WO2019230905A1 - ハロゲン化したビオチン改変二量体およびその利用 - Google Patents

ハロゲン化したビオチン改変二量体およびその利用 Download PDF

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金井　求
洋平 清水
健三 山次
俊文 巽
児玉　龍彦
暁 杉山
雅信 塚越
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国立大学法人 東京大学
サヴィッド・セラピューティックス株式会社
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    • C07B2200/05—Isotopically modified compounds, e.g. labelled

Definitions

  • the present invention relates to a halogenated biotin-modified dimer and use thereof.
  • the avidin / streptavidin-biotin interaction is widely applied in biochemistry, molecular biology, or medicine. Drug delivery methods and pre-targeting methods combining high binding ability of avidin / streptavidin and biotin and antibody molecules have been devised.
  • Low immunogenic streptavidin is characterized by reduced immunogenicity to the human body, but has a high background for diagnostic applications due to its affinity for biotin that is inherent in the human body. There was a concern that even in the case of therapeutic use, there is a possibility that the drug effect cannot be exhibited specifically for the disease.
  • a streptavidin mutant having a reduced affinity for natural biotin and a biotin variant having a high affinity for the low affinity streptavidin mutant for natural biotin have been reported (International Publication WO2014). / 129446).
  • a streptavidin mutant having a reduced affinity for natural biotin and a biotin-modified dimer having a high affinity for the low affinity streptavidin mutant for natural biotin have been reported (international publication). WO2015 / 125820).
  • the present invention is halogenated to allow imaging diagnostics or therapy by labeling halogen elements in biotin modified dimers with high affinity for low affinity streptavidin variants for natural biotin. Providing a biotin-modified dimer was an issue to be solved. Furthermore, another object of the present invention is to provide a diagnostic kit / treatment kit using a combination of the above-mentioned halogenated biotin-modified dimer and a streptavidin mutant.
  • the present inventor has intensively studied to solve the above problems and succeeded in introducing a halogen element into a biotin-modified dimer described in International Publication WO2015 / 125820.
  • the obtained halogenated biotin-modified dimer was confirmed to bind with high affinity to the low-affinity streptavidin mutant with respect to natural biotin, and the present invention was completed.
  • a compound represented by the following formula (1) or a salt thereof (Where X1a, X1b, X2a and X2b each independently represent O or NH; Y 1 and Y 2 each independently represent C or S; Z 1 and Z 2 each independently represent O, S or NH; V 1 and V 2 each independently represent S or S + —O — , n 1 and n 2 each independently represent an integer of 0 or 1, L 1 , L 2 , and L 3 each independently represent a divalent linking group, L 4 represents a trivalent linking group, Hal represents a halogen element, p represents an integer of 1 to 5. )
  • X1a, X1b, X2a and X2b represents NH
  • Y 1 and Y 2 represents a C
  • V 1 and V 2 represent S.
  • L 1 , L 2 , and L 3 are each independently —CONH—, —NHCO—, —COO—, —OCO—, —CO—, —O—, and an alkylene group having 1 to 10 carbon atoms.
  • L 1 represents — (CH 2 ) m1 -L 11 — (CH 2 ) m2 -L 12 — *
  • L 2 represents * -L 13 — (CH 2 ) m3 —L 14 — (CH 2 ) m4 —
  • L 3 represents L 15 -L 21 -L 16-
  • L 11 , L 12 , L 13 , L 14 , L 15 , and L 16 are each independently —CONH—, —NHCO—, —COO—, —OCO—, —CO—, or —O—.
  • kits for treatment or diagnosis comprising: a streptavidin variant-molecular probe conjugate.
  • halogenated biotin-modified dimer according to the present invention and a kit containing the same are useful in diagnostic methods and therapeutic methods based on the pretargeting method.
  • FIG. 1 shows an outline of the domain structure.
  • FIG. 2 shows an SDS-PAGE electrophoresis CBB-stained image of CEA-V2122.
  • FIG. 3 shows the HER2-V2122 structural diagram.
  • FIG. 4 shows an SDS-PAGE electrophoresis CBB-stained image of HER2-V2122.
  • FIG. 5 shows the result of confirming the binding complex of Psyche B astatine labeled body and Herceptin-Cupid with magnetic beads.
  • FIG. 6 shows the result of confirming the binding complex of Psyche B astatine labeled body and Herceptin-Cupid using ovarian cancer cell SKOV3.
  • Halogenated biotin-modified dimer The present invention is a compound represented by the following formula (1) or a salt thereof, preferably the following formula (1a), the following formula (1b), the following formula (2), Or it is a compound or its salt shown by following formula (3).
  • the compounds of the present invention are also referred to as “halogenated biotin modified dimers”.
  • X1a, X1b, X2a and X2b each independently represent O or NH; Y 1 and Y 2 each independently represent C or S; Z 1 and Z 2 each independently represent O, S or NH; V 1 and V 2 each independently represent S or S + —O — , n 1 and n 2 each independently represent an integer of 0 or 1, L 1 , L 2 , and L 3 each independently represent a divalent linking group, L 4 represents a trivalent linking group, Hal represents a halogen element, p represents an integer of 1 to 5. )
  • Formula (1) Formula (1a), Formula (1b), Formula (2), and Formula (3), the following structure: The part represented by However, it is not limited to these.
  • X1a, X1b it is preferable that X2a and X2b represents a NH, it is preferred that Y 1 and Y 2 represents a C, Z 1 and Z 2 preferably exhibit NH, V 1 and V 2 is the S It is preferable.
  • L 1 , L 2 , and L 3 are each independently selected from —CONH—, —NHCO—, —COO—, —OCO—, —CO—, —O—, and an alkylene group having 1 to 10 carbon atoms. It is preferable that it is a bivalent coupling group which consists of a combination of these groups.
  • L 1 , L 2 , and L 3 are each independently a divalent linking group comprising a combination of groups selected from —CONH—, —NHCO—, —O—, and an alkylene group having 1 to 10 carbon atoms. Preferably there is.
  • L 1 and L 2 are preferably each independently a divalent linking group comprising a combination of groups selected from —CONH—, —NHCO—, and an alkylene group having 1 to 10 carbon atoms.
  • L 1 preferably represents — (CH 2 ) m1 -L 11 — (CH 2 ) m2 -L 12 — *, and L 2 represents * —L 13 — (CH 2 ) m3 —L 14 — (CH 2 ) preferably represents m4- , and L 3 preferably represents L 15 -L 21 -L 16- .
  • L 11 , L 12 , L 13 , L 14 , L 15 , and L 16 each independently represent —CONH—, —NHCO—, —COO—, —OCO—, —CO—, or —O—.
  • L 11 and L 12 are preferably —CONH—, —NHCO— or —O—.
  • L 11 is —O— and L 12 is —NHCO—.
  • L 13 and L 14 are preferably —NHCO—, —CONH— or —O—.
  • L 13 is —CONH— and L 14 is —O—.
  • L 15 is preferably —CONH— or a single bond.
  • L 16 is preferably —NHCO—.
  • m 1 , m 2 , m 3 and m 4 each independently represents an integer of 1 to 10, preferably an integer of 2 to 10, more preferably an integer of 2 to 8, more preferably an integer of 2 to 6. Show. ⁇ indicates the binding position of the L 4,
  • L 21 preferably represents — (CH 2 ) 2 — (O (CH 2 ) 2 ) m5 —.
  • m 5 represents an integer of 1 to 10, preferably an integer of 1 to 6, more preferably an integer of 1 to 4.
  • L 4 represents a trivalent linking group, preferably Or (Trivalent linking group or nitrogen atom derived from benzene).
  • halogen element represented by Hal examples include fluorine (F), chlorine (Cl), bromine (Br), iodine (I), astatine (At), tennessine (Ts), and isotopes thereof. Preferred are iodine, astatine and their isotopes.
  • the halogen element include 123 I, 124 I, 125 I, 131 I, 210 At, 211 At, and the like. Among these, I, 123 I, 124 I, 125 I, 131 I, and 211 At are preferable.
  • P represents an integer of 1 to 5, preferably an integer of 1 to 3, particularly preferably 1.
  • the halogenated biotin-modified dimer of the present invention is prepared by using N-Bromo-succinimide or N-Iodo-succinimide methanol and acetic acid as described in the examples below. To the mixed solution, sodium halide (sodium iodide, Na 125 I, etc.) or halogen ( 211 At) dissolved in methanol was added and stirred, and then the compound represented by the following formula (A) dissolved in methanol was added. Can be produced by reacting with each other.
  • the amount of N-Bromo-succinimide or N-Iodo-succinimide added is preferably 0.1 to 1.0 equivalent, more preferably 0.1 to 0.5 equivalent, still more preferably 0.1 to 1.0 equivalent. 0.3 equivalents.
  • the addition amount of N-Bromo-succinimide or N-Iodo-succinimide is preferably larger than the addition amount (equivalent) of sodium halide or halogen, but the addition amount of N-Bromo-succinimide or N-Iodo-succinimide If the amount is too large, the compound represented by the formula (A) may be decomposed.
  • biotin halide-modified dimer of the present invention is prepared by adding Tetrakis (pyridine) copper (II) triflate to a mixed solution of the compound represented by the following (B) in methanol and acetonitrile, as described in Examples below.
  • the addition amount is preferably 1 to 10 equivalents, more preferably 2 to 8 equivalents) and 3,4,7,8-Tetramethyl-1,10-phenanthroline (the addition amount is preferably 1 to 10 equivalents) Yes, more preferably 2 to 8 equivalents) and sodium halide is added and reacted.
  • halogenated biotin-modified dimer According to the present invention, there is provided a therapeutic or diagnostic agent in which the halogenated biotin-modified dimer of the present invention is combined with a streptavidin mutant-molecular probe conjugate. Is done.
  • the streptavidin mutant described in International Publication WO2014 / 129446 and International Publication WO2015 / 125820 can be used.
  • the streptavidin variant V2122 described in Example 3 of International Publication WO2015 / 125820 (SEQ ID NO: 4 of International Publication WO2015 / 125820) can be used.
  • molecular probes examples include antibodies, peptides, nucleic acids, aptamers, and the like. Specifically, antibodies, peptides, nucleic acids, aptamers, etc. that target the following antigens that are specifically expressed in cancer can be used. it can.
  • coli Shiga toxin type 1 E. coli Shiga toxin type 2, EGFL7, EGFR, endotoxin, EpCAM, episialin, ERBB3, Escherichia coli, Respiratory syncytial virus F protein, FAP, fibrin II ⁇ chain, fibronectin extra domain-B, folate receptor 1, Frizzled receptor, GD2, GD3 ganglioside, GMCSF receptor ⁇ chain, GPNMB, Hepatitis B surface antigen, Hepatitis B virus, HER1, HER2 / neu, HER3, HGF, HIV-1, HLA-DR ⁇ , HNGF, Hsp90, human ⁇ amyloid, human scatter factor Body kinase, human TNF, ICAM-1 (CD54), IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , IgE, IgE Fc region, IGF-1 receptor, IGF-I, IgG4, IGHE, IL-1 ⁇ , IL-12, IL -13,
  • the streptavidin mutant By preparing a fusion of a molecular probe such as a cancer antigen-specific antibody molecule and a streptavidin mutant and administering it to a patient, the streptavidin mutant can be accumulated specifically in cancer cells.
  • the halogenated biotin-modified dimer of the present invention having an affinity for the above-mentioned streptavidin mutant, it becomes possible to accumulate the halogen in cancer cells accurately.
  • antibody production is suppressed due to low immunogenicity, and early clearance from the body and shock such as anaphylaxis due to antibodies can be prevented.
  • the present invention by using it as an in vitro diagnostic agent or clinical test agent using tissue, serum or the like collected from a patient, noise derived from biotin or biotin-binding protein present in the tissue, serum or the like is reduced, and more S Diagnosis and inspection with high / N ratio becomes possible.
  • a conjugate of a fusion of a molecular probe such as a cancer antigen-specific antibody molecule and a streptavidin mutant and the halogenated biotin-modified dimer of the present invention is prepared,
  • the conjugate can also be administered to a patient.
  • antibody can be used as the antibody to be bound to the streptavidin variant. Both polyclonal and monoclonal antibodies can be used. Although subclass of the antibody is not particularly limited, preferably IgG, particularly IgG 1 is suitably used. “Antibody” includes all modified antibodies and antibody fragments. Humanized antibodies, humanized antibodies, human antibodies, antibodies derived from various animals such as mice, rabbits, rats, guinea pigs, monkeys, chimeric antibodies of human antibodies and antibodies derived from various animals, diabody, scFv, Fd, Fab, Fab ′, F (ab) ′ 2 may be mentioned, but is not limited thereto.
  • a conjugate of a streptavidin variant and an antibody can be obtained using methods known to those skilled in the art. For example, it can be obtained by a chemical binding method (US5, 608, 060), or by ligating DNA encoding a streptavidin variant and DNA encoding an antibody, and expressing it in a host cell using an expression vector or the like, It can also be obtained as a fusion protein.
  • the DNA encoding the streptavidin variant and the DNA encoding the antibody may be linked via DNA encoding an appropriate peptide called a linker. It is desirable that the streptavidin variant-antibody conjugate is produced while leaving the specific binding force between the antibody and the target molecule.
  • Reverse phase high performance liquid chromatography was performed using JASCO-HPLC system. Detection was performed using ultraviolet light of 254 nm, and the mobile phase was a gradient solvent system (acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid MQ solution or 0.1% formic acid MQ solution).
  • the analysis was performed using a YMC-Triart-C18 (150 mm ⁇ 4.6 mm mm I.D.) column at a flow rate of 1 mL / min.
  • the fractionation was performed using a YMC-Triart-C18 column (250 mm ⁇ 10 mm mm I.D. or 150 mm ⁇ 4.6 mm mm I.D.) with a flow rate of 6.3 ⁇ mL / min in the former and 1 ⁇ mL / min in the latter.
  • Example 2 (1) 2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl 3- (4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl) benzoate 3- (4,4,5,5-Tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl) benzoic acid in dichloromethane (3 ml) and triethylamine (26 ⁇ l, 188 ⁇ mol) in a mixed solution of N-Hydroxysuccinimide ( 21.4 mg, 188 ⁇ mol) and 1- (3-Dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide Hydrochloride (36 mg, 188 ⁇ mol) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 4 hours in an argon atmosphere.
  • N-Hydroxysuccinimide 21.4 mg, 188 ⁇ mol
  • the title compound 4 is also referred to as PsycheB-iodine.
  • Di-tert-butyl dicarbonate (4.26 g, 20.5 mmol) was added to a 1,4-dioxane (20 ml) solution of the crude product 10 at room temperature, and 1M NaOH aqueous solution (20 ml) was added under ice cooling. . The mixture was stirred at room temperature for 15 hours under an argon atmosphere. After the solvent was removed under reduced pressure, 1M aqueous HCl was added, the mixture was extracted with ethyl acetate, and the organic layer was washed with saturated brine. After drying with sodium sulfate, the solvent was removed under reduced pressure.
  • the target compound 19 (9.6 mg, soot yield 49%) was obtained.
  • V2122 is a streptavidin variant described in Example 3 of International Publication WO2015 / 125820 (SEQ ID NO: 4 of International Publication WO2015 / 125820).
  • the amino acid sequence of V2122 (sequence having a 6 ⁇ His tag at the C-terminus) is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • ScFv-V2122 is obtained by binding a single chain antibody (scFv) against CEACAM5 to V2122 described above.
  • This scFv-type anti-CEACAM5 antibody has the scFv sequence described in Patent Document US7626011B2.
  • the amino acid sequence of the scFv-type anti-CEACAM5 antibody is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence of CEA-V2122 obtained by binding scFv-type anti-CEACAM5 antibody and V2122 with an amino acid linker (GGGGSGGGG) (SEQ ID NO: 11) is shown in SEQ ID NO: 3 of the sequence listing.
  • the pelB signal for secretory expression in E. coli was optimized at the N-terminus, and the DNA codon of the CEA-V2122 gene sequence incorporating the 6xHis-Tag sequence at the C-terminus was optimized in E. coli.
  • Artificial gene synthesis was performed. This amino acid sequence is described in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, and the DNA sequence is described in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing. An outline of the domain structure is shown in FIG.
  • a vector in which the chaperone skp gene was incorporated into MCS2 of the pETDuet1 vector was used.
  • the skp gene was synthesized from an artificial gene of DNA whose codon was optimized for Escherichia coli based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing.
  • the synthesized skp gene was amplified by PCR using primers (AAGGAGATATACATATGGATAAAATTGCCATTGTTAATAT (SEQ ID NO: 12), TTGAGATCTGCCATATGTTATTTCACTTGTTTCAGAACG (SEQ ID NO: 13)), and in-Fusion KitCHD in pETDue1 vector MCS2 linearized with the restriction enzyme NdeI And was cloned into pETDuet_skp.
  • the CEA-V2122 gene was incorporated into MCS1 of pETDuet_skp.
  • the artificially synthesized CEA-V2122 gene was amplified by PCR using primers (AGAAGGAGATATACCATGAAATATCTGCTGCCGAC (SEQ ID NO: 14), CGCCGAGCTCGAATTTTAATGATGGTGATGATGATG (SEQ ID NO: 15)). Further, pETDuet_skp was linearized by PCR using primers (GGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC (SEQ ID NO: 16), AATTCGAGCTCGGCGCGCCTGCAG (SEQ ID NO: 17)). PCR-amplified CEA-V2122 and linearized pETDuet_skp were cloned using In-Fusion HD Cloning Kit. The cloned vector was confirmed as a gene sequence incorporated by sequencing and named pETDuet_CEA-V2122_skp.
  • CEA-V2122 protein was roughly purified by a batch method using 6xHis-Tag added to the C-terminus. Specifically, cOmplete His-Tag Purification Resin ⁇ ⁇ equilibrated with buffer A (50 mM TrisHCl, 0.2 M NaCl, 1 mM ED TA, 5 mM Imidazole, pH 8.0) was added to the culture supernatant stored at 4 ° C, and 2 The protein was combined with the resin by stirring at 4 ° C overnight from time. Next, the resin was recovered in a column, and 20 column volumes of washing work was performed with buffer A. Thereafter, the crude product of CEA-V2122 was recovered by elution with buffer B (50 mM TrisHCl, 0.2 M NaCl, 1 mM EDTA, 400 mM Imidazol, pH 8.0).
  • buffer B 50 mM TrisHCl, 0.2 M NaCl, 1 mM EDTA, 400 mM Imidazol
  • the crude purified product was purified by a Protein L column. Specifically, 1 mL of Capto L (GE Healthcare Life Sciences) is packed in a PD-10 column, equilibrated with 10 column volumes of PBS, the above-described crude product is applied, washed with 10 column volumes of PBS, Elution was performed with 10 mM glycine hydrochloride pH 2.0, and centrifugal concentration was performed using Vivaspin Turbo 15 (MWCO 100,000). Further, the buffer was replaced with PBS using PD-10 (GE Healthcare Life Sciences), and further concentrated by centrifugation with Vivaspin Turbo 4 (MWCO 100,000) to obtain a final purified product.
  • FIG. 2 shows the result of the purity test of tetramer CEA-V2122 by SDS-PAGE electrophoresis and CBB staining.
  • SDS-PAGE gel was Mini-PROTEAN TGX 4-15% (Bio-Rad), and CBB staining solution was Bullet CBB Stain One (Ready To Use) (Nacalai Tesque). From FIG. 2, it was confirmed that the purified CEA-V2122 is a main component of a tetramer of about 150 kDa.
  • V2122 is a streptavidin variant described in Example 3 of International Publication WO2015 / 125820 (SEQ ID NO: 4 of International Publication WO2015 / 125820).
  • the amino acid sequence of V2122 is set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • scFv-V2122 is obtained by binding a single chain antibody (scFv) against HER2 (ERBB2) to the above-mentioned V2122.
  • scFv type anti-HER2 antibody is Zhang H, et al., Therapeutic potential of an anti-HER2 single chain antibody-DM1 conjugates for the treatment of HER2-positive cancer.Signal Transduct Target Ther.
  • FIG. 3 shows a structural diagram of HER2-V2122 in which an scFv-type anti-HER2 antibody and V2122 are bound by an amino acid linker (GGGGGSGGGGG) (SEQ ID NO: 18), and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing.
  • the pelB signal for secretory expression in E. coli was optimized at the N-terminus, and the DNA codon of the HER2-V2122 gene sequence incorporating the 6xHis-Tag sequence at the C-terminus was optimized in E. coli. Artificial gene synthesis was performed. This amino acid sequence is described in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing, and the DNA sequence is described in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing.
  • a vector in which the chaperone skp gene was incorporated into MCS2 of the pETDuet1 vector was used.
  • the skp gene was synthesized from an artificial gene of DNA whose codon was optimized for Escherichia coli based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing.
  • the synthesized skp gene was amplified by PCR using primers (AAGGAGATATACATATGGATAAAATTGCCATTGTTAATAT (SEQ ID NO: 12), TTGAGATCTGCCATATGTTATTTCACTTGTTTCAGAACG (SEQ ID NO: 13)), and in-Fusion KitCHD in pETDue1 vector MCS2 linearized with the restriction enzyme NdeI And was cloned into pETDuet_skp.
  • the HER2-V2122 gene was incorporated into MCS1 of pETDuet_skp.
  • the artificially synthesized HER2-V2122 gene was amplified by PCR using primers (AGAAGGAGATATACCATGAAATATCTGCTGCCGAC (SEQ ID NO: 14), CGCCGAGCTCGAATTTTAATGATGGTGATGATGATG (SEQ ID NO: 15)). Further, pETDuet_skp was linearized by PCR using primers (GGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC (SEQ ID NO: 16), AATTCGAGCTCGGCGCGCCTGCAG (SEQ ID NO: 17)). PCR-amplified CEA-V2122 and linearized pETDuet_skp were cloned using In-Fusion HD Cloning Kit. The cloned vector was confirmed to be a gene sequence incorporated by sequencing, and named pETDuet_HER-V2122_skp.
  • HER2-V2122 protein was roughly purified by a batch method using 6xHis-Tag added to the C-terminus. Specifically, cOmplete His-Tag Purification Resin ⁇ ⁇ equilibrated with buffer A (50 mM TrisHCl, 0.2 M NaCl, 1 mM ED TA, 5 mM Imidazole, pH 8.0) was added to the culture supernatant stored at 4 ° C, and 2 The protein was combined with the resin by stirring at 4 ° C overnight from time. Next, the resin was recovered in a column, and 20 column volumes of washing work was performed with buffer A.
  • buffer A 50 mM TrisHCl, 0.2 M NaCl, 1 mM ED TA, 5 mM Imidazole, pH 8.0
  • buffer B 50 mM TrisHCl, 0.2 M NaCl, 1 mM EDTA, 400 mM Imidazol, pH 8.0
  • a crude product of HER2-V2122 was recovered.
  • the crude purified product was purified by a Protein L column. Specifically, 1 mL of Capto L (GE Healthcare) is packed into a PD-10 column, equilibrated with 10 column volumes of PBS, the above crude product is applied, washed with 10 column volumes of PBS, and then 10 mM. Elution was performed with glycine hydrochloride pH2.0, and centrifugal concentration was performed using Vivaspin Turbo 15 (MWCO 100,000). Furthermore, the buffer was replaced with PBS using PD-10 (GE Healthcare), and further concentrated by centrifugation with Vivaspin Turbo 4 (MWCO 100,000) to obtain the final purified product.
  • FIG. 4 shows the results of the purity test of the tetramer HER2-V2122 by CBB staining on the purified product.
  • the SDS-PAGE gel was Mini-PROTEAN TGX 4-15% (Bio-Rad), and the CBB staining solution was Bullet CBB Stain One (Ready To Use) (Nacalai Tesque). It was confirmed from FIG. 4 that the purified HER2-V2122 is a main component of a tetramer of about 150 kDa.
  • Test Example 1 Affinity analysis of CEA-V2122 and Psyche B-iodine and Psyche P-iodine Affinity data acquisition of CEA-V2122 and Psyche B-iodine and Psyche P-iodine was obtained from Japanese Patent Application No. 2018-247363. Performed as described. Briefly, using an amine coupling kit (GE Healthcare Life Sciences), set the sensor chip CM5 (GE Healthcare Life Sciences) to a target value of 5000RU, and immobilize the purified CEA-V2122. I did it. The concentration of the analyte was 5 types of 2-fold dilution series from 1E-08 M to 6.25E-10 M.
  • Test Example 2 Confirmation of Binding Complex between Psyche B Astatine Label and Herceptin-Cupid Using Magnetic Beads To confirm whether astatine-labeled Psyche B has the ability to bind Cupid, Herceptin-Cupid and Herceptin- Binding assay was performed using Ni-NTA magnetic beads (Thermo) that bind to the 6xHis tag attached to Cupid. Psyche B-At211 used here was prepared according to (1) of Example 1, and Herceptin-Cupid was prepared according to the method described in Japanese Patent Application No. 2018-247363 as described above. The specific assay method is as follows.
  • Test Example 3 Confirmation of binding complex between Psyche B astatine-labeled compound and Herceptin-Cupid using ovarian cancer cell SKOV3 Astatine-labeled Psyche B has binding ability to Herceptin-V2122 previously bound to HER2-positive SKOV3 cells It was confirmed whether it had. Moreover, CEA-V2122 was used as a negative control. Psyche B-At211 used here was prepared according to Example 1 (4), and Herceptin-V2122 and CEA-V2122 were prepared according to the method described in Japanese Patent Application No. 2018-247363 as described above. The specific assay method is as follows.
  • SEQ ID NO: 2 (sm3E-scFv sequence) QVKLEQSGAEVVKPGASVKLSCKASGFNIKDSYMHWLRQGPGQRLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATFTTDTSANTAYLGLSSLRPEDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSGGGGGSQGGSGGGGSENKLTQSPSSMSVSVGDRVNIACSASSSTPYMHQ

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Abstract

本発明の課題は、天然ビオチンに対する低親和性のストレプトアビジン変異体に対して高い親和性を有するビオチン改変二量体においてハロゲン元素を標識することにより、イメージング診断または治療を可能にするようなハロゲン化したビオチン改変二量体を提供することである。本発明によれば、下記式（１）で示される化合物又はその塩が提供される。（式中の各記号の意味は、本明細書に記載の通りである）。

Description

ハロゲン化したビオチン改変二量体およびその利用
　本発明は、ハロゲン化したビオチン改変二量体およびその利用に関する。
　アビジンとビオチン、あるいはストレプトアビジンとビオチンの間の親和性は非常に高く（Kd=10-15 から10-14M）、生体二分子間の相互作用としては、最も強い相互作用の一つである。現在、アビジン／ストレプトアビジン - ビオチン相互作用は、生化学、分子生物学、あるいは医学の分野で広く応用されている。アビジン／ストレプトアビジンとビオチンの高い結合能と抗体分子とを組み合わせたドラッグデリバリーの方法、プレターゲティング法が考案されている。
　ニワトリ由来のアビジンや微生物由来のストレプトアビジンは人体に対し高い免疫原性を示すため、人体に投与後、早期に抗アビジン／ストレプトアビジン抗体が産生されることが問題となりプレターゲティング法の実用化を妨げている原因の１つとなっている。この問題を解決するための低免疫原性ストレプトアビジンが報告されている（国際公開ＷＯ２０１０／０９５４５５）。
　低免疫原性ストレプトアビジンは、人体に対する免疫原性が低下しているという特徴を有するものであるが、人体に内在するビオチンに対する親和性を有するため、診断用途の場合にはバックグラウンドが高くなるという問題や、治療用途の場合にも疾患に特異的に薬効を発揮できない可能性があるという懸念があった。
　そこで、天然ビオチンに対する親和性を低減させたストレプトアビジン変異体、並びにこの天然ビオチンに対する低親和性のストレプトアビジン変異体に対して高い親和性を有するビオチン改変体が報告されれている（国際公開ＷＯ２０１４／１２９４４６）。また、天然ビオチンに対する親和性を低減させたストレプトアビジン変異体、並びにこの天然ビオチンに対する低親和性のストレプトアビジン変異体に対して高い親和性を有するビオチン改変二量体が報告されている（国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０）。
国際公開ＷＯ２０１０／０９５４５５ 国際公開ＷＯ２０１４／１２９４４６ 国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０
　本発明は、天然ビオチンに対する低親和性のストレプトアビジン変異体に対して高い親和性を有するビオチン改変二量体においてハロゲン元素を標識することにより、イメージング診断または治療を可能にするようなハロゲン化したビオチン改変二量体を提供することを解決すべき課題とした。更に本発明は、上記ハロゲン化したビオチン改変二量体と、ストレプトアビジン変異体との組み合わせを用いた診断キット・治療キットを提供することを解決すべき課題とした。
　本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討し、国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０に記載されたビオチン改変二量体にハロゲン元素を導入することに成功した。そして、得られたハロゲン化したビオチン改変二量体が、天然ビオチンに対する低親和性のストレプトアビジン変異体に対して高い親和性で結合することを確認し、本願発明を完成するに至った。
　即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］　下記式（１）で示される化合物又はその塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （式中、
Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ及びＸ２ｂはそれぞれ独立にＯ又はＮＨを示し、
Ｙ１及びＹ２はそれぞれ独立にＣ又はＳを示し、
Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立にＯ、Ｓ又はＮＨを示し、
Ｖ１及びＶ２はそれぞれ独立にＳ又はＳ＋－Ｏ－を示し、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立に０又は１の整数を示し、
Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３はそれぞれ独立に、２価の連結基を示し、
Ｌ４は、３価の連結基を示し、
Ｈａｌは、ハロゲン元素を示し、
ｐは１～５の整数を示す。）
［２］　式（１）で示される化合物が、下記式（１ａ）又は下記式（１ｂ）で示される化合物である、［１］に記載の化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （式中の各記号の意味は［１］と同義である。）
［３］　ｎ１及びｎ２が０である、下記式（２）又は下記式（３）で示される、［１］又は［２］に記載の化合物又はその塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （式中の各記号の意味は［１］と同義である。）
［４］　Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ及びＸ２ｂがＮＨを示し、Ｙ１及びＹ２がＣを示し、
Ｚ１及びＺ２がＮＨを示し、Ｖ１及びＶ２がＳを示す、［１］から［３］の何れか一に記載の化合物又はその塩。
［５］　Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３がそれぞれ独立に、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、－ＣＯＯ－、－ＯＣＯ―、－ＣＯ－、－Ｏ－、及び炭素数１から１０のアルキレン基から選択される基の組み合わせからなる２価の連結基である、［１］から［４］の何れか一に記載の化合物又はその塩。
［６］　Ｌ１が、－（ＣＨ２）ｍ１－Ｌ１１－（ＣＨ２）ｍ２－Ｌ１２－※を示し、
Ｌ２が、※－Ｌ１３－（ＣＨ２）ｍ３－Ｌ１４－（ＣＨ２）ｍ４－を示し、
Ｌ３が、Ｌ１５－Ｌ２１－Ｌ１６－を示す、
ここで、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１３、Ｌ１４、Ｌ１５、及びＬ１６はそれぞれ独立に、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、－ＣＯＯ－、－ＯＣＯ―、－ＣＯ－又は－Ｏ―を示し、
ｍ１、ｍ２、ｍ３、及びｍ４はそれぞれ独立に１から１０の整数を示し、
※はベンゼン環との結合位置を示し、
Ｌ２１は、－ＣＨ２－（ＯＣＨ２）ｍ５－を示し、ｍ５は１から１０の整数を示す、［１］から［５］の何れか一に記載の化合物又はその塩。
［７］　Ｈａｌが、Ｉ、１２５Ｉ、又は２１１Ａｔである、［１］から［６］の何れか一に記載の化合物又はその塩。
［８］　ｐが１である、［１］から［７］の何れか一に記載の化合物又はその塩。
［９］　以下の何れかの化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
［１０］　（１）［１］から［９］の何れか一に記載の化合物；及び（ｂ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含むストレプトアビジン変異体に分子プローブを結合させることにより得られる、ストレプトアビジン変異体－分子プローブ結合物：を含む治療又は診断のためのキット。
［１１］　下記式（Ａ）で表される化合物と、ハロゲン化ナトリウム又はハロゲンとを反応させることを含む、［１］から［９］の何れか一に記載の化合物又はその塩の製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 （式中の各記号の意味は［１］と同義である。）
［１２］　下記式（Ｂ）で表される化合物と、ハロゲン化ナトリウム又はハロゲンとを反応させることを含む、［１］から［９］の何れか一に記載の化合物又はその塩の製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 （式中の各記号の意味は［１］と同義である。）
　本発明によるハロゲン化したビオチン改変二量体及びそれを含むキットは、プレターゲティング法に基づく診断法・治療法において有用である。
図１は、ドメイン構造の概略を示す。 図２は、CEA-V2122のSDS-PAGE泳動CBB 染色像を示す。 図３は、HER2-V2122構造図を示す。 図４は、HER2-V2122のSDS-PAGE泳動CBB 染色像を示す。 図５は、磁気ビーズによりPsyche Bアスタチン標識体とHerceptin-Cupidとの結合複合体を確認した結果を示す。 図６は、卵巣癌細胞SKOV3を用いてPsyche Bアスタチン標識体とHerceptin-Cupidとの結合複合体を確認した結果を示す。
　以下、本発明について更に詳細に説明する。
（１）ハロゲン化したビオチン改変二量体
　本発明は、下記式（１）で示される化合物又はその塩であり、好ましくは下記式（１ａ）、下記式（１ｂ）、下記式（２）、又は下記式（３）で示される化合物又はその塩である。本発明の化合物は、「ハロゲン化ビオチン改変二量体」とも称する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
（式中、
Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ及びＸ２ｂはそれぞれ独立にＯ又はＮＨを示し、
Ｙ１及びＹ２はそれぞれ独立にＣ又はＳを示し、
Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立にＯ、Ｓ又はＮＨを示し、
Ｖ１及びＶ２はそれぞれ独立にＳ又はＳ＋－Ｏ－を示し、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立に０又は１の整数を示し、
Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３はそれぞれ独立に、２価の連結基を示し、
Ｌ４は、３価の連結基を示し、
Ｈａｌは、ハロゲン元素を示し、
ｐは１～５の整数を示す。）
　式（１）、式（１ａ）、式（１ｂ）、式（２）、式（３）において、下記構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 で示される部分は好ましくは、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 の何れかであるが、これらに限定はされない。
　Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ及びＸ２ｂがＮＨを示すことが好ましく、Ｙ１及びＹ２がＣを示すことが好ましく、Ｚ１及びＺ２がＮＨを示すことが好ましく、Ｖ１及びＶ２がＳを示すことが好ましい。
　Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３はそれぞれ独立に、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、－ＣＯＯ－、－ＯＣＯ―、－ＣＯ－、－Ｏ－、及び炭素数１から１０のアルキレン基から選択される基の組み合わせからなる２価の連結基であることが好ましい。
　Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３はそれぞれ独立に、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、－Ｏ－、及び炭素数１から１０のアルキレン基から選択される基の組み合わせからなる２価の連結基であることが好ましい。
　Ｌ１、及びＬ２はそれぞれ独立に、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、及び炭素数１から１０のアルキレン基から選択される基の組み合わせからなる２価の連結基であることが好ましい。
　Ｌ１は、－（ＣＨ２）ｍ１－Ｌ１１－（ＣＨ２）ｍ２－Ｌ１２－※を示すことが好ましく、Ｌ２は、※－Ｌ１３－（ＣＨ２）ｍ３－Ｌ１４－（ＣＨ２）ｍ４－を示すことが好ましく、Ｌ３は、Ｌ１５－Ｌ２１－Ｌ１６－を示すことが好ましい。
　Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１３、Ｌ１４、Ｌ１５、及びＬ１６はそれぞれ独立に、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、－ＣＯＯ－、－ＯＣＯ―、－ＣＯ－又は－Ｏ―を示す。
　Ｌ１１、及びＬ１２は、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－又は－Ｏ―であることが好ましい。特に好ましくは、Ｌ１１が－Ｏ―であり、Ｌ１２が－ＮＨＣＯ－である。
　Ｌ１３、及びＬ１４は、－ＮＨＣＯ－、－ＣＯＮＨ－又は－Ｏ―であることが好ましい。特に好ましくは、Ｌ１３が－ＣＯＮＨ－であり、Ｌ１４が－Ｏ―である。
　Ｌ１５は、－ＣＯＮＨ－、又は単結合であることが好ましい。
　Ｌ１６は、－ＮＨＣＯ－であることが好ましい。
　ｍ１、ｍ２、ｍ３、及びｍ４はそれぞれ独立に１から１０の整数を示し、好ましくは２から１０の整数、より好ましくは２から８の整数、より好ましくは２から６の整数を示す。
　※はＬ４との結合位置を示し、
　Ｌ２１は、好ましくは、－（ＣＨ２）２－（Ｏ（ＣＨ２）２）ｍ５－を示す。
　ｍ５は１から１０の整数を示し、好ましくは１から６の整数、より好ましくは１から４の整数を示す。
　Ｌ４は、３価の連結基を示し、好ましくは、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 又は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 である（ベンゼンに由来する３価の連結基または窒素原子）。
　Ｈａｌで表されるハロゲン元素としては、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、ヨウ素（Ｉ）、アスタチン（Ａｔ）、テネシン（Ｔｓ）及びその同位体を挙げることができるが、好ましくはヨウ素、アスタチン及びその同位体である。ハロゲン元素としては、123I、124I、125Ｉ、131I、２１０Ａｔ、２１１Ａｔなどが挙げられる。上記の中でも、Ｉ、123Ｉ、124Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、211Ａｔが好ましい。
　ｐは１～５の整数を示し、好ましくは１～３の整数を示し、特に好ましくは１を示す。
（２）ハロゲン化ビオチン改変二量体の製造方法
　本発明のハロゲン化ビオチン改変二量体は、後記の実施例に記載の通り、　N-Bromo-succinimideあるいはN-Iodo-succinimideのメタノールと酢酸の混合溶液に、メタノールに溶解したハロゲン化ナトリウム（ヨウ化ナトリウム、Ｎａ１２５Ｉなど）又はハロゲン（２１１Ａｔ）を加えて攪拌した後に、メタノールに溶解した下記式（Ａ）で表される化合物を加えて反応させることにより製造することができる。N-Bromo-succinimideあるいはN-Iodo-succinimideの添加量は、好ましくは０．１～１．０当量であり、より好ましくは０．１～０．５当量であり、さらに好ましくは０．１～０．３当量である。N-Bromo-succinimideあるいはN-Iodo-succinimideの添加量は、ハロゲン化ナトリウム又はハロゲンの添加量（当量）よりは多くすることが好ましいが、N-Bromo-succinimideあるいはN-Iodo-succinimideの添加量を多くし過ぎると、式（Ａ）で表される化合物が分解する懸念があるので、適量に調節することが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
（式中の各記号の意味は、式（１）における定義と同義である。）
　また、本発明のハロゲン化ビオチン改変二量体は、後記の実施例に記載の通り、下記（Ｂ）で表される化合物のメタノールとアセトニトリルの混合溶液に、Tetrakis(pyridine)copper(II) triflate （添加量は好ましくは１～１０当量であり、より好ましくは２～８当量である）と3,4,7,8-Tetramethyl-1,10-phenanthroline（添加量は好ましくは１～１０当量であり、より好ましくは２～８当量である）とハロゲン化ナトリウムを加えて反応させることにより製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
（式中の各記号の意味は、式（１）における定義と同義である。）
（３）ハロゲン化ビオチン改変二量体の利用
　本発明によれば、本発明のハロゲン化ビオチン改変二量体と、ストレプトアビジン変異体―分子プローブ結合物とを組み合わせた治療剤又は診断剤が提供される。
　ストレプトアビジン変異体としては、国際公開ＷＯ２０１４／１２９４４６及び国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０に記載のストレプトアビジン変異体を使用することができる。特に好ましくは、国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０の実施例３（国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０の配列番号４）に記載されているストレプトアビジン変異体V2122を使用することができる。
　分子プローブとしては、例えば抗体、ペプチド、核酸、アプタマー等を挙げることができ、具体的には、癌に特異的に発現する以下抗原を標的とした抗体、ペプチド、核酸、アプタマー等を用いることができる。
　エピレギュリン、ROBO1,2,3,4、1-40-β-アミロイド, 4-1BB, 5AC, 5T4, ACVR2B, 腺がん抗原,　α-フェトプロテイン, アンギオポエチン2, 炭疽毒素, AOC3 (VAP-1), B-リンパ腫細胞, B7-H3, BAFF, βアミロイド, C242抗原, C5, CA-125, カルボニックアンヒドラーゼ9 (CA-IX), 心臓ミオシン, CCL11 (eotaxin-1), CCR4, CCR5, CD11, CD18, CD125, CD140a, CD147 (basigin), CD147 (basigin), CD15, CD152, CD154 (CD40L), CD154, CD19, CD2, CD20, CD200, CD22, CD221, CD23 (IgE受容体), CD25(IL-2受容体のα鎖), CD28, CD3, CD30 (TNFRSF8), CD33, CD37, CD38(サイクリックADPリボースヒドロラーゼ), CD4, CD40, CD41(インテグリンα-IIb), CD44 v6, CD5, CD51, CD52, CD56, CD6, CD70, CD74, CD79B, CD80, CEA, CFD, ch4D5, CLDN18.2, クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）,クランピング因子A, CSF2, CTLA-4, サイトメガロウイルス, サイトメガロウイルス糖タンパク質B, DLL4, DR5, E. coli 志賀毒素１型, E. coli志賀毒素２型、EGFL7, EGFR, エンドトキシン, EpCAM, エピシアリン（episialin）, ERBB3, 大腸菌（Escherichia coli）, 呼吸器合胞体｛こきゅうき ごうほうたい｝ウイルス（respiratory syncytial virus）のFタンパク質, FAP, フィブリンIIβ鎖, フィブロネクチンエクストラドメイン-B, 葉酸受容体1, Frizzled 受容体, GD2, GD3ガングリオシド, GMCSF受容体α鎖, GPNMB, Ｂ型肝炎表面抗原, Ｂ型肝炎ウイルス、HER1, HER2/neu, HER3, HGF, HIV-1, HLA-DRβ, HNGF, Hsp90, ヒトβアミロイド,ヒト分散因子（scatter factor）受容体キナーゼ, ヒトTNF, ICAM-1 (CD54), IFN-α, IFN-γ, IgE, IgE Fc 領域, IGF-1受容体, IGF-I, IgG4, IGHE, IL-1β, IL-12, IL-13, IL-17, IL-17A, IL-22, IL-23, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6受容体, IL-9, ILGF2, インフルエンザA ヘマグルチニン, インスリン様増殖因子I受容体, インテグリンα4, インテグリンα4β7, インテグリンα5β1, インテグリンα7 β7, インテグリンαIIbβ3, インテグリンαvβ3, インテグリンγ誘導タンパク質,インターフェロン受容体, インターフェロンα/β受容体, ITGA2, ITGB2 (CD18), KIR2D, L-セレクチン(CD62L), Lewis-Y抗原, LFA-1 (CD11a), リポタイコ酸, LOXL2, LTA, MCP-1, メソテリン、MS4A1, MUC1, ムチンCanAg, ミオスタチン, N-グリコリルノイラミン酸, NARP-1, NCA-90 (顆粒球抗原), NGF, NOGO-A, NRP1, Oryctolagus cuniculus, OX-40, oxLDL, PCSK9, PD-1, PDCD1, PDGF-R α, フォスファチジルセリン,前立腺がん細胞、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）,狂犬病｛きょうけんびょう｝ウイルス糖タンパク質、RANKL, 呼吸器合胞体｛こきゅうき ごうほうたい｝ウイルス, RHD, Ｒｈ（Rhesus）因子, RON, RTN4, スクレロスチン, SDC1, セレクチンP, SLAMF7, SOST, スフィンゴシン-1-ホスフェート, TAG-72, TEM1, テネイシンC, TFPI, TGFβ1, TGFβ2, TGF-β, TNF-α, TRAIL-R1, TRAIL-R2, 腫瘍抗原CTAA16.88,MUC1の腫瘍特異的グリコシル化, TWEAK受容体, TYRP1(グリコプロテイン75), VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, ビメンチン, VWF
　癌抗原特異的抗体分子などの分子プローブとストレプトアビジン変異体との融合体を調製し、患者に投与することで、癌細胞に特異的にストレプトアビジン変異体を集積できることができる。次に、上記ストレプトアビジン変異体に親和性を有する本発明のハロゲン化ビオチン改変二量体を患者に投与することによって、癌細胞へ的確にハロゲンを集積させることが可能になる。本発明においては、低免疫原性化により抗体産生が抑制され、抗体による早期の体内からのクリアランス、アナフィラキシーなどのショックを防ぐことができる。また、本発明においては患者から採取した組織、血清等を用いた体外診断薬、臨床検査薬として使用することで、組織、血清等に存在するビオチン或いはビオチン結合タンパク由来ノイズが低減し、よりＳ／Ｎ比の高い診断、検査が可能となる。
　あるいはまた、本発明においては、癌抗原特異的抗体分子などの分子プローブとストレプトアビジン変異体との融合体と、本発明のハロゲン化ビオチン改変二量体とを結合させた結合体を調製し、上記結合体を患者に投与することもできる。
　ストレプトアビジン変異体に結合させる抗体は種々の分子を用いることができる。ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体はどちらも使用することができる。抗体のサブクラスは特に問わないが、好ましくはＩｇＧ、特にＩｇＧ1が好適に用いられる。また、「抗体」は改変抗体および抗体断片の全てを含む。ヒト化抗体、ヒト型抗体、ヒト抗体、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、サル等の各種動物由来抗体、ヒト抗体と各種動物由来抗体とのキメラ抗体、ｄｉａｂｏｄｙ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ‘、Ｆ（ａｂ）’2が挙げられるが、これらに限らない。
　ストレプトアビジン変異体と抗体の結合物は、当業者に公知の方法を用いて得ることができる。例えば、化学的結合方法（US5,608,060）によって得ることもできるし、ストレプトアビジン変異体をコードするＤＮＡと抗体をコードするＤＮＡを連結し、発現ベクター等を用いて宿主細胞に発現させることにより、融合タンパクとして得ることもできる。ストレプトアビジン変異体をコードするＤＮＡと抗体をコードするＤＮＡとの連結は、リンカーと呼ばれる適当なペプチドをコードするＤＮＡを介しても良い。ストレプトアビジン変異体―抗体結合物は、抗体と標的分子との特異的結合力を残して作製されることが望ましい。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
ハロゲン化したビオチン改変体２量体化合物の合成
一般的方法
　核磁気共鳴 (NMR) スペクトルは、JEOL ECX500 (1H NMR: 500MHz)、またはJEOL ECS400(1H NMR: 400MHz) スペクトロメータを用いて測定した。化学シフトは、内部参照として重溶媒中の残存溶媒ピークに対する値としてppmで記載した （CDCl3:δ= 7.26 ppm,  CD3OD:δ= 3.31 ppm）。低分解能質量スペクトル (LHMS) は、Shimadzu LCMS-2020システムによりESI-MSを用いて測定した。反応は薄層クロマトグラフィー (TLC)、あるいは低分解能質量分析 (LRMS) によって追跡した。
　逆相高速液体クロマトグラフフィー (HPLC) は、JASCO-HPLCシステムを用いて行った。254 nmの紫外光を用いて検出し、移動相はグラジエント溶媒系 (アセトニトリル／0.1% トリフルオロ酢酸MQ溶液あるいは0.1%ギ酸MQ溶液) を用いた。分析については、YMC-Triart-C18 (150 mm×4.6 mm I.D.) のカラムを用い、流速 1 mL/minで行った。分取については、YMC-Triart-C18 (250 mm×10 mm I.D. あるいは 150 mm×4.6 mm I.D.) のカラムを用い、前者では流速6.3 mL/min、後者では流速1 mL/minで行った。
＜実施例１＞
（１）
(3aS,3a'S,4S,4'S,6aR,6a'R)-4,4'-(((((5-((2-(2-(2-(3-(Trimethylstannyl)benzamido)ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamoyl)-1,3-phenylene)bis(azanediyl))bis(6-oxohexane-6,1-diyl))bis(azanediyl))bis(5-oxopentane-5,1-diyl))bis(tetrahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-2(3H)-iminium) formate
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　ビスイミノビオチン1（国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０；特開2017-66155号公報）（44.7 mg, 34 μmol）のメタノール（1 ml）溶液に化合物2（19.3 mg, 51 μmol）とトリエチルアミン（47.3 μl, 510 μmol）を加え室温で2時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、得られた粗生成物を逆相HPLC（グラジエント：2% for 2 min; 2-100% for 90 min CH3CN in 0.1% HCOOH水溶液, 保持時間 = 43.6 min, YMC-Triart C18, flow rate = 6.3 ml/min）で精製することで標題化合物3（15.0 mg, 収率 33%, 白色アモルファス状）を得た。
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ：0.29 (s, 9H), 1.35-1.45 (m, 8H), 1.48-1.80 (m, 16H), 2.18 (t, 4H, J =7.4 Hz), 2.37 (t, 4H, J = 7.4 Hz), 2.80 (d, 2H, J = 13.2 Hz), 2.97 (dd, 2H, J = 5.2 Hz, 13.2 Hz), 3.24-3.29 (m, 2H), 3.50-3.58 (m, 4H), 3.62-3.67 (m, 8H), 4.50 (dd, 2H, J = 4.6 Hz, 8.0 Hz), 4.70 (dd, 2H, J = 4.6 Hz, 8.0 Hz), 7.37 (t, 1H, J =7.4 Hz), 7.62 (d, 1H, J =6.9 Hz), 7.70 (d, 2H, J =2.1 Hz),7.92-7.94 (m, 1H), 8.01 (t, 1H, J = 1.7 Hz), 8.51-8.57 (m, 1H). LRMS (ESI): m/z 614 [M+2H]2+.
（２）
(3aS,3a'S,4S,4'S,6aR,6a'R)-4,4'-(((((5-((2-(2-(2-(3-Iodobenzamido)ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamoyl)-1,3-phenylene)bis(azanediyl))bis(6-oxohexane-6,1-diyl))bis(azanediyl))bis(5-oxopentane-5,1-diyl))bis(tetrahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-2(3H)-iminium) 2,2,2-trifluoroacetate
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　N-Bromo-succinimide（0.0027 mg, 0.152 μmol）のメタノール（560 μl）と酢酸 (0.76 μl)の混合溶液に,メタノール（100 μl）に溶解したヨウ化ナトリウム（0.00114 mg, 0.076 μmol）を加えて室温で5分間攪拌した後、メタノール(100 μl)に溶解したビスイミノビオチン3（0.1 mg, 0.076 μmol）を加えて、室温で10分間攪拌した。反応溶液を濃縮せずに逆相HPLC（グラジエント：30% for 2 min; 30-100% for 20 min CH3CN in 0.1% CF3COOH水溶液, 保持時間 = 8.5 min, YMC-Triart C18, flow rate = 1.0 ml/min）で精製することで、標題化合物4（黄色高粘着油状）を得た。得られた生成物はLC-MS解析において別法で合成した標品と保持時間および観測質量が一致した。
　標題化合物4のことをPsycheB-ヨウ素体とも称する。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.34-1.75 (m, 24H), 2.18 (t, 4H, J = 7.2 Hz), 2.38 (t, 4H, J = 7.2 Hz), 2.80 (d, 2H, J = 13.0 Hz), 2.98 (dd, 2H, J = 4.9 Hz, 13.5 Hz), 3.18 (t, 4H, J = 7.2 Hz), 3.23-3.28 (m, 2H), 3.55 (t, 4H, J = 5.4 Hz), 3.63-3.70 (m, 8H), 4.50 (dd, 2H, J = 4.5 Hz, 8.1 Hz), 4.70 (dd, 2H, J = 4.5 Hz, 8.1 Hz), 7.19 (t, 1H, J = 7.6 Hz), 7.70 (d, 2H, J = 1.8 Hz), 7.76-7.80 (m, 1H), 7.83-7.87 (m, 1H), 7.98 (t, 1H, J = 1.8 Hz), 8.15 (t, 1H, 1.8 Hz). LRMS (ESI): m/z595 [M+2H]2+.
（３）
(3aS,3a'S,4S,4'S,6aR,6a'R)-4,4'-(((((5-((2-(2-(2-(3-(Iodo-125I)benzamido)ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamoyl)-1,3-phenylene)bis(azanediyl))bis(6-oxohexane-6,1-diyl))bis(azanediyl))bis(5-oxopentane-5,1-diyl))bis(tetrahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-2(3H)-iminium) 2,2,2-trifluoroacetate
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　N-Bromosuccinimide（0.00271 mg, 0.152 μmol）のメタノール（560 μl）と酢酸 (0.76 μl)の混合溶液に,メタノール（100 μl）に溶解した Na125I（7.1 MBq）を加えて室温で5分間攪拌した後、メタノール(100 μl)に溶解したビスイミノビオチン3（0.1 mg, 0.076 μmol）を加えて、室温で10分間攪拌した。反応溶液を濃縮せずに逆相HPLC（30% for 2 min; 30-100% for 20 min CH3CN in 0.1% CF3COOH水溶液, 保持時間 = 8.5 min, YMC-Triart C18, flow rate = 1.0 ml/min）で精製することで標題化合物5を得た。
（４）
(3aS,3a'S,4S,4'S,6aR,6a'R)-4,4'-(((((5-((2-(2-(2-(3-(Astato-211At)benzamido)ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamoyl)-1,3-phenylene)bis(azanediyl))bis(6-oxohexane-6,1-diyl))bis(azanediyl))bis(5-oxopentane-5,1-diyl))bis(tetrahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-2(3H)-iminium) 2,2,2-trifluoroacetate
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　N-Iodosuccinimide（0.0034 mg, 0.152 μmol）のメタノール（560 μl）と酢酸 (0.76 μl)の混合溶液に,メタノール（100 μl）に溶解した 211At（20.6 MBq）を加えて室温で１分間攪拌した後、メタノール(100 μl)に溶解したビスイミノビオチン3（0.1 mg, 0.076 μmol）を加えて、室温で10分間攪拌した。反応溶液を濃縮せずに逆相HPLC精製（30% for 2 min; 30-80% for 13 min CH3CN in 0.1% CF3COOH水溶液, 保持時間 = 7.0 min, YMC-Triart C18, flow rate = 1.0 ml/min）で精製することで標題化合物6を得た。標題化合物6は、Psyche B-At211とも称する。
＜実施例２＞
（１）
2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl 3-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)benzoate
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 3-(4,4,5,5-Tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)benzoic acidのジクロロメタン (3 ml) 、トリエチルアミン (26 μl, 188 μmol) の混合溶液にN-Hydroxysuccinimide (21.4 mg, 188 μmol)、1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide Hydrochloride (36 mg, 188 μmol)を加え、アルゴン雰囲気下、室温で４時間攪拌した。溶媒を減圧除去後、水を加え酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液で1度、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で1度、飽和食塩水で1度洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧除去し、標的化合物7 (42.7 mg, 収率 80%, 白色個体)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.35 (s, 12H), 2.85-2.98 (br, 4H), 7.52 (t, 1H, J = 7.6 Hz), 8.06-8.10 (m, 1H), 8.20(dt, 1H, J = 1.8 Hz, J = 7.6 Hz), 8.59 (s, 1H). LRMS (ESI): m/z 368 [M+Na]+.
（２）
(3-((2-(2-(2-(3,5-bis(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-Iminohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanamido)hexanamido)benzamido)ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamoyl)phenyl)boronic acid
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　ビスイミノビオチン1（国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０；特開2017-66155号公報）（10 mg, 7.68 μmol）のDMF（400 μl）溶液に化合物7（3.9 mg, 11.5 μmol）とトリエチルアミン（16 μl, 115 μmol）を加え室温で4.5時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、得られた粗生成物を逆相HPLC（グラジエント：0% for 5 min; 0-100% for 90 min CH3CN in 0.1% HCOOH水溶液, 保持時間 = 32.5 min, YMC-Triart C18, flow rate = 3.5 ml/min）で精製することで標題化合物8（3.6 mg, 収率 39%, 白色アモルファス状）を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ：1.34-1.75 (m, 24H), 2.17 (t, 4H, J = 7.4 Hz), 2.37 (t, 4H, J = 7.4 Hz), 2.79 (d, 2H, J = 13.2 Hz), 2.96 (dd, 2H, J = 4.6 Hz, 13.2 Hz), 3.17 (t, 4H, J = 6.3 Hz), 3.21-3.28 (m, 2H), 3.50-3.57 (m, 4H), 3.61-3.69 (m, 8H), 4.49 (dd, 2H, J = 4.0 Hz, 7.4 Hz), 4.69 (dd, 2H, J = 4.6 Hz, 8.0 Hz), 7.35 (t, 1H, J = 7.4 Hz), 7.65-7.79 (m, 3H), 7.96-8.03 (m, 2H), 8.50 (s, 1H). LRMS (ESI): m/z 554 [M+2H]2+.
（３）(3aS,3a'S,4S,4'S,6aR,6a'R)-4,4'-(((((5-((2-(2-(2-(3-Iodobenzamido)ethoxy)ethoxy)ethyl)carbamoyl)-1,3-phenylene)bis(azanediyl))bis(6-oxohexane-6,1-diyl))bis(azanediyl))bis(5-oxopentane-5,1-diyl))bis(tetrahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-2(3H)-iminium) 2,2,2-trifluoroacetate
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　ビスイミノビオチン8のメタノール（17.5 μl）とアセトニトリル (2.5 μl)の混合溶液に Tetrakis(pyridine)copper(II) triflate (2.8 mg, 4.2 μmol)と3,4,7,8-Tetramethyl-1,10-phenanthroline (0.99 mg, 4.2 μmol) とヨウ化ナトリウム（0.0125 mg, 0.0834 μmol）を加えて、室温で10分間攪拌した。反応溶液のLCMS解析を行い、別法で合成した標品と保持時間および観測質量が一致した。
　標題化合物4のことをPsycheB-ヨウ素体とも称する。
＜実施例３＞
Methyl 5-((2S,3S,4R)-3,4-diaminotetrahydrothiophen-2-yl)pentanoate hydrobromide
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　ビオチン 7(2.5 g, 10.2 mmol)に47%臭化水素水溶液を12 mlを加え、アルゴン雰囲気下、150 ℃で48時間還流しながら攪拌した後、溶媒を減圧除去した。得られた粗生成物8は更なる精製操作を行わずに次の反応に用いた。
Methyl 5-((2S,3S,4R)-3,4-diaminotetrahydrothiophen-2-yl)pentanoate hydrobromide
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
　粗生成物8にメタノールを20 mlを加え、アルゴン雰囲気下、還流しながら5時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、得られた粗生成物9は更なる精製操作を行わずに次の反応に用いた。
5-((2S,3S,4R)-3,4-Diaminotetrahydrothiophen-2-yl)pentan-1-ol
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
　水素化アルミニウムリチウム(1.55 g, 40.9 mmol) のTHF(50 ml)溶液に、氷冷下、粗生成物9のTHF (400 ml)溶液を30分かけて滴下した。アルゴン雰囲気下、氷浴上で3時間攪拌した後、水（1.5 ml）,15% NaOH水溶液（1.5 ml）,水（4.5 ml）を加え、硫酸ナトリウム濾過で得られた濾液を減圧濃縮した。得られた粗精製物10（1.9 g, 黄色固体）は更なる精製操作は行わずに次の反応に使用した。
Di-tert-butyl ((2S,3S,4R)-2-(5-hydroxypentyl)tetrahydrothiophene-3,4-diyl)dicarbamate
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　粗生成物10の1,4-dioxane(20 ml)溶液に室温で、二炭酸ジ-tert-ブチル(4.26 g, 20.5 mmol)を加え、氷冷下で1M NaOH水溶液(20 ml)を加えた。アルゴン雰囲気下、室温で15時間攪拌した。溶媒を減圧除去した後、1M HCl水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で有機層を洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧除去した。得られた粗精製物をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル＝67:33 → 20:80 → 0:100 →酢酸エチル/メタノール＝95:5 → 90:10）で精製することで標的化合物11(1.77 g, 化合物7から4段階で収率 46%, 白色アモルファス)を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ：1.20-1.38 (m, 4H), 1.38-1.50 (m, 19H), 1.50-1.57 (m, 2H), 1.57-1.78 (m, 1H), 2.45 (t, J = 10.3 Hz, 1H), 3.10-3.27 (m, 1H), 3.45-3.46 (m, 1H), 3.60 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 4.05-4.25 (m, 1H), 4.25-4.40 (m, 1H), 4.70-4.85 (m, 1H), 4.90-5.05 (m, 1H). LRMS (ESI): m/z 427 [M+H]+.
Di-tert-butyl ((2S,3S,4R)-2-(5-oxopentyl)tetrahydrothiophene-3,4-diyl)dicarbamate
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　化合物11(1.15 g, 2.84 mmol)の酢酸エチル(12ml)溶液に2-iodoxybenzoic acid(4.08ｇ, 5.68 mmol,純度39%市販品)を加えた。アルゴン雰囲気下、80 ℃で還流しながら4時間攪拌した。溶液をセライトで濾過し、濾液を減圧除去した。得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル＝76:24 →）で精製することで標的化合物12(0.53 g, 収率46%, 白色アモルファス)を得た。
12H NMR (500 MHz, CD3OD) δ：1.30-1.50 (m, 24H), 2.42 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.47 (t, J = 10.3 Hz, 1H), 3.15-3.25 (m, 1H), 3.45-3.55 (m, 1H), 4.10-4.35 (m, 2H), 4.65-4.80 (m, 1H), 4.90-5.00 (m, 1H), 9.75 (t, J = 1.7 Hz, 1H) .
Di-tert-butyl ((2S,3S,4R)-2-(5,5-bis(4-(1,3-dioxoisoindolin-2-yl)butoxy)pentyl)tetrahydrothiophene-3,4-diyl)dicarbamate
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
　化合物12(235.7 mg, 0.59 mmol)のメタノール(2 ml)溶液に室温でオルトギ酸メチル（333 μl, 2.95 mmol）及びp-トルエンスルホン酸ピリジニウム(13.6 mg, 0.059 mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下、室温で10時間攪拌し、溶媒及びオルトギ酸メチルを減圧除去した。トルエン(13 ml)及び2-(4-Hydroxybutyl)isoindoline-1,3-dione(1.03 g. 4.68 mmol)加えて、Dean-stark装置を用いて還流しながら8時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル＝64:36 → 46:54 → 35:65）で精製することで標的化合物13(0.32g, 収率67%)を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ：1.28-1.80 (m, 34H), 2.46 (t, J =10.3 Hz, 1H), 3.05-3.35 (m, 1H), 3.34-3.44 (m, 2H), 3.47-3.62 (m, 3H), 3.70, (t, J = 7.4 Hz, 4H), 4.18-4.23 (m, 1H), 4.28-4.33 (m, 1H), 4.39 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 4.74-4.81 (m, 1H), 4.97-5.03 (m, 1H), 7.68-7.74 (m, 4H), 7.80-7.84 (m, 4H).
2-(4-((5-((2S,3S,4R)-3,4-Diaminotetrahydrothiophen-2-yl)pentyl)oxy)butyl)isoindoline-1,3-dione
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
　化合物13 (302 mg, 0.367 mmol)のジクロロメタン(7.2 ml)の溶液に室温で、トリエチルシラン (468 μl, 2.93 mmol), 三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート (234 μl, 0.881 mmol)を加え、アルゴン雰囲気下、室温で11時間攪拌した。反応溶液にメタノール (500 μl)を加え室温で一時間攪拌した後、溶媒を減圧除去した。得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム/メタノール＝99:1 → 75:25 → 65:35）で精製した。得られた化合物に飽和重曹水を加え、ジクロロメタンで抽出した。硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧除去し、標的化合物14(67.6 mg, 収率45%, 黄色油状)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.32-1.62 (m, 9H), 1.67-1.76 (m, 3H), 2.55 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 2.93 (dd, J = 5.7 Hz, 12.6 Hz, 1H), 3.20-3.30 (m, 1H), 3.41 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.45 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.68 (t, J = 6.9 Hz, 2H) 3.82 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 3.94 (t, J = 6.3 Hz, 1H), 7.76-7.81 (m, 2H), 7.82-7.87 (m, 2H). LRMS (ESI): m/z 406 [M+H]+.
tert-Butyl ((3aS,4S,6aR,E)-4-(5-(4-(1,3-dioxoisoindolin-2-yl)butoxy)pentyl)tetrahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-2(3H)-ylidene)carbamate
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
　化合物14 (43.5 mg, 0.107 mmol)のジオキサン (300 μl)、トリエチルアミン(30 μl, 0.214 mmol)混合溶液に室温で、ジオキサン (400 μl)に溶解したGoodman試薬 (42 mg, 0.107mmol)を加えた。アルゴン雰囲気下、室温で21時間攪拌し、溶媒を減圧除去した。得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム/メタノール＝100:0 → 10:1 → 5:1）で精製し、標的化合物15 (9.1 mg, 収率16%)を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ：1.32-1.50 (m, 4H), 1.43 (s, 9H), 1.51-1.69 (m, 5H), 1.71-1.81 (m, 3H), 2.86-2.95 (m, 2H), 3.18-3.24 (m, 1H), 3.38 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.42 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.71 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 4.42 (dd, J = 5.2 Hz, 8.0 Hz, 1H),4.62 (m, 1H), 7.67-7.73 (m, 2H), 7.80-7.86 (m, 2H). LRMS (ESI): m/z 531 [M+H]+.
tert-Butyl ((3aS,4S,6aR,E)-4-(5-(4-aminobutoxy)pentyl)tetrahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-2(3H)-ylidene)carbamate
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
　化合物15 (31.7 mg, 0.06 mmol)のエタノール (500 μl)溶液に室温で、ヒドラジン水和物 (10 mg, 0.3 mmol)を加えた。反応溶液を50 ℃で10時間攪拌した。反応溶液を吸引ろ過し、濾液を減圧除去した。得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（アミノシリカ、クロロホルム/メタノール＝100:0 → 94:6 ）で精製し、標的化合物16 (11.8 mg, 収率49%)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.40-1.50 (m, 13H), 1.51-1.69 (m, 7H), 1.72-1.82 (m, 1H), 2.69 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.81 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 2.97 (dd,J = 4.9 Hz, 13.0 Hz, 1H), 3.24-3.32 (m, 1H), 3.40-3.48 (m, 4H), 4.41 (dd, J = 4.5 Hz, 8.1 Hz, 1H), 4.62 (dd, J = 4.5 Hz, 8.1 Hz, 1H). LRMS (ESI): m/z 401 [M+H]+.
14-(Carboxymethyl)-2,2-dimethyl-4-oxo-3,8,11-trioxa-5,14-diazahexadecan-16-oic acid
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
　化合物17（AMGEN INC.WO2006/14645, 2006, A1） (131.1 mg, 240.7 mmol)のメタノール (5 ml)溶液に、10%パラジウム炭素 (24.1 mg, 22 .6 μmol)を加え、水素雰囲気下室温で3時間攪拌した。セライト濾過後、溶媒を減圧除去し、得られた粗生成物18 (93.3 mg, 収率quant., 無色高粘性油状)は更なる精製操作を行わずに次の反応に使用した。
tert-Butyl (22-((3aS,4S,6aR,E)-2-((tert-butoxycarbonyl)imino)hexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)-9-(2-((4-((5-((3aS,4S,6aR,Z)-2-((tert-butoxycarbonyl)imino)hexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentyl)oxy)butyl)amino)-2-oxoethyl)-11-oxo-3,6,17-trioxa-9,12-diazadocosyl)carbamate
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
　化合物18 (6.4 mg, 17.5 μmol)のジクロロメタン (400 μl)溶液に、室温で化合物16 (12.9 mg, 32.2 μmol)と1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド塩酸塩 (6.9 mg, 36 μmol)を加えた。アルゴン雰囲気下、室温で36時間攪拌した溶媒を減圧除去した。得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（アミノシリカ、クロロホルム/メタノール＝200:1 → 50:1→30:1→ 20:1 → 10:1 → 5:1 → 3:1 ）で精製し、標的化合物19 (9.6 mg, 収率49%)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ：1.34-1.50 (m, 35H), 1.51-1.64 (m, 14H), 1.72-1.82 (m, 2H), 2.81 (d, J = 12.6 Hz, 2H), 2.97 (dd, J = 4.9 Hz, 12.6 Hz, 2H), 3.18-3.30 (m, 10H), 3.39-3.65 (m, 20H), 4.41 (dd, J = 4.5 Hz, 8.1 Hz, 2H), 4.63 (dd, J = 4.5 Hz, 8.1 Hz, 2H). LRMS (ESI): m/z565 [M+2H]2+.
2,2'-((2-(2-(2-Aminoethoxy)ethoxy)ethyl)azanediyl)bis(N-(4-((5-((3aS,4S,6aR)-2-iminohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentyl)oxy)butyl)acetamide) 2,2,2-trifluoroacetate
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
　化合物19 (5.2 mg, 4.6 μmol)の水溶液 (200 μl)に室温でトリフルオロ酢酸 (400 μl)を加えた。アルゴン雰囲気下、室温で18時間攪拌し、溶媒を減圧除去した。得られた粗生成物を逆相HPLC（グラジエント：0% for 5 min; 0-100% for 90 min CH3CN in 0.1% CF3COOH水溶液, YMC-Triart C18, flow rate = 3.5 ml/min）で精製し、標的化合物20 (3.5 mg, 収率59%)を得た。
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ：1.34-1.50 (m, 8H), 1.52-1.63 (m, 14H), 1.71-1.81 (m, 2H), 2.82 (d, J = 13.2 Hz, 2H), 2.99 (dd, J = 4.6 Hz, 13.2 Hz, 2H), 3.14 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 3.20-3.30 (m, 6H), 3.43 (t, J = 6.3 Hz, 8H), 3.60-3.74 (m, 12H), 4.53 (dd, J = 4.0 Hz, 8.0 Hz, 2H), 4.72 (dd, J = 4.6 Hz, 8.0 Hz, 2H). LRMS (ESI): m/z415 [M+2H]2+.
2-((4-((5-((3aS,4S,6aR)-2-Iminiohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentyl)oxy)butyl)amino)-N-(2-((4-((5-((3aS,4S,6aR)-2-iminiohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentyl)oxy)butyl)amino)-2-oxoethyl)-2-oxo-N-(2-(2-(2-(3-(trimethylstannyl)benzamido)ethoxy)ethoxy)ethyl)ethan-1-aminium formate
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
　化合物20 (3.5 mg, 2.72 μmol)のDMF (300 μl)溶液に室温で、化合物21 (1.1 mg, 2.99 μmol)とトリエチルアミン (5.7 μl, 40.8 μmol)を加えた。アルゴン雰囲気下、室温で3時間攪拌し、溶媒を減圧除去した。得られた粗生成物を逆相HPLC（グラジエント：0% for 5 min; 2-100% for 90 min CH3CN in 0.1% HCOOH水溶液, 保持時間：42.0 min, YMC-Triart C18, flow rate = 3.5 ml/min）で精製し、標的化合物22 (1.5 mg, 収率 45％)を得た。LRMS (ESI): m/z 366 [M+3H]3+.
2,2'-((2-(2-(2-(3-Iodobenzamido)ethoxy)ethoxy)ethyl)azanediyl)bis(N-(4-((5-((3aS,4S,6aR)-2-iminohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentyl)oxy)butyl)acetamide) 2,2,2-trifluoroacetate
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
 ビスイミノビオチン20 (2.4 mg, 1.87 μmol)のDMF (150 μl)溶液に、室温でDMF (100 μl)に溶解した化合物23 (0.7 mg, 2.06 μmol)とトリエチルアミン (4 μl, 28.3 μmol)を加えた。アルゴン雰囲気下、室温で2時間攪拌し、溶媒を減圧除去した。得られた粗生成物を逆相HPLC（グラジエント：0% for 5 min; 2-100% for 90 min CH3CN in 0.1% CF3COOH水溶液, 保持時間：47.6 min, YMC-Triart C18, flow rate = 3.5 ml/min）で精製し、標的化合物24 (1.3 mg, 収率 50％)を得た。LRMS (ESI): m/z 354 [M+3H]3+.
　標的化合物24のことをPsycheP-ヨウ素体とも称する。
2,2'-((2-(2-(2-(3-Iodobenzamido)ethoxy)ethoxy)ethyl)azanediyl)bis(N-(4-((5-((3aS,4S,6aR)-2-iminohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentyl)oxy)butyl)acetamide) 2,2,2- trifluoroacetate
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
　N-Bromo-succinimide（0.00288 mg, 0.162 μmol）のメタノール（610 μl）と酢酸 (0.81 μl)の混合溶液に,メタノール（100 μl）に溶解したヨウ化ナトリウム（0.00121 mg, 0.081 μmol）を加えて室温で5分間攪拌した後、メタノール(100 μl)に溶解したビスイミノビオチン22（0.1 mg, 0.081 μmol）を加えて、室温で10分間攪拌した。反応液のLC-MS解析において、上記の方法で合成した標品（24）と保持時間および観測質量が一致した。標的化合物24のことをPsycheP-ヨウ素体とも称する。
＜CEA-V2122の製造＞
　V2122は、国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０の実施例３（国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０の配列番号４）に記載されているストレプトアビジン変異体である。V2122のアミノ酸配列（Ｃ末端に６×Ｈｉｓタグを有する配列）を配列表の配列番号１に記載する。
　scFv-V2122は、上記のV2122に、CEACAM5に対する一本鎖抗体（scFv）を結合したものである。このscFv型の抗CEACAM5抗体は特許文献US7626011B2に記載されているscFv配列である。scFv型の抗CEACAM5抗体のアミノ酸配列を配列表の配列番号２に記載する。また、scFv型の抗CEACAM5抗体とV2122とをアミノ酸リンカー(GGGGSGGGG)（配列番号１１）で結合したCEA-V2122のアミノ酸配列を配列表の配列番号３に記載する。
　CEA-V2122融合タンパク質の発現のために、大腸菌にて分泌発現するためのpelBシグナルをN末端に、また6xHis-Tag配列をC末端に組み込んだCEA-V2122遺伝子配列のDNAコドンを大腸菌に最適化し人工遺伝子合成を行なった。このアミノ酸配列を配列表の配列番号４、DNA配列を配列表の配列番号５に記載する。また、ドメイン構造の概略を図１に示す。
　具体的なタンパク質発現ベクターは、pETDuet1ベクターのMCS2にシャペロンskp遺伝子が組み込まれたベクターを使用した。skp遺伝子は配列表の配列番号６に記載されたアミノ酸配列を元にコドンを大腸菌に最適化したDNAの人工遺伝子合成を行った。合成されたskp遺伝子はプライマー（AAGGAGATATACATATGGATAAAATTGCCATTGTTAATAT（配列番号１２）, TTGAGATCTGCCATATGTTATTTCACTTGTTTCAGAACG（配列番号１３））を使用しPCRで増幅し、制限酵素NdeIで直鎖化されたpETDue1ベクターのMCS2にIn-Fusion HD Cloning Kitをもちいてクローニングを行い pETDuet_skp とした。次に、 pETDuet_skp のMCS1にCEA-V2122遺伝子を組み込んだ。具体的には、人工合成されたCEA-V2122遺伝子をプライマー（AGAAGGAGATATACCATGAAATATCTGCTGCCGAC（配列番号１４）、CGCCGAGCTCGAATTTTAATGATGGTGATGATGATG（配列番号１５））を用いPCRにて増幅した。また、 pETDuet_skp をプライマー（GGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC（配列番号１６）、AATTCGAGCTCGGCGCGCCTGCAG（配列番号１７））を使用しPCRにて直鎖化した。PCRにより増幅された CEA-V2122と直鎖化された pETDuet_skp を In-Fusion HD Cloning Kit をもちいてクローニングを行った。クローニングされたベクターはシーケンスにより組み込まれた遺伝子配列の確認を行い pETDuet_CEA-V2122_skp とした。
　タンパク質発現のために、pETDuet_CEA-V2122_skpをBL21(DE3)(ニッポン・ジーン社)に形質転換し 2xYT培地(SIGMA-ADLRICH社)、37°Cにて一晩、前培養を行った。前培養を行った培地を 新しい培地に100倍希釈になるように添加し、OD(600nm) = 0.5～2.0になるまで37°Cで培 養を行った。次に最終濃度0.5mM IPTGを添加し37°Cで4時間培養し培養上清を回収した後、4°Cで保存した。
　CEA-V2122タンパク質は、C末端に付加されている6xHis-Tagを利用し バッチ法で粗精製を行った。具体的にはバッファーA(50mM TrisHCl, 0.2M NaCl, 1mM ED TA, 5mM Imidazole, pH8.0)で平衡化したcOmplete His-Tag Purification Resin を4°C で保存した培養上清へ添加し、2時間から一晩、4°Cにて撹拌しレジンへのタンパク質結 合処理を行った。次にレジンをカラムに回収し、バッファーAで20カラム容量の洗浄作業 を行った。その後、バッファーB(50mM TrisHCl, 0.2M NaCl, 1mM EDTA, 400mM Imidazol e, pH8.0)で溶出しCEA-V2122の粗精製物の回収を行った。 
  次に、粗精製物についてProtein L カラムによる精製を行った。具体的にはCapto L (GE Healthcare Life Sciences) 1mLをPD-10カラムに充填し、10カラムボリュームのPBSで平衡化後、上述の粗精製物をアプライし、10カラムボリュームのPBSで洗浄後、10mM グリシン塩酸 pH2.0で溶出しVivaspin Turbo 15 (MWCO 100,000) による遠心濃縮を行なった。さらに PD-10 (GE Healthcare Life Sciences社) を用いてPBSへバッファー置換を行い、さらに Vivaspin Turbo 4  (MWCO 100,000) による遠心濃縮を行い最終精製物とした。SDS-PAGE電気泳動後、CBB染色により４量体CEA-V2122の純度の検定を行なった結果を図２に示す。SDS-PAGEゲルは Mini-PROTEAN TGX 4-15% (Bio-Rad社) を使用し CBB染色液はBullet CBB Stain One(Ready To Use) (ナカライテスク社）を使用した。
　図２より精製されたCEA-V2122は約150kDaの４量体を主たる成分であることが確認された。
＜Herceptin-V2122の製造＞
　V2122は、国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０の実施例３（国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０の配列番号４）に記載されているストレプトアビジン変異体である。V2122のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に記載する。
　scFv-V2122は、上記のV2122に、HER2 (ERBB2) に対する一本鎖抗体（scFv）を結合したものである。このscFv型の抗HER2抗体は、Zhang H, et al.,Therapeutic potential of an anti-HER2 single chain antibody-DM1 conjugates for the treatment of HER2-positive cancer. Signal Transduct Target Ther. 2017 May 19;2:17015. doi: 10.1038/sigtrans.2017.15に記載されているscFv配列である。scFv型の抗HER2抗体のアミノ酸配列を配列表の配列番号７に記載する。また、scFv型の抗HER2抗体とV2122とをアミノ酸リンカー(GGGGGSGGGGG)（配列番号１８）で結合したHER2-V2122の構造図を図３、アミノ酸配列を配列表の配列番号８に示す。
　HER2-V2122融合タンパク質の発現のために、大腸菌にて分泌発現するためのpelBシグナルをN末端に、また6xHis-Tag配列をC末端に組み込んだHER2-V2122遺伝子配列のDNAコドンを大腸菌に最適化し人工遺伝子合成を行なった。このアミノ酸配列を配列表の配列番号９、DNA配列を配列表の配列番号１０に記載する。
　具体的なタンパク質発現ベクターは、pETDuet1ベクターのMCS2にシャペロンskp遺伝子が組み込まれたベクターを使用した。skp遺伝子は配列表の配列番号６に記載されたアミノ酸配列を元にコドンを大腸菌に最適化したDNAの人工遺伝子合成を行った。合成されたskp遺伝子はプライマー（AAGGAGATATACATATGGATAAAATTGCCATTGTTAATAT（配列番号１２）, TTGAGATCTGCCATATGTTATTTCACTTGTTTCAGAACG（配列番号１３））を使用しPCRで増幅し、制限酵素NdeIで直鎖化されたpETDue1ベクターのMCS2にIn-Fusion HD Cloning Kitをもちいてクローニングを行い pETDuet_skp とした。次に、 pETDuet_skp のMCS1にHER2-V2122遺伝子を組み込んだ。具体的には、人工合成されたHER2-V2122遺伝子をプライマー（AGAAGGAGATATACCATGAAATATCTGCTGCCGAC（配列番号１４）、CGCCGAGCTCGAATTTTAATGATGGTGATGATGATG（配列番号１５））を用いPCRにて増幅した。また、 pETDuet_skp をプライマー（GGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC（配列番号１６）、AATTCGAGCTCGGCGCGCCTGCAG（配列番号１７））を使用しPCRにて直鎖化した。PCRにより増幅された CEA-V2122と直鎖化された pETDuet_skp を In-Fusion HD Cloning Kit をもちいてクローニングを行った。クローニングされたベクターはシーケンスにより組み込まれた遺伝子配列の確認を行い pETDuet_HER-V2122_skp とした。
　タンパク質発現のために、pETDuet_HER2-V2122_skpをBL21(DE3)(ニッポン・ジーン社)に形質転換し 2xYT培地(SIGMA-ADLRICH社)、37°Cにて一晩、前培養を行った。前培養を行った培地を 新しい培地に100倍希釈になるように添加し、OD(600nm) = 0.5～2.0になるまで37°Cで培 養を行った。次に最終濃度0.5mM IPTGを添加し37°Cで4時間培養し培養上清を回収した後、4°Cで保存した。
　HER2-V2122タンパク質は、C末端に付加されている6xHis-Tagを利用し バッチ法で粗精製を行った。具体的にはバッファーA(50mM TrisHCl, 0.2M NaCl, 1mM ED TA, 5mM Imidazole, pH8.0)で平衡化したcOmplete His-Tag Purification Resin を4°C で保存した培養上清へ添加し、2時間から一晩、4°Cにて撹拌しレジンへのタンパク質結 合処理を行った。次にレジンをカラムに回収し、バッファーAで20カラム容量の洗浄作業 を行った。その後、バッファーB(50mM TrisHCl, 0.2M NaCl, 1mM EDTA, 400mM Imidazol e, pH8.0)で溶出しHER2-V2122の粗精製物の回収を行った。 
  次に、粗精製物についてProtein L カラムによる精製を行った。具体的にはCapto L (GEヘルスケア)1mLをPD-10カラムに充填し、10カラムボリュームのPBSで平衡化後、上述の粗精製物をアプライし、10カラムボリュームのPBSで洗浄後、10mM グリシン塩酸 pH2.0で溶出しVivaspin Turbo 15 (MWCO 100,000) による遠心濃縮を行なった。さらに PD-10（GEヘルスケア）を用いてPBSへバッファー置換を行い、さらに Vivaspin Turbo 4  (MWCO 100,000) による遠心濃縮を行い最終精製物とした。精製物についてCBB染色により４量体HER2-V2122の純度の検定を行なった結果を図４に示す。SDS-PAGEゲルは Mini-PROTEAN TGX 4-15% (Bio-Rad社) を使用し CBB染色液は Bullet CBB Stain One(Ready To Use) (ナカライテスク社）を使用した。
　図４より精製されたHER2-V2122は約150kDaの４量体を主たる成分であることが確認された。
試験例１：CEA-V2122とPsyche B-ヨウ素体およびPsyche P-ヨウ素体の親和性解析
　CEA-V2122とPsyche B-ヨウ素体およびPsyche P-ヨウ素体の親和性データ取得は特願２０１８－２４７３６３の記載に従い実施した。簡単にまとめるとアミンカップリングキット(GE Healthcare Life Sciences社)を使用し、Sensor Chip CM5 (GE Healthcare Life Sciences社)  に目標値 5000RUとなるように設定し、精製された CEA-V2122 の固定化を行なった。アナライトの濃度は 1E-08 M から 6.25E-10 M までの２倍希釈系列５種類を使用した。BiacoreT200 (GE Healthcare Life Sciences社)を用い、測定温度25度に設定しSingle-Cycle Kinetics 解析にてカイネティクスデータ取得を行った。得られたデータを Biacore T200 Evaluation Software, version 2.0 (GE Healthcare Life Sciences社)にて Bivalent Analyze モードによるカーブフィッティングを実施し各パラメータの評価値を得た。解離定数KDは、Kd/Ka = KDより求められる。それらの結果を表１に示す。結果より、Psyche B-ヨウ素体およびPsyche P-ヨウ素体はCEA-V2122と安定な結合を形成することが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
試験例２：磁気ビーズによるPsyche Bアスタチン標識体とHerceptin-Cupidとの結合複合体確認
　アスタチン標識されたPsyche BがCupidとの結合能を有するかどうかを確認するために、Herceptin-CupidとHerceptin-Cupidについている6xHisタグに結合するNi-NTA磁気ビーズ（Thermo社製）を用いた結合アッセイを実施した。ここで用いたPsyche B-At211は実施例１の（４）に従い調製し、Herceptin-Cupidは上記の通り特願２０１８－２４７３６３に記載された方法に従って調製した。具体的なアッセイ方法は以下の通りである。
　1.5mLチューブに4μLのHerceptin-V2122溶液またはコントロール用PBSの分注をおこなった。そこへ10μL(5.8kBq相当)のPsyche-At211を添加し、室温で５分間インキュベーションをおこなった。次にPBSにて平衡化したNi-NTA磁気ビーズ10μLを添加し、室温で５分間インキュベーションをおこなった。その後、マグネットを使用し、ビーズを沈殿、固定化し上清を回収したのち、100μLのPBSにて洗浄を２回行いガンマーカウンターにより放射線量のカウントを行なった。結果は図５のグラフである。Herceptin-V2122の存在依存的にPsyche-At211が沈降しているのが確認された。
試験例３：卵巣癌細胞SKOV3を用いたPsyche Bアスタチン標識体とHerceptin-Cupidとの結合複合体確認
　アスタチン標識されたPsyche BがHER2陽性SKOV3細胞にあらかじめ結合させたHerceptin-V2122との結合能を有するかどうかを確認を行なった。また、ネガティブコントロールとしてCEA-V2122を用いた。ここで用いたPsyche B-At211は実施例１の（４）に従い調製し、Herceptin-V2122およびCEA-V2122は上記の通り特願２０１８－２４７３６３に記載された方法に従って調製した。具体的なアッセイ方法は以下の通りである。
　1.5mLチューブ４本用意し、各チューブに0.875x106 cells/tubeになるように細胞を分注した。N=2となるように２本のチューブにHerceptin-V2122を添加をおこない、残りの２本にはCEA-V2122の添加をおこなった。次に、氷上にて1時間インキュベーションし、10kBq/tubeとなるようにアスタチン標識されたPsyche Bの添加をおこなった。その後、室温にて30分間浸透しながらインキュベーションをおこなった。最後に遠心にて細胞を沈殿させ上清を回収し、PBSによる洗浄を２回行ない、ガンマカウンターによる放射線量のカウントを行なった。結果は図６のグラフである。Herceptin-V2122依存的な測定結果となり、SKOV3細胞にHerceptin-V2122を介し、Psyche B-At212が結合していることが確認された。
配列番号１
AEAGITGTWSDQLGDTFIVTAGADGALTGTYENAVGGAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNSKNAHSATTWSGQYVGGADAKINTQWLLTSGTTNANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASHHHHHH
配列番号２(sm3E-scFv配列)
QVKLEQSGAEVVKPGASVKLSCKASGFNIKDSYMHWLRQGPGQRLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATFTTDTSANTAYLGLSSLRPEDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSENVLTQSPSSMSVSVGDRVNIACSASSSVPYMHWLQQKPGKSPKLLIYLTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSVQPEDAATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIK
配列番号３
QVKLEQSGAEVVKPGASVKLSCKASGFNIKDSYMHWLRQGPGQRLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATFTTDTSANTAYLGLSSLRPEDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSENVLTQSPSSMSVSVGDRVNIACSASSSVPYMHWLQQKPGKSPKLLIYLTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSVQPEDAATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGAEAGITGTWSDQLGDTFIVTAGADGALTGTYENAVGGAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNSKNAHSATTWSGQYVGGADAKINTQWLLTSGTTNANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASHHHHHH
配列番号４
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAQVKLEQSGAEVVKPGASVKLSCKASGFNIKDSYMHWLRQGPGQRLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATFTTDTSANTAYLGLSSLRPEDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSENVLTQSPSSMSVSVGDRVNIACSASSSVPYMHWLQQKPGKSPKLLIYLTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSVQPEDAATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGAEAGITGTWSDQLGDTFIVTAGADGALTGTYENAVGGAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNSKNAHSATTWSGQYVGGADAKINTQWLLTSGTTNANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASHHHHHH
配列番号５
ATGAAATATCTGCTGCCGACCGCAGCAGCGGGTCTGCTGCTGCTGGCAGCACAGCCTGCAATGGCACAGGTTAAACTGGAACAGAGCGGTGCCGAAGTTGTTAAACCGGGTGCAAGCGTTAAACTGAGCTGTAAAGCAAGCGGCTTTAACATCAAAGATAGCTATATGCATTGGCTGCGTCAGGGTCCGGGTCAGCGTCTGGAATGGATTGGTTGGATTGATCCGGAAAATGGTGATACCGAATATGCACCGAAATTTCAGGGTAAAGCAACCTTTACCACCGATACCAGCGCAAATACCGCATATCTGGGTCTGAGCAGCCTGCGTCCGGAAGATACCGCAGTGTATTATTGTAATGAAGGCACCCCGACCGGTCCGTATTATTTCGATTATTGGGGTCAGGGCACCCTGGTTACCGTTAGCAGCGGTGGTGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGTTCAGGCGGTGGCGGTAGCGAAAATGTTCTGACCCAGAGCCCGAGCAGCATGAGCGTTAGCGTTGGTGATCGTGTTAATATTGCATGTAGCGCAAGCAGCAGCGTTCCGTACATGCACTGGCTGCAGCAGAAACCGGGTAAAAGCCCGAAACTGCTGATTTATCTGACCAGCAATCTGGCAAGCGGTGTTCCGAGCCGTTTTAGCGGTAGCGGTAGTGGCACCGATTATAGCCTGACCATTAGCAGCGTGCAGCCTGAAGATGCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGCGTAGCAGTTATCCGCTGACCTTTGGTGGTGGCACCAAACTGGAAATTAAAGGGGGTGGTGGCTCAGGTGGCGGAGGTGCAGAAGCAGGTATTACCGGTACATGGTCAGATCAGCTGGGTGATACCTTTATTGTTACCGCAGGCGCAGATGGTGCACTGACCGGCACCTATGAAAATGCAGTTGGTGGTGCAGAAAGCCGTTATGTGCTGACCGGTCGTTATGATAGCGCACCGGCAACCGATGGTAGCGGCACCGCACTGGGTTGGACCGTTGCATGGAAAAATAACAGCAAAAATGCACATAGCGCAACCACCTGGTCAGGTCAGTATGTGGGTGGTGCCGATGCCAAAATTAACACCCAGTGGCTGCTGACCAGCGGTACAACCAATGCAAATGCCTGGAAAAGTACCCTGGTTGGTCATGATACATTCACCAAAGTTAAACCGAGCGCAGCAAGCCATCATCATCACCATCATTAA
配列番号６
MDKIAIVNMGSLFQQVAQKTGVSNTLENEFKGRASELQRMETDLQAKMKKLQSMKAGSDRTKLEKDVMAQRQTFAQKAQAFEQDRARRSNEERGKLVTRIQTAVKSVANSQDIDLVVDANAVAYNSSDVKDITADVLKQVK
配列番号７
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK
配列番号８
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGGSGGGGGAEAGITGTWSDQLGDTFIVTAGADGALTGTYENAVGGAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNSKNAHSATTWSGQYVGGADAKINTQWLLTSGTTNANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASHHHHHH
配列番号９
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGGSGGGGGAEAGITGTWSDQLGDTFIVTAGADGALTGTYENAVGGAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNSKNAHSATTWSGQYVGGADAKINTQWLLTSGTTNANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASHHHHHH
配列番号１０
ATGAAATATCTGCTGCCGACCGCAGCAGCGGGTCTGCTGCTGCTGGCAGCACAGCCTGCAATGGCAGAAGTTCAGCTGGTTGAAAGCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCTGGTGGTAGCCTGCGTCTGAGCTGTGCAGCAAGCGGTTTTAACATTAAAGATACCTATATTCATTGGGTGCGTCAGGCACCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTGCACGTATTTATCCGACCAATGGTTATACCCGTTATGCCGATAGCGTTAAAGGTCGTTTTACCATTAGCGCAGATACCAGCAAAAATACCGCATACCTGCAGATGAATAGTCTGCGTGCAGAGGATACCGCAGTGTATTATTGTAGCCGTTGGGGTGGTGATGGTTTTTATGCAATGGATTATTGGGGTCAGGGCACCCTGGTTACCGTTAGCTCAGGTGGAGGCGGTTCCGGTGGCGGAGGTTCCGGTGGAGGTGGCTCCGGTGGCGGAGGTTCCGATATTCAGATGACCCAGAGTCCGAGCAGCCTGAGCGCAAGCGTTGGTGATCGTGTGACCATTACCTGTCGTGCAAGCCAGGATGTTAATACAGCAGTTGCATGGTATCAGCAGAAACCGGGTAAAGCACCGAAACTGCTGATTTATAGCGCAAGCTTTCTGTATAGCGGTGTTCCGAGCCGTTTTAGCGGTAGCCGTAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTGCAACCTATTATTGTCAGCAGCATTACACCACACCGCCTACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTTGAAATTAAAGGAGGTGGCGGTGGATCCGGCGGAGGTGGCGGAGCAGAAGCAGGTATTACCGGTACATGGTCAGATCAGCTGGGTGATACCTTTATTGTTACCGCAGGCGCAGATGGTGCACTGACCGGCACCTATGAAAATGCAGTTGGTGGTGCAGAAAGCCGTTATGTGCTGACCGGTCGTTATGATAGCGCACCGGCAACCGATGGTAGCGGCACCGCACTGGGTTGGACCGTTGCATGGAAAAATAACAGCAAAAATGCACATAGCGCAACCACCTGGTCAGGTCAGTATGTGGGTGGTGCCGATGCCAAAATTAACACCCAGTGGCTGCTGACCAGCGGTACAACCAATGCAAATGCCTGGAAAAGTACCCTGGTTGGTCATGATACATTCACCAAAGTTAAACCGAGCGCAGCAAGCCATCATCATCACCATCATTAA 

Claims (12)

  1. 下記式（１）で示される化合物又はその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、
    Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ及びＸ２ｂはそれぞれ独立にＯ又はＮＨを示し、
    Ｙ１及びＹ２はそれぞれ独立にＣ又はＳを示し、
    Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立にＯ、Ｓ又はＮＨを示し、
    Ｖ１及びＶ２はそれぞれ独立にＳ又はＳ＋－Ｏ－を示し、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立に０又は１の整数を示し、
    Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３はそれぞれ独立に、２価の連結基を示し、
    Ｌ４は、３価の連結基を示し、
    Ｈａｌは、ハロゲン元素を示し、
    ｐは１～５の整数を示す。）
  2. 式（１）で示される化合物が、下記式（１ａ）又は下記式（１ｂ）で示される化合物である、請求項１に記載の化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中の各記号の意味は請求項１と同義である。）
  3. ｎ１及びｎ２が０である、下記式（２）又は下記式（３）で示される、請求項１又は２に記載の化合物又はその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式中の各記号の意味は請求項１と同義である。）
  4. Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ及びＸ２ｂがＮＨを示し、Ｙ１及びＹ２がＣを示し、
    Ｚ１及びＺ２がＮＨを示し、Ｖ１及びＶ２がＳを示す、請求項１から３の何れか一項に記載の化合物又はその塩。
  5. Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３がそれぞれ独立に、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、－ＣＯＯ－、－ＯＣＯ―、－ＣＯ－、－Ｏ－、及び炭素数１から１０のアルキレン基から選択される基の組み合わせからなる２価の連結基である、請求項１から４の何れか一項に記載の化合物又はその塩。
  6. Ｌ１が、－（ＣＨ２）ｍ１－Ｌ１１－（ＣＨ２）ｍ２－Ｌ１２－※を示し、
    Ｌ２が、※－Ｌ１３－（ＣＨ２）ｍ３－Ｌ１４－（ＣＨ２）ｍ４－を示し、
    Ｌ３が、Ｌ１５－Ｌ２１－Ｌ１６－を示す、
    ここで、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１３、Ｌ１４、Ｌ１５、及びＬ１６はそれぞれ独立に、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、－ＣＯＯ－、－ＯＣＯ―、－ＣＯ－又は－Ｏ―を示し、
    ｍ１、ｍ２、ｍ３、及びｍ４はそれぞれ独立に１から１０の整数を示し、
    ※はベンゼン環との結合位置を示し、
    Ｌ２１は、－ＣＨ２－（ＯＣＨ２）ｍ５－を示し、ｍ５は１から１０の整数を示す、請求項１から５の何れか一項に記載の化合物又はその塩。
  7. Ｈａｌが、Ｉ、１２５Ｉ、又は２１１Ａｔである、請求項１から６の何れか一項に記載の化合物又はその塩。
  8. ｐが１である、請求項１から７の何れか一項に記載の化合物又はその塩。
  9. 以下の何れかの化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
  10. （１）請求項１から９の何れか１項に記載の化合物；及び（ｂ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含むストレプトアビジン変異体に分子プローブを結合させることにより得られる、ストレプトアビジン変異体－分子プローブ結合物：を含む治療又は診断のためのキット。
  11. 下記式（Ａ）で表される化合物と、ハロゲン化ナトリウム又はハロゲンとを反応させることを含む、請求項１から９の何れか１項に記載の化合物又はその塩の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     （式中の各記号の意味は請求項１と同義である。）
  12. 下記式（Ｂ）で表される化合物と、ハロゲン化ナトリウム又はハロゲンとを反応させることを含む、請求項１から９の何れか１項に記載の化合物又はその塩の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     （式中の各記号の意味は請求項１と同義である。）
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