いたが、これ以上の数の、導入される糖分子の種類が異なるセンサチップを用いてもよい。なお、糖分子の末端とは、センサチップに固定されていない側のことである。

上記ＳＰＲ測定では、第１の糖分子に特異的に作用するタンパク質等を用いて、測定条件を一定にして、上記２つのセンサチップに作用させ、両者の共鳴角度を観測する。この両者の共鳴角度の差を検出することで、糖分子とタンパク質等との特異的な相互作用として測定することができる。

また、糖分子との相互作用を観測する物質は、タンパク質に限定はされない。

上記では、２つの種類のセンサチップを同時に測定したが、これに限定されることはなく、２種類以上のセンサチップを測定してもかまわないし、同時に測定しなくてもかまわない。また、少なくとも１つのセンサチップに糖分子を導入していないものを用いてもよい。例えば、リンカー化合物のみを固定化したものを用いてもよい。

上記のようなＳＰＲ測定を行うと、糖分子以外は同じ構造のリガンド複合体を固定化した少なくとも２つのセンサチップを用いて、測定をすることができるため、少なくとも２つのセンサチップで測定された相互作用の大きさの差は、糖分子に起因したものとして観測される。従って、上記測定方法を用いれば、糖分子以外の部分と、他の物質との非特異的な相互作用を低減させ、糖分子と他の物質との特異的な相互作用を観測することができる。

以下、本発明のリンカー化合物およびリガンド複合体の合成について、より詳細に説明する。また、本実施例では、合成した当該リガンド複合体と他のリガンド複合体とを用いて、その特性を比較検討するという実験も行った。それについても併せて説明する。

〔実施例１：リンカー化合物（化合物１５）の合成〕
本発明にかかるリンカー化合物の一つ、すなわち、前記一般式（２）にて、ｎが４であり、Ｘが前記一般式（３）にて表され、ｐ^１，ｐ^２が１であり、ｍ^１，ｍ^２，ｍ^３，ｍ^４が２である構造を有するリンカー化合物（化合物１５）は以下の手順で合成した。図１には、このリンカー化合物（化合物１５）を合成する過程を示す。なお、本実施例１の説明において、各化合物に付記している番号は図１に記載の番号に相当する。

図１に示すように、先ず、原料として、ビス［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチル］エーテル（化合物１）を用いて、ジクロロメタン中でＢＦ_３・Ｅｔ_２Ｏ存在下ジアゾ酢酸エチル（化合物２）を反応させて、エステル体（化合物３）を収率４０％で合成した。次に、化合物３をジクロロメタン中でＤＭＡＰ、ピリジン存在下ｐ−トルエンスルホニルクロリドと反応させ、トシル体（化合物４）を７８％の収率で得た。化合物４にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中アジ化ナトリウムを作用させ、収率９０％でアジド体（化合物５）を得た。

これをメタノール中１Ｎ ＮａＯＨで加水分解し、カルボン酸誘導体（化合物６）を収率９８％で得た。ジクロロメタン中で上記化合物６と化合物７を、ＨＯＢｔとＥＤＣ・ＨＣｌを用いて縮合し、ジエステル誘導体（化合物８）を８０％の収率で得た。この化合物８をメタノール中０．６Ｎ ＮａＯＨで加水分解することにより、ジカルボン酸誘導体（化合物９）を収率９３％で得た。上記化合物９とジアミン誘導体（化合物１０）をＦＤＰＰとＤＩＰＥＡを用いて縮合し、化合物１１を収率４０％で得た。この化合物１１のアジド基を接触水素還元して、収率８０％でアミン体（化合物１２）へと導いた。

その後、チオクト酸（化合物１３）と縮合させ、化合物１４を収率５９％で得た。最後に、この化合物１４にＴＦＡを作用させることによって、Ｂｏｃ基を脱保護し、目的の芳香族アミノ基を４単位有するリンカー化合物（化合物１５）を収率９１％で得た。

以下、上述の合成過程で得られる各化合物の合成方法についてより具体的に示すとともに、合成された各化合物について^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの測定と質量分析の測定を行った結果を示す。また、リガンドである糖鎖のチップ上での相対濃度は全反射ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ−ＦＴ−ＩＲ）を測定して求めた。それぞれ、以下のような手順で行った。

〔^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル、質量分析、ＡＴＲ−ＦＴ−ＩＲの測定、および試薬等〕
^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの測定には、ＪＥＯＬ−ＪＮＭ−Ｌａｍｂｄａ−５００ ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒとＪＥＯＬ ＪＮＭ−ＧＳＸ４００ ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒとＪＥＯＬ ＥＸ−２７０ ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを用いた。化学シフトは、ＣＤＣｌ_３の場合テトラメチルシランを基準物質としてδ値で表した。ＣＤ_３ＯＤおよびＤＭＳＯ−ｄ_６は残存する溶媒のプロトンの化学シフトを基準にδ値で表した。質量分析はＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｉｎｅｒ^ＴＭを用いて測定した。ＡＴＲ−ＦＴ−ＩＲ測定には、Ｓｈｉｍａｄｚｕ，ＩＲＰｒｅｓｔｉｇｅ−２１に１回反射ＡＴＲ付属装置（ＭＩＲａｃｌｅ Ｇｅプリズム）を搭載したものを用いた。ＡＴＲ−ＦＴ−ＩＲ測定のためのセンサチップはＳＰＲ測定の時と同じものを使用した。中圧カラムシリカゲルクロマトグラフィはＳｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ Ｎｏ．９３８５（Ｍｅｒｃｋ）を使用し、薄層シリカゲルクロマトグラフィはＳｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ）を使用した。無水ジクロロメタンは水素化カルシウムを乾燥剤に用いて窒素気流下蒸留したものを使用した。その他の脱水溶媒は、関東化学株式会社製のものを購入して使用した。それ以外の試薬及び溶媒は、基本的に特級のものを使用した。

（１）化合物３の合成
ビス［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチル］エーテル（化合物１）（１４．５７ｍｌ，８０ｍｍｏｌ）とＢＦ_３・Ｅｔ_２Ｏ（２５２ｍｌ，２ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン５０ｍｌに溶解し、０℃でジアゾ酢酸エチル（化合物２）（１．８ｍｌ，１７．３５ｍｍｏｌ）を滴下した後、室温で７０分間攪拌した。反応溶液に飽和塩化アンモニウム水溶液２０ｍｌを加え、ジクロロメタンで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾去して減圧濃縮し、濃縮残渣を中圧分取クロマトグラフィー（６００ｇ、ヘキサン：酢酸エチル＝１：３）で精製して化合物３（２．２６ｇ，収率：４７％）を無色液体として得た。

この化合物３について^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）測定を行ったところ、δ４．２２（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．０，１４．２Ｈｚ，ＣＯ_２ＣＨ _２），４．１４（２Ｈ，ｓ，ＯＣＨ _２ＣＯ），３．７５−３．６２（１４Ｈ，ｍ，ＣＨ _２ＣＨ _２Ｏ×３，ＨＯＣＨ_２ＣＨ _２），３．６１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，ＨＯＣＨ _２），１．８４（１Ｈ，ｂｓ，ＯＨ），１．２８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，ＣＨ_２ＣＨ _３）であった。また、上記化合物３のＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）測定を行ったところ、ｍ／ｚ ３０３．２７［（Ｍ＋Ｎａ）^＋］であった。これによって化合物３の構造を確認することができた。なお、この化合物３の分子質量はＣ_１２Ｈ_２４Ｏ_７：２８０．１５である。

（２）化合物４の合成
上記のエチル体化合物３（２．１５ｇ，７．６６ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰ（４１．７ｍｇ，３３７ｍｍｏｌ）を無水ピリジン８ｍｌに溶解した。この溶液に０℃でｐ−トルエンスルホン酸クロリド（１．７５ｇ，９．１９ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン８ｍｌに溶解した溶液を滴下し、室温で３時間攪拌した。反応溶液にジクロロメタンと氷水を加えてジクロロメタンに抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で１回ずつ洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾去して減圧濃縮し、濃縮残渣を中圧分取クロマトグラフィー（１００ｇ、クロロホルム：アセトン＝４：１）で精製して化合物４（２．５９ｇ，収率：７８％）を黄色液体として得た。

この化合物４について^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）測定を行ったところ、δ７．８０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，ａｒｏｍａｔｉｃ），７．３５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，ａｒｏｍａｔｉｃ），４．２１（２Ｈ，ｑ，ＣＯ_２ＣＨ _２），４．１６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，ＴｓＯＣＨ _２），４．１４（２Ｈ，ｓ，ＯＣＨ _２ＣＯ），３．７６−３．５９（１４Ｈ，ｍ，ＣＨ _２ＣＨ _２Ｏ×３，ＴｓＯＣＨ_２ＣＨ _２），２．４５（３Ｈ，ｓ，ＣＨ _３Ａｒ），１．２８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，ＣＨ_２ＣＨ _３）であった。また、上記化合物４のＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）測定を行ったところ、ｍ／ｚ ４５７．１６［（Ｍ＋Ｎａ）^＋］であった。これによって化合物４の構造を確認することができた。なお、この化合物４の分子質量はＣ_１９Ｈ_３０Ｏ_９Ｓ：４３４．１６である。

（３）化合物５の合成
上記のトシル体化合物４（１．０１ｇ，２．３１ｍｍｏｌ）とアジ化ナトリウム（１．５３ｇ，２．３１ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド５０ｍｌに溶解し、遮光して１２０℃で窒素雰囲気下１０時間攪拌した。反応溶液をクロロホルムで抽出し、水、飽和食塩水で有機層を１回ずつ洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾去して減圧濃縮し、濃縮残渣を中圧分取クロマトグラフィー（１０ｇ、クロロホルム：アセトン＝２：１）で精製して化合物５（６３８ｍｇ，収率：９０％）を黄色液体として得た。

この化合物５について^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）測定を行ったところ、δ４．２２（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，ＣＯ_２ＣＨ _２），４．１５（２Ｈ，ｓ，ＯＣＨ _２ＣＯ_２Ｅｔ），３．７５−３．６３（１２Ｈ，ｍ，ＯＣＨ _２ＣＨ _２Ｏ），３．６９（２Ｈ，ｍ，Ｎ_３ＣＨ_２ＣＨ _２），３．３９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，Ｎ_３ＣＨ _２），１．２９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，ＣＯ_２ＣＨ_２ＣＨ _３）であった。また、上記化合物５のＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）測定を行ったところ、ｍ／ｚ ３２８．１４［（Ｍ＋Ｎａ）^＋］であった。これによって化合物５の構造を確認することができた。なお、この化合物５の分子質量はＣ_１２Ｈ_２３Ｎ_３Ｏ_６：３０５．１６である。

（４）化合物６の合成
上記のアジド体化合物５（６１４ｍｇ，２．０１ｍｍｏｌ）をメタノール２４ｍｌに溶解し、遮光下０℃で１Ｎ ＮａＯＨ ４．３ｍｌを加えた後、室温で２１時間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮し、濃縮残渣にクロロホルムを加えた後、１Ｎ ＨＣｌをｐＨ＝２になるまで加え、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で１回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾去して減圧濃縮し、化合物６（５４９ｍｇ，収率：９０％）を無色液体として得た。

この化合物６について^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）測定を行ったところ、δ６．１９（１Ｈ，ｂｓ，ＣＯ_２ Ｈ），４．１６（２Ｈ，ｓ，ＯＣＨ _２ＣＯ_２Ｈ），３．７５−３．６４（１２Ｈ，ｍ，ＯＣＨ _２ＣＨ _２Ｏ），３．６８（２Ｈ，ｍ，Ｎ_３ＣＨ_２ＣＨ _２），３．４１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，Ｎ_３ＣＨ _２）であった。また、上記化合物６のＥＳＩ−ＭＳ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）測定を行ったところ、ｍ／ｚ ３２８．１４［（Ｍ＋Ｎａ）^＋］であった。これによって化合物６の構造を確認することができた。なお、この化合物６の分子質量はＣ_１０Ｈ_１９Ｎ_３Ｏ_６：２７７．１３である。

（５）化合物７の合成
イミノ二酢酸（１０．０ｇ，７５．１ｍｍｏｌ）とＢＦ_３・ＯＥｔ_２（２２ｍｌ，１７３ｍｍｏｌ）を無水メタノール（５０ｍｌ）に溶解し、アルゴン雰囲気下にて５時間還流した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて中和し、クロロホルムで抽出した。ｐＨが９になるまで水層にトリエチルアミンを加え、さらにクロロホルムで抽出し、乾燥剤として無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮し、化合物７（９．６１ｇ，収率：７９％）を黄色油状物として得た。

この化合物７について^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）測定を行ったところ、δ３．７４（６Ｈ，ｓ，ＯＭｅ），３．４８（４Ｈ，ｓ，ＣＨ_２Ｎ），２．００（１Ｈ，ｓ，ＮＨ）であった。また、上記化合物７のＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）測定を行ったところ、ｍ／ｚ １６２．１［（Ｍ＋Ｈ）^＋］であった。これによって、化合物７の構造を確認することができた。なお、この化合物７の分子質量はＣ_６Ｈ_１１ＮＯ_２：１６１．０７である。

（６）化合物８の合成
上記化合物６（０．３５ｇ，１．２６ｍｍｏｌ）とＥＤＣ・ＨＣｌ（０．２７ｇ，１．３９ｍｍｏｌ）とＨＯＢｔ（０．１９ｇ，１．３９ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン２ｍｌに溶解し、アルゴン雰囲気下、遮光して０℃で８０分間攪拌した後、上記化合物７（１．４２ｇ，６．８３ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン１ｍｌに溶解した溶液を加えて、室温で１７時間攪拌した。反応容液をクロロホルムで抽出し、有機層を１０％クエン酸と、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液とで１回ずつ洗浄した。乾燥剤として無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。濃縮残渣を分取シリカゲルクロマトグラフィ（５０ｇ、クロロホルム：アセトン＝１０：１）で精製して、化合物８（０．４２ｇ，収率：８０％）を白色固体として得た。

この化合物８について^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）測定を行ったところ、δ４．２３，４．１１（４Ｈ，ｓ，ｓ，ＣＯＮＣＨ _２），４．１８（２Ｈ，ｓ，ＯＣＨ _２ＣＯＮ），３．６９，３．６６（４Ｈ，ｓ，ｓ，ＣＯ_２ＣＨ _３），３．６９−３．５６（１２Ｈ，ｍ，ＯＣＨ _２ＣＨ _２Ｏ），３．６１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，Ｎ_３ＣＨ_２ＣＨ _２），３．３２（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，Ｎ_３ＣＨ _２）であった。また、上記化合物８のＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）測定を行ったところ、ｍ／ｚ ４４３．１７［（Ｍ＋Ｎａ）^＋］であった。これによって化合物８の構造を確認することができた。なお、この化合物８の分子質量はＣ_１６Ｈ_２８Ｎ_４Ｏ_９：４２０．１９である。

（７）化合物９の合成
上記化合物８（３９８ｍｇ，９４７μｍｏｌ）をメタノール（５ｍｌ）に溶解し、２ＮのＮａＯＨ（２．１ｍｌ）を加えて、０℃で２．５時間攪拌した後、Ｄｏｗｅｘ ５０ＷＸ−８（Ｈ^＋ｆｏｒｍ）をｐＨ＝２になるまで加えて中和し、Ｄｏｗｅｘ ５０ＷＸ−８を濾別して減圧濃縮を行った。減圧濃縮によって得られた濃縮残渣に水を加えて不溶物を濾別した後、減圧濃縮及び凍結乾燥を行って、化合物９（３４６ｍｇ，収率：９３％）を白色固体として得た。

この化合物９について^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）測定を行ったところ、δ５．６６（２Ｈ，ｂｓ，ＣＯ_２ Ｈｘ２），４．２６（２Ｈ，ｓ，ＯＣＨ _２ＣＯＮ），４．２４，４．１８（４Ｈ，ｓ，ｓ，ＣＯＮＣＨ _２），３．７１−３．６３（１２Ｈ，ｍ，ＯＣＨ _２ＣＨ _２Ｏ），３．６７（２Ｈ，ｍ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，Ｎ_３ＣＨ_２ＣＨ _２），３．４０（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，Ｎ_３ＣＨ _２）であった。また、上記化合物９のＥＳＩ−ＭＳ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）測定を行ったところ、ｍ／ｚ ３９１．１５［（Ｍ−Ｈ）⁻］であった。これによって化合物９の構造を確認することができた。なお、この化合物９の分子質量はＣ_１４Ｈ_２４Ｎ_４Ｏ_９：３９２．１５である。

（８）化合物１０の合成
Ｎ−Ｂｏｃアミノ安息香酸誘導体（３．３３ｇ，１４．０ｍｍｏｌ）と、ＨＯＢｔ（１．９３ｇ，１４．３ｍｍｏｌ）とを無水ジクロロメタン（６０ｍｌ）に懸濁させ、アルゴン雰囲気下、０℃で１５分撹拌し、ＥＤＣ・ＨＣｌ（２．８７ｇ，１５．０ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（３０ｍｌ）に溶解させた溶液を加えて、５０分撹拌した。この溶液にジエチレントリアミン（０．７９ｍｌ，７．００ｍｍｏｌ）を加え、遮光下、室温で終夜撹拌し、白色結晶を得た。この白色結晶を濾取した後、メタノールから再結晶して、化合物１０（３．５３ｇ，収率：９２．９％）を白色結晶として得た。

この化合物１０について^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）測定を行ったところ、δ７．７７−７．７４（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６７Ｈｚ，ａｒｏｍａｔｉｃ），７．５０−７．４８（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５７Ｈｚ，ａｒｏｍａｔｉｃ），３．７０−３．６６（４Ｈ，ｍ，Ｊ＝５．１９Ｈｚ ＣＯＮＨＣＨ _２），３．３４−３．２８（４Ｈ，ｍ，Ｊ＝５．６１Ｈｚ ＣＨ _２ＣＨ_２ＯＮＨ），１．５３（１８Ｈ，ｓ，ＣＨ _３）であった。また、上記化合物１０のＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）測定を行ったところ、ｍ／ｚ ５４２．４［（Ｍ＋Ｈ）^＋］であった。これによって化合物１０の構造を確認することができた。なお、この化合物１０の分子質量はＣ_２８Ｈ_３９Ｎ_５Ｏ_６：５４１．２９である。

（９）化合物１１の合成
上記化合物９（３３３ｍｇ，８４７μｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン（４３５ｍｌ，２．５４ｍｍｏｌ）、とＦＤＰＰ（１．００ｇ，２．６０ｍｍｏｌ）とを無水ジメチルホルムアミド（５ｍｌ）に溶解して遮光してアルゴン雰囲気下０℃で３０分間攪拌した後、上記化合物１０（１．１５ｇ，２．１１ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド（１１ｍｌ）に溶解して加え、室温で２０時間攪拌した。この反応溶液を減圧濃縮して得られた濃縮残渣をクロロホルムで抽出し、水、有機層を１０％クエン酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で１回ずつ洗浄して、乾燥剤として無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。減圧濃縮によって得られた濃縮残渣を分取シリカゲルクロマトグラフィ（８０ｇ，クロロホルム：メタノール＝１０：１）で精製して、化合物１１（１２５ｍｇ，収率：５９％）を白色固体として得た。

この化合物１１について^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）測定を行ったところ、δ８．１８（１Ｈ，ｂｓ，ＮＨＣＯＰｈ），７．８６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，ａｒｏｍａｔｉｃ），７．８０（１Ｈ，ｂｓ，ＰｈＮＨＣＯ），７．７５−７．６８（８Ｈ，ｍ，ＮＨＣＯＰｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ，ＰｈＮＨＣＯ），７．５４（１Ｈ，ｂｓ，ＰｈＮＨＣＯ），７．４８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，ＮＨＣＯＰｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ），７．４２（５Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ，ＮＨＣＯＰｈ），７．３４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，ａｒｏｍａｔｉｃ），７．２８（１Ｈ，ｂｓ，ＰｈＮＨＣＯ），３．８４（４Ｈ，ｂｓ，ＣＯＮＣＨ _２），３．６２−３．４８（２０Ｈ，ｍ，ＯＣＨ _２ＣＨ _２Ｏ，ＮＣＨ_２ＣＨ _２ＮＨ），３．５６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，Ｎ_３ＣＨ_２ＣＨ _２），３．４３（２Ｈ，ｂｓ，ＯＣＨ _２ＣＯＮ），３．３５−３．３０（４Ｈ，ｍ，ＮＣＨ _２ＣＨ_２ＮＨ），３．２６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，Ｎ_３ＣＨ _２），３．１３，２．９８（４Ｈ，ｂｓ，ｂｓ，ＮＣＨ _２ＣＨ_２ＮＨ），１．５２，１．５０，１．４９（３６Ｈ，ｓ，ｓ，ｓ，ｔ−ｂｕｔｙｌ）であった。また、上記化合物１１のＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）測定を行ったところ、ｍ／ｚ １４６１．７２［（Ｍ＋Ｎａ）^＋］であった。これによって化合物１１の構造を確認することができた。なお、この化合物１１の分子質量はＣ_７０Ｈ_９８Ｎ_１４Ｏ_１９：１４３８．７１である。

（１０）化合物１２の合成
上記化合物１１（１６５ｍｇ，１１４μｍｏｌ）をメタノール（１２ｍｌ）に溶解し、５％Ｐｄ／Ｃ（５５ｍｇ）を加え、水素雰囲気下、室温で５時間攪拌した後、上記Ｐｄ／Ｃを濾去して減圧濃縮し、得られた濃縮残渣を分取シリカゲルクロマトグラフィ（１０ｇ，クロロホルム：メタノール＝７：１）で精製して、化合物１２（１２８ｍｇ，収率：７９％）を白色固体として得た。

この化合物１２について、^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）測定を行ったところ、δ７．７８−７．６８（８Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ），７．４８（８Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ），４．２１，４．１０（４Ｈ，ｂｓ，ｂｓ，ＣＯＮＣＨ _２），３．８５（２Ｈ，ｂｓ，ＯＣＨ _２ＣＯＮ），３．６２−３．４４（２６Ｈ，ｍ，ＯＣＨ _２ＣＨ _２Ｏ，ＮＣＨ_２ＣＨ _２ＮＨ，ＮＣＨ _２ＣＨ_２ＮＨ），３．５０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，Ｈ_２ＮＣＨ_２ＣＨ _２），２．７６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，Ｈ_２ＮＣＨ _２ＣＨ_２），１．５０（３６Ｈ，ｓ，ｔ−ｂｕｔｙｌ）であった。また、上記化合物１２のＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）測定を行ったところ、ｍ／ｚ １４１３．７４［（Ｍ＋Ｈ）^＋］であった。なお、この化合物１２の分子質量はＣ_７０Ｈ_１００Ｎ_１２Ｏ_１９：１４１２．７２である。

この化合物１２は、前記一般式（１１）にてｎが４であり、ｐ^１，ｐ^２が１であり、ｍ^１，ｍ^２，ｍ^３，ｍ^４が２である構造を有するアミン化合物である。

（１１）化合物１４の合成
上記化合物１３（チオクト酸）（３．４ｍｇ，１６．６ｉｍｏｌ）とＨＯＢｔ（１．６ｍｇ，１６．６μｍｏｌ）ＥＤＣ・ＨＣｌ（３．２ｍｇ，１．６６μｍｏｌ）とを無水ジメチルホルムアミド（２ｍｌ）に溶解し、アルゴン雰囲気下、０℃で遮光して攪拌した。次いで、上記化合物１２（２３．５ｍｇ，１６．６μｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド（２ｍｌ）に溶解して加え、室温で２２時間攪拌した。この反応溶液を減圧濃縮して得られた濃縮残渣をジクロロメタンで抽出し、有機層を１０％クエン酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で１回ずつ洗浄した。乾燥剤として無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。濃縮残渣を分取シリカゲルクロマトグラフィ（７ｇ、クロロホルム：メタノール＝１０：１）で精製して、化合物１４（１５．７ｍｇ，収率：５９％）を白色固体として得た。

この化合物１４について^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）測定を行ったところ、δ８．２０，８．００（４Ｈ，ｂｓ，ｂｓ，ＮＨＣＯＰｈ），７．８６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，ａｒｏｍａｔｉｃ），７．７７−７．７２（７Ｈ，ｍ，ＣＯＰｈＮＨ，ａｒｏｍａｔｉｃ），７．５３（１Ｈ，ｂｓ，ＮＨＣＯＰｈ），７．５０−７．３６（１０Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，ＣＯＰｈＮＨ），７．２７（２Ｈ，ｂｓ，ＣＯＰｈＮＨ，ＣＯＮＨＣＨ_２），３．８９（４Ｈ，ｂｓ，ＣＯＮＣＨ _２ＣＯ），３．６４−３．３７（２６Ｈ，ｍ，ＮＣＨ_２ＣＨ _２ＮＨ，ＮＣＨ _２ＣＨ_２ＮＨ，ＯＣＨ _２ＣＨ _２Ｏ，ＣＯＮＨＣＨ _２，ＣＯＮＨＣＨ_２ＣＨ _２），３．５３（１Ｈ，ｍ，ＳＳＣＨ），３．４８（２Ｈ，ｍ，ＮＣＨ _２ＣＨ_２ＮＨ），３．３２（４Ｈ，ｍ，ＯＣＨ _２ＣＯＮ，ＮＣＨ _２ＣＨ_２ＮＨ），３．１８，２．８５（４Ｈ，ｂｓ，ｂｓ，ＮＣＨ _２ＣＨ_２ＮＨ），３．１７−３．０４（２Ｈ，ｍ，ＣＨ _２ＳＳＣＨ），２．４４−２．３６（１Ｈ，ｍ，ＣＨ _２ＣＨ_２ＳＳ），２．１６（２Ｈ，ｍ，ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ _２ＣＯＮＨ），１．８９−１．８１（１Ｈ，ｍ，ＣＨ _２ＣＨ_２ＳＳ），１．６９−１．５６（４Ｈ，ｍ，ＣＨ_２ＣＨ _２ＣＨ_２ＣＯＮＨ，ＣＨ _２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＮＨ），１．５１，１．５０（３６Ｈ，ｓ，ｓ，ｔ−ｂｕｔｙｌ），１．４２−１．３４（２Ｈ，ｍ，ＣＨ _２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＮＨ）であった。また、上記化合物１４のＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）測定を行ったところ、ｍ／ｚ１６０１．８１［（Ｍ＋Ｈ）^＋］であった。これによって化合物１４の構造を確認することができた。なお、この化合物１４の分子質量はＣ_７８Ｈ_１１２Ｎ_１２Ｏ_２０Ｓ_２：１６００．７６である。

（１２）リンカー化合物（化合物１５）の合成
上記化合物１４（６０．３ｍｇ，３１．２μｍｏｌ）をジクロロメタン（１ｍｌ）に溶解し、ＴＦＡ（３ｍｌ）を加えて遮光下０℃で１時間攪拌した後、減圧濃縮を行い、得られた残渣をメタノールに溶解してＤｏｗｅｘ Ｍａｒａｔｈｏｎ Ａ（ＯＨ⁻ｆｏｒｍ）を充填したカラム（１．０ｃｍ Φ×３．０ｃｍ）に注入してイオン交換を行った。溶出液を減圧濃縮し、化合物１５（４１．２ｍｇ，収率：９１％）を白色固体として得た。

この化合物１５について、^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_３）測定を行ったところ、δ８．１９，８．０５（４Ｈ，ｍ，ｍ，ＮＨＣＯＰｈ），７．８２（１Ｈ，ｂｔ，ＣＯＮＨＣＨ_２），７．５３（８Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ），６．５１（８Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．４，１．５Ｈｚ，ａｒｏｍａｔｉｃ），５．６１−５．５５（８Ｈ，ｍ，ＮＨ _２），４．２４，４．１１（４Ｈ，ｓ，ｓ，ＣＯＮＣＨ _２ＣＯ），３．９３（２Ｈ，ｂｓ，ＯＣＨ _２ＣＯＮ），３．６０−３．３７（３１Ｈ，ｍ，ＮＣＨ_２ＣＨ _２ＮＨ，ＮＣＨ _２ＣＨ_２ＮＨ，ＯＣＨ _２ＣＨ _２Ｏ，ＣＯＮＨＣＨ _２，ＣＯＮＨＣＨ_２ＣＨ _２，ＳＳＣＨ），３．１９−３．０６（４Ｈ，ｍ，ＣＯＮＨＣＨ _２ＣＨ_２，ＣＨ _２ＳＳＣＨ），２．４２−２．３２（１Ｈ，ｍ，ＣＨ _２ＣＨ_２ＳＳ），２．０４（２Ｈ，ｍ，ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ _２ＣＯＮＨ），１．８７−１．７８（１Ｈ，ｍ，ＣＨ _２ＣＨ_２ＳＳ），１．６４−１．４５（４Ｈ，ｍ，ＣＨ_２ＣＨ _２ＣＨ_２ＣＯＮＨ，ＣＨ _２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＮＨ），１．３４−１．２８（２Ｈ，ｍ，ＣＨ _２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＮＨ）であった。また、上記化合物１５のＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）測定を行ったところ、ｍ／ｚ ６２３．２７［（Ｍ＋２Ｎａ）^２＋］であった。なお、この化合物１５の分子質量はＣ_５８Ｈ_８０Ｎ_１２Ｏ_１２Ｓ_２：１２００．５５である。

この化合物１５は、前記一般式（２）にてｎが４であり、Ｘが前記一般式（３）にて表され、ｐ^１，ｐ^２が１であり、ｍ^１，ｍ^２，ｍ^３，ｍ^４が２である構造を有するリンカー化合物である。

〔実施例２：リガンド複合体（化合物１７）の合成〕
実施例１で得られたリンカー化合物１５を用いて、前記一般式（５）にて、ｎが４であり、ｐ^１，ｐ^２が１であり、ｍ^１，ｍ^２，ｍ^３，ｍ^４が２であり、Ｒ’が水素（Ｈ）であり、Ｒが前記一般式（１２）で表されるオリゴ糖由来の構造を有するリガンド複合体を以下の手順で合成した。図２には、この合成の化学反応式を示す。

図２に示すように、実施例１にて得られたリンカー化合物１５と、前記一般式（１２）にて表される糖分子である化合物１６（７当量）とを用いて還元アミノ化反応を行った。これによって、本発明のリガンド複合体の一例である化合物１７を収率２２％で得た。

具体的には、上記リンカー化合物１５（２．０ｍｇ，１．６７μｍｏｌ）と化合物１６（１０ｍｇ，１１．７ｍｍｏｌ）とを、水１００ｍｌとジメチルアセトアミド４００ｍｌと酢酸１０ｍｌとの混合溶媒に溶解し、遮光下、封管中３７℃で２５時間加熱した。ＮａＢＨ_３ＣＮ（３．５１ｍｇ，５０．２ｍｍｏｌ）を酢酸１５ｍｌに溶解して反応溶液に加え、３７℃で６日間加熱した後、減圧濃縮して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０（１．６ｃｍ Φ×８０ｃｍ、ＰＢＳに０．３ＭのＮａＣｌを加えた溶液）を用いて精製した。精製によって得られた目的画分を減圧濃縮し、濃縮残渣をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（１．６ｃｍ Φ×４０ｃｍ、水）を用いて脱塩した。脱塩により得られた目的画分を減圧濃縮し、水に溶かして凍結乾燥を行い、化合物１７（１．７ｍｇ，収率：２２％）を白色粉体として得た。

この化合物１７について、実施例１に記載の方法で^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ）測定を行ったところ、δ７．６５−７．５８（８Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ），６．７８−６．６７（８Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ），５．３７（４Ｈ，ｂｓ，Ｈ−１”），５．１３（４Ｈ，ｂｓ，Ｊ＝２．５Ｈｚ），４．５２（４Ｈ，ｂｓ，Ｈ−５’），４．２９（１０Ｈ，ｍ，Ｈ−６ａ”，Ｈ−３’，ＣＯＮＣＨ _２ＣＯ），４．１９（１０Ｈ，ｍ，Ｈ−６ｂ”，Ｈ−２’，ＣＯＮＣＨ _２ＣＯ），４．０５（３Ｈ，ｍ，Ｈ−４’），３．９９−３．９２（１４Ｈ，ｍ，Ｈ−２，Ｈ−６ａ，Ｈ−５”，ＯＣＨ _２ＣＯＮ），３．８７（８Ｈ，ｍ，Ｈ−５，ＮＣＨ_２ＣＨ _２ＮＨ），３．８３（８Ｈ，ｍ，Ｈ−３，ＮＣＨ_２ＣＨ _２ＮＨ），３．７７−３．７０（８Ｈ，ｍ，Ｈ−４，ＮＣＨ_２ＣＨ _２ＮＨ），３．７１（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，Ｈ−３”），３．６４−３．５０（２５Ｈ，ｍ，Ｈ−６ｂ，ＮＣＨ _２ＣＨ_２ＮＨ，ＯＣＨ _２ＣＨ _２Ｏ，ＣＯＮＨＣＨ _２，ＣＯＮＨＣＨ_２ＣＨ _２，ＳＳＣＨ），３．５４（３Ｈ，ｓ，ＯＣＨ _３），３．４５−３．１９（１４Ｈ，ｍ，Ｈ−１ａ，Ｈ−１ｂ，ＮＣＨ _２ＣＨ_２ＮＨ，ＣＨ _２ＳＳ），３．３４（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，Ｈ−４”），３．２４（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．４，１０．５Ｈｚ，Ｈ−２”），２．３５−２．２８（１Ｈ，ｍ，ＣＨ _２ＣＨ_２ＳＳ），２．２７（２Ｈ，ｂｔ，ＣＨ_２ＣＨ _２ＣＯＮＨＣＨ_２），１．８９−１．８４（１Ｈ，ｍ，ＣＨ _２ＣＨ_２ＳＳ），１．５６−１．４６（２Ｈ，ｍ，ＣＨ _２ＣＨ_２ＣＯＮＨ），１．３５−１．１４（２Ｈ，ｍ，ＣＨ _２ＣＨ_２（ＣＨ_２）_２ＣＯＮＨ）であった。また、上記化合物１７のＥＳＩ−ＭＳ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）測定を行ったところ、ｍ／ｚ １４４９．９３［（Ｍ−１０Ｎａ＋７Ｈ）^３−］であった。これによって化合物１７の構造を確認することができた。なお、この化合物１７の分子質量はＣ_１３４Ｈ_１９６Ｎ_１６Ｎａ_１６Ｏ_１０８Ｓ_１４：４５７２．４８である。

この化合物１７が、前記一般式（５）にて、ｎが４であり、ｐ^１，ｐ^２が１であり、ｍ^１，ｍ^２，ｍ^３，ｍ^４が２であり、Ｒ’が水素（Ｈ）であり、Ｒが一般式（６−３）で表されるオリゴ糖由来化合物である構造を有するリガンド複合体である。

〔実施例３：リガンドである糖鎖とタンパク質との相互作用の検証〕
本実施例では、実施例２において得られた、前記一般式（５）にて、ｎが４であり、ｐ^１，ｐ^２が１であり、ｍ^１，ｍ^２，ｍ^３，ｍ^４が２であり、Ｒ’が水素（Ｈ）であり、Ｒが一般式（６−３）で表されるオリゴ糖由来化合物である構造を有するリガンド複合体（以下、このリガンド複合体については、「Ｔｅｔｒａ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ」と記載する）を用いて、タンパク質との分子間相互作用について検証した。

本実施例においては、比較のために本願発明者らが以前に見出した他の２種類のリガンド複合体についても同様の実験を行い、その相互作用について比較検討した。上記他の２種類のリガンド複合体とは、具体的には、上記特許文献１に記載のリガンド複合体であって、以下の一般式（１３）で表されるリガンド複合体である。以下、このリガンド複合体については、「Ｍｏｎｏ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ」と記載する。

また、他のリガンド複合体のもう一つは、特開２００４−１５７１０８に記載のリガンド複合体であって、以下の一般式（１４）で表されるリガンド複合体である。以下、このリガンド複合体については、「Ｔｒｉ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ」と記載する。なお、上記特開２００４−１５７１０８は、本願の優先日の時点で未公開である。

〔実施例３−１：特異的相互作用の確認〕
先ず、実施例３−１として、前記一般式（８）にて表される二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）を固定化したチップと、ヘパリン結合性タンパク質との特異的相互作用を確認するため、阻害実験を行った。すなわち、ヘパリン結合性タンパク質とＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ構造との結合を阻害するインヒビターを共存させて、ヘパリン結合性タンパク質のチップへの結合が阻害されるかどうかについて検討した。

本実験では、インヒビターとしてヘパリン（豚小腸由来、Ｍｗ＝１７６００）を、ヘパリン結合性タンパク質としてｂＦＧＦを用いた。ｂＦＧＦは、ＦＧＦ−２とも呼ばれ、血管内皮細胞や線維芽細胞に働いて、血管新生作用、肉芽形成促進作用を発揮することにより創傷治癒を促進することが知られている。生体内では、細胞表面上にあるヘパリン類似物質であるヘパラン硫酸と相互作用し、生物活性を発現させている。ｂＦＧＦとの結合に必要な最小結合単位は、以下の一般式（１５）にて表される５糖であるということが報告されている（参考文献：Ｍ．Ｍａｃｃａｒａｎａ，Ｂ．Ｃａｓｕ ＆ Ｕ．Ｌｉｎｄａｈｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８巻、８８５７頁、１９９３年）。

上記の構造には、グルコサミンの６位が硫酸化されている構造が含まれていない。しかし、ヘパラン硫酸中のＩｄｏＡ２Ｓ−ＧｌｃＮＳ構造とｂＦＧＦとの会合において、不特定多数の６位硫酸化は必要ないもの、活性部位の形成には必要であることが確認されている。そのため、ｂＦＧＦを、ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ構造との相互作用を観測するためのタンパク質として選択した。

次に、上述のＭｏｎｏ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ、Ｔｒｉ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ、Ｔｅｔｒａ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃをそれぞれ固定化したチップを用いて、ヘパリン共存下ｂＦＧＦとの結合阻害実験を行った。すなわち、２００ｎＭのｂＦＧＦ溶液にヘパリンを、３，１０，１００，３００，１０００ｎＭと濃度を変えて混合し、チップへ注入した。

図３には、Ｍｏｎｏ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃを固定化したチップへのｂＦＧＦの結合挙動を示す。この図から、Ｍｏｎｏ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃを固定化したチップへのｂＦＧＦの結合は、ヘパリンの濃度依存的に低下することが確認された。すなわち、Ｍｏｎｏ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃを固定化したチップへのｂＦＧＦの結合は、ヘパリンによって阻害されることが確認された。

上記実験によって得られた３種類のチップそれぞれのデータから、各チップにおけるｂＦＧＦの結合の阻害率を算出した。その結果を図４に示す。なお、上記阻害率は、異なった濃度のヘパリン共存下での最大角度変化量を、ヘパリンを共存させない場合の最大角度変化量で割った値の百分率で示したものである。

図４に示すグラフから、ｂＦＧＦのチップへの結合阻害率が５０％の所をＩＣ_５０として定義した。その結果、Ｍｏｎｏ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃを固定化したチップではＩＣ_５０＝２．５ｎＭ、Ｔｒｉ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃを固定化したチップではＩＣ_５０＝９４ｎＭ、Ｔｅｔｒａ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃを固定化したチップではＩＣ_５０＝７１ｎＭとなり、Ｍｏｎｏ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃを固定化したチップのＩＣ_５０値は、他の２種類のチップの値と比較して、１オーダー低く、ヘパリンによる阻害効果を強く受けていることが確認された。何れのチップにおいても阻害率がヘパリンの濃度依存的に変化していることから、これらのチップはヘパリン結合性タンパク質であるｂＦＧＦを特異的に認識していると結論できる。

〔実施例３−２：チップ表面の糖鎖の相対密度の検討〕
先ず、Ｔｒｉ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−ＧｌｃあるいはＴｅｔｒａ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃと、糖鎖を有していない分子が結合したリンカー化合物（非糖鎖−リンカー結合化合物、以下、Ｍｏｎｏ−Ｇｌｃと呼ぶ）とを溶液中で混合してチップへの固定化を行い、その混合比（仕込み比）によるチップ上のリガンドである硫酸化二糖の密度変化について、ＡＴＲ−ＦＴ−ＩＲ法を用いて検討した。溶液中のＴｒｉ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−ＧｌｃあるいはＴｅｔｒａ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃの割合は、０，２５，５０，７５，１００％と変化させた。その結果を図５（ａ）、（ｂ）に示す。図５（ａ）が、溶液中の混合比を変えたＴｒｉ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃの全反射スペクトルであり、図５（ｂ）が、溶液中の混合比を変えたＴｅｔｒａ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃの全反射スペクトルである。

波数（ｗａｖｅｎｕｍｂｅｒ）１２００−１３０３ｃｍ^−１の範囲に硫酸基由来のＳ＝０伸縮振動が観測されたため、この領域の吸光度曲線を用いて多変量解析法により硫酸基の定量を行い、溶液中のリガンド複合体の混合比に対するチップ上の硫酸基の相対強度をプロットした。その結果を図６（ａ）、（ｂ）に示す。図６（ａ）が、溶液中のＴｒｉ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃの混合比に対するチップ上の硫酸基の相対強度を示すグラフであり、図６（ｂ）が、溶液中のＴｅｔｒａ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃの混合比に対するチップ上の硫酸基の相対強度を示すグラフである。図６（ａ）、（ｂ）に示す一次曲線の相関係数は、それぞれ０．９９９３、０．９６１０であることから、リガンドである硫酸化二糖のチップへの固定化率（チップ表面の糖鎖の密度）は何れも溶液中のリガンド複合体の存在比に比例することが示された。

〔実施例３−３：糖鎖の相対密度が、ｈ−ｖＷＦとの相互作用に与える影響の検討〕
続いて、チップ表面のリガンドである硫酸化二糖の相対密度が、タンパク質との相互作用に与える影響について検討した。ここでは、ヒト血漿由来ｖＷＦ（以下、ｈ−ｖＷＦと呼ぶ）との相互作用について解析を行った。

上記３種の各リガンド複合体（Ｍｏｎｏ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ、Ｔｒｉ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ、Ｔｅｔｒａ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ）とＭｏｎｏ−Ｇｌｃとの混合比を、それぞれ１００／０、および、２０／８０に変えて、６種のチップを作成し、ｈ−ｖＷＦとの相互作用をＳＰＲ法で観測した。ここで、ＳＰＲ法による測定の手順について説明する。

測定には、ＳＰＲ６７０（日本レーザー電子株式会社製）を用いた。また、センサチップには、１３×２０×０．７ｍｍのガラス基盤に接着層として２ｎｍのクロムを蒸着し、さらにその上に５０ｎｍの金薄膜を蒸着したもの（日本レーザー電子株式会社製）を用い、ＵＶオゾンクリーナー（日本レーザー電子株式会社製ＮＬ−ＵＶ２５３）に入れて紫外線を３０分間照射し、オゾンでチップ表面を洗浄した。

次に、センサチップを専用のＰＴＦＥセル（日本レーザー電子株式会社製）に装着した後、上記６種の各チップをメタノール／水＝１／１の混合溶液（但し、Ｍｏｎｏ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ／Ｍｏｎｏ−Ｇｌｃ混合の場合はメタノール溶液）に溶解し（０．１ｍＭ）、この溶液を５０μｌ取ってＰＴＦＥセルに入れ、パラフィルムで密封した。このチップを装着したＰＴＦＥセルを、室温でＢｉｏ Ｄａｎｃｅｒ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）上で終夜緩やかに振とうした。

このチップをメタノールで６回洗浄し、水で１回洗浄した後、もう一度メタノール、水の順で１回ずつ洗浄した。風乾後、ＳＰＲ６７０のセンサーチップカートリッジに取り付けた。ランニングバッファーでチップ表面を十分平衡化した後、レーザー光を金膜に照射し、その時観測される表面プラズモン共鳴角度変化を観察した。ランニングバッファーは、ｐＨ７．４の等張リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を用いた。また、ＳＰＲ測定はすべて２５℃の温度で行った。ｂＦＧＦは、ＳＴＲＡＴＨＭＡＮＮ ＢＩＯＴＥＣ ＡＧ社製（Ｒｅｃｏｍｂｉａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＦＧＦ−ｂａｓｉｃ，ＭＷ；１７０００，Ｌｏｔ Ｎｏ．；４７１１２０）のものを用い、ｈ−ｖＷＦは、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ，Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ，ＭＷ；２７００００（Ｍｏｎｏｍｅｒ Ｕｎｉｔ換算），Ｌｏｔ Ｎｏ．；Ｂ４１６３２）を使用した。

このＳＰＲ測定を行う際に、ｈ−ｖＷＦの濃度を１０，２０，４０，８０，１６０ｎＭと変えながら、各チップ上に注入すると、結合相互作用が観測され、ｈ−ｖＷＦがチップ上に固定化されている様子が観察された。この際、リガンドである硫酸化二糖を変性させずにｈ−ｖＷＦをチップから完全に解離させる解離剤が見つからなかったため、解離定数（Ｋ_Ｄ）の算出はチップ上のｈ−ｖＷＦの結合量から求めた。ｈ−ｖＷＦの結合量は、リガンド複合体が固定化された状態をベースとし、濃度を変えて注入したｈ−ｖＷＦのセンサーグラムのカーブがほぼ一定になったところの差を用いた。

図７（ａ）〜（ｃ）には、上記３種の各リガンド複合体（Ｍｏｎｏ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ、Ｔｒｉ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ、Ｔｅｔｒａ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ）とＭｏｎｏ−Ｇｌｃとの混合比が１００／０の場合の結合相互作用を示す。（ａ）はＭｏｎｏ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃの場合、（ｂ）はＴｒｉ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃの場合、（ｃ）はＴｅｔｒａ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃの場合である。また、図８（ａ）〜（ｃ）には、上記３種の各リガンド複合体（Ｍｏｎｏ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ、Ｔｒｉ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ、Ｔｅｔｒａ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ）とＭｏｎｏ−Ｇｌｃとの混合比が２０／８０の場合の結合相互作用を示す。（ａ）はＭｏｎｏ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃの場合、（ｂ）はＴｒｉ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃの場合、（ｃ）はＴｅｔｒａ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃの場合である。

この結果から得られた結合量を、ｈ−ｖＷＦの濃度ごとにプロットしたものを図９（ａ）〜（ｃ）に示す。（ａ）はＭｏｎｏ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃの場合、（ｂ）はＴｒｉ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃの場合、（ｃ）はＴｅｔｒａ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃの場合である。この図９には、各グラフのカーブから解離定数（Ｋ_Ｄ）を算出した結果も示している。

図９（ａ）に示すように、Ｍｏｎｏ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ／Ｍｏｎｏ−Ｇｌｃ＝１００／０、および、Ｍｏｎｏ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ／Ｍｏｎｏ−Ｇｌｃ＝２０／８０としてリガンドである硫酸化二糖を固定化したチップを用いた場合には、解離定数はそれぞれＫ_Ｄ＝３５ｎＭおよび４１ｎＭとなった。図９（ｂ）に示すように、Ｔｒｉ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ／Ｍｏｎｏ−Ｇｌｃ＝１００／０、および、Ｔｒｉ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ／Ｍｏｎｏ−Ｇｌｃ＝２０／８０としてリガンドである硫酸化二糖を固定化したチップを用いた場合には、解離定数はそれぞれＫ_Ｄ＝２７ｎＭおよび２４ｎＭとなった。さらに、Ｔｅｔｒａ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃｔｏ／Ｍｏｎｏ−Ｇｌｃ＝１００／０、および、Ｔｅｔｒａ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃｔｏ／Ｍｏｎｏ−Ｇｌｃ＝２０／８０としてリガンドである硫酸化二糖を固定化したチップを用いた場合には、解離定数はそれぞれＫ_Ｄ＝３２ｎＭおよび３５ｎＭとなった。

これらの結果から、アナライトとしてｈ−ｖＷＦを用いた場合、リガンドである糖鎖のチップ上の存在比を変化させても親和性に与える影響は殆ど無いことがわかった。また、糖鎖間距離が異なるリガンド複合体を固定化したチップを用いても、ｈ−ｖＷＦとの相互作用において糖鎖間距離の差が解離定数の値に影響を与えなかった。これはｈ−ｖＷＦが多量体構造をとっているために複数のヘパリン結合性ドメインが存在し、その影響により解離速度が著しく遅くなり、糖鎖間距離の差が解離定数に反映されなかったものと考えられた。

〔実施例３−４：糖鎖の相対密度が、タンパク質との相互作用に与える影響の検討〕
そこで、１つのヘパリン結合性ドメインを有するＡｌループ部分のみを有する大腸菌由来のリコンビナントヒトｖＷＦ部分タンパク質（以下、ｒｈｖＷＦ−Ａ１と呼ぶ）を用いれば、チップ上にクラスター化した糖鎖とタンパク質間の相互作用において、糖鎖間距離の差が糖鎖−糖鎖結合性タンパク質間の相互作用に与える影響を検討できると考えて、以下のような実験を行った。ｒｈｖＷＦ−Ａ１は文献（Ｍ．Ａ．Ｃｒｕｚ，Ｒ．Ｉ．Ｈａｎｄｉｎ ＆ Ｒ．Ｊ．Ｗｉｓｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８巻，２１２３８頁，１９９３年）に従って調製した。

ここでは、リガンド複合体として上述の上記３種の各リガンド複合体（Ｍｏｎｏ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ、Ｔｒｉ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ、Ｔｅｔｒａ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ）、および、Ｍｏｎｏ−Ｇｌｃを用いて、上記３種の各リガンド複合体／Ｍｏｎｏ−Ｇｌｃの存在比を、それぞれ１００／０，５０／５０と変えて作成したチップを用いた。ｒｈｖＷＦ−Ａ１濃度を変化させてチップとの結合相互作用を測定した結果を図１０〜図１２に示す。なお、図１０（ａ）は、Ｍｏｎｏ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ／Ｍｏｎｏ−Ｇｌｃ＝１００／０でチップを作成した場合であり、図１０（ｂ）は、Ｍｏｎｏ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ／Ｍｏｎｏ−Ｇｌｃ＝５０／５０の場合である。また、図１１（ａ）は、Ｔｒｉ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ／Ｍｏｎｏ−Ｇｌｃ＝１００／０でチップを作成した場合であり、図１１（ｂ）は、Ｔｒｉ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ／Ｍｏｎｏ−Ｇｌｃ＝５０／５０の場合である。また、図１２（ａ）は、Ｔｅｔｒａ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ／Ｍｏｎｏ−Ｇｌｃ＝１００／０でチップを作成した場合であり、図１２（ｂ）は、Ｔｅｔｒａ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃ／Ｍｏｎｏ−Ｇｌｃ＝５０／５０の場合である。

これらの結果から算出した解離定数、結合定数、結合速度定数、解離速度定数を表１にまとめて示す。なお、表１において、解離定数：Ｋ_Ｄ（ｋ_ｄ／ｋ_ａ）、結合定数：Ｋ_Ａ（ｋ_ａ／ｋ_ｄ）、結合速度定数：ｋ_ａ、解離速度定数：ｋ_ｄである。

表１に示すように、Ｍｏｎｏ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃを固定化したチップの場合は、Ｔｒｉ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−ＧｌｃやＴｅｔｒａ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃを固定化したチップと比べて、解離定数の値は大きくなった（Ｋ_Ｄ＝２．６０μＭ）。また、チップ上の糖鎖の固定化密度を相対的に小さくすると解離定数の値はさらに大きくなった（Ｋ_Ｄ＝３．７９μＭ）。一方、Ｔｒｉ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃを固定化したチップでは、チップ上の固定化密度を相対的に小さくした場合、若干の解離定数の値の増加が見られた（Ｋ_Ｄ＝１．２０μＭ→１．５０μＭ）。また、Ｔｅｔｒａ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃを固定化したチップでは、チップ上の固定化密度を変化させても、解離定数はほとんど変わらなかった（Ｋ_Ｄ＝０．９９μＭ→１．００μＭ）。

また、表１に示すように、Ｍｏｎｏ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃを固定化したチップの場合は、他の２つのリガンド複合体と固定したチップと比べて、１オーダー高い解離速度定数（ｋ_ｄ）を有することが確認された。このことから、Ｔｒｉ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−ＧｌｃおよびＴｅｔｒａ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃは、分子内で硫酸化オリゴ糖鎖間距離が制御された糖鎖クラスター構造を有しているため、チップ上の糖鎖の固定化密度を相対的に低下させてもその影響を受けにくいもとの考えられる。

つまり、ｒｈｖＷＦ−Ａ１との相互作用においては、Ｍｏｎｏ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃを固定化したチップでは、チップ上の相対的な糖鎖固定化密度を低下させると、結合力が低下してしまうことが確認された。これに対し、Ｔｒｉ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−ＧｌｃやＴｅｔｒａ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃを固定化したチップでは、チップ上の相対的な糖鎖固定化密度を低下させても、その結合力はあまり変化しないことがわかった。

以上の結果から、硫酸化オリゴ糖鎖−糖鎖結合タンパク質間の相互作用において、結合力を増大させるには、Ｍｏｎｏ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃを固定化したチップのように、同じリガンド複合体構造を有する硫酸化オリゴ糖鎖をチップ上に２次元的にクラスター化させるだけでは不十分であり、Ｔｒｉ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−ＧｌｃやＴｅｔｒａ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｇｌｃのように、分子レベルで糖鎖間距離が制御されたクラスター構造が必要であることが裏付けられた。

〔実施例４：リンカー化合物（化合物２６）およびリガンド複合体（化合物２７）の合成〕
本発明にかかるリンカー化合物の一つ、すなわち、前記一般式（１）にて、ａが１、ｂが４、ｄが１、ｅが４であり、Ｘが前記一般式（４）にて表され、ｑ^１，ｑ^２，ｑ^３が２であり、ｒ^１，ｒ^２，ｒ^３，ｔ^１，ｔ^２，ｔ^３，ｕ^１，ｕ^２，ｕ^３が０である構造を有するリンカー化合物（化合物２６）、および前記一般式（７）にて表され、ａが１、ｂが４、ｄが１、ｅが４であり、ｑ^１，ｑ^２，ｑ^３が２であり、ｒ^１，ｒ^２，ｒ^３，ｔ^１，ｔ^２，ｔ^３，ｕ^１，ｕ^２，ｕ^３が０であり、Ｒが水素（Ｈ）であり、Ｒが一般式（６−２）である構造を有するリガンド複合体（化合物２７）は以下の手順で合成した。図１３には、このリンカー化合物（化合物２６）を合成する過程を示す。また、図１４にはこのリンカー化合物（化合物２６）からリガンド複合体（化合物２７）を合成する過程を示す。なお、本実施例４の説明において、各化合物に付記している番号は図１３および図１４に記載の番号に相当する。

〔測定方法、試薬等〕
^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの測定には、ＪＯＥＬ−Ｄｅｌｔａ６００ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを用いた。化学シフトは、ＣＤＣｌ_３の場合はテトラメチルシラン（０．００ｐｐｍ）を基準物質にしてδ値で表した。Ｄ_２Ｏの場合はＤＨＯ（４．６５ｐｐｍ）を基準物質にしてδ値で表した。質量分析はＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｍａｒｉｎｅｒ^ＴＭ Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを用いて測定した。中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィは、Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ６０（Ｍｅｒｃｋ、０．０４０−０．０６３ｍｍ）を用いて行った。薄層クロマトグラフィーはＰｒｅｃｏａｔｅｄ Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ６０ Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ，０．５ｍｍ）を使用した。全ての試薬、脱水溶媒は関東化学株式会社製のものを購入して使用した。

（１）Ｎ_３−ＴＥＧ−Ｔｒｉｖａｌｅｎｔ−（Ｏ^ｔＢＵ）_３（化合物２０）の合成（図１３参照）
Ｏ_２Ｎ−Ｔｒｉｖａｌｅｎｔ−（Ｏ^ｔＢｕ）_３（化合物１８）（７５７ｍｇ，１．７０ｍｍｏｌ）と塩化ニッケル６水物（ＮｉＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ）（８０．８ｍｇ，０．３４０ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍｌ）に溶解し、水素化ホウ素ナトリウム（３２２ｍｇ，８．５０ｍｍｏｌ）を５回に分けて当量分ずつ加え、室温で３０分間攪拌した。メタノールを濃縮除去した後、水とクロロホルムとを加えた。セライト濾過後、濾液をクロロホルムで３回抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮した。得られた濃縮残渣（化合物１９）とＮ_３−ＴＥＧ−ＣＯＯＨ（化合物６）（４４１ｍｇ，１．７０ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）に溶解し、室温、アルゴン雰囲気下でＤＩＥＡ（５９２μｌ，３．４０ｍｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（４６３ｍｇ，３．４０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（６５２ｍｇ，３．４０ｍｍｏｌ）を順に加え、１６時間攪拌した反応液に水を加えた後、水相を酢酸エチルで３回抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。得られた濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（５０ｇ、クロロホルム：アセトン＝５０：１）で精製し、Ｎ_３−ＴＥＧ−Ｔｒｉｖａｌｅｎｔ−（Ｏ^ｔＢｕ）_３（化合物２０）を無色の油状物として得た。収量は８３９ｍｇ（７３％）であった。

この化合物２０について^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）測定を行ったところ、δ３．９０（ｓ，２Ｈ，−ＯＣＨ _２ ＣＯＮＨ−），３．７０−３．６７（ｍ，１４Ｈ，−ＯＣＨ _２ ＣＨ _２ Ｏ−×３，Ｎ_３ＣＨ_２ ＣＨ _２ Ｏ−），３．３９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，Ｎ_３ ＣＨ _２ ＣＨ_２Ｏ−），２．２１−２．１８（ｍ，６Ｈ，−ＣＨ_２ ＣＨ _２ ＣＯ−×３），２．００−１．９６（ｍ，６Ｈ，−ＣＨ _２ ＣＨ_２ＣＯ−×３），１．４３（ｓ，２７Ｈ，−ＣＨ_３×９）であった。ＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）測定を行ったところ、ｍ／ｚ ６９７．４５［（Ｍ＋Ｎａ）^＋］であった。これらによって化合物２０の構造を確認することができた。なお、この化合物２０の分子質量はＣ_３２Ｈ_５８Ｎ_４Ｏ_１１：６７６．４１である。

（２）ＴＥＧ−Ｔｒｉｖａｌｅｎｔ−（Ｏ^ｔＢＵｕ）_３（化合物２２）の合成（図１３参照）
上記化合物２０（Ｎ_３−ＴＥＧ−Ｔｒｉｖａｌｅｎｔ−（Ｏ^ｔＢＵ）_３）（８３７ｍｇ，１．２４ｍｍｏｌ）をメタノール（１０ｍｌ）に溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ（２００ｍｇ）を加え、水素雰囲気下、室温で１．５時間攪拌した。上記Ｐｄ／Ｃを濾去して濾液を減圧濃縮した。得られた濃縮残渣（化合物２１）とチオクト酸（３８５ｍｇ、１．８７ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）に溶解し、アルゴン雰囲気下、室温でＤＩＥＡ（３２５μｌ，１．８７ｍｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（２５４ｍｇ，１．８７ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（３５８ｍｇ，１．８７ｍｍｏｌ）を順に加え、１３時間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた後、水相を酢酸エチルで３回抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。得られた濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（５０ｇ、クロロホルム：メタノール＝３０：１）で精製し、ＴＥＧ−Ｔｒｉｖａｌｅｎｔ−（Ｏ^ｔＢｕ）_３（化合物２２）を無色の油状物として得た。収量は１．０５ｇ（９９％）であった。

この化合物２２について^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）測定を行ったところ、δ３．９１（ｓ，２Ｈ，−ＯＣＨ _２ ＣＯＮＨ−），３．７０−３．５４（ｍ，１３Ｈ，−ＯＣＨ _２ ＣＨ _２ Ｏ−×３，ＣＨ_２ ＣＨ（ＣＨ_２−）（Ｓ−）），３．５５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，−ＣＯＮＨＣＨ_２ ＣＨ _２ Ｏ−），３．４５（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，−ＣＯＮＨＣＨ _２ ＣＨ_２Ｏ−），３．２０−３．１６（ｍ，１Ｈ，−ＳＣＨ _２ （１Ｈ）−），３．１４−３．０９（ｍ，１Ｈ，−ＳＣＨ _２ （１Ｈ）−），２．４９−２．４３（ｍ，１Ｈ，−ＳＣＨ_２ ＣＨ _２ （１Ｈ）−），２．２２−２．１７（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ_２ ＣＨ _２ ＣＯ−×３，−ＮＨＣＯＣＨ _２ ＣＨ_２−），２．００−１．９６（ｍ，６Ｈ，−ＣＨ _２ ＣＨ_２ＣＯ−×３），１．９４−１．８８（ｍ，１Ｈ，−ＳＣＨ_２ ＣＨ _２ （１Ｈ）−），１．７４−１．６２（ｍ ４Ｈ，−ＣＯＣＨ_２ ＣＨ _２ ＣＨ_２ ＣＨ _２ −），１．５２−１．４１（ｍ，２Ｈ，−ＣＯＣＨ_２ＣＨ_２ ＣＨ _２ ＣＨ_２−），１．４４（ｓ，２７Ｈ，−ＣＨ_３×９）であった。これによって化合物２２の構造を確認することができた。

（３）ＴＥＧ−Ｔｒｉｖａｌｅｎｔ−（ＮＨＢｏｃ）_３（化合物２５）の合成（図１３参照）
上記化合物２２（ＴＥＧ−Ｔｒｉｖａｌｅｎｔ−（Ｏ^ｔＢｕ）_３）（５００ｍｇ，０．５８７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン／水（２．２ｍｌ，１０／１）に溶解し、０℃でＴＦＡ（２ｍｌ）を加え、同温で１時間攪拌した。反応溶液を濃縮後、トルエンで共沸した。得られた濃縮残渣（化合物２３）とＮ−Ｂｏｃ−フェニレンジアミン（化合物２４）（６１２ｍｇ，２．９４ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）に溶解し、アルゴン雰囲気下、室温でＤＩＥＡ（３８０μｌ，２．９４ｍｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（４００ｍｇ，２．９４ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（５６３ｍｇ，２．９４ｍｍｏｌ）を順に加え、１９時間攪拌した。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた後、水相をＡｃＯＥｔで３回抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。得られた濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（５０ｇ、クロロホルム：アセトン＝３：１）で精製し、ＴＥＧ−Ｔｒｉｖａｌｅｎｔ−（ＮＨＢｏｃ）_３（化合物２５）を淡黄色の油状物として得た。収量は２３０ｍｇ（３１％）であった。

この化合物２５について^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）測定を行ったところ、δ８．７２（ｂｓ，３Ｈ，−ＮＨＣＯ−），７．５６（ｂｓ，３Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ），７．２２−７．１０（ｍ，６Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ），６．９１（ｂｓ，３Ｈ，−ＮＨＣＯ−），３．８５（ｓ，２Ｈ，−ＯＣＨ _２ ＣＯＮＨ−），３．６７−３．５７（ｍ，９Ｈ，ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｃｈａｉｎ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ_２−）（Ｓ−）），３．５５−３．４７（ｍ，６Ｈ，ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｃｈａｉｎ，−ＣＯＮＨＣＨ_２ ＣＨ _２ Ｏ−），３．３８（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，−ＣＯＮＨＣＨ _２ ＣＨ_２Ｏ−），３．１４（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，６．９，１２．４Ｈｚ，−ＳＣＨ _２ （１Ｈ）−），３．０８（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，６．９，１２．４Ｈｚ，−ＳＣＨ _２ （１Ｈ）−），２．４３−２．３５（ｍ，７Ｈ，−ＣＨ_２ ＣＨ _２ ＣＯ−×３，−ＳＣＨ_２ ＣＨ _２ （１Ｈ）−），２．０８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，−ＮＨＣＯＣＨ _２ ＣＨ_２−），２．１７−２．１２（ｍ，６Ｈ，−ＣＨ _２ ＣＨ_２ＣＯ−×３），１．８８−１．８３（ｍ，１Ｈ，−ＳＣＨ_２ ＣＨ _２ （１Ｈ）−），１．６５−１．５０（ｍ ４Ｈ，−ＣＯＣＨ_２ ＣＨ _２ ＣＨ_２ ＣＨ _２−），１．５０（ｓ，２７Ｈ，−ＣＨ_３ｘ９），１．４６−１．２９（ｍ，２Ｈ，−ＣＯＣＨ_２ＣＨ_２ ＣＨ _２ ＣＨ_２−）であった。これらによって化合物２５の構造を確認することができた。

（４）リガンド複合体ＴＥＧ−Ｔｒｉｖａｌｅｎｔ−（Ｍａｌ）_３（化合物２７）の合成（図１３および図１４参照）
上記化合物２５（ＴＥＧ−Ｔｒｉｖａｌｅｎｔ−（Ｏ^ｔＢｕ）_３）（５００ｍｇ，０．５８７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン／水（４．４ｍｌ，１０／１）に溶解し、０℃でＴＦＡ（２ｍｌ）を加え、同温で１．５時間攪拌した。反応溶液を濃縮後、トルエンで共佛した。得られた残渣（化合物２６）は精製することなく、次の還元アミノ化反応に用いた。収量は２５２ｍｇであった。

以下、図１４にしたがって説明する。得られた残渣（化合物２６）（１２．１ｍｇ，８．８８μｍｏｌ）とマルトース（９．６０ｍｇ，２６．７μｍｏｌ）をヂメチルアセトアミド／水（１：１，６００μｌ）に溶解し、３７℃で７時間放置した。反応液に酢酸（３０μｌ）とシアノ水素化ホウ素ナトリウム（５．５８ｍｇ，８８．８μｍｏｌ）を加え、３７℃でさらに７０時間放置した。反応液を凍結乾燥した後、得られた残渣は、分取高速液体クロマトグラフィー（ＯＤＳカラム、メタノール／水＝５０／５０）によって精製した。リガンド複合体ＴＥＧ−Ｔｒｉｖａｌｅｎｔ−（Ｍａｌ）_３（化合物２７）は白色の固体として得られた。

この化合物２７について^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ）測定を行ったところ、δ７．０２（ｄｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．６，８．２Ｈｚ，ａｒｏｍａｔｉｃ），６．７２（ｓ，３Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ），６．６０（ｄｄ，３Ｈ，Ｊ＝１．４，７．６Ｈｚ，ａｒｏｍａｔｉｃ），６．４４（ｄｄ，３Ｈ，Ｊ＝１．４，８．２Ｈｚ，ａｒｏｍａｔｉｃ），４．９１（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，Ｈ−１’×３），３．８２−３．７３（ｍ，８Ｈ，Ｈ−２×３，Ｈ−５×３，−ＯＣＨ _２ ＣＯＮＨ−），３．７３−３．６７（ｍ，９Ｈ，Ｈ−３×３，Ｈ−５’×３，Ｈ−６ａ’×３），３．６５（ｄｄ，３Ｈ，Ｊ＝２．１，１２．４Ｈｚ，Ｈ−６ｂ’×３），３．５９（ｄｄ，３Ｈ，Ｊ＝４．８，１２．４Ｈｚ，Ｈ−６ａ×３），３．５５（ｄｄ，３Ｈ，Ｊ＝５．５，６．２Ｈｚ，Ｈ−４×３）３．５５（ｄｄ，３Ｈ，Ｊ＝９．６，９．６Ｈｚ，Ｈ−３’×３），３．５０−３．３６（ｍ，１２Ｈ，−ＯＣＨ _２ ＣＨ _２ Ｏ−×３），３．４５−３．４０（ｍ，３Ｈ，Ｈ−６ｂ×３），３．４２−３．３８（ｍ，１Ｈ，ＣＨ_２ ＣＨ（ＣＨ_２−）（Ｓ−）），３．３８（ｄｄ，３Ｈ，Ｊ＝３．４，１０．３Ｈｚ，Ｈ−２’×３），３．４０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，−ＣＯＮＨＣＨ_２ ＣＨ _２ Ｏ−），３．２５（ｄｄ，３Ｈ，Ｊ＝９．６，９．６Ｈｚ，Ｈ−４’×３），３．１５−３．１０（ｍ，５Ｈ，−ＣＯＮＨＣＨ _２ ＣＨ_２Ｏ−，Ｈ−１ａ×３），３．０２（ｄｄ，Ｊ＝８．２，１３．７Ｈｚ，Ｈ−１ｂ×３），３．０１−２．９７（ｍ，１Ｈ，−ＳＣＨ _２ （１Ｈ）−），２．９６−２．９１（ｍ，１Ｈ，−ＳＣＨ _２ （１Ｈ）−），２．２９−２．２５（ｍ，６Ｈ，ＣＨ_２ ＣＨ _２ ＣＯ−×３），２．２６−２．１９（ｍ，１Ｈ，−ＳＣＨ_２ ＣＨ _２ （１Ｈ）−），２．０５−１．９８（ｍ，６Ｈ，−ＣＨ _２ ＣＨ_２ＣＯ−×３），１．９９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，−ＮＨＣＯＣＨ _２ ＣＨ_２−），１．７４−１．６９（ｍ，１Ｈ，−ＳＣＨ_２ ＣＨ _２ （１Ｈ）−），１．５０−１．３０（ｍ ４Ｈ，−ＣＯＣＨ_２ ＣＨ _２ ＣＨ_２ ＣＨ _２ −），１．１６−１．１０（ｍ，２Ｈ，−ＣＯＣＨ_２ＣＨ_２ ＣＨ _２ ＣＨ_２−）であった。
ＥＳＩ−ＭＳ測定を行ったところ、ｍ／ｚ ９８１．４１［（Ｍ＋２Ｎａ）^２＋］であった。これらによって化合物２７の構造を確認することができた。なお、この化合物２７の分子質量はＣ_８２Ｈ_１３２Ｎ_８Ｏ_３９Ｓ_２：１９１６．８０である。

〔実施例５：リンカー化合物（化合物３２）およびリガンド複合体（化合物３４）の合成〕
本発明にかかるリンカー化合物の一つ、すなわち、前記一般式（１）にて、ａが４、ｂが０、ｄが０、ｅが０であり、Ｘが前記一般式（４）にて表され、ｑ^１，ｑ^２，ｑ^３が２であり、ｒ^１，ｒ^２，ｒ^３が１であり、ｔ^１，ｔ^２，ｔ^３が４であり、ｕ^１，ｕ^２，ｕ^３が１である構造を有するリンカー化合物（化合物３２）、および前記一般式（７）にて表され、ａが４、ｂが０、ｄが０、ｅが０であり、ｑ^１，ｑ^２，ｑ^３が２であり、ｒ^１，ｒ^２，ｒ^３が１であり、ｔ^１，ｔ^２，ｔ^３が４であり、ｕ^１，ｕ^２，ｕ^３が１であり、Ｒ’が水素（Ｈ）であり、Ｒが一般式（６−２）である構造を有するリガンド複合体（化合物３４）は以下の手順で合成した。図１５には、このリンカー化合物（化合物３２）を合成する過程を示す。図１６には上記リンカー化合物（化合物３２）を合成する過程で用いられる化合物３０の合成過程を示す。また、図１７にはこのリンカー化合物（化合物３２）からリガンド複合体（化合物３４）を合成する過程を示す。なお、本実施例５の説明において、各化合物に付記している番号は図１５、図１６および図１７に記載の番号に相当する。

〔測定方法、試薬等〕
^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの測定には、ＪＯＥＬ−Ｄｅｌｔａ６００ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを用いた。化学シフトは、ＣＤＣｌ_３の場合はテトラメチルシラン（０．００ｐｐｍ）を基準物質にしてδ値で表した。Ｄ_２Ｏの場合はＤＨＯ（４．６５ｐｐｍ）を基準物質にしてδ値で表した。質量分析はＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｍａｒｉｎｅｒ^ＴＭ Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを用いて測定した。中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィは、Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ６０（Ｍｅｒｃｋ、０．０４０−０．０６３ｍｍ）を用いて行った。薄層クロマトグラフィーはＰｒｅｃｏａｔｅｄ Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ６０ Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ、０．５ｍｍ）を使用した。全ての試薬、脱水溶媒は関東化学株式会社製のものを購入して使用した。

（１）Ｔｒｉｖａｌｅｎｔ−（Ｏ^ｔＢｕ）_３（化合物２８）の合成（図１５参照）
Ｏ_２Ｎ−Ｔｒｉｖａｌｅｎｔ−（Ｏ^ｔＢｕ）_３（化合物１８）（７５７ｍｇ，１．７０ｍｍｏｌ）とＮｉＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ（８０．８ｍｇ，０．３４０ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍｌ）に溶解し、０℃で水素化ホウ素ナトリウム（３２２ｍｇ，８．５０ｍｍｏｌ）を５回に分けて当量分ずつ加え、その後反応液を室温で３０分間攪拌した。メタノールを濃縮して除去し、反応溶液に水とクロロホルムを加えた。セライト濾過後、水相をクロロホルムで３回抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮した。得られた濃縮残渣（化合物１９）とチオクト酸（３５１ｍｇ，１．７０ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）に溶解し、アルゴン雰囲気下、室温でＤＩＥＡ（５９２μｌ，３．４０ｍｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（４６３ｍｇ，３．４０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ−ＨＣｌ（６５２ｍｇ，３．４０ｍｍｏｌ）を順に加え、１６時間攪拌した。反応溶液に水を加えた後、水相を酢酸エチルで３回抽出した。有機相を飽和食塩水及び飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った得られた濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（５０ｇ、ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）で精製し、Ｔｒｉｖａｌｅｎｔ−（Ｏ^ｔＢｕ）_３（化合物２８）を淡黄色の油状物として得た。収量は７５０ｍｇ（７３％）であった。

この化合物２８について^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）測定を行ったところ、δ５．９１（ｓ，１Ｈ，−ＣＯＮＨ−），３．５７（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．２，６．２，１２．４Ｈｚ，ＣＨ_２ ＣＨ（ＣＨ_２−）（Ｓ−）），３．１８（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，５．５，１２．４Ｈｚ，−ＳＣＨ _２ （１Ｈ）−），３．１１（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，７．６，１２．４Ｈｚ，−ＳＣＨ _２ （１Ｈ）−），２．４６（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．２，６．２，１２．４Ｈｚ，−ＳＣＨ_２ ＣＨ _２ （１Ｈ）−），２．２２（ｔ，８Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，−ＣＨ_２ ＣＨ _２ ＣＯ−×３），２．１１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．９，７．６Ｈｚ，−ＣＯＣＨ _２ ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−），１．９７（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，−ＣＨ _２ ＣＨ_２ＣＯ−×３），１．９１（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，６．９，１２．４Ｈｚ−ＳＣＨ_２ ＣＨ _２ （１Ｈ）−），１．７４−１．５７（ｍ ４Ｈ，−ＣＯＣＨ_２ ＣＨ _２ ＣＨ_２ ＣＨ _２ −），１．５１−１．３８（ｍ，２Ｈ，−ＣＯＣＨ_２ＣＨ_２ ＣＨ _２ ＣＨ_２−），１．４３（ｓ，２７Ｈ，−ＣＨ_３×９）であった。また^１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）測定を行ったところ、δ１７２．９，１７２．１，８０．７，５７．３，５６．３，４０．２，３８．５，３７．２，３４．６，３０．０，２９．８，２８．９，２８．１，２５．３であった。これらによって化合物２８の構造を確認することができた。

（２）Ｎ_３−ＴＥＧ−ＮＨＢｏｃ（化合物３３）の合成（図１６参照）
Ｎ_３−ＴＥＧ−ＣＯ_２Ｅｔ（化合物５）（５００ｍｇ，１．６４ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（６ｍｌ）に溶解し、０℃で水酸化ナトリウム水溶液（１ｍｌ，１５０ｍｇ／ｍｌ）を反応液に加え、同温で３時間攪拌した。１，４−ジオキサンを濃縮除去した後、５％硫酸水素カリウム水溶液とクロロホルムを加えた。水相をクロロホルムで３回抽出し、有機相を無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。得られた残渣（化合物６）は精製することなく、次のカップリング反応に用いられた。収量は４３５ｍｇ（９６％）であった。得られた濃縮残渣とＮ−Ｂｏｃ−フェニレンジアミン（化合物２４）（３２７ｍｇ，１．５７ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミドに溶解し、アルゴン雰囲気下、室温でＤＩＥＡ（４１０μｌ，２．３５ｍｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（３２０ｍｇ，２．３５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（４５１ｍｇ，２．３５ｍｍｏｌ）を順に加え、１４時間攪拌した。反応溶液に水を加えた後、水相を酢酸エチルで３回抽出した。有機相を飽和食塩水及び飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。得られた濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（５０ｇ、トルエン：酢酸エチル＝１：１）で精製し、Ｎ_３−ＴＥＧ−ＮＨＢｏｃ（化合物３３）を淡黄色の油状物として得た。収量は５９７ｍｇ（８１％）であった。

この化合物３３について^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）測定を行ったところ、δ８．８１（ｂｓ，１Ｈ，−ＮＨＣＯ−），７．６１（ｓ，１Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ），７．３５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，ａｒｏｍａｔｉｃ），７．２６−７．２０（ｍ，２Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ），６．７１（ｂｓ，１Ｈ，−ＮＨＣＯ−），４．１０（ｓ，２Ｈ，−ＯＣＨ _２ ＣＯＮＨ−），３．７８−３．７０（ｍ，８Ｈ，ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ ｃｈａｉｎ），３．６７−３．６２（ｍ，６Ｈ，ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｃｈａｉｎ，−ＣＯＮＨＣＨ_２ ＣＨ _２ Ｏ−），３．３５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，−ＣＯＮＨＣＨ _２ ＣＨ_２Ｏ−）であった。また、^１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）測定を行ったところ、δ１６８．３，１５２．６，１３９．０，１３８．０，１２９．５，１１４．５，１１４．３，１０９．８，８０．５，７１．２，７０．６，７０．６，７０．６，７０．５，７０．４，７０．２，７０．０，５０．６，２８．３であった。これらによって化合物３３の構造を確認することができた。

（３）Ｈ_２Ｎ−ＴＥＧ−ＮＨＢｏｃ（化合物３０）の合成（図１６参照）
上記化合物３３（Ｎ_３−ＴＥＧ−ＮＨＢｏｃ）（２００ｍｇ，０．４２５ｍｍｏｌ）をメタノール（４ｍｌ）に溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ（２００ｍｇ）を加え、水素雰囲気下、室温で１．５時間攪拌した。上記Ｐｄ／Ｃを濾去した後、減圧濃縮した。得られた残渣（化合物３０）は精製することなく、次の反応に用いた。収量は１７４ｍｇ（９３％）であった。

（４）Ｔｒｉｖａｌｅｎｔ−（ＴＥＧ−ＮＨＢｏｃ）_３（化合物３１）の合成（図１５参照）
上記化合物２８（Ｔｒｉｖａｌｅｎｔ−（Ｏ^ｔＢｕ）_３）（６４．２ｍｇ，０．１０６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン／水（２．２ｍｌ，１０／１）に溶解し、０℃でＴＦＡ（２ｍｌ）を加え、同温で１時間攪拌した。反応液を濃縮後、トルエンで共佛した。得られた濃縮残渣（化合物２９）とＨ_２Ｎ−ＴＥＧ−ＮＨＢｏｃ（化合物３０）（１７４ｍｇ，０．４２５ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）に溶解し、アルゴン雰囲気下、室温でＤＩＥＡ（９２．６μｌ，０．５３２ｍｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（７２．３ｍｇ，０．５３２ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１０２ｍｇ，０．５３２ｍｍｏｌ）を順に加え、１４時間攪拌した。反応溶液に水を加えた後、水相を酢酸エチルで３回抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。得られた濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（５０ｇ、クロロホルム：メタノール＝３０：１）で精製し、Ｔｒｉｖａｌｅｎｔ−（ＴＥＧ−ＮＨＢｏｃ）_３（化合物３１）を淡黄色の油状物として得た。収量は６４．７ｍｇ（３６％）であった。

この化合物３１について^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）測定を行ったところ、δ８．８８（ｂｓ，３Ｈ，−ＮＨＣＯ−×３），７．６７（ｂｓ，３Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ），７．４２（ｂｓ，３Ｈ，−ＮＨＣＯ−×３），７．３１（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，ａｒｏｍａｔｉｃ），７．２７（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，ａｒｏｍａｔｉｃ），７．２２（ｄｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．７，８．２Ｈｚ，ａｒｏｍａｔｉｃ），６．６３（ｂｔ，３Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，−ＮＨＣＯ−×３），４．１１（ｓ，６Ｈ，−ＯＣＨ _２ ＣＯＮＨ−×３），３．７８−３．５８（ｍ，３６Ｈ，ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｃｈａｉｎ），３．５７−３．４９（ｍ，１Ｈ，ＣＨ_２ ＣＨ（ＣＨ_２−）（Ｓ−）），３．５０（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，−ＣＯＮＨＣＨ_２ ＣＨ _２ Ｏ−×３），３．３６（ｑ，６Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，−ＣＯＮＨＣＨ _２ ＣＨ_２Ｏ−×３），３．１５（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，６．９，１１．０Ｈｚ，−ＳＣＨ _２ （１Ｈ）−），３．０９（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，６．９，１１．０Ｈｚ，−ＳＣＨ _２ （１Ｈ）−），２．４２（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，６．９，１２．４Ｈｚ，−ＳＣＨ_２ ＣＨ _２ （１Ｈ）−），２．１２−２．０６（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ_２ ＣＨ _２ ＣＯ−×３，−ＮＨＣＯＣＨ _２ ＣＨ_２ＣＨ_２−），１．９５−１．８８（ｍ，６Ｈ，−ＣＨ _２ ＣＨ_２ＣＯ−×３），１．８７（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，６．９，１２．４Ｈｚ，−ＳＣＨ_２ ＣＨ _２ （１Ｈ）−），１．７０−１．５０（ｍ ４Ｈ，−ＣＯＣＨ_２ ＣＨ _２ ＣＨ_２ ＣＨ _２ −），１．５０（ｓ，２７Ｈ，−ＣＨ_３×９），１．４８−１．３３（ｍ，２Ｈ，−ＣＯＣＨ_２ＣＨ_２ ＣＨ _２ ＣＨ_２−）であった。また、^１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）測定を行ったところ、δ１７３．３，１７２．８．１６８．４，１５２．８，１３９．３，１３７．８，１２９．３，１１４．５，１１４．４，１１０．１，８０．２，７１．１，７０．５，７０．４，７０．４，７０．３，７０．１，７０．１，６９．７，５７．３，５６．４，４０．１，３９．２，３８．３，３７．０，３４．５，３１．１，３０．５，２８．８，２８．３，２５．４であった。また、ＥＳＩ−ＭＳ測定を行ったところ、ｍ／ｚ ８７５．４１［（Ｍ＋２Ｎａ）^２＋］であった。これらによって化合物３１の構造を確認することができた。なお、この化合物３１の分子質量はＣ_８１Ｈ_１２８Ｎ_１０Ｏ_２５Ｓ_２：１７０４．８５である。

（５）リガンド複合体Ｔｒｉｖａｌｅｎｔ−（ＴＥＧ−Ｍａｌ）_３（化合物３４）の合成（図１６および図１７参照）
上記化合物３１（Ｔｒｉｖａｌｅｎｔ−（ＴＥＧ−ＮＨＢｏｃ）_３）（６４．７ｍｇ，３７．９μｍｏｌ）をジクロロメタン／水（２．２ｍｌ，１０／１）に溶解し、０℃でＴＦＡ（２ｍｌ）を加え、同温で２．５時間攪拌した。反応液を濃縮後、トルエンで共沸した。得られた残渣（化合物３２）は精製することなく、次の還元アミノ化反応に用いた。収量は７０ｍｇであった。

以下、図１７にしたがって説明する。得られた濃縮残渣（化合物３２）（６．９５ｍｇ、３．７７μｍｏｌ含有）とマルトース（４．０７ｍｇ，１１．３μｍｏｌ）をジメチルアセトアミド／水（１：１，４００μｌ）に溶解し、３７℃で１３時間放置した。その後、酢酸（２０μｌ）とシアノ水素化ホウ素ナトリウム（２．２４ｍｇ，３５．６μｍｏｌ）を反応液に加え、３７℃で５９時間放置した。反応液を凍結乾燥した後、得られた残渣を分取高速液体クロマトグラフィ（ＯＤＳカラム、メタノール／水＝５０／５０））によって精製し、Ｔｒｉｖａｌｅｎｔ−（ＴＥＧ−Ｍａｌ）_３（化合物３４）を白色固体として得た。収量は４．４６ｍｇ（５０％）であった。

化合物３４について^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ）測定を行ったところ、δ７．０５（ｄｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．６，８．２Ｈｚ，ａｒｏｍａｔｉｃ），６．７７（ｓ，３Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ），６．６３（ｄｄ，３Ｈ，Ｊ＝１．４，７．６Ｈｚ，ａｒｏｍａｔｉｃ），６．４７（ｄｄ，３Ｈ，Ｊ＝１．４，８．２Ｈｚ，ａｒｏｍａｔｉｃ），４．９２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，Ｈ−１’×３），４．０１（ｓ，６Ｈ，−ＯＣＨ _２ ＣＯＮＨ−×３），３．８１（ｄｄｄ，３Ｈ，Ｊ＝２．１，４．８，７．６Ｈｚ，Ｈ−２×３），３．７１（ｄｄｄ，３Ｈ，Ｊ＝４．１，７．６Ｈｚ，Ｈ−５×３），３．７４−３．６８（ｍ，９Ｈ，Ｈ−３×３，Ｈ−５’×３，Ｈ−６ａ’×３），３．６５（ｄｄ，３Ｈ，Ｊ＝２．１，１２．４Ｈｚ，Ｈ−６ｂ’×３），３．６４−３．６０（ｍ，３Ｈ，Ｈ−６ａ×３），３．６４−３．４２（ｍ，３６Ｈ，−ＯＣＨ _２ ＣＨ _２ Ｏ−×９），３．５６−３．５２（ｍ，６Ｈ，Ｈ−４×３，Ｈ−３’×３），３．４７−３．４３（ｍ，３Ｈ，Ｈ−６ｂ×３），３．４２−３．３９（ｍ，１Ｈ，ＣＨ_２ ＣＨ（ＣＨ_２−）（Ｓ−）），３．３８（ｄｄ，３Ｈ，Ｊ＝３．４，９．６Ｈｚ，Ｈ−２’×３），３．３７（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，−ＣＯＮＨＣＨ_２ ＣＨ _２ Ｏ−×３），３．２６（ｄｄ，３Ｈ，Ｊ＝９．６，９．６Ｈｚ，Ｈ−４’×３），３．１５（ｄｄ，３Ｈ，Ｊ＝４．８，１３．７Ｈｚ，Ｈ−１ａ×３），３．１４（ｔ，６Ｈ，−ＣＯＮＨＣＨ _２ ＣＨ_２Ｏ−×３），３．０６（ｄｄ，Ｊ＝７．６，１３．７Ｈｚ，Ｈ−１ｂ×３），３．０１（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．２，６．２，１１．０Ｈｚ，−ＳＣＨ _２ （１Ｈ）−），２．９５（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，６．９，１１．０Ｈｚ，−ＳＣＨ _２ （１Ｈ）−），２．２４（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．２，６．２，１２．４Ｈｚ，−ＳＣＨ_２ ＣＨ _２ （１Ｈ）−），２．００（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，−ＮＨＣＯＣＨ _２ ＣＨ_２−），１．９６−１．９２（ｍ，６Ｈ，ＣＨ_２ ＣＨ _２ ＣＯ−×３），１．７７−１．６９（ｍ，７Ｈ，−ＣＨ _２ ＣＨ_２ＣＯ−×３，−ＳＣＨ_２ ＣＨ _２ （１Ｈ）−），１．５２−１．３２（ｍ ４Ｈ，−ＣＯＣＨ_２ ＣＨ _２ ＣＨ_２ ＣＨ _２ −），１．２０−１．１４（ｍ，２Ｈ，−ＣＯＣＨ_２ＣＨ_２ ＣＨ _２ ＣＨ_２−）であった。またＥＳＩ−ＭＳ測定を行ったところ、ｍ／ｚ １２１４．５７［（Ｍ＋２Ｎａ）^２＋］であった。これらによって化合物３４の構造を確認することができた。なお、この化合物３４の分子質量はＣ_１０２Ｈ_１７０Ｎ_１０Ｏ_４９Ｓ_２：２２８３．０６である。

なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。

本発明のリンカー化合物は、以上のように、３単位以上の糖分子を導入可能な部位として、芳香族アミノ基末端を有している。また、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のセンサチップやアフィニティクロマトグラフィの担体等のタンパク質分析用の支持体に結合可能な部位として、Ｓ−Ｓ結合を有している。さらに、非特異的な疎水性相互作用を極力抑えることができ、かつ、金属結合に供されるジスルフィド基までの長さを容易に調整することができるように、ジスルフィド基と芳香族アミノ基との間にオリゴエチレンオキシドを有している。

それゆえ、上記リンカー化合物を用いることによって、上記支持体表面上に、３単位以上の糖分子を再現性よく２次元的に配列させることができるという効果を奏する。また、上記リンカー化合物は、タンパク質との非特異的な相互作用の影響はほぼ無視することができるので、糖分子とタンパク質との相互作用を観測する際に、糖分子の生物活性を再現性よく評価することが可能になる。さらに、効率よく金属−硫黄結合を形成することができる。

また、本発明のリガンド複合体は、上記リンカー化合物に糖分子を導入してなるものである。

それゆえ、上記リガンド複合体をタンパク質分析用の支持体表面に導入することにより、２次元的に複数の糖分子を再現性よく配列することができるので、糖分子の生物活性を再現性よく評価することが可能になるという効果を奏する。さらに、効率よく金属−硫黄結合を形成することができるという効果を奏する。

本発明によれば、センサチップ表面上の糖鎖間距離を制御し、オリゴ糖を再現性よく２次元的に配列し得るリンカー化合物、及び、該リンカー化合物に糖分子が導入されてなるリガンド複合体を得ることができる。このリンカー化合物およびリガンド複合体は、オリゴ糖鎖チップの実用化と一般化のために非常に有用である。

オリゴ糖鎖を固定化したチップが糖鎖やタンパク質の機能解析のツールとして発展すれば、オリゴ糖鎖が関与する生命現象の解明に貢献するだけでなく、医薬品開発における重要な技術となることが期待される。それゆえ、本発明の有用性は高いと考えられる。

Claims (12)

1. 糖分子を支持体の表面に配列させるために用いられるリンカー化合物であって、
   一般式（１）
   

   

   （式中、ａ，ｂ，ｄ，ｅは、それぞれ独立して、０以上６以下の整数）にて表される構造を備え、
   上記Ｘは、一般式（３）
   

   

   （式中、ｍ ^１ ，ｍ ^２ ，ｍ ^３ ，ｍ ^４ ，ｐ ^１ ，ｐ ^２ は、それぞれ独立して、１以上６以下の整数）にて表される構造、あるいは一般式（４）
   

   

   （式中、ｑ ^１ ，ｑ ^２ ，ｑ ^３ ，ｒ ^１ ，ｒ ^２ ，ｒ ^３ ，ｔ ^１ ，ｔ ^２ ，ｔ ^３ ，ｕ ^１ ，ｕ ^２ ，ｕ ^３ は、それぞれ独立して、０以上６以下の整数）にて表される構造を備えており、ｂが０の場合は、Ｘの内部にオリゴエチレンオキシドを有していることを特徴とするリンカー化合物。
2. 一般式（２）
   

   

   （式中、ｎは１以上６以下の整数）にて表される構造を備えていることを特徴とする請求項１に記載のリンカー化合物。
3. 請求項１または２に記載のリンカー化合物の芳香族アミノ基に、糖分子を導入してなることを特徴とするリガンド複合体。
4. 糖分子を支持体の表面に配列させるために用いられるリガンド複合体であって、
   一般式（５）
   

   

   （式中、ｍ^１，ｍ^２，ｍ^３，ｍ^４，ｎ，ｐ^１，ｐ^２は、それぞれ独立して、１以上６以下の整数。Ｒ’は水素（Ｈ）またはＲ。）にて表される構造を備え、
   上記Ｒが式式（６−１）ないし式（６−６）
   

   

   から選択されるオリゴ糖由来化合物であることを特徴とするリガンド複合体。
5. 糖分子を支持体の表面に配列させるために用いられるリガンド複合体であって、
   一般式（７）
   

   

   （式中、ａ，ｂ，ｄ，ｅ，ｑ^１，ｑ^２，ｑ^３，ｒ^１，ｒ^２，ｒ^３，ｔ^１，ｔ^２，ｔ^３，ｕ^１，ｕ^２，ｕ^３は、それぞれ独立して、０以上６以下の整数。ただし、ｂが０のときはｔ^１，ｔ^２およびｔ^３は０ではなく、ｔ^１，ｔ^２およびｔ^３が０のときはｂは０ではない。また、Ｒ’は水素（Ｈ）またはＲ。）にて表される構造を備え、
   上記Ｒが式（６−１）ないし式（６−６）
   

   

   から選択されるオリゴ糖由来化合物であることを特徴とするリガンド複合体。
6. 請求項１または２に記載のリンカー化合物の製造方法であって、
   チオクト酸と、芳香族アミノ基末端が保護基によって保護された分岐鎖を３鎖以上有するアミン化合物との縮合反応を行うステップと、
   上記芳香族アミノ基末端の保護基を脱保護するステップとを含んでいることを特徴とするリンカー化合物の製造方法。
7. 請求項１または２に記載のリンカー化合物と、糖分子とを用いて、還元アミノ化反応を行うことを特徴とするリガンド複合体の製造方法。
8. 上記糖分子として、一般式（８）
   

   

   にて表されるヘパリン部分二糖構造を有する硫酸化オリゴ糖を用いることを特徴とする請求項７に記載のリガンド複合体の製造方法。
9. 上記糖分子として、群（９）
   

   

   から選択されるオリゴ糖の少なくとも１つを用いることを特徴とする請求項７に記載のリガンド複合体の製造方法。
10. 糖分子を支持体の表面に配列させる糖分子の導入方法であって、
    請求項３ないし５のいずれか１項に記載のリガンド複合体を含む溶液と表面に金属を有する支持体とを接触させることを特徴とする糖分子の導入方法。
11. 請求項３ないし５のいずれか１項に記載のリガンド複合体を、表面に金属を有する支持体上に固定化させてなることを特徴とするリガンド担持体。
12. 請求項３ないし５のいずれか１項に記載のリガンド複合体を表面に固定化させてなることを特徴とする表面プラズモン共鳴用センサチップ。

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