WO2012023579A1 - ストレプトアビジンの製造方法 - Google Patents

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WO2012023579A1
WO2012023579A1 PCT/JP2011/068655 JP2011068655W WO2012023579A1 WO 2012023579 A1 WO2012023579 A1 WO 2012023579A1 JP 2011068655 W JP2011068655 W JP 2011068655W WO 2012023579 A1 WO2012023579 A1 WO 2012023579A1
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streptavidin
acid residue
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variant
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龍彦 児玉
暁 杉山
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分子動力学抗体創薬技術研究組合
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    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing streptavidin and a streptavidin variant with reduced immunogenicity.
  • the avidin / streptavidin-biotin interaction is widely applied in the fields of biochemistry, molecular biology, and medicine (Green, (1975), Adv. Protein Chem., 29: 85-133; Green, (1990), Methods Enzymol., 184: 51-67).
  • Avidin is a basic glycoprotein derived from egg white and has an isoelectric point of more than 10.
  • streptavidin is derived from Streptomyces avidinii, has an isoelectric point near neutral and does not contain sugar chains. Both proteins form a tetramer and bind to one molecule of biotin per subunit.
  • the molecular weight is about 60 kDa.
  • the present inventors reduced the immunogenicity (antigenicity) of mammals possessed by streptavidin, a protein derived from Streptomyces avidinii, belonging to microorganisms, suppresses anti-streptavidin antibody production in the animal body, and binds to biotin Streptavidin variants (low immunogenic streptavidin) have been developed (PCT / JP2010 / 001100) that retain the ability to be used for a variety of purposes in medicine and other industries.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing the above-mentioned streptavidin and streptavidin mutant, which can purify streptavidin and a streptavidin mutant with reduced immunogenicity with high purity. .
  • the present inventor has found that streptavidin and streptavidin expressed as recombinant proteins by using affinity chromatography utilizing the binding property between modified subtilisin and subtilisin prodomain The present inventors have found that the mutant can be purified with high purity and have completed the present invention.
  • Recombinant fusion protein of streptavidin or streptavidin mutant and subtilisin prodomain part is expressed, and the recombinant fusion protein is purified by affinity chromatography using a column to which subtilisin or modified subtilisin is immobilized.
  • a method for producing a streptavidin or streptavidin variant further comprising purifying the purified streptavidin or streptavidin variant with a ceramic hydroxyapatite column.
  • the streptavidin variant has the amino acid sequence of core streptavidin represented by SEQ ID NO: 2 in which (a) the arginine at the 72nd amino acid residue is substituted with another amino acid, and (b) the 10th position Any one or more of tyrosine of the amino acid residue, tyrosine of the 71st amino acid residue, glutamic acid of the 89th amino acid residue, arginine of the 91st amino acid residue, and glutamic acid of the 104th amino acid residue Any one of [1] to [4], which is a streptavidin mutant comprising an amino acid sequence substituted with another amino acid and having reduced immunogenicity compared to wild-type streptavidin The method described.
  • streptavidin and a streptavidin mutant expressed as a recombinant protein can be purified with high purity.
  • the streptavidin and mutant streptavidin obtained by the method of the present invention can be used for various purposes in medicine and other industries.
  • FIG. 1 shows a CBB-stained image of crude wild-type streptavidin.
  • FIG. 2 shows a chromatogram of CHT column purification and a CBB stained image.
  • FIG. 3 shows a CBB-stained image of the final purified product.
  • FIG. 4 shows a CBB-stained image of the crudely purified modified streptavidin (mcSA314 and mcSA414).
  • FIG. 5 shows a chromatogram of CHT column purification of modified streptavidin (mcSA314 and mcSA414).
  • FIG. 6 shows a CBB-stained image of the final purified product of modified streptavidin (mcSA314 and mcSA414).
  • the method for producing streptavidin or a streptavidin variant according to the present invention comprises expressing a recombinant fusion protein of streptavidin or a streptavidin variant and a subtilisin prodomain part, and substituting the recombinant fusion protein with subtilisin or modified subtilisin. And purifying the streptavidin or the streptavidin variant purified as described above with a ceramic hydroxyapatite column.
  • the amino acid sequence of the subtilisin prodomain part is known and is as follows. MGGKSNGEKKYIVGFKQGFKSCAKKEDVISEKGGKLQKCFKYVDAASATLNEKAVEELKKDPSVAYVEEDKLFKAL (SEQ ID NO: 14)
  • Streptavidin or streptavidin mutants and subtilidin prodomain portion recombinant fusion proteins can be purified by affinity chromatography using a column to which subtilisin or modified subtilisin is immobilized.
  • Recombinant streptavidin or a streptavidin variant consisting only of the amino acid sequence and not containing any other amino acid can be produced.
  • the elution step in affinity chromatography using a column to which subtilisin or modified subtilisin is immobilized is preferably performed at 5-35 ° C, more preferably 10-25 ° C.
  • Subtilisin is a serine protease.
  • Serine protease is a protease (proteolytic enzyme) with a serine residue that performs nucleophilic attack as a catalytic residue. Trypsins, a representative serine protease, has a high substrate specificity, but it is known that butyridine has a substrate specificity as low as chymotrypsin. Recently, a method has been reported in which the amino acid of butyridine is modified to increase the substrate specificity of butyridine and control the cleavage of the substrate subtilisin prodomain (Ruan et al., (2004), Biochemistry 43, 14539-14546.
  • the modified subtilisin and the modified subtilisin prodomain have the following five properties.
  • Modified subtilisin has its own stability while having high specificity by modification.
  • Modified subtilisin enhances the sequence selectivity of the binding pocket by introducing a mutation into the substrate binding pocket.
  • the subtilisin prodomain is modified so that any protein that is fused is directly cleaved at the junction.
  • the active center of subtilisin has been modified to separate the binding and cleavage reactions in a kinetic model.
  • the direct cleaving action between the prodomain and the fusion protein has been found to work with a special anion, and fluoride ions are particularly suitable for use and can be cleaved efficiently. Recently, it has been reported that cleaving is also performed using sodium azide (NaNH 3 ). (Gallagher et al., (2009), Biochemistry 48, 10389-10394)
  • the type of streptavidin mutant used in the present invention is not particularly limited, but is preferably a streptavidin mutant with reduced immunogenicity.
  • the amino acid sequence of core streptavidin described in SEQ ID NO: 2 having a predetermined amino acid mutation and having reduced immunogenicity compared to wild-type streptavidin can be used. .
  • amino acid sequence of wild-type (natural) core streptavidin is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and the base sequence encoding this is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the streptavidin variant used in the present invention is obtained by replacing (a) the arginine at the 72nd amino acid residue with another amino acid in the amino acid sequence of core streptavidin represented by SEQ ID NO: 2. And (b) tyrosine at the 10th amino acid residue, tyrosine at the 71st amino acid residue, glutamic acid at the 89th amino acid residue, arginine at the 91st amino acid residue, and 104th amino acid residue.
  • SEQ ID NO: 2 tyrosine at the 10th amino acid residue, tyrosine at the 71st amino acid residue, glutamic acid at the 89th amino acid residue, arginine at the 91st amino acid residue, and 104th amino acid residue
  • the streptavidin mutant used in the present invention comprises an amino acid sequence having any one or more of the following mutations in the amino acid sequence of core streptavidin described in SEQ ID NO: 2.
  • tyrosine of the 10th amino acid residue is substituted with another amino acid
  • specific examples of the other amino acid include glycine, serine, and threonine, and particularly preferably serine or threonine.
  • the 71st amino acid residue tyrosine is substituted with another amino acid
  • specific examples of the other amino acid include glycine, alanine, and serine, and particularly preferably alanine or serine.
  • arginine at the 72nd amino acid residue is substituted with another amino acid
  • specific examples of the other amino acid include glycine and lysine, and particularly preferably lysine.
  • glutamic acid at the 89th amino acid residue is substituted with another amino acid
  • specific examples of the other amino acid include glycine, alanine, and aspartic acid, and particularly preferably aspartic acid.
  • arginine at the 91st amino acid residue is substituted with another amino acid
  • specific examples of the other amino acid include glycine or lysine, and particularly preferably lysine.
  • glutamic acid at the 104th amino acid residue is substituted with another amino acid
  • specific examples of the other amino acid include serine, glutamine, and asparagine, and particularly preferably glutamine or asparagine.
  • the immunogenicity is reduced compared to wild-type streptavidin means that the immunogenicity is reduced when a streptavidin variant is administered to a mammal such as a human. .
  • the reduction in immunogenicity can be confirmed, for example, by the following method. That is, with respect to the mutant streptavidin of the present invention, the reactivity to the anti-streptavidin antiserum obtained by immunizing wild type streptavidin to cynomolgus monkeys was analyzed, and the reactivity to the above anti-streptavidin antiserum was If it is lower than that of the wild type streptavidin, it can be determined that the immunogenicity is lower than that of wild type streptavidin.
  • the streptavidin variant of the present invention preferably has an immunogenicity of 80% or less, more preferably 60% or less, compared to wild-type streptavidin. It is preferably 20% or less, more preferably 15% or less, further preferably 10% or less, and particularly preferably 5% or less.
  • streptavidin mutants include the following.
  • a streptavidin mutant comprising an amino acid sequence having any one or more of the following mutations in the amino acid sequence of core streptavidin described in SEQ ID NO: 2 and having reduced immunogenicity compared to wild-type streptavidin.
  • a streptavidin variant comprising an amino acid sequence having the following mutation in the amino acid sequence of core streptavidin described in SEQ ID NO: 2 and having reduced immunogenicity compared to wild-type streptavidin.
  • streptavidin variant which has the following mutations.
  • Streptavidin variant having all of the following mutations in the amino acid sequence of core streptavidin described in SEQ ID NO: 2 (1) Mutation in which tyrosine at the 10th amino acid residue is substituted with serine: (2) Mutation in which tyrosine at the 71st amino acid residue is substituted with serine: (3) Mutation in which arginine at the 72nd amino acid residue is substituted with lysine: (4) Mutation in which glutamic acid at the 89th amino acid residue is substituted with aspartic acid: (5) Mutation in which arginine at the 91st amino acid residue is substituted with lysine: (6) Mutation in which glutamic acid at the 104th amino acid residue is substituted with glutamine or asparagine:
  • the streptavidin mutant of the present invention can be produced using the DNA encoding the above-described streptavidin mutant of the present invention.
  • the above DNA can be prepared by site-directed mutagenesis on DNA encoding wild type (natural) streptavidin.
  • the above-described DNA encoding the streptavidin variant of the present invention can be used by being incorporated into a vector.
  • the DNA encoding the streptavidin mutant of the present invention is incorporated into an expression vector, and the expression vector is transformed into a host to thereby produce the streptavidin mutant of the present invention. Mutants can be expressed.
  • a vector used in the present invention has an origin of replication (ori) and a gene for selecting a transformed host (for example, ampicillin, tetracycline, kanamycin, or chlorampheny). It is preferable to have a drug resistance gene for a drug such as cole).
  • a promoter capable of efficiently expressing the streptavidin variant of the present invention in the host for example, a lacZ promoter or a T7 promoter.
  • vectors examples include M13 vectors, pUC vectors, pBR322, pBluescript, pCR-Script, pGEX-5X-1 (Pharmacia), “QIAexpress system” (Qiagen), pEGFP, or pET.
  • the host preferably uses BL21 expressing T7 RNA polymerase.
  • a signal sequence for increasing the yield of the streptavidin variant of the present invention can be added to the vector.
  • the introduction of the vector into the host cell can be performed using, for example, the calcium chloride method or the electroporation method.
  • a tag for improving solubility for example, a sequence encoding glutathione-S-transferase, thioredoxin, or maltose-binding protein may be added. It also encodes tags designed to facilitate purification, such as polyhistidine tags, Myc epitopes, hemagglutinin (HA) epitopes, T7 epitopes, Xpress tags and FLAG peptide tags, and other known tag sequences A sequence may be added.
  • expression vectors derived from mammals for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen), pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18 (17), p5322), pEF, pCDM8), derived from insect cells
  • Expression vectors eg, “Bac-to-BAC baculovairus expression system” (manufactured by Gibco BRL), pBacPAK8), plant-derived expression vectors (eg, pMH1, pMH2), animal virus-derived expression vectors (eg, pHSV, pMV, pAdexLcw), an expression vector derived from a retrovirus (for example, pZIPneo), an expression vector derived from yeast (for example, “Pichia® Expression® Kit” (manufactured by Invitrogen), pNV11®, SP-Q01), an expression vector derived from Bacillus subtilis (for example, PPL608, p
  • promoters necessary for expression in cells such as the SV40 promoter (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), It is essential to have the MMLV-LTR promoter, EF1 ⁇ promoter (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CMV promoter, etc., and genes for selecting transformation into cells (for example, More preferably, it has a drug resistance gene that can be discriminated by a drug (neomycin, G418, etc.). Examples of such a vector include pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, and pOP13.
  • the host cell into which the vector is introduced is not particularly limited and may be either prokaryotic or eukaryotic.
  • E. coli and various animal cells can be used.
  • animal cells for example, animal cells, plant cells, and fungal cells can be used as the host.
  • animal cells mammalian cells such as CHO cells, COS cells, 3T3 cells, HeLa cells, Vero cells, or insect cells such as Sf9, Sf21, and Tn5 can be used.
  • CHO cells are particularly preferred for mass expression purposes.
  • Introduction of a vector into a host cell can be performed by, for example, a calcium phosphate method, a DEAE dextran method, a method using a cationic ribosome DOTAP (Boehringer Mannheim), an electroporation method, a lipofection method, or the like.
  • yeasts such as the genus Saccharomyces, such as Saccharomyces cerevisiae, filamentous fungi such as the genus Aspergillus, such as Aspergillus niger, are known. .
  • E. coli for example, JM109, DH5 ⁇ , HB101, etc.
  • Bacillus subtilis is also known.
  • the culture can be performed according to a known method.
  • DMEM, MEM, RPMI1640, and IMDM can be used as the culture medium for animal cells.
  • a serum supplement such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination, or serum-free culture may be performed.
  • FCS fetal calf serum
  • the pH during culture is preferably about 6-8.
  • the culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 200 hours, and medium exchange, aeration, and agitation are added as necessary.
  • a growth factor for promoting cell proliferation may be added.
  • Treatment comprising streptavidin or streptavidin variant-antibody conjugate, and streptavidin or streptavidin variant-antibody conjugate by binding antibody to streptavidin or streptavidin variant produced by the method of the present invention
  • Agents or diagnostic agents can be provided.
  • the above-mentioned streptavidin or streptavidin variant-antibody conjugate can be provided as a treatment or diagnostic kit in combination with a diagnostic or therapeutic substance labeled with biotin or a derivative thereof having affinity for streptavidin. it can.
  • the streptavidin of the present invention or Streptavidin variants can be accumulated.
  • a diagnostic or therapeutic substance radioisotope, low molecular weight compound, protein, etc. conjugated to biotin having affinity for streptavidin or a derivative thereof, the substance can be accurately applied to cancer cells.
  • the substance can be accurately applied to cancer cells.
  • a diagnostic or therapeutic substance radioisotope, low molecular weight compound, protein, etc. conjugated to biotin having affinity for streptavidin or a derivative thereof.
  • the substance can be accurately applied to cancer cells.
  • antibody production is suppressed due to low immunogenicity, and early clearance from the body and shock such as anaphylaxis due to antibodies can be prevented.
  • Antibody includes all modified antibodies and antibody fragments. Humanized antibodies, humanized antibodies, human antibodies, antibodies derived from various animals such as mice, rabbits, rats, guinea pigs, monkeys, chimeric antibodies of human antibodies and antibodies derived from various animals, diabody, scFv, Fd, Fab, Fab ′, F (ab) ′ 2 may be mentioned, but is not limited thereto.
  • the conjugate of streptavidin or a streptavidin variant and an antibody can be obtained using methods known to those skilled in the art. For example, it can be obtained by a chemical binding method (US5, 608, 060), or a DNA encoding streptavidin or a streptavidin variant and a DNA encoding an antibody are linked and expressed in a host cell using an expression vector or the like. Thus, it can also be obtained as a fusion protein.
  • the DNA encoding the streptavidin or streptavidin variant and the DNA encoding the antibody may be linked via DNA encoding an appropriate peptide called a linker. It is desirable that the streptavidin or streptavidin variant-antibody conjugate is produced leaving the specific binding force between the antibody and the target molecule.
  • Example 1 Design of low immunogenic streptavidin Based on the gene sequence and amino acid sequence of core streptavidin described in SEQ ID NOs: 1 and 2, the sequence of mutant streptavidin having a mutation that satisfies the following conditions: The mutant streptavidin having the mutations listed in Table 1 was designed. (1) The fusion protein with the antibody is a sequence that is predicted to minimize the immunogenicity in the human body as much as possible. (2) A sequence that maintains as much affinity as possible for biotin molecules.
  • Y22 in Table 1 corresponds to the tyrosine of the 10th amino acid residue in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing.
  • Y22S in Table 1 represents the substitution from the above tyrosine to serine
  • Y22T in Table 1 represents the substitution from the above tyrosine to threonine.
  • Y83 in Table 1 corresponds to tyrosine at the 71st amino acid residue in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing.
  • Y83A in Table 1 represents the substitution from tyrosine to alanine
  • Y83S in Table 1 represents the substitution from tyrosine to serine.
  • R84 in Table 1 corresponds to arginine at the 72nd amino acid residue in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing.
  • R84K in Table 1 represents the above-mentioned substitution from arginine to lysine.
  • E101 in Table 1 corresponds to glutamic acid at the 89th amino acid residue in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing.
  • E101D in Table 1 represents the substitution of glutamic acid to aspartic acid.
  • R103 in Table 1 corresponds to arginine at the 91st amino acid residue in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing.
  • R103K in Table 1 represents the above-mentioned substitution from arginine to lysine.
  • E116 in Table 1 corresponds to glutamic acid at the 104th amino acid residue in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing.
  • E116N in Table 1 shows the substitution from glutamic acid to asparagine
  • E116Q in Table 1 shows the substitution from glutamic acid to glutamine.
  • Example 2 Production of mutant streptavidin (1) Synthesis of base sequence of wild-type core streptavidin For the base sequence of the gene encoding core streptavidin shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, a service of artificial gene synthesis (Integrated DNA Technologies) was used.
  • the expression vector was designed so that the fusion protein of the wild-type streptavidin and the modified streptavidin and the subtilisin prodomain part which is a purification tag was expressed. Protein in which wild-type streptavidin or modified streptavidin is fused to the C-terminal side using a pPAL7 vector (manufactured by BIO-RAD), a vector in which the subtilisin prodomain gene sequence is incorporated on the N'-terminal side A vector that expresses was prepared.
  • pPAL7 vector manufactured by BIO-RAD
  • the following primers 1 and 2 that add a HindIII site on the 5 ′ end side and an EcoRI site on the 3 ′ end side by PCR are used. After PCR, the restriction enzymes HindIII and EcoRI was processed.
  • Primer 1 GCTCTTCAAAGCTTTGGCCGAAGCTGGTATCACTG (SEQ ID NO: 3)
  • Primer 2 CTCGAGGAATTCTTAGCTAGCAGCAGAAGGCTTAAC (SEQ ID NO: 4)
  • the sample treated with the restriction enzyme was subjected to gel purification after electrophoresis.
  • the pPAL7 vector (manufactured by BIO-RAD) was subjected to enzyme treatment and gel purification.
  • the purified vector and PCR product were ligated by the designated method using 2 ⁇ Rapid Ligation Buffer and T4DNA Polymerase (Promega).
  • the transformation of E. coli was performed by adding 2 microliters of ligation product to 50 microliters of DH5 ⁇ competent cell (manufactured by TOYOBO). Plasmid extraction was performed using Miniprep Kit (manufactured by QIAGEN), and the sequence of the obtained plasmid was confirmed by sequence analysis.
  • a pPAL7 expression vector incorporating the wild-type streptavidin and mutant streptavidin gene sequences was transfected into Escherichia coli BL21 (BIO-RAD) according to a conventional method.
  • Each protein was expressed as follows. That is, the cells were cultured at 37 degrees until the cell density of the E. coli culture solution reached OD (600 nm) 0.5-0.7, and IPTG (isopropyl- ⁇ -D-thiogalactocyanide) was added to a final concentration of 1 mM. Then, protein expression was induced, and culturing was performed at 10 to 30 ° C., preferably 16 ° C. for 24 hours or more. After culturing, the cells were collected by centrifugation and stored at minus 20 degrees until protein purification.
  • E. coli Preparation of E. coli was carried out by adding 10 mM sodium phosphate, pH 7.2--5.6, 10x BugBuser reagent (Novagen), and nucleolytic enzyme (Benzonase) as a cell lysate. Dissolution was performed at room temperature, and the dissolved solution was centrifuged at 35,000 ⁇ g for 30 minutes. The supernatant after centrifugation was defined as total soluble protein.
  • Binding buffer / wash buffer 1 5 mM sodium phosphate pH 6.8, wash buffer 2: 10 mM sodium phosphate, 300 mM, elution buffer: 10 mM sodium phosphate, 100 mM sodium fluoride, column regeneration buffer: 100 mM Phosphoric acid, column storage buffer: 5 mM mM sodium phosphate (pH 6.8) was used for purification.
  • the pH of the washing buffer 2 and elution buffer was adjusted to pH 6.1 for purification of natural streptavidin, and to pH 7.0 for purification of modified streptavidin.
  • the buffer pH is set to pH 6.1 for wild-type streptavidin and pH 7.0 for modified streptavidin (mcSA314, 414).
  • the roughly purified recombinant protein was concentrated by centrifugal filtration using a 10,000 MWCO ultrafiltration membrane in preparation for purification using a ceramic hydroxyapatite column.
  • the buffer was replaced with 5 mM sodium phosphate solution using a desalting column.
  • the ceramic hydroxyapatite column used was CHT2-1 or CHT5-1 (BIO-RAD), and the flow rate of all operations was 2 ml / min. Initially, the column was equilibrated with 10 column volumes of 5 mM sodium phosphate.
  • Endotoxin test For the final purified product, the concentration of endotoxin was determined using a measurement kit based on the LAL method. Specifically, Table 2 shows the results of measurement using EndoSafePTS kit (Charles River). Table 2 shows the purity and endotoxin level of the final purified product.

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Abstract

　本発明の課題は、ストレプトアビジン並びに免疫原性を低下させたストレプトアビジン変異体を高純度に精製することができる、上記ストレプトアビジン並びにストレプトアビジン変異体の製造方法を提供することである。本発明によれば、ストレプトアビジン又はストレプトアビジン変異体とズブチリジンプロドメイン部分との組み換え融合体タンパク質を発現させ、上記組み換え融合体タンパク質を、ズブチリジン又は改変ズブチリジンを固定したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、上記で精製されたストレプトアビジン又はストレプトアビジン変異体をさらにセラミックハイドロキシアパタイトカラムで精製することを含む、ストレプトアビジン又はストレプトアビジン変異体の製造方法が提供される。

Description

ストレプトアビジンの製造方法
　本発明は、ストレプトアビジン並びに免疫原性を低下させたストレプトアビジン変異体の製造方法に関する。
　アビジンとビオチン、あるいはストレプトアビジンとビオチンの間の親和性は非常に高く（Kd=10-15 から10-14M）、生体二分子間の相互作用としては、最も強い相互作用の一つである。現在、アビジン／ストレプトアビジン - ビオチン相互作用は、生化学、分子生物学、あるいは医学の分野で広く応用されている（Green, (1975), Adv. Protein Chem., 29: 85-133; Green, (1990), Methods Enzymol., 184: 51-67）。アビジンは卵白由来の塩基性糖タンパクで、等電点は１０を超える。一方、ストレプトアビジンは放線菌（Streptomyces avidinii）由来で、等電点は中性付近で糖鎖は含まない。両タンパク質とも、４量体を形成し、１つのサブユニット当たり1分子のビオチンと結合する。分子量は60kDa程度である。
　近年このアビジン／ストレプトアビジンとビオチンの高い結合能と抗体分子とを組合わせたドラッグデリバリーの方法、プレターゲティング法が考案されている（Hnatowich, (1987), J. Nucl. Med., 28, 1294-1302）。
Green, (1975), Adv. Protein Chem., 29: 85-133; Green, (1990), Methods Enzymol., 184: 51-67 Hnatowich, (1987), J. Nucl. Med., 28, 1294-1302
　本発明者らは、微生物に属する Streptomyces avidinii 由来蛋白質であるストレプアビジンがもつ哺乳動物に対する免疫原性（抗原性）を低減させ、動物体内での抗ストレプトアビジン抗体産生を抑制し、かつビオチンに対する結合能は維持した、医薬およびその他の工業での種々の目的に使用することを可能にするストレプトアビジン変異体（低免疫原性ストレプトアビジン）を開発している（ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／００１１００）。本発明は、ストレプトアビジン並びに免疫原性を低下させたストレプトアビジン変異体を高純度に精製することができる、上記ストレプトアビジン並びにストレプトアビジン変異体の製造方法を提供することを解決すべき課題とした。
　本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、改変ズブチリジンとズブチリジンプロドメインとの結合性を利用したアフィニティークロマトグラフィーを用いることによって、組み換え蛋白質として発現させたストレプトアビジン並びにストレプトアビジン変異体を高純度に精製できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］　ストレプトアビジン又はストレプトアビジン変異体とズブチリジンプロドメイン部分との組み換え融合体タンパク質を発現させ、上記組み換え融合体タンパク質を、ズブチリジン又は改変ズブチリジンを固定したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、上記で精製されたストレプトアビジン又はストレプトアビジン変異体をさらにセラミックハイドロキシアパタイトカラムで精製することを含む、ストレプトアビジン又はストレプトアビジン変異体の製造方法。
［２］　ズブチリジン又は改変ズブチリジンを固定したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにおける溶出工程を、５～３５℃で行う、［１］に記載の方法。
［３］　ズブチリジン又は改変ズブチリジンを固定したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにおける溶出工程を、１０～２５℃で行う、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］　ストレプトアビジン変異体が、免疫原性を低下させたストレプトアビジン変異体である、［１］から［３］の何れか１項に記載の方法。
［５］　ストレプトアビジン変異体が、配列番号２に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において、（ａ）７２番目のアミノ酸残基のアルギニンが他のアミノ酸に置換しており、かつ（ｂ）１０番目のアミノ酸残基のチロシン、７１番目のアミノ酸残基のチロシン、８９番目のアミノ酸残基のグルタミン酸、９１番目のアミノ酸残基のアルギニン、及び１０４番目のアミノ酸残基のグルタミン酸の何れか一つ以上が他のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列を含み、野生型ストレプトアビジンと比較して免疫原性が低下している、ストレプトアビジン変異体である、［１］から［４］の何れか１項に記載の方法。
［６］　配列番号２に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において、（ａ）７１番目のアミノ酸残基のチロシン及び７２番目のアミノ酸残基のアルギニンが他のアミノ酸に置換しており、かつ（ｂ）１０番目のアミノ酸残基のチロシン、８９番目のアミノ酸残基のグルタミン酸、９１番目のアミノ酸残基のアルギニン、１０４番目のアミノ酸残基のグルタミン酸の何れか一つ以上が他のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列を含む、［５］に記載のストレプトアビジン変異体。
［７］　配列番号２に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において以下の何れか１以上の変異を有する、［５］又は［６］に記載のストレプトアビジン変異体
（１）１０番目のアミノ酸残基のチロシンがセリン又はトレオニンに置換している変異：
（２）７１番目のアミノ酸残基のチロシンがアラニン又はセリンに置換している変異：
（３）７２番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異：
（４）８９番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換している変異：
（５）９１番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異：
（６）１０４番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がグルタミン又はアスパラギンに置換している変異：
　本発明によれば、組み換え蛋白質として発現させたストレプトアビジン並びにストレプトアビジン変異体を高純度に精製できる。本発明の方法で得られるストレプトアビジン及び変異体ストレプトアビジンは、医薬およびその他の工業での種々の目的に使用することが可能である。
図１は、粗精製された野生型ストレプトアビジンのCBB染色像を示す。 図２は、CHTカラム精製のクロマトグラムとCBB染色像を示す。 図３は、最終精製産物のCBB染色像を示す。 図４は、粗精製された改変体ストレプトアビジン（mcSA314とmcSA414）のCBB染色像を示す。 図５は、改変体ストレプトアビジン（mcSA314とmcSA414）のCHTカラム精製のクロマトグラムを示す。 図６は、改変体ストレプトアビジン（mcSA314とmcSA414）の最終精製産物のCBB染色像を示す。
　以下、本発明について更に詳細に説明する。
　本発明によるストレプトアビジン又はストレプトアビジン変異体の製造方法は、ストレプトアビジン又はストレプトアビジン変異体とズブチリジンプロドメイン部分との組み換え融合体タンパク質を発現させ、上記組み換え融合体タンパク質を、ズブチリジン又は改変ズブチリジンを固定したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、上記で精製されたストレプトアビジン又はストレプトアビジン変異体をさらにセラミックハイドロキシアパタイトカラムで精製することを含む。
　ズブチリジンプロドメイン部分のアミノ酸配列は、公知であり、以下の通りである。
MGGKSNGEKKYIVGFKQGFKSCAKKEDVISEKGGKLQKCFKYVDAASATLNEKAVEELKKDPSVAYVEEDKLFKAL
（配列番号１４）
　ストレプトアビジン又はストレプトアビジン変異体とズブチリジンプロドメイン部分との組み換え融合体タンパク質を、ズブチリジン又は改変ズブチリジンを固定したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製することにより、ストレプトアビジン又はストレプトアビジン変異体のアミノ酸配列のみから構成され、それ以外のアミノ酸を含まない、組み換え体のストレプトアビジン又はストレプトアビジン変異体を製造することができる。
　ズブチリジン又は改変ズブチリジンを固定したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにおける溶出工程は、５～３５℃で行うことが好ましく、１０～２５℃で行うことがさらに好ましい。
ズブチリジン（subtilisin）はセリンプロテアーゼである。セリンプロテアーゼ (Serine Protease) とは触媒残基として求核攻撃を行うセリン残基をもつプロテアーゼ（タンパク質分解酵素）のことである。セリンプロテアーゼの代表格であるトリプシンズは高い基質特異性をもつが、それに比してブチリジンの基質特異性はキモトリプシンと同様に低いことが知られている。
近年、ブチリジンのアミノ酸を改変することにより、ブチリジンの基質特異性を高め、基質であるズブチリジンプロドメイン切断を制御する方法が報告された(Ruanら, (2004), Biochemistry 43, 14539-14546) 。具体的に、改変ズブチリジンと改変ズブチリジンプロドメインは、次の５つの性質を持っている。（１）改変ズブチリジンは改変により高い特異性を持ちながらそれ自身の安定性を有している。（２）改変ズブチリジンは基質結合ポケットに変異を入れることにより結合ポケットの配列選択性が増強している。（３）ズブチリジンプロドメインは融合されているどんなタンパク質に対してもジャンクション部分でダイレクトに切断されるように改変ものである。（４）ズブチリジンの活性中心は動力学モデル的に結合と切断の反応を分離するように改変されたものである。（５）プロドメインと融合タンパク質とのダイレクトな切断作用は、特別な陰イオンで切断プロセスが働くことが分かっており、特にフッ化イオンが使用に適しており切断が効率よく行える。 また、最近ではアジ化ナトリウム（NaNH3）を用いても切断されることが報告されている。 (Gallagherら, (2009), Biochemistry 48, 10389-10394)
　本発明で用いるストレプトアビジン変異体の種類は特に限定されないが、好ましくは、免疫原性を低下させたストレプトアビジン変異体である。具体的には、配列番号２に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において、所定のアミノ酸の変異を有し、野生型ストレプトアビジンと比較して免疫原性が低下しているものを用いることができる。
　野生型（天然）のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示し、これをコードする塩基配列を配列表の配列番号１に示す。
　第一の態様によれば、本発明で用いるストレプトアビジン変異体は、配列番号２に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において、（ａ）７２番目のアミノ酸残基のアルギニンが他のアミノ酸に置換しており、かつ（ｂ）１０番目のアミノ酸残基のチロシン、７１番目のアミノ酸残基のチロシン、８９番目のアミノ酸残基のグルタミン酸、９１番目のアミノ酸残基のアルギニン、及び１０４番目のアミノ酸残基のグルタミン酸の何れか一つ以上が他のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列を含む。
　第二の態様によれば、本発明で用いるストレプトアビジン変異体は、配列番号２に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において以下の何れか１以上の変異を有するアミノ酸配列を含む。
（１）１０番目のアミノ酸残基のチロシンがセリン又はトレオニンに置換している変異：
（２）７１番目のアミノ酸残基のチロシンがアラニン又はセリンに置換している変異：
（３）７２番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異：
（４）８９番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換している変異：
（５）９１番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異：
（６）１０４番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がグルタミン又はアスパラギンに置換している変異：
　１０番目のアミノ酸残基のチロシンが他のアミノ酸に置換している場合、他のアミノ酸の具体例としては、グリシン、セリン又はトレオニンが挙げられ、特に好ましくはセリン又はトレオニンが挙げられる。
　７１番目のアミノ酸残基のチロシンが他のアミノ酸に置換している場合、他のアミノ酸の具体例としては、グリシン、アラニン又はセリンが挙げられ、特に好ましくはアラニン又はセリンが挙げられる。
　７２番目のアミノ酸残基のアルギニンが他のアミノ酸に置換している場合、他のアミノ酸の具体例としては、グリシン、又はリジンが挙げられ、特に好ましくはリジンが挙げられる。
　８９番目のアミノ酸残基のグルタミン酸が他のアミノ酸に置換している場合、他のアミノ酸の具体例としては、グリシン、アラニン、又はアスパラギン酸が挙げられ、特に好ましくはアスパラギン酸が挙げられる。
　９１番目のアミノ酸残基のアルギニンが他のアミノ酸に置換している場合、他のアミノ酸の具体例としては、グリシン、又はリジンが挙げられ、特に好ましくはリジンが挙げられる。
　１０４番目のアミノ酸残基のグルタミン酸が他のアミノ酸に置換している場合、他のアミノ酸の具体例としては、セリン、グルタミン又はアスパラギンが挙げられ、特に好ましくはグルタミン又はアスパラギンが挙げられる。
　本発明で言う、野生型ストレプトアビジンと比較して免疫原性が低下しているとは、ストレプトアビジン変異体をヒトなどの哺乳動物に投与した場合における免疫原性が低下していることを言う。免疫原性が低下していることは、例えば、以下の方法で確認することができる。即ち、本発明の変異体ストレプトアビジンについて、野生型ストレプトアビジンをカニクイサルに免疫して取得した抗ストレプトアビジン抗血清に対する反応性を解析し、上記の抗ストレプトアビジン抗血清に対する反応性が野生型ストレプトアビジンに比べて低下していれば、野生型ストレプトアビジンと比較して免疫原性が低下していると判断することができる。上記した方法で免疫原性の低下を判断した場合、本発明のストレプトアビジン変異体は、野生型ストレプトアビジンと比較して、免疫原性が好ましくは８０％以下、さらに好ましくは６０％以下、さらに好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１５％以下、さらに好ましくは１０％以下、特に好ましくは５％以下に低下している。
　ストレプトアビジン変異体としては、以下のものがあげられる。
　配列番号２に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において以下の何れか１以上の変異を有するアミノ酸配列を含み、野生型ストレプトアビジンと比較して免疫原性が低下している、ストレプトアビジン変異体。
（１）１０番目のアミノ酸残基のチロシンがセリン又はトレオニンに置換している変異：
（２）７１番目のアミノ酸残基のチロシンがアラニン又はセリンに置換している変異：
（３）７２番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異：
（４）８９番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換している変異：
（５）９１番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異：
（６）１０４番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がグルタミン又はアスパラギンに置換している変異：
　配列番号２に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において以下の変異を有するアミノ酸配列を含み、野生型ストレプトアビジンと比較して免疫原性が低下している、ストレプトアビジン変異体。
（２）７１番目のアミノ酸残基のチロシンがアラニン又はセリンに置換している変異：
（３）７２番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異：
（４）８９番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換している変異：
（６）１０４番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がグルタミン又はアスパラギンに置換している変異：
　さらに以下の変異を有する、上記のストレプトアビジン変異体。
（１）１０番目のアミノ酸残基のチロシンがセリン又はトレオニンに置換している変異：
（５）９１番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異：
　配列番号２に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において以下の変異の全てを有する、ストレプトアビジン変異体
（１）１０番目のアミノ酸残基のチロシンがセリンに置換している変異：
（２）７１番目のアミノ酸残基のチロシンがセリンに置換している変異：
（３）７２番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異：
（４）８９番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換している変異：
（５）９１番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異：及び
（６）１０４番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がグルタミン又はアスパラギンに置換している変異：
　本発明のストレプトアビジン変異体は、上記した本発明のストレプトアビジン変異体をコードするＤＮＡを用いて製造することができる。上記のＤＮＡは、野生型（天然）のストレプトアビジンをコードするＤＮＡに対して部位特異的変異誘発により作製することができる。
　上記した本発明のストレプトアビジン変異体をコードするＤＮＡは、ベクターに組み込んで使用することができる。特に、本発明のストレプトアビジン変異体を製造するためには、本発明のストレプトアビジン変異体をコードするＤＮＡを発現ベクターに組み込み、この発現ベクターを宿主に形質転換することによって、本発明のストレプトアビジン変異体を発現させることができる。
　大腸菌を宿主とする場合には、本発明で用いるベクターとしては、複製起点（ori）を有し、さらに形質転換された宿主を選択するための遺伝子（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン又はクロラムフェニコールなどの薬剤に対する薬剤耐性遺伝子など）を有していることが好ましい。また、発現ベクターの場合には、宿主において本発明のストレプトアビジン変異体を効率よく発現させることができるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーターまたはT7プロモーターなどを持っていることが好ましい。このようなベクターとしては、ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Script、pGEX-5X-1（ファルマシア）、「QIAexpress system」（キアゲン）、pEGFP、またはpET(この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21を使用することが好ましい)などが挙げられる。また、ベクターには、本発明のストレプトアビジン変異体の収量をあげるためのシグナル配列などを付加することもできる。
　宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。また、可溶性を向上させるためのタグ、例えばグルタチオンーS－トランスフェラーゼやチオレドキシン、マルトース結合蛋白質をコードする配列が付加されていてもよい。また、精製を容易にすることを目的にした設計されたタグ、例えばポリヒスチジンタグ、Ｍｙｃエピトープ、ヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープ、Ｔ７エピトープ、ＸｐｒｅｓｓタグやＦＬＡＧペプチドタグ、その他の既知のタグ配列をコードする配列が付加されていてもよい。
　大腸菌以外にも、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3(インビトロゲン社製）や、pEGF-BOS(Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」（ギブコBRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（インビトロゲン社製）、pNV11 、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）が挙げられる。
　CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。
　ベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、原核生物および真核生物のいずれでもよい。例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。
　真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、CHO細胞、COS細胞、3T3細胞、HeLa細胞、Vero細胞、あるいは昆虫細胞、例えば、Sf9、Sf21、Tn5などを用いることができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にCHO細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリボソームDOTAP（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
　植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）由来の細胞が蛋白質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）が知られている。
　原核細胞を使用する場合は、大腸菌（E. coli）、例えば、JM109、DH5α、HB101等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
　これらの細胞を、本発明のＤＮＡにより形質転換し、形質転換された細胞をin vitroで培養することによりストレプトアビジン又はストレプトアビジン変異体が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができる。その際、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のpHは、約6～8であるのが好ましい。培養は、通常、約30～40℃で約15～200時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。また、細胞の増殖を促進するための成長因子の添加を行ってもよい。
　本発明の方法で製造されるストレプトアビジン又はストレプトアビジン変異体に抗体を結合させることにより、ストレプトアビジン又はストレプトアビジン変異体―抗体結合物、並びにストレプトアビジン又はストレプトアビジン変異体―抗体結合物を含む治療剤又は診断剤を提供することができる。さらに、上記したストレプトアビジン又はストレプトアビジン変異体―抗体結合物は、ストレプトアビジンに親和性を有するビオチン又はその誘導体で標識した診断用又は治療用物質と組み合わせて、治療又は診断キットとして提供することができる。
　即ち、癌抗原特異的抗体分子と、本発明で製造されるストレプトアビジン又はストレプトアビジン変異体との融合体を調製し、患者に投与することで、癌細胞に特異的に本発明のストレプトアビジン又はストレプトアビジン変異体を集積できることができる。次に、ストレプトアビジンに親和性を有するビオチン又はその誘導体に結合させた診断用もしくは治療用物質（放射性同位元素、低分子化合物、タンパク質など）を患者に投与することによって、癌細胞へ的確に物質を集積させることが可能になる。本発明においては、低免疫原性化により抗体産生が抑制され、抗体による早期の体内からのクリアランス、アナフィラキシーなどのショックを防ぐことができる。
　ストレプトアビジン又はストレプトアビジン変異体に結合させる抗体は種々の分子を用いることができる。ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体はどちらも使用することができる。抗体のサブクラスは特に問わないが、好ましくはＩｇＧ、特にＩｇＧ1が好適に用いられる。また、「抗体」は改変抗体および抗体断片の全てを含む。ヒト化抗体、ヒト型抗体、ヒト抗体、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、サル等の各種動物由来抗体、ヒト抗体と各種動物由来抗体とのキメラ抗体、ｄｉａｂｏｄｙ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ‘、Ｆ（ａｂ）’2が挙げられるが、これらに限らない。
　ストレプトアビジン又はストレプトアビジン変異体と抗体の結合物は、当業者に公知の方法を用いて得ることができる。例えば、化学的結合方法（US5,608,060）によって得ることもできるし、ストレプトアビジン又はストレプトアビジン変異体をコードするＤＮＡと抗体をコードするＤＮＡを連結し、発現ベクター等を用いて宿主細胞に発現させることにより、融合タンパクとして得ることもできる。ストレプトアビジン又はストレプトアビジン変異体をコードするＤＮＡと抗体をコードするＤＮＡとの連結は、リンカーと呼ばれる適当なペプチドをコードするＤＮＡを介しても良い。ストレプトアビジン又はストレプトアビジン変異体―抗体結合物は、抗体と標的分子との特異的結合力を残して作製されることが望ましい。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例１：低免疫原性ストレプトアビジンの設計
　配列番号１及び２に記載のコアストレプトアビジンの遺伝子配列及びアミノ酸列を元に、以下の条件を満たすような変異を有する変異体ストレプトアビジンの配列を検討し、表１に記載の変異を有する変異体ストレプトアビジンを設計した。
（１）抗体との融合タンパク質が、人体内において免疫原性を可能な限り少なくすると予測される配列であること。
（２）ビオチン分子に対する高いアフィニティーを可能な限り維持している配列であること。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１におけるＹ２２は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列における１０番目のアミノ酸残基のチロシンに対応する。表１におけるＹ２２Ｓは、上記チロシンからセリンへの置換を示し、表１におけるＹ２２Ｔは、上記チロシンからトレオニンへの置換を示す。
　表１におけるＹ８３は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列における７１番目のアミノ酸残基のチロシンに対応する。表１におけるＹ８３Ａは、上記チロシンからアラニンへの置換を示し、表１におけるＹ８３Ｓは、上記チロシンからセリンへの置換を示す。
　表１におけるＲ８４は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列における７２番目のアミノ酸残基のアルギニンに対応する。表１におけるＲ８４Ｋは、上記アルギニンからリジンへの置換を示す。
　表１におけるＥ１０１は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列における８９番目のアミノ酸残基のグルタミン酸に対応する。表１におけるＥ１０１Ｄは、上記グルタミン酸からアスパラギン酸への置換を示す。
　表１におけるＲ１０３は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列における９１番目のアミノ酸残基のアルギニンに対応する。表１におけるＲ１０３Ｋは、上記アルギニンからリジンへの置換を示す。
　表１におけるＥ１１６は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列における１０４番目のアミノ酸残基のグルタミン酸に対応する。表１におけるＥ１１６Ｎは、上記グルタミン酸からアスパラギンへの置換を示し、表１におけるＥ１１６Ｑは、上記グルタミン酸からグルタミンへの置換を示す。
実施例２：変異体ストレプトアビジンの製造
（１）ワイルドタイプコアストレプトアビジンの塩基配列の合成
　配列表の配列番号１に示すコアストレプトアビジンをコードする遺伝子の塩基配列は、人工遺伝子合成（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）のサービスを使用した。
（２）発現ベクターの構築
 発現ベクターは、上記の野生型ストレプトアビジンおよび改変体ストレプトアビジンと精製用タグであるズブチリジンプロドメイン部分の融合体タンパク質が発現するように設計を行った。N'末端側にズブチリジンプロドメイン遺伝子配列が組み込まれたベクター、ｐＰＡＬ７ベクター（ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）を利用しコドンを合わせ野生型ストレプトアビジンもしくは改変体ストレプトアビジンがC末端側に融合するタンパク質を発現するベクターを調製した。
　具体的には、上記の配列を鋳型にし、５'端側にＨｉｎｄＩＩＩサイト、３'端側にＥｃｏＲＩサイトをＰＣＲにより付加する下記のプライマー１及び２を用い、ＰＣＲ後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩにて処理を行った。
プライマー１: GCTCTTCAAAGCTTTGGCCGAAGCTGGTATCACTG  （配列番号３）
プライマー２：CTCGAGGAATTCTTAGCTAGCAGCAGAAGGCTTAAC　（配列番号４）
　制限酵素処理をしたサンプルは電気泳動の後、ゲル精製を行った。同様にｐＰＡＬ７ベクター（ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）も酵素処理を実施し、ゲル精製を行った。精製したベクターおよびＰＣＲ産物は２xＲａｐｉｄ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　BｕｆｆｅｒとＴ４ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（供にＰｒｏｍｅｇａ社）を用いて指定の方法でライゲーションを実施した。大腸菌のトランスフォーメーションは５０マイクロリットルのDH５αコンピテントセル（TOYOBO社製）に対し、２マイクロリットルのライゲーション産物を添加し実施した。プラスミドの抽出はＭｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて実施し、得られたプラスミドについてシーケンス解析により配列の確認を実施した。
（３）変異株の作成
　上記のワイルドタイプストレプトアビジン発現ベクターを鋳型とし、ＳｉｔｅーＤｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法により塩基配列の置換によるコドン配列の変更を行いアミノ酸配列の変換を行った。すなわち、変更する塩基配列が、ほぼ中心に来るように長さ２８～３０ベースの相補的プライマーを設計し、野生型ストレプトアビジン発現ベクターを鋳型としてＰＣＲ法を実施した。その後、制限酵素ＤｐｎＩにて鋳型プラスミドを切断し、大腸菌の形質転換を行った。
プライマー：
Y22S Fw: CACTGGCACCTGGTCGAACCAACTGGGGTC  （配列番号５）
Y22T Fw: CACTGGCACCTGGACTAACCAACTGGGGTC  （配列番号６）
E101D FW: CGTTGGCGGTGCTGATGCTCGTATCAACAC　（配列番号７）
R103K FW: GGTGCTGATGCTAAGATCAACACTCAGTGG　（配列番号８）
Y83A FW: GGAAAAACAACGCCCGTAATGCGCACAGCG  （配列番号９）
Y83S FW: GGAAAAACAACTCGCGTAATGCGCACAGCG  （配列番号１０）
R84K FW: GAAAAACAACTATAAGAATGCGCACAGCG　（配列番号１１）
E116N FW: CATCCGGCACTACCAATGCGAATGCATGG  （配列番号１２）
E160Q FW: CATCCGGCACTACCCAAGCGAATGCATGG  （配列番号１３）
（４）組換えタンパク質の発現
　野生型ストレプトアビジンおよび変異体ストレプトアビジンの遺伝子配列を組み込んだｐＰＡＬ７発現ベクターを大腸菌BL２１（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）に常法に従いトランスフェクションを行った。各タンパク質の発現は以下のように実施した。すなわち、大腸菌培養液の細胞密度がＯＤ（６００ｎｍ）０．５－０．７となるまで３７度にて培養を行い、最終濃度１mMになるようにＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－D－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、タンパク質発現を誘導し、１０℃～３０℃好ましくは１６℃にて２４時間以上の培養を行った。培養の後、菌体を遠心分離により細胞を集め、タンパク質精製までマイナス２０度で保存した。
（５）組換えタンパク質の粗精製
　組換えタンパク質の粗精製は、改変ズブチリジンとズブチリジンプロドメインとの結合性を利用したアフィニティークロマトグラフィーを行った（Ruanら, (2004), Biochemistry 43, 14539-14546）。具体的には、改変ズブチリジンをSperflow 6% agarose ビーズに固定したカラム（Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridge, BIO-RAD社）を使用した。
　大腸菌の調製は細胞溶解液として10mM sodiumn phosphate, pH7.2 - 5.6、10xBugBuser reagent (Novagen)、核酸分解酵素（Benzonase） を添加し細胞の溶解を行った。溶解は室温で行い、溶解した液は35,000xg、30分間の遠心分離をおこなった。遠心分離後上清を総可溶性タンパク質とした。
　結合バッファー・洗浄バッファー１：5 mM リン酸ナトリウム pH6.8、洗浄バッファー２：10 M リン酸ナトリム, 300 mM、溶出バッファー：10 M リン酸ナトリウム, 100 mM フッ化ナトリウム、カラム再生バッファー：100 mM リン酸、カラム保存バッファー：5 mM リン酸ナトリウム pH6.8 を精製に使用した。なお洗浄バッファー２および溶出バッファーのpHについては天然型ストレプトアビジンの精製では、pH6.1、改変体ストレプトアビジンの精製ではpH7.0に調製した。
　精製は以下の手順でおこなった。
　10カラムボリュームのバッファーでカラムを平衡化した。次に、大腸菌の総可用性タンパク質を2ml/minの流速でカラムへアプライした。カラムへのアプライ後10カラムボリュームの洗浄バッファー１でカラムを洗浄した。次に10カラムボリュームの洗浄バッファー２でカラムの洗浄を行った。その後、１カラムボリュームの溶出バッファーを注入し30分間室温（25℃）でインキュベーションを行った。インキュベーションの後、溶出バッファー3カラムボリュームでタンパク質の溶出を行った。その後、５カラムボリュームのカラム再生バッファーでカラムの再生を行った。最後に５カラムボリュームのカラム保存バッファーでカラムを洗浄し精製を終了した。図１および図４に、粗精製された野生型ストレプトアビジンのCBB染色像を示す。
　また、エンドトキシンレベルの低減のためエンドトキシン除去フィルター処理を実施した。
（６）粗精製された組換タンパク質の高純度化精製
　以降、バッファーのpHについては、野生型ストレプトアビジンはpH6.1、改変体ストレプトアビジン（mcSA314、414）はpH7.0とする。
　粗精製された組換えタンパク質は、セラミックハイドロキシアパタイトカラムによる精製の準備として10,000 MWCOの限外ろ過膜を使用し遠心ろ過にて濃縮をした。濃縮後、脱塩カラム用い、5 mM リン酸ナトリム溶液にバッファーを置換した。セラミックハイドロキシアパタイトカラムはCHT2-1もしくはCHT5-1(BIO-RAD社)を使用し、すべての作業の流速は2ml/minで行った。初めに10カラムボリュームの５ｍMリン酸ナトリムでカラムの平衡化を行った。次にバッファー置換された粗精製サンプルをアプライしカラムへ吸着させた。洗浄を6カラムボリューム行った後、5mM リン酸ナトリウム、500mM 塩化ナトリムバッファーでタンパク質の溶出を行った。図２および図５に、CHTカラム精製のクロマトグラムとCBB染色像を示す。
　その後、限外濾過フィルターにより遠心濃縮を実施したものを最終精製産物とした。
　最終精製産物のCBB染色像を図３および図６に示す。
（７）エンドトキシン試験
　最終精製物についてエンドトキシンの濃度はLAL法に基づく測定キットを用いて行った。具体的には、EndoSafePTSキット（チャールズリバー社）を使用し測定を行った結果を表２に示す。表２は、最終精製産物の純度とエンドトキシンレベルを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002

Claims (7)

  1. ストレプトアビジン又はストレプトアビジン変異体とズブチリジンプロドメイン部分との組み換え融合体タンパク質を発現させ、上記組み換え融合体タンパク質を、ズブチリジン又は改変ズブチリジンを固定したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、上記で精製されたストレプトアビジン又はストレプトアビジン変異体をさらにセラミックハイドロキシアパタイトカラムで精製することを含む、ストレプトアビジン又はストレプトアビジン変異体の製造方法。
  2. ズブチリジン又は改変ズブチリジンを固定したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにおける溶出工程を、５～３５℃で行う、請求項１に記載の方法。
  3. ズブチリジン又は改変ズブチリジンを固定したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにおける溶出工程を、１０～２５℃で行う、請求項１又は２に記載の方法。
  4. ストレプトアビジン変異体が、免疫原性を低下させたストレプトアビジン変異体である、請求項１から３の何れか１項に記載の方法。
  5. ストレプトアビジン変異体が、配列番号２に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において、（ａ）７２番目のアミノ酸残基のアルギニンが他のアミノ酸に置換しており、かつ（ｂ）１０番目のアミノ酸残基のチロシン、７１番目のアミノ酸残基のチロシン、８９番目のアミノ酸残基のグルタミン酸、９１番目のアミノ酸残基のアルギニン、及び１０４番目のアミノ酸残基のグルタミン酸の何れか一つ以上が他のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列を含み、野生型ストレプトアビジンと比較して免疫原性が低下している、ストレプトアビジン変異体である、請求項１から４の何れか１項に記載の方法。
  6. 配列番号２に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において、（ａ）７１番目のアミノ酸残基のチロシン及び７２番目のアミノ酸残基のアルギニンが他のアミノ酸に置換しており、かつ（ｂ）１０番目のアミノ酸残基のチロシン、８９番目のアミノ酸残基のグルタミン酸、９１番目のアミノ酸残基のアルギニン、１０４番目のアミノ酸残基のグルタミン酸の何れか一つ以上が他のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のストレプトアビジン変異体。
  7. 配列番号２に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において以下の何れか１以上の変異を有する、請求項５又は６に記載のストレプトアビジン変異体
    （１）１０番目のアミノ酸残基のチロシンがセリン又はトレオニンに置換している変異：
    （２）７１番目のアミノ酸残基のチロシンがアラニン又はセリンに置換している変異：
    （３）７２番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異：
    （４）８９番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換している変異：
    （５）９１番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異：
    （６）１０４番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がグルタミン又はアスパラギンに置換している変異：
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014129446A1 (ja) * 2013-02-20 2014-08-28 サヴィッド・セラピューティックス株式会社 ビオチン改変体、ストレプトアビジン変異体およびそれらの利用
WO2015125820A1 (ja) * 2014-02-18 2015-08-27 サヴィッド・セラピューティックス株式会社 ビオチン改変体、ストレプトアビジン変異体およびそれらの利用
WO2017050947A1 (en) * 2015-09-23 2017-03-30 European Molecular Biology Laboratory Protease-resistant streptavidin

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CUMMINGS, L.J. ET AL.: "Protein chromatography on hydroxyapatite columns.", METHODS ENZYMOL., vol. 463, 2009, pages 387 - 404 *
MEYER, D.L. ET AL.: "Reduced antibody response to streptavidin through site-directed mutagenesis.", PROTEIN SCI., vol. 10, 2001, pages 491 - 503, XP002617615, DOI: doi:10.1110/PS.19901 *
RUAN, B. ET AL.: "Engineering subtilisin into a fluoride-triggered processing protease useful for one-step protein purification.", BIOCHEMISTRY, vol. 43, 2004, pages 14539 - 14546, XP002530005, DOI: doi:10.1021/bi048177j *
SOLOMON, J.S. ET AL.: "Expression, purification, and human antibody response to a 67 kDa vaccine candidate for schistosomiasis japonica.", PROTEIN EXPR PURIF., vol. 36, 2004, pages 226 - 231, XP004520286, DOI: doi:10.1016/j.pep.2004.04.011 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014129446A1 (ja) * 2013-02-20 2014-08-28 サヴィッド・セラピューティックス株式会社 ビオチン改変体、ストレプトアビジン変異体およびそれらの利用
CN104995196B (zh) * 2013-02-20 2018-10-12 赛威德医疗公司 生物素改变体、链霉亲和素突变体和它们的用途
CN104995196A (zh) * 2013-02-20 2015-10-21 赛威德医疗公司 生物素改变体、链霉亲和素突变体和它们的用途
JP2016027006A (ja) * 2013-02-20 2016-02-18 分子動力学抗体創薬技術研究組合 ビオチン改変体、ストレプトアビジン変異体およびそれらの利用
US9670255B2 (en) 2013-02-20 2017-06-06 Savid Therapeutics Inc. Modified biotin, mutant streptavidin, and use thereof
JPWO2015125820A1 (ja) * 2014-02-18 2017-03-30 サヴィッド・セラピューティックス株式会社 ビオチン改変体、ストレプトアビジン変異体およびそれらの利用
JP2017066155A (ja) * 2014-02-18 2017-04-06 サヴィッド・セラピューティックス株式会社 ビオチン改変体、ストレプトアビジン変異体およびそれらの利用
JP6096371B2 (ja) * 2014-02-18 2017-03-15 サヴィッド・セラピューティックス株式会社 ビオチン改変体、ストレプトアビジン変異体およびそれらの利用
WO2015125820A1 (ja) * 2014-02-18 2015-08-27 サヴィッド・セラピューティックス株式会社 ビオチン改変体、ストレプトアビジン変異体およびそれらの利用
US11161884B2 (en) 2014-02-18 2021-11-02 Savid Therapeutics Inc. Modified biotin, streptavidin mutant, and usage of them
US11286285B2 (en) 2014-02-18 2022-03-29 Savid Therapeutics Inc. Modified biotin, streptavidin mutant, and usage of them
WO2017050947A1 (en) * 2015-09-23 2017-03-30 European Molecular Biology Laboratory Protease-resistant streptavidin
CN108291214A (zh) * 2015-09-23 2018-07-17 欧洲分子生物学实验室 抗蛋白酶的链霉亲和素

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