KR100740071B1 - 리포익산 유도체 및 이를 함유한 피부외용제 조성물 - Google Patents

리포익산 유도체 및 이를 함유한 피부외용제 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 리포익산(α-lipoic acid; DL-6,8-thioctic acid; DL-1,2-dithio-lane-3-pentanoic acid; LA)의 유도체에 관한 것으로서, 좀더 구체적으로는 피부세포에서 생리활성을 갖는 리포익산을 이용하여 물에 대한 용해성이 매우 우수하여 제형화가 쉽고, 화학적 안정성이 개선되며, 독성이 감소되고, 경피흡수율이 증가된 리포익산-PEG 콘쥬게이트를 제조하였다. 이 리포익산-PEG 유도체는 미백, 항노화 및 여드름 완화에 효과를 갖는 화장품의 원료로서 유용하다. 본 발명에 의하면 리포익산-PEG 콘쥬게이트는 항산화능 뿐만 아니라 인간 섬유아세포 콜라겐 생성 촉진효과, 피부 잔주름 개선효과, 미백효과, 자극완화 효과 및 여드름 억제 효과가 있어 이 물질을 이용하여 각종 기능성 화장료를 제조할 수 있다.
리포익산-PEG 콘쥬게이트, 리포익산 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 리포익산, 피부외용제

Description

리포익산 유도체 및 이를 함유한 피부외용제 조성물{Novel lipoic acid conjugated compounds and skin external applications containing thereof}
도 1은 고분자 유도체에 의해 수식되지 아니한 리포익산을 제형의 상온 조건에서 6개월간 보관한 후 HPLC를 수행한 결과(전, 후)의 그래프이며,
도 2는 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 반응한 리포익산을 제형의 상온조건에서 6개월간 보관한 후 HPLC를 수행한 결과(전, 후)의 그래프이다.
본 발명은 항산화, 미백 및 항노화제로 유용한 리포익산에 관한 것이며, 더욱 구체적으로는 리포익산을 화학적으로 수용성인 고분자 또는 거대분자 운반체에 결합시킨 새로운 수용성 고분자-리포익산 콘쥬게이트에 관한 것이다. 이와 같은 리포익산 유도체는 리포익산의 용해도, 생체이용률, 산성, 고온, 자외선 안정성 및 경피 흡수율을 증가시키고, 독성은 감소시켜 그 사용범위를 확대시킬 수 있으며, 운반체로부터 가수분해될 때 다시 생리활성을 나타낸다. 또한, 본 발명은 리포익산 -PEG 콘쥬게이트를 주요 활성성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 좀더 구체적으로는 리포익산-PEG 콘쥬게이트를 활성성분으로 0.001 - 30.0중량%, 바람직하게는 0.01 - 5중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 항산화효과, 주름방지효과, 미백효과, 자극완화, 여드름 완화 및 억제 효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.
사람의 피부는 노화 과정에서 다양한 물리·화학적인 변화가 일어나며 그 원인으로는 크게 내적인 노화(intrinsic aging)와 광노화(photo-aging)로 구분되며 이에 관한 연구가 활발히 이루어져 왔다. 즉, 자외선, 스트레스, 질병상태, 환경인자, 상처, 나이가 들어감에 따라 프리라디칼이 활성화되며, 이런 상태가 심화될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망을 파괴하고, 세포 및 조직을 손상시켜 성인병 및 노화를 촉진하게 된다. 좀 더 구체적으로 말하자면, 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되어 피부세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부노화 현상이 생겨나는 것이다. 특히 산화 반응에서 생성되는 활성산소는 피부의 결합조직인 콜라겐(collagen), 히알루론산(hyaluronic acid), 엘라스틴(elastin), 프로테오글리칸(proteoglycan), 피브로넥틴(fibronectin) 등이 절단되어 염증반응과 피부의 탄력을 감소시키고 이것이 심해질 경우 DNA의 변이에 의해 돌연변이, 암의 유발, 면역기능 저하에 이르게 된다.
그러므로 신체의 대사 과정에서 발생하는 프리라디칼이나 자외선 조사, 염증반응에 의해 매개되는 프리라디칼을 소거하여 세포막을 보호하고, 또 이미 손상받은 세포는 활발한 신진대사에 의해 재생시켜서 세포를 증식시켜야 피부는 빠르게 회복되고 건강한 피부를 유지할 수 있다. 노화에는 프리라디칼 뿐만 아니라 기질 단백질 분해효소(MMP; Matrixmetalloproteinase)라는 효소가 관여하는데 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외 기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 단백질 분해효소(Matrix metalloprotease; "MMP")의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한 자외선 조사에 의해 이러한 분해효소가 활성화되기도 한다. 그러므로 세포 내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다. 이제까지 화장품의 소재로서 사용된 원료들은 단순히 효소 활성만을 억제하는 것이 대부분이었다. 이에 세포 내 자연노화와 광노화에 의해 그 발현이 유도되는 MMP 발현과 활성을 조절하고자 하였다.
다음으로, 색소 침착에 의한 피부 변화이다. 피부색에 영향을 주는 색소로는 멜라닌, 멜라노이드, 카로틴, 헤모글로빈 등이 있는데 이중 가장 중요한 것은 멜라닌으로 생합성에 영향을 미치는 가장 큰 요인은 자외선과 체내 호르몬 분비 정도이다. 멜라닌은 자외선을 흡수 또는 산란시켜 자외선으로부터 피부가 손상되는 것을 방지하는데 큰 역할을 하는데, 특별한 최대흡수파장이 없으며 전 영역의 빛을 흡수한다. 멜라닌의 생합성은 아미노산의 일종인 티로신이 멜라노사이트의 멜라노좀에서 티로시나제에 의해 산화되어 디하이드록시 페닐알라닌(dihydroxy phenylalanine)으로 전환되는 것을 시작으로 계속되는 일련의 산화과정을 거쳐 갈색멜라닌(pheomelanin), 흑색멜라닌(eumelanin)의 중합체로 형성된다. 이러한 생합성 과정은 멜라노좀이라는 특수한 형태의 갈색 세포 내 소기관에서 진행되며 멜라 닌 과립을 포함한 멜라노좀은 핵 주변 부위에서 수지상 돌기 끝부분으로 이동, 케라티노사이트의 식세포작용에 의해 세포질 내로 이동하고 이들은 케라티노사이트의 핵 주변에 축적된다. 이미 아스코르빈산(일본특개평 4-9320), 하이드로퀴논(일본특개평 6-192062), 코지산(일본특개소 56-7710), 알부틴(일본특개평 4-93150) 및 많은 다수의 천연 식물 추출물 등이 미백 화장료로 이용되고 있으나 화장품 제형 중에서의 안정성이 떨어지거나, 이취의 발생 및 생체 레벨에서의 효능, 효과의 불분명의 문제 등으로 그 사용이 제한되고 있는 실정이다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여, 최근 여러 화학물질의 유도체가 개발되고 있으며, 유도체화는 안정성, 용해도의 개선, 경피흡수 증진, 독성 감소 및 신규 화합물의 개발에 대한 소비자 호응도 증가 등을 통해 화장품 원료의 개발가치를 늘리고 있다.
이에, 본 발명자들은 화장품으로의 응용 가능성을 연구한 결과, 수용성의 생분해성 고분자인 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 리포익산을 중합하여, 개선된 용해도, 안정성, 경피 흡수율 및 세포독성을 확인하였으며, 항산화 효과, 미백 효과, 항노화 효과 및 피부자극 개선 효과를 측정한 결과 우수하여 화장품으로서의 효능을 기대할 수 있다는 것을 발견하게 되었다.
일반적으로 유도체들의 수용성 중합체부는 비독성 및 생체적합성이며, 전형적으로 2내지 약 300개의 말단을 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 중합체의 예에는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG), 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리올레핀계 알콜 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
수용성 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 HO-(CH2CH2O)nCH2CH2-OH의 기본 구조를 가지는 물질로서 음식물이나 화장품에 종종 사용되고 있으며 활성물질이 분해되어 없어지는 것을 지연시키는 효과가 있어 약제의 처방에 많이 사용되어 왔다. PEG는 인체에 무독성의 고분자이며, 인체에 항원성이 없고 체내에서 쉽게 없어지는 물질이므로 무해하다(Milos Dedlak, Collcet. Czech. Chem. Commun., 70:260-290, 2005).
폴리에틸렌 글리콜(PEG)를 활성물질과 접합시키는 반응을 PEGylation이라 하며 반응 산물을 PEG 콘쥬게이트라고 한다. 이러한 반응을 통해 활성물질의 안정성을 향상시키고 반감기를 높여주고 효소의 분해를 막을 수 있어 낮은 농도의 활성물질을 처리함으로써 독성을 낮추고 효과를 높이며 경제적으로 사용할 수 있다. 또한, 활성물질의 난용성을 개선하며 독성을 감소시켜 고농도로 제형에 함유될 수 있는 장점이 있다(Claudia Furijteier-Polloth, Toxicology, 214:1-38, 2005, Robert A. Scott et al., Biomaterials., 20(15):1371-1380, 1999, R. B. Greenwald, J. contr 74:159-171, PEG drugs: an overview, WO 2003/037385). 폴리에틸렌글리콜 자체의 프리라디칼 소거 및 크산틴 옥시다제(Xanthine oxidase) 억제효과는 없으나, 손상된 세포의 막을 보호하여 지질과산화나 활성산소 발생을 억제할 수 있다고 보고되어 있다(Jian Luo, et al., J. Neurochem., 83:471-480, 2002).
폴리에틸렌글리콜의 접합 방법은 한쪽 기능부위를 커플링제로 활성화시켜 활성물질의 작용기(-NH2, -OH, -COOH, -SH)와 탈수소 반응을 시킴으로써 활성물질과 PEG를 연결한다. 이러한 결합은 접합된 물질이 피부 내로 투과 시, 생체 효소에 의 해 연결이 끊겨 원래의 활성물질로서의 기능을 할 수 있는 에스테르, 티오에스테르, 아마이드 결합이 되도록 디자인한다(Samuel Zalipsky, Advanced Drug Delivery Reviews , 16: 57-182, 1995).
리포익산은 동물과 식물에 다양하게 존재하는 조효소로 미토콘드리아 내의 효소반응에 관여한다. 옥타노익산(Octanoate)이 리포익산의 C-8 지방산 사슬의 전구체가 되며, 시스테인이 황의 공급원이 되어 리포익산의 생합성이 일어난다고 알려져 있다. 리포익산과 그것의 환원된 형태인 DHLA(dihydrolipoic acid)는 항산화제로 잘 알려져 있으며(Suzuki Y. T. et al., Free Rad. Res. Commun. 15:255-263, 1991, Scott B. C., et al., Free Rad. Res. Commun. 20:119-133, 1994), 비타민 C, E의 보호(Likkesfeldt, J., et al., FASEB J. 12:1183-1189, 1998, Kagen, V. E., Serbinova, E. A., Forte, et al., J. Lipid Res. 33:385-397, 1992), 글루타티온 보호 및 합성 촉진(Han D, et al., Biofactors 6:321-338, 1997, Sen CK, et al., Free Rad. Biol. Med. 22:1241-1257,1997), 금속 킬레이션(chelation)에 의해 효과를 증진시킨다(Gregus Z, et al., Toxicol. Appl. Pharmacol. 114:88-96, 1992, Ou P, et al., Biochem. Pharmacol. 50:123-126, 1995). NF-kB를 억제하여 항염증제로서 자외선에 의한 조직손상을 줄이며, 손상된 콜라겐 섬유만을 제거하는 분해효소의 생성을 촉진하는 기능을 한다. 또한 자외선에 의한 microphthalmia-associated transcription factor의 발현 및 티로시나아제 활성을 억제하여 멜라닌 형성을 조절한다고 밝혀져 있다(Lin CB, et al., J. Invest. Dermatol. 119(6):1330-1340, 2002).
그러나, 리포익산은 물에 거의 난용성이기 때문에 화장품 및 약물의 제형화에 문제가 있다. 또한 반응성이 큰 SH기(sulfhydryl group) 함유 화합물의 특성상 산화되어 이황화물을 만들기 때문에 용해도가 감소하고 변색, 변취, 분해 등 안정성의 문제가 있다고 알려져 있으며, 이를 개선하기 위해 비타민 C 및 비타민 E와 티오화합물을 혼합하는 것이 오랜 기간 동안 안정하게 저장될 수 있는 조성물이 제공될 수 있다고 제안한다(A. Segall, et al., J. Cosmet. Sci., 55:419-461, 2004,EPO349797B1, 일본특허 53-7488).
그러나 이러한 방법으로는 리포익산의 안정성 개선에 많은 한계가 있으며 냄새, 제형 안정성, 효능효과의 감소 등으로 피부 외용제로의 응용에 한계가 있다. 리포익산을 유도체화한 사례를 살펴보면, 비타민 C, 비타민 E, 플라보노이드와 접합하여 화장품 조성물로 사용한 특허(WO2005072505)와 α-MSH와 접합한 미백제의 합성 특허(WO95/08564), 리포익산의 티올부위에 지방산을 접합시켜 당뇨병질환의 치료제로 이용한 특허(EPO317264) 등이 있으며, 또한 인돌과 접합시켜 지질과산화 억제 효율을 높이거나(Gurkan AS, et al., Arch. Pharm. (Weinheim), 338(2-3):67-73, 2005), 당뇨병 치료를 위한 하이드록시숙신이미드와의 접합(Gruzman A, et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 12(5):1183-1190, 2004), NOS(nitric oxide synthase) 억제제와의 접합(Harnett JJ, et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 12(11):1439-1442, 2002) 등의 연구가 보고된 바 있다. 폴리에틸렌글리콜과 리포익산을 접합시킨 사례는 있으나 특정한 기능을 목적으로 한 것이 아니라 대조군으로서 사용하기 위함이었다(Gruzman A, et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 12(5):1183-1190, 2004, Bruggraber SF, et al., Gastroenterology, 125(6):1705-1713, 2003). 기존 리포익산 유도체화 연구의 목적은 효능효과의 증진으로 리포익산을 폴리에틸렌글리콜의 한쪽 말단에 에스테르 결합시켜 세포독성, 안정성 및 용해도의 개선효과와 화장품에서의 우수한 피부개선에 대한 발명은 없었다.
본 발명은 리포익산의 수용성 유도체를 합성하여, 피부외용제의 원료로서의 효능을 확인하고, 그 사용 방법을 개발하고, 이 원료를 사용함으로써 소정의 기능성을 갖는 피부외용제를 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
즉, 본 발명의 목적은 화장료에 함유 시 항산화효과, 미백 효과, 우수한 항노화 효과, 피부 자극 개선효과 및 여드름 억제효과를 나타내는 물질을 개발하여 그 물질을 함유하는 화장료를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 PEG의 수용성에 근거하여, 이들의 비개질 리포익산 대응물에 비해 제형화, 가공 및 전달이 용이한 리포익산의 새로운 수용성 유도체를 제공하려는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 비개질 리포익산 대응물에 비해 산, 고온 및 자외선에 대한 불안정성, 경피흡수율, 및 세포 독성이 개선된 효과를 갖는 리포익산의 유도체를 제공하려는 것이다.
또한, 본 발명은 리포익산의 수용성 유도체를 유효 성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 리포익산을 수용성 운반체에 화학적으로 결합시켜 만들어진 것으로 다음의 화학식 1의 수용성 리포익산-PEG 콘쥬게이트에 관한 것이다.
Figure 112006017101606-pat00001
(상기 화학식에서, X는 O, N-H, 및 S로부터 선택되는 헤테로 원자이며, n은 4-2,000의 정수, R은 -H 또는 알콕시 또는 벤질옥시, 히드록실, 활성에스테르, 활성 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 히드레이트, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아마이드, 활성 술폰, 아민, 히드라지드, 티올, 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐술폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세타미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 트레실레이트, 또는 이들의 관능성 동등물로 이루어진 군으로부터 선택되는 관능기이다.)
바람직한 실시예에 있어서, 본 발명의 유도체는 리포익산 부분 및 폴리에틸렌글리콜 사이에 가수분해로 분해 가능한 연결, 예컨대 에스테르 연결을 포함한다. 따라서, 이러한 실시예에 있어서 리포익산-PEG 유도체는 전구물질로 여겨지며, 이 는 가수분해 가능한 연결이 끊겨 비기질 리포익산이 유리될 수 있음을 의미한다.
폴리에틸렌글리콜 부분의 n은 4-2,000으로 분자량이 200-100,000Da이다. R은-H 또는 말단 캡핑기로서, 예컨대 알콕시기, 벤질옥시기, 또는 반응성 관능기, 예컨대 히드록실기, 활성에스테르, 활성 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 히드레이트, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아마이드, 활성 술폰, 아민, 히드라지드, 티올, 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐술폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세타미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 트레실레이트, 또는 이들의 관능성 동등물이다. 이때 관능성 동등물이라 함은 화학식 1로 표시되는 물질의 물성에 영향을 미치지 않는 위에 기재된 알콕시기 등의 관능기의 유도체를 말하는 것이다.
본 발명의 유도체를 형성하는데 사용되는 폴리에틸렌 글리콜은 선형, 분지형, 포크형, 아령형 구조를 포함하는 임의의 여러 기하구조를 보유할 수 있다.
본 발명은 리포익산의 카르보닐 탄소에 공유 부착된 수용성 중합체를 포함하여 가수분해적으로 분해 가능한 연결을 형성하는 리포익산 유도체를 제공한다. 바람직한 연결에는 에스테르, 티오에스테르 및 아마이드가 포함되며, 당 분야에서 통상 사용되는 커플링 방법을 이용하여 제조된다. 리포익산-PEG 콘쥬게이트는 예컨대 카르복실산기 또는 활성화 카르복실산, 예컨대 산 할라이드와 반응하는 관능기, 예컨대 히드록실기 또는 티올기와, 활성화된 수용성 유도체를 반응시켜 형성될 수 있다. 실시예에 기재된 바와 같이, 리포익산으로 수행되는 커플링 반응을 위해서는 반응은 바람직하게는 촉매량의 커플링제, 예컨대 1-에틸-3-(3‘-디메틸아미노프로 필)카보이미드(EDCI), N,N'-디메틸아미노피리딘(DMAP)의 존재 하에 일어난다.
또한, 본 발명의 리포익산 유도체 화합물은 물에 매우 잘 용해되기 때문에 이 화합물을 사용할 때 과민반응을 일으키는 요인이 되는 계면활성제와 유기 용매를 사용하지 않아도 되며, 따라서 고농도로 조성물에 함유될 수 있다.
또한, 본 발명은 리포익산 수용성 유도체를 주요 활성성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 리포익산-PEG 콘쥬게이트의 함량이 피부 외용제 조성물 전체에 대해서 동결건조중량 기준 0.001-30.0중량%인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물을 제공한다. 상기 리포익산-PEG의 함량이 0.001중량% 미만인 경우에는 피부개선 효과가 거의 없으며, 30.0중량% 이상인 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하여 경제적이지 못하다.
또한, 본 발명은 상기 피부 외용제 조성물이 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 팩, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형의 제형 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 리포익산-PEG 콘쥬게이트를 주요 활성성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물을 제공한다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시 예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예의 기재에 국한되는 것은 아니다.
실시예 1: 리포익산- PEG (2 kDa ) 콘쥬게이트의 제조
가지 달린 둥근 플라스크 내에 500mg 메톡시폴리에틸렌글리콜(M.W. 2000), 58mg 리포익산, 52.7mg EDCI(1-에틸-3-(3‘-디메틸아미노프로필)카보이미드) 및 촉매로서 DMAP(N,N'-디메틸아미노피리딘) 미량을 첨가하여 광의 부재하에 세 시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 혼합물의 용매를 감압증발로 제거하여 건조 잔류물을 적은 양의 디클로로메탄에 녹여 디에틸에테르를 첨가하였다. 생성된 침전 산물을 여과로 수집하고, 에테르로 세척하여 진공 하에 건조하였다. 반응 산물을 물/아세토니트릴 구배로 용출되는 C18칼럼 역상의 고성능 액체크로마토그라피법(HPLC)를 이용하여 순도를 확인하였다. 합성물은 미황색의 결정으로 얻어졌으며, 수율은 92% 이상이었다.
실시예 2: 리포익산- PEG (1 kDa ) 콘쥬게이트의 제조
가지 달린 둥근 플라스크 내에 250mg 메톡시폴리에틸렌글리콜(M.W. 1000), 58mg 리포익산, 52.7mg EDCI 및 촉매로서 DMAP를 미량 첨가하여 광의 부재하에 세 시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 혼합물의 용매를 감압증발로 제거하여 건조잔류물을 적은 양의 디클로로메탄에 녹여 디에틸에테르를 첨가하였다. 생성된 침전산물을 여과로 수집하고, 에테르로 세척하여 진공 하에 건조하였다. 반응 산물을 물/아세토니트릴 구배로 용출되는 C18칼럼 역상의 고성능 액체크로마토그라피법(HPLC)를 이용하여 순도를 확인하였다. 합성물은 미황색의 결정으로 얻어졌으며, 수율은 95% 이상이었다.
실시예 3: 리포익산- PEG (500 Da ) 콘쥬게이트의 제조
가지 달린 둥근 플라스크 내에 120mg 메톡시폴리에틸렌글리콜(M.W. 500), 58mg 리포익산, 52.7mg EDCI 및 촉매로서 DMAP를 미량 첨가하여 광의 부재하에 세 시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 혼합물의 용매를 감압증발로 제거하여 건조잔류물을 적은 양의 디클로로메탄에 녹여 디에틸에테르를 첨가하였다. 생성된 침전 산물을 여과로 수집하고, 에테르로 세척하여 진공 하에 건조하였다. 반응 산물을 물/아세토니트릴 구배로 용출되는 C18칼럼 역상의 고성능 액체크로마토그라피법(HPLC)를 이용하여 순도를 확인하였다. 합성물은 미황색의 결정으로 얻어졌으며, 수율은 94% 이상이었다.
실시예 4: 용해도 실험
증류수 1㎖에 상기 실시예 1 내지 3의 방법으로 제조된 리포익산-PEG 유도체 화합물을 첨가량을 증가시키며 용해하여 헤이즈미터(Haxemeter, NHD-300A, Nippon denshocku IND.)로 용해도를 측정하였다. 측정 결과 유동성이 있고 측정치가 0.5 이하를 나타내는 리포익산 화합물의 첨가량을 용해도로 하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
구분 용해량(D.W.) 비고
실시예1 1000 mg 이상
실시예2 1000 mg 이상
실시예3 1000 mg 이상
리포익산 난용성(에탄올 용해: 50mg/ml)
실시예 5: 세포 독성 실험
본 실시예는 실시예 1 내지 3에서 수득한 리포익산-PEG 콘쥬게이트와 비개질 리포익산의 세포독성을 평가하기 위하여 실시되었다. 섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 1x105개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 여기에 평가하고자 하는 리포익산-PEG 콘쥬게이트와 비개질 리포익산을 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지 500㎕ 배지와 MTT 용액(2.5㎎/㎖) 60㎕를 넣은 후 2시간 동안 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl(0.04 N)을 500㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100㎕씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 판독기에서 565nm 흡광도를 측정하였다. 수학식 1에 의해 세포생존율(%)을 계산하였다.
세포생존율(%) =〔(St-Bo)/(Bt-Bo)〕X 100
Bo : 세포배양배지 만을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도
Bt : 시료를 처리하지 않은 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도
St : 시료를 처리한 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도
실험결과 5mM 농도에서 리포익산-PEG 콘쥬게이트는 리포익산보다 10-20% 세포독성이 완화되었다(표 2).
시료명 처리농도( mM ) 세포생존률 (%) 비고
실시예 1 5 93.16
실시예 2 5 93.62
실시예 3 5 85.12
리포익산 5 61.09
실시예 6: DPPH 법을 이용한 항산화 효과 측정 실험
본 실시예는 실시예 1 내지 3에서 수득한 리포익산-PEG 콘쥬게이트의 항산화 효과를 측정하기 위해 실험실 조건에서 아스코르브산(Ascorbic acid)과 같은 항산화제 및 비개질 리포익산을 비교 샘플로 하여 DPPH법을 이용, 항산화 활성을 측정하였다.
DPPH법은 2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical (DPPH)라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 항산화 활성을 측정한다. 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율을 측정한다.
사용한 시약으로서는 2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical (Aldrich Chem. Co., M.W.=618.76) 0.1mM 용액으로서 61.88mg을 메탄올에 용해하여 100㎖로 한다.
측정방법으로서
① 96-웰 플레이트에 0.1mM DPPH 용액 0.15㎖에 시료용액 0.15㎖를 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 10분간의 배양을 개시한다.
② 그 후 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.
③ 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정한다.
④ 역시, 시료용액의 블랭크(Blank)는 0.1mM DPPH 용액 대신에 메탄올을 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.
효과의 결과는 수학식 2에 의하여 산출하였으며, 결과는 표 3과 같다.
억제율(%) = 〔1-(St-So)/(Bt-Bo)〕X 100
St : 시료용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도
Bt : 공시험용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도
So : 시료용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도
Bo : 공시험용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도
결과는 표 3과 같이 리포익산-PEG 콘쥬게이트(실시예 1-3)는 50mM 농도에서 리포익산보다 우수한 항산화 효과를 가지고 있었다. 그러나, 아스코르브산보다는 DPPH 라디칼 소거효과가 낮았다.
시료명 처리 농도 ( mM ) 항산화효과(%) 비고
실시예 1 50 62.7
실시예 2 50 65.8
실시예 3 50 66.2
리포익산 50 39.3
아스코르브산 1 97.0
실시예 7: 티로시나아제 억제 효과 측정 실험
본 실시예는 실시예 1 내지 3에서 수득한 리포익산-PEG 콘쥬게이트의 티로시나아제 억제 효과를 측정하기 위해 실험실 조건에서 코지산(Kojic acid)과 같은 항산화제 및 비개질 리포익산을 비교 샘플로 하여 티로시나아제 억제 효과를 측정하였다.
티로신(Tyrosine)으로부터 멜라닌을 형성하는 일련된 산화반응에서 티로시나아제는 처음 티로신이 도파(Dopa)로 산화되는 과정과 다음 단계인 도파가 도파퀴논(Dopaquinone)으로 산화되는 과정의 두 단계의 반응을 촉진하는 효소이다. 피검물질에 의해 티로시나아제 활성을 억제하여 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 490nm에서 흡광도를 측정한다.
사용한 시약으로서는 2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical (Aldrich Chem. Co., M.W.=618.76) 0.1mM 용액으로서 61.88mg을 메탄올에 용해하여 100㎖로 한다.
측정방법으로서
① 96-웰 플레이트에 0.1mM DPPH 용액 0.15㎖에 시료용액 0.15㎖를 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 10분간의 배양을 개시한다.
② 그 후 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.
③ 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정한다.
④ 역시, 시료용액의 블랭크(Blank)는 0.1mM DPPH 용액 대신에 메탄올을 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.
효과의 결과는 수학식 3에 의하여 산출하였으며, 결과는 표 4와 같다.
억제율(%) = 〔1-(St-So)/(Bt-Bo)〕X 100
St : 시료용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도
Bt : 공시험용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도
So : 시료용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도
Bo : 공시험용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도
결과는 표 4와 같이 리포익산-PEG 콘쥬게이트(실시예 1-3)는 2.5mM 농도에서 비개질 리포익산보다 30% 정도 우수한 티로시나아제 억제 효과를 나타내었다. 그 효과는 코지산(Kojic acid)보다는 낮았다.
시료명 처리 농도( mM ) 티로시나아제 억제효과(%) 비고
실시예 1 2.5 80.5
실시예 2 2.5 82.3
실시예 3 2.5 84.6
리포익산 2.5 53.7
코지산 1 98.97
실시예 8: 여드름 유발 균주 억제 시험( Paper Disc Test )
본 실시예는 실시예 1 내지 3에서 리포익산-PEG 콘쥬게이트 및 비개질 리포익산의 여드름균에 대한 항균력을 확인하기 위한 페이퍼 디스크 테스트(Paper Disc Test)를 실시하였다. 먼저, 여드름 발생원인의 피부 상재균인 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acnes)를 활성화시키기 위하여 BHI 액체배지(Brain-Heart Infusion Broth;3.7%)에서 48시간 전배양하였다. 이렇게 준비한 균배양액을 BHI 고체배지(Brain-Heart Infusion Broth;3.7%;agar 1.5%)에 0.1㎖씩 도말한 후 건조시켰다. 리포익산-PEG 콘쥬게이트(실시예 1-3) 및 리포익산을 95% 에탄올 수용액에 12%(W/v)로 희석하여 직경 8㎜의 페이퍼 디스크에 50㎕씩 점적한 후 앞서 준비한 고체 배지 위에 올려놓은 후 이것을 35℃ 혐기 배양조에서 3일간 배양하였다. 페이퍼 디스크 주변에 생긴 균 성장 저지 영역을 관찰하고 저지환의 크기를 측정함으로써 항균력을 평가하였다.
페이퍼 디스크 주변에 생긴 균 성장 저지환의 크기를 관찰한 결과, 표 5와 같이 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 리포익산-PEG 콘쥬게이트(실시예 1-3)는 약 30mm 저지환을 보였으며, 22mm 인 리포익산보다 더 우수하게 여드름 유발 균주의 성장을 억제하는 것으로 나타났다.
시험군 처리농도( mM ) 저지환의 크기( mm ) 비고
실시예 1 5 28
실시예 2 5 30
실시예 3 5 30
리포익산 5 22
실시예 9: 5알파 - 리덕타아제 활성 억제 효과
본 실시예는 실시예 1에서 수득한 리포익산-PEG 콘쥬게이트의 5알파-리덕타아제 활성 억제 효과를 측정하였다.
5알파-리덕타아제는 남성 호르몬인 테스토스테론과 밀접한 관련이 있는 것으로, 피부세포 내에서 5알파-리덕타아제에 의해 테스토스테론이 디하이드로테스토스테론으로 전환되어 피지분비 세포의 활성을 증진시켜 피지분비를 촉진시키는 것으로 알려져 있다.
5알파-리덕타아제 활성억제 실험에 사용된 5알파-리덕타아제는 포피 유래의 섬유아세포가 생성하는 효소를 사용하였다. 섬유아세포를 마이크로플레이트 홀(microplate hole)마다 10000개의 세포가 들어가도록 접종한 후 배양하였다. 각 홀마다 3H(트리튬)으로 방사선표지(radio labelling)된 테스토스테론을 0.1.mμ.Ci 첨가한 후에 배양하므로 섬유아세포가 이를 이용하는지 측정하였다. 리포익산-PEG 콘쥬게이트 및 리포익산이 들어가지 않은 것을 대조군으로 삼았다. 24시간 배양 후 상등액을 얻고 에틸아세테이트(ethyl acetate)-사이크로헥산(cyclohexane) (1:1) 추출용매 1㎖로 스테로이드(steroids)를 얻었다. 이 얻어진 스테로이드를 박막크로마토그래피 판에 올려놓고 클로로포름/메탄올 혼합액(98/2 (v/v))으로 전개시켰다. 테스토스테론과 디하이드로테스토스테론에 해당하는 점의 방사활성을 덴시토미터를 이용하여 측정하여 전환율을 계산하고, 그 결과를 대조군과 비교하여 하기 수학식 4에 의해 5알파-리덕타아제 저해능을 평가하였다.
저해율(%) = 〔(A-B)/A〕X 100
A=공시험 용액의 테스토스테론에서 다이하이드로테스토스테론으로의 전환율
B=시료 용액의 테스토스테론에서 다이하이드로테스토스테론으로의 전환율
5알파-리덕타아제 저해효과는 리포익산-PEG 콘쥬게이트(실시예 1-3)가 10mM 농도에서 75% 이상의 저해율을 보였으며, 이는 리포익산의 억제율보다 40% 정도 우수한 결과이다(표 6). 따라서 리포익산-PEG 콘쥬게이트가 효과적으로 피지분비를 억제해 여드름 치료에 우수한 효과가 있을 것으로 예상된다.
Figure 112006017101606-pat00002
실시예 10: 자외선 조사 후 리포익산- PEG 콘쥬게이트에 의한 MMP -1 발현억제 효과
본 실시예는 실시예 1 내지 3에서 수득한 리포익산-PEG 콘쥬게이트의 UV 조사 및 시료 첨가 후 MMP-1 농도를 측정하기 위해서 ELISA를 실시하였다.
UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 5J/㎠의 에너지로 조사한다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비 실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 시간 유지하였다. UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사 한 후 샘플이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수하여 96-웰에 코팅하였다. 일차항체(MMP-1 (Ab-5) 단일클론항체와 MMP-2(Ab-3) 단일클론항체)를 처리하고 37℃에서 60분 동안 반응시켰다. 이차항체인 안티마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질 용액(1mg/㎖ρ-nitrophenyl phosphate in diethanolamine 완충용액)을 상온에서 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 리더로 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용한다.
자외선 조사시에 발현이 유도되는 MMP-1에 대하여 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 리포익산-PEG 콘쥬게이트(실시예 1-3)는 75% 이상의 억제율을 보였으며, 이는 대조군으로 사용한 레티노익산의 억제율보다 우수한 결과이다(표 7). 또한 비개질 리포익산은 자외선 조사시에 유도되는 MMP-1의 발현을 억제시키는 효과가 없는 것으로 나타났다.
시험군 처리농도( mM ) MMP -1 발현억제율(%) 비고
실시예 1 0.25 76.0
실시예 2 0.25 77.2
실시예 3 0.25 79.3
리포익산 0.25 0
레티노익산 0.01 30.4
실시예 11: B16F1 멜라노싸이트를 이용한 멜라닌 생성 억제효과 측정 실험
본 실시예는 실시예 1 내지 3에서 수득한 리포익산-PEG 콘쥬게이트의 미백효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라노싸이트에 대한 멜라닌 생성 억제 정도를 보고 미백 효과를 판단한 것이다.
본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포균주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. 이 세포의 인공배양중에 시료를 처리하여 멜라닌 흑색색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다. 본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 ATCC(American Type Culture Collection, 기탁번호 : 6323)로부터 분양받아 사용하였다.
B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생합성 억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다. B16F1 멜라노싸이트를 6웰 플레이트에 각 웰당 2 x 106 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신-EDTA로 떼어낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포내 멜라닌의 정량은 로탄(Lotan : Cancer Res ., 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 버퍼액(50 mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2 mM PMSF) 1㎖를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3,000rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1N NaOH(10% DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판독기로 405nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 저해율 (%)은 수학식 5에 의하여 계산하였으며, IC50값은 멜라닌 생성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.
저해율 (%) = [(A-B)/A]x 100
A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양
B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양
B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 억제효과를 시험한 결과 리포익산-PEG 콘쥬게이트(실시예 1-3)의 IC50값은 0.5mM로 비개질 리포익산과 유사한 효과를 보였으며, 기존의 미백제인 하이드로퀴논, 알부틴 등에 비해 우수한 효과를 나타내었다(표 8).
시료명 멜라닌 합성 저해효과( IC 50 ) 비 고
실시예 1 0.5mM
실시예 2 0.5mM
실시예 3 0.5mM
리포익산 0.5mM
하이드로퀴논 3 mM
알부틴 7 mM
실시예 12: 자외선 조사에 의한 세포독성 완화 효과
본 실시예는 실시예 1 내지 3에서 수득한 리포익산-PEG 콘쥬게이트의 자외선 조사에 의한 세포독성의 완화 효과를 평가하기 위하여 실시되었다. 섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 1x105개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 10% FBS가 첨가된 것) 1㎖을 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 리포익산-PEG 콘쥬게이트 및 리포익산을 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지 500㎕ 배지와 MTT 용액(2.5㎎/㎖) 60㎕를 넣은 후 두 시간 동안 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl(0.04N)을 500㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100㎕씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 판독기에서 565nm 흡광도를 측정하였다. 수학식 6에 의해 세포생존율(%)을 측정하고 자외선에 의한 세포독성 완화율은 수학식 7에 의하여 계산하였다.
세포생존율(%) =〔(St-Bo)/(Bt-Bo)〕X 100
Bo : 세포 배양배지 만을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도
Bt : 시료를 처리하지 않은 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도
St : 시료를 처리한 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도
자외선에 의한 세포독성 완화율(%) =〔1-(St-Bo)/(Bt-Bo)〕X 100
Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 세포 생존율
Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포 생존율
St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 세포 생존율
실험결과 리포익산-PEG 콘쥬게이트(실시예 1-3)는 자외선에 의한 세포 독성을 0.5mM 농도에서 30% 이상 완화하여 자외선에 의한 세포독성을 효과적으로 방어함을 알 수 있었다. 또한 이는 리포익산의 자외선에 의한 세포독성 완화율보다 20% 정도 높은 것을 확인할 수 있다(표 9).
시료명 처리농도( mM ) 세포독성 완화율(%) 비고
실시예 1 0.5 36
실시예 2 0.5 32
실시예 3 0.5 30
리포익산 0.5 12
실시예 13: 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과
본 실시예는 실시예 1 내지 3에서 수득한 리포익산-PEG 콘쥬게이트의 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 평가하기 위하여 사람의 표피조직에서 분리한 섬유아세포(Fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5X104개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350㎕를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 리포익산-PEG 콘쥬게이트를 처리한 후 다섯 시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 150㎕ 취하여 프로스타글란딘 E2(PGE2)를 정량함으로서 리포익산-PEG 콘쥬게이트의 염증성 사이토카인 발현억제효과를 판단하였다. PGE2의 양은 효소면역분석법(Enzyme-linked Immunosorbent Assay; ELISA)를 이용하여 정량화하였으며, PGE2의 생성율은 수학식 8에 의해 계산하였다.
염증성 사이토카인 발현 억제율(%) =〔1-(St-Bo)/(Bt-Bo)〕X 100
Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 PGE2 생성량
Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 PGE2 생성량
St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 PGE2 생성량
실험 결과 리포익산-PEG 콘쥬게이트(실시예 1-3)는 자외선에 의한 염증성 사이토카인인 PGE2의 생성을 0.25mM 농도에서 55% 이상 억제하여, 자외선에 의한 염증 발생을 낮은 농도에서 효과적으로 방어함을 알 수 있었고, 이는 리포익산보다 우수함을 알 수 있었다(표 10).
시료명 처리농도( mM ) 염증성 사이토카인( PGE 2 ) 발현 억제율(%) 비고
실시예 1 0.25 58
실시예 2 0.25 56
실시예 3 0.25 57
리포익산 0.25 30
실시예 14: 리포익산- PEG 콘쥬게이트의 안정도 측정
본 발명에 따른 예시적 리포익산-PEG 콘쥬게이트(실시예 1)의 수용액과 화장료에서의 안정도를 2개의 상이한 온도(상온, 고온), 3개의 상이한 pH(4, 7, 10) 및 빛의 유무(암흑, 자외선)에 따라 비개질 리포익산과 비교하였다.
리포익산-PEG(2kDa) 콘쥬게이트(실시예 1 참고) 및 비개질 리포익산을 25mM농도로 pH별 완충액(pH 4.0 아세테이트 완충액, pH 7.0 포스페이트 완충액, pH 10.2 바이카보네이트 완충액) 중 30% 에탄올을 함유하여 완전 용해시켰다.
리포익산 및 리포익산-PEG 콘쥬게이트를 함유한 화장료는 크림 형태이고, 그 조성은 표 11에 나타낸 바와 같다. 우선 표 11에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존하였다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림을 제조하였다.
상온(암흑), 고온(54℃,암흑), 자외선(상온)조건에 6개월간 보관하여, 용해성 및 장기보관시의 변취를 확인하기 위해 제조 직후 및 6개월 보관 후의 용해상태 및 냄새를 관찰하고 다음의 표 12에 나타내었다. 또한 분석용 역상 HPLC에 의해 정량 분석을 실시하여 유효성분의 장기보존성을 확인하고 실험결과를 표 13에 나타내었으며, 제형의 상온조건에서의 6개월간 보관 후의 HPLC 분석 결과를 도면 1(리포익산)과 도면 2(리포익산-PEG 콘쥬게이트)에 나타내었다.
HPLC 분석은 C18 분석칼럼(Xterra, 5um, 4.6X250mm, Waters)을 이용하였으며, 실시예 1에서 합성한 리포익산-PEG 콘쥬게이트는 이동상으로 40% 아세트산 완충액, pH 4.5, 60% 메탄올을 사용하였으며 측정파장은 300nm이다. 리포익산의 경우 이동상으로 30% 아세트산 완충액, pH 4.5, 70% 메탄올을 사용하였으며 측정파장은 330nm이다.
Figure 112006017101606-pat00003
Figure 112006017101606-pat00004
Figure 112006017101606-pat00005
표 12 에서 보는 바와 같이 리포익산의 경우는 산성, 중성, 염기성 및 제형(*표 11의 제형을 의미함) 조건에서 자외선에 의해 변취의 발생이 나타나며, 그 중 산성과 상온, 고온, 자외선 하에서 변취가 매우 심했다. 리포익산-PEG 콘쥬게이트의 경우, 변취가 발생하기는 했으나 리포익산보다 매우 개선되었다. 또한 표 13의 보관조건에 따른 함량의 변화를 살펴보면 산성 수용액의 상온조건에서 보관한 리포익산의 함량이 44%인 반면, 중성 및 염기성 수용액에서 보관한 리포익산의 함량은 각각 64%, 62%로, 산성 수용액에서 리포익산이 불안정했다. 또한 산성인 제형에서의 리포익산의 함량변화는 산성 수용액에서보다 더 컸으며, 산성 조건에서 상 불안정성으로 인하여 제품 내 장기 보존율이 떨어짐을 알 수 있었다. 그러나 리포익산-PEG 콘쥬게이트는 모든 조건에서 비개질 리포익산보다 안정하여 변취가 감소하고, 장기보존율이 우수하였다.
실시예 15: 리포익산- PEG 콘쥬게이트의 가수분해
본 발명에 따른 예시적 리포익산-PEG 콘쥬게이트의 온도 및 화학적, 효소적 가수분해에 대한 안정성을 측정하였다.
리포익산-PEG(2kDa) 콘쥬게이트(실시예 1 내지 3)를 0.5중량% 농도로 인산염 완충액(0.1M, pH 7.4)에 용해시켜 23℃와 37℃에서 보관하였으며, 포신 에스터라제(porcine esterase)가 녹아있는 인산염 완충액(0.1M, pH 7.4) 중에 용해시켜 37℃에서 보관하면서, 시간 간격을 두고 분석용 역상 HPLC에 의한 분석을 위해 분취량을 제거하였다. HPLC 분석조건은 실시예 14에서 나타낸 바와 같다.
위 1차 동역학(pseudo-first-order kinetics)을 이용하여 가수분해 반감기를 수득하였다. 표 14에서 나타낸 바와 같이, 23℃ 완충액에서 리포익산-PEG 콘쥬게이트(실시예 1-3)의 가수분해 반감기는 약 3000시간인 반면, 37℃ 완충액에서 반감기는 약 800시간이었다. 또한 포신 에스터라제(porcine esterase) 효소에 의한 반감기는 5시간 내외로 매우 짧았다. 상기 결과는 비개질 리포익산 화합물을 방출하기 위한 상기 특정 에스테르 커플링된 콘쥬게이트의 가수분해 가능한 성질을 나타낸다. 즉, 상기 본 발명의 콘쥬게이트는 리포익산의 수용성 전구 약물 형태를 특징으로 할 수 있다.
Figure 112006017101606-pat00006
실시예 16: 리포익산- PEG 콘쥬게이트의 경피흡수 효과
본 실시예는 실시예 1에서 수득한 리포익산-PEG 콘쥬게이트를 함유한 화장료를 제조하여 8주 정도의 암컷 무모 기니아피그(strain IAF/HA-hrBR)를 이용하여 경피 흡수율을 비개질 리포익산을 함유한 화장료와 비교실험을 행하여 평가하였다.
기니아피그의 복부 피부를 절취한 후 프란쯔 타입 확산 세포(Franz-type diffusion cell)(Lab Fine Instruments, Korea)에 정착하여 실험하였다. 프란쯔 타입 확산 세포의 받게(Receptor) 용기(5㎖)에 50mM 인산염 완충액(pH 7.4, 0.1M NaCl)을 넣어준 후, 확산 세포를 32℃, 600rpm으로 혼합, 분산시켜 주었으며, 표 11에 나타낸 바와 같이 화장료를 조제하여 화장료 10%(W/V)로 분산시킨 용액 50㎕를 주게(donor) 용기에 넣어주었다. 37℃로 유지된 상태에서 흡수확산시켰으며, 흡수확산이 일어나는 피부가 0.64 cm2이 되도록 하였다. 유효성분의 흡수확산이 끝난 후에는 건조된 킴와이프스(Kimwipes) 또는 10㎖의 에탄올로 흡수되지 못하고 피부에 남아있는 유화물을 씻어주고, 팁-타입 균등기(tip-type homogenizer, Polytron PT2100, Swizerland)를 사용하여 유효성분이 흡수 확산되어 있는 피부를 갈아준 후, 피부 내부로 흡수된 리포익산-PEG 콘쥬게이트 및 비개질 리포익산을 4㎖의 디클로로메탄올을 사용하여 추출하였다. 이후 추출액을 0.45um 나일론 멤브레인(nylon membrane) 여과막으로 여과하고, 실시예 15에서 실시한 HPLC법으로 그 함량을 측정한 후 그 결과를 표 15에 나타내었다.
총흡수량( ug ) 면적및 단위시간당 흡수량 경피흡수 증 가율 비고
리포익산-PEG 콘쥬게이트(실시예1) 313 27 ug/cm2h 1.6배
리포익산 196 17 ug/cm2h
(18시간 후)
상기 실험결과로부터, 실시예 1로 제조한 리포익산-PEG 콘쥬게이트의 경피 흡수율은 리포익산의 경피 흡수율에 비해 1.6배 정도 우수한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 17: 리포익산- PEG 콘쥬게이트의 탄력 개선 효과
본 실시예는 실시예 1에서 수득한 리포익산-PEG 콘쥬게이트를 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 탄력 개선 효과를 리포익산을 함유한 화장료와 비교실험을 행하여 평가하였다.
표 11에 나타낸 바와 같이 화장료를 조제하여 실험자(20세-35세의 여성) 30명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 리포익산-PEG 콘쥬게이트를 함유한 크림을 얼굴 왼쪽 부위에는 리포익산을 함유한 크림을 각각 1일 2회씩 연속 3개월간 도포하였다.
실험완료 후 피부 탄력 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부탄력측정기(cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 측정하였다. 실험결과는 하기 표 16에 Cutometer SEM 575의 △R8값으로 기재하였는데 R8값은 피부의 점탄성(viscoelasticity)의 성질을 나타낸다. 표 16에서 나타난 바와 같이 리포익산-PEG 콘쥬게이트를 함유한 크림을 도포한 실험자의 피부 탄력개선 효과가 우수함을 알 수 있다.
피부탄력효과(△ R8 ) 비고
리포익산-PEG 콘쥬게이트(실시예1) 0.24
리포익산 0.12
n=30, p＜0.05
실시예 18 : 리포익산- PEG 콘쥬게이트의 피부미백 효과
본 실시예는 실시예 1에서 수득한 리포익산-PEG 콘쥬게이트를 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 미백효과를 리포익산을 함유한 화장료와 비교실험을 행하여 평가하였다.
표 11에 나타낸 바와 같이 화장료를 조제하여 실험자(20세-35세의 여성) 30명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 리포익산-PEG 콘쥬게이트를 함유한 크림을 얼굴 왼쪽 부위에는 리포익산을 함유한 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다. 시험 완료 후 얼굴 좌우 양편의 도포 부위 피부를 화상분석기 및 피부색의 변화를 크로마메타(Minolta CR300)를 이용하여 색의 밝기 변화(ΔL)를 측정하고, 복수의 숙련자에 의한 객관적 육안 관찰과 피검자에 의한 주관적 육안 관찰을 실시하여 하기 등급 분류에 따라 효과를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 17에 나타내었다. 이때 미백 효능 정도를 다음의 7등급으로 분류하여 평가하였다.
미백 효능 평가 기준 :
-3: 매우 악화-2: 악화-1: 약간 악화0: 변화 없음
1: 약간 개선 2: 개선 3: 매우 개선
표 17에서 나타낸 바와 같이 리포익산-PEG 콘쥬게이트를 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면 피부에서 미백효과가 우수함을 알 수 있다.
Figure 112006017101606-pat00007
이하 그 외의 실시예를 나타내었다. 즉, 실시예 1에서 수득한 리포익산-PEG 콘쥬게이트를 함유한 화장수, 유액 및 미용액을 실시예 19 내지 21에서 제조하였다. 이들 리포익산-PEG 콘쥬게이트를 함유한 화장수, 유액 및 미용액은 항산화 효과, 티로시나아제 활성 억제 효과, 미백효과, 피부 잔주름 개선 효과 등 피부개선에 우수한 효과를 나타내었다.
실시예 19: 리포익산- PEG 콘쥬게이트를 함유한 화장수의 제조
95% 에탄올 8g에 폴리피로리돈 0.05g, 올레일알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합 용해하였다. 실시예 1에서 수득한 리포익산-PEG 콘쥬게이트 0.05g, 글리세린 5g을 정제수 85.33g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 피부개선효과가 있는 화장수를 얻었다.
실시예 20: 리포익산- PEG 콘쥬게이트를 함유한 유액의 제조
세틸알콜 1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2g, 글리세린모노에스테아레이드 1g, 폴리옥시에틸렌(20몰부가)모노올레이트 1g 및 향료 0.1g을 70℃에서 가열, 혼합 용해하고, 실시예 1에서 수득한 리포익산-PEG 콘쥬게이트 0.5g, 디프로필렌글리콜 5g, 폴리에틸렌글리콜-1500 2g, 트리에탄올아민 0.2g, 정제수 76.2g을 75℃로 가열해서 용해시켰다. 양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수중유(O/W)형의 피부개선효과가 있는 유액을 얻었다.
실시예 21: 리포익산- PEG 콘쥬게이트를 함유한 미용액의 제조
95% 에틸알콜 5g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 카르복시메틸셀룰로오즈 0.3g, 히아론산나트륨 0.2g, 비타민 E-아세테이트 0.2g, 감초산 나트륨 0.2g, 파라옥시안식향산 에틸에스테르 0.1g, 실시예 1에서 수득한 리포익산-PEG 콘쥬게이트 1g 및 적량의 색소를 혼합하여 피부개선효과가 있는 미용액을 얻었다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 리포익산-PEG 콘쥬게이트는 항산화 효과와 MMP 저해 효과 등 우수한 항노화 효과를 나타내었다.
또한, 리포익산-PEG 콘쥬게이트는 기미, 주근깨 및 피부 색소 침착의 원인이 되는 물질인 멜라닌 생성억제 효과, 티로신으로부터 멜라닌을 형성하는 일련된 산화반응에 관련된 효소인 티로시나아제의 억제효과 등 미백작용을 나타내었다.
또한, 리포익산-PEG 콘쥬게이트는 여드름의 원인이 되는 여드름 균주의 성장을 억제 및 5알파-리덕타아제의 활성을 저해에 의한 피지분비를 억제를 통해 여드름의 방지 효과를 나타내었다.
또한, 리포익산-PEG 콘쥬게이트는 리포익산과 비교하여 산성, 고온, 자외선의 조건에서 안정한 것을 확인하였다.
또한, 리포익산-PEG 콘쥬게이트는 리포익산과 비교하여 수용액에서의 용해도가 매우 큰 것을 확인하였다.
또한, 리포익산-PEG 콘쥬게이트는 리포익산과 비교하여 세포독성이 낮은 것을 확인하였다.
또한, 리포익산-PEG 콘쥬게이트는 리포익산과 비교하여 경피흡수율이 개선된 것을 확인하였다.
따라서, 이러한 리포익산-PEG 콘쥬게이트를 함유하는 화장수, 크림, 유액, 팩, 파우더 등의 화장료 조성물은 항산화 효과와 콜라겐 분해효소 활성 조절 효과, 미백, 피부자극 완화효과 등 우수한 피부 외용제 효과를 갖고, 리포익산 함유 조성물과 비교하여 산, 고온 및 자외선 조건에 안정하며, 독성이 낮아 고농도를 함유할 수 있고, 제형화가 유리함을 알 수 있다.

Claims (7)

  1. 하기 화학식으로 표시되는 리포익산 유도체.
    Figure 112007011667383-pat00008
    (상기 화학식에서, X는 O인 헤테로 원자이며, n은 4-120의 정수, R은 -CH3이다.)
  2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 중 CH2CH2(OCH2CH2)nOR로 표시되는 폴리에틸렌글리콜 부분은 분자량이 200 내지 5,000이며, 선형, 분지형, 포크형 및 아령형 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 리포익산 유도체.
  3. 제1항에 있어, 상기 리포익산 유도체는 액상 또는 건조된 형태인 것을 특징으로 하는 리포익산 유도체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 리포익산 유도체를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 피부외용제 조성물은 항산화, 노화방지, 주름완화, 미백, 자극 완화 및 여드름 방지 기능을 지니는 것을 특징으로 하는, 리포익산 유도체를 주요 활성성분으로 함유하는 피부외용제 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 리포익산 유도체는 조성물 전체에 대해서 0.001 - 30.0중량% 함유하는 것을 특징으로 하는, 리포익산 유도체를 주요 활성성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물.
  7. 제4항에 있어서, 상기 피부외용제 조성물은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 팩, 수중유(O/W)형 또는 유중수(W/O)형의 제형의 화장료 조성물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 리포익산-PEG 콘쥬게이트를 주요 활성성분으로 함유하는 화장료 조성물.
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