JP2013139440A - ペプチドコンジュゲートおよびリンカーの改良された調製方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ｃＧＭＰ条件下で時間的および費用的に効率よく何百グラムもの量を製造することのできる、大量のペプチド−リンカーコンジュゲートの生成方法を開発すること。
【解決手段】本発明は、式５ｂの化合物の調製方法、ならびにその中間体、およびこうした化合物および類似化合物の調製方法において有用な新規の部類の化合物を提供する。
【化１】

Description

本発明は、ある特定の抗体−リンカー−ペプチドコンジュゲートの調製において有用な新規の方法、化合物、および中間体に関する。

生化学的分子の共有結合によるコンジュゲート形成を用いると、２種以上の分子を一緒にして、個々の構成要素それぞれの複合の性質を示すバイオコンジュゲートを生成することができる。この技術は、血漿半減期を延長し、ペプチドなどの治療薬の免疫原性を低減するのに使用されてきた。通常は、治療薬を、巨大分子担体と直接またはリンカーを介してコンジュゲート形成させる。一般的な巨大分子担体として、抗体、アルブミン、および合成ポリマーが挙げられる。

ＵＳ７５２１４２５およびＵＳ８２８８３４９は、リンカーとして有用な化合物の調製方法を記載している。

本明細書における技術への言及はいずれも、その言及した技術が共通の一般知識の一端をなすことを何らかの形で容認し、または提唱するとは解釈されず、また解釈すべきでない。

コンジュゲート形成方法の背景
抗体−薬物コンジュゲート５は、ＵＳ８２８８３４９（この内容全体を本明細書に援用する）に記載されており、その製造は、いくつかの段階を要する。最初に、ペプチド２およびリンカー１を別々に調製する。次いで、ペプチド２をリンカー１とコンジュゲート形成させて、リンカー−ペプチド複合体（３）を生成する。精製した後、コンジュゲート形成したリンカー−ペプチド複合体３を抗体（４）と合わせて、３のアゼチジノン部分による抗体４との共有結合の形成が可能になるようにし、その結果、ペプチド−リンカー−抗体複合体、すなわち抗体−薬物コンジュゲート５が組み立てられる（スキームＩ）。リンカーペプチド複合体は、リンカー１、８の生成、およびペプチド２とのコンジュゲート形成が必要となる冗長な多段階工程によって調製される（スキームＩＩ）。

酸リンカー６の合成
酸６の当初からの合成をスキームＩＩに示す。酸９を還流下においてＣｌ_２ＳＯで処理して、未精製の酸塩化物１０を得る。別のフラスコにおいて、ＴＨＦ中でｎ−ＢｕＬｉを用い、２−アゼチジノン１１を極低温で脱プロトン化して、Ｌｉアニオン１２を生成し、これを単離せずに酸塩化物１０と反応させて、中間体１３を収率９１％で得る。次いで、ＭｅＯＨ中で１０％Ｐｄ／Ｃを用いる接触水素化を使用して１３上のニトロ基を還元して、アニリンＨＣｌ塩１４ｂを収率６８％で得る。最後のステップは、ＣＨ_２Ｃｌ_２中にてＤＩＰＥＡの存在下で１４ｂとジグリコール酸無水物（１５）を反応させて、酸６を収率８３％で得るものである。

スキームＩＩの規模拡大性を判断する予備実験の際に、酸塩化物１０とアゼチジノン１１の結合の収率が、反応を約２００ｇのスケールで進めたとき、再現可能でなく、約４０〜５５％に低下したことが判明した。したがって、極低温で工程を進めることの回避をさらなる目標として、酸６を生成する代替機序を見出すことが求められている。

ペプチド−リンカー３の合成
酸６とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（７）を、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を結合試薬として用いて反応させると、尿素副生物の濾過および石油エーテル中での摩砕後に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル８が定量的収率で得られる（スキーム２、反応ｆ）。未精製の８を、ＤＭＦ中でＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）を塩基として用いる、後続のペプチド２との反応において直ちに使用して、約２日かかる工程においてコンジュゲート３を得る。未精製の３の反応混合物からの単離には、酢酸でｐＨ＝６．０に中和し、真空中でＤＭＦを除去し、得られる残渣を０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液に溶解させることが必要である。

次いで、未精製の３をクロマトグラフィー精製（０．１Ｍ ＮａＣｌＯ_４／ＭｅＣＮ緩衝液）にかける。純度の低い画分（＜６０％）を破棄し、６０〜９５％の純度範囲にある画分をクロマトグラフィーにかけ直す（０．１％ＴＦＡ水／ＭｅＣＮ緩衝液）。８０〜９５％の純度範囲にある画分を同じ条件下でクロマトグラフィーにかけ直し、純度が８０％未満の画分を廃棄する。純度が＞９６％であり、単一不純物が１．５％を上回らない画分をプールし、凍結乾燥して、高純度の（ｃｌｅａｎ）３を収率４０．４％（モル濃度ベース）で得る。３のこのクロマトグラフィー精製には、約２日かかる。次いで、凍結乾燥した画分を１：１のＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ混合物中に復元して（言い換えれば、固体を適切な溶媒に完全に溶解し直して）、約２日かかる工程において、均質なロットの中間体３を生成する。

多少の不溶性材料を濾過した後、濾液を２回目の凍結乾燥にかけて、約２日かかる工程において、３を収率約１１．９％で生成する。この冗長でエネルギーおよび溶媒集約的な工程は、少量バッチの材料（約５０ｇ）の生成には実に適するが、処理量が非常に少なく、スケールアップ費用が高く、工程時間が約１０日と冗長であるので、これをより大量の３の製造において実施することは、相対的に実現不可能である。

ＵＳ７５２１４２５ ＵＳ８２８８３４９ ＵＳ８２５２９０２ ＵＳ２００６２０５６７０（ＵＳ７５２１４２５） ＷＯ０１／２２９２２ 米国特許第６，２１０，９３８号 米国特許第６，３６８，８３９号 米国特許第６，３２６，１７６号 米国特許第６，５８９，７６６号 米国特許第５，９８５，６２６号 米国特許第５，７３３，７５号

ＨｏｌｌｉｎｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ、２００５、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（９）：１１２６〜１１３６ Ｗａｒｄら、１９８９ Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４〜５４６ ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６（４）：９０１〜９１７、１９８７ Ｋａｂａｔら、１９９２、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、ＮＩＨ、ワシントンＤ．Ｃ Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７〜８８３ ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６２：７３２〜７４５ Ｍａｋａｂｅら、２００８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８３：１１５６〜１１６６ Ｃ．Ｆ．Ｂａｒｂａｓ ３ｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：２０８５〜２０９２（１９９７） Ｋ．Ｄ．Ｊａｎｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：２５３２〜２５３６（１９９４） Ｐ．Ｗｉｒｓｃｈｉｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：７７５〜１７８２（１９９５） Ｃ．Ｒａｄｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．３３２：８８９〜８９９（２００３）

したがって、ｃＧＭＰ条件下で時間的および費用的に効率よく何百グラムもの量を製造することのできる、大量のペプチド−リンカーコンジュゲート３の生成方法を開発することが求められている。

本発明は、式５ａによるペプチド−リンカー抗体コンジュゲート

の改良された調製方法であって、
（ｉ）１−プロパンホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ）の存在下で９ａと１１を反応させて、化合物１３ａを作製するステップと、

（ｉｉ）少なくとも約５０％がＴＨＦであるＴＨＦ：Ｈ_２Ｏ溶液中で、Ｐｄ／Ｃを用いた化合物１３ａの接触水素化を行って、式１４ａの化合物を生成するステップと、

（ｉｉｉ）塩基を実質上使用しない反応において、１４ａのＴＨＦ溶液を、式１５による化合物と合わせて、化合物６ａを生成するステップと、

（ｉｖ）ＴＨＦ中にてＤＣＣの存在下で式６ａによる化合物を式１９ａによる化合物と反応させて、化合物２０ａを生成するステップと、

（ｖ）２０ａを、非プロトン性極性第１５番溶媒に溶解させたε−アミノ含有ペプチド２と合わせて、バイオコンジュゲート３ａを生成するステップと、

（ｖｉ）化合物３ａをＤＭＳＯに溶解させるステップと、
（ｖｉｉ）ステップ（ｖｉ）のＤＭＳＯおよび３ａからなる溶液に、約５．５〜約７．５の間のｐＨのヒスチジン緩衝液を加えるステップと、
（ｖｉｉｉ）ステップ（ｖｉｉ）の溶液に、配列番号５を含む軽鎖可変部と、配列番号６を含む重鎖可変部とを含む抗体を、ペプチド：抗体モル比が約１．８：１〜約３：１の間になるように加えるステップと、
（ｉｘ）ステップ（ｖｉｉｉ）において形成した混合物を、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ７．５の間および約５℃〜３５℃の間の温度で、反応混合物が泡立つのを回避するように中程度のスピードで少なくとも約１時間撹拌するステップと、
（ｘ）（ｉｘ）からの溶液を濾過して、得られたペプチド−リンカー抗体コンジュゲート５ａ

を抽出するステップと
を含み、
ｑ＝１、２、３、４または５であり、Ｘ＝ＦまたはＣｌであり、ｍ＝３、４または５である方法を提供する。

本発明は、式３ａによるペプチド−リンカー

の改良された調製方法であって、
（ｉ）１−プロパンホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ）の存在下で９ａと１１を反応させて、化合物１３ａを作製するステップと、

（ｉｉ）少なくとも約５０％がＴＨＦであるＴＨＦ：Ｈ_２Ｏ溶液中で、Ｐｄ／Ｃを用いた化合物１３ａの接触水素化を行って、式１４ａの化合物を生成するステップと、

（ｉｉｉ）塩基を実質上使用しない反応において、１４ａのＴＨＦ溶液を、式１５による化合物と合わせて、化合物６ａを生成するステップと、

（ｉｖ）ＴＨＦ中にてＤＣＣの存在下で化合物６ａを式１９ａによる化合物と反応させて、化合物２０ａを生成するステップと、

（ｖ）場合により、化合物２０ａを結晶化するステップと、
（ｖｉ）２０ａを、非プロトン性極性第１５番溶媒に溶解させたε−アミノ含有ペプチド２と合わせて、ペプチド−リンカー３ａを生成するステップと、

（ｖｉｉ）場合により、３ａのＤＭＦ溶液をＭｅＣＮに加えることによりペプチド−リンカー３ａを沈殿させるステップと
を含み、
ｑ＝１、２、３、４または５であり、Ｘ＝ＦまたはＣｌであり、ｍ＝３、４または５である方法をさらに提供する。

本発明の一部の態様では、改良された方法により、出発ペプチド２からのペプチド−リンカーコンジュゲート３ａの収率が約３０％から約８５％に増大する収率の向上に基づき、費用が削減される。エネルギーの節約や溶媒の節約などの他の構成要素もあり、これらも重要であるが、経済的な影響はより小さいと思われる。詳細には、改良された方法において２回のクロマトグラフィーが省かれる結果、１５００〜２０００リットル／生成物ｋｇと推定される溶媒の節約が実現される。溶媒が削減されると、溶離溶媒を蒸留によって除去する必要がないので、エネルギーの節約にもなる。相当なエネルギーの節約には、改良された方法において２回の凍結乾燥ステップが省かれることも関係している。

本発明の一部の態様では、改良された方法によって、ペプチド−リンカーコンジュゲート３ａを合成した後のクロマトグラフィーおよび凍結乾燥が回避されることによるサイクル時間の短縮が実現される。サイクル時間については、新しい方法では、現行の約１０日のサイクル時間と比べて、約２日で材料が送出される。したがって、新しい方法では、８０％以上のサイクル時間の短縮が実現される。

本発明の一部の態様では、ペプチド２は、配列番号１の特定の配列［配列中、ＡｃＫはアシルリシンである］を含んで、ペプチド２ａをなす。
配列番号１：Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３−Ｑ（ＡｃＫ）ＹＱＰＬＤＥ（ＡｃＫ）ＤＫＴＬＹＤＱＦＭＬＱＱＧ−ＮＨ_２ ２ａ

本発明の一部の態様では、ペプチド−リンカーコンジュゲート３ｂは、次式を含む。

他のペプチドおよび非ペプチド剤も、本発明のリンカーと有益にコンジュゲート形成させることができることは理解されよう。

本発明は、クロマトグラフィー精製、およびこの種類の化合物の単離に通常は必要となる凍結乾燥が回避され、収率が有意により高くなる、ペプチド−リンカーコンジュゲート３ａを製造するための、最適化され、規模拡大可能な方法を提供する。

本発明は、ＤＭＦ中でペプチドをリンカーに結合させ、場合により、続いて反溶媒としてのＭｅＣＮで沈殿させ、濾過して、臨床バッチでの使用の規格を満たす材料を得る、操作の簡単なプロトコールを提供する。第１ステップにおいて１−プロパンホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ）により穏やかな条件下で促進される、２−アゼチジノン１１のＮ−アシル化を特色とする規模拡大可能なリンカーの合成についても記載する。この新しいプロトコールでは、収率が再現可能となり、クロマトグラフィー精製を用いず、反応を極低温で実施する必要も、当初からの経路では必要であったｎ−ＢｕＬｉの使用も回避される。

合成の第２ステップ（１３ａの１４ａへの還元）の際の操作の数は、化合物１４ａを次のステップ（酸６ａを生成するジグリコール酸無水物との反応）にテレスコーピングする、すなわち余計な単離を回避することにより、簡略化した。

さらに、単離目的での安定性と、ペプチド２とコンジュゲート形成する際の反応性とにおいて優れたバランスを示す、対応する式２０ａのエステルによって、酸６ａの効率的な活性化方法を開発した。

本発明は、がん治療のためのペプチド−リンカー−抗体バイオコンジュゲートの製造プログラムの一環としてリンカーとペプチドを結合させる、改良された効率的なコンジュゲート形成プロトコールをさらに提供する。この新規の手法では、ペプチド−リンカーコンジュゲート３ａを、ＭｅＣＮ／ＤＭＦ混合物から直接沈殿させた後に濾過して単離することが可能になる。大がかりなクロマトグラフィー精製および凍結乾燥を要する、当初から実施され、この部類の化合物によくある資源集約的な単離プロトコールは、こうして回避された。主要な改善点の１つは、このステップの収率の劇的な増大であり、１２％から８３％に上がった。別の利点は、溶媒およびエネルギー消費の減少であり、これにより、１グラムあたりの費用が実質上下がり、方法は、より環境に配慮した代替法に変わる。すべての重要パラメータを精査した結果、純度および残留溶媒含有量の点で、厳しい規格を満たすのに申し分のない品質の材料をもたらす反応条件が得られた。この方法は、伝統的なクロマトグラフィー精製から脱却する、この種類の材料の単離の革新的な手法となる。

本発明は、極低温条件およびｎ−ＢｕＬｉの使用を省き、中間体の１つの単離をテレスコーピングによって回避し、さらに、単離目的での安定性と、ペプチド治療薬との最終コンジュゲート形成ステップにおける反応性とにおいて所望のバランスを備えた、適切な基体としての新規のペンタフルオロフェノールエステルを得るものである、活性化型リンカーへの最適化された経路も提供する。

これらの改良点はすべて、ｃＧＭＰ条件下での相当な量のペプチド−リンカーコンジュゲート３ａの製造につながった。

一部の態様では、本発明は、１−プロパンホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ）の存在下で９ａと１１を反応させて、化合物１３ａを作製するステップ

を含み、ｑは、１、２、３、４または５である、化合物１３ａの新しい調製方法を提供する。ｑが２である場合、反応は、Ｔ３Ｐの存在下で９と１１を含んで、１３を生成するものでよい。

２−アゼチジノン１１は、通常はアミド結合形成に関して全く反応性でないので、本発明の改良された方法では、当初からの方法に優る意味のある利点が得られる。加えて、この改良された方法は、少なくとも数百グラムのスケールで再現可能である。一部の態様では、本発明は、そのような方法に従って調製される化合物を提供する。

反応は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、２−メチルテトラヒドロフラン、ＮＭＰ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、１−メチル−２−ピロリジノン、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）、およびアセトニトリル（ＭｅＣＮ）からなる群から選択される第１番溶媒中で実施することができる。特に適切な第１番溶媒として、ＤＭＦ、ＥｔＯＡｃ、およびＭｅＣＮが挙げられる。一部の態様では、第１番溶媒は、ＥｔＯＡｃおよびＭｅＣＮから選択する。一部の態様では、第１番溶媒はＤＭＦである。一部の態様では、第１番溶媒は、ＭｅＣＮでよい。

一部の態様では、第１番塩基の存在下で反応を実施する。第１番塩基は、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ＤＩＰＥＡ、ピリジン、ＤＢＵ、ＤＡＢＣＯ、２，３−ルチジン、２，４−ルチジン、２，５−ルチジン、２，６−ルチジン、３，４−ルチジン、３，５−ルチジンからなる群から選択されるものでよい。特に適切な第１番塩基として、ＤＩＰＥＡ、トリエチルアミン、およびピリジンが挙げられる。一部の態様では、第１番塩基はＤＩＰＥＡである。

第１番塩基は、酸９ａに対して、下限が約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５および５からなる群から選択され、上限が約２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される範囲の量で存在してよい。一部の態様では、第１番塩基は、酸９の約１当量〜約１０当量の間の量で存在する。一部の態様では、第１番塩基は、酸９ａの約２当量〜約５当量の間の量で存在する。一部の態様では、第１番塩基は、酸９ａの約２当量〜約４当量の間の量で存在する。一部の態様では、第１番塩基は、酸９ａの約２．５当量〜約３．５当量の間の量で存在する。一部の態様では、第１番塩基は、酸９ａの約３当量の量で存在する。一部の態様では、第１番塩基はＤＩＰＥＡであり、酸９ａの約３当量の量で存在する。

２−アゼチジノン１１は、酸９ａに対して、下限が約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５および５からなる群から選択され、上限が約１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される範囲の量で存在してよい。一部の態様では、２−アゼチジノン１１は、酸９ａの約０．１当量〜約１０当量の間の量で存在する。一部の態様では、２−アゼチジノン１１は、酸９ａの約０．５当量〜約３当量の間の量で存在する。一部の態様では、２−アゼチジノン１１は、酸９ａの約０．５当量〜約５当量の間の量で存在する。一部の態様では、２−アゼチジノン１１は、酸９ａの約０．５当量〜約１．５当量の間の量で存在する。一部の態様では、２−アゼチジノン１１は、酸９ａの約１．０当量〜約１．５当量の間の量で存在する。一部の態様では、２−アゼチジノン１１は、酸９ａの約１．２当量の量で存在する。

Ｔ３Ｐは、酸９ａに対して、下限が約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５および５からなる群から選択され、上限が約１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される範囲の量で存在してよい。一部の態様では、Ｔ３Ｐは、酸９ａの約０．１当量〜約１０当量の間の量で存在する。一部の態様では、Ｔ３Ｐは、酸９ａの約０．５当量〜約３当量の間の量で存在する。一部の態様では、Ｔ３Ｐは、酸９ａの約０．５当量〜約５当量の間の量で存在する。一部の態様では、Ｔ３Ｐは、酸９ａの約０．５当量〜約１．５当量の間の量で存在する。一部の態様では、Ｔ３Ｐは、酸９ａの約１．０当量〜約１．５当量の間の量で存在する。一部の態様では、Ｔ３Ｐは、酸９ａの約１．３当量の量で存在する。

一部の態様では、Ｔ３Ｐは、ＥｔＯＡｃ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、および酢酸ブチルからなる群から選択される第２番溶媒中に用意することができる。一部の態様では、Ｔ３Ｐは、Ｔ３Ｐと基体のモル比が約０．１：１〜約１０：１の間に保たれるという前提で、溶液中に１％〜９９％の間の量で存在してよい。Ｔ３Ｐは、第２番溶媒中に、下限が約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、および約５０％からなる群から選択され、上限が約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、および約９９％からなる群から選択される範囲で用意することができる。一部の態様では、Ｔ３Ｐは、約５０％の溶媒溶液にして用意する。Ｔ３Ｐは、約５０％のＥｔＯＡｃ溶液にして用意することができる。

したがって、一部の態様では、ＤＭＦ中の化合物９ａおよび１１と塩基としてのピリジンの混合物にＴ３Ｐを加えると、所望の生成物が収率約２０％〜約４５％で得られる。一部の態様では、反応構成物の比率は、ＭｅＣＮ中に、約１当量の酸９ａに対して、約３当量のＤＩＰＥＡ、約１．２当量の１１、および約１．２当量のＴ３Ｐ（約５０％のＥｔＯＡｃ溶液）である。こうした割合の利点は、少なくとも約２０％という一定の収率が得られることである。一部の態様では、この組合せによって、収率が少なくとも約２５％になる。一部の態様では、この組合せによって、収率が少なくとも約３０％になる。一部の態様では、この組合せによって、収率が少なくとも約３５％になる。一部の態様では、この組合せによって、収率が少なくとも約４０％になる。一部の態様では、こうした割合により、収率が約４０％となる。

一部の態様では、ＭｅＣＮ中で、約５当量のＤＩＰＥＡ、約１．５当量の１１、および約１．５当量のＴ３Ｐを使用する。こうした割合の利点は、特に、反応を室温（すなわち、約１５℃〜約２５℃、好ましくは１８℃〜約２２℃、最も好ましくは約２０℃）で約２時間実施したとき、約５５〜６０％という一定の収率が得られることである。

この方法の利点には、操作が簡便（ＭｅＣＮ中に２種の結合パートナーおよび塩基を含有する混合物に、５０％のＴ３Ｐ ＥｔＯＡｃ溶液をゆっくりと加える）であり、反応条件が穏やかであり、収率が再現可能であるということもある。

一部の態様では、反応を室温（たとえば約２０℃）で約１８時間実施することができる。一部の態様では、反応の温度は、最低値が約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９および３０℃からなる群から選択され、上限値が約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３５、３６、３７、４０、４５および５０℃からなる群から選択される範囲で操作することができる。一部の態様では、温度範囲は、約０℃〜約５０℃の間である。一部の態様では、温度範囲は、約１０℃〜約３０℃の間である。一部の態様では、温度は室温である。一部の態様では、温度は２０℃である。

反応が完了した後、真空中でＭｅＣＮを除去し、残渣を、酢酸Ｃ_１〜Ｃ_４アルキルを含む第３番溶媒に溶解し直すことができる。酢酸Ｃ_１〜Ｃ_４アルキルは、酢酸ｉ−プロピル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ｎ−プロピル、および酢酸ｎ−ブチルからなる群から選択されるものでよい。一部の態様では、残渣を酢酸ｉ−プロピルに溶解し直すことができる。

次いで、有機相をクエン酸水溶液（酢酸などの他の酸も使用してよい）で洗浄し、溶媒を第３番溶媒から、２−プロパノール、１−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、およびｔｅｒｔ−ブタノールからなる群から選択される第４番溶媒に切り替えた後、溶液から中間体１３ａを高純度（＞９８％）で沈殿させることができる。一部の態様では、第３番から第４番溶媒への切替えは、酢酸ｉ−プロピルから２−プロパノールへと行うことができる。

一部の態様では、中間体１３ａは、この材料を次のニトロ還元ステップ（すなわち、中間体１３ａの塩１４ａへの変換）で使用する前に、活性炭で処理して、存在する多少の着色および微量不純物を除去することが有利となり得る。活性炭処理は、ＥｔＯＡｃなどの第５番溶媒中で実施することができる。他の適切な第５番溶媒は、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、メタノール、エタノール、酢酸メチル、および酢酸ｉ−プロピルである。活性炭は、ＳＸ−Ｐｌｕｓ、Ｄａｒｃｏ（登録商標）Ｓ−５１ＨＦ、Ｅ Ｓｕｐｒａ ＵＳＰ、ＳＸ−Ｕｌｔｒａ、ＣＡＳＰ、Ｄａｒｃｏ（登録商標）Ｇ−６０、およびＣＧＳＰ（すべてＮｏｒｉｔ（登録商標）から入手可能）からなる群から選択されるものでよい。本発明の一部の態様では、活性炭はＤａｒｃｏ（登録商標）Ｇ−６０であり、これにより、微量不純物１６ａ（ｑ＝１、２、３、４または５である）、またはｑ＝２である１６の量が最少となる。

一部の態様では、酸９ａの純度は、少なくとも約８５％である。一部の態様では、酸９ａの純度は、少なくとも約９０％である。一部の態様では、酸９ａの純度は、少なくとも約９５％である。一部の態様では、酸９ａの純度は、少なくとも約９６％である。一部の態様では、酸９ａの純度は、少なくとも約９７％である。一部の態様では、酸９ａの純度は、少なくとも約９８％である。一部の態様では、酸９ａの純度は、少なくとも約９９％である。酸９ａの純度は、反応の再現性に多大な影響を及ぼす場合がある。純度８５％未満の９ａを使用すると、着色度の高い不純物を除去するのに２回の炭素処理が必要となる場合もあり、これにより結合生成物１３ａの収率は４８％に低下する。

炭素処理の別の利点は、後続のニトロ還元ステップにおいて新たに生成するアミノ基によってアゼチジノン環が開環する結果として生じる不純物１６ａのレベルを、許容されるレベルより低く保つことができる点であった。炭素処理においてＥｔＯＡｃ中でＤａｒｃｏ（登録商標）Ｇ−６０を使用するとき、不純物１６ａのレベルは、約０．３％となり得る。

一部の態様では、本発明は、少なくとも約５０％がＴＨＦであるＴＨＦ：Ｈ_２Ｏ溶液中で、Ｐｄ／Ｃを用いた化合物１３ａの接触水素化を行って、式１４ａの化合物を生成するステップ

を含み、ｑ＝１、２、３、４または５である、化合物１４ａの新しい調製方法を提供する。ｑ＝２である場合、１３ａは１３とすることができ、１４ａは１４とすることができる。

一部の態様では、ＴＨＦ：Ｈ_２Ｏ溶液は、少なくとも約６０％のＴＨＦを含む。一部の態様では、ＴＨＦ：Ｈ_２Ｏ溶液は、少なくとも約７０％のＴＨＦを含む。一部の態様では、ＴＨＦ：Ｈ_２Ｏ溶液は、少なくとも約８０％のＴＨＦを含む。一部の態様では、ＴＨＦ：Ｈ_２Ｏ溶液は、少なくとも約９０％のＴＨＦを含む。一部の態様では、ＴＨＦ：Ｈ_２Ｏ溶液は、約９０％のＴＨＦを含む。一部の態様では、ＴＨＦ：Ｈ_２Ｏ溶液は、約９９％までのＴＨＦを含む。一部の態様では、ＴＨＦ：Ｈ_２Ｏ溶液は、約９５％までのＴＨＦを含む。一部の態様では、ＴＨＦ：Ｈ_２Ｏの比は、約８：１〜１０：１の間である。一部の態様では、ＴＨＦ：Ｈ_２Ｏの比は、約９：１である。

一部の態様では、５％または１０％Ｐｄ／Ｃを用い、１３ａに対して１〜１００％の重量／重量比で使用する。一部の態様では、接触水素化は、約１ｐｓｉｇ〜５０ｐｓｉｇの間の圧力で実施する。一部の態様では、接触水素化は、約１５ｐｓｉｇで実施する。一部の態様では、反応の前に、１３ａを、実質上本明細書に記載のとおりに木炭処理にかける。一部の態様では、触媒を濾別し、濾液を約１当量の強酸（ＨＣｌ（たとえば１２Ｍ）、または上で論述したような類似物など）で処理して、対応する（ＨＣｌ）塩を生成し、単離することができる。

これまで、化合物１３ａを化合物１４ａにするニトロ還元ステップは、メタノール（ＭｅＯＨ）中で実施され、収率およそ６８％の１４ａを得ていた。しかし、メタノールを使用すると、かなりの量の不純物１７ａ（ｑ＝２である場合、１７）（約１％〜約５％の間）が生じることが判明した。

したがって、化合物１３ａを化合物１４ａに変換する方法を改良することが求められている。１７ａの生成を回避する可能性のある１つの解決策は、ジオキサンを使用して、その生成を防止することであろう。しかし、ジオキサンは、知られた発癌物質であり、したがって、より安全な代替品を見出すことが求められている。

提唱する解決策は、１ｐｓｉｇ（重量ポンド毎平方インチゲージ）〜５０ｐｓｉｇの間の圧力範囲での接触水素化と併せたＴＨＦの使用を含む。１５ｐｓｉｇでＴＨＦ中にて１０％Ｐｄ／Ｃ（１０ｗｔ％）を用いると、急速な反応（＜１時間）となったが、不定レベルの１６ａの生成が認められた（１〜５％）（Ｃ支持体の重量に対するＰｄ金属の量を１％から１００％までの他の量にすることが有用な場合もある）。１６ａの生成を防止または低減するために、いくつかの添加剤を試したが（ＨＣｌ、ＨＯＡｃ、Ｈ_２Ｏ、すべて１０％）、化合物１６ａが依然として検出された（それぞれ、１．８％、１．９％、および１．６％）ばかりでなく、変換がより遅くなった。

水の存在は、アゼチジノン環が開環する可能性があるので懸念されたが、反応をＴＨＦ／Ｈ_２Ｏ ９：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）中で進めると、不純物レベルはわずかにしか増大しなかった。

最良の結果は、出発材料１３ａを上述のように木炭処理にかけたときに得られ、これにより、不純物１６ａの量は、添加剤なしで低いレベル（＜０．３％）に保たれた。

１３ａの１４ａへの（一部の態様では、１３のアニリン１４への）完全な変換が実現されたなら、触媒（１０％Ｐｄ／Ｃ）を濾過によって除去し、濾液を１当量の１２Ｍ ＨＣｌで処理して、対応するＨＣｌ塩（アニリンは、酸化して着色度の高い生成物を与える傾向があるので、ＨＣｌ塩は、長期間の貯蔵に好ましい形態である）を生成し、単離することができる。硫酸や硝酸などの他の強酸も適切である。濃度および酸の選択は、主として、体積および材料損失が最小限に抑えられるように決定する。

一部の態様では、本発明は、塩基を実質上使用しない反応において、１４ａの第６番溶媒溶液を、式１５による化合物と合わせて

［式中、ｑ＝１、２、３、４または５である］、化合物１４ａ

のＴＨＦ溶液から化合物６ａを生成するステップを含む、化合物６ａの調製方法を提供する。

化合物１５は、溶液として加えても、または固体として加えてもよい。第６番溶媒は、ＴＨＦ、酢酸Ｃ１〜Ｃ４アルキル、トルエン、クロロホルム、メチルＴＨＦからなる群から選択されるものでよい。一部の態様では、第６番溶媒はＴＨＦである。一部の態様では、Ｈ_２Ｏの非存在下で反応を実施する。

ｑ＝２である場合、化合物６は、化合物１４を使用して、上述のように調製することができる。

一つには、本発明の一部の態様は、１４ａを含有するＴＨＦ濾液を、塩基の非存在下で約１当量のジグリコール酸無水物（１５）で処理すると、６ａが効率よく生成されるという意外な発見に基づく。（アニリン１４などの）式１４ａの化合物は、不十分な求核性しか示さず、通常は、その反応性を増大させるために、塩基による脱プロトン化が必要となる。さらに、化合物１４のＨＣＬ塩である化合物１４ｂは固体であり、長期間貯蔵することができるのに対し、１４または１４ａの溶液は、一般に即座に扱うことが求められる。しかし、全体としてのサイクル時間の短縮ならびに反応および精製の費用の削減という本方法の意外な利点は、こうした不利益を凌ぐものであった。

一部の態様では、化合物１４ａを約１当量の化合物１５と反応させる。一部の態様では、化合物１４ａを少なくとも約１当量の化合物１５と反応させる。一部の態様では、化合物１４ａを約１当量〜約１０当量の間の化合物１５と反応させる。

結果として、６ａを生成する反応が完了した後、本発明は、化合物６ａの溶液を真空中で蒸留してＴＨＦを除去し、これに続いて、酢酸Ｃ_１〜Ｃ_４アルキルを含む第７番溶媒を加えて、約２５％ＴＨＦ／７５％酢酸Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル〜約１００％酢酸Ｃ_１〜Ｃ_４アルキルの間の溶媒組成を実現する、追加の工程ステップも提供する。これにより、合計溶媒体積は、６ａ １グラムあたり約５ｍｌ〜約１５ｍｌの溶媒とすることができる。一部の態様では、第７番溶媒は、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ｉ−プロピル、酢酸ｎ−プロピル、酢酸ｎ−ブチルの１つを含むものでよい。一部の態様では、第７番溶媒は、酢酸メチルまたは酢酸ｉ−プロピルのいずれかである。一部の態様では、第７番溶媒は、酢酸メチルである。一部の態様では、第７番溶媒は、酢酸ｉ−プロピルである。

このようにして単離すると、収率は８５〜９０％となり、典型的な残留溶媒レベルは、ＴＨＦおよびｉ−ＰｒＯＡｃについて、それぞれ０．２ｗｔ％および０．５ｗｔ％となる。

２５：７５の第６番溶媒：第７番溶媒（ＴＨＦ：ｉ−ＰｒＯＡｃ）〜１００％の第７番溶媒（ｉ−ＰｒＯＡｃ）の間の最終溶媒比を用いる場合、収率または品質の変化は見られない。塩基を含有しないＴＨＦ溶液をテレスコーピングすると、はるかに簡便な方法が可能になり、かなりの量の時間が節約される。

６ａを生成する１４ａの１５との反応は、非常に急速であり（たとえば、６０体積の溶媒で＜１５分）、ＴＨＦ溶液を濃縮した後、第７番溶媒（たとえば、酢酸ｉ−プロピル）を加え、冷却すると、溶液から酸６ａが優れた収率（８５〜９０％）および純度（＞９８％）で沈殿する。この単離方法は、収率が高く急速であるが、残留溶媒レベルが比較的高くなる場合がある（たとえば、０．５〜１％のＴＨＦ、１〜２％の酢酸ｉ−プロピル）。したがって、最終結晶化をより良好に制御するために、代替の溶媒交換方法を開発することが望ましかった。

酢酸Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル（たとえば、ｉ−ＰｒＯＡｃ）を含む第７番溶媒から高温（たとえば７０℃）で６ａを結晶化すると、生成物の分解が引き起こされ（材料を妥当な体積の溶媒に溶解させるのに高温が必要となった）、一方、アセトンに溶解させた後、溶媒をｉ−ＰｒＯＡｃで置き換え、結晶化すると、０．５％の残留ｉ−ＰｒＯＡｃを含有する材料が得られた。したがって、溶媒の残留量をさらに減らす（＜０．２５ｗｔ％）ために、最適化された結晶化プロトコールを開発することが求められている。

したがって、一部の態様では、本発明は、
（ｉ）酸６ａを、ＴＨＦを含む第８番溶媒に溶解させるステップと、
（ｉｉ）活性炭で処理し、次いで前記活性炭を濾別するステップと、
（ｉｉｉ）ＴＨＦ溶液中の酸６ａを約２体積〜約２０体積の間に濃縮するステップと、
（ｉｖ）Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルアルコールからなる、約１体積〜約５０体積の間の第１番アルコールを加えるステップと、
（ｖ）酸６ａをＴＨＦおよび２−プロパノールに溶かした溶液を約２体積〜約５０体積の間に濃縮するステップと、
（ｖｉ）濃縮した酸６の溶液を約−２５℃〜約１０℃の間に冷却するステップと
を含む、酸６ａを結晶化するさらなる工程ステップを提供する。

一部の態様では、第８番溶媒は、ＴＨＦ、酢酸Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、トルエン、およびアセトニトリルからなる群から選択される。一部の態様では、第８番溶媒はＴＨＦである。一部の態様では、６ａは、約１０℃〜約６７℃の間の温度で第８番溶媒に溶解させることができる。第８番溶媒は、約１０体積〜約５０体積の間の量で存在してよく、約３５体積とすることができる。

６ａを、酢酸Ｃ_１〜Ｃ_４アルキルを含有する溶液として用意する場合などの本発明の一部の態様では、溶質を取り出し、６ａを、ＴＨＦとしてよい第８番溶媒に溶解し直すことができる。本発明の一部の態様では、酸６ａは、約２０体積〜約５０体積の間、一部の態様では約３５体積の第８番溶媒に溶解させることができる。一部の態様では、酸６ａは、約１５℃〜約６０℃の間で第８番溶媒に溶解させることができる。一部の態様では、温度は、２０℃〜約４０℃の間である。一部の態様では、温度は約３０℃である。

ステップ（ｉ）で第８番溶媒に溶解させた後、酸６ａは、酸６ａを活性炭で処理する追加のステップ（ｉｉ）にかけることができる。炭素処理すると、着色の除去によって、結晶化挙動がより予測可能になるとみられる利点が得られる。

活性炭は、ＣＧＳＰ、ＳＸ−Ｐｌｕｓ、Ｄａｒｃｏ Ｓ−５１ＨＦ、Ｅ Ｓｕｐｒａ ＵＳＰ、ＳＸ−Ｕｌｔｒａ、ＣＡＳＰ、Ｄａｒｃｏ Ｇ−６０、およびＤａｒｃｏ−ＫＢＢからなる群から選択されるものでよい。本発明の一部の態様では、活性炭はＤａｒｃｏ−ＫＢＢである。一部の態様では、少なくとも約５重量％の最終量の６ａに活性炭を加える。一部の態様では、少なくとも約１０重量％の最終量の６ａに活性炭を加える。一部の態様では、少なくとも約１５重量％の最終量の６ａに活性炭を加える。一部の態様では、約２０重量％の最終量の６ａに活性炭を加える。

酸６ａ／第８番溶媒溶液は、少なくとも約１５分間、一部の態様では少なくとも約１時間、活性炭処理することができ、約１時間〜約２４時間の間とすることができる。

一部の態様では、（たとえば、Ｃｅｌｉｔｅなどの濾過助剤を使用して）活性炭を濾別する。一部の態様では、溶液（濾液）は次いで、ステップ（ｉｉｉ）において（たとえば、約０気圧〜約１気圧などの減圧下で）約２体積〜約２０体積の間に濃縮することができる。一部の態様では、濾液は次いで、約５体積〜約１５体積の間に濃縮することができる。一部の態様では、濾液は次いで、約１０体積に濃縮することができる。

一部の態様では、ステップ（ｉｖ）において、溶液に約１体積〜約５０体積の間の第１番アルコールを加えることができる。一部の態様では、過剰の第１番アルコールを加えて、６ａの第８番溶媒からの沈殿を開始させることができる。一部の態様では、約１体積〜約３０体積の間の第１番アルコールを加えることができる。一部の態様では、約１体積〜約２０体積の間の第１番アルコールを加えることができる。一部の態様では、約５体積〜約５０体積の間の第１番アルコールを加えることができる。一部の態様では、約５体積〜約３０体積の間の第１番アルコールを加えることができる。一部の態様では、約１２体積〜約１６体積の間の第１番アルコールを加えることができる。一部の態様では、約１４体積の第１番アルコールを加えることができる。

第１番アルコールは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２、ブタノール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、１−ヘキサノール、２−ヘキサノール、３−ヘキサノール、３−メチル−１−ブタノール、２−メチル−１−ブタノール、２，２，−ジメチル−１−プロパノール、３−メチル−２−ブタノール、および２−メチル−２−ブタノールを含めて、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルアルコールからなる群から選択されるものでよい。一部の態様では、第１番アルコールを第一級または第二級Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルアルコールとすることができる。一部の態様では、第１番アルコールを第二級Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルアルコールとすることができる。一部の態様では、第１番アルコールを２−プロパノールとすることができる。

一部の態様では、ステップ（ｉｖ）において、第１番アルコールを、濃縮した酸６の溶液に、約０．５：約１〜約１０：約１の間の比で加えることができる。一部の態様では、比は、約０．５：１〜約５：１の間である。一部の態様では、過剰の第１番アルコールを加える。一部の態様では、比は、約１：１〜約３：１の間である。一部の態様では、比は、約１：１〜約２：１の間である。一部の態様では、比は、約１．２：１〜約６：１の間である。一部の態様では、比は、約１：３〜約１．５：１の間である。一部の態様では、比は、約１．４：１である。

一部の態様では、次いで、ステップ（ｉｖ）からの酸６ａの第８番溶媒溶液および第１番アルコールを、約１体積〜約５０体積の間に濃縮することができる。一部の態様では、酸６ａの第８番溶媒溶液および第１番アルコールを、約１体積〜約３０体積の間に濃縮することができる。一部の態様では、酸６ａの第８番溶媒溶液および第１番アルコールを、約５体積〜約２０体積の間に濃縮することができる。一部の態様では、酸６ａの第８番溶媒溶液および第１番アルコールを、約５体積〜約２０体積の間に濃縮することができる。一部の態様では、酸６ａの第８番溶媒溶液および第１番アルコールを、約５体積〜約１５体積の間に濃縮することができる。一部の態様では、酸６ａの第８番溶媒溶液および第１番アルコールを、約１０体積に濃縮することができる。

一部の態様では、ステップ（ｉｖ）からの酸６ａの第８番溶媒溶液および第１番アルコールは、理想的には減圧下で濃縮することができる。一部の態様では、大気圧を使用することができる。一部の態様では、完全真空〜１気圧の間を使用して、６ａを濃縮することができる。

一部の態様では、次いで、ステップ（ｖ）からの溶液を、酸６ａが結晶し得るように冷却することができる。一部の態様では、ステップ（ｖ）からの溶液を、約−２５℃〜約１０℃の間に冷却することができる。一部の態様では、ステップ（ｖ）からの溶液を、約−２０℃〜約１０℃の間に冷却することができる。一部の態様では、ステップ（ｖ）からの溶液を、約−２０℃〜約５℃の間に冷却することができる。一部の態様では、ステップ（ｖ）からの溶液を、約−５℃〜約１０℃の間に冷却することができる。一部の態様では、ステップ（ｖ）からの溶液を、約−５℃〜約５℃の間に冷却することができる。一部の態様では、ステップ（ｖ）からの溶液を、約−５℃〜約０℃の間に冷却することができる。一部の態様では、ステップ（ｖ）からの溶液を、約−１℃〜約４℃の間に冷却することができる。一部の態様では、ステップ（ｖ）からの溶液を、約−０℃〜約４℃の間に冷却することができる。一部の態様では、ステップ（ｖ）からの溶液を、約０℃〜約５℃の間に冷却することができる。

一部の態様では、炭素を濾別した後、混合物を（たとえば、減圧下（０〜１気圧）での蒸留によって）１０体積に濃縮することができ、これに約１４体積の第１番アルコールを加えることができる。次いで溶液を約１０体積にさらに濃縮し、次いで約−２０℃〜約１０℃の間、好ましくは約０℃〜約５℃の間に冷却することができる。このようなプロトコールでは、酸６ａが、回収率８０％および化学純度＞９９％で得られる。この特に有利な本発明の実施形態では、当初からのＴＨＦ／ｉ−ＰｒＯＡｃ結晶化（１００〜２００μ）よりかなり小さい粒子（約３０μ）が送出され、粒子サイズがより小さいことから、結晶中に捕捉された溶媒がより少なかった理由が説明できる。

一部の態様では、本発明は、高い収率で容易に調製することができ、ペプチドおよびタンパク質などとコンジュゲート形成させる前に長時間にわたって貯蔵することのできる活性化型エステル、ならびに前記活性化型エステルの生成方法を好結果に特定したことに基づく。

当初からの合成に存在する、時間的および資源的に高くつくクロマトグラフィー精製および凍結乾燥に頼ることなく、ペプチド−リンカーコンジュゲート３ａを高い収率および純度で単離するのを可能にする、ペプチド２の酸６ａとのコンジュゲート形成方法を開発する必要が明確になった。さらに、改良された方法では、化学純度が≧９５％となり、単一不純物が２％を上回らず、残留溶媒含有量が個々の各溶媒について０．２５％（ｗｔ／ｗｔ）を下回ることが望ましい。

したがって、一部の態様では、本発明は、次式の化合物および中間体

を提供し、ｑは、１、２、３、４または５であり、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０であり、Ｘは、任意のハロゲンであり、ｍ＝３、４または５である。Ｘは、ＦまたはＣｌでよく、Ｆであることが好ましい。ｍは、４または５でよく、５であることが好ましい。一部の態様では、ｎ＝１〜１０である。一部の態様では、ｎ＝１、２、３、４、５または６である。一部の態様では、ｑ＝１、２または３である。一部の態様では、ｑ＝２である。

一部の態様では、本発明は、式２０、２０ａ、２０ｂ、２０ｃ、２０ｄおよび２０ｅの活性化型エステルの生成方法を提供する。一部の態様では、本発明は、式２０、２０ａ、２０ｃおよび２０ｄの活性化型エステルの生成方法を提供する。

Ｃｌ_２ＳＯもしくは（ＣＯＣｌ）_２を用いた６ａの酸塩化物誘導体の調製、またはＣＤＩやクロロホルメートなどの試薬での活性化は、これら試薬の反応性が高く、生じる中間体は、容易に環化して、１８ａなどの化合物、たとえば、ｑ＝２であるモルホリン−３，５−ジオン１８を与えることになるので、除外した。

一部には、本発明は、酸６ａ（６など）と、式１９ａのトリ、テトラ、およびペンタハロ置換フェノール化合物などの化合物（ペンタフルオロフェノール１９など）を、ＴＨＦなどの第１０番溶媒中にてＤＣＣの存在下で反応させると、エステル２０ａ（２０など）が収率８０〜８５％で得られるという発見に基づく。ＴＨＦに代わる適切な他の第１０番溶媒として、ジクロロメタン、２−メチルテトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、およびＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドが挙げられる。

したがって、一部の態様では、本発明は、第１０番溶媒中にてＤＣＣの存在下で式６ｂによる化合物を式１９ａによる化合物と反応させて、式２０ｂによる化合物を生成する方法を提供する。

式中、ｑ＝１、２、３、４または５であり、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０であり、Ｘ＝ＦまたはＣｌであり、ｍ＝３、４または５である。

一部の態様では、１９ａの６ｂに対する比は、少なくとも約１である。一部の態様では、１９ａ：６ｂの比は、約１：１である。一部の態様では、過剰の１９ａを６ｂに加える。一部の態様では、１９ａ：６ｂの比は、約２：１である。

一部の態様では、ＴＨＦ、ジクロロメタン、２−メチルテトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、およびＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドからなる群から選択される第１０番溶媒中で反応を実施する。一部の態様では、第１０番溶媒はＴＨＦである。

一部の態様では、６ｂおよび１９ａの溶液に、約−１０℃〜約１０℃の間、好ましくは約０℃〜約１０℃の間、より好ましくは約３℃〜約５℃の間でＤＣＣを加える。少なくとも約１分、好ましくは少なくとも約１０分の混合時間の後、反応溶液をおよそ室温（たとえば、約１５℃〜約２５℃の間、好ましくは約１８℃〜約２２℃の間、最も好ましくは約２０℃）に加熱し、少なくとも４時間、好ましくは少なくとも６時間、より好ましくは少なくとも１２時間、最も好ましくは約１８時間撹拌することができる。

反応後、溶液を（ジシクロへキシル尿素などの副生物を除去するために）濾過し、ＴＨＦ、ジクロロメタン、２−メチルテトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、およびＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドからなる群から選択される第１１番溶媒で洗浄することができる。一部の態様では、第１１番溶媒はＴＨＦである。これに続いて、固体を第１１番溶媒に懸濁し直し、アセトン（一部の態様では、アセトンの代わりに、酢酸Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、トルエン、ＭＴＢＥ、またはアセトニトリルを用いてもよい）と混合することができる。第１１番溶媒対アセトンの比は、約２：１〜約１：２の間、好ましくは約１：１とすることができる。一部の態様では、過剰のアセトンを使用することが望ましい。

溶液は、少なくとも１５℃、好ましくは少なくとも約１２℃、最も好ましくは少なくとも約１０℃、好ましくは約０℃までに冷却することができる。場合により、次いで溶液を少なくとも１０分、好ましくは少なくとも３０分、少なくとも６０分、および少なくとも８０分間撹拌することができる。次いで溶液を濾過し、固体をアセトン（または上で論述したような類似物）で洗浄することができる。

濾液は、ＴＨＦ、ジクロロメタン、２−メチルテトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、およびＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドからなる群から選択される第１２番溶媒に懸濁し直すことができる。一部の態様では、第１２番溶媒はＴＨＦである。第１２番溶媒は、第２番アルコール（メタノールを除く第１番アルコールと同じ群から選択されるものでよく、２−プロパノールとすることができる）と約２：１〜約１：２の間、好ましくは約１：１の比に混合して、スラリーを作製することができる。一部の態様では、比は、第２番アルコールが過剰となるように、少なくとも約１：１である。

スラリーは、少なくとも１時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間撹拌することができる。スラリーは、約４℃〜約３０℃の間、または約１２℃〜約２５℃の間、または約１８℃〜約２２℃の間、または約２０、または室温で撹拌することができる。

スラリーは、濾過し、第３番アルコール（第２番アルコールと同じ群から選択されるものでよく、２−プロパノールとすることができる）で洗浄し、乾燥させることができる。得られた固体は、真空中で乾燥させることができる。得られた固体は、室温〜約５０℃の間、好ましくは約４０℃で乾燥させることができる。固体は、少なくとも約１時間、少なくとも約４時間、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも約１６時間乾燥させることができる。

化合物２０は、６と１９などの化合物を出発材料として使用して、本発明の有利な方法によって同様に調製することができる。化合物２０ａは、６ａと１９ａなどの化合物を出発材料として使用して、本発明の有利な方法によって同様に調製することができる。化合物２０ｃは、６と１９ａなどの化合物を出発材料として使用して、本発明の有利な方法によって同様に調製することができる。化合物２０ｄは、６ａと１９などの化合物を出発材料として使用して、本発明の有利な方法によって同様に調製することができる。化合物２０ｅは、６ｂと１９などの化合物を出発材料として使用して、本発明の有利な方法によって同様に調製することができる。

一部の態様では、ＴＨＦ中におけるＤＣＣ存在下での化合物６と化合物１９の付加反応によって、化合物２０が少なくとも８０％、場合によっては少なくとも８５％の収率で生成される。

一部の態様では、酸６ｂと１９ａを約−２５℃〜約５０℃の間の温度で反応させる。一部の態様では、下限が約−２５、−２０、−１５、−１０、−５、−１、０、１、４、５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２℃からなる群から選択され、上限が約−１、０、１、４、５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５および５０℃からなる群から選択される温度範囲で、酸６ｂと１９ａを反応させる。一部の態様では、酸６ｂと１９ａを約−０℃〜約２０℃の間の温度で反応させる。一部の態様では、反応は、約−１５℃においてとする。

一部の態様では、酸６ｂと１９ａを少なくとも１時間反応させる。一部の態様では、酸６ｂと１９ａを少なくとも２時間反応させる。一部の態様では、酸６ｂと１９ａを少なくとも３時間反応させる。一部の態様では、酸６ｂと１９ａを少なくとも４時間反応させる。一部の態様では、酸６ｂと１９ａを少なくとも６時間反応させる。一部の態様では、酸６ｂと１９ａを少なくとも８時間反応させる。一部の態様では、酸６ｂと１９ａを少なくとも１２時間反応させる。一部の態様では、リンカー６ｂと１９ａを少なくとも１８時間反応させる。一部の態様では、リンカー６ｂと１９ａを約２４時間反応させる。

一部の態様では、酸６ｂと１９ａは、約１：１〜約１：１０の間の比で反応させる。

一部の態様では、カップリング剤を加えることができる。このカップリング剤の役割は、フェノール１９ａと反応して所望のエステルを与えることのできる、より反応性の高い中間体を生成するために、酸６ｂを活性化することである。カップリング剤なしでは、エステル結合形成が起こらない。カップリング剤は、ＤＣＣ、ＣＤＩ、ＣＤＭＴ、ＤＣＭＴ、ＤＩＣ、ＤＰＰＡ、ＥＤＣ、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵ、ＰｙＢＯＰ、ＰｙＢｒｏＰ、ＰｙＣｌｏＰ、ＴＢＴＵ、およびＴ３Ｐからなる群から選択されるものでよい。一部の態様では、カップリング剤はＤＣＣである。

エステル２０、２０ａ、２０ｂ、２０ｃ、２０ｄおよび２０ｅは、クロマトグラフィー精製によって単離することができる。本発明の別の態様では、エステル２０、２０ａ、２０ｂ、２０ｃ、２０ｄおよび２０ｅは、イソプロパノールなどの第１４番溶媒から（実施例１１で例示するとおりに）沈殿させることができる。適切な他の第１４番溶媒として、エタノールおよびブタノールが挙げられる。

エステル２０は、特別な貯蔵条件を必要とせずに、空気と接触した状態で、室温で数か月間安定であり、検出可能な量の環状モルホリン−３，５−ジオン１８を示さない、高純度の（ｆｉｎｅ）白色固体である。加えて、エステル２０は、１を生成する最終コンジュゲート形成ステップ（以下参照）において優れた反応性を示す。

一部の態様では、本発明は、
（ｉ）非プロトン性極性第１５番溶媒中で１当量のペプチド２を混合するステップと、
（ｉｉ）過剰の２０ｂをペプチド２と合わせて、３ｂを生成するステップと

を含み、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０であり、ｑ＝１、２、３、４または５であり、Ｘ＝ＦまたはＣｌであり、ｍ＝３、４または５である、化合物３ｂを生成する改良された方法を提供する。

一部の態様では、非プロトン性極性第１５番溶媒は、ＤＭＦ、ＤＭＡｃ、ＤＭＳＯ、またはＮＭＰからなる群から選択される。一部の態様では、非プロトン性極性溶媒はＤＭＦである。

一部の態様では、ペプチド２は、２のトリフルオロ酢酸塩などの塩でもよいし、または遊離塩基形態でもよい。ペプチド２が塩である場合、ステップ（ｉ）は、第２番塩基中で実施する。ペプチド２を遊離塩基形態として用意する場合、第２番塩基は必要でない。

一部の態様では、ペプチド２を、約５体積〜約５０体積の間の非プロトン性極性第１５番溶媒に溶解させる。一部の態様では、ペプチド２を、約１０体積〜約２０体積の間の非プロトン性極性第１５番溶媒に溶解させる。一部の態様では、ペプチド２を、約１５体積の非プロトン性極性第１５番溶媒に溶解させる。

本発明の一部の態様では、第２番塩基は、ＮＭＭ、ＴＥＡ、ＤＩＰＥＡ、ピリジン、ＤＡＢＣＯ、ＤＢＵ、およびルチジンからなる群から選択される。一部の態様では、第２番塩基は、ＴＥＡ、ＤＩＰＥＡ、またはピリジンとすることができる。

第２番塩基は、約１当量〜約１０当量の間の量で存在してよい。一部の態様では、第２番塩基は、約１〜約５当量の量で存在する。一部の態様では、第２番塩基は、約１〜約３当量の量で存在する。一部の態様では、第２番塩基は、約１〜約２当量の量で存在する。一部の態様では、第２番塩基は、約１〜約１．５当量の量で存在する。一部の態様では、第２番塩基は、約１．２当量の量で存在する。

しかし、ペプチド２およびペプチド−リンカーコンジュゲート３は両方とも、ＤＭＦ、ＤＭＡｃ、ＤＭＳＯなどの非プロトン性極性第１５番溶媒中では、水の存在下または非存在下で、数時間後に濃厚なゲルを形成する傾向がある。この問題の解決策は、ペプチド２を非プロトン性極性第１５番溶媒に溶解させて約１８時間以内、好ましくは約１２時間以内、より好ましくは約８時間以内、より好ましくは約６時間以内、より好ましくは約４時間以内、より好ましくは約２時間以内、より好ましくは約１時間以内に、ペプチド２を２０ｂと反応させることである。加えて、ゲル化の問題は、少なくとも１０体積、好都合な場合では少なくとも１５体積の非プロトン性極性第１５番溶媒の使用によって、それほど深刻でなくなる。

一部の態様では、約１当量〜約３０当量の間の２０ｂを、約１当量のペプチド２に加えることができる。一部の態様では、約１当量〜約２０当量の間の２０ｂを、約１当量のペプチド２に加えることができる。一部の態様では、約１当量〜約１０当量の間の２０ｂを、約１当量のペプチド２に加えることができる。一部の態様では、約２当量〜約３０当量の間の２０ｂを、約１当量のペプチド２に加えることができる。一部の態様では、約３当量〜約３０当量の間の２０ｂを、約１当量のペプチド２に加えることができる。一部の態様では、約３当量〜約２０当量の間の２０ｂを、約１当量のペプチド２に加えることができる。一部の態様では、約３当量〜約１０当量の間の２０ｂを、約１当量のペプチド２に加えることができる。一部の態様では、少なくとも３当量の２０ｂを、約１当量のペプチド２に加える。一部の態様では、約３当量の２０ｂを、約１当量のペプチド２に加えることができる。

一部の態様では、ペプチド２に対して約１当量〜約１０当量の間の第３番塩基中で、２０ｂと２を合わせる。一部の態様では、ペプチド２に対して約１当量〜約５当量の間の第３番塩基中で、２０ｂと２を合わせる。一部の態様では、ペプチド２に対して約１当量〜約２当量の間の第３番塩基中で、２０ｂと２を合わせる。一部の態様では、ペプチド２に対して約１当量〜約１．５当量の間の第３番塩基中で、２０ｂと２を合わせる。一部の態様では、ペプチド２に対して約１．３当量の第３番塩基中で、２０ｂと２を合わせる。第３番塩基は、ＮＭＭ、ＴＥＡ、ＤＩＰＥＡ、およびピリジンからなる群から選択されるものでよい。第３番塩基は、ＮＭＭとすることができる。

ペプチド２は溶解性が低いので、ＭｅＣＮやＭｅＯＨなどの溶媒中では、ペプチド−リンカーコンジュゲート１への変換が認められなかった。ペプチド２を溶液にするのを助けるために、これら溶媒に水を加えると、活性化型リンカーが分解するために変換が弱まり、数時間後に濃厚なゲルが形成された。

本発明によれば、非プロトン性極性溶媒（ＤＭＦなど）では、ペプチド２を完全に溶解させることができ、約３当量の化合物２０ｂを用い、ペプチド２を室温（たとえば約２０℃）で完全に消費することが可能になる。最もクリーンな反応は、塩基としてのＮＭＭと組み合わせたＤＭＦにおいて実現された。ＴＥＡ、ＤＩＰＥＡ、ピリジンなどの塩基を加えたＤＭＳＯ、ＮＭＰ、およびＤＭＡｃでは、より低い純度が得られた。一部の態様では、反応は、約２０体積のＤＭＦ、約２当量〜約３当量の間の２０ｂ、および約２０当量のＮＭＭを混合することを含む。反応は、室温とすることができる。反応は、少なくとも１０分間実施することができる。

ペプチド−リンカーコンジュゲート３を単離する条件も調査した。最も簡便な手法は、溶液からペプチド−リンカーコンジュゲート３を沈殿させた後、濾過される、適切な反溶媒を特定することであった。この目的についていくつかの有機溶媒を試した。トルエン、ＥｔＯＡｃ、ＴＨＦ、およびＭＴＢＥでは、濾過するのが困難であったゲル様の粘着性固体が得られたが、本発明の一部の態様は、ＭｅＣＮによって、それよりはるかに扱いやすい高純度の易流動性固体が生成したという意外な発見に基づく。

したがって、本発明の一部の態様では、３は、引き続いてＭｅＣＮで沈殿させた後、濾過することにより、単離することができる。

一部の態様では、反溶媒：非プロトン性極性第１５番溶媒の割合は、約５：１〜約２０：１の間であり、約９：１であることが好ましい。

この時点において、不活性気体（Ｎ_２、Ａｒ、ＣＯ_２など）の存在下で濾過することが、ケーキへの水分吸着を防止するのに望ましかったが、そうしないと、生成物がゴム質の固体に変わる場合がある。後処理手順は、反応完了後のペプチド−リンカーコンジュゲート３のＤＭＦ溶液をＭｅＣＮ中にゆっくりと移して、最終の９：１のＭｅＣＮ／ＤＭＦ混合物を得るものであった。得られる沈殿を熟成（固体に溶液から沈殿するのに十分な時間を与える）させた後、固体を濾過し、真空中にて約０℃〜約５０℃の間で乾燥させた。一部の態様では、沈殿を２４時間まで熟成させた。一部の態様では、沈殿を１２時間まで熟成させた。一部の態様では、沈殿を６時間まで熟成させた。一部の態様では、沈殿を３時間まで熟成させた。一部の態様では、沈殿を２時間まで熟成させた。一部の態様では、約２時間後にさらに撹拌すると、固体が、粘着性で扱いにくいものになる。一部の態様では、固体を約０〜約４０℃で乾燥させた。一部の態様では、固体を約２０〜約５０℃で乾燥させた。より高い温度は、有害な影響を及ぼすと思われる。

したがって、本発明の一部の態様では、水蒸気または水雰囲気の非存在下で濾過を行うことができる。一部の態様では、不活性気体中で濾過を行うことができる。不活性気体は、Ｎ_２、アルゴン、ＣＯ_２などからなる群から選択されるものでよい。

本発明の一部の態様では、ペプチド２と化合物２０ｂは、約−３０℃〜約３０℃の間の温度でコンジュゲート形成させることができる。本発明の一部の態様では、ペプチド３と化合物２０ｂは、下限が約−３０、−２５、−２０、−１８、−１７、−１６、−１５、−１４、−１３、−１２、−１０、−５、−１、０、１、２、３、４、５、１０、１５および１８℃からなる群から選択され、上限が約−１４、−１３、−１２、−１０、−５、−１、０、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５および３０℃からなる群から選択される温度範囲でコンジュゲート形成させることができる。本発明の一部の態様では、ペプチド２と化合物２０ｂは、約−３０℃〜約２０℃の間の温度でコンジュゲート形成させることができる。本発明の一部の態様では、ペプチド２と化合物２０ｂは、約−１５℃の温度でコンジュゲート形成させることができる。

一部の態様では、２と２０ｂのコンジュゲート形成は、−３０℃でさえ進行するが、約１８時間〜約２０時間の間の時間が必要となることがあり、ペプチドを完全に消費するのに、約５当量ものペンタフルオロフェノールエステルリンカーを要する場合もある。加えて、反応時間がより長いと、より多くの副生物が生成するばかりでなく、一部生成物が沈殿するために、混合物が濁る場合がある。さらに実験を経た後、工程の速度論と満足な不純物プロフィールとの間に、意外にも申し分のない妥協点を見出した。したがって、一部の態様では、本発明は、（ペプチド２を容易に溶解させ、ゲル化を防止するのに十分な）約１５体積のＤＭＦ、好ましくは約１５体積〜約５０体積の間のＤＭＦ中にて、約３当量の化合物２０ｂ、および約１当量〜約５当量の間、好ましくは約１．２当量のＮＭＭの存在下で、約−１５℃〜約−１８℃の間で反応を進める方法を提供する。約７時間後、未反応の２は、約１％未満しか残らず、エステル２０ｂの合計副生物は、約０．３％以下に保たれた。

約７時間後、未反応の２は、１％未満しか残らず、合計ペンタフルオロフェノールエステル副生物レベルは、０．３％に保たれた。次いで、より大きい粒子サイズを促すために弱い撹拌を使用しながら、混合物を０．４５ミクロンのインラインフィルターで濾過し、ＭｅＣＮなどの反溶媒中にゆっくりと加えることができる。ＭｅＣＮの量は、ＭｅＣＮ：ＤＭＦの所望の最終比が得られるように、有利に選択することができる。一部の態様では、ＭｅＣＮの量は、非プロトン性極性第１５番溶媒の約５〜約２０倍であり、ＭｅＣＮ：ＤＭＦの最終比が９：１になるように整えることができる。

固体の沈殿が通常は直ちに起こり、熟成期間（たとえば、約１〜２時間）後、固体を濾過し、新たなＭｅＣＮで洗浄し、真空乾燥することができる。

一部の態様では、おそらくは溶液から生成物がすばやく沈殿する際に意図的にゆっくりと撹拌され、その結果ＤＭＦが閉じ込められるために、固体中に４．５％（ｗｔ／ｗｔ）の含有量のＤＭＦが依然として存在する場合もある。固体を＃２０手篩にかけた後、ＭｅＣＮを再スラリー化（ｒｅｓｌｕｒｒｙ）（固体を完全に溶解させることなく溶媒に懸濁させ、撹拌して、不純物を除去する）し、引き続いて、約２０℃〜約５０℃の間、好ましくは約４０℃で乾燥させると、材料が収率８３％で得られる。

一部の態様では、沈殿させる際に、撹拌スピードを速くし、または生成物溶液をＭｅＣＮ中に液面下で加えると、閉じ込められるＤＭＦの量を最小限に抑えることができる。

したがって、一部の態様では、本発明は、生成物溶液をＭｅＣＮ中に激しく混合しながら加えることを含む、単離された生成物固体中へのＤＭＦの閉じ込めを最小限に抑える手段を提供する。これは、単離容器において高速撹拌を使用することで、または好ましくはそのうえに、排出口がＭｅＣＮの表面より下、かつ高剪断領域の近く（インペラの羽根に近い）になる添加用チューブで生成物溶液を加えることにより、実現することができる。激しい撹拌によって、生成物溶液を沈殿前により十分に分散させることが可能になり、沈殿領域中のＤＭＦの濃度が低下する。

室温（ＲＴ）は、約１５℃〜約２５℃の間でよい。一部の態様では、室温は、約１８℃〜約２２℃の間でよい。一部の態様では、室温は、約１８℃〜約２０℃の間でよい。一部の態様では、室温は、約２０℃でよい。

一部の態様では、本発明は、トリ、テトラ、およびペンタハロ置換フェニルでなく、ＰＮＰエステルの使用を提供する。したがって、一部の態様では、本発明は、次式の化合物および中間体を提供する。

式中、ｑは、１、２、３、４または５であり、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０であり、Ｘは、任意のハロゲンである。一部の態様では、ｎ＝１〜１０である。一部の態様では、ｎ＝１、２、３、４、５または６である。一部の態様では、ｑ＝１、２または３である。一部の態様では、ｑ＝２である。

一部の態様では、本発明は、化合物２１を、それぞれ化合物６、６ａ、または６ｂと（６ｂと１９ｂの反応について記載したのと同じ化学機序を使用して）反応させるステップを含む、式２２、２２ａ、および２２ｂの活性化型エステルの生成方法を提供する。化合物２２、２２ａ、および２２ｂを、ペプチド２の、ε−アミノ基を有する側鎖（たとえば、リシン側鎖）とコンジュゲート形成させると、それぞれ、ペプチド−リンカーコンジュゲート３、３ａ、および３ｂを生成することができる。

本発明のこの態様の意外な部分は、ペプチド２との結合に、式２２、２２ａ、および２２ｂのＰＮＰエステルを使用すると、３、３ａ、３ｂの対応するＰＮＰエステル不純物を含有することのない、生成物３、３ａ、３ｂがそれぞれ得られることである。こうした不純物の考えられる化学構造を以下に示す。

こうした種類の不純物は、通常は、２０ｂの２との結合反応の際にペンタハロフェノールエステルを活性化基として使用したときに生成し、その結果、対応するペンタハロエステル不純物が生成する（実施例１６を参照されたい）。こうした不純物は、非常に反応性であり、後続のコンジュゲート形成ステップで使用するｈ３８Ｃ２などのモノクローナル抗体と潜在的に反応することができ、その結果、薬物原体中に好ましくない不純物が形成される（実施例１６の論述を参照されたい）。一部の態様では、本発明は、以下に示す式のペプチド−リンカー−抗体５の調製方法について記載する。一部の態様では、抗体は、ｈ３８Ｃ２またはその変異体である。一部の態様では、ペプチド−リンカーは、３、３ａ、または３ｂである。

略語
ｎ−ＢｕＬｉ：ｎ−ブチルリチウム
ＣＤＩ：１，１’−カルボニルジイミダゾール
ＣＤＭＴ：２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン
ＤＢＵ：１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン
ＤＡＢＣＯ：１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン
ＤＣＣ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＭＴ：２，４−ジクロロ−６−メトキシ−１，３，５−トリアジン
ＤＩＣ：Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡｃ：Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＤＰＰＡ アジ化ジフェニルホスホリル
ＥＤＣ：１−［３−（ジメチルアミノプロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩
ＥｔＯＡｃ：酢酸エチル
ＨＡＴＵ：Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＢＴＵ：Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＯＡｃ：酢酸
ＭｅＣＮ：アセトニトリル
ＭｅＯＨ：メタノール
ＭＴＢＥ：ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル
ＮＨ_４ＯＡｃ：酢酸アンモニウム
ＮＭＭ：Ｎ−メチルモルホリン
ＮＭＰ：１−メチル−２−ピロリジノン
ＰＦＰ ペンタフルオロフェニル
ＰＮＰ ｐａｒａ−ニトロフェニル
ｉ−ＰｒＯＡｃ：酢酸ｉ−プロピル
ＰｙＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリ（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＰｙＢｒｏＰ：ブロモトリ（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＰｙＣｌｏＰ：クロロトリ（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
Ｔ３Ｐ：１−プロパンホスホン酸無水物
ＴＢＴＵ：Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
ＴＥＡ：トリエチルアミン
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＨＩＣ 疎水性相互作用クロマトグラフィー
ＳＥＣ サイズ排除クロマトグラフィー

定義
「約」または「およそ」は、測定可能な可変数値と共に使用するとき、その可変値の表示値、および表示値の実験誤差の範囲（たとえば、平均の９５％信頼区間）または表示値の１０パーセントの範囲のいずれか大きい方の範囲内にある可変値のすべての値を指す。

「抗体」は、その可変部に位置する少なくとも１箇所の抗原認識部位によって、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどのターゲットに特異的に結合することのできる免疫グロブリン分子である。本明細書では、用語「抗体」は、無処置のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけでなく、その任意の抗原結合性断片（すなわち「抗原結合性部分」）または単鎖、抗体を含む融合タンパク質、ならびに、たとえば、限定はしないが、ｓｃＦｖ、単ドメイン抗体（たとえば、サメおよびラクダ科の抗体）、マキシボディ、ミニボディ、細胞内抗体、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ、およびビス−ｓｃＦｖを含めて、抗原認識部位を含む他の任意の変更型立体構造の免疫グロブリン分子も包含する（たとえば、ＨｏｌｌｉｎｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ、２００５、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（９）：１１２６〜１１３６を参照されたい）。抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭなどの任意のクラス（またはそのサブクラス）の抗体が含まれ、抗体は、任意の特定のクラスのものである必要はない。免疫グロブリンは、その重鎖定常部の抗体アミノ酸配列に応じて、異なるクラスに割り振ることができる。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭという主要な５クラスの免疫グロブリンが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けられる場合もある。異なる免疫グロブリンクラスに対応する重鎖定常部を、それぞれ、アルファ、デルタ、エプシロン、ガンマ、およびミューと呼ぶ。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体構造は、よく知られている。

ラムダ（ＣＬ−λ）およびカッパ（ＣＬ−κ）の２種類のヒト軽鎖定常部が知られている。（配列番号９に従って番号を付けて）４６位のＶ／Ａおよび８４位のＡ／Ｌの多型に基づき、３種のＣＬ−κ変異体が知られている。同定された３種のＣＬ−κ多型体は、Ｋｍ（１）：Ｖ^４６／Ｌ^８４、Ｋｍ（１，２）：Ａ^４６／Ｌ^８４、およびＫｍ（３）Ａ^４６／Ｖ^８４）である。したがって、本発明の抗体は、配列番号９、１０、１１、もしくは１２のいずれか１つによるκ定常ドメイン、または５、４、３、２もしくは１個以下のアミノ酸の挿入、置換、または欠失しか含まないその変異体を含むものでよい。カウント方法によっては、配列番号９、１０、１１、および１２の残基Ｒ^１が、可変ドメインに含まれる場合もあり、したがって、定常ドメインも、前記配列の残基Ｔ^２から始まるとみなされる場合もあることは当業者には理解される。

抗体の「抗原結合性部分」という用語は、本明細書では、所与の抗原（たとえば、ターゲットＸ）に特異的に結合する能力を保持する、無処置抗体の１または複数の断片を指す。抗体の抗原結合性機能を、無処置抗体の断片によって実現することができる。抗体の「抗原結合性部分」という用語の範囲内に含まれる結合性断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、抗体の一本の腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、単ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄら、１９８９ Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４〜５４６）、ならびに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。

抗体の「可変部」とは、単独でまたは複合語をなして、抗体軽鎖の可変部または抗体重鎖の可変部を指す。当業界で知られているように、重鎖および軽鎖の可変部は、それぞれ、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）が、高頻度可変領域としても知られる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって連結されたものからなり、抗体の抗原結合性部位の形成に寄与する。特にＣＤＲ領域の外側（すなわち、フレームワーク領域中）のアミノ酸残基の置換による、対象可変部の変異体が所望される場合、適切なアミノ酸置換、好ましくは、保存的なアミノ酸の置換は、対象可変部を、対象可変部と同じ基準クラスになるＣＤＲ１配列およびＣＤＲ２配列を含んでいる他の抗体の可変部と比較して確認することができる（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６（４）：９０１〜９１７、１９８７）。対象ＣＤＲの側面に配置するＦＲを選択するとき、たとえば、抗体をヒト化または最適化するとき、同じ基準クラスになるＣＤＲ１配列およびＣＤＲ２配列を含んでいる抗体からのＦＲが好ましい。

可変ドメインの「ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａ両方の蓄積、ＡｂＭ、接触、および／もしくは立体構造定義、または当業界でよく知られている任意のＣＤＲ決定方法に従って特定される、可変部内のアミノ酸残基である。抗体ＣＤＲは、Ｋａｂａｔらによって当初規定された高頻度可変領域として特定することができる。たとえば、Ｋａｂａｔら、１９９２、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、ＮＩＨ、ワシントンＤ．Ｃを参照されたい。ＣＤＲの位置は、Ｃｈｏｔｈｉａ他によって当初記載された構造上のループ構造として特定することもできる。たとえば、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７〜８８３を参照されたい。ＣＤＲを特定する他の手法として、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの折衷案であり、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（現Ａｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標））を使用して導かれる「ＡｂＭ定義」、またはＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６２：７３２〜７４５に記載されている、抗体接触の観察に基づくＣＤＲの「接触定義」が挙げられる。本明細書ではＣＤＲの「立体構造定義」と称する別の手法では、ＣＤＲの位置を、抗原結合にエンタルピー的に寄与する残基として特定することができる。たとえば、Ｍａｋａｂｅら、２００８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８３：１１５６〜１１６６を参照されたい。さらに他のＣＤＲ境界定義は、上記手法の１つに厳密に従わないこともあり、特定の残基もしくは残基群またはＣＤＲ全体でさえもが抗原結合に有意に影響を与えないという予測または実験所見に照らして短くまたは長くされる場合があるとしても、Ｋａｂａｔ ＣＤＲの少なくとも一部分とは、それでもなお一致することになる。本明細書では、ＣＤＲとは、手法の組合せを含めて、当業界で知られている任意の手法によって規定されるＣＤＲを指すとしてよい。本明細書で使用する方法は、これら手法のいずれかに従って規定されたＣＤＲを利用するものでよい。２つ以上のＣＤＲを含んでいる所与の任意の実施形態について、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、延長、ＡｂＭ、接触、および／または立体構造定義のいずれかに従って規定したものでよい。

ＵＳ２００６２０５６７０（ＵＳ７５２１４２５）の内容を参照により本明細書に援用する。ＵＳ２００６２０５６７０（ＵＳ７５２１４２５）は、特に、数ある抗体技術の要素の中でも、抗体、その有用な断片および変異体および改変体、結合部位およびＣＤＲ、抗体の調製、発現、ヒト化、アミノ酸改変、グリコシル化、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、延長される抗体血清半減期、発現ベクター、哺乳動物宿主系、ならびに折り畳み構造についての記載のある段落［０１５３］〜［０２３３］において、本出願に直接適用できるいくつかの組成物および技術を記載している。

「結合部位」（抗体結合性部位としても知られる）とは、本明細書では、適切な抗原（または構造上類似のタンパク質）の決定基と結合する（または結合することのできる）免疫グロブリンまたはＩｇドメインの領域を指す。この用語は、一般に、抗原結合に関与するＣＤＲおよび近接するフレームワーク残基を包含する。

「アルドラーゼ抗体」とは、本明細書では、（たとえば、コンジュゲート形成による）負荷のないとき、脂肪族ケトンドナーとアルデヒドアクセプターのアルドール付加反応を触媒する、結合部位部分を含んでいる抗体を指す。アルドラーゼ抗体は、免疫応答性動物を、担体タンパク質に結合させた次式の１，３ ジケトンハプテン

を含む免疫原で免疫化して生成することができ、抗体の結合部位に反応性ε−アミノ基を備えたリシンを有することをさらに特徴とする。アルドラーゼ抗体は、１，３−ジケトンハプテンと、この触媒抗体のリシンのε−アミノ基とにおいて複合体が形成されることで、その触媒活性が、１，３−ジケトンハプテンによる阻害を受けることもさらに特徴とする。

論述したように、特定の実施形態では、本発明の化合物と併せて使用することのできる特定の抗体には、抗体結合部位中に反応性側鎖が必要となり得る。反応性側鎖は、自然に存在するものでもよく、または突然変異によって抗体に入ったものでもよい。抗体結合部位の反応性残基は、最初に特定されたリンパ球中に存在する核酸により残基がコードされて抗体が作製される場合のように、抗体と関連付けることができる。あるいは、アミノ酸残基は、特定の残基をコード化するようにＤＮＡを故意に突然変異させることによっても発生し得る（たとえば、ＷＯ０１／２２９２２）。反応性残基は、たとえば、独特なコドン、ｔＲＮＡ、およびアミノアシル−ｔＲＮＡを使用する、本明細書で論述するような生合成取込みによって発生する非天然残基でもよい。別の手法では、アミノ酸残基またはその反応性官能基（たとえば、求核性アミノ基またはスルフヒドリル基）が、抗体結合部位にあるアミノ酸残基に結合していてもよい。したがって、本明細書で使用する、「抗体の結合部位にあるアミノ酸残基を介して」生じる抗体との共有結合による連結とは、連結が、抗体結合部位のアミノ酸残基に直接なされてもよく、または抗体結合部位のアミノ酸残基の側鎖に連結している化学的部分を介してなされてもよいことを意味する。一部の実施形態では、アミノ酸はシステインであり、側鎖の反応性基はスルフヒドリル基である。他の実施形態では、アミノ酸残基はリシンであり、側鎖の反応性基はε−アミノ基である。一部の実施形態では、アミノ酸は、Ｋａｂａｔ番号による、重鎖上のＬｙｓ９３である。一部の実施形態では、アミノ酸は、ＨＣ ｈ３８Ｃ２（配列番号４）上のＬｙｓ−９９である。

触媒抗体は、１または複数の反応性アミノ酸側鎖を含む適切な結合部位を有する抗体の一供給源である。このような抗体としては、アルドラーゼ抗体、βラクタマーゼ抗体、エステラーゼ抗体、およびアミダーゼ抗体が挙げられる。

一実施形態は、マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ ３３Ｆ１２およびｍＡｂ ３８Ｃ２などのアルドラーゼ抗体、ならびにそのような抗体の適切なキメラ版およびヒト化版（たとえば、ｈ３８Ｃ２、配列番号３および４）を含む。マウスｍＡｂ ３８Ｃ２（およびｈ３８Ｃ２）は、ＨＣＤＲ３の近くであるが外側に反応性リシンを有しており、反応性免疫化によって作製された、天然アルドラーゼ酵素を機構的に模倣する、新しいクラスの触媒抗体の原型である。Ｃ．Ｆ．Ｂａｒｂａｓ ３^ｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：２０８５〜２０９２（１９９７）を参照されたい。使用することのできる他のアルドラーゼ触媒抗体として、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０１５のハイブリドーマ８５Ａ２、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０１４のハイブリドーマ８５Ｃ７、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０１７のハイブリドーマ９２Ｆ９、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−８２３のハイブリドーマ９３Ｆ３、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−８２４のハイブリドーマ８４Ｇ３、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０１８のハイブリドーマ８４Ｇ１１、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０１９のハイブリドーマ８４Ｈ９、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−８２５のハイブリドーマ８５Ｈ６、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０１６のハイブリドーマ９０Ｇ８によって産生される抗体が挙げられる。これらの抗体は、反応性リシンを介して、天然アルドラーゼのエナミン機構を使用しながら、アルドール反応および逆アルドール反応を触媒する。アルドラーゼ抗体およびアルドラーゼ抗体の作製方法は、参照により本明細書に援用される、米国特許第６，２１０，９３８号、第６，３６８，８３９号、第６，３２６，１７６号、第６，５８９，７６６号、第５，９８５，６２６号、および第５，７３３，７５号で開示されている。

本発明の化合物は、本発明の化合物を、チオエステラーゼおよびエステラーゼ触媒抗体の結合部位に見られるものなどの、反応性システインに連結して生成することもできる。適切なチオエステラーゼ触媒抗体は、Ｋ．Ｄ．Ｊａｎｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：２５３２〜２５３６（１９９４）に記載されている。適切なエステラーゼ抗体は、Ｐ．Ｗｉｒｓｃｈｉｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：７７５〜１７８２（１９９５）に記載されている。反応性アミノ酸含有抗体は、抗体結合部位残基を突然変異させて反応性アミノ酸をコード化するもの、または抗体結合部位にあるアミノ酸側鎖を、反応性基を含んでいるリンカーで化学的に誘導体化するものを始めとして、当業界でよく知られている手段によって調製することができる。

抗体は、ヒト化抗体でもよい。本発明の化合物を抗体の結合部位に共有結合によって連結し、その抗体がヒト化されている場合、その抗体は、Ｚ基に対する高い連結親和性を保持した状態で、ヒト化されていることが重要である。様々な形態のヒト化マウスアルドラーゼ抗体を企図する。一実施形態では、ヒト定常ドメインＣ_κおよびＣ_γ１１を有するヒト化アルドラーゼ触媒抗体ｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１またはｈ３８Ｃ２ Ｆａｂを使用する。Ｃ．Ｒａｄｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．３３２：８８９〜８９９（２００３）は、ｈ３８Ｃ２ Ｆａｂおよびｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１の産生に使用することのできる遺伝子配列およびベクターを開示している。ｍ３８Ｃ２のκ軽鎖可変ドメインのヒト化には、ヒト生殖系列Ｖ_ｋ遺伝子ＤＰＫ−９およびヒトＪ_ｋ遺伝子ＪＫ４がフレームワークとして使用され、ｍ３８Ｃ２の重鎖可変ドメインのヒト化には、ヒト生殖系列遺伝子ＤＰ−４７およびヒトＪ_Ｈ遺伝子ＪＨ４がフレームワークとして使用された。ＵＳ２００６２０５６７０（参照により本明細書に援用される）の図７Ａは、ｍ３８Ｃ２とｈ３８Ｃ２とヒト生殖系列とにおける可変部軽鎖および重鎖配列の並びを図示するものである。ｈ３８Ｃ２は、そのアロタイプのいずれかを含めて、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４定常ドメインを利用するものでよい。抗体が、Ｇ１ｍ（ｆ）アロタイプを有するｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１である、本発明の化合物の特定の実施形態では、Ｚは、重鎖の９９位のリシン残基の側鎖に結合する。別の実施形態では、ｈ３８Ｃ２の可変ドメイン（Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ）（配列番号５および６）と、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４からの定常ドメインとを含むキメラ抗体を使用する。抗体は、全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆ_ｖ、ｄｓＦ_ｖ、ｓｃＦ_ｖ、Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｌ、ダイアボディ、またはミニボディでよい。抗体は、全長抗体とすることができ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ_２Δａ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ_４Δｂ、ＩｇＧ_４Δｃ、ＩｇＧ_４Ｓ２２８Ｐ、ＩｇＧ_４ΔｂＳ２２８Ｐ、およびＩｇＧ_４ΔｃＳ２２８Ｐからなる群から選択されるものでよい。抗体またはその抗原結合部分は、ｈ３８Ｃ２からのＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインを含むものでよい。抗体は、ｈ３８Ｃ２からのＶ_ＬおよびＶ_Ｈドメインと、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ_２Δａ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ_４Δｂ、ＩｇＧ_４Δｃ、ＩｇＧ_４Ｓ２２８Ｐ、ＩｇＧ_４ΔｂＳ２２８Ｐ、およびＩｇＧ_４ΔｃＳ２２８Ｐからなる群から選択される定常ドメインとを含む抗体でよい。抗体は、ｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１（配列番号３および４）でもよい。抗体は、ｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ２（配列番号３および１４）でもよい。抗体は、ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ抗体からの定常部を含む、マウスアルドラーゼ抗体のヒト化版でもよい。別の実施形態では、抗体は、マウスアルドラーゼ抗体からのＶ_ＬおよびＶ_Ｈ領域と、ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ抗体からの定常部とを含むキメラ抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ｍ３８Ｃ２からのＶ_ＬおよびＶ_Ｈ領域（配列番号７および８）を含む。別の実施形態では、抗体は、天然または未変性ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ抗体からのポリペプチド配列を含む、マウスアルドラーゼ抗体の完全なヒト版である。一部の態様では、抗体は、配列番号５に示すＶ_Ｌ配列のＶ_ＬＣＤＲ１、Ｖ_ＬＣＤＲ２、およびＶ_ＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変部（Ｖ_Ｌ）と、配列番号６に示すＶ_Ｈ配列のＶ_ＨＣＤＲ１、Ｖ_ＨＣＤＲ２、およびＶ_ＨＣＤＲ３を含む重鎖可変部（Ｖ_Ｈ）とを含むものでよい。上で概略を述べたように、ＣＤＲは、当業界のいくつかの既知の方法によって決定することができる。

一部の態様では、抗体は、配列番号３と少なくとも９５％一致する軽鎖と、配列番号４と少なくとも９５％一致する重鎖とを含む。軽鎖は、配列番号３と少なくとも９６％一致するものでよい。軽鎖は、配列番号３と少なくとも９６％一致するものでよい。軽鎖は、配列番号３と少なくとも９７％一致するものでよい。軽鎖は、配列番号３と少なくとも９８％一致するものでよい。軽鎖は、配列番号３と少なくとも９９％一致するものでよい。重鎖は、配列番号４と少なくとも９６％一致するものでよい。重鎖は、配列番号４と少なくとも９７％一致するものでよい。重鎖は、配列番号４と少なくとも９８％一致するものでよい。重鎖は、配列番号４と少なくとも９９％一致するものでよい。一部の態様では、軽鎖は、配列番号３と１アミノ酸だけ異なるものでよい。一部の態様では、重鎖は、配列番号４と１アミノ酸だけ異なるものでよい。一部の態様では、軽鎖と配列番号３の相違は、定常部だけに設けることができる。一部の態様では、重鎖と配列番号４の相違は、定常部だけに設けることができる。

一部の態様では、本発明の抗体は、配列番号９、１０、１１および１２からなる群から選択される配列、または１個〜５個の間のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を含むこれらの変異体を含む軽鎖定常部と、配列番号３を含む軽鎖可変部とを含む軽鎖を含む。

一部の態様では、本発明の抗体は、配列番号１３および１４からなる群から選択される配列、または１個〜５個の間のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を含むこれらの変異体を含む重鎖定常部と、配列番号４を含む重鎖可変部とを含む重鎖を含む。

一部の態様では、本発明の抗体は、配列番号９、１０、１１および１２からなる群から選択される配列、または１個〜５個の間のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を含むこれらの変異体を含む軽鎖定常部と、配列番号１３および１４からなる群から選択される配列、または１個〜５個の間のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を含むこれらの変異体を含む重鎖定常部とを含む。一部の態様では、重鎖は、配列番号１３、または１個〜５個の間のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を含むその変異体である。

本明細書に記載の抗体の（１または複数の）アミノ酸配列改変を企図する。たとえば、アミノ酸配列改変は、抗体の結合親和性および／または他の生物学的性質を改善するのに望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体核酸に適切なヌクレオチド交替を導入することにより、またはペプチド合成によって調製される。このような改変には、たとえば、抗体のアミノ酸配列からの欠失、アミノ酸配列への挿入、および／またはアミノ酸配列内の残基の置換が含まれる。欠失、挿入、および置換をいずれかに組み合わせて最終作成物を得るが、但し、最終作成物は、所望の特性を有するものとする。アミノ酸交替により、グリコシル化部位の数または位置が変わるなど、抗体の翻訳後過程も変更される場合がある。

本発明の抗体または抗体部分は、別の分子（たとえば、別のペプチドまたはタンパク質）に誘導体化または連結することができる。一般に、抗体またはその部分は、リンカーが抗体の結合部位と共有結合によりコンジュゲート形成する能力が、誘導体化または標識化によって不利な影響を受けないように、誘導体化される。したがって、本発明の抗体および抗体部分は、本明細書に記載の抗体の無処置形態および改変形態の両方を包含するものとする。たとえば、本発明の抗体または抗体部分は、１または複数の他の分子実在物、たとえば、別の抗体（たとえば、二重特異性抗体またはダイアボディ）、検出薬、細胞傷害性薬物、医薬、および／または抗体もしくは抗体部分の別の分子との会合を媒介することのできるタンパク質もしくはペプチド（ストレプトアビジンコア領域やポリヒスチジンタグなど）に、（化学的結合、遺伝子融合、非共有結合による会合、またはその他のものによって）機能的に連結することができる。

他の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合部分は、融合抗体、または別のポリペプチドに連結された抗体でもよい。一部の態様では、抗体の可変部のみをポリペプチドに連結する。一部の態様では、結合部位の結合能力の妨げとならないようにして、抗体を、ペプチドと共有結合によりコンジュゲート形成させる。

ポリペプチドは、標的指向性薬剤、ペプチド、タンパク質作動薬、タンパク質拮抗薬、代謝調節薬、ホルモン、トキシン、成長因子、他の調節タンパク質などの治療薬でもよいし、または容易に可視化することのできる酵素、たとえば西洋ワサビペルオキシダーゼなどの診断薬でもよい。加えて、２種（またはそれ以上）の単鎖抗体が互いに連結された融合抗体を作製することもできる。これは、単一ポリペプチド鎖上に二価または多価抗体を作製したい場合、または二重特異性抗体を作製したい場合に有用である。「ペプチド」に関して、この用語は、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質と一般に呼ばれる、アミノ酸の鎖を包含すると理解される。一部の態様では、ペプチドは、少なくとも３アミノ酸の長さである。一部の態様では、ペプチドは、約５００アミノ酸未満の長さである。一部の態様では、ペプチドは、約３００アミノ酸未満の長さである。一部の態様では、ペプチドは、約２００アミノ酸未満の長さである。一部の態様では、ペプチドは、約１５０アミノ酸未満の長さである。一部の態様では、ペプチドは、約１００アミノ酸未満の長さである。一部の態様では、ペプチドは、約８０アミノ酸未満の長さである。一部の態様では、ペプチドは、約７０アミノ酸未満の長さである。一部の態様では、ペプチドは、約６０アミノ酸未満の長さである。一部の態様では、ペプチドは、約５０アミノ酸未満の長さである。一部の態様では、ペプチドは、約４０アミノ酸未満の長さである。

あるタイプの誘導体化抗体は、（たとえば、二重特異性抗体を作製するための、同じ種類または異なる種類の）２種以上の抗体を架橋結合させて生成する。適切な架橋剤としては、適切なスペーサーによって隔てられた反応性の異なる２個の基を有するヘテロ二官能性のもの（たとえば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、またはホモ二官能性のもの（たとえば、スベリン酸ジスクシンイミジル）が挙げられる。

別のタイプの誘導体化抗体は、標識された抗体である。本発明の抗体または抗体部分を誘導体化することのできる有用な検出剤として、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナプタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリン、ランタニドリン光体などを含めた蛍光性化合物が挙げられる。抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどの、検出に有用である酵素で標識することもできる。抗体が検出可能な酵素で標識されているとき、抗体は、酵素に使用される追加の試薬を加えて、識別できる反応産物を生成することにより検出する。たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ薬剤が存在するとき、過酸化水素およびジアミノベンジジンを加えると、検出可能である有色反応産物が生じる。抗体はまた、ビオチンで標識し、アビジンまたはストレプトアビジン結合を間接的に測定して検出することもできる。抗体は、ガドリニウムなどの磁性物質で標識してもよい。抗体はまた、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（たとえば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体のための結合性部位、金属結合性ドメイン、エピトープタグ）で標識してもよい。一部の実施形態では、標識は、潜在的な立体障害を低減するために、様々な長さのスペーサーアームによって結合している。

抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチル基またはエチル基、炭水化物基などの化学基で誘導体化することもできる。これらの基は、抗体の生物学的特性を改善する、たとえば、血清半減期を延長し、または組織結合性を増大させるのに有用となり得る。

一部の態様では、本発明の抗体は、ｈ３８Ｃ２と関連する。一部の態様では、ｈ３８Ｃ２は、配列番号３および４、ならびにその変異体を含む。これに関連して、「その変異体」は、配列番号５として示すＶ_Ｌ配列のＶ_ＬＣＤＲ１、Ｖ_ＬＣＤＲ２、およびＶ_ＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変部（Ｖ_Ｌ）と、配列番号６として示すＶ_Ｈ配列のＶ_ＨＣＤＲ１、Ｖ_ＨＣＤＲ２、およびＶ_ＨＣＤＲ３を含む重鎖可変部（Ｖ_Ｈ）とを含む抗体に関する。ｈ３８Ｃ２は、ＩｇＧ１抗体であることが好ましい。ｈ３８Ｃ２変異体は、配列番号５として示すＶ_Ｌと、配列番号６として示すＶ_Ｈとを含み、配列番号９、１０、１１および１２の１つまたは複数と少なくとも９５％一致する軽鎖定常部と、配列番号１３と少なくとも９５％一致する重鎖定常部とをさらに含むことが好ましい。一部の態様では、各定常鎖の、配列番号１２または１３の一方との同一性は、独立に、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％でよい。一部の態様では、軽鎖定常部は、配列番号９、１０、１１および１２の１つまたは複数と５アミノ酸残基以下しか異ならない。一部の態様では、軽鎖定常部は、配列番号１２を含む。一部の態様では、軽鎖定常部は、配列番号１２と５、４、３、２または１アミノ酸以下しか異ならない。

実施例
本発明の融通性を、以下の実施例によって例示するが、実施例は、本発明の典型的な実施形態を例示するものであり、特許請求の範囲または明細書を多少なりとも限定するものではない。

化合物１３を調製するための実験条件の概要
１３を生成するいくつかの経路を調査した。これまで、アゼチジノンの脱プロトン化を遅くするために、いくつかのタイプの変換においてＫＦ担持アルミナが用いられてきたが、この手法を試したとき、３日間かけて１３への低い変換率が認められた（データは示さず）。

実験条件
１． １３を生成する第１の経路では、酸塩化物１０の生成にＣｌ_２ＳＯを、アゼチジノン１１の脱プロトン化にｎ−ＢｕＬｉを用いた。第１のフラスコにおいて、酸９をＣｌ_２ＳＯで処理して、酸塩化物１０を調製した。反応が完了したら、蒸留によって過剰のＣｌ_２ＳＯを除去し、酸塩化物をＴＨＦに溶解させた。第２のフラスコでは、アゼチジノン１１をＴＨＦ中にて指定の温度でｎ−ＢｕＬｉ処理した。第１のフラスコに調製した酸塩化物溶液を、第２のフラスコに加え、混合物を室温に温めた。水での後処理後、生成物をクロマトグラフィーによって精製した。

２． １３を生成する第２の経路では、酸塩化物１０の生成に（ＣＯＣｌ）_２を、アゼチジノン１１の脱プロトン化にＬｉＨＭＤＳを用いた。上記第１の経路と同様のプロトコールを用いた。

３．調査した第３の経路では、ＣＤＩ／ＤＩＰＥＡを使用した。酸９のＣＨ_２Ｃｌ_２溶液に、ＣＤＩを加えた。室温で１時間経過後、２−アゼチジノン（１１）を加え、混合物を室温で所望の時間撹拌する。

４．調査した第４の経路は、Ｔ３ＰとＤＩＰＥＡを組み合わせたものであった。酸９、２−アゼチジノン１１、およびＤＩＰＥＡを適切な溶媒に溶かした溶液に、５０％のＴ３Ｐ ＥｔＯＡｃ溶液を加えた。混合物を所望の温度で指定の時間撹拌した。反応が完了したら、水で後処理を行い、化合物１３を適切な溶媒から再結晶させて精製した。

Ｃｌ_２ＳＯまたは塩化オキサリルを使用して酸塩化物１０を調製し、引き続いて、ＢｕＬｉまたはＬｉＨＭＤＳを用いた脱プロトン化によって調製した２−アゼチジノンのアニオンと反応させると、所望の生成物１３が得られたが、収率および純度が一般に低くなったことがわかった。

酸９のＣＤＩによる活性化は、容易に実現されたが、後続の２−アゼチジノンまたはそのアニオンとの結合は、おそらくはこの基体の求核性が弱いために、ＣＨ_２Ｃｌ_２、ＴＨＦ、ＥｔＯＡｃなどの溶媒中では実現されなかった。

最良の結果は、ＤＩＰＥＡ／Ｔ３Ｐを使用する第４の経路より得られた。

１３の合成

３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸（９、４４０ｇ、２．２５ｍｏｌ）、２−アゼチジノン（１１、２４０ｇ、３．３７ｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（１．４６ｋｇ、１１．３ｍｏｌ）をＭｅＣＮ（４．４Ｌ）に溶かした溶液に、１−プロパンホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ）をＥｔＯＡｃに溶かした５０％（ｗｔ／ｗｔ）溶液（２．１５ｋｇ、３．３８ｍｏｌ）を、内部温度を２０〜２５℃に保ちながら１時間かけて加えた。得られる混合物を２２℃で２０時間撹拌した後、ＨＰＬＣ分析によって、未反応の９が０．９％あることが示された。

反応液を減圧下で約２Ｌに濃縮し、残渣を３０〜３５℃でｉ−ＰｒＯＡｃ（６．６Ｌ）に溶かした。有機層を１０％クエン酸水溶液（４Ｌ）で洗浄した。水層をｉ−ＰｒＯＡｃ（２．７Ｌ）で再び抽出し、合わせた有機抽出物にＤａｒｃｏ Ｇ−６０（９０ｇ）を加えた。混合物を２５℃で４時間撹拌し、Ｃｅｌｉｔｅで濾過した。Ｃｅｌｉｔｅフィルターをｉ−ＰｒＯＡｃ（０．５Ｌ）で洗浄し、濾液を減圧下で約１Ｌに濃縮した。２−プロパノール（２．２Ｌ）を加え、蒸留を再開して、最終体積を約１Ｌとした。２−プロパノール（２．２Ｌ）を加え、混合物を３℃に冷却し、１時間この温度に保った。固体を濾過し、２−プロパノール（０．５５Ｌ）で洗浄した。湿ったケーキを反応器に戻し、ＥｔＯＡｃ（３．２４Ｌ）に溶解させた。Ｄａｒｃｏ Ｇ−６０（９０ｇ）を加え、混合物を２５℃で２時間撹拌した。懸濁液をＣｅｌｉｔｅで濾過し、ＣｅｌｉｔｅパッドをＥｔＯＡｃ（０．５Ｌ）で洗浄した。濾液を減圧下で約１Ｌに濃縮し、２−プロパノール（１．４Ｌ）を加えた。溶液を約１Ｌに濃縮し、追加の２−プロパノール（１．４Ｌ）を加えた。懸濁液を３℃に冷却し、１時間この温度に保った。固体を濾過し、２−プロパノール（０．５Ｌ）で洗浄し、真空中にて３０〜３５℃で８時間乾燥させて、２７３ｇ（４９％）の１３を得た。
ＨＰＬＣ 保持時間：２．６８分。ＨＰＬＣ純度：９８．０％（ａ／ａ）。融点：１０４〜１０６℃。¹H NMR (400MHz, DMSO-d₆) δ ppm 2.88-3.05 (m, 6H) 3.42 (t, J=5.27Hz, 2H) 7.44-7.53 (m, 2H)
8.07-8.16 (m, 2H). ¹³C NMR (100MHz, DMSO-d₆) δ ppm 29.37, 36.05, 36.89, 37.00, 123.83, 130.06, 146.38, 149.49,
166.20, 169.38. MS (ES+): 249 (M+H)⁺.

１４ｂの合成

調査した１つの仮説は、長期貯蔵を容易にするためには、化合物１４を固体として単離することが必要であるということであった。したがって、改良された方法は、化合物１４の塩形態である化合物１４ｂの生成に向けて考案された。１Ｌ容Ａｔｌａｎｔｉｓ反応器に、１０％パラジウム炭素（Ｐｄ／Ｃ）（５０．００ｍｇ）、ＴＨＦ（１１．００ｍＬ）、および化合物１３（０．５ｇ）を加えた。反応器を密閉し、２５℃で１時間、１０ｐｓｉで水素化した。ＨＰＬＣにより、反応が完了したことが示される。触媒を濾過によって除去した。化合物１４を溶液として単離した。ＨＰＬＣ純度＞９９％。

ＨＣｌ塩の生成および単離
実施したニトロ還元からの、遊離塩基化合物１４（５．８５ｇ）を含有する１９０ｍＬの溶液を、０〜５℃に冷却した。ＨＣｌ（１２Ｍ、１．５ｍＬ）を加えて、黄色がかった懸濁液を得た。スラリーを真空中で約６０ｍＬに濃縮した。酢酸イソプロピル（１１７ｍＬ）を３０分かけて加えた。スラリーを真空中で濃縮し直して、最終体積を６０ｍＬとした。スラリーを０〜５℃で３０分間粒状化し、次いで濾過した。固体を真空オーブンにおいて４０℃で終夜乾燥させて、６．６ｇのＨＣｌ塩１４ｂを得た。

上記方法は、以前の方法より改良されてはいるが、依然として相対的に時間および資源を消費するという不利益を有する。したがって、化合物の溶液中での安定性が潜在的に不利であり、溶液を直ちに使用するという要件がおそらく付随するにもかかわらず、化合物１４を遊離塩基として単離する、直観に反した決断を下した。

化合物１４を調製する条件の概要

化合物１３をＴＨＦに溶解させ、１０％Ｐｄ／Ｃを加えた。次いで反応液を約２５℃で１６時間、１０ｐｓｉｇで水素化した。反応が完了したら、触媒を濾別し、アニリン１４を含有する濾液を次のステップ（ジグリコール酸無水物１５との結合）で使用した。検定において、ＴＨＦの体積（たとえば、約２０体積〜約６０体積）または反応時間（たとえば、約１時間〜約１６時間）を変更しても、反応の収率または純度は変わらず、したがって、これらの変数は、自由裁量とすることを決定した。

活性炭スクリーン
１０重量％の等量の１０％パラジウムおよび炭素を、窒素下で乾燥させて反応器に装入した後、出発材料を１０体積のテトラヒドロフランに溶かした溶液を装入した。添加剤の一部をそれぞれに加え、室温にて終夜５０ｐｓｉで水素化した。完了した反応液を濾過して触媒を除去し、得られる濾液を、好ましくない副生成物について分析した。炭素スクリーンの結果を表２に示す。

化合物６を調製する反応条件の概要
化合物１４を対応する溶媒に溶かした溶液に、ジグリコール酸無水物（１５）を加える。ＤＩＰＥＡなどの塩基を加えてもよいが、必要ではない。反応液を所望の温度で指定の時間撹拌する。水で後処理した後、未精製材料を適切な溶媒でスラリー精製する。

第７番溶媒の選択
等しい量の化合物１４（遊離塩基）および１５を、２０体積のＴＨＦ（１４に対して２０ｍＬ／ｇ）に溶解させた。反応が完了するまで（約３０分）、混合物を室温で撹拌した。減圧下で溶媒を除去し、固体残渣を５体積の第７番溶媒（ヘキサン、２−プロパノール、酢酸メチル、または酢酸ｉ−プロピルのうちの１つ）中で摩砕した。固体を濾過し、乾燥させ、収率および純度（表５）について評価した。ヘキサンを使用すると、９７％の純度が収率６８％で得られた。２−プロパノールを使用すると、５０％の収率しか得られなかった。酢酸メチルを使用すると、９６．８％の純度が収率８０％で得られた。酢酸ｉ−プロピルを使用すると、およそ９５．５％の純度が収率８０％で得られた。

化合物６の合成

３０Ｌ容水素化反応器に、ニトロ化合物１３（１４２ｇ、０．５７ｍｏｌ）、１０％Ｐｄ／Ｃ（１４ｇ）、およびＴＨＦ（８．５２Ｌ）を装入した。撹拌を開始し、混合物を２５℃で１時間、１０ｐｓｉｇで水素化した。ＨＰＬＣ分析により出発材料の完全な消費が示された後、混合物を、Ｃｅｌｉｔｅでプレコーティングされた０．５ミクロンカートリッジフィルターで濾過し、フィルターをＴＨＦ（３Ｌ）で洗浄した。アニリン１４を含有する濾液を、２０Ｌ容ジャケット付き反応器に移し、ジグリコール酸無水物（１５、７５ｇ、０．６５ｍｏｌ）を加えた。２２℃で１５分経過後、混合物のＨＰＬＣ分析により、１４が完全に消費されたことが示され、反応液を減圧下で２Ｌに濃縮した。残渣に少量の酸６結晶（１．０６ｇ）を播き、１５分後、ｉ−ＰｒＯＡｃ（１．７８Ｌ）を１時間かけて加えた。懸濁液を減圧下で１．５Ｌに濃縮し、残渣を３℃に冷却した。１時間後、固体を濾過し、冷ｉ−ＰｒＯＡｃ（０．５Ｌ）で洗浄し、４０℃で真空乾燥して、１６０ｇ（８４％）の酸６を得た。分析により、残留ＴＨＦ（０．６０重量％／ｗｔ）およびｉ−ＰｒＯＡｃ（０．６２重量％／ｗｔ）が示された。

この材料に、次のように手を加えて、色を改良し、残留溶媒の量を減らした。酸６（１５０ｇ、０．４５ｍｏｌ）を３０℃でＴＨＦ（５．２５Ｌ）に溶解させた。活性炭Ｄａｒｃｏ ＫＢＢ（３０ｇ）を加え、混合物をこの温度で１時間撹拌した。懸濁液をＣｅｌｉｔｅで濾過し、ＣｅｌｉｔｅパッドをＴＨＦ（０．５Ｌ）で洗浄した。濾液を減圧下で１．５Ｌに濃縮し、残渣にｉ−ＰｒＯＡｃ（３Ｌ）を３０分かけて加えた。混合物を２時間室温（たとえば約２０℃）に保ち、次いでそれを減圧下で１．５Ｌに濃縮した。懸濁液を３℃に冷却し、１時間撹拌し、濾過した。固体をｉ−ＰｒＯＡｃ（８０ｍＬ）で洗浄し、４０℃で１２時間真空乾燥して、１２０ｇ（収率８０％）の６を得た。

分析により、残留ＴＨＦ（０．１３重量％／ｗｔ）およびｉ−ＰｒＯＡｃ（０．２７重量％／ｗｔ）が示された。ＨＰＬＣ保持時間：２．１８分。ＨＰＬＣ純度：９９．３％（ａ／ａ）。融点：１３９〜１４０℃。¹H NMR (400MHz, DMSO-d₆) δ ppm 2.72-2.90 (m, 4H) 3.00 (t, J=5.27Hz, 2H) 3.38-3.42 (m, 2H) 3.43
(s, 1H) 4.12 (s, 2H) 4.16 (s, 2H) 7.10-7.16 (m, 2H) 7.47-7.53 (m, 2H) 9.77 (s,
1H) 12.84 (br. s., 1H). ¹³C NMR (100MHz, DMSO-d₆) δ ppm 29.16, 35.98, 36.84, 37.89, 68.54, 70.89, 120.09, 128.95,
136.24, 136.84, 166.20, 168.10. MS (ES+): 335 (M+H)⁺.

化合物９および１１からの化合物６の調製

化合物２０を調製する条件の概要
酸６およびペンタフルオロフェノール（１９）を対応する溶媒に溶解させた。カップリング剤を加え、反応液を所望の温度で指定の時間撹拌した。水で後処理した後、未精製の２０をクロマトグラフィー精製または適切な溶媒でスラリー精製した。

ペンタフルオロフェノールエステル２０の合成

酸６（８０ｇ、２３９ｍｍｏｌ）およびペンタフルオロフェノール（１９、４９ｇ、２６６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１．１Ｌ）に溶かした冷（３〜５℃）溶液に、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（５２ｇ、２５２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４００ｍＬ）溶液を１０分かけて加えた。１５分後、混合物を２２℃に温め、１８時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析により、反応が完了したことが示された。懸濁液を濾過して、ジシクロヘキシル尿素副生物を除去し、固体をＴＨＦ（１１０ｍＬ）で洗浄した。濾液を約１．８Ｌに濃縮し、アセトン（１．５８Ｌ）を加えた。懸濁液を１０℃に冷却し、１．５時間撹拌した。残存するジシクロヘキシル尿素を濾別し、固体をアセトン（２５ｍＬ）で洗浄した。濾液を約１．８Ｌに濃縮し、２−プロパノール（２．７５Ｌ）を加えた。スラリーを室温（たとえば約２０℃）で１６時間撹拌し、固体を濾過し、２−プロパノール（１１０ｍＬ）で洗浄し、４０℃で１６時間真空乾燥して、９５ｇ（８３％）のペンタフルオロフェノールエステル２０を白色の固体として得た。
ＨＰＬＣ保持時間：３．２５分。ＨＰＬＣ純度：９６．６％。融点：９４〜９９℃。¹H NMR (400MHz, CDCl₃) δ ppm 2.85-3.07 (m, 7H) 3.53 (t, J=5.27Hz, 2H) 4.26 (s, 2H) 4.62 (s,
2H) 7.10-7.22 (m, 2H) 7.40-7.53 (m, 2H) 8.47 (s, 1H). ¹³C NMR
(100MHz, CDCl₃) δ ppm 29.37, 35.83, 36.50,
37.98, 67.89, 69.03, 71.46, 71.83, 120.08, 120.16, 128.97, 128.08, 135.07,
136.87, 165.03, 166.13, 166.24, 170.10. MS (ES+): 501 (M+H)⁺.

化合物３を調製する実験条件
ペプチド２ａ（配列番号１）を適切な溶媒に溶解させ、得られる溶液の温度を所望の値に調整した。ペンタフルオロエステル２０および塩基を加え、反応液を所望の温度で所定の時間撹拌した。溶液から生成物３を沈殿させるのに反溶媒を用いた場合、反溶媒は、２と２０の結合を進める同じ温度で加えた。次いで混合物を室温に温め、１時間撹拌した。生成物３を濾過によって単離した。

ペプチド−リンカーコンジュゲート３の合成
ペプチド２（１００ｇ、３５．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．９５Ｌ）に溶かした冷（−１５℃）溶液に、ＮＭＭ（４．８ｍＬ、４３．６ｍｍｏｌ）を加えた後、ペンタフルオロフェノールエステル２０（５０ｇ、１００ｍｍｏｌ）を５分かけて少量ずつ加えた。混合物を−１５℃で７時間撹拌し、その時点で、ＨＰＬＣ分析により、未反応の２が１％未満であることが示された。混合物を０．４５ミクロンのインラインフィルターで濾過し、ＭｅＣＮ（１２．８Ｌ）を含有する第２の反応器に、室温（たとえば約２０℃）で５分かけて加えた。白色の沈殿が直ちに生成した。第１の反応器をＤＭＦ（１００ｍＬ）で洗浄し、この洗液を、インラインフィルターを介して第２の反応器に加えた。スラリーを室温（たとえば約２０℃）で約１時間撹拌し、固体を濾過し、ＭｅＣＮ（３×１Ｌ）で洗浄し、室温（たとえば約２０℃）で６時間真空乾燥して、９４ｇ（８６％）の３を白色の固体として得た。ＧＣヘッドスペースにより、残留ＤＭＦ（４．５重量％／ｗｔ）およびＭｅＣＮ（０．９５重量％／ｗｔ）が示された。溶媒含有量を減らして規格を満たすという目標のもと、固体を＃２０手篩にかけ、次いでＭｅＣＮ（１０Ｌ）中にておよそ室温で１時間、十分に撹拌しながらスラリー化した。固体を濾過し、ＭｅＣＮ（２×１Ｌ）で洗浄し、３０℃で２４時間、４０℃でさらに２４時間乾燥させて、９１ｇの３を得た（回収率９７％、全体としての収率８３％）。残留ＤＭＦ（０．０５重量％／ｗｔ）およびＭｅＣＮ（０．１９重量％／ｗｔ）。ＨＰＬＣ純度：９６．５％（ａ／ａ）。ＨＰＬＣ保持時間：１７．９９分。ＭＳ（ＥＳ＋）：３１５６．６ Ｄａ（Ｍ ＋ Ｈ）^＋。

スキームＶＩＩ：ペプチド−リンカーコンジュゲート３の最終コンジュゲート形成および単離条件。条件：ＮＭＭ（１．３当量）、ＤＭＦ（１５体積）、−１５〜−１８℃、７時間。濾過して不溶性物質を除去する（０．４５ミクロン）。濾液をＭｅＣＮ（約１４４体積）中に滴下して生成物を沈殿させる。最終組成：ＭｅＣＮ／ＤＭＦ ９／１。フィルターをＤＭＦ（１体積）で洗浄する。室温で１〜２時間撹拌する。Ｎ_２中で濾過する。ケーキを１００％ＭｅＣＮ（３×１０体積）で洗浄する。室温（たとえば約２０℃）で乾燥させる。ＭｅＣＮ（１００体積）中で再スラリー化して、残留ＤＭＦを除去する。１を４０℃で真空乾燥する。収率：８３％。

コンジュゲート３を生成するための酸６のペプチド２とのコンジュゲート形成
酸６を、ペプチド２と結合させる前に、そのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとして最初から活性化した。Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）をカップリング試薬として使用しながら、酸６をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（７）で処理して、中間体８を生成することにより、この手法を調査した。中間体８を結晶化によって単離するのが困難であることがわかった。

加えて、中間体８をシリカでのクロマトグラフィーによって単離するという手間により、シリカと接触する際の中間体８の不安定性の痕跡が、ＴＬＣ分析によって観察されたことも明らかになった。

８は、クロマトグラフィー後に、泡沫状の固体として９２％の優れた収率で単離されたが、ＨＰＬＣおよび^１Ｈ ＮＭＲの両方の分析により、主要な２成分の混合物が示された。その一方は、所望の８として同定されたが、固体を数時間だけ放置しておいた後、第２の成分の量が増加していることが認められた。

さらに調査した結果、ＬＣ−ＭＳによって、第２の成分として、分子上のアニリド窒素によりＮ−ヒドロキシスクシンイミド基が分子内置換されて生成した、モルホリン−３，５−ジオン１８が同定された。

この環状副生物は、室温で数日だけ経過した後、単離された固体の主要な構成成分になった。この副反応は、処理および単離のための時系列がより長いために規模に関してなおさら問題になると想定されることから、酸６のための代替活性化基の探索に着手した。

Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに関連した実験から得た情報に基づき、ペプチド２のリシン残基上のアミノ基に対する反応性と、モルホリン−３，５−ジオン１８の生成を防止するための安定性との微妙なバランスが必要であったことが明白になった。

不純物プロフィールを改善する
ペプチド２と化合物２０の反応は、室温（たとえば約２０℃）で進めたとき、非常に急速であり（＜３０分）、単離した材料の純度は、９０〜９５％の範囲にあった。ペプチド２出発材料の純度と比べて純度を低下させた、４種もの主な不純物が検出された。

それら４種の副生物は、ＭＳデータに基づき（これらすべてが同じ質量を示した）、ペプチド−リンカーコンジュゲート３のペンタフルオロフェノールエステル誘導体として特徴付けられ、これらを合わせると、合計７〜８％に達した。興味深いことに、各不純物は、ペプチド主鎖上の４種の異なるカルボン酸基に対応する別個のモノエステルであり、複数のエステルを有する不純物は検出されなかった。したがって、ペンタ−フルオロフェノールモノエステル誘導体が生成してしまうと、その同じ分子上でのさらなるエステル化は、極めて緩やかであることが明らかである。これら不純物の構造を以下に示す。

この事実は、現況の酸基の物理的選別に基づいて合理的に扱うことが難しい。したがって、ペプチド−リンカーコンジュゲート３について純度≧９５％の規格を実現するために、これらの存在を最小限に抑えることが望ましかった。このための主要な原動力は、摩砕または再結晶によってペプチド−リンカーコンジュゲート３の化学純度を向上させるいかなる試みも、ペプチド−リンカーコンジュゲート３および関連副生物の溶解性が極めて低いために、失敗していたことであった。

ペプチド−リンカーのコンジュゲート形成反応の際に同定されたペンタフルオロフェノールエステル不純物の安定性を判断する最終調査を実施した。こうした副生物が、薬物原体を調製する最終工程の際に同様にモノクローナル抗体に結合することになり、５の最終精製を困難にするかもしれないことが推論された。結果として、ペンタフルオロフェノールエステル不純物レベルの高いペプチド−リンカーコンジュゲート３のサンプルを、ペプチド−リンカー３のモノクローナル抗体４とのコンジュゲート形成に用いる、同じｐＨ６．５の５０：５０ヒスチジン／プロピレングリコール２０ｍＭ緩衝液中に入れた。結果を表６に示す。わずか３０分後、３種の不純物の１つが検出可能でなくなり、他の２種のレベルがかなり低下していた。同時に、全体としての純度は、およそ同じ量だけ増加した。６０分後、残存する２種がほとんど完全に消失し、３の純度は変化しないままとなった。この結果は、これら不純物が、この水性媒質中では短寿命であり、所望の生成物３に再び戻ることを示唆していると見られる。

３の改良された調製方法

ＰＮＰエステルを使用したコンジュゲート３の調製

化合物６（０．５ｇ、０．００１５モル、１当量）のＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液に、化合物２１（ｐ−ニトロフェノール）（０．２３ｇ、０．００１６５モル、１．１当量）を加えた。混合物を０〜５℃で撹拌した。混合物は、わずかに濁っていた。この混合物に、ＤＣＣ（０．３２５ｇ、０．００１６モル、１．０５当量）を加えた。混合物を室温で終夜撹拌した。翌日、スラリーをブフナー漏斗で濾過して、沈殿したＤＣＵを除去した。濾液をロータリーエバポレーターで蒸発乾燥させた。残渣を８ｍＬのイソプロパノール中にスラリー化し、０〜５℃で１時間撹拌した。生成物スラリーを濾過し、５ｍＬのイソプロパノールで洗浄し、高真空中で終夜乾燥させて、０．５３１ｇ（６８％）の収率の化合物２２を得た。

化合物２２（０．３ｇ、０．０００６６モル、３当量）を３５ｍＬ容丸底フラスコに入れた。固体を５ｍＬのＤＭＦに溶解させた。溶液に、ペプチド２ａ（配列番号１）遊離塩基（０．６２４ｇ、０．０００２２５モル、１当量）を固体として加えた。反応混合物を０〜５℃で８時間撹拌した。反応期間の終わりに、反応混合物のＨＰＬＣ分析によって、ペプチド２ａがすべて消失したことが示された。混合物を１５０ｍＬのアセトニトリルにゆっくりと滴下した。沈殿した生成物スラリーを室温で３時間撹拌した。スラリーを、ブフナー漏斗で、Ｗｈａｔｍａｎ濾紙＃２を使用して濾過した。スラリーは、１０分以内で濾過した。生成物ケーキを１５ｍＬのアセトニトリルで洗浄した。生成物化合物３ｄを高真空中で１６時間乾燥させて、化合物３ｄである白色の生成物を０．６１２ｇ（８６％）の収率で得た。

反応の完了および生成物の純度の概要
１．化合物６、１３、１４および２０についての反応の完了および生成物の純度は、次の条件を使用したＨＰＬＣによって評価した。カラム：Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ−ＣＮ ３．５μｍ、３×７５ｍｍ。カラム温度：４５℃。検出：２１０ｎｍのＵＶ。移動相：Ａ：水（０．０５％ＴＦＡ）、Ｂ：ＭｅＣＮ。勾配：０分：９５／５、３．７分：５／９５、４．３分：５／９５、４．４分：９５／５。流量：１．２ｍＬ／分。

２．ペプチド−リンカーコンジュゲート３についての反応の完了は、次の条件を使用したＨＰＬＣによって評価した。カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ１３０ Ｃ１８ ３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍ。カラム温度：３０℃。検出：２１０ｎｍのＵＶ。移動相：Ａ：６０／４０の水／ＭｅＯＨ（０．１％ギ酸）、Ｂ：６０／４０のＭｅＣＮ／ＭｅＯＨ（０．０８５％ギ酸）。勾配：０分：９５／５、３分：９５／５、２０分：６０／４０、２３分：０／１００、２５分：０／１００、２５．１分：９５／５、３０分：９５／５。流量：１ｍＬ／分。

３．化合物３についての生成物の純度は、次の条件を使用したＨＰＬＣによって評価した。カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ、２５０×内径４．６ｍｍ、Ｓ−５μｍ １２ｎｍ、Ｐ／Ｎ ＡＡ１２Ｓ０５−２５４６ＷＴ。カラム温度：６０℃。オートサンプラー温度：５℃。注入体積：２５μＬ。検出：２２０ｎｍのＵＶ。移動相：Ａ：０．１Ｍ ＮａＣｌＯ_４、Ｈ_３ＰＯ_４でｐＨ３．１に調整、Ｂ：０．１％のＴＦＡ ＡＣＮ溶液。溶解用溶媒：１：１の水／ジメチルホルムアミド。サンプル濃度：１ｍｇ／ｍＬ。勾配：０分：７３／２７、２分：７３／２７、３２分：７０／３０、４２分：５０／５０、４２．１分：７３／２７、５０分：７３／２７分。流量：１．５ｍＬ／分。

４．^１Ｈ ＮＭＲおよび^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、溶媒および内部標準両方としてのＣＤＣｌ_３またはＤＭＳＯ−ｄ_６中で、４００ＭＨｚ分光計において記録した。化合物６、１３、１４および２０についての質量データは、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ Ｓｅｒｉｅｓ ＬＣ／ＭＳＤ ＳＬ分光計（ＥＳＩ）で取得した。３についての質量データは、ＭｉｃｒｏＭａｓｓ Ｑ−ＴｏＦ Ｇｌｏｂａｌ質量分析計（ＥＳＩ）を使用して取得した。

３ｂのｈ３８Ｃ２ 抗体とのコンジュゲート形成
３ｂのコンジュゲート形成を、約５℃〜約３５℃の間の温度範囲で実施した。ヒスチジン、グリシン、およびスクロースを含有する緩衝液混合物にｈ３８Ｃ２抗体（配列番号３および配列番号４）を溶かした溶液に、共溶媒とヒスチジン緩衝液の混合物に３ｂを溶かした溶液を加えた。コンジュゲート形成を約２〜約２４時間実施した。コンジュゲート形成反応の終わりに、混合物を０．２ミクロンフィルターで濾過した。次いで溶液をＱメンブレンフィルターに通して、残存する残留ペプチド３ｂを除去した。次いで溶液を濃縮し、所望のｐＨ、好ましくはｐＨ６．５のヒスチジン／グリシン緩衝溶液を使用しながら、ＵＦ−ＤＦ膜で透析濾過した。次いで、濃縮されたペプチド−リンカー−抗体５の溶液を、ポリソルベート２０およびスクロースを含有するヒスチジン／グリシン緩衝液で希釈して、所望の濃度、好ましくは約２０ｍｇ／ｍＬとした。

コンジュゲート形成方法の共溶媒の変更
薬物原体５の生成方法は、当初、その内容が本明細書に援用されるＵＳ８２８８３４９に記載された。当初の方法は、ペプチド−リンカー３と抗体ｈ３８Ｃ２のコンジュゲート形成工程において、プロピレングリコールを共溶媒として使用するものであった。ペプチド−リンカー３ｂは、プロピレングリコール溶媒への溶解性が非常に低い。また、３、特に３ｂのタイプの化合物は、２種の異なる固体形態で存在し、一方は完全に非晶質であり、他方の固体形態は、部分的に結晶質のモルホロジーを示す。両方の固体形態が、種々の溶媒および緩衝液において異なる溶解性特性を示す。非晶質である方の固体形態は、種々の溶媒および緩衝溶液により可溶性であるのが普通である。しかし、コンジュゲート形成混合物への溶解性が高い方の固体形態だけが一貫して生成および単離されることになる、３ｂの調製方法の条件を制御することは難しい。３ｂの製造方法では通常、２種の異なる固体形態の混合物として生成物が得られる。これにより、５を調製する間のコンジュゲート形成混合物は不均一になり、コンジュゲート形成反応の動態は不定となる。バイオコンジュゲート５を調製する際、一貫した反応動態およびより堅固な製造方法を実現するためには、反応の始めに、均質な溶液としてのコンジュゲート形成混合物を取得することが望ましい。

意外にも、ＤＭＳＯを溶媒として用いると、３ｂの固体形態は両方とも、周囲温度において、所望の１２ｍｇ／ｍＬの濃度および１００ｍｇ／ｍＬもの濃度で容易に可溶性となったことがわかった。アセトニトリルやメタノールなどの、ＤＭＳＯ以外の溶媒では、表７に示すように、結晶質である方の固体形態が、限られた溶解度を伴った。

当初の方法では、プロピレングリコールが、主として、疎水性のペプチド−リンカー３ｂがｐＨ６．５の水性ヒスチジン緩衝溶液に分散するのを助けるために、共溶媒として使用された。プロピレングリコール／ヒスチジン緩衝液混合物では、３ｂの両方の固体形態が、異なる速度ではあるとしても、２〜３時間かけてゆっくりと溶解する。これにより、コンジュゲート形成反応の始めの時点のコンジュゲート形成混合物は、不均一になり、コンジュゲート形成反応の動態は不定となる。バイオコンジュゲート５の調製の際、反応速度を予測可能なものとするためには、反応開始時に、均質な溶液としてのコンジュゲート形成混合物を取得することが有利であるとわかった。５のコンジュゲート形成工程において、プロピレングリコールを共溶媒としての（１０％ｖ／ｖまでの）ＤＭＳＯと差し替えると、反応混合物が均質となったことが発見された。これにより、ひいては、コンジュゲート形成工程の反応速度がより一定で予測可能となり、５を生成する製造方法がより堅固なものとなる。

この工程で使用するｈ３８Ｃ２は、完全にコンジュゲート形成可能なｍＡｂ、部分的にコンジュゲート形成可能なｍＡｂ、およびコンジュゲート形成可能でないｍＡｂを含んだ、ｍＡｂ種の混合物からなる。ｈ３８Ｃ２のペプチド３ｂとのコンジュゲート形成により、５は、完全にコンジュゲート形成した２負荷（＋２）種、部分的負荷種（＋１）、およびコンジュゲート形成可能でないｍＡｂ（０負荷種）を含んだ、コンジュゲートの混合物として得られる。

種々のコンジュゲート形成反応可変要因が、反応速度、製品品質、および収率に与える影響を調査するために、実験計画（ＤＯＥ）手法を使用して、一連の実験を実施した。評価のために、コンジュゲート形成混合物のｐＨ、コンジュゲート形成の温度、および出発抗体に対するペプチドの比率という３つのパラメータを選択した。緩衝溶液の組成（２０ｍＭヒスチジン緩衝液）、抗体濃度（１６．７ｍｇ／ｍＬ）、溶液中のＤＭＳＯ濃度（７％）などの他のパラメータは、一定に保った。各パラメータの中心点は、ｐＨ６．５、２０℃、および２．４：１のペプチド：抗体比とした。低い試験レベルは、ｐＨ５．５、５℃、および１．８の比とし、高いレベルは、ｐＨ７．５、３５℃、および３の比とした。

考えられる非線形効果についての情報を得るために、可変値が全パラメータ範囲について中心点にあるいくつかの実験を選択した。これら実験のプロトコールは、簡潔に述べると以下のとおりである。ペプチド３ｂ（２５ｍｇ）を、磁気撹拌子を備え付けた２０ｍＬ容バイアルに入れた。固体をＤＭＳＯ（２．１ｍＬ）に溶解させた。溶液にヒスチジン緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ６．５、２．１ｍＬ）を加えた。混合物を２０℃で９０分間撹拌した。抗体ｈ３８Ｃ２の溶液（２５．１３ｍＬ、１９．９ｍｇ／ｍＬ）を、別のジャケット付き反応器に加えた。この溶液に、ペプチド３ｂをＤＭＳＯ／ヒスチジン緩衝液に溶かした溶液を２〜３分間かけてシリンジで加えた。混合物を２０℃で撹拌した。ＳＥＣおよびＨＩＣクロマトグラフィー法によって、反応が完了したかモニターした。残りの試験についてのプロトコールは、それぞれのｐＨ、温度、およびペプチド：抗体の比を除いては同一であった。５のその場での収率および反応完了時間（時間）を、ＨＩＣおよびＳＥＣクロマトグラフィー法によって評価した。ＤＯＥ実験の結果を表８に示す。

ＤＯＥ調査からの結論は、以下のとおりである。
コンジュゲート形成についての所与の設計空間内：
−所与のｐＨでは、より高い温度およびより高いペプチド：ｍＡｂ比で、＋２の収率の増加が実現される。
−所与のペプチド比率では、より高いｐＨおよびより高い温度で、＋２のより高い収率が実現される。
−所与の温度では、より高いｐＨおよびより高いペプチド比率により、＋２のより高い収率となる。
−コンジュゲート形成混合物のｐＨは、反応速度に最大の影響を及ぼす。低いｐＨでは、コンジュゲート形成反応は、より緩やかである。

パラメータおよびその範囲区域によって規定される反応設計空間内では、＋２のコンジュゲートの最適収率は、ペプチド比率が２．１当量〜３当量の間であり、ｐＨが６．５〜７．５であり、温度が２０℃〜３０℃の間であるとき、３時間の標準反応時間内で実現される。しかし、ペプチド比率が１．８当量〜３当量の間である限り、ｐＨ（５．５〜７．５）および温度（５〜３５℃）についてより広い範囲区域内でも所望の生成物を得ることができ、コンジュゲート形成反応をその完了へと進めることが可能である。物資の費用を最小限に抑え、生産性を最大にするために、コンジュゲート形成反応は、通常、２．１のペプチド／抗体比、室温（たとえば２２℃）、およびｐＨ６．５で実施される。より高い温度（たとえば３０〜３５℃）およびより高いｐＨ（たとえば、約ｐＨ７．５）では、ペプチド３ｂの分解がより速い速度で起こる。コンジュゲート形成混合物にかなり過剰のペプチド３ｂを加えると、特に、高いｐＨ条件では、工程に関連した不純物がより多く生成されかねない可能性がある。したがって、工程は、規定のパラメータ内で稼働し得るが、最適化された範囲内で稼働させることが好ましい。

一部の態様では、本発明は、ペプチド−リンカーを、本明細書に記載するような抗体とコンジュゲート形成させる方法であって、
（ｉ）化合物３ｂを、好ましくは約５ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌの間、より好ましくは約１０ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌの間、最も好ましくは約１２ｍｇ／ｍｌで、好ましくは、少なくとも約１分、少なくとも約５分、好ましくは少なくとも約１５分の期間をかけて、ＤＭＳＯに溶解させるステップ（反応は安定したものであるので、期間に上限は必要ない）と、
（ｉｉ）（ｉ）において作製した化合物３ｂの溶液に、（本明細書および以下に記載するような）ヒスチジン緩衝液（約５．５〜約７．５の間のｐＨ、好ましくは約ｐＨ６．５）を、好ましくはおよそ等体積、好ましくは約２ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの間、より好ましくは約５ｍｇ／ｍｌ〜約８ｍｇ／ｍｌの間、最も好ましくは約６ｍｇ／ｍｌで加えるステップと、
（ｉｉｉ）ｈ３８Ｃ２ 抗体を加えるステップと、
（ｉｖ）好ましくはおよそ約１５℃〜約３５℃の間、より好ましくは室温、最も好ましくは約２２℃において、反応混合物が泡立つのを回避するように中程度のスピードで少なくとも約１時間撹拌するステップと、
（ｖ）（ｉｖ）からの溶液を濾過するステップと
を含む方法を提供する。

したがって、一部の態様では、本発明は、式３ｂのペプチドを抗体とコンジュゲート形成させる方法であって、
（ｉ）化合物３ｂをＤＭＳＯに溶解させるステップと、

（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＭＳＯおよび３ｂからなる溶液に、約５．５〜約７．５の間のｐＨのヒスチジン緩衝液を加えるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の溶液に、配列番号５を含む軽鎖可変部と、配列番号６を含む重鎖可変部とを含む抗体を、ペプチド：抗体モル比が約１．８：１〜約３：１の間になるように加えるステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）において形成した混合物を、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ７．５の間および約５℃〜３５℃の間の温度で、反応混合物が泡立つのを回避するように中程度のスピードで少なくとも約１時間撹拌するステップと、
（ｖ）（ｉｖ）からの溶液を濾過して、得られたペプチド−リンカー抗体コンジュゲート５ｂ

を抽出するステップと
を含み、
ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０であり、ｑ＝１、２、３、４または５である方法を提供する。

一部の態様では、抗体は、約１ｍＭ〜約１００ｍＭの間のヒスチジン、好ましくは約５ｍＭ〜約２０ｍＭ、より好ましくは約１０ｍＭのヒスチジンと、約１ｍＭ〜約１００ｍＭの間のグリシン、好ましくは約１ｍＭ〜約２０ｍＭの間のグリシン、より好ましくは約１０ｍＭのグリシン緩衝液とを含み、約０．１％（ｗ／ｗ）〜約１０％（ｗ／ｗ）の間のスクロース、好ましくは約０．５％（ｗ／ｗ）〜約５％（ｗ／ｗ）の間のスクロース、より好ましくは約１％（ｗ／ｗ）〜約３％（ｗ／ｗ）の間のスクロース、最も好ましくは約２％（ｗ／ｗ）のスクロースをさらに含む溶液中にあってよい。好ましくは、コンジュゲート形成混合物中の抗体の最終濃度は、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約３０ｍｇ／ｍｌの間、より好ましくは約１４ｍｌ〜約２０ｍｌの間、最も好ましくは約１６．７ｍｇ／ｍＬでよい。

一部の態様では、撹拌は、磁気結合式撹拌機（６インチ刃の６枚刃）を底に据え付けたステンレス鋼製反応器において、７０ｒｐｍで行ってもよいし、またはガラス製反応器において、Ｔｅｆｌｏｎ製パドルを備えたオーバーヘッド型機械式撹拌機を１２０ｒｐｍのスピードで使用して行ってもよい。反応混合物は、少なくとも約１時間、より好ましくは少なくとも約２時間、より好ましくは約１時間〜終夜の間、さらに好ましくは約２時間〜約６時間の間、最も好ましくは約３時間撹拌することができる。

一部の態様では、濾過は、０．２μｍフィルターによるものであり、それに続いて濾液をＱ濾過にかけることができる。この後、濾液は、２０ｍＭのヒスチジンおよび２００ｍＭのグリシンを含有するｐＨ６．５の緩衝液と、ポリソルベート２０（０．１％ｗ／ｗ）およびスクロース（２％ｗ／ｗ）の配合物を用い、３０キロダルトン分子量カットオフのＨｙｄｒｏｓａｒｔ限外濾過膜で行うなどの、ＵＦ／ＤＦ濾過にかけた後、さらに０．２μｍ濾過にかけることができる。

一部の態様では、上記反応は、化合物３ｂおよび化合物５ｂに関する。上記の一部の態様では、ｎ＝１であり、方法は、化合物３ａおよび化合物５ａに関する。一部の態様では、ｎ＝１およびｑ＝１であり、方法は、化合物３および化合物５に関する。

９と１１から５を調製する改良された方法

３と４から５を調製する改良された方法

こうして本発明を広く開示し、上述の典型的な実施形態に即して例示してきた。当業者であれば、本発明に対して、その真意および範囲から逸脱することなく、様々な変更を行ってもよいことは承知されよう。すべての刊行物、特許出願、および登録特許は、個々の各刊行物、特許出願、または登録特許について、その全体が参照により援用されることが詳細かつ個別に示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に援用される。参照により援用される文言に含まれる定義は、この開示における定義に矛盾するならば除外される。

明確にするために、別々の実施形態の文脈において記載している、本発明のある特定の特徴は、単一実施形態において組み合わせて提供することもできると理解される。逆に、簡潔にするために、単一実施形態の文脈において記載している、本発明の様々な特徴を、別々に提供することも、または適切な任意の下位組合せ形態にして提供することもできる。

本発明の一実施形態に関して論じた任意の制限事項が、本発明の他の任意の実施形態に適用される場合もあることは、明確に企図される。さらに、本発明の任意の組成物は、本発明の任意の方法で使用することができ、本発明の任意の方法は、本発明の任意の組成物の製造または利用に使用することができる。詳細には、特許請求の範囲に記載の本発明の任意の態様は、単独で、または１もしくは複数の追加の請求項および／もしくは記述文の態様と組み合わせて、特許請求の範囲および／または記述文の他の場所で述べた本発明の他の態様と組合せ可能であると理解されるものとする。

特許請求の範囲における用語「ｏｒ（または、もしくは）」の使用は、本開示が選択肢のみと「ａｎｄ／ｏｒ」を表す定義を支持しているとしても、選択肢だけを表すこと、または選択肢が互いに両立しないことを明確に示さない限り、「ａｎｄ／ｏｒ（および／または、および／もしくは）」を意味するのに使用する。

本明細書で使用するとき、「ａ（１つの）」または「ａｎ（１つの）」は、そうでないと明確に示さない限り、１または複数を意味し得る。請求項（複数可）で使用するとき、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」という語と併せて使用する場合、「ａ（１つの）」または「ａｎ（１つの）」という語は、１または１より多いことを意味し得る。本明細書では、「ａｎｏｔｈｅｒ（別の）」は、少なくとも２番目またはそれ以上を意味し得る。

「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ／ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」という語および「ｈａｖｉｎｇ（有する）／ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」という語は、本発明に関連して本明細書で使用するとき、言明する特徴、完全体、ステップ、または成分の存在を指定するのに使用するが、他の１または複数の特徴、完全体、ステップ、成分、またはそれらの群の存在または追加を除外しない。

Claims (31)

1. 式５ａによる化合物
   

   

   の調製方法であって、
   （ｉ）１−プロパンホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ）の存在下で９ａと１１を反応させて、化合物１３ａを作製するステップと、
   

   

   （ｉｉ）少なくとも約５０％がＴＨＦであるＴＨＦ：Ｈ_２Ｏ溶液中で、Ｐｄ／Ｃを用いた化合物１３ａの接触水素化を行って、式１４ａの化合物を生成するステップと、
   

   

   （ｉｉｉ）塩基を実質上使用しない反応において、１４ａのＴＨＦ溶液を、式１５による化合物と合わせて、化合物６ａを生成するステップと、
   

   

   （ｉｖ）ＴＨＦ中にてＤＣＣの存在下で式６ａによる化合物を式１９ａによる化合物と反応させて、化合物２０ａを生成するステップと、
   

   

   （ｖ）２０ａを、非プロトン性極性第１５番溶媒に溶解させたε−アミノ含有ペプチド２と合わせて、化合物３ａを生成するステップと、
   

   

   （ｖｉ）化合物３ａをＤＭＳＯに溶解させるステップと、
   （ｖｉｉ）ステップ（ｖｉ）のＤＭＳＯおよび３ａからなる溶液に、約５．５〜約７．５の間のｐＨのヒスチジン緩衝液を加えるステップと、
   （ｖｉｉｉ）ステップ（ｖｉｉ）の溶液に、配列番号５を含む軽鎖可変部と、配列番号６を含む重鎖可変部とを含む抗体を、ペプチド：抗体モル比が約１．８：１〜約３：１の間になるように加えるステップと、
   （ｉｘ）ステップ（ｖｉｉｉ）において形成した混合物を、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ７．５の間および約５℃〜３５℃の間の温度で、反応混合物が泡立つのを回避するように中程度のスピードで少なくとも約１時間撹拌するステップと、
   （ｘ）（ｉｘ）からの溶液を濾過して、得られたペプチド−リンカー抗体コンジュゲート５ａを抽出するステップと
   を含み、
   ｑ＝１、２、３、４または５であり、Ｘ＝ＦまたはＣｌであり、ｍ＝３、４または５である方法。
2. 式３ａによる化合物
   

   

   の調製方法であって、
   （ｉ）１−プロパンホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ）の存在下で９ａと１１を反応させて、化合物１３ａを作製するステップと、
   

   

   （ｉｉ）少なくとも約５０％がＴＨＦであるＴＨＦ：Ｈ_２Ｏ溶液中で、Ｐｄ／Ｃを用いた化合物１３ａの接触水素化を行って、式１４ａの化合物を生成するステップと、
   

   

   （ｉｉｉ）塩基を実質上使用しない反応において、１４ａのＴＨＦ溶液を、式１５による化合物と合わせて、化合物６ａを生成するステップと、
   

   

   （ｉｖ）ＴＨＦ中にてＤＣＣの存在下で式６ａによる化合物を式１９ａによる化合物と反応させて、化合物２０ａを生成するステップと、
   

   

   （ｖ）２０ａを、非プロトン性極性第１５番溶媒に溶解させたε−アミノ含有ペプチド２と合わせて、バイオコンジュゲート３ａを生成するステップと
   

   

   を含み、
   ｑ＝１、２、３、４または５であり、Ｘ＝ＦまたはＣｌであり、ｍ＝３、４または５である方法。
3. 式１３ａの化合物
   

   

   ［式中、ｑは、１、２、３、４または５である］の調製方法であって、
   

   

   を、１−プロパンホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ）の存在下で反応させることを特徴とする方法。
4. テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、２−メチルテトラヒドロフラン、１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、１−メチル−２−ピロリジノン、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）、およびアセトニトリル（ＭｅＣＮ）からなる群から選択される第１番溶媒、好ましくはＭｅＣＮの存在下で９ａと１１の反応を実施する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ＤＩＰＥＡ、ピリジン、ＤＢＵ、ＤＡＢＣＯ、２，３−ルチジン、２，４−ルチジン、２，５−ルチジン、２，６−ルチジン、３，４−ルチジン、３，５−ルチジンからなる群から選択される第１番塩基、好ましくはＤＩＰＥＡの存在下で反応を実施する、請求項４に記載の方法。
6. 式１４ａの化合物
   

   

   ［式中、ｑは、１、２、３、４または５である］の調製方法であって、Ｐｄ／Ｃを用いた化合物１３ａの接触水素化
   

   

   を行うステップを含み、
   ＴＨＦが少なくとも約５０％であるＴＨＦ：Ｈ_２Ｏ溶液中で反応を実施することを特徴とする方法。
7. ＴＨＦ：Ｈ_２Ｏ溶液が、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、および少なくとも約９０％からなる群から選択される量でＴＨＦを含む、請求項１、２または６のいずれか一項に記載の方法。
8. ＴＨＦ／Ｈ_２Ｏ中での水素化より前に、化合物１３ａを活性炭での処理にかける、請求項１、２、６または７のいずれか一項に記載の方法。
9. 活性炭が、ＳＸ−Ｐｌｕｓ、Ｄａｒｃｏ（登録商標）Ｓ−５１ＨＦ、Ｅ Ｓｕｐｒａ ＵＳＰ、ＳＸ−Ｕｌｔｒａ、ＣＡＳＰ、Ｄａｒｃｏ（登録商標）Ｇ−６０、およびＣＧＳＰからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
10. 式６ａの化合物
    

    

    ［式中、ｑ＝１、２、３、４または５である］の調製方法であって、化合物１４ａ
    

    

    を、ＴＨＦを含む第６番溶媒に溶かした溶液を、化合物１５
    

    

    と反応させるステップを含み、
    実質上塩基を使用せずに反応を実施することを特徴とする方法。
11. 化合物１４ａを約１当量〜約１０当量の間の化合物１５と反応させる、請求項１、２または１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 化合物６ａの溶液を真空中で蒸留し、続いて酢酸Ｃ_１〜Ｃ_４アルキルを含む第７番溶媒を加えて、約２５％ＴＨＦ／７５％酢酸Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル〜約１００％酢酸Ｃ_１〜Ｃ_４アルキルの間の溶媒組成を実現する、請求項１、２、１０または１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 第７番溶媒が、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ｉ−プロピル、酢酸ｎ−プロピル、酢酸ｎ−ブチルからなる群から選択され、好ましくは酢酸ｉ−プロピルである、請求項１２に記載の方法。
14. 第６番溶媒と第７番溶媒の比が２５：７５〜０：１００の間である、請求項１２または１３に記載の方法。
15. 式６ａによる化合物の結晶化方法であって、
    （ｉ）酸６ａを、ＴＨＦを含む第８番溶媒に溶解させるステップと、
    （ｉｉ）場合により、活性炭で処理し、次いで前記活性炭を濾別するステップと、
    （ｉｉｉ）ＴＨＦ溶液中の酸６ａを約２体積〜約２０体積の間に濃縮するステップと、
    （ｉｖ）２−プロパノールからなる、約１体積〜約５０体積の間の第９番溶媒を加えるステップと、
    （ｖ）酸６ａをＴＨＦおよび２−プロパノールに溶かした溶液を約２体積〜約５０体積の間に濃縮するステップと、
    （ｖｉ）濃縮した酸６の溶液を約−２５℃〜約１０℃の間に冷却するステップと
    を含む方法。
16. 式２０ｂによる化合物の調製方法であって、第１０番溶媒中にてＤＣＣの存在下で式６ｂによる化合物を式１９ａによる化合物と反応させるステップを含み、
    

    

    ｑ＝１、２、３、４または５であり、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０であり、Ｘ＝ＦまたはＣｌであり、ｍ＝３、４または５である方法。
17. ε−アミノ含有ペプチド２を式６ｂのリンカーとコンジュゲート形成させる方法であって、
    （ｉ）ペプチド２を非プロトン性極性第１５番溶媒に溶解させるステップと、
    （ｉｉ）ＴＨＦ中で６ｂを約１当量〜約１０当量の間の１９ａと反応させて、化合物２０ｂを生成するステップと、
    （ｉｉｉ）２０ｂをペプチド２と合わせて、バイオコンジュゲート３ｂを生成するステップと
    を含み、
    

    

    

    ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０であり、ｑ＝１、２、３、４または５であり、Ｘ＝ＦまたはＣｌであり、ｍ＝３、４または５である方法。
18. 少なくとも約１当量の化合物１９ａを化合物６ａまたは６ｂに加える、請求項１、２、１６または１７のいずれか一項に記載の方法。
19. ＤＣＣを、−１０℃〜＋１０℃の間、好ましくは約＋３℃〜＋５℃の間の温度で反応に加える、請求項１、２、１６、１７または１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 化合物１９ａと６ａまたは６ｂとの反応を、ＴＨＦ、ジクロロメタン、２−メチルテトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、およびＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドからなる群から選択される第１０番溶媒、好ましくはＴＨＦ中で実施する、請求項１、２、１６、１７、１８または１９のいずれか一項に記載の方法。
21. ＸがＦであり、ｍが５である、請求項１、２、および１６から２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 式３ｂのペプチドを抗体とコンジュゲート形成させる方法であって、
    （ｉ）化合物３ｂ
    

    

    をＤＭＳＯに溶解させるステップと、
    （ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＭＳＯおよび３ｂからなる溶液に、約５．５〜約７．５の間のｐＨのヒスチジン緩衝液を加えるステップと、
    （ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の溶液に、配列番号５を含む軽鎖可変部と、配列番号６を含む重鎖可変部とを含み、約２％（ｗ／ｗ）のスクロースを含有する約１０ｍＭのヒスチジンおよび約１０ｍＭのグリシンの緩衝液からなる溶液中にある抗体を、ペプチド：抗体モル比が約１．８：１〜約３：１の間になるように加えるステップと、
    （ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）において形成した混合物を、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ７．５の間および約５℃〜３５℃の間の温度で、反応混合物が泡立つのを回避するように中程度のスピードで少なくとも約１時間撹拌するステップと、
    （ｖ）（ｉｖ）からの溶液を濾過して、得られたペプチド−リンカー抗体コンジュゲート５ｂ
    

    

    を抽出するステップと
    を含み、
    ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０であり、ｑ＝１、２、３、４または５である方法。
23. 化合物３ａまたは化合物３ｂを、約５ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌの間、好ましくは約１０ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌの間でＤＭＳＯに溶解させる、請求項１または２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 化合物３ａまたは３ｂのＤＭＳＯ溶液に、ヒスチジン緩衝液を等体積プラスマイナス１０％で加える、請求項１、２２または２３のいずれか一項に記載の方法。
25. ヒスチジン緩衝液を加えた後の化合物３ａまたは化合物３ｂの濃度が、約２ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの間であり、好ましくは約６ｍｇ／ｍｌである、請求項１、２２から２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 抗体が、配列番号９、１０、１１および１２からなる群から選択される配列、または１個〜５個の間のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を含むこれらの変異体を含む軽鎖定常部と、配列番号１３および１４からなる群から選択される配列、または１個〜５個の間のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を含むこれらの変異体を含む重鎖定常部とを含む、請求項１、または２２から２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 抗体が、配列番号３、または１個〜５個の間のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を含むその変異体を含む軽鎖と、配列番号４、または１個〜５個の間のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を含むその変異体を含む重鎖とを含む、請求項２６に記載の方法。
28. ｑ＝２であり、存在する場合ｎ＝１であり、存在する場合ｍ＝５であり、存在する場合Ｘ＝Ｆである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
29. 請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法に従って生成された化合物。
30. 化合物１３、化合物１３ａ、化合物１４、化合物１４ａ、化合物６、化合物６ａ、化合物６ｂ、化合物２０、化合物２０ａ、化合物２０ｂ、化合物２０ｃ、化合物２０ｄ、化合物２０ｅ、化合物３、化合物３ａ、化合物３ｂ、化合物５、化合物５ａ、および化合物５ｂからなる群から選択される化合物の生成における、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法の使用。
31. 次式
    

    

    ［式中、ｑは、１、２、３、４または５であり、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０であり、Ｘは、任意のハロゲンであり、ｍ＝３、４または５である］からなる群から選択される構造を含む化合物。