WO2010095455A1 - 低免疫原性ストレプトアビジンおよびその利用 - Google Patents
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Abstract
Description
(1) 配列番号2に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において、(a)72番目のアミノ酸残基のアルギニンが他のアミノ酸に置換しており、かつ(b)10番目のアミノ酸残基のチロシン、71番目のアミノ酸残基のチロシン、89番目のアミノ酸残基のグルタミン酸、91番目のアミノ酸残基のアルギニン、及び104番目のアミノ酸残基のグルタミン酸の何れか一つ以上が他のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列を含み、野生型ストレプトアビジンと比較して免疫原性が低下している、ストレプトアビジン変異体。
(1)10番目のアミノ酸残基のチロシンがセリン又はトレオニンに置換している変異:
(2)71番目のアミノ酸残基のチロシンがアラニン又はセリンに置換している変異:
(3)72番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異:
(4)89番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換している変異:
(5)91番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異:
(6)104番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がグルタミン又はアスパラギンに置換している変異:
(1)10番目のアミノ酸残基のチロシンがセリン又はトレオニンに置換している変異:
(2)71番目のアミノ酸残基のチロシンがアラニン又はセリンに置換している変異:
(3)72番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異:
(4)89番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換している変異:
(5)91番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異:
(6)104番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がグルタミン又はアスパラギンに置換している変異:
(2)71番目のアミノ酸残基のチロシンがアラニン又はセリンに置換している変異:
(3)72番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異:
(4)89番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換している変異:
(6)104番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がグルタミン又はアスパラギンに置換している変異:
(1)10番目のアミノ酸残基のチロシンがセリン又はトレオニンに置換している変異:
(5)91番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異:
(7) 配列番号2に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において以下の変異の全てを有する、ストレプトアビジン変異体
(1)10番目のアミノ酸残基のチロシンがセリンに置換している変異:
(2)71番目のアミノ酸残基のチロシンがセリンに置換している変異:
(3)72番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異:
(4)89番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換している変異:
(5)91番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異:及び
(6)104番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がグルタミン又はアスパラギンに置換している変異:
(9) (1)から(7)の何れかに記載のストレプトアビジン変異体に抗体を結合させることにより得られる、抗体で標識したストレプトアビジン変異体。
(10) (9)に記載の抗体で標識したストレプトアビジン変異体を含む、治療剤又は診断剤。
(11) (a)(9)に記載の抗体で標識したストレプトアビジン変異体;及び(b)ストレプトアビジンに親和性を有するビオチン又はその誘導体で標識した診断用又は治療用物質:を含む治療又は診断キット。
本発明のストレプトアビジン変異体は、配列番号2に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において、所定のアミノ酸の変異を有し、野生型ストレプトアビジンと比較して免疫原性が低下していることを特徴とする。
(1)10番目のアミノ酸残基のチロシンがセリン又はトレオニンに置換している変異:
(2)71番目のアミノ酸残基のチロシンがアラニン又はセリンに置換している変異:
(3)72番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異:
(4)89番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換している変異:
(5)91番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異:
(6)104番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がグルタミン又はアスパラギンに置換している変異:
配列番号1及び2に記載のコアストレプトアビジンの遺伝子配列及びアミノ酸配列を元に、以下の条件を満たすような変異を有する変異体ストレプトアビジンの配列を検討し、表1に記載の変異を有する変異体ストレプトアビジンを設計した。
(1)抗体との融合タンパク質が、人体内において免疫原性を可能な限り少なくすると予測される配列であること。
(2)ビオチン分子に対する高いアフィニティーを可能な限り維持している配列であること。
表1におけるY83は、配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列における71番目のアミノ酸残基のチロシンに対応する。表1におけるY83Aは、上記チロシンからアラニンへの置換を示し、表1におけるY83Sは、上記チロシンからセリンへの置換を示す。
表1におけるE101は、配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列における89番目のアミノ酸残基のグルタミン酸に対応する。表1におけるE101Dは、上記グルタミン酸からアスパラギン酸への置換を示す。
表1におけるE116は、配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列における104番目のアミノ酸残基のグルタミン酸に対応する。表1におけるE116Nは、上記グルタミン酸からアスパラギンへの置換を示し、表1におけるE116Qは、上記グルタミン酸からグルタミンへの置換を示す。
(1)ワイルドタイプコアストレプトアビジンの塩基配列の合成
配列表の配列番号1に示すコアストレプトアビジンをコードする遺伝子の塩基配列は、人工遺伝子合成(Integrated DNA Technologies社)のサービスを使用した。
上記の配列を鋳型にし、5'端側にHindIIIサイト、3'端側にEcoRIサイトをPCRにより付加する下記のプライマー1及び2を用い、PCR後、制限酵素HindIII、EcoRIにて処理を行った。
プライマー2:CTCGAGGAATTCTTAGCTAGCAGCAGAAGGCTTAAC (配列番号4)
上記のワイルドタイプストレプトアビジン発現ベクターを鋳型とし、SiteーDirected Mutagenesis法により塩基配列の置換によるコドン配列の変更を行いアミノ酸配列の変換を行った。すなわち、変更する塩基配列が、ほぼ中心に来るように長さ28~30ベースの相補的プライマーを設計し、野生型ストレプトアビジン発現ベクターを鋳型としてPCR法を実施した。その後、制限酵素DpnIにて鋳型プラスミドを切断し、大腸菌の形質転換を行った。
Y22S Fw: CACTGGCACCTGGTCGAACCAACTGGGGTC (配列番号5)
Y22T Fw: CACTGGCACCTGGACTAACCAACTGGGGTC (配列番号6)
E101D FW: CGTTGGCGGTGCTGATGCTCGTATCAACAC (配列番号7)
R103K FW: GGTGCTGATGCTAAGATCAACACTCAGTGG (配列番号8)
Y83A FW: GGAAAAACAACGCCCGTAATGCGCACAGCG (配列番号9)
Y83S FW: GGAAAAACAACTCGCGTAATGCGCACAGCG (配列番号10)
R84K FW: GAAAAACAACTATAAGAATGCGCACAGCG (配列番号11)
E116N FW: CATCCGGCACTACCAATGCGAATGCATGG (配列番号12)
E160Q FW: CATCCGGCACTACCCAAGCGAATGCATGG (配列番号13)
野生型ストレプトアビジンおよび変異体ストレプトアビジンの遺伝子配列を組み込んだpPAL7発現ベクターを大腸菌BL21(BIO-RAD社)に常法に従いトランスフェクションを行った。各タンパク質の発現は以下のように実施した。すなわち、大腸菌培養液の細胞密度がOD(600nm)0.5-0.7となるまで37度にて培養を行い、最終濃度1mMになるようにIPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyanoside)を添加し、タンパク質発現を誘導し、20度にて24時間の培養を行った。24時間の培養の後、菌体を遠心分離により細胞を集め、タンパク質精製までマイナス20度で保存した。
組換えタンパク質の精製は、Profinity eXact Protein Purification System (BIO-RAD社製)の方法を用い実施した。BugBuster(Novagen社)を培養容量の1/20添加し細胞の溶解を行った。遠心分離後上清を総可溶性タンパク質とした。回収した可溶性画分は、Profinity eXact Mini Spin Columns(BIO-RAD)の用法容量に従い処理を行った。総可溶性タンパク質、カラム通過画分、洗浄画分、溶出画分を10-20% レディーゲルJ(BIO-RAD社製)を用いてSDS-PAGE電気泳動した。泳動後、タンパク質をSimplyBlue SafeStain(Invitrogen社製)で染色し精製純度の確認を実施した。
カニクイサルに対し、一回に付き1ミリグラムのリコンビナントストレプトアビジン(PIERCE社製)を2週間おきに3回の投与を実施した。投与前採血をDay1としDay8、15、29、36、50、57に実施した(イナリサーチ株式会社)。
(1)ビアコアバイオセンサーを用いたタンパク質とビオチンとの相互作用のカイネティクス分析
ビアコア(登録商標)のバイオセンサーのリガンド(センサーチップへ貼り付ける物質)は、抗マウスIgG抗体(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)とした。一方、アナライト(流路系に流す物質)としてビオチン化されたマウス抗体と各種ストレプトアビジン変異体を調製し、Biacore(登録商標)3000(表面プラズモン共鳴を原理としたバイオセンサー、GEヘルスケアバイオサイエンス社製)による分子間相互作用の分析を行った。抗マウスIgG抗体は、アミンカップリング法によってCM5センサーチップの全てのフローセルに固定化した。各フローセルの固定化量は8000RUであった。次にリファレンス用として非ビオチン化マウス抗体をフローセル1と3へキャプチャーさせ、ビオチン化マウス抗体をフローセル2と4へキャプチャーさせた。各種ストレプトアビジンは1と2または3と4に、流速20マイクロリットル/分で2分間、ランニングバッファー(HBS-EP、GEヘルスケアバイオサイエンス社製)中にロードした。その後、7分間、サンプルの解離をモニターした。その後、10mMグリシン塩酸バッファー、pH1.7(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)にて再生操作を行い繰り返し測定を実施した。得られたセンサーグラムから、解析ソフトウェアBIAevaluation ver.4.1を用い、1:1結合モデルを用いて、反応速度論的解析を行い、結合速度定数(ka)と解離速度定数(kd)を計算した。解離定数(Kd)は、kd/kaから求めた。
ビアコア(登録商標)のバイオセンサーのリガンド(センサーチップへ貼り付ける物質)は、Amine-PEG3-Biotin (Thermo SCIENTIFIC)と各種ストレプトアビジン改変体とした。一方、アナライト(流路系に流す物質)として、ランニングバッファー(HBS-EP、GEヘルスケアバイオサイエンス社製)にて20倍希釈したカニクイサル抗血清を調製し、Biacore(登録商標)3000(表面プラズモン共鳴を原理としたバイオセンサー、GEヘルスケアバイオサイエンス社製)による分子間相互作用の分析を行った。Amine-PEG3-Biotin (Thermo SCIENTIFIC)はアミンカップリング法によってCM5センサーチップの全てのフローセルに固定化した。各フローセルの固定化量の平均は160RUであった。次に、フローセル2はワイルドタイプストレプトアビジン、フローセル3、4それぞれに各種2種類のストレプトアビジン改変体を流し、ビオチンとの結合反応により固定化を行った。フローセル1はリファレンスとした。
Epibase T-cell epitope profiling サービス(Algonomics社)を利用し、野生型ストレプトアビジン、mcSA072、mcSA040、mcSA314、mcSA414 についてインシリコベースで免疫原性(immunogenicity)の解析を実施した(Desmet, (2005), Proteins, 58, 53-69; ES126528)。予測で使用するアロタイプは、Caucasian、Oriental、Indo-European、Afro-American plus West African、Austronesian、Mestizoにおいて出現頻度が30%以上のものを選択した。それぞれのアロタイプについて結晶構造もしくは結晶構造に基づいてモデル化した最も近い構造を用い独自の側鎖の配置方法を含む方法を使用した(Desmet, (2002), Proteins, 48, 31-34)。次に、レセプターとターゲットペプチドとの結合自由エネルギーの計算を実施し、その結合力の強さに基づき抗原性の強さの分類を行った(Kapoerchan, (2009), Mol. Immunol. 47(5), 1091-1097)。
実施例2に従って精製された次の5種類のタンパク質、天然型ストレプトアビジン、mcSA040、mcSA072、mcSA314、mcSA414についてサーマルシフトアッセイを実施した(Vedadi, (2006), Proc Natl Sci USA., 103(43), 15835-15840)。リアルタイムPCR用チューブ(PCR Tube Strip, Flat Cap Strip, BIO-RAD社製)に各試料の最終濃度が次にようになるようにサンプルを調製した。SYPRO Orangeは5000倍希釈、各タンパク質は10μM、バッファーは1x PBS となるようにした。また、タンパク質の熱変性を加速化させる目的で、グアニジン塩酸溶液の濃度が終濃度0M, 0.5M, 1M, 2Mになるように調製した。反応ボリュームは20μlで行った。測定装置はCFX96リアルタイムPCR検出システム(BIO-RAD社製)を用いた。CFX96リアルタイムPCR検出システムのプログラムモードはFRET検出用を使用し、温度上昇は10秒ごとに 0.5 ℃づつ上昇させるプログラムで反応および検出を行った。
(1)ハイブリドーマ細胞からtotal RNAの調製
モノクロナール抗体B5209B(IgG2b)産生ハイブリドーマ細胞として、特開2008-290996号公報に記載されているモノクロナール抗体B5209Bを産生するハイブリドーマを用いた。このモノクロナール抗体B5209Bを産生するハイブリドーマは、受託番号FERM P-21238として、2007年(平成19年)3月2日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東一丁目1番地1 中央第6(郵便番号305-8566))に寄託されており、さらに受託番号FERM BP-10921として、2007年(平成19年)10月16日付で国際寄託に移管された。
B5209B total RNA 5μgを鋳型として、3’ーPrimerとしてマウスIgG2b heavy chain C領域5’端のcDAN配列に基づくprimer (5'-ccaagcttaggggccagtggatagactg-3')(配列番号14)を用い、SuperScript cDNA合成キット(Invitrogen社製)を使用してキットの説明書に従い、1st strand cDNAを合成した。得られた1st strand cDNAにNovagen社Mouse Ig-Primer SetのMuIgVH5'-A primerを加えて、Expand High Fidelity PCR System (Roche Diagnostics社製)を用いて2本鎖cDNAを増幅した。得られた2本鎖cDNAをTAクローニング法によりpGEM-T vector (Promega社製)にサブクローンし、大腸菌DH5αに導入してプラスミド含有ベクターを得た。6クローンに関してプラスミドDNAをQiagen Plasmid Midi Kit (Qiagen社製)で精製し、常法に従って、DNA塩基配列を決定した。抗体の重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列は、配列番号16に記載のアミノ酸配列のうち1番目から122番目までのアミノ酸配列であることが判明した。
モノクロナール抗体B5209B(IgG2b)を含むハイブリドーマ無血清培養上清からProtein Gカラム(GE Healthcare社製)を用いて、付属の説明書に従って抗体の精製を行った。
精製したモノクロナール抗体B5209BをSDS-PAGEを用いて電気泳動を行った。電気泳動ゲルはPVDF膜に転写した後、クマシー染色を行った。染色されたIgG light chainのバンドを切り出しエドマン分解法によりN末端アミノ酸配列(DIQMT)を決定した。
図4に記載の構造を有するB5209B mouse-scFv-mcSA414の発現ベクターを構築した。当該発現ベクター中のB5209B mouse-scFv-SAの塩基配列を配列番号15に記載し、アミノ酸配列を配列番号16に記載する。抗体の重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列は、配列番号16のうちの1番目から122番目のアミノ酸配列に対応し、抗体の軽鎖可変領域(VL)のアミノ酸配列は、配列番号16に記載のアミノ酸配列のうちの142番目から248番目のアミノ酸配列に対応する。
大腸菌BL21(DE3)を形質転換し、アンピシリン50μg/ml含有LBプレート培地にて28℃条件下で20時間程度培養をした。プレートから単一コロニーを釣菌し、アンピシリンアンピシリン50μg/ml含有LB試験培地(3mL)に植菌後、28℃にて18時間程度振盪培養(140 rpm程度)を行った。続いて、アンピシリン50μg/ml含有2xYT培地(1L)前培養液の全量を植え継ぎ、28℃にて振盪培養(125 rpm)した。OD600 = 0.8の時点で終濃度0.5mMのIPTGを添加することで発現誘導を行い、引続き一晩培養をした。
菌体内可用性画分から目的タンパク質を回収し、Ni2+アフィニティーカラムHisTrap HP (GE Healthcare社製)によって粗精製を行った。このとき、50mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 8.0 緩衝液を移動相に用い、50mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 500mM イミダゾール, pH 8.0 緩衝液を用いて段階的に溶出させた(図5)。目的タンパク質溶出画分を回収し、50mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 8.0 緩衝液にて透析後、サイズ排除クロマトグラフィーにより最終精製を行った。使用したカラムはHiLoad 26/60 Superdex 200 (GE Healthcare)、移動相には 50mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 8.0 緩衝液を用いた。最終精製産物について、SDS-PAGEにより確認した。サイズ排除クロマトグラフィーによる最終精製とSDS-PAGEの結果を図6に示す。
(1)ROBO1との結合性
等温滴定型熱量測定(ITC)により、B5209B mouse-scFv-mcSA414とのROBO1との相互作用に関する熱力学的解析を行った。図7には、溶媒にPBSを用い、25℃条件下にてB5209B mouse-scFv-mcSA414(3.7μM)に対し、ROBO1を一定量づつ滴下した時の測定結果を示す。
等温滴定型熱量測定(ITC)により、B5209B mouse-scFv-mcSA414とのBiotinに対する結合活性評価を行った。図8には、溶媒にPBSを用い、25℃条件下にてB5209B mouse-scFv-SA(9μM)に対し、Biotin(90μM)を一定量づつ滴下した時の測定結果を示す。
ここから算出された解離定数は5.6X10-8 (1/M)、エンタルピー変化量(ΔH)は-25.5 kJ/mol、またエントロピー変化量(ΔS)は検出限界以下であった。
示差走査型熱量測定(DSC)により、B5209B mouse-scFv-mcSA414の熱安定性を評価した。そのときの結果を図9に示す。溶媒には。PBSを用いた。B5209B mouse-scFvの熱安定性は50℃付近であることから、B5209B mouse-scFv-SAのscFvドメインの変性温度はTm 51.4℃、1分子の完全変性温度はTm 108℃であると推察される。また、Streptavidin ドメイン4量体解離温度は検出されないことから途中4量体の解離をせずに完全変性にいたっていると推察される。
Claims (11)
- 配列番号2に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において、(a)72番目のアミノ酸残基のアルギニンが他のアミノ酸に置換しており、かつ(b)10番目のアミノ酸残基のチロシン、71番目のアミノ酸残基のチロシン、89番目のアミノ酸残基のグルタミン酸、91番目のアミノ酸残基のアルギニン、及び104番目のアミノ酸残基のグルタミン酸の何れか一つ以上が他のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列を含み、野生型ストレプトアビジンと比較して免疫原性が低下している、ストレプトアビジン変異体。
- 配列番号2に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において、(a)71番目のアミノ酸残基のチロシン及び72番目のアミノ酸残基のアルギニンが他のアミノ酸に置換しており、かつ(b)10番目のアミノ酸残基のチロシン、89番目のアミノ酸残基のグルタミン酸、91番目のアミノ酸残基のアルギニン、104番目のアミノ酸残基のグルタミン酸の何れか一つ以上が他のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のストレプトアビジン変異体。
- 配列番号2に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において以下の何れか1以上の変異を有する、請求項1又は2に記載のストレプトアビジン変異体
(1)10番目のアミノ酸残基のチロシンがセリン又はトレオニンに置換している変異:
(2)71番目のアミノ酸残基のチロシンがアラニン又はセリンに置換している変異:
(3)72番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異:
(4)89番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換している変異:
(5)91番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異:
(6)104番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がグルタミン又はアスパラギンに置換している変異: - 配列番号2に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において以下の何れか1以上の変異を有するアミノ酸配列を含み、野生型ストレプトアビジンと比較して免疫原性が低下している、ストレプトアビジン変異体。
(1)10番目のアミノ酸残基のチロシンがセリン又はトレオニンに置換している変異:
(2)71番目のアミノ酸残基のチロシンがアラニン又はセリンに置換している変異:
(3)72番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異:
(4)89番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換している変異:
(5)91番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異:
(6)104番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がグルタミン又はアスパラギンに置換している変異: - 配列番号2に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において以下の変異を有するアミノ酸配列を含み、野生型ストレプトアビジンと比較して免疫原性が低下している、ストレプトアビジン変異体。
(2)71番目のアミノ酸残基のチロシンがアラニン又はセリンに置換している変異:
(3)72番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異:
(4)89番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換している変異:
(6)104番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がグルタミン又はアスパラギンに置換している変異: - さらに以下の変異を有する、請求項5に記載のストレプトアビジン変異体。
(1)10番目のアミノ酸残基のチロシンがセリン又はトレオニンに置換している変異:
(5)91番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異: - 配列番号2に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において以下の変異の全てを有する、ストレプトアビジン変異体
(1)10番目のアミノ酸残基のチロシンがセリンに置換している変異:
(2)71番目のアミノ酸残基のチロシンがセリンに置換している変異:
(3)72番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異:
(4)89番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換している変異:
(5)91番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異:及び
(6)104番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がグルタミン又はアスパラギンに置換している変異: - 請求項1から7の何れかに記載のストレプトアビジン変異体をコードするDNA。
- 請求項1から7の何れかに記載のストレプトアビジン変異体に抗体を結合させることにより得られる、ストレプトアビジン変異体―抗体結合物。
- 請求項9に記載のストレプトアビジン変異体―抗体結合物を含む、治療剤又は診断剤。
- (a)請求項9に記載のストレプトアビジン変異体―抗体結合物;及び(b)ストレプトアビジンに親和性を有するビオチン又はその誘導体で標識した診断用又は治療用物質:を含む治療又は診断キット。
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