CN115605487A

CN115605487A - 生物素变体二聚体及其用途

Info

Publication number: CN115605487A
Application number: CN202180028597.9A
Authority: CN
Inventors: 金井求; 山次健三; 巽俊文; 儿玉龙彦; 杉山晓; 塚越雅信; 户田雄三; 鹫山幸信; 高桥和弘; 赵松吉; 右近直之; 铃木美穗
Original assignee: University of Tokyo NUC; Fukushima Medical University PUC; Savid Therapeutics Inc
Current assignee: University of Tokyo NUC; Fukushima Medical University PUC; Savid Therapeutics Inc
Priority date: 2020-04-14
Filing date: 2021-04-13
Publication date: 2023-01-13
Also published as: WO2021210573A1; US20230241257A1; JPWO2021210573A1; EP4151278A4; EP4151278A1

Abstract

本发明的课题是提供能够进行成像诊断或治疗的卤化的新型生物素变体二聚体。根据本发明，提供下述式（1）所示的化合物或其盐。式中，L₁表示3价连接基，L₂表示2价连接基，Hal表示卤素元素，p表示1～5的整数，q、r、s和t各自独立地表示1～8的整数。

Description

生物素变体二聚体及其用途

技术领域

本发明涉及生物素变体二聚体（ビオチン改変二量体）及其用途。

背景技术

抗生物素蛋白与生物素、或者链霉抗生物素蛋白与生物素之间的亲和性非常高（Kd=10^-15至10^-14M），并且生物体双分子间的相互作用是最强的相互作用之一。目前，抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白-生物素相互作用广泛应用于生物化学、分子生物学或医学领域。已经设计了将抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白和生物素的高结合能力与抗体分子组合的药物递送的方法、预靶向法。

由于鸡来源的抗生物素蛋白、微生物来源的链霉抗生物素蛋白对人体显示出高免疫原性，因此存在对人体施用后早期产生抗抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白抗体的问题，成为妨碍预靶向法实用化的原因之一。报道了用于解决该问题的低免疫原性链霉抗生物素蛋白（国际公开WO2010/095455）。

低免疫原性链霉抗生物素蛋白具有对人体的免疫原性降低的特征，由于其对人体的内源生物素具有亲和性，因此担心在诊断用途的情况中存在背景变高的问题、在治疗用途的情况中也可能无法对疾病特异性地发挥药效。

因此，报道了降低了对天然生物素的亲和性的链霉抗生物素蛋白突变体、以及对该对天然生物素低亲和性的链霉抗生物素蛋白突变体具有高亲和性的生物素变体（国际公开WO2014/129446）。此外，还报道了降低了对天然生物素的亲和性的链霉抗生物素蛋白突变体、以及对该对天然生物素低亲和性的链霉抗生物素蛋白突变体具有高亲和性的生物素变体二聚体（国际公开WO2015/125820）。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开WO2010/095455

专利文献2：国际公开WO2014/129446

专利文献3：国际公开WO2015/125820。

发明内容

发明要解决的课题

本发明要解决的课题是提供卤化的新型生物素变体二聚体，其能够进行成像诊断或治疗。进一步，本发明要解决的课题还在于提供组合使用上述生物素变体二聚体和链霉抗生物素蛋白突变体的诊断试剂盒・治疗试剂盒。

用于解决课题的手段

患病率高且有增加倾向的大肠癌即使是IV阶段也考虑远处转移的切除，使用多药并用化学疗法和分子靶向药，但还未确立对生命预后有效的辅助疗法。大肠癌大多表达癌胚抗原(CEA)，并且可以用特异性的抗CEA抗体的RI标记物进行放射免疫疗法。本发明的目的在于，组合药物递送系统（Cupid-Psyche系统）和释放α射线的核素砹-211(²¹¹At)，提供用于难治性癌的治疗的新型放射性药剂和配套诊断药。

Cupid-Psyche系统是利用基于超级计算机分子动力学模拟开发的变体生物素(Psyche)和结合四聚体链霉抗生物素蛋白(Cupid)的单克隆抗体的预靶向放射免疫疗法。

本发明的实施例中，开发了将²¹¹At通过Cupid-Psyche系统而高效地递送至大肠癌的治疗方法。通过使用结合Cupid的单链可变区片段（scFv）型抗体以及²¹¹At标记Psyche，确认了结合Cupid的scFv型抗体靶向至大肠癌细胞，同时确认了²¹¹At标记Psyche的安定性以及与结合Cupid的scFv型抗体的结合性。进一步，分析Cupid-²¹¹At标记Psyche的体内动态，进行在大肠癌动物模型中的有效性评价。本发明基于上述见解而完成。

即，根据本发明，提供以下发明。

＜1＞下述式（1）所示的化合物或其盐，

[化1]

式中，

L₁表示3价连接基，

L₂表示2价连接基，

Hal表示卤素元素，

p表示1～5的整数，

q、r、s和t各自独立地表示1～8的整数。

＜2＞权利要求1所述的化合物或其盐，其中，L₁为

[化2]

或

。

＜3＞＜1＞或＜2＞所述的化合物或其盐，其中，L2为包含选自-CONH-、-NHCO-、-COO-、-OCO―、-CO-、-O-和碳原子数1至10的亚烷基中的基团的组合的2价连接基。

＜4＞＜1＞至＜3＞中任一项所述的化合物或其盐，其为下述式（2）所示的化合物或其盐，

[化3]

式中的各符号的含义与权利要求1相同。

＜5＞＜1＞至＜4＞中任一项所述的化合物或其盐，其中，Hal为I、¹²⁵I、或²¹¹At。

＜6＞＜1＞至＜5＞中任一项所述的化合物或其盐，其中，p为1。

＜7＞以下的化合物，

[化4]

。

＜8＞用于治疗或诊断的试剂盒，其包含：（1）＜1＞至＜7＞中任一项所述的化合物；和（b）通过使分子探针与包含SEQ ID NO: 1中记载的氨基酸序列的链霉抗生物素蛋白突变体（其中，C末端的由6个组氨酸组成的氨基酸序列可以部分或全部缺失）结合而得的链霉抗生物素蛋白突变体-分子探针结合物。

发明效果

本发明的生物素变体二聚体和包含其的试剂盒在基于预靶向法的诊断方法・治疗方法中有用。

附图说明

图1：图1表示结构域结构的概略。

图2：图2表示CEA-V2122的SDS-PAGE电泳CBB 染色图像。

图3：图3表示CEA-Cupid与抗原（CEACAM5）的结合性能评价。

图4：图4表示CEA-Cupid与生物素变体的结合性能评价。

图5：图5表示¹²⁵I-Cupid-scFv抗体的体内分布（%ID/g）。

图6：图6表示¹²⁵I-Cupid-scFv抗体在肿瘤组织中的积聚量（%ID/g）。

图7：图7表示¹²⁵I-Cupid-scFv抗体在甲状腺中的积聚量（%ID）、肿瘤对血液比、肿瘤对肌肉比。

图8：图8表示Cupid-scFv抗体 (24h前)+ ²¹¹At-psyche-B的体内分布（%ID/g）。

图9：图9表示Cupid-scFv抗体 (24h前)+ ²¹¹At-psyche-B在甲状腺中的积聚（%ID）、肿瘤对血液比、肿瘤对肌肉比。

图10：图10表示Cupid-scFv抗体 (48h前)+ ²¹¹At-psyche-B的体内分布（%ID/g）。

图11：图11表示Cupid-scFv (48h前)+²¹¹At-psyche-B在甲状腺中的积聚量（%ID）、肿瘤对血液比、肿瘤对肌肉比。

图12：图12表示²¹¹At-psyche-B的体内分布（%ID/g）。

图13：图13表示²¹¹At-psyche-B在甲状腺中的积聚量（%ID）。

图14：图14表示Cupid-scFv (24h前)+²¹¹At-psyche-BR体内分布（%ID/g）。

图15：图15表示Cupid-scFv (24h前)+²¹¹At-psyche-BR在甲状腺中的积聚量（%ID）、肿瘤对血液比、肿瘤对肌肉比。

图16：图16表示Cupid-scFv (48h前)+²¹¹At-psyche-BR体内分布（%ID/g）。

图17：图17表示Cupid-scFv (48h前)+²¹¹At-psyche-BR在甲状腺中的积聚（%ID）、肿瘤对血液比、肿瘤对肌肉比。

图18：图18表示²¹¹At-psycheBR的体内分布（%ID/g）。

图19：图19表示²¹¹At-psyche-BR在甲状腺中的积聚（%ID）。

图20：图20表示Cupid-scFv-抗体＋²¹¹At-psyche-BR治疗后的小鼠体重（g）的经时性变化。

图21：图21表示Cupid-scFv-抗体＋²¹¹At-psyche-BR治疗后的肿瘤体积（mm³）的经时性变化。

图22：图22表示Cupid-scFv抗体（24h前）＋²¹¹At-psycheBR的体内动态（%ID/g,6h）。

图23：图23表示小鼠的体重（g）的经时性变化。

图24：图24表示肿瘤体积（mm³）的经时性变化。

图25：图25表示Cupid-scFv抗体（24h前）＋²¹¹At-psycheB的体内动态（%ID/g,6h）。

具体实施方式

以下，对本发明更详细地进行说明。

（1）卤化的生物素变体二聚体

本发明是下述式（1）所示的化合物或其盐，优选为下述式（2）所示的化合物或其盐。本发明的化合物也称为“卤化生物素变体二聚体”。

[化5]

[化6]

。

L₁表示3价连接基，优选为

[化7]

或

；更优选为

[化8]

。

L₂表示2价连接基。

L₂优选为包含选自-CONH-、-NHCO-、-COO-、-OCO―、-CO-、-O-和碳原子数1至10的亚烷基中的基团的组合的2价连接基。

L₂更优选为包含选自-CONH-、-NHCO-、-O-和碳原子数1至10的亚烷基中的基团的组合的2价连接基。

Hal表示卤素元素。作为Hal所示的卤素元素，可举出氟（F）、氯（Cl）、溴（Br）、碘（I）、砹（At）、

（Ts）及其同位素，优选为碘、砹及其同位素。

作为卤素元素，优选可举出¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、²¹⁰At、²¹¹At等。上述中，优选为I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、²¹¹At。Hal特别优选为I、¹²⁵I或²¹¹At。

p表示1～5的整数，优选表示1～3的整数，特别优选表示1。

q、r、s和t各自独立地表示1～8的整数，优选独立地表示1～6的整数，更优选独立地表示3～6的整数，特别优选表示4或5。

作为本发明的化合物的具体例，可举出以下化合物。

[化9]

。

（2）卤化生物素变体二聚体的制造方法

如后述实施例所述，本发明的卤化生物素变体二聚体可以通过在N-溴代琥珀酰亚胺的甲醇和乙酸的混合溶液中加入溶解于甲醇的卤化钠（碘化钠、Na¹²⁵I等）或卤素（²¹¹At）并搅拌后，加入溶解于甲醇的下述式（A）所示的化合物并使其反应来制造。

N-溴代琥珀酰亚胺的添加量优选为0.1～1.0当量、更优选为0.1～0.5当量、进一步优选为0.1～0.3当量。N-溴代琥珀酰亚胺的添加量优选比卤化钠或卤素的添加量（当量）多，但若N-溴代琥珀酰亚胺的添加量过多，则式（A）所示的化合物有可能分解，因此优选调节至适量。

[化10]

式中的各符号的含义与式（1）中的定义相同。

（3）生物素变体二聚体的用途

根据本发明，提供组合本发明的生物素变体二聚体和链霉抗生物素蛋白突变体―分子探针结合物而成的治疗剂或诊断剂。

作为链霉抗生物素蛋白突变体，可以使用国际公开WO2014/129446和国际公开WO2015/125820中记载的链霉抗生物素蛋白突变体。特别优选地，可以使用国际公开WO2015/125820的实施例3（国际公开WO2015/125820的SEQ ID NO: 4）中记载的链霉抗生物素蛋白突变体V2122。

作为分子探针，可举出例如抗体、肽、核酸、适体等，具体可以使用以在癌中特异性表达的以下抗原为靶标的抗体、肽、核酸、适体等。

上皮调节蛋白、ROBO1,2,3,4、1-40-β-淀粉样蛋白、4-1BB、5AC、5T4、ACVR2B、腺癌抗原、α-胎蛋白、血管生成素2、炭疽毒素、AOC3 (VAP-1)、B-淋巴瘤细胞、B7-H3、BAFF、β淀粉样蛋白、C242抗原、C5、CA-125、碳酸酐酶9 (CA-IX)、心脏肌球蛋白、CCL11 (eotaxin-1)、CCR4、CCR5、CD11、CD18、CD125、CD140a、CD147 (basigin)、CD147 (basigin)、CD15、CD152、CD154 (CD40L)、CD154、CD19、CD2、CD20、CD200、CD22、CD221、CD23 (IgE受体)、CD25(IL-2受体的α链)、CD28、CD3、CD30 (TNFRSF8)、CD33、CD37、CD38(环状ADP核糖水解酶)、CD4、CD40、CD41(整联蛋白α-IIb)、CD44 v6、CD5、CD51、CD52、CD56、CD6、CD70、CD74、CD79B、CD80、CEA、CFD、ch4D5、CLDN18.2、艰难梭菌（Clostridium difficile）、凝集因子A、CSF2、CTLA-4、巨细胞病毒、巨细胞病毒糖蛋白B、DLL4、DR5、大肠杆菌志贺毒素1型、大肠杆菌志贺毒素2型、EGFL7、EGFR、内毒素、EpCAM、上皮唾蛋白（episialin）、ERBB3、大肠杆菌（Escherichiacoli）、呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus）的F蛋白、FAP、纤维蛋白IIβ链、纤连蛋白额外结构域-B、叶酸受体1、Frizzled受体、GD2、GD3神经节苷脂、GMCSF受体α链、GPNMB、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎病毒、HER1、HER2/neu、HER3、HGF、HIV-1、HLA-DRβ、HNGF、Hsp90、人β淀粉样蛋白、人分散因子（scatter factor）受体激酶、人TNF、ICAM-1(CD54)、IFN-α、IFN-γ、IgE、IgE Fc区、IGF-1受体、IGF-I、IgG4、IGHE、IL-1β、IL-12、IL-13、IL-17、IL-17A、IL-22、IL-23、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6受体、IL-9、ILGF2、甲型流感病毒血凝素、胰岛素样生长因子I受体、整联蛋白α4、整联蛋白α4β7、整联蛋白α5β1、整联蛋白α7 β7、整联蛋白αIIbβ3、整联蛋白αvβ3、整联蛋白γ诱导蛋白、干扰素受体、干扰素α/β受体、ITGA2、ITGB2 (CD18)、KIR2D、L-选择素(CD62L)、Lewis-Y抗原、LFA-1 (CD11a)、脂磷壁酸、LOXL2、LTA、MCP-1、间皮素、MS4A1、MUC1、粘蛋白CanAg、肌肉生长抑制素、N-糖基神经氨酸、NARP-1、NCA-90 (粒细胞抗原)、NGF、NOGO-A、NRP1、Oryctolagus cuniculus、OX-40、oxLDL、PCSK9、PD-1、PDCD1、PDGF-R α、磷脂酰丝氨酸、前列腺癌细胞、绿脓杆菌（Pseudomonasaeruginosa）、狂犬病病毒糖蛋白、RANKL、呼吸道合胞病毒、RHD、Rh（Rhesus）因子、RON、RTN4、硬蛋白、SDC1、选择素P、SLAMF7、SOST、鞘氨醇-1-磷酸酯、TAG-72、TEM1、肌腱蛋白C、TFPI、TGFβ1、TGFβ2、TGF-β、TNF-α、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、MUC1的肿瘤特异性糖基化、TWEAK受体、TYRP1(糖蛋白75)、VEGF-A、VEGFR-1、VEGFR2、波形蛋白、VWF。

通过制备癌抗原特异性抗体分子等分子探针与链霉抗生物素蛋白突变体的融合体并向患者施用，可以使链霉抗生物素蛋白突变体特异性地积聚于癌细胞。接着，通过对患者施用对上述链霉抗生物素蛋白突变体具有亲和性的本发明的卤化生物素变体二聚体，可以使卤素可靠地积聚于癌细胞。本发明中，通过低免疫原性化抑制抗体产生，可以防止抗体引起的早期的来自体内的清除、过敏反应等休克。另外，在本发明中，通过使用采取自患者的组织、血清等作为体外诊断药、临床检查药，可以降低来自存在于组织、血清等中的生物素或生物素结合蛋白的噪声，能够进行S/N比高的诊断、检查。

或者，在本发明中，也可以制备使癌抗原特异性抗体分子等分子探针与链霉抗生物素蛋白突变体的融合体和本发明的卤化生物素变体二聚体结合而成的结合体，并将上述结合体对患者施用。

与链霉抗生物素蛋白突变体结合的抗体可以使用各种分子。多克隆抗体、单克隆抗体均可以使用。抗体的亚类没有特别限制，优选IgG、特别适宜使用IgG₁。另外，“抗体”包括所有的变体抗体（改変抗体）和抗体片段。可举出人源化抗体、人型抗体、人抗体、小鼠、兔、大鼠、豚鼠、猴等各种动物来源抗体、人抗体与各种动物来源抗体的嵌合抗体、diabody、scFv、Fd、Fab、Fab‘、F（ab）’₂，但并不限定于此。

链霉抗生物素蛋白突变体与抗体的结合物可以使用本领域技术人员公知的方法获得。例如，可以通过化学结合方法（US5,608,060）得到，也可以通过连接编码链霉抗生物素蛋白突变体的DNA和编码抗体的DNA，使用表达载体等在宿主细胞中表达而获得融合蛋白。编码链霉抗生物素蛋白突变体的DNA与编码抗体的DNA可以通过编码被称为接头的适当的肽的DNA连接。链霉抗生物素蛋白突变体―抗体结合物理想的是保留抗体与靶标分子的特异性结合力而制作。

通过以下的实施例进一步具体说明本发明，但本发明并不受实施例限定。

实施例

＜生物素变体2聚体化合物的合成＞

＜一般方法＞

核磁共振(NMR)光谱是使用JEOL ECX500 (¹H NMR: 500MHz)、或JEOL ECS400(¹HNMR: 400MHz) 光谱仪测定。化学位移以相对于作为内参的氘代溶剂中的残留溶剂峰的值的形式，以ppm记载（CDCl₃:δ= 7.26 ppm, CD₃OD:δ= 3.31 ppm）。低分辨率质谱(LRMS) 通过Shimadzu LCMS-2020系统使用ESI-MS来测定。通过薄层色谱(TLC)、或低分辨率质谱(LRMS) 追踪反应。

反相高效液相色谱(HPLC)使用JASCO-HPLC系统进行。使用254 nm的紫外光进行检测，流动相使用梯度溶剂系统(乙腈/0.1% 三氟乙酸MQ溶液或0.1%甲酸MQ溶液)。关于分析，使用YMC-Triart-C18 (150 mm×4.6 mm I.D.)的柱，以流速 1 mL/min进行。关于制备，使用YMC-Triart-C18 (250 mm×10 mm I.D. 或 150 mm×4.6 mm I.D.) 的柱，前者以流速6.3 mL/min、后者以流速1 mL/min进行。

5-((2S,3S,4R)-3,4-二氨基四氢噻吩-2-基)戊酸甲酯氢溴酸盐(2)

[化11]

在生物素 1(5 g, 20.4 mmol)中加入47%溴化氢水溶液 (24 ml)，在氩气氛下、150 ℃下进行90小时回流搅拌后，将溶剂减压除去。所得的粗产物2不进行进一步纯化操作而用于后续反应。

5-((2S,3S,4R)-3,4-双((叔丁氧基羰基)氨基)四氢噻吩-2-基)戊酸 (3)

[化12]

在粗产物2 (20.4 mmol)的1,4-二噁烷 (100 ml)、1 M NaOH水溶液 (100 ml)的混合溶液中，在室温下加入二碳酸二叔丁酯(12.8 g, 61.3 mmol)。在氩气氛下、室温下进行22小时搅拌。将溶剂减压除去后，加入1 M HCl水溶液，用氯仿提取，用饱和食盐水洗涤有机层。用硫酸钠干燥后，将溶剂减压除去。所得的粗产物3不进行进一步纯化操作而用于后续反应。

((2S,3S,4R)-2-(4-氨基丁基)四氢噻吩-3,4-二基)二氨基甲酸二叔丁酯 (4)

[化13]

在粗产物3(471 mg, 1.13 mmol)的甲苯(6 ml) 溶液中，在室温下加入N,N-二异丙基乙胺 (293 μl, 1.70 mmol)和叠氮磷酸二苯酯 (367 μl, 1.70 mmol)，在氩气氛下、85 ℃下进行3小时40分钟搅拌。进一步加入N,N-二异丙基乙胺 (98 μl, 0.73 mmol)和叠氮磷酸二苯酯 (122 μl, 0.73 mmol)，在85 ℃下进行1小时搅拌。冷却至室温，加入THF(7ml)和2 M NaOH水溶液(4 ml)，在室温下进行13小时搅拌，将溶剂减压除去。将所得的粗产物通过硅胶色谱（氯仿/甲醇＝95:5 → 75:25 → 65:35）纯化，得到目标化合物4(151 mg,收率34%, 3个步骤)。

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ：1.28-1.72 (m, 24H), 2.47 (t, J = 10.3 Hz,1H), 2.66 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 3.16-3.28 (m, 1H), 3.44-3.60 (m, 1H), 4.16-4.40 (m, 2H), 4.72-4.88 (m, 1H), 4.90-5.08 (m, 1H). LRMS (ESI): m/z 390.95 [M+H]⁺。

7-((4-((2S,3S,4R)-3,4-双((叔丁氧基羰基)氨基)四氢噻吩-2-基)丁基)氨基)-7-氧代庚酸苄酯（5）

[化14]

在化合物4(129.4 mg, 0.33 mmol)与7-(苄氧基)-7-氧代庚酸（参考文献1）(150mg, 0.599 mmol)的二氯甲烷(5ml)溶液中，在室温下加入三乙胺 (115 μl, 0.825 mmol)和EDCI (157 mg, 0.825 mmol)。在氩气氛下、室温下进行18小时搅拌。将溶剂减压除去后，加入水，用乙酸乙酯提取，分别用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化铵水溶液、饱和食盐水洗涤有机层。用硫酸钠干燥后，将溶剂减压除去。将所得的粗产物通过硅胶色谱（氯仿/甲醇＝100:0 → 95:5）纯化，得到目标化合物5 (126 mg, 收率61%)。

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ：1.26-1.70 (m, 30H), 2.15 (t, J = 6.9 Hz,2H), 2.36 (t, J = 7.4 Hz, 2H),2.46 (t, J = 9.7 Hz, 1H), 3.11-3.29 (m, 3H),3.41-3.53 (m, 1H), 4.16-4.27 (m, 1H), 4.28-4.36 (m, 1H), 4.72-4.81 (m, 1H),4.89-4.98 (m, 1H), 5.11 (s, 2H), 5.55-5.65 (m, 1H), 7.28-7.40 (m, 5H). LRMS(ESI): m/z 644.10 [M+Na]⁺。

7-((4-((2S,3S,4R)-3,4-二氨基四氢噻吩-2-基)丁基)氨基)-7-氧代庚酸苄酯三氟乙酸盐（6）

[化15]

在化合物5 (126 mg, 0.203 mmol)的二氯甲烷 (4 ml)溶液中，在室温下加入三氟乙酸 (1 ml)。在氩气氛下、室温下进行2小时搅拌。将溶剂减压除去后，进行三次甲苯共沸，将三氟乙酸减压除去。粗产物6不进行进一步纯化操作而用于后续反应。

7-((4-((3aS,4S,6aR,E)-2-((叔丁氧基羰基)亚氨基)六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)丁基)氨基)-7-氧代庚酸苄酯（7）

[化16]

在化合物6 (0.203 mmol)的1,4-二噁烷溶液 (2 ml)、三乙胺 (141 μl, 1.02mmol)的混合溶液中，在室温下加入溶解于1,4-二噁烷 (1.5 ml)中的Goodman试剂 (83.4mg, 0.213 mmol)。在氩气氛下、50 ℃下进行2小时搅拌，将溶剂减压除去。将所得的粗产物通过硅胶色谱（氯仿/甲醇＝100:0 → 93:7）纯化，得到目标化合物7 (收率定量, 2个步骤)。

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ：1.22-1.78 (m, 21H), 2.15 (t, J = 7.4 Hz,2H), 2.35 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.88 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 3.01 (dd, J = 4.6Hz, 13,2 Hz, 1H), 3.10-3.20 (m, 1H), 3.21-3.28 (m, 1H), 3.29-3.38 (m, 1H),4.60 (dd, J = 4.6 Hz, 8.6 Hz, 1H), 4.79 (dd, J = 4.6 Hz, 8.0 Hz, 1H), 5.10(s, 2H), 7.30-7.40 (m, 5H). LRMS (ESI): m/z 547.25 [M+H]⁺。

7-((4-((3aS,4S,6aR,E)-2-((叔丁氧基羰基)亚氨基)六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)丁基)氨基)-7-氧代庚酸（8）

[化17]

在化合物7 (0.203 mmol)的甲醇 (3 ml)、水 (1.5 ml)的混合溶液中，在室温下加入氢氧化锂水合物 (21.3 mg, 0.51 mmol)。在氩气氛下、50 ℃下进行1小时20分钟搅拌，将溶剂减压除去。加入饱和氯化铵水溶液，用氯仿提取。用硫酸钠干燥后，将溶剂减压除去。将所得的粗产物通过硅胶色谱（氯仿/甲醇＝99:1 → 85:15 → 80:20 → 75:25）纯化，得到目标化合物8 (83.2 mg, 收率89%, 白色固体)。

¹H NMR (500 MHz,CD₃OD) δ：1.26-1.87 (m, 21H), 2.19 (t, J = 6.8 Hz, 2H),2.22 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.89 (d, J = 13.2 Hz, 1H),3.02 (dd, J = 4.6 Hz,13.2 Hz, 1H), 3.10-3.29 (m, 3H), 4.53 (dd, J = 4.6 Hz, 8.0 Hz, 1H), 4.76 (dd,J = 4.6 Hz, 8.6 Hz, 1H). LRMS (ESI): m/z 457.85 [M+H]⁺。

(5-((3-氧代-1-苯基-2,7,10-三氧杂-4-氮杂十二烷-12-基)氨基甲酰基)-1,3-亚苯基)二氨基甲酸二叔丁酯（10）

[化18]

在化合物9（参考文献2） (450 mg, 1.28 mmol)的甲醇 (5 ml)溶液中，在室温下加入(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸苄酯（参考文献3）(646 mg, 2.29mmol)与4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物 (DMTMM, 530 mg,1.92 mmol)。在氩气氛下、室温下进行115小时搅拌，将溶剂减压除去后，加入1 M HCl水溶液，用乙酸乙酯提取，将有机层分别用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水洗涤。用硫酸钠干燥后，将溶剂减压除去。将所得的粗产物通过硅胶色谱（氯仿/甲醇＝96:4）纯化，得到目标化合物10 (273 mg, 收率35%, 黄色固体)。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ：1.49 (s, 18H), 3.32-3.47 (m, 2H), 3.54-3.70(m, 10H), 5.07 (s, 2H), 5.36-5.47 (m, 1H), 6.68-6.86 (m, 2H), 6.88-6.98 (m,1H), 7.28-7.40 (m, 5H), 7.42-7.51(m, 2H), 7.67-7.77 (m, 1H)。

LRMS (ESI): m/z 617.05 [M+H]⁺。

(2-(2-(2-(3,5-二氨基苯甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸苄酯三氟乙酸盐（11）

[化19]

在化合物10 (86.8 mg, 0.14 mmol)的二氯甲烷 (4.5 ml)溶液中，在室温下加入三氟乙酸 (0.5 ml)。杂氩气氛下、室温下进行4小时搅拌，将溶剂减压除去。进行两次甲苯共沸，将三氟乙酸减压除去。粗产物11不进行进一步纯化操作而用于后续反应。

((3aS,4S,6aR,E)-4-(4-(7-((3-(7-((4-((3aS,4S,6aR,Z)-2-((叔丁氧基羰基)亚氨基)六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)丁基)氨基)-7-氧代庚酰胺基)-5-((3-氧代-1-苯基-2,7,10-三氧杂-4-氮杂十二烷-12-基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-7-氧代庚酰胺基)丁基)四氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-2(3H)-亚基)氨基甲酸叔丁酯（12）

[化20]

在化合物11 (37.9 mg, 58.8 μmol)和化合物8 (67.3 mg, 147 μmol)的DMF (1ml)、三乙胺 (65.6μl, 470 μmol)的混合溶液中，在室温下加入1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt, 32 mg, 235 μmol)和1-[双(二甲基氨基)甲基鎓]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧化物六氟磷酸盐 (HATU, 89.4 mg, 235 μmol)。在氩气氛下、室温下进行16小时搅拌。将溶剂减压除去后，加入水，用氯仿提取。用硫酸钠干燥后，将溶剂减压除去。将所得的残渣通过硅胶色谱（氯仿/甲醇＝97:3 → 75:25 → 40:60）粗纯化，得到包含目标化合物12的粗纯化物 (20.5 mg)。

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ1.21-1.90 (m, 42H), 2.19 (t, J = 7.2 Hz, 4H),2.37 (t, J = 7.2 Hz, 4H), 2.92 (d, J = 13.0 Hz, 2H), 3.01 (dd, J = 4.5 Hz,13.1 Hz, 2H), 3.05-3.67 (m, 18H), 4.51-4.60 (m, 2H), 4.75-85 (m, 2H), 5.03(s, 2H), 7.23-7.36 (m, 5H), 7.67-7.73 (m, 2H), 7.98-8.05(m, 1H). LRMS (ESI):m/z 647.90 [M+2H]²⁺。

N1,N1'-(5-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-1,3-亚苯基)双(N7-(4-((3aS,4S,6aR)-2-亚氨基六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)丁基)庚二酰胺) 2,2,2-三氟乙酸酯（13）

[化21]

在化合物12 (20.5mg, 15.8 μmol)的水溶液(150 μl)中，在室温下加入三氟乙酸(3 ml)。在氩气氛下、室温下进行14小时30分钟搅拌，将溶剂减压除去。将所得的粗产物通过反相HPLC（梯度：0% 5 min; 2-100% 90 min CH₃CN的0.1% CF₃COOH水溶液, 保留时间：35.2 min, YMC-Triart C18, 流速 = 3.5 ml/min）纯化，得到目标化合物13 (8.3 mg,收率11%, 2个步骤)。

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ：1.35-1.81 (m, 24H), 2.20 (t, J = 7.6 Hz,4H), 2.39 (t, J = 7.2 Hz, 4H), 2.81 (d, J = 13.5 Hz, 2H), 2.98 (dd, J = 4.9Hz, 13.0 Hz, 2H), 3.07-3.17 (m, 4H), 3.18-3.28 (m, 4H), 3.57 (t, J = 6.3 Hz,2H), 3.64-3.72 (m, 8H), 4.50 (dd, J = 4.5 Hz, 8.1 Hz, 2H), 4.71 (dd, J = 4.5Hz, 8.1 Hz, 2H), 7.76 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 7.90 (t, J = 1.8 Hz, 1H). LRMS(ESI): m/z 320.65 [M+3H]³⁺。

N1,N1'-(5-((2-(2-(2-(3-(三甲基甲锡烷基)苯甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-1,3-亚苯基)双(N7-(4-((3aS,4S,6aR)-2-亚氨基六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)丁基)庚烷二酰胺)甲酸酯（15）

[化22]

在化合物13 (5.9 mg, 4.5 μmol)的DMF (400μl)溶液中，在室温下加入化合物14（参考文献4） (1.9 mg, 5.0 μmol)和三乙胺 (9.5 μl, 68 μmol)。在氩气氛下、室温下进行3小时30分钟搅拌，将溶剂减压除去。将所得的粗产物通过反相HPLC（梯度：0% 5 min; 2-100% 90 min CH₃CN的0.1% HCOOH水溶液, 保留时间：40.5 min, YMC-Triart C18, 流速= 3.5 ml/min）纯化，得到目标化合物15 (3.4 mg, 收率 57%)。LRMS (ESI): m/z 614.10[M+2H]²⁺。

参考文献

1.Su, Z.; Yeagley, A. A.; Su, R.; Peng, L.; Melander, C. ChemMedCmem2012, 7, 2030-2039

2.Roy, B. C.; Malik, S. J. Org. Chem. 199, 64, 2969-2974。

3.Thoma, G.; Streiff, M. B.; Katapodis, A. G.; Duthaler, R. O.;Voelcker, N. H.; Ehrhardt, C.; Masson, C. Chem.-Eur. J. 2006, 12, 99-117。

4.GE HEALTHCARE LIMITED, Michelle, A.;Jane, B.; Peter, B. I. WO2010/86398, 2010, A1。

＜²¹¹At的标记＞

在N-溴代琥珀酰亚胺（0.00271 mg, 0.152 μmol）的甲醇（100 μl）和乙酸 (1 μl)的混合溶液中，加入溶解于甲醇（100 μl）的²¹¹At（10-150 MBq），在室温下进行1分钟搅拌后，加入溶解于甲醇(100 μl)的双亚氨基生物素（化合物15）（0.1 mg, 0.076 μmol），在室温下进行10分钟搅拌。在反应溶液中加入800μl的水进行稀释，通过反相HPLC（20% for 2min; 20-70% for 20 min CH₃CN in 0.1% CF₃COOH水溶液, 保留时间 = 9.7 min, YMC-Triart C18, 流速 = 4.7 ml/min）纯化，由此得到²¹¹At标记的化合物23（也记为²¹¹At-psycheBR）。

²¹¹At标记的化合物23（²¹¹At-psycheBR）的结构：

[化23]

关于²¹¹At-psycheB制造

具有下述结构的化合物24如国际公开WO2019/230905的实施例1所述那样合成。

化合物24（双亚氨基生物素 24（Psyche-B-ATE））的结构：

[化24]

＜²¹¹At的标记＞

在N-溴代琥珀酰亚胺（0.00271 mg, 0.152 μmol）的甲醇（100 μl）和乙酸 (1 μl)的混合溶液中，加入溶解于甲醇（100 μl）的²¹¹At（10-150 MBq），在室温下进行1分钟搅拌后，加入溶解于甲醇(100 μl)的双亚氨基生物素（化合物24）（0.1 mg, 0.076 μmol），在室温下进行10分钟搅拌。在反应溶液中加入800μl的水进行稀释，通过反相HPLC（20% for 2min; 20-70% for 20 min CH₃CN的0.1% CF₃COOH水溶液, 保留时间 = 9.7 min, YMC-Triart C18, 流速 = 4.7 ml/min）纯化，由此得到²¹¹At标记的化合物25（也记为²¹¹At-psyche-B）。

²¹¹At标记的化合物25（²¹¹At-Psyche-B）的结构：

[化25]

在经反相HPLC回收的化合物23和25的回收液中，加入0.1%TFA溶液，稀释至2倍，通过Sep-Pak固相提取柱(Sep-pak C18 light, Waters制)。通入0.5%抗坏血酸Na溶液6mL，从Sep-Pak柱上洗去不需要的溶剂和夹杂物，用包含50%乙醇0.5%乙酸0.5%抗坏血酸Na的PBS溶液1mL回收。

＜Cupid-scFv抗体的准备＞

（1）CEA-V2122蛋白（也称为Cupid-scFv抗体）的表达和纯化

V2122是国际公开WO2015/125820的实施例3（国际公开WO2015/125820のSEQ IDNO: 4）中记载的链霉抗生物素蛋白突变体。V2122的氨基酸序列（在C末端具有6×His标签的序列）记载于序列表的SEQ ID NO: 1。

scFv-V2122是在上述V2122上结合CEACAM5的单链抗体（scFv）而成的。该scFv型的抗CEACAM5抗体是在专利文献US7626011B2中记载的scFv序列。scFv型的抗CEACAM5抗体的氨基酸序列记载于序列表的SEQ ID NO: 2。另外，将scFv型的抗CEACAM5抗体与V2122通过氨基酸接头(GGGGSGGGG)（SEQ ID NO: 7）结合而成的CEA-V2122的氨基酸序列记载于序列表的SEQ ID NO: 3。

为了表达CEA-V2122融合蛋白，在大肠杆菌中优化CEA-V2122基因序列的DNA密码子并进行人工基因合成，所述CEA-V2122基因序列中，在N末端引入有用于在大肠杆菌中进行分泌表达的pelB信号，另外在C末端引入有6xHis-Tag序列。该氨基酸序列记载于序列表的SEQ ID NO: 4，DNA序列记载于序列表的SEQ ID NO: 5。另外，结构域结构的概略示于图1。

具体的蛋白表达载体使用了pETDuet1载体的MCS2上引入有伴侣skp基因的载体。skp基因是基于序列表的SEQ ID NO: 6中记载的氨基酸序列，进行使密码子对大肠杆菌最优化的DNA的人工基因合成。合成的skp基因使用引物（AAGGAGATATACATATGGATAAAATTGCCATTGTTAATAT（SEQ ID NO: 8）, TTGAGATCTGCCATATGTTATTTCACTTGTTTCAGAACG（SEQ ID NO:9）），通过PCR进行扩增，在用限制性酶NdeI直链化的pETDue1载体的MCS2上，利用In-FusionHD Cloning Kit进行克隆，制为pETDuet_skp。接着，在pETDuet_skp的MCS1上引入CEA-V2122基因。具体地，将人工合成的CEA-V2122基因使用引物（AGAAGGAGATATACCATGAAATATCTGCTGCCGAC（SEQ ID NO: 10）、CGCCGAGCTCGAATTTTAATGATGGTGATGATGATG（SEQ ID NO:11））通过PCR扩增。另外，使用引物（GGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC（SEQ ID NO: 12）、AATTCGAGCTCGGCGCGCCTGCAG（SEQ ID NO: 13）），通过PCR将pETDuet_skp直链化。将由PCR扩增的CEA-V2122和直链化的pETDuet_skp利用In-Fusion HD Cloning Kit进行克隆。经克隆的载体通过测序来确认引入的基因序列，制为pETDuet_CEA-V2122_skp。

为了蛋白表达，将pETDuet_CEA-V2122_skp转化至BL21(DE3)(Nippon Gene公司)，用2xYT培养基(SIGMA-ADLRICH公司)、37℃下进行一夜预培养。进行了预培养的培养基添加至新培养基中使之达到100倍稀释，在37℃下进行培养，直至OD(600nm) = 0.5～2.0。接着，添加最终浓度0.5mM IPTG，在37℃下进行4小时培养，回收培养上清后，在4℃下保存。

CEA-V2122蛋白通过分批法，利用添加于C末端的6xHis-Tag来进行粗纯化。具体地，将用缓冲液A(50mM TrisHCl, 0.2M NaCl, 1mM ED TA, 5mM 咪唑, pH8.0)平衡的cOmplete His-Tag Purification Resin添加至在4℃下保存的培养上清中，在4℃搅拌2小时至一夜，进行蛋白对树脂的结合处理。接着，将树脂回收至柱，用缓冲液A进行20柱容量的洗涤作业。然后，用缓冲液B(50mM TrisHCl, 0.2M NaCl, 1mM EDTA, 400mM 咪唑, pH8.0)洗脱，进行CEA-V2122的粗纯化物的回收。

接着，利用Protein L柱对粗纯化物进行纯化。具体地，将Capto L (GEHealthcare Life Sciences) 1mL填充于PD-10柱，用10倍柱体积的PBS平衡后，施加上述粗纯化物，用10倍柱体积的PBS洗涤后，用10mM 甘氨酸盐酸 pH2.0下洗脱，通过VivaspinTurbo 15 (MWCO 100,000)进行离心浓缩。进一步使用PD-10 (GE Healthcare LifeSciences公司)，对PBS进行缓冲液置换，进一步利用Vivaspin Turbo 4 (MWCO 100,000)进行离心浓缩，制为最终纯化物。SDS-PAGE电泳后，通过CBB染色进行4聚体CEA-V2122的纯度的检测，结果示于图2。SDS-PAGE凝胶使用Mini-PROTEAN TGX 4-15% (Bio-Rad公司)，CBB染色液使用Bullet CBB Stain One(Ready To Use) (ナカライテスク公司）。

由图2确认，纯化的CEA-V2122以约150kDa的4聚体为主成分。

（2）CEA-V2122的SPR中的性能评价

CEA-V2122与抗原CEACAM5的亲和性是使用表面等离子体共振（SPR）测定装置：Biacore T200 (GE Healthcare Life Sciences公司)来实施。具体地，将RecombinantHuman CEACAM-5/CD66e Protein, CF (R&D SYSTEMS公司)使用胺偶联试剂盒 (GEHealthcare Life Sciences公司)固定于Sensor Chip CM5 (GE Healthcare LifeSciences公司)上，配体的最终固定量为279RU。另外，将纯化的CEA-V2122调整为1E-08 M至6.25E-10 M的2倍稀释系列，作为分析物。相互作用分析是通过Single-Cycle Kinetics分析进行数据获得。将所得数据通过Biacore T200 Evaluation Software, version 2.0，利用Bivalent Analyze模式实施曲线拟合，得到ka1=3.208E+5、kd1=3.461E-7的值。另外，Bivalent Analyze中可以在K_D＝kd1/ka1下进行评价，因此得到K_D＝kd1/ka1= 3.461E-7/3.208E+5=1.078E-12的评价值。这些结果示于图3。

由图3所示的传感图、K_D值确认CEA-V2122强烈地结合于CEACAM5。

另外，CEA-V2122与生物素变体的相互作用分析也使用Biacore T200来实施。具体的生物素变体是国际公开WO2018/07239的实施例1中记载的標題化合物14。另外具体的分析方法如下所述。使用胺偶联试剂盒，以目标值为5000RU的方式进行设定，将纯化的CEA-V2122固定于Sensor Chip CM5上。分析物的浓度使用5种1E-08 M至6.25E-10 M的2倍稀释系列。相互作用分析是通过Single-Cycle Kinetics分析进行数据获得。将所得数据通过Biacore T200 Evaluation Software, version 2.0，利用Bivalent Analyze模式实施曲线拟合，得到ka1=3.792E+4、kd1=4.424E-6的值。另外，Bivalent Analyze中可以在K_D＝kd1/ka1下进行评价，因此得到K_D＝kd1/ka1= 3.792E+4/4.424E-6=1.167E-10的评价值。这些结果示于图4。

由图4所示的传感图、K_D值确认CEA-V2122强烈地结合于生物素变体。

＜¹²⁵I标记的Cupid＞

¹²⁵I标记的Cupid通过下述方法制作。

在预先加入有38.2 µg的N-琥珀酰亚胺基3-(三甲基锡烷基)苯甲酸酯(简称ATE,Toronto Research Chemicals, North York, Canada)的反应容器中，加入11 µL的N-氯代琥珀酰亚胺的甲醇溶液(1mg/mL)、12 µL的Na¹²⁵I溶液(23.2 MBq)和41 µL的1%乙酸/甲醇，在室温下进行45分钟搅拌。

在反应溶液中加入40 µL的超纯水并混合后，通过反相HPLC（流动相A: 1%CF₃COOH/水、流动相B: 1%CF₃COOH/MeCN; 流动相B 40-60%（20分）, 保留时间 8.7 min, 柱Cosmosil 5C₁₈-AR-II (4.6 × 15 mm, Nacalai Tesque, Kyoto, Japan), 流速 1.0 mL/min）纯化，收集包含[¹²⁵I]SIB的级分，得到N-琥珀酰亚胺基3-[¹²⁵I]碘代苯甲酸酯 ([¹²⁵I]SIB)。将通过反相HPLC回收的[¹²⁵I]SIB收集液用蒸发器进行溶剂干燥，用超纯水25 µL再溶解。

在[¹²⁵I]SIB水溶液25uL中加入scFv-CEA-Cupid溶液[4.1mg/mL] 50uL和25uL的0.1M 硼酸缓冲液(pH 8.5)，在冰冷条件下反应2小时。然后将反应溶液通过PD-10柱(GEHealthcare, Uppsala, Sweden)，用PBS洗脱，得到标题化合物X。分离的试样通过使用Tec-control Chromatography 150-771 strip (BIODEX, Shirley, NY, USA)的薄层色谱和尺寸排阻HPLC来检测纯度。

・SIB合成时的标记率

75.6%(可以由HPLC以馏分回收的SIB)

※HPLC上为92.6%

・¹²⁵I-Cupid的标记率

49.4%(由PD-10出来的¹²⁵I-Cupid)

※SE-HPLC上为66.1%

・放射化学纯度

SE-HPLC: 98.0%

iTLC: 99.7%

参考文献：

Zalutsky MR, Narula AS. Astatination of proteins using an N-succinimidyl tri-n-butylstannyl benzoate intermediate. Int J Rad Appl InstrumA. 1988;39(3):227-32.

［实验1：移植有癌胚抗原（CEA）的高表达胃癌细胞（MKN-45）的MKN-45荷瘤模型小鼠中的¹²⁵I-Cupid-scFv抗体的体内动态研究］

＜目的＞

在评价²¹¹At-psyche针对与癌细胞表达的CEA结合的Cupid-scFv抗体的体内动态之前，需要掌握Cupid-scFv抗体结合癌细胞的比例、血液清除率、正常组织中的积聚比例。因此，本研究中对MKN-5荷瘤模型小鼠中的Cupid-scFv抗体的体内动态进行了调查。

＜方法＞

本实验中，使用了CEA表达高的人胃癌细胞（MKN-45）。小鼠使用了雄性、9周龄的免疫缺陷小鼠（BALB/cSlc nu/nu）。通过在小鼠的右肩背侧的皮下植入MKN-45细胞（1x10⁷/0.1ml），制作MKN-45荷瘤模型小鼠。在肿瘤体积达到恒定大小的时刻（移植后第13日）将小鼠分组为8组，从小鼠的尾静脈以每只100pmol（约0.18MBq/100ml）施用¹²⁵I标记抗Cupid-scFv抗体（¹²⁵I-Cupid-scFv抗体）。另外，为了通过Cupid-scFv抗体的施用量来评价对CEA的结合量，对一组施用50pmol。¹²⁵I-Cupid-scFv抗体的施用1分钟、1小时、6小时、12小时、24小时（100pmol）、24小时（50pmol）、48小时和72小时后，在异氟烷麻醉下从小鼠的心脏抽全血，由此将小鼠安乐死，摘出肿瘤组织和正常组织・脏器。正常组织・脏器：皮肤（右下肢）、肌肉（右腓肠肌）、心脏、肺、脾脏、胰脏、白色脂肪（右侧睾丸的上部）、睾丸（右侧））、胃（不含内容物）、小肠（含内容物）、大肠（含内容物）、肝脏、棕色脂肪（肩胛骨间）、颌下腺、甲状腺（与气管一起）、骨（右大腿骨）、大脑、眼球（两侧）、膀胱（不含尿）；将剩余的残骸3等分，作为剩余-1、剩余-2、剩余-3。然后，测定血液、血浆、肿瘤、和正常组织・脏器的重量，用γ计数器测定其放射性。计算血液、血浆、肿瘤、和正常组织・脏器中的¹²⁵I-Cupid-scFv抗体的积聚量（放射性）。即，以施用的¹²⁵I-Cupid-scFv抗体中在每单位重量（g）的血液、血浆、肿瘤、和正常组织・脏器中积聚的比例（%ID/g）来表示。对于甲状腺中的¹²⁵I-Cupid-scFv抗体的积聚，由于无法准确测定甲状腺的重量，因此以施用的¹²⁵I-Cupid-scFv抗体中在甲状腺中积聚的比例（%ID）来表示。

＜结果＞

图5表示¹²⁵I-Cupid-scFv抗体的体内分布（%ID/g）。

图6表示¹²⁵I-Cupid-scFv抗体在肿瘤组织中的积聚量（%ID/g）。

图7表示¹²⁵I-Cupid-scFv抗体在甲状腺中的积聚量（%ID）、肿瘤对血液比、肿瘤对肌肉比。

¹²⁵I-Cupid-scFv抗体自血中的清除率在1分钟是50.0±1.6%、1小时是40.1±2.8%、6小时是25.1±1.4%ID/g、12小时是15.5±1.4%ID/g、24小时是6.4±0.8%ID/g（50pmol:6.6±0.5%ID/g）、48小时是1.9±0.2%ID/g、和72小时是0.4±0.1%ID/g。即，¹²⁵I-Cupid-scFv抗体自血中的排出随着时间而降低，在24小时时降低至施用量的约94%、在48小时降低至约98%、在72小时降低至约99.6%。

¹²⁵I-Cupid-scFv抗体在肿瘤中的积聚在1分钟是0.6±0.2%ID/g、1小时是3.2±0.6%ID/g、6小时是10.4±1.7%ID/g、12小时是14.0±3.1%ID/g、24小时是13.5±0.6%（50pmol:12.6±1.3%ID/g）、48小时是9.9±1.6%ID/g、和72小时是5.9±0.7%ID/g。即，¹²⁵I-Cupid-scFv抗体在肿瘤中的积聚随着时间而增加，在12小时时达到峰值。在24小时、48小时后也维持高的积聚。在72小时时降低至峰值的约一半。¹²⁵I-Cupid-scFv抗体在肿瘤中的积聚在施用24小时后100pmol与50pmol之间为大致相同水平。

肿瘤对血液比在1分钟是0.01±0.00、1小时是0.06±0.03、6小时是0.33±0.16、12小时是0.79±0.28、24小时是1.79±0.71（50pmol:1.94±0.33）、48小时是4.43±1.75、和72小时是12.74±6.24。

肿瘤对肌肉比在1分钟是1.5±0.3、1小时是4.0±2.2、6小时是12.7±5.0、12小时是19.7±4.4、24小时是32.1±6.5（34.6±8.5）、48小时是57.7±14.4、和72小时是159.8±72.0。

在甲状腺中的积聚相当低（小于0.05%ID）。另外，没有发现随着时间而增加的倾向。

［实验2：MKN-45荷瘤模型小鼠中的Cupid-scFv抗体（24h前）＋²¹¹At-psyche-B的体内动态研究］

＜目的＞

在MKN-45荷瘤模型小鼠中，调查²¹¹At-psyche-B针对之前施用的（24h前）Cupid-scFv抗体的体内动态。

＜方法＞

本实验中，使用了CEA表达高的人胃癌细胞（MKN-45）。小鼠使用了雄性、9周龄的免疫缺陷小鼠（BALB/cScl nu/nu）。通过在小鼠的右肩背侧的皮下植入MKN-45细胞（1x10⁷/0.1ml），制作MKN-45荷瘤模型小鼠。在肿瘤体积达到恒定大小的时刻（移植后第13日）分组为4组，从小鼠的尾静脈以每只100pmol/0.1ml施用Cupid-scFv抗体。在Cupid-scFv抗体施用24小时后，由小鼠的尾静脈施用²¹¹At-psyche-B（约0.25MBq/100ml）。在²¹¹At-psyche-B施用1分钟、1小时、6小时和24小时后，在异氟烷麻醉下从小鼠的心脏抽全血，由此将小鼠安乐死，摘出肿瘤组织和正常组织・脏器。正常组织・脏器：皮肤（右下肢）、肌肉（右腓肠肌）、心脏、肺、脾脏、胰脏、白色脂肪（右侧睾丸的上部）、睾丸（右侧）、胃（无内容物）、小肠、大肠、肝脏、棕色脂肪、颌下腺、甲状腺（与气管一起）、骨（右大腿骨）、大脑、眼球（两侧）、膀胱、尿；将剩余的残骸3等分，作为剩余-1、剩余-2、剩余-3。然后，测定血液、血浆、尿、肿瘤、和正常组织・脏器的重量，用γ计数器测定其放射性。计算血液、血浆、尿、肿瘤、和正常组织・脏器中的²¹¹At-psyche-B的积聚量（放射性）。即，以施用的²¹¹At-psyche-B中在每单位重量（g）的血液、血浆、尿、肿瘤、和正常组织・脏器中积聚的比例（%ID/g）来表示。对于甲状腺中的²¹¹At-psyche-B的积聚，由于无法准确测定甲状腺的重量，因此以施用的²¹¹At-psyche-B中在甲状腺中积聚的比例（%ID）来表示。

＜结果＞

图8表示Cupid-scFv抗体 (24h前)+ ²¹¹At-psyche-B的体内分布（%ID/g）。

图9表示Cupid-scFv抗体 (24h前)+ ²¹¹At-psyche-B在甲状腺中的积聚（%ID）、肿瘤对血液比、肿瘤对肌肉比。

²¹¹At-psyche-B自血中的清除率在1分钟是46.4±1.4% Id/g、1小时是40.6±3.2%ID/g、6小时是29.4±0.9%ID/g、24小时是6.2±1.3%ID/g。即，血中的²¹¹At-psyche-B的积聚随着时间而降低，在24小时时施用量的约94%被排出。

²¹¹At-psyche-B在肿瘤中的积聚在1分钟是0.6±0.1%ID/g、1小时是3.2±0.4%ID/g、6小时是11.8±1.5%ID/g、24小时是16.3±4.1%。即，²¹¹At-psyche-B在肿瘤中的积聚随着时间而增加。

肿瘤对血液比在1分钟是0.01±0.00、1小时是0.08±0.01、6小时是0.40±0.05、24小时是2.63±0.10。

肿瘤对肌肉比在1分钟是1.5±0.3、1小时是5.2±1.0、6小时是14.0±0.9、24小时是26.5±4.6。

甲状腺中的积聚虽然低（在24h是0.16±0.06%ID），但确认到随时间增加的倾向。

肝脏中的²¹¹At-psyche-B在1分钟是17.4±2.3%ID/g、1小时是13.6±1.4%ID/g、6小时是16.0±1.4%ID/g、24小时是15.5±0.1%。即，肝脏中的²¹¹At-psyche-B的积聚在刚施用后就高，维持于高值直至24小时。

脾脏中的²¹¹At-psyche-B在1分钟是4.9±1.7%ID/g、1小时是7.9±1.1%ID/g、6小时是10.1±0.3%ID/g、24小时是9.6±2.4%。即，脾脏中的²¹¹At-psyche-B的积聚随着时间而增加，在6小时达到峰值，在24小时后也显示出高值。

肾脏中的²¹¹At-psyche-B在1分钟是29.3±1.5%ID/g、1小时是14.2±1.3%ID/g、6小时是9.8±0.7%ID/g、24小时是4.7±0.8%。即，肾脏中的²¹¹At-psyche-B的积聚随着时间而降低，在24小时时降低至施用量的5%。

肺中的²¹¹At-psyche-B在1分钟是15.9±1.7%ID/g、1小时是14.7±3.6%ID/g、6小时是11.2±0.9%ID/g、24小时是4.2±0.5%。即，肺中的²¹¹At-psyche-B的积聚虽然直至6小时为止均高，但在24小时时降低至施用量的4%。

［实验3：MKN-45荷瘤模型小鼠中的Cupid-scFv抗体（48h前）＋²¹¹At-psyche-B的体内动态研究］

根据实验1的¹²⁵I-Cupid-scFv抗体的体内动态实验结果，¹²⁵I-Cupid-scFv抗体施用48小时后，血液的¹²⁵I-Cupid-scFv抗体的积聚低，与之相对，肿瘤中的¹²⁵I-Cupid-scFv抗体积聚显示高值。

＜目的＞

在MKN-45荷瘤模型小鼠中，调查²¹¹At-psyche-B针对之前施用的（48h前）Cupid-scFv抗体的体内动态。

＜方法＞

本实验中，使用了CEA表达高的人胃癌细胞（MKN-45）。小鼠使用了雄性、9周龄的免疫缺陷小鼠（BALB/cSlc nu/nu）。通过在小鼠的右肩背侧的皮下植入MKN-45细胞（1x10⁷/0.1ml），制作荷瘤模型小鼠。在肿瘤体积达到恒定大小的时刻（移植第12日）将小鼠分组为4组，从小鼠的尾静脈以每只100pmol/0.1ml施用Cupid-scFv抗体。在Cupid-scFv抗体施用48小时后，由小鼠的尾静脈施用²¹¹At-psyche-B（约0.25MBq/100ml）。在²¹¹At-psyche-B施用1分钟、1小时、6小时和24小时后，在异氟烷麻醉下从小鼠的心脏抽全血，由此将小鼠安乐死，摘出肿瘤组织和正常组织・脏器。正常组织・脏器：皮肤（右下肢）、肌肉（右腓肠肌）、心脏、肺、脾脏、胰脏、白色脂肪（右侧睾丸的上部）、睾丸（两侧）、胃、胃内容物、小肠（含内容物）、大肠（含内容物）、肝脏、棕色脂肪（肩胛骨间）、颌下腺、甲状腺（与气管一起）、骨（右大腿骨）、大脑、眼球（两侧）、膀胱、尿；将剩余的残骸3等分，作为剩余-1、剩余-2、剩余-3。然后，测定血液、血浆、尿、肿瘤、和正常组织・脏器的重量，用γ计数器测定其放射性。计算血液、血浆、尿、肿瘤、和正常组织・脏器中的²¹¹At-psyche-B的积聚量（放射性）。即，以施用的²¹¹At-psyche-B中在每单位重量（g）的血液、血浆、尿、肿瘤、和正常组织・脏器中积聚的比例（%ID/g）来表示。对于甲状腺中的²¹¹At-psyche-B的积聚，由于无法准确测定甲状腺的重量，因此以施用的²¹¹At-psyche-B中在甲状腺中积聚的比例（%ID）来表示。

＜结果＞

图10表示Cupid-scFv抗体 (48h前)+ ²¹¹At-psyche-B的体内分布（%ID/g）。

图11表示Cupid-scFv抗体 (48h前)+²¹¹At-psyche-B在甲状腺中的积聚量（%ID）、肿瘤对血液比、肿瘤对肌肉比。

²¹¹At-psyche-B自血中的清除率在1分钟是30.7±2.2% Id/g、1小时是30.8±5.5%ID/g、6小时是19.0±2.6%ID/g、24小时是2.6±0.5%ID/g。即，血中的²¹¹At-psyche-B的积聚在1分钟与1小时为相同程度，在24小时时降低至施用量的约2.6%。

²¹¹At-psyche-B在肿瘤中的积聚在1分钟是0.5±0.1%ID/g、1小时是3.2±0.7%ID/g、6小时是9.9±2.9%ID/g、24小时是11.3±3.3%。即，²¹¹At-psyche-B在肿瘤中的积聚随着时间而增加。

肿瘤对血液比在1分钟是0.02±0.00、1小时是0.11±0.02、6小时是0.51±0.09、24小时是4.38±0.85。

肿瘤对肌肉比在1分钟是1.0±0.3、1小时是4.7±0.4、6小时是13.1±3.5、24小时是23.2±7.2。

甲状腺中的²¹¹At-psyche-B的积聚低（24h是0.16±0.02%ID），但确认到随时间而增加的倾向。

肝脏中的²¹¹At-psyche-B在1分钟是41.4±6.2%ID/g、1小时是25.6±2.5%ID/g、6小时是23.6±2.3%ID/g、24小时是19.3±0.6%。即，肝脏中的²¹¹At-psyche-B的积聚在刚施用后高，随着时间而降低，但在24小时显示出高值。

脾脏中的²¹¹At-psyche-B在1分钟是3.5±0.1%ID/g、1小时是8.5±0.6%ID/g、6小时是11.1±0.7%ID/g、24小时是10.2±1.6%。即，脾脏中的²¹¹At-psyche-B的积聚随着时间而增加，在6小时达到峰值，在24小时后也显示出高值。

肾脏中的²¹¹At-psyche-B在1分钟是62.3±9.8%ID/g、1小时是38.0±4.5%ID/g、6小时是14.9±0.8%ID/g、24小时是6.6±0.2%。即，²¹¹At-psyche-B在施用后立即从肾脏排出，在24小时时降低至施用量的6.6%。

肺中的²¹¹At-psyche-B在1分钟是10.2±1.6%ID/g、1小时是12.2±0.9%ID/g、6小时是8.5±0.9%ID/g、24小时是3.5±0.2%。即，肺中的²¹¹At-psyche-B的积聚在1小时达到峰值，然后随时间而降低，在24小时时降低至施用量的3.5%。

［实验4：MKN-45荷瘤模型小鼠中的²¹¹At-psycheB的体内动态研究］

＜目的＞

在MKN-45荷瘤模型小鼠中，在Cupid-scFv抗体不存在的状态下调查²¹¹At-psyche-B的体内动态。

＜方法＞

本实验中，使用了癌胚抗原（CEA）表达高的人胃癌细胞（MKN-45）。小鼠使用了雄性、9周龄的免疫缺陷小鼠（BALB/cScl nu/nu）。通过在小鼠的右肩背侧的皮下植入MKN-45细胞（1x10⁷/0.1ml），制作荷瘤模型小鼠。在肿瘤体积达到恒定大小的时刻（移植后第14日）将小鼠分组为4组，从小鼠的尾静脈施用²¹¹At-psyche-B (约0.25MBq/00ml)。在²¹¹At-psyche-B施用1分钟、1小时、6小时和24小时后，在异氟烷麻醉下从小鼠的心脏抽全血，由此将小鼠安乐死，摘出肿瘤组织和正常组织・脏器。正常组织・脏器：皮肤（右下肢）、肌肉（右侧腓肠肌）、心脏、肺、脾脏、胰脏、白色脂肪（右侧睾丸的上部）、睾丸（两侧）、胃、胃内容物、小肠（含内容物）、大肠（含内容物）、肝脏、棕色脂肪（肩胛骨间）、颌下腺、甲状腺（与气管一起）、骨（右大腿骨）、脑、眼球、膀胱、尿；将剩余的残骸3等分，作为剩余-1、剩余-2、剩余-3。然后，测定血液、血浆、尿、肿瘤、和正常组织・脏器的重量，用γ计数器测定其放射性。计算血液、血浆、尿、肿瘤、和正常组织・脏器中的²¹¹At-psyche-B的积聚量（放射性）。即，以施用的²¹¹At-psyche-B中在每单位重量（g）的血液、血浆、尿、肿瘤、和正常组织・脏器中积聚的比例（%ID/g）来表示。对于甲状腺中的²¹¹At-psyche-B的积聚，由于无法准确测定甲状腺的重量，因此以施用的²¹¹At-psyche-B中在甲状腺中积聚的比例（%ID）来表示。

＜结果＞

图12表示²¹¹At-psyche-B的体内分布（%ID/g）。

图13表示甲状腺中的²¹¹At-psyche-B的积聚量（%ID）。

血中的²¹¹At-psyche-B的积聚在1分钟是10.4±1.1% ID/g、1小时是3.8±0.3%ID/g、6小时是0.4±0.1%ID/g、24小时是0.2±0.04%ID/g。即，血中的²¹¹At-psyche-B的积聚在1分钟时刻已降低，在24小时时降低至施用量的约0.2%，自血液的清除相当快。

²¹¹At-psyche-B在肿瘤中的积聚在1分钟是0.3±0.05%ID/g、1小时是1.0±0.1%ID/g、6小时是1.0±0.1%ID/g、24小时是0.3±0.02%。即，几乎没有确认到肿瘤中的²¹¹At-psyche-B的积聚。

甲状腺中的积聚低，在6h时是0.16±0.06%ID。

肾脏中的²¹¹At-psyche-B在1分钟是61.4±6.5%ID/g、1小时是57.2±3.1%ID/g、6小时是17.7±1.9%ID/g、24小时是5.1±0.9%。即，²¹¹At-psyche-B在施用后立即积聚于肾脏，但在24小时时降低至施用量的5.1%。

肝脏中的²¹¹At-psyche-B在1分钟是49.1±6.2%ID/g、1小时是35.3±3.3%ID/g、6小时是16.8±0.7%ID/g、24小时是9.0±1.4%。即，肝脏中的²¹¹At-psyche-B的积聚在刚施用后高，随着时间而降低，但在24小时显示出高值。

［实验5：MKN-45荷瘤模型小鼠中的Cupid-scFv抗体（24h前）＋²¹¹At-psyche-BR的体内动态研究］

＜目的＞

在MKN-45荷瘤模型小鼠中，调查²¹¹At-psyche-BR针对之前施用的（24h前）Cupid-scFv抗体的体内动态。

＜方法＞

本实验中，使用了癌胚抗原（CEA）表达高的人胃癌细胞（MKN-45）。小鼠使用了雄性、9周龄的免疫缺陷小鼠（BALB/cSlc nu/nu）。通过在小鼠的右肩背侧的皮下植入MKN-45细胞（1x10⁷/0.1ml），制作荷瘤模型小鼠。在肿瘤体积达到恒定大小的时刻（移植后第13日）将小鼠分组为4组，从小鼠的尾静脈以每只100pmol/0.1ml施用Cupid-scFv抗体。在Cupid-scFv抗体施用24小时后，由小鼠的尾静脈施用²¹¹At-psyche-BR（约0.25MBq/100ml）。在²¹¹At-psyche-BR施用1分钟、1小时、6小时和24小时后，在异氟烷麻醉下从小鼠的心脏抽全血，由此将小鼠安乐死，摘出肿瘤组织和正常组织・脏器。正常组织・脏器：皮肤（右下肢）、肌肉（右腓肠肌）、心脏、肺、脾脏、胰脏、白色脂肪（右侧睾丸的上部）、睾丸（两侧）、胃、胃内容物、小肠（含内容物）、大肠（含内容物）、肝脏、棕色脂肪（肩胛骨间）、颌下腺、甲状腺（与气管一起）、骨（右大腿骨）、大脑、眼球（两侧）、膀胱、尿；将剩余的残骸3等分，作为剩余-1、剩余-2、剩余-3。然后，测定血液、血浆、尿、肿瘤、和正常组织・脏器的重量，用γ计数器测定其放射性。计算血液、血浆、尿、肿瘤、和正常组织・脏器中的²¹¹At-psyche-B的积聚量（放射性）。即，以施用的²¹¹At-psyche-BR中在每单位重量（g）的血液、血浆、尿、肿瘤、和正常组织・脏器中积聚的比例（%ID/g）来表示。对于甲状腺中的²¹¹At-psyche-BR的积聚，由于无法准确测定甲状腺的重量，因此以施用的²¹¹At-psyche-BR中在甲状腺中积聚的比例（%ID）来表示。

＜结果＞

图14表示Cupid-scFv抗体 (24h前)+²¹¹At-psyche-BR体内分布（%ID/g）。

图15表示Cupid-scFv抗体 (24h前)+²¹¹At-psyche-BR在甲状腺中的积聚量（%ID）、肿瘤对血液比、肿瘤对肌肉比。

²¹¹At-psyche-BR自血中的清除率在1分钟是46.9±1.1% ID/g、1小时是39.5±5.2% ID/g、6小时是25.3±1.0%ID/g、24小时是8.3±0.5%ID/g。即，血中的²¹¹At-psyche-B的积聚随着时间而降低，在24小时时施用量的约92%被排出。

肿瘤中的²¹¹At-psyche-BR的积聚在1分钟是0.6±0.1%ID/g、1小时是3.1±0.7%ID/g、6小时是9.3±0.6%ID/g、24小时是18.4±2.5%。即，肿瘤中的²¹¹At-psyche-BR的积聚随着时间而增加。

肿瘤对血液比在1分钟是0.01±0.00、1小时是0.08±0.02、6小时是0.7±0.02、24小时是2.23±0.41。

肿瘤对肌肉比在1分钟是1.22±0.05、1小时是5.11±1.81、6小时是12.80±1.86、24小时是25.07±3.68。

甲状腺中的²¹¹At-psyche-BR的积聚低（24h是0.15±0.05%ID），但确认到随时间而增加的倾向。

肝脏中的²¹¹At-psyche-BR在1分钟是13.3±2.2%ID/g、1小时是11.4±0.7%ID/g、6小时是12.8±0.2%ID/g、24小时是7.8±0.9%。即，肝脏中的²¹¹At-psyche-BR的积聚在刚施用后就高，直至6小时均保持于恒定水平，在24小时时降低至1分钟时的约一半。

脾脏中的²¹¹At-psyche-BR在1分钟是4.7±0.4%ID/g、1小时是7.1±0.2%ID/g、6小时是8.4±1.0%ID/g、24小时是5.5±1.1%。即，脾脏中的²¹¹At-psyche-BR的积聚随着时间而增加，在6小时达到峰值，在24小时后降低至1分钟时的水平。

肾脏中的²¹¹At-psyche-BR在1分钟是28.6±1.3%ID/g、1小时是17.1±1.4%ID/g、6小时是9.5±0.2%ID/g、24小时是5.4±0.5%。

肺中的²¹¹At-psyche-BR在1分钟是14.4±1.6%ID/g、1小时是13.2±2.2%ID/g、6小时是9.1±1.0%ID/g、24小时是5.3±0.1%。即，肺中的²¹¹At-psyche-BR的积聚随着时间而降低。

［实验6：MKN-45荷瘤模型小鼠中的Cupid-scFv抗体（48h前）＋²¹¹At-psyche-BR的体内动态研究］

＜目的＞

在MKN-45荷瘤模型小鼠中，调查²¹¹At-psyche-BR针对之前施用的（48h前）Cupid-scFv抗体的体内动态。

＜方法＞

本实验中，使用了癌胚抗原（CEA）表达高的人胃癌细胞（MKN-45）。小鼠使用了雄性、9周龄的免疫缺陷小鼠（BALB/cSlc nu/nu）。通过在小鼠的右肩背侧的皮下植入MKN-45细胞（1x10⁷/0.1ml），制作荷瘤模型小鼠。在肿瘤体积达到恒定大小的时刻（移植后第12日）将小鼠分组为4组，从小鼠的尾静脈以每只100pmol/0.1ml施用Cupid-scFv抗体。在Cupid-scFv抗体施用48小时后，由小鼠的尾静脈施用²¹¹At-psyche-BR（约0.25MBq/100ml）。在²¹¹At-psyche-BR施用1分钟、1小时、6小时和24小时后，在异氟烷麻醉下从小鼠的心脏抽全血，由此将小鼠安乐死，摘出肿瘤组织和正常组织・脏器。正常组织・脏器：皮肤（右下肢）、肌肉（右腓肠肌）、心脏、肺、脾脏、胰脏、白色脂肪（右侧睾丸的上部）、睾丸（两侧）、胃、胃内容物、小肠（不含内容物）、大肠（不含内容物）、肝脏、棕色脂肪（肩胛骨间）、颌下腺、甲状腺（与气管一起）、骨（右大腿骨）、大脑、眼球（两侧）、膀胱、尿；将剩余的残骸3等分，作为剩余-1、剩余-2、剩余-3。然后，测定血液、血浆、尿、肿瘤、和正常组织・脏器的重量，用γ计数器测定其放射性。计算血液、血浆、尿、肿瘤、和正常组织・脏器中的²¹¹At-psyche-BR的积聚量（放射性）。即，以施用的²¹¹At-psyche-BR中在每单位重量（g）的血液、血浆、尿、肿瘤、和正常组织・脏器中积聚的比例（%ID/g）来表示。对于甲状腺中的²¹¹At-psyche-BR的积聚，由于无法准确测定甲状腺的重量，因此以施用的²¹¹At-psyche-BR中在甲状腺中积聚的比例（%ID）来表示。

＜结果＞

图16表示Cupid-scFv抗体 (48h前)+²¹¹At-psyche-BR体内分布（%ID/g）。

图17表示甲状腺中的Cupid-scFv抗体 (48h前)+²¹¹At-psyche-BR的积聚（%ID）、肿瘤对血液比、肿瘤对肌肉比。

²¹¹At-psyche-BR自血中的清除率在1分钟是26.4±2.7% ID/g、1小时是30.6±3.2% ID/g、6小时是22.7±2.7%ID/g、24小时是1.6±1.0%ID/g。即，血中的²¹¹At-psyche-BR的积聚维持了恒定程度的水平直至6小时，但在24小时时施用量的约98%被排出。

肿瘤中的²¹¹At-psyche-BR的积聚在1分钟是0.5±0.0%ID/g、1小时是3.2±0.5%ID/g、6小时是9.3±1.4%ID/g、24小时是7.4±2.3%。即，肿瘤中的²¹¹At-psyche-BR的积聚在6小时达到峰值。

肿瘤对血液比在1分钟是0.02±0.00、1小时是0.10±0.01、6小时是0.42±0.11、24小时是5.39±1.56。

肿瘤对肌肉比在1分钟是1.30±0.06、1小时是5.13±0.67、6小时是11.42±1.05、24小时是27.98±2.34。

甲状腺中的²¹¹At-psyche-BR的积聚低（24h是0.19±0.03%ID），但确认到随时间而增加的倾向。

肝脏中的²¹¹At-psyche-BR的积聚在1分钟是31.5±4.3%ID/g、1小时是19.8±1.3%ID/g、6小时是18.7±2.7%ID/g、24小时是8.9±1.7%。即，肝脏中的²¹¹At-psyche-BR的积聚在刚施用后高，然后随着时间而降低。

脾脏中的²¹¹At-psyche-BR的积聚在1分钟是3.4±0.2%ID/g、1小时是6.8±0.3%ID/g、6小时是9.7±1.0%ID/g、24小时是4.6±1.6%。即，脾脏中的²¹¹At-psyche-BR的积聚随着时间而增加，在6小时达到峰值，在24小时后降低至1分钟时的水平。

肾脏中的²¹¹At-psyche-BR的积聚在1分钟是81.7±11.8%ID/g、1小时是54.5±4.0%ID/g、6小时是15.0±2.3%ID/g、24小时是5.6±1.0%。

肺中的²¹¹At-psyche-BR的积聚在1分钟是9.5±0.4%ID/g、1小时是12.7±0.6%ID/g、6小时是7.5±3.3%ID/g、24小时是2.9±0.3%。

［实验7：MKN-45荷瘤模型小鼠中的²¹¹At-psycheBR的体内动态研究］

＜目的＞

在MKN-45荷瘤模型小鼠中，在Cupid-scFv抗体不存在的状态下调查²¹¹At-psyche-BR的体内动态。

＜方法＞

本实验中，使用了癌胚抗原（CEA）表达高的人胃癌细胞（MKN-45）。小鼠使用了雄性、9周龄的免疫缺陷小鼠（BALB/cSlc nu/nu）。通过在小鼠的右肩背侧的皮下植入MKN-45细胞（1x10⁷/0.1ml），制作荷瘤模型小鼠。在肿瘤体积达到恒定大小的时刻（移植后第19日）将小鼠分组为4组，从小鼠的尾静脈施用²¹¹At-psyche-BR。在²¹¹At-psyche-BR施用1分钟、1小时、6小时和24小时后，在异氟烷麻醉下从小鼠的心脏抽全血，将小鼠安乐死，摘出肿瘤组织和正常组织・脏器。正常组织・脏器：肌肉（右腓肠肌）、心脏、肺、脾脏、胰脏、睾丸（两侧）、胃、胃内容物、小肠（不含内容物）、大肠（不含内容物）、肝脏、肾脏、颌下腺、甲状腺（与气管一起）、骨（右大腿骨）、大脑。然后，测定血液、血浆、肿瘤、和正常组织・脏器的重量，用γ计数器测定其放射性。计算血液、血浆、尿、肿瘤、和正常组织・脏器中的²¹¹At-psyche-BR的积聚量（放射性）。即，以施用的²¹¹At-psyche-BR中在每单位重量（g）的血液、血浆、尿、肿瘤、和正常组织・脏器中积聚的比例（%ID/g）来表示。对于甲状腺中的²¹¹At-psyche-BR的积聚，由于无法准确测定甲状腺的重量，因此以施用的²¹¹At-psyche-BR中在甲状腺中积聚的比例（%ID）来表示。

＜结果＞

图18表示²¹¹At-psycheBR的体内分布（%ID/g）。

图19表示甲状腺中的²¹¹At-psyche-BR的积聚（%ID）。

血中的²¹¹At-psyche-BR的积聚在1分钟是13.5±1.1% ID/g、1小时是2.1±0.2%ID/g、6小时是1.0±0.2%ID/g、24小时是0.2±0.04%ID/g。即，血中的²¹¹At-psyche-B的积聚在1分钟时刻已经降低，在24小时时为施用量的约0.2%，自血液的清除相当快。

肿瘤中的²¹¹At-psyche-BR的积聚在1分钟是0.3±0.04%ID/g、1小时是0.4±0.02%ID/g、6小时是0.8±0.09%ID/g、24小时是0.4±0.02%。即，几乎没有确认到肿瘤中的²¹¹At-psyche-BR的积聚。

甲状腺中的²¹¹At-psyche-BR的积聚低，在6h时是0.29±0.05%ID。

肾脏中的²¹¹At-psyche-BR的积聚在1分钟是72.7±5.6%ID/g、1小时是77.9±2.1%ID/g、6小时是32.1±8.2%ID/g、24小时是3.0±0.1%。即，²¹¹At-psyche-B在施用后立即从肾脏排出，在24小时时降低至施用量的3.0%。

肝脏中的²¹¹At-psyche-BR的积聚在1分钟是51.1±5.9%ID/g、1小时是30.8±3.3%ID/g、6小时是19.6±0.5%ID/g、24小时是5.0±0.2%。即，肝脏中的²¹¹At-psyche-B的积聚在刚施用后高，随着时间而降低。

［实验8：MKN-45荷瘤模型小鼠中的Cupid-scFv抗体（24h前）＋²¹¹At-psycheBR的治疗效果与毒性评价］

＜目的＞

经时性地评价MKN-45荷瘤模型小鼠中的Cupid-scFv抗体（24h前）＋²¹¹At-psyche-BR的治疗效果与毒性。

＜方法＞

本实验中，使用了癌胚抗原（CEA）表达高的人胃癌细胞（MKN-45）。小鼠使用了雄性、9周龄的免疫缺陷小鼠（BALB/cSlc nu/nu）。通过在小鼠的右肩背侧的皮下植入MKN-45细胞（5x10⁶/0.1ml），制作荷瘤模型小鼠。在肿瘤体积达到恒定大小的时刻（移植后第8日）分组为用于评价治疗效果的7组和该肿瘤大小荷瘤模型中的体内分布组（6小时），从小鼠的尾静脈以每只100pmol/0.1ml施用Cupid-scFv抗体。在Cupid-scFv抗体施用24小时后，对于治疗组，由小鼠的尾静脈分别以每只5.55MBq、3.70MBq、1.85MBq、1.11MBq和0.37MBq施用²¹¹At-psyche-BR。对于对照组，使用²¹¹At-psyche-BR的溶剂（溶剂组）。另外，将仅施用cupid的组作为Cupid组。观察并记录²¹¹At-psyche-BR刚施用后、3小时后的小鼠一般状态。另外，直至²¹¹At-psyche-BR施用第14日，毎天进行一般状态的观察和体重测定。从²¹¹At-psyche-BR施用14日后起每隔1日进行一般状态的观察和体重测定。在²¹¹At-psyche-BR治疗后每隔1日测定肿瘤大小。在²¹¹At-psyche-BR治疗后第36日进行一般状态的观察、体重测定、肿瘤大小的测定，在异氟烷麻醉下从心脏进行抽全血，使之安乐死，摘出肿瘤组织和主要的组织・脏器，测量重量，进行福尔马林固定。

＜结果＞

图20表示小鼠体重（g）的经时性变化。

图21表示肿瘤体积（mm³）的经时性变化。

5.55MBq、3.70MBq施用组在施用后随着时间而体重减少，在第5日由于一般状态和体重减少严重，因此使其急迫安乐死而结束。

在1.85 MBq施用组中，在第5日虽然一般状态和体重减少显著，但没有使之安乐死而继续观察。在6日以后可见一般状态和体重的恢复，在第19日起完全恢复。

在1.11MBq、0.37MBq施用组中，一般状态和体重的变化与对照组为大致相同程度。

与对照组相比，通过1.85MBq、1.11MBq和0.37MBq治疗，对于肿瘤的体积，肿瘤的成长被抑制直至治疗第10日为止。然后，肿瘤的体积随着时间増加，但与对照组相比，肿瘤成长施用量依赖性地被抑制。

［实验9：MKN-45荷瘤模型小鼠中的Cupid-scFv抗体（24h前）＋²¹¹At-psyche-BR的体内动态研究(6h)］

＜目的＞

在MKN-45荷瘤模型小鼠中，调查²¹¹At-psyche-BR针对之前施用的（24h前）Cupid-scFv抗体的体内动态(6h)。

＜方法＞

本实验中，使用了癌胚抗原（CEA）表达高的人胃癌细胞（MKN-45）。小鼠使用了雄性、9周龄的免疫缺陷小鼠（BALB/cSlc nu/nu）。通过在小鼠的右肩背侧的皮下植入MKN-45细胞（1x10⁷/0.1ml），制作荷瘤模型小鼠。在肿瘤体积达到恒定大小的时刻（移植后第8日），由小鼠的尾静脈以每只100pmol/0.1ml施用Cupid-scFv抗体。在Cupid-scFv抗体施用24小时后，由小鼠的尾静脈施用²¹¹At-psyche-BR（约0.30MBq/100ml）。在²¹¹At-psyche-BR施用6小时后，在异氟烷麻醉下从小鼠的心脏抽全血，由此将小鼠安乐死，摘出肿瘤组织和正常组织・脏器。正常组织・脏器：皮肤（右下肢）、肌肉（右腓肠肌）、心脏、肺、脾脏、胰脏、白色脂肪（右侧睾丸的上部）、睾丸（两侧）、胃、胃内容物、小肠（不含内容物）、大肠（不含内容物）、肝脏、棕色脂肪（肩胛骨间）、颌下腺、甲状腺（与气管一起）、骨（右大腿骨）、大脑、眼球（两侧）、膀胱、尿；将剩余的残骸3等分，作为剩余-1、剩余-2、剩余-3。然后，测定血液、血浆、尿、肿瘤、和正常组织・脏器的重量，用γ计数器测定其放射性。计算血液、血浆、尿、肿瘤、和正常组织・脏器中的²¹¹At-psyche-BR的积聚量（放射性）。即，以施用的²¹¹At-psyche-BR中在每单位重量（g）的血液、血浆、尿、肿瘤、和正常组织・脏器中积聚的比例（%ID/g）来表示。对于甲状腺中的²¹¹At-psyche-BR的积聚，由于无法准确测定甲状腺的重量，因此以施用的²¹¹At-psyche-BR中在甲状腺中积聚的比例（%ID）来表示。

＜结果＞

图22表示Cupid-scFv抗体（24h前）＋²¹¹At-psycheBR的体内动态（%ID/g, 6h）。

肿瘤中的²¹¹At-psyche-BR的积聚高，为31.0±3.4 %ID/g。

［实验10：MKN-45荷瘤模型小鼠中的Cupid-scFv抗体（24h前）＋²¹¹At-psycheB的治疗效果与毒性评价］

＜目的＞

＜方法＞

本实验中，使用了癌胚抗原（CEA）表达高的人胃癌细胞（MKN-45）。小鼠使用了雄性、9周龄的免疫缺陷小鼠（BALB/cSlc nu/nu）。通过在小鼠的右肩背侧的皮下植入MKN-45细胞（5x10⁶/0.1ml），制作荷瘤模型小鼠。在肿瘤体积达到恒定大小的时刻（移植后第8日）分组为用于评价治疗效果的6组和该肿瘤大小荷瘤模型中的体内分布组（6小时），从小鼠的尾静脈以每只100pmol/0.1ml施用Cupid-scFv抗体。在Cupid-scFv抗体施用24小时后，对于治疗组，由小鼠的尾静脈分别以每只3.70MBq、1.85MBq、1.11MBq和0.37MBq施用²¹¹At-psyche-B。本实验中，没有设置5.55MBq的施用组。对于对照组，使用²¹¹At-psyche-B的溶剂（溶剂组）。另外，将仅施用cupid的组作为Cupid组。观察并记录²¹¹At-psyche-B刚施用后、3小时后的小鼠一般状态。另外，直至²¹¹At-psyche-B施用第14日，毎天进行一般状态的观察和体重测定。从²¹¹At-psyche-B施用14日后起每隔1日进行一般状态的观察和体重测定。在²¹¹At-psyche-B治疗后每隔1日测定肿瘤大小。在²¹¹At-psyche-B治疗后第36日进行一般状态的观察、体重测定、肿瘤大小的测定，在异氟烷麻醉下从心脏进行抽全血，使之安乐死，摘出肿瘤组织和主要的组织・脏器，测量重量，进行福尔马林固定。

＜结果＞

图23表示小鼠体重（g）的经时性变化。

图24表示肿瘤体积（mm³）的经时性变化。

3.70MBq施用组在施用后随着时间而体重减少，在第5日由于一般状态和体重减少严重，因此使其急迫安乐死而结束。

在1.85 MBq施用组中，在第5日虽然一般状态和体重减少显著，但没有使之安乐死而继续观察。在6日以后皮肤上散布有红点，在10日1只死亡。皮肤的红点持续至第12日。第12日以后2只的一般状态恢复，在第26日完全恢复。

在1.11MBq施用组中，体重轻度减少直至第5日，然后稍微恢复，但没有恢复至与对照组相同的程度。

在0.37MBq施用组中，体重的减少不如1.11MBq施用组。在10日以后与1.11MBq施用组为相同程度。

［实验11：MKN-45荷瘤模型小鼠中的Cupid-scFv抗体（24h前）＋²¹¹At-psyche-B的体内动态研究(6h)］

＜目的＞

在MKN-45荷瘤模型小鼠中，调查²¹¹At-psyche-B针对之前施用的（24h前）Cupid-scFv抗体的体内动态(6h)。

＜方法＞

本实验中，使用了癌胚抗原（CEA）表达高的人胃癌细胞（MKN-45）。小鼠使用了雄性、9周龄的免疫缺陷小鼠（BALB/cSlc nu/nu）。通过在小鼠的右肩背侧的皮下植入MKN-45细胞（1x10⁷/0.1ml），制作荷瘤模型小鼠。在肿瘤体积达到恒定大小的时刻（移植后第8日），由小鼠的尾静脈以每只100pmol/0.1ml施用Cupid-scFv抗体。在Cupid-scFv抗体施用24小时后，由小鼠的尾静脈施用²¹¹At-psyche-B（约0.30MBq/100ml）。在²¹¹At-psyche-B施用6小时后，在异氟烷麻醉下从小鼠的心脏抽全血，由此将小鼠安乐死，摘出肿瘤组织和正常组织・脏器。正常组织・脏器：皮肤（右下肢）、肌肉（右腓肠肌）、心脏、肺、脾脏、胰脏、白色脂肪（右侧睾丸的上部）、睾丸（两侧）、胃、胃内容物、小肠（不含内容物）、大肠（不含内容物）、肝脏、棕色脂肪（肩胛骨间）、颌下腺、甲状腺（与气管一起）、骨（右大腿骨）、大脑、眼球（两侧）、膀胱、尿；将剩余的残骸3等分，作为剩余-1、剩余-2、剩余-3。然后，测定血液、血浆、尿、肿瘤、和正常组织・脏器的重量，用γ计数器测定其放射性。计算血液、血浆、尿、肿瘤、和正常组织・脏器中的²¹¹At-psyche-B的积聚量（放射性）。即，以施用的²¹¹At-psyche-B中在每单位重量（g）的血液、血浆、尿、肿瘤、和正常组织・脏器中积聚的比例（%ID/g）来表示。对于甲状腺中的²¹¹At-psyche-B的积聚，由于无法准确测定甲状腺的重量，因此以施用的²¹¹At-psyche-B中在甲状腺中积聚的比例（%ID）来表示。

＜结果＞

图25表示Cupid-scFv抗体（24h前）＋²¹¹At-psycheB的体内动态（%ID/g, 6h）。

肿瘤中的²¹¹At-psyche-B的积聚高，为25.8±1.5 %ID/g。

序列表

<110> 国立大学法人东京大学（The University of Tokyo）

<110> 赛威德医疗公司（Savid Therapeutics Inc.）

<110> 公立大学法人福岛县立医科大学（Fukushima Medical University）

<120> 生物素变体二聚体及其用途

<130> F21520A-WO

<160> 13

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 重组蛋白

<400> 1

Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Ser Asp Gln Leu Gly Asp Thr

1 5 10 15

Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu

20 25 30

Asn Ala Val Gly Gly Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr

35 40 45

Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr

50 55 60

Val Ala Trp Lys Asn Asn Ser Lys Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp

65 70 75 80

Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Asp Ala Lys Ile Asn Thr Gln Trp

85 90 95

Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Asn Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu

100 105 110

Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser His

115 120 125

His His His His His

130

<210> 2

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 重组蛋白

<400> 2

Gln Val Lys Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser

20 25 30

Tyr Met His Trp Leu Arg Gln Gly Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gly Leu Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser

130 135 140

Ser Met Ser Val Ser Val Gly Asp Arg Val Asn Ile Ala Cys Ser Ala

145 150 155 160

Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met His Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys

165 170 175

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val

180 185 190

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr

195 200 205

Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

210 215 220

Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

225 230 235 240

Lys

<210> 3

<211> 383

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 重组蛋白

<400> 3

Gln Val Lys Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser

20 25 30

Tyr Met His Trp Leu Arg Gln Gly Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gly Leu Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser

130 135 140

Ser Met Ser Val Ser Val Gly Asp Arg Val Asn Ile Ala Cys Ser Ala

145 150 155 160

Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met His Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys

165 170 175

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val

180 185 190

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr

195 200 205

Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

210 215 220

Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

225 230 235 240

Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Glu Ala Gly Ile Thr

245 250 255

Gly Thr Trp Ser Asp Gln Leu Gly Asp Thr Phe Ile Val Thr Ala Gly

260 265 270

Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Asn Ala Val Gly Gly Ala

275 280 285

Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr

290 295 300

Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn

305 310 315 320

Ser Lys Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Val Gly

325 330 335

Gly Ala Asp Ala Lys Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser Gly Thr

340 345 350

Thr Asn Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe

355 360 365

Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser His His His His His His

370 375 380

<210> 4

<211> 405

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 重组蛋白

<400> 4

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Lys Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu

20 25 30

Val Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly

35 40 45

Phe Asn Ile Lys Asp Ser Tyr Met His Trp Leu Arg Gln Gly Pro Gly

50 55 60

Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr

65 70 75 80

Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Phe Thr Thr Asp Thr

85 90 95

Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Leu Gly Leu Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp

100 105 110

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr

115 120 125

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Asn Val

145 150 155 160

Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Val Gly Asp Arg Val

165 170 175

Asn Ile Ala Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met His Trp Leu

180 185 190

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Thr Ser

195 200 205

Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Ala Ala

225 230 235 240

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

260 265 270

Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Ser Asp Gln Leu Gly Asp Thr

275 280 285

Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu

290 295 300

Asn Ala Val Gly Gly Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr

305 310 315 320

Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr

325 330 335

Val Ala Trp Lys Asn Asn Ser Lys Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp

340 345 350

Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Asp Ala Lys Ile Asn Thr Gln Trp

355 360 365

Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Asn Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu

370 375 380

Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser His

385 390 395 400

His His His His His

405

<210> 5

<211> 1218

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 重组DNA

<400> 5

atgaaatatc tgctgccgac cgcagcagcg ggtctgctgc tgctggcagc acagcctgca 60

atggcacagg ttaaactgga acagagcggt gccgaagttg ttaaaccggg tgcaagcgtt 120

aaactgagct gtaaagcaag cggctttaac atcaaagata gctatatgca ttggctgcgt 180

cagggtccgg gtcagcgtct ggaatggatt ggttggattg atccggaaaa tggtgatacc 240

gaatatgcac cgaaatttca gggtaaagca acctttacca ccgataccag cgcaaatacc 300

gcatatctgg gtctgagcag cctgcgtccg gaagataccg cagtgtatta ttgtaatgaa 360

ggcaccccga ccggtccgta ttatttcgat tattggggtc agggcaccct ggttaccgtt 420

agcagcggtg gtggtggtag tggtggcggt ggttcaggcg gtggcggtag cgaaaatgtt 480

ctgacccaga gcccgagcag catgagcgtt agcgttggtg atcgtgttaa tattgcatgt 540

agcgcaagca gcagcgttcc gtacatgcac tggctgcagc agaaaccggg taaaagcccg 600

aaactgctga tttatctgac cagcaatctg gcaagcggtg ttccgagccg ttttagcggt 660

agcggtagtg gcaccgatta tagcctgacc attagcagcg tgcagcctga agatgcagca 720

acctattatt gtcagcagcg tagcagttat ccgctgacct ttggtggtgg caccaaactg 780

gaaattaaag ggggtggtgg ctcaggtggc ggaggtgcag aagcaggtat taccggtaca 840

tggtcagatc agctgggtga tacctttatt gttaccgcag gcgcagatgg tgcactgacc 900

ggcacctatg aaaatgcagt tggtggtgca gaaagccgtt atgtgctgac cggtcgttat 960

gatagcgcac cggcaaccga tggtagcggc accgcactgg gttggaccgt tgcatggaaa 1020

aataacagca aaaatgcaca tagcgcaacc acctggtcag gtcagtatgt gggtggtgcc 1080

gatgccaaaa ttaacaccca gtggctgctg accagcggta caaccaatgc aaatgcctgg 1140

aaaagtaccc tggttggtca tgatacattc accaaagtta aaccgagcgc agcaagccat 1200

catcatcacc atcattaa 1218

<210> 6

<211> 141

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 重组蛋白

<400> 6

Met Asp Lys Ile Ala Ile Val Asn Met Gly Ser Leu Phe Gln Gln Val

1 5 10 15

Ala Gln Lys Thr Gly Val Ser Asn Thr Leu Glu Asn Glu Phe Lys Gly

20 25 30

Arg Ala Ser Glu Leu Gln Arg Met Glu Thr Asp Leu Gln Ala Lys Met

35 40 45

Lys Lys Leu Gln Ser Met Lys Ala Gly Ser Asp Arg Thr Lys Leu Glu

50 55 60

Lys Asp Val Met Ala Gln Arg Gln Thr Phe Ala Gln Lys Ala Gln Ala

65 70 75 80

Phe Glu Gln Asp Arg Ala Arg Arg Ser Asn Glu Glu Arg Gly Lys Leu

85 90 95

Val Thr Arg Ile Gln Thr Ala Val Lys Ser Val Ala Asn Ser Gln Asp

100 105 110

Ile Asp Leu Val Val Asp Ala Asn Ala Val Ala Tyr Asn Ser Ser Asp

115 120 125

Val Lys Asp Ile Thr Ala Asp Val Leu Lys Gln Val Lys

130 135 140

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 重组接头

<400> 7

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成DNA

<400> 8

aaggagatat acatatggat aaaattgcca ttgttaatat 40

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成DNA

<400> 9

ttgagatctg ccatatgtta tttcacttgt ttcagaacg 39

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成DNA

<400> 10

agaaggagat ataccatgaa atatctgctg ccgac 35

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成DNA

<400> 11

cgccgagctc gaattttaat gatggtgatg atgatg 36

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成DNA

<400> 12

ggtatatctc cttcttaaag ttaaac 26

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成DNA

<400> 13

aattcgagct cggcgcgcct gcag 24

Claims

1.下述式（1）所示的化合物或其盐，

[化1]

式中，

L₁表示3价连接基，

L₂表示2价连接基，

Hal表示卤素元素，

p表示1～5的整数，

q、r、s和t各自独立地表示1～8的整数。

2.权利要求1所述的化合物或其盐，其中，L₁为

[化2]

或

。

3.权利要求1或2所述的化合物或其盐，其中，L₂为包含选自-CONH-、-NHCO-、-COO-、-OCO―、-CO-、-O-和碳原子数1至10的亚烷基中的基团的组合的2价连接基。

4.权利要求1至3中任一项所述的化合物或其盐，其为下述式（2）所示的化合物或其盐，

[化3]

式中的各符号的含义与权利要求1相同。

5.权利要求1至4中任一项所述的化合物或其盐，其中，Hal为I、¹²⁵I、或²¹¹At。

6.权利要求1至5中任一项所述的化合物或其盐，其中，p为1。

7.以下的化合物，

[化4]

。

8.用于治疗或诊断的试剂盒，其包含：（1）权利要求1至7中任一项所述的化合物；和（b）通过使分子探针与包含SEQ ID NO: 1中记载的氨基酸序列的链霉抗生物素蛋白突变体（其中，C末端的由6个组氨酸组成的氨基酸序列可以部分或全部缺失）结合而得的链霉抗生物素蛋白突变体-分子探针结合物。