CN104995196B

CN104995196B - 生物素改变体、链霉亲和素突变体和它们的用途

Info

Publication number: CN104995196B
Application number: CN201480009625.2A
Authority: CN
Inventors: 杉山晓; 土居洋文; 儿玉龙彦; 井上豪; 沟端荣; 沟端荣一; 川户达矢; 饭塚友洋; 金井求; 清水洋平; 山本伦广
Original assignee: Savid Therapeutics Inc
Current assignee: Savid Therapeutics Inc
Priority date: 2013-02-20
Filing date: 2014-02-18
Publication date: 2018-10-12
Anticipated expiration: 2034-02-18
Also published as: EP2960243B1; US9670255B2; EP2960243A4; WO2014129446A1; JP2016027006A; JP6178586B2; US20160137704A1; CN104995196A; EP2960243A1; JPWO2014129446A1

Abstract

本发明的课题是提供降低了对天然生物素的亲和性的链霉亲和素突变体，进而提供对与该天然生物素的亲和性低的链霉亲和素突变体具有高亲和性的生物素改变体。根据本发明，提供用于治疗或诊断的试剂盒，其含有：（a）降低了与天然生物素或生物胞素的亲和性的链霉亲和素突变体、和（b）对上述链霉亲和素突变体具有高亲和性的生物素改变体。

Description

生物素改变体、链霉亲和素突变体和它们的用途

技术领域

本发明涉及生物素改变体、链霉亲和素突变体和它们的用途。更详细地，本发明涉及降低了与天然生物素的亲和性的链霉亲和素突变体、与上述链霉亲和素突变体具有亲和性的生物素改变体、以及它们的用途。

背景技术

亲和素与生物素、或链霉亲和素与生物素之间的亲和性非常高（Kd=10^-15至10^- ¹⁴M），作为生物体二分子间的相互作用，是最强的相互作用之一。现在，亲和素/链霉亲和素- 生物素相互作用被广泛应用于生物化学、分子生物学或医学的领域（Green, (1975),Adv. Protein Chem., 29: 85-133; Green, (1990), Methods Enzymol., 184: 51-67）。亲和素是来源于蛋清的碱性糖蛋白，等电点超过10。另一方面，链霉亲和素来源于放线菌（Streptomyces avidinii），等电点在中性附近，且不含糖链。两种蛋白质均形成4聚体，每1个亚基与1分子的生物素结合。分子量为60kDa左右。

近年来，设计出组合了该亲和素/链霉亲和素与生物素的高结合能力和抗体分子的药物递送方法、预靶向方法（Hnatowich, (1987), J. Nucl. Med., 28, 1294-1302）。然而，来源于鸡的亲和素或来源于微生物的链霉亲和素对人体显示出高免疫原性，因而在给予人体后，早期产生抗亲和素/链霉亲和素抗体成为问题，从而成为阻碍预靶向方法实用化的原因之一（Paganelli, (1991), Cancer Res., 51, 5960-5966）。报道了用于解决上述问题的低免疫原性链霉亲和素（国际公开WO2010/095455）。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开WO2010/095455

非专利文献

非专利文献1：Green, (1975), Adv. Protein Chem., 29: 85-133;

非专利文献2：Green, (1990), Methods Enzymol., 184: 51-67

非专利文献3：Hnatowich, (1987), J. Nucl. Med., 28, 1294-1302

非专利文献4：Paganelli, (1991), Cancer Res., 51, 5960-5966）。

发明内容

发明要解决的问题

如上所述的低免疫原性链霉亲和素具有对人体的免疫原性降低了的特征，但由于对存在于人体内部的生物素具有亲和性，因而下述问题令人担忧：在诊断用途的情形中，存在背景变高的问题，在治疗用途的情形中，存在不能对疾病特异性地发挥药效的可能性。因此，本发明的课题是要解决下述问题：提供降低了对天然生物素的亲和性的链霉亲和素突变体、进而提供对与该天然生物素的亲和性低的链霉亲和素突变体具有高亲和性的生物素改变体。进而，本发明的课题是要解决下述问题：提供组合使用了上述链霉亲和素突变体与生物素改变体的诊断药物・治疗药物、组合使用了上述链霉亲和素突变体和生物素改变体的诊断试剂盒・治疗试剂盒。

用于解决问题的方法

本发明人为了解决上述课题而进行了深入研究，通过对国际公开WO2010/095455中记载的低免疫原性链霉亲和素突变体进一步导入规定的的氨基酸突变，成功获得了降低了对天然生物素的亲和性的链霉亲和素突变体。同时，通过改变生物素的结构的一部分，合成了各种生物素改变体。继而，调查了上述链霉亲和素突变体和上述生物素改变体的亲和性，结果发现了相互具有亲和性的组合，从而完成了本申请发明。

即，根据本发明，提供以下发明。

[1]下述式（1）所示的化合物，

[化1]

式中，X1和X2各自独立地表示O或NH，Y表示C或S，Z表示O、S或NH，V表示S或S^＋-O^-，n表示0或1的整数，m表示1至10的整数，W表示-OH、-NH（CH₂）_pCOOH、或-NH（CH₂）_qC（NH₂）COOH；其中，p和q各自独立地表示1至10的整数。

[2][1]所述的化合物，其是n为0的下述式（2）所示的化合物，

[化2]

式中，X1、X2、Y、Z、V、m、和W与[1]中含义相同。

[3]以下的任一化合物，

[化3]

。

[4]链霉亲和素突变体，其含有SEQ ID No:3至12中任一者所记载的氨基酸序列。

[5]编码[4]所述的链霉亲和素突变体的DNA。

[6]链霉亲和素突变体-分子探针结合物，其是通过使分子探针与[4]所述的链霉亲和素突变体结合而得的。

[7]治疗剂或体内或体外诊断剂，其含有[6]所述的链霉亲和素突变体-分子探针结合物。

[8]治疗或体内或体外诊断试剂盒，其含有：（a）[6]所述的链霉亲和素突变体―分子探针结合物；和（b）经[1]至[3]中任一项所述的化合物标记的体内或体外诊断用或治疗用物质。

[9] 用于治疗或体内或体外诊断的试剂盒，其含有：

（a）降低了与天然生物素或生物胞素的亲和性的链霉亲和素突变体、和

（b）对上述链霉亲和素突变体具有高亲和性的生物素改变体。

[10] 治疗或体内或体外诊断试剂盒，其含有：

（a）降低了与天然生物素或生物胞素的亲和性的链霉亲和素突变体与分子探针的结合物、和

（b）经对上述链霉亲和素突变体具有高亲和性的生物素改变体标记的体内或体外诊断用或治疗用物质。

发明效果

根据本发明，提供免疫原性降低的同时对天然生物素的亲和性也降低了的链霉亲和素突变体、与对上述链霉亲和素突变体具有高亲和性的生物素改变体的组合。本发明的链霉亲和素突变体与生物素改变体的组合在基于预靶向方法的诊断方法・治疗方法中有用。

附图说明

[图1]图1示出链霉亲和素突变体重组蛋白的粗纯化的结果。

[图2]图2示出与生物素-HRP标记体的竞争分析的结果。

[图3]图3示出坐滴蒸气扩散法(Sitting drop vapor diffusion method)。

[图4]图4示出LISA314和LISA314-V21的结晶结构。

[图5]图5示出LISA314和LISA314-V21的结晶结构。

(A)LISA314与生物素的共晶结构。（B）LISA314-V21与亚氨基生物素长尾（iminobiotin long tail）的共晶结构。将亚基A和C用线条带表示，B和D用扁平带表示。

[图6]图6示出重折叠蛋白的纯化的一例。

[图7]图7示出对生物胞素与LISA314 WT的相互作用进行SPR分析时的传感图。

[图8]图8示出对生物胞素与LISA314 V21的相互作用进行SPR分析时的传感图。

[图9]图9示出对化合物29与LISA314 V21的相互作用进行SPR分析时的传感图。

具体实施方式

以下，对本发明进行更详细说明。

（1）生物素改变体

本发明的生物素改变体是下述式（1）所示的化合物，优选是式（1）中n为0时的式（2）所示的化合物。

[化4]

[化5]

式（1）和式（2）中，下述结构：

[化6]

所示的部分优选为

[化7]

中的任一者，但并不限定于此。

m表示1至10的整数，优选表示2至10的整数，更优选表示2至8的整数，更优选表示2至6的整数，特别优选表示4。

p和q各自独立地表示1至10的整数，优选表示2至10的整数，更优选表示2至8的整数，更优选表示2至6的整数，特别优选表示4或5。

本发明的式（1）或式（2）的化合物可以通过以下的实施例1中记载的合成方法来合成。实施例1中的化合物11、19、21、23、24、27、29、31、36、37、46和47是本发明的式（1）或式（2）的化合物。

化合物11的合成方法

首先，在(L)-阿拉伯糖（化合物1）的DMF溶液中加入2,2-二甲氧基丙烷和甲苯磺酸一水合物，由此得到(3aS,7R,7aR)-2,2-二甲基四氢-3aH-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡喃-6,7-二醇 (化合物2)。将化合物2溶解于水和己烷的混合溶剂中，加入高碘酸钠并进行搅拌，加入碳酸钠，由此得到(3aS,6aS)-2,2-二甲基四氢呋喃并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-醇(化合物3)。在化合物3 的DMF溶液中加入硅藻土（Celite）和重铬酸吡啶鎓进行反应，由此得到(3aS,6aS)-2,2-二甲基二氢呋喃并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4(3aH)-酮(化合物4)。在化合物4的DMF溶液中加入硫代乙酸钾进行反应，由此得到(3aS,6aR)-2,2-二甲基二氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4(3aH)-酮(化合物5)。在化合物5的THF溶液中加入3-丁烯-1-基溴化镁进行反应，由此得到(3aS,6aR)-4-(3-丁烯-1-基)-2,2-二甲基四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-醇(化合物6)。在化合物6的CH₂Cl₂溶液中加入三乙基硅烷并进行搅拌后，加入三氟乙酸 (675 μL, 9.05 mmol)进行反应，由此得到(2S,3S,4R)-2-(3-丁烯-1-基)四氢噻吩-3,4-二醇(化合物7)。在化合物7的CH₂Cl₂溶液中加入吡啶和三光气进行反应，由此得到(3aS,4S,6aR)-4-(3-丁烯-1-基)四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-2-酮(化合物8)。在含有化合物8的CH₂Cl₂溶液中加入丙烯酸苄酯和第二代Hoveyda-Grubbs 催化剂，进行加热回流，由此得到 (E)-苄基5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-2-戊烯酸酯 (化合物9)。在化合物9的乙醇溶液中加入钯碳，在氢气存在下搅拌，进行反应，由此得到5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)戊酸苄酯(化合物10)。在含有化合物10的CH₂Cl₂溶液中加入三溴化硼进行反应，由此得到本发明的式（1）所示的((3aS,4S,6aR)-2-氧代四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)戊酸(化合物11)。

化合物19的合成方法

在化合物13的无水THF溶液中滴加正丁基锂溶液(2.6 M己烷溶液)并进行搅拌后，滴加化合物 12与HMPA无水THF溶液并进行搅拌，由此得到(R)-叔丁基4-((R)-1-羟基-6-(4-甲基-2,6,7-三氧杂双环[2.2.2]辛烷-1-基)-2-己炔基-1-基yl)-2,2-二甲基噻唑烷-3-甲酸酯(化合物14)。在含有化合物14的无水甲苯溶液中加入六甲基二硅氮烷锂溶液进行反应，由此得到(1R,7aR)-5,5-二甲基-1-(5-(4-甲基-2,6,7-三氧杂双环[2.2.2]辛烷-1-基)-1-戊炔-1-基)二氢-1H-噻唑并[3,4-c]噁唑-3(5H)-酮(化合物15)。在化合物15的CH₃CN和H₂O 混合溶液中，加入硝酸银(I)进行反应，由此得到(E)-3-羟基-2-(羟基甲基)-2-甲基丙基5-((3aR,6aS)-2-氧代四氢噻吩并[3,4-d]噁唑-6(6aH)-亚基)戊酸酯(化合物16)。在化合物16和乙酸烯丙酯的甲醇溶液中加入氢氧化钯碳，在氢气存在下进行反应，由此得到3-羟基-2-(羟基甲基)-2-甲基丙基 5-((3aR,6S,6aS)-2-氧代六氢噻吩并[3,4-d]噁唑-6-基)戊酸酯(化合物18)。在化合物18的CH₃CN和H₂O的混合溶液中，加入氢氧化锂进行反应，由此得到5-((3aR,6S,6aS)-2-氧杂六氢噻吩并[3,4-d]噁唑-6-基)戊酸(化合物19)。

化合物21的合成方法

在室温下在生物素 (化合物20)的乙酸溶液中加入NaBO₃･4H₂O，搅拌后加入硫代硫酸钠，减压下蒸馏除去溶剂，由此得到5-((3aS,4S,6aR)-5-氧化物-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酸(化合物21)。

化合物23的合成方法

在亚氨基生物素(化合物22)的1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇溶液中加入H₂O₂水溶液进行反应，由此得到5-((3aS,4S,6aR)-2-亚氨基-5-氧化物六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酸 (化合物23)。

化合物24的合成方法

在化合物11的1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇溶液中加入H₂O₂水溶液进行反应，由此得到5-((3aS,4S,6aR)-5-氧化物-2-氧代四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)戊酸(化合物24)。

化合物27的合成方法

在生物素甲基酯 (化合物25)的甲苯溶液中加入Lawesson's 试剂进行反应，由此得到5-((3aS,4S,6aR)-2-硫代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酸甲酯 (化合物26)。在含有化合物26的THF溶液中添加氢氧化钠水溶液，由此得到5-((3aS,4S,6aR)-2-硫代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酸(化合物27)。

化合物29的合成方法

在6-氨基己酸的二噁烷和H₂O的混合溶液中，加入氢氧化钠水溶液，调整至pH为9左右。加入化合物28进行反应，由此得到5-((3aR,6S,6aS)-2-氧代六氢噻吩并[3,4-d]噁唑-6-基)戊酸 (化合物29)。

化合物31的合成方法

对化合物28和Nα-Boc-L-赖氨酸的二噁烷/水的混合溶剂进行搅拌，

由此得到(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-6-(5-((3aS,4S,6aR,Z)-2-((2,2,2-三氟乙酰基)亚氨基)六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺)己酸 (化合物30)。将化合物30在二噁烷和H₂O的混合溶液中，加入盐酸调整至pH为3左右进行5小时搅拌后，减压下蒸馏除去溶剂，将所得固体溶解于二噁烷和H₂O中，加入氨水，由此得到 (S)-2-氨基-6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-亚氨基六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺)己酸(化合物31)。

化合物36的合成方法

在化合物32的CH₂Cl₂溶液中，加入丙烯酸苄酯和第二代 Hoveyda-Grubbs 催化剂，进行反应，由此得到(E)-苄基 5-((3aS,4S,6aR)-2,2-二甲基四氢噻吩并[3,4-d][1,3] 二氧杂环戊烯-4-基)-2-戊烯酸酯(化合物33)。在化合物33的乙醇溶液中加入钯碳，在氢气存在下进行反应，由此得到5-((3aS,4S,6aR)-2,2-二甲基四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)戊酸苄酯(化合物34)。在化合物34的CH₂Cl₂溶液中加入三溴化硼进行反应，由此得到5-((2S,3S,4R)-3,4-二羟基四氢噻吩-2-基)戊酸(化合物35)。在化合物35的 CH₃CN溶液中，加入亚硫酰氯进行反应，由此得到5-((3aS,4S,6aR)-2-氧化物四氢噻吩并[3,4-d][1,3,2]二氧杂硫杂环戊二烯-4-基)戊酸(化合物36)。

化合物37的合成方法

将化合物17溶解于MeOH中，使用催化量的Pd/C在氢气氛下进行搅拌，由此进行双键的还原。接着将所得化合物的酯部位在CH₃CN、H₂O混合溶剂下用LiOH进行水解，由此得到4-((3aR,6S,7aR)-2-氧代六氢-2H-硫代吡喃并[3,4-d]噁唑-6-基)丁酸 (化合物37)。

化合物46的合成方法

在化合物15的乙腈和水的混合溶液中，加入氟化银，在室温进行反应，由此得到化合物38。在三元醇化合物38和2,2-二甲氧基丙烷的无水丙酮溶液中加入对甲苯磺酸一水合物，将混合物在室温下搅拌。加入三乙基胺后，将溶剂减压蒸馏除去，将所得粗产物用硅胶柱色谱纯化，由此得到化合物39。在二丙酮化合物39的甲醇溶液中加入Pearlman催化剂(10% 钯)，用氢气 (1大气压, 气球)置换，在室温下进行反应，由此得到双键被还原的化合物40和41的混合物。将该粗产物溶解于乙腈和水的混合溶剂后，加入2当量的氢氧化锂水溶液，在室温进行反应，由此得到化合物42。在羧酸42和N-羟基琥珀酰亚胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，将混合物在室温搅拌进行反应，由此得到活性酯体43。将所得43溶解于二噁烷和水的混合溶剂中，加入6-氨基己酸，在室温进行反应，由此得到化合物44。在羧酸44的二噁烷溶液中加入3当量的盐酸，将混合物在室温进行反应，由此得到化合物45。在铵盐45的四氢呋喃溶液中加入碳酸钾和羰基二咪唑，将混合物在80℃进行反应，冷却至室温后，加入2当量的氢氧化钠水溶液，在室温进行2小时反应，进而加入2当量盐酸调节为酸性 (pH 3)，由此得到化合物46。

化合物47的合成方法

在铵盐45的甲醇溶液中加入乙酸钠和溴化氰，将混合物在室温进行搅拌。加入2当量的氢氧化钠水溶液，在室温进行搅拌。加入水，将水层用二乙基醚洗涤后，用2当量的盐酸调节为酸性(pH 3)。将溶剂减压蒸馏除去后，加入二氯甲烷/甲醇 (1:1) 的混合溶液，将固体通过过滤分离除去。将溶剂减压蒸馏除去，将所得粗产物用反相HPLC进行纯化，由此得到化合物47。

（2）链霉亲和素突变体

本发明的链霉亲和素突变体的特征在于，在SEQ ID No:2中记载的核心链霉亲和素的氨基酸序列中，具有规定的氨基酸的突变，与野生型链霉亲和素相比免疫原性降低，同时降低了与天然生物素或生物胞素的亲和性。

将野生型（天然）的核心链霉亲和素的氨基酸序列示于序列表的SEQ ID No:2，将编码其的碱基序列示于序列表的SEQ ID No:1。

作为本发明的链霉亲和素突变体，具体地，其具有序列表的SEQ ID No:3至12中的任一者所记载的氨基酸序列。

本发明中所说的与野生型链霉亲和素相比免疫原性降低是指将链霉亲和素突变体给予人等哺乳动物时的免疫原性降低。免疫原性降低例如可通过以下的方法来确认。即，对于本发明的链霉亲和素突变体，分析相对于将野生型链霉亲和素免疫食蟹猴而获得的抗链霉亲和素抗血清的反应性，若相对于上述抗链霉亲和素抗血清的反应性与野生型链霉亲和素相比降低，则可以判断为与野生型链霉亲和素相比免疫原性降低。通过上述方法判断为免疫原性的降低的情形中，本发明的链霉亲和素突变体与野生型链霉亲和素相比，免疫原性降低至优选80%以下、进一步优选60%以下、进一步优选20%以下、进一步优选15%以下、进一步优选10%以下、特别优选5%以下。

本发明中所说的降低了与天然生物素或生物胞素的亲和性，意指链霉亲和素突变体与天然生物素或生物胞素的结合性同链霉亲和素与天然生物素或生物胞素的结合性相比降低。链霉亲和素突变体与天然生物素或生物胞素的亲和性・结合性可以通过SPR分析等进行评价。本发明的链霉亲和素突变体与野生型链霉亲和素相比，与天然生物素或生物胞素的亲和性降低至优选80%以下、进一步优选70%以下、进一步优选60%以下、进一步优选50%以下、进一步优选40%以下。

根据本发明，进一步提供编码上述本发明的链霉亲和素突变体的DNA。本发明的DNA可以通过对编码野生型（天然）的链霉亲和素的DNA进行位点特异性突变诱导来制作。

编码上述本发明的链霉亲和素突变体的DNA可以插入载体使用。特别地，为了制造本发明的链霉亲和素突变体，可以将编码本发明的链霉亲和素突变体的DNA插入表达载体，将该表达载体转化宿主，由此表达本发明的链霉亲和素突变体。

以大肠杆菌作为宿主时，作为本发明中所用的载体，优选具有复制起点（ori），进而还具有用于选择经转化的宿主的基因（例如，针对氨苄青霉素、四环素、卡那霉素或氯霉素等药物的药物抗性基因等）。此外，在表达载体的情形中，优选具有能够在宿主中高效表达本发明的链霉亲和素突变体的启动子，例如，lacZ启动子或T7启动子等。作为这种载体，载体的例子可举出M13系载体、pUC系载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script、pGEX-5X-1（PHARMACIA）、“QIAexpress system”（Qiagen）、pEGFP、或pET(此时，宿主优选使用表达T7RNA聚合酶的BL21)等。此外，也可以对载体添加用于提高本发明的链霉亲和素突变体的收量的信号序列等。

向宿主细胞导入载体可以采用例如氯化钙法、电穿孔法来进行。此外，也可以添加编码用于提高可溶性的标签例如谷胱甘肽-S-转移酶、硫氧还蛋白、麦芽糖结合蛋白的序列。此外，也可以添加编码为了使纯化容易而设计的标签例如多组氨酸标签、Myc表位、血凝素（HA）表位、T7表位、Xpress标签或FLAG肽标签、其它已知的标签序列的序列。

除了大肠杆菌以外，还可举出：来源于哺乳动物的表达载体（例如，pcDNA3(Invitrogen社制）、pEGF-BOS(Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF、pCDM8）、来源于昆虫细胞的表达载体（例如“Bac-to-BAC baculovairus expression system”（Gibco BRL社制）、pBacPAK8）、来源于植物的表达载体（例如pMH1、pMH2）、来源于动物病毒的表达载体（例如，pHSV、pMV、pAdexLcw）、来源于反转录病毒的表达载体（例如，pZIPneo）、来源于酵母的表达载体（例如，“Pichia Expression Kit”（Invitrogen社制）、pNV11 、SP-Q01）、来源于枯草杆菌的表达载体（例如、pPL608、pKTH50）。

当目的在于CHO细胞、COS细胞、NIH3T3细胞等动物细胞中的表达时，需要具有在细胞内进行表达所需的启动子，例如SV40启动子（Mulligan等人, Nature (1979) 277,108）、MMLV-LTR启动子、EF1α启动子（Mizushima等人, Nucleic Acids Res. (1990) 18,5322）、CMV启动子等，若具有用于挑选进行了转化的细胞的基因（例如，能够通过药剂（新霉素、G418等）来判断的药物抗性基因）则进一步优选。作为具有这种特性的载体，可举出例如：pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。

作为导入载体的宿主细胞，没有特别限制，可以是原核生物和真核生物的任一者。例如，可以使用大肠杆菌或各种动物细胞等。

在使用真核细胞时，例如可以使用动物细胞、植物细胞、真菌细胞作为宿主。作为动物细胞，可以使用哺乳类细胞，例如，CHO细胞、COS细胞、3T3细胞、HeLa细胞、Vero细胞；或者昆虫细胞，例如，Sf9、Sf21、Tn5等。动物细胞中，以大量表达为目的时特别优选CHO细胞。向宿主细胞导入载体可以通过例如磷酸钙法、DEAE葡聚糖法、使用阳离子核糖体DOTAP（ベーリンガーマンハイム社制）的方法、电穿孔法、脂质体转染等方法来进行。

作为植物细胞，例如，已知来源于烟草（Nicotiana tabacum）的细胞作为蛋白生产系统，将其进行愈伤组织培养即可。作为真菌细胞，已知有：酵母，例如，酵母（Saccharomyces）属，例如，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），丝状真菌，例如，曲霉菌（Aspergillus）属，例如，黑曲霉菌（Aspergillus niger）。

使用原核细胞时，可举出大肠杆菌（E. coli），例如，JM109、DH5α、HB101等，另外还已知枯草杆菌。

将这些细胞用本发明的DNA转化，将经转化的细胞在体外进行培养，由此得到本发明的链霉亲和素突变体。培养可依照公知的方法来进行。例如，作为动物细胞的培养液，可使用例如：DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM。此时，既可以并用胎牛血清（FCS）等血清补液，也可以进行无血清培养。培养时的pH优选为约6～8。培养通常在约30～40℃进行约15～200小时，根据需要加以培养基的更换、通气、搅拌。此外，还可以进行用于促进细胞增殖的生长因子的添加。

（3）链霉亲和素突变体和生物素改变体的用途

进而，根据本发明，提供通过使分子探针与本发明的链霉亲和素突变体结合而得的链霉亲和素突变体―分子探针结合物、以及含有链霉亲和素突变体―分子探针结合物的治疗剂或诊断剂。进而，还可以将上述链霉亲和素突变体―分子探针结合物与经对本发明的链霉亲和素突变体具有亲和性的生物素改变体标记的诊断用或治疗用物质组合，而提供作为治疗或诊断试剂盒。作为分子探针，可举出例如抗体、肽、核酸、适体等。

即，本发明中，制备癌抗原特异性抗体分子等分子探针与本发明的链霉亲和素突变体的融合体并给予患者，由此可以使本发明的链霉亲和素突变体特异性地集结于癌细胞。接着，通过将结合有对上述链霉亲和素突变体具有亲和性的生物素改变体的诊断用或治疗用物质（荧光色素、化学发光剂、放射性同位素、包含金属化合部等的敏化剂、包含金属化合物等的中子捕获剂、低分子化合物、微米或纳米气泡、蛋白等）给予患者，可以确实地使物质向癌细胞集结。本发明中，通过低免疫原性化抑制抗体产生，可以防止抗体所致的早期从体内清除、过敏反应等的休克。此外，本发明中，通过用作使用了采集自患者的组织、血清等的体外诊断药物、临床检查药物，可以降低来源于组织、血清等中存在的生物素或生物素结合蛋白的噪音，实现S/N比更高的诊断、检查。

与链霉亲和素突变体结合的抗体可以使用各种分子。可以使用多克隆抗体、单克隆抗体的任一者。抗体的亚类并不特别限定，优选使用IgG、特别适宜使用IgG₁。此外，“抗体”包括改变抗体和抗体片段全部。可举出：人源化抗体、人型抗体、人抗体、来源于小鼠、兔、大鼠、豚鼠、猴等各种动物的抗体、人抗体和来源于各种动物的抗体的嵌合抗体、双抗体、scFv、Fd、Fab、Fab‘、F(ab)'₂，但并不限定于此。

链霉亲和素突变体与抗体的结合物可以使用本领域技术人员公知的方法得到。例如，可以通过化学结合方法（US5,608,060）得到，也可以将编码链霉亲和素突变体的DNA与编码抗体的DNA连接，使用表达载体等在宿主细胞中表达，由此以融合蛋白的形式得到。编码链霉亲和素突变体的DNA与编码抗体的DNA的连接可以经由编码被称为接头的适当肽的DNA来进行。链霉亲和素突变体―抗体结合物理想的是保留抗体与靶分子的特异性结合能力而制作。

根据本发明，提供含有：

（b）对上述链霉亲和素突变体具有高亲和性的生物素改变体

的用于治疗或诊断的试剂盒；以及含有

（b）经对上述链霉亲和素突变体具有高亲和性的生物素改变体标记的诊断用或治疗用物质

的治疗或诊断试剂盒。

作为降低了与天然生物素或生物胞素的亲和性的链霉亲和素突变体的具体例，可举出：在具有SEQ ID No:2中记载的氨基酸序列的链霉亲和素中，具有

（1）第10位氨基酸残基的酪氨酸替换为丝氨酸的突变；

（2）第71位氨基酸残基的酪氨酸替换为丝氨酸的突变；

（3）第72位氨基酸残基的精氨酸替换为赖氨酸的突变；

（4）第89位氨基酸残基的谷氨酸替换为天冬氨酸的突变；

（5）第91位氨基酸残基的精氨酸替换为赖氨酸的突变；和

（6）第104位氨基酸残基的谷氨酸替换为天冬酰胺的突变

的全部突变，并且除此之外还进一步具有

（7）第33位氨基酸残基的丝氨酸替换为其它氨基酸（例如，天冬酰胺）的突变；和

（8）第116位天冬氨酸替换为其它氨基酸（例如，天冬酰胺）的突变

的链霉亲和素突变体；或

具有上述（1）～（6）的全部突变，并且除此之外还进一步具有

（7‘）第11位氨基酸残基的天冬酰胺替换为其它氨基酸（例如，天冬氨酸）的突变；

（8’）第15位氨基酸残基的丝氨酸替换为其它氨基酸（例如，天冬氨酸）的突变

的链霉亲和素突变体。

进而，可以使用在具有SEQ ID No:2中记载的氨基酸序列的链霉亲和素中，具有

（1）第10位氨基酸残基的酪氨酸替换为丝氨酸的突变；

（2）第71位氨基酸残基的酪氨酸替换为丝氨酸的突变；

（3）第72位氨基酸残基的精氨酸替换为赖氨酸的突变；

（4）第89位氨基酸残基的谷氨酸替换为天冬氨酸的突变；

（5）第91位氨基酸残基的精氨酸替换为赖氨酸的突变；

（6）第104位氨基酸残基的谷氨酸替换为天冬酰胺的突变

（7‘）第11位氨基酸残基的天冬酰胺替换为其它氨基酸（例如，天冬氨酸）的突变；和

的全部突变，进而还具有

（9）第33位氨基酸残基的丝氨酸替换为其它氨基酸（例如，丙氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、苏氨酸、缬氨酸和天冬酰胺）的突变

的链霉亲和素突变体。

作为对上述链霉亲和素突变体具有高亲和性的生物素改变体，可以使用本说明书中记载的式（1）所示的化合物（优选为式（2）所示的化合物）。

通过以下实施例进一步具体说明本发明，但本发明并不受实施例限定。

实施例

实施例1：生物素改变体的合成

一般方法：NMR光谱用JEOL JNM-LA500或ECX500光谱仪进行记录（¹H NMR为500MHz、¹³C NMR为125.65 MHz）。化学位移以相对于作为内部参照的残留CHCl₃ (对于¹H NMR，δ= 7.26；对于¹³C NMR，δ=77.0)的δ标度，以ppm报告。ESI质谱用Waters-ZQ4000进行测定。柱色谱使用硅胶Merk 60 (230-400 目 ASTM)或硅胶60 N (KANTO CHEMICAL, spherical,neutral, 40-100 μm)来进行。无水四氢呋喃（THF）购自Kanto Chemical. Co., Inc.，或由Ph₂CO-Na新鲜蒸馏。其它试剂若无特别说明则直接使用市售品。

(3aS,7R,7aR)-2,2-二甲基四氢-3aH-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡喃-6,7-二醇 (2)

[化8]

在(L)-阿拉伯糖 (4g, 26.6 mmol) 的DMF 30 mL 溶液中，在室温下加入2,2-二甲氧基丙烷 (10 mL, 81.6 mmol) 和甲苯磺酸一水合物 (60 mg, 0.32 mmol)。进行12 小时搅拌后，加入碳酸钠进行中和。过滤后，减压下蒸馏除去溶剂，得到含有2 的粗产物。不进行进一步纯化而进行后续反应。

(3aS,6aS)-2,2-二甲基四氢呋喃并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-醇(3)

[化9]

将含有2 的粗产物溶解于水 (40 mL)、己烷 (20 mL) 的混合溶剂，加入高碘酸钠(14.2 g, 66.5 mmol)，进行2 小时搅拌。加入碳酸钠，进而继续进行1 小时搅拌后，加入水，用乙酸乙酯提取。将有机层用饱和盐水洗涤并干燥后，减压下蒸馏除去溶剂。将所得粗产物用硅胶柱色谱 (二氯甲烷-甲醇)进行纯化，则得到标题化合物 2.17g (二阶段收率51%)。

(3aS,6aS)-2,2-二甲基二氢呋喃并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4(3aH)-酮(4)

[化10]

在3 (740 mg, 4.60 mmol) 的DMF 20 mL 溶液中，加入硅藻土（Celite）和重铬酸吡啶鎓 (5 g, 18.5 mmol)，在100 ℃搅拌12 小时。冷却反应液，使用Florisil的短柱，用乙酸乙酯进行洗脱。减压下蒸馏除去溶剂，将所得粗产物通过硅胶柱色谱 (二氯甲烷-甲醇) 进行纯化，则得到标题化合物 520 mg (收率 71%)。

(3aS,6aR)-2,2-二甲基二氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4(3aH)-酮(5)

[化11]

在4 (1.3 g, 8.22 mmol) 的DMF 40 mL 溶液中，加入硫代乙酸钾 (1 g, 9.00mmol) ，在室温搅拌3 小时。加入冷水停止反应，用醚提取。将有机层用饱和盐水洗涤并干燥后，减压下蒸馏除去溶剂。将所得粗产物通过硅胶柱色谱 (己烷-乙酸乙酯) 进行纯化，则得到标题化合物 500 mg (收率 35%, 褐色固体)。

(3aS,6aR)-4-(3-丁烯-1-基)-2,2-二甲基四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-醇(6)

[化12]

在5 (350 mg, 2.01 mmol) 的THF 40 mL 溶液中，加入3-丁烯-1-基溴化镁(6.05 mmol) ，在-20℃搅拌30 分钟。加入饱和氯化铵水溶液停止反应，用乙酸乙酯提取。将有机层用饱和盐水洗涤并干燥后，减压下蒸馏除去溶剂。将所得粗产物通过硅胶柱色谱(己烷-乙酸乙酯) 进行纯化，则得到标题化合物 417 mg (收率 90%, 浅黄色油状)。

(2S,3S,4R)-2-(3-丁烯-1-基)四氢噻吩-3,4-二醇(7)

[化13]

在6 (417 mg, 1.81 mmol) 的CH₂Cl₂ 8 mL 溶液中，在0℃加入三乙基硅烷 (2.9mL, 18.1 mmol) ，进行15 分钟搅拌后，加入三氟乙酸 (675 μL, 9.05 mmol)，继续12 小时搅拌。加入饱和碳酸氢钠水溶液停止反应，用乙酸乙酯提取。将有机层用饱和盐水洗涤并干燥后，减压下蒸馏除去溶剂。将所得粗产物通过硅胶柱色谱 (己烷-乙酸乙酯) 进行纯化，则得到标题化合物 130 mg (收率 42%, 浅黄色固体)。另外得到作为副产物的32（收率25%）。

化合物7：

化合物32：

。

(3aS,4S,6aR)-4-(3-丁烯-1-基)四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-2-酮(8)

[化14]

在7 (6 mg, 0.034 mmol)的CH₂Cl₂ 600 μL 溶液中，在0 ℃加入吡啶 (8 μL,0.10 mmol)和三光气 (15.3 mg, 0.052 mmol) 。进行30 分钟搅拌后，加入饱和碳酸氢钠水溶液停止反应，用乙酸乙酯提取。将有机层用饱和盐水洗涤并干燥后，减压下蒸馏除去溶剂。所得粗产物不经过进一步纯化操作而用于后续反应。

(E)-苄基 5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-2-戊烯酸酯 (9)

[化15]

在含有8 的粗产物的 CH₂Cl₂ 600 μL 溶液中，加入丙烯酸苄酯 (51 μL, 0.34mmol) 和第二代 Hoveyda-Grubbs 催化剂 (2.1 mg, 3.4 μmol) ，进行12 小时加热回流。减压下蒸馏除去溶剂，将所得粗产物通过硅胶柱色谱 (己烷-乙酸乙酯) 进行纯化，则得到标题化合物 2.6 mg (二阶段收率 23%, 浅黄色油状)。

5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)戊酸苄酯(10)

[化16]

在9的EtOH 1 mL 溶液中，加入钯碳 (10 w/w% Pd, 15 mol%, 1.0 mg)。在30 atm的氢气存在下，在100 ℃继续3 小时搅拌。将反应液冷却至室温，使用硅藻土（Celite）的短柱，用乙醇进行洗脱。减压下蒸馏除去溶剂，所得粗产物不经过进一步纯化操作而用于后续反应。

((3aS,4S,6aR)-2-氧代四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)戊酸(11)

[化17]

在含有10的粗产物的 CH₂Cl₂ 600μL 溶液中，在-78℃加入1M 的三溴化硼 (50 μL, 0.050 mmol)。在0 ℃进行3 小时搅拌后，加入饱和氯化铵水溶液，用乙酸乙酯提取。将有机层用饱和盐水洗涤并干燥后，减压下蒸馏除去溶剂。将所得粗产物通过硅胶柱色谱(二氯甲烷-甲醇) 进行纯化，则得到标题化合物 1.5 mg (收率 78%, 白色固体)。

3-甲基氧基乙烷-3-基)甲基-5-己炔酸酯(40)

[化18]

在5-己炔酸38(5 mL, 44.6 mmol)和3-甲基-3-氧杂环丁烷甲醇39(4.5 mL, 44.6mmol)的 CH₂Cl₂ 20 mL 溶液中，在0 ℃加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐 (10.3 g, 53.5 mmol)和 N,N-二甲基-4-氨基吡啶(545 mg, 4.46 mmol)。冰冷下进行1小时搅拌后，加入水和饱和盐水，用CH₂Cl₂提取。将有机层用饱和盐水洗涤并干燥后，减压下蒸馏除去溶剂。将所得粗产物通过硅胶柱色谱 (己烷-乙酸乙酯)进行纯化，则得到标题化合物 8.5 g (收率 97%, 无色油状)。

4-甲基-1-(4-戊基-1-基)-2,6,7-三氧杂双环[2.2.2]辛烷(13)

[化19]

在40(8.5 g, 43.3 mmol)的CH₂Cl₂ 40 mL 溶液中，在0℃滴加三氟化硼乙基醚(2.7 mL, 21.7 mmol)。室温下进行12 小时搅拌后，在0℃滴加三乙基胺(8 mL)，在室温进行1小时搅拌后，将反应液通过硅胶柱色谱 (己烷-乙酸乙酯-三乙基胺)进行纯化，则得到标题化合物 4.4 g (收率 52%, 无色油状)。

(R)-叔丁基4-((R)-1-羟基-6-(4-甲基-2,6,7-三氧杂双环 [2.2.2]辛烷-1-基)-2-己炔基-1-基yl)-2,2-二甲基噻唑烷-3-甲酸酯(14)

[化20]

在13 (4.8 g, 24.4 mmol) 的无水 THF 50 mL 溶液中，在 -78 ℃滴加正丁基锂溶液 (2.6 M 己烷溶液 15 mL, 38.9 mmol)，升温至0 ℃，进行1 小时搅拌。然后在-78℃滴加 12 (2.9g, 11.8 mmol)（依照Duthaler, O. D. Angew. Chem. 1991, 103, 729合成得到的物质）和 HMPA (6 mL)的无水 THF 50 mL溶液，进行2小时搅拌。加入饱和氯化铵水溶液停止反应，用乙酸乙酯提取。将有机层用饱和盐水洗涤并干燥后，减压下蒸馏除去溶剂。将所得粗产物通过硅胶柱色谱 (己烷-乙酸乙酯) 进行纯化，得到含有14 的粗产物。

(1R,7aR)-5,5-二甲基-1-(5-(4-甲基-2,6,7-三氧杂双环[2.2.2]辛烷-1-基)-1-戊炔-1-基)二氢-1H-噻唑并[3,4-c]噁唑-3(5H)-酮(15)

[化21]

含有14 的粗产物的无水甲苯 40 mL 溶液中，加入六甲基二硅氮烷锂溶液 (1 MTHF 溶液 7.88 mmol)。在120℃进行12 小时搅拌后，加入饱和氯化铵水溶液，用乙酸乙酯提取。将有机层用饱和盐水洗涤并干燥后，减压下蒸馏除去溶剂。将所得粗产物通过硅胶柱色谱 (己烷-乙酸乙酯) 进行纯化，则得到标题化合物 1.82 g (二阶段收率 42%, 浅黄色油状)。

(E)-3-羟基-2-(羟基甲基)-2-甲基丙基5-((3aR,6aS)-2-氧代四氢噻吩并[3,4-d]噁唑-6(6aH)-亚基)戊酸酯(16)

[化22]

在15 (150 mg, 0.41 mmol)的CH₃CN (2.7 mL) 和H₂O (2.7 mL) 混合溶液中，加入硝酸银(I) (50 mg, 0.30 mmol)。进行9 小时搅拌后，用硅藻土（Celite）进行过滤，用乙酸乙酯提取。将有机层用饱和盐水洗涤并干燥后，减压下蒸馏除去溶剂。将所得粗产物通过硅胶柱色谱 (乙酸乙酯) 进行纯化，则标题化合物 16得到44 mg (收率 31%, 浅黄色油状)。此外，作为副产物的 17 得到35 mg (收率 25%, 浅黄色油状)。

3-羟基-2-(羟基甲基)-2-甲基丙基 5-((3aR,6S,6aS)-2-氧代六氢噻吩并[3,4-d]噁唑-6-基)戊酸酯(18)

[化23]

在16 (11 mg, 0.032 mmol) 、乙酸烯丙酯 (344μL, 3.2 mmol)的MeOH 1 mL 溶液中加入氢氧化钯碳 (10 w/w% Pd, 40 mol%, 0.013 mmol)。在25 atm 的氢气存在下，在50℃继续4 小时搅拌。将反应液冷却至室温，通过硅藻土（Celite）的短柱，用甲醇洗涤硅藻土（Celite）。减压下蒸馏除去溶剂，将所得粗产物通过硅胶柱色谱 (二氯甲烷-甲醇) 进行纯化，则得到标题化合物 4.2 mg (收率 37%, 无色油状)。

5-((3aR,6S,6aS)-2-氧杂六氢噻吩并[3,4-d]噁唑-6-基)戊酸(19)

[化24]

在18 (1.1 mg, 3.2μmol)的CH₃CN (500μL) 和 H₂O (500μL) 的混合溶液中，加入氢氧化锂 (5μmol)。进行12 小时搅拌后，用1 M 的盐酸停止反应，通过硅胶柱色谱，用甲醇洗涤。减压下蒸馏除去溶剂，将所得粗产物通过硅胶柱色谱 (二氯甲烷-甲醇) 进行纯化，则得到标题化合物 700μg (收率 92%, 白色固体)。

5-((3aS,4S,6aR)-5-氧化物-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酸(21)

[化25]

室温下，在生物素 (20) (50 mg, 0.21 mmol)的乙酸1 ml溶液中加入NaBO₃･4H₂O(94.6 mg, 0.62 mmol)。在室温进行1小时20分搅拌后，加入硫代硫酸钠(160 mg)，减压下蒸馏除去溶剂。将所得粗产物通过硅胶柱色谱（二氯甲烷-甲醇-水）纯化后，进而通过反相柱色谱（甲醇）纯化，得到标题化合物51.6 mg (收率97%、浅黄色油状)。

5-((3aS,4S,6aR)-2-亚氨基-5-氧化物六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酸(23)

[化26]

室温下在亚氨基生物素(22) (5.0 mg, 0.021 mmol)的1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇100 μL溶液中加入30% H₂O₂水溶液(5 μL)。在室温进行20分钟搅拌后，减压蒸馏除去溶剂，得到标题化合物5.2 mg (收率98%、非对映体混合物 dr = 1:1.6、白色固体)。

5-((3aS,4S,6aR)-5-氧化物-2-氧代四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)戊酸 (24)

[化27]

室温下在11(0.6 mg, 0.002 mmol)的1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇100 μL溶液中加入30% H₂O₂水溶液(5μL)。在室温进行10分钟搅拌后，减压蒸馏除去溶剂，得到标题化合物0.6 mg (收率100%、非对映体混合物 dr = 1:1.1、白色固体)。

5-((3aS,4S,6aR)-2-硫代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酸甲酯 (26)

[化28]

在生物素甲基酯 (25) (5.0 mg, 0.019 mmol)的甲苯200 μL溶液中加入Lawesson’s 试剂 (5.3 mg, 0.013 mmol)。在100 ℃进行13小时搅拌后，冷却至室温，将溶剂减压蒸馏除去。将所得粗产物通过硅胶柱色谱（二氯甲烷-甲醇）除去不溶性化合物而得到粗产物3.8 mg (白色固体)。

5-((3aS,4S,6aR)-2-硫代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酸(27)

[化29]

室温下在含有26 的粗产物2.4 mg的THF溶液100 μL中加入20%氢氧化钠水溶液100 μL。在60 ℃进行1小时搅拌后，冷却至室温，滴加1 M盐酸500 μL，将溶剂减压蒸馏除去。将所得粗产物通过硅胶柱色谱（二氯甲烷-甲醇）进行纯化，得到标题化合物0.7 mg（白色固体）。

5-((3aR,6S,6aS)-2-氧代六氢噻吩并[3,4-d]噁唑-6-基)戊酸 (29)

[化30]

在6-氨基己酸(3 mg, 0.023 mmol)的二噁烷 (500 μL)和 H₂O (500 μL) 的混合溶液中，加入氢氧化钠水溶液，调整至pH为 9左右。加入28 (10 mg, 0.023 mmol)（市售品），进行12 小时搅拌后，加入醚，将有机层除去。用盐酸对水层进行中和，进行过滤。将残渣用丙酮洗涤，减压下蒸馏除去溶剂。将所得固体溶解于二噁烷 (500μL)和H₂O (500μL)，加入29% 氨水，进行3 小时搅拌。减压下蒸馏除去溶剂，将所得结晶用二氯甲烷-甲醇的混合溶剂进行洗涤，由此得到标题化合物 4 mg (收率 49%, 白色固体)。

(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-6-(5-((3aS,4S,6aR,Z)-2-((2,2,2-三氟乙酰基)亚氨基)六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺)己酸 (30)

[化31]

对28 (10 mg, 0.023 mmol)与Nα-Boc-L-赖氨酸(5 mg, 0.023 mmol)的二噁烷/水的混合溶剂进行18 小时搅拌后，加入醚，将有机层除去。减压下蒸馏除去溶剂，所得粗产物不经过进一步纯化操作而用于后续反应。

(S)-2-氨基-6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-亚氨基六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺)己酸(31)

[化32]

在含有30 的粗产物的二噁烷 (500 μL)和H₂O (500 μL) 的混合溶液中，加入盐酸，调整至pH为 3左右。进行5 小时搅拌后，减压下蒸馏除去溶剂。将所得固体溶解于二噁烷 (500 μL)和H₂O (500μL)，加入25% 氨水，进行3 小时搅拌。减压下蒸馏除去溶剂，将所得结晶用二氯甲烷-甲醇的混合溶剂洗涤，由此得到标题化合物 3.1 mg (二阶段收率35%, 白色固体)。

(E)-苄基 5-((3aS,4S,6aR)-2,2-二甲基四氢噻吩并[3,4-d][1,3] 二氧杂环戊烯-4-基)-2-戊烯酸酯(33)

[化33]

在32 (10 mg, 0.047 mmol)的CH₂Cl₂ 500 μL 溶液中，加入丙烯酸苄酯 (70 μL,0.47 mmol) 和第二代 Hoveyda-Grubbs 催化剂 (3 mg, 4.7 mmol)，继续12 小时搅拌。减压下蒸馏除去溶剂，将所得粗产物通过硅胶柱色谱 (己烷-乙酸乙酯) 进行纯化，则得到标题化合物 10 mg (62%, 黄色油状)。

5-((3aS,4S,6aR)-2,2-二甲基四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)戊酸苄酯(34)

[化34]

在33(10 mg, 0.028 mmol)的EtOH 1 mL 溶液中，加入钯碳 (10 w/w% Pd, 10mol%, 5.0 mg)。在30 atm 的氢气存在下，在70 ℃继续2 小时搅拌。将反应液冷却至室温，使用硅藻土（Celite）的短柱，用乙醇进行洗脱。减压下蒸馏除去溶剂，所得粗产物不经过进一步纯化操作而用于后续反应。将所得粗产物通过硅胶柱色谱 (己烷-乙酸乙酯) 进行纯化，则得到标题化合物 6.5 mg (67%, 浅黄色油状)。

5-((2S,3S,4R)-3,4-二羟基四氢噻吩-2-基)戊酸(35)

[化35]

在34(2.5 mg, 7.1μmol)的CH₂Cl₂ 600 μL 溶液中，在-78℃加入1M 的三溴化硼(36 μL, 0.050 mmol)。在0℃进行3 小时搅拌后，加入饱和氯化铵水溶液，用乙酸乙酯提取。将有机层用饱和盐水洗涤并干燥后，减压下蒸馏除去溶剂。将所得粗产物通过硅胶柱色谱 (二氯甲烷-甲醇) 进行纯化，则得到标题化合物 1.2 mg (收率 76%, 无色油状)。

5-((3aS,4S,6aR)-2-氧化物四氢噻吩并[3,4-d][1,3,2]二氧杂硫杂环戊二烯-4-基)戊酸(36)

[化36]

在35(1.2 mg, 5.4 μmol)的CH₃CN 400μL 溶液中，在-78℃加入亚硫酰氯 (0.5μL, 7.2μmol)。在0℃进行3 小时搅拌后，加入饱和盐水，用CH₂Cl₂提取。将有机层用饱和盐水洗涤并干燥后，减压下蒸馏除去溶剂。将所得粗产物通过硅胶柱色谱 (二氯甲烷-甲醇) 进行纯化，则得到标题化合物 700μg (收率 48%, 非对映体混合物, dr = 2:1, 白色固体)。

4-((3aR,6S,7aR)-2-氧代六氢-2H-硫代吡喃并[3,4-d]噁唑-6-基)丁酸 (37)

[化37]

将化合物17溶解于MeOH中，使用催化量的Pd/C在氢气氛下进行搅拌，由此进行双键的还原。接着将所得化合物的酯部位在CH₃CN、H₂O混合溶剂下使用LiOH进行水解，由此得到37。

追加实施例1：生物素改变体的合成（追加）。

一般方法

核磁共振 (NMR) 光谱使用JEOL ECX500 (¹H NMR: 500MHz)、或JEOL ECS400(¹HNMR: 400MHz) 光谱仪进行测定。化学位移是作为相对于作为内部参照的氘代溶剂中的残留溶剂峰的值，以ppm记载（CDCl₃:δ= 7.26 ppm, CD₃OD:δ= 3.31 ppm, D₂O: δ= 4.79ppm）。低分辨质谱(LHMS)是利用Waters ZQ4000光谱仪，使用ESI-MS来测定。柱色谱是使用硅胶 Merk 60 (230-400 目 ASTM)来进行。反应通过薄层色谱(TLC)、或低分辨质谱(LRMS)来追踪。

反相高效液相色谱(HPLC)使用JASCO-HPLC系统来进行。使用210 nm 或 254 nm的紫外光进行检测，流动相使用梯度溶剂系 (乙腈/0.1% 三氟乙酸MQ溶液) 。对于分析，使用YMC-Pack ODS-AM (150×4.6 mL)的柱子，以流速 1 mL/min来进行。对于制备，使用YMC-Pack ODS-AM (250×20 mL)的柱子，以流速8-10 mL/min来进行。

试剂是由Aldrich、东京化成工业株式会社 (TCI)、关东化学株式会社 (Kanto)、和光纯药工业株式会社、渡边化学工业株式会社购入。全部试剂和溶剂若无特别说明则直接使用市售品。

(E)-(3S,4R)-5-[4-(叔丁氧基羰基氨基)-3-羟基二氢噻吩-2(3H)-亚基)]戊酸3-羟基-2-(羟基甲基)-2-甲基丙酯 (38)

[化38]

在15 (2.0 g, 4.53 mmol)的乙腈 (38 mL)、水 (7 mL)的混合溶液中，加入氟化银 (1.15 g, 9.06 mmol)，在室温进行16小时搅拌。将混合物通过硅胶短柱，用乙酸乙酯进行洗脱。将溶剂减压蒸馏除去后，将所得粗产物通过硅胶柱色谱 (己烷/乙酸乙酯＝1：1→1：2) 进行纯化，由此得到标题化合物38 (0.475 g，收率25%、黄色高粘性油状)。

(E)-(3aR,6aS)-2,2-二甲基-6-{5-氧代-5-[(2,2,5-三甲基-1,3-二噁烷-5-基)甲氧基]戊叉}四氢噻吩并[3,4-d]噁唑-3(2H)-甲酸叔丁酯 (39)

[化39]

在三元醇化合物38 (0.529 g, 1.26 mmol)和2,2-二甲氧基丙烷 (0.93 mL,7.56 mmol)的无水丙酮 (13 mL) 溶液中加入对甲苯磺酸一水合物 (12 mg, 0.063mmol)，将混合物在室温进行4小时搅拌。加入三乙基胺 (53μL, 0.378 mmol) 后，将溶剂减压蒸馏除去。将所得粗产物通过硅胶柱色谱 (己烷/乙酸乙酯＝4：1) 进行纯化，由此得到标题化合物39 (0.526 g、收率80%、无色油状)。

5-[(3aR, 6S, 6aS)-3-(叔丁氧基羰基)-2,2-二甲基六氢噻吩并[3,4-d]噁唑-6-基]戊酸 (42)

[化40]

在二丙酮化合物39 (0.310 g, 0.620 mmol) 的甲醇 (12 mL) 溶液中加入Pearlman催化剂 (10% 钯, 174 mg, 0.124 mmol)。封入氩气后，用氢气 (1大气压, 气球)置换，在室温进行8小时搅拌。将混合物通过硅藻土（Celite），用甲醇进行洗脱，除去Pearlman催化剂后，将溶剂减压蒸馏除去。将所得粗产物通过硅胶短柱，用己烷/乙酸乙酯＝4：1进行洗脱，由此得到双键被还原的化合物40和41的混合物。将该粗产物溶解于乙腈(6.2 mL)和水 (6.2 mL) 的混合溶剂后，加入2当量的氢氧化锂水溶液 (0.47 mL, 0.93mmol)，在室温进行6小时搅拌。将水层用二乙基醚洗涤后，加入2当量的盐酸调节为酸性(pH<5)。用乙酸乙酯提取，将有机层用饱和盐水洗涤。用硫酸钠干燥后，将溶剂减压蒸馏除去，将所得粗产物通过硅胶柱色谱 (己烷/乙酸乙酯＝2：1)进行纯化，由此得到标题化合物42(85 mg, 2阶段收率38%, 白色固体)。

6-{[(3aR, 6S, 6aS)-3-(叔丁氧基羰基)-2,2-二甲基六氢噻吩并[3,4-d]噁唑-6-基]戊酰胺}己酸 (44)

[化41]

在羧酸42 (48.5 mg,0.135 mmol) 和N-羟基琥珀酰亚胺 (18.6 mg, 0.162mmol)的N,N-二甲基甲酰胺 (1.4 mL) 溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐 (WSC･HCl, 31.1 mg, 0.162 mmol)，将混合物在室温进行6小时搅拌。将溶剂减压蒸馏除去后，溶解于乙酸乙酯，用少量的0.5当量的盐酸洗涤3次，用饱和盐水洗涤。用硫酸钠干燥后，将溶剂减压蒸馏除去，由此得到活性酯体43。将所得43溶解于二噁烷 (1.6mL) 和水 (0.5 mL) 的混合溶剂，加入6-氨基己酸 (42.1 mg, 0.321 mmol)，在室温进行9小时搅拌。将溶剂减压蒸馏除去，加入1当量的氢氧化钠水溶液，将水层用二乙基醚洗涤2次。在水层中加入1当量的盐酸调节为酸性(pH <5)，用乙酸乙酯提取，将有机层用饱和盐水洗涤。用硫酸钠干燥后，将溶剂减压蒸馏除去，将所得粗产物通过硅胶柱色谱 (二氯甲烷/甲醇＝10：1) 纯化，由此得到标题化合物44 (40 mg, 2阶段收率80%, 无色高粘性油状) 。

(3R, 4S, 5S)-5-[5-(5-羧基戊基氨基)-5-氧代戊基]-4-羟基四氢噻吩-3-氯化铵 (45)

[化42]

在羧酸44 (76.9 mg, 0.163 mmol)的二噁烷 (5 mL) 溶液中加入3当量的盐酸(5 mL) ，将混合物在室温进行2小时搅拌。将溶剂减压蒸馏除去后，用二乙基醚洗涤，将所得固体在减压下干燥，由此定量得到标题化合物45。在需要进一步纯化的情形中，进行硅胶柱色谱 (二氯甲烷/甲醇＝1：1)，由此可作为白色固体得到。

6-{5-[(3aR, 6S, 6aS)-2-氧代六氢噻吩并[3,4-d]噁唑-6-基]戊酰胺}己酸(46)

[化43]

在铵盐45 (15.0 mg, 0.0407 mmol)的四氢呋喃 (4 mL) 溶液中加入碳酸钾(16.9 mg, 0.122 mmol)和羰基二咪唑 (CDI, 9.9 mg, 0.0611 mmol) ，将混合物在80℃进行20小时搅拌。冷却至室温后，加入2当量的氢氧化钠水溶液 (30 μL) ，在室温进行2小时搅拌。加入水 (0.5 mL)，将水层分别用二乙基醚和乙酸乙酯洗涤各2次后，用2当量的盐酸调节为酸性(pH 3)。将溶剂减压蒸馏除去后，加入二氯甲烷/甲醇 (1:1) 的混合溶液，将固体过滤分离除去。将溶剂减压蒸馏除去，将所得粗产物通过反相HPLC (YMC-Pack ODS-AM, 梯度: 0-10-11-41-42-55 min; 0-0-21-51-100-100% CH₃CN 在0.1% TFA MQ中, 梯度time 30 min (21-51%), t_R = 30.2 min) 进行纯化，由此得到标题化合物46 (9.2 mg,2阶段收率63%, 白色固体)。

(3aR, 6S, 6aS)-6-[5-(5-羧基戊基氨基)-5-氧代戊基]四氢噻吩并[3,4-d]噁唑-2(3H)-亚胺2,2,2-三氟乙酸盐 (47)

[化44]

在铵盐45 (14.5 mg, 0.0393 mmol) 的甲醇 (2 mL) 溶液中加入乙酸钠 (9.7mg, 0.118 mmol)和溴化氰 (7.5 mg, 0.0707 mmol)，将混合物在室温进行20小时搅拌。加入2当量的氢氧化钠水溶液 (30 μL) ，在室温进行2小时搅拌。加入水 (0.5 mL)，将水层用二乙基醚洗涤2次后，用2当量的盐酸调节为酸性(pH 3)。将溶剂减压蒸馏除去后，加入二氯甲烷/甲醇 (1:1) 的混合溶液，将固体通过过滤分离除去。将溶剂减压蒸馏除去，将所得粗产物通过反相HPLC (YMC-Pack ODS-AM, 梯度: 0-10-11-41-42-55 min; 0-0-18-48-100-100% CH₃CN 在0.1% TFA MQ中, 梯度time 30 min (18-48%), t_R = 26.5 min) 进行纯化，由此得到标题化合物47 (9.2 mg, 2阶段收率50%, 白色固体)。

3-羟基-2-（羟基甲基）-2-甲基丙基5-（（3aR,6aS)-2-氧代四氢噻吩并[3,4-d]噁唑-6(6aH)-亚基)戊酸酯(16)

[化45]

在15 (78 mg, 0.21 mmol)的CH₂Cl₂ (2 mL)和H₂O (50 μL) 混合溶液中，缓慢滴加三氟乙酸 (2 ml) 。进行24 小时搅拌后，加入饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯提取。将有机层用饱和盐水洗涤并干燥后，减压下蒸馏除去溶剂。所得粗产物不进行进一步纯化操作而进行后续操作。

(2,2,5-三甲基-1,3-二噁烷-5-基)甲基 5-((3aR,6aS)-2-氧代四氢噻吩并[3,4-d]噁唑-6(6aH)-亚基)戊酸酯 (48)

[化46]

在含有16的粗纯化物、2,2-二甲氧基丙烷 (77 μL, 0.63 mmol)的丙酮 1 mL 溶液中加入对甲苯磺酸 (3.2 mg, 0.02 mmol)。在50 ℃继续10 小时搅拌后，加入三乙基胺90 μl。将溶液通过二氧化硅短柱，用乙酸乙酯和三乙基胺的混合溶剂进行洗涤。减压下蒸馏除去溶剂，将所得粗产物通过凝胶渗透色谱进行纯化，则得到标题化合物48(40 mg、二阶段收率 53%、无色油状)。

(2,2,5-三甲基-1,3-二噁烷-5-基)甲基 5-((3aR,6S,6aS)-2-氧代四氢噻吩并[3,4-d]噁唑-6-基)戊酸酯(50)

[化47]

在49 (1.5 mg, 3.9μmol)的MeOH (500 μL) 溶液中，加入第二代Hoveyda-Grubbs催化剂(0.8 mg, 1.6 μmol)。在30 atm 的氢气存在下，继续18 小时搅拌。将反应液冷却至室温，通过硅藻土（Celite）的短柱，用甲醇洗涤硅藻土（Celite）。减压下蒸馏除去溶剂，得到粗产物。

5-((3aR,6S,6aS)-2-氧代六氢噻吩并[3,4-d]噁唑-6-基)戊酸 (51)

[化48]

在含有50的粗纯化物的 CH₃CN (500 μL)和H₂O (500 μL) 的混合溶液中，加入氢氧化锂 (10 μmol)。进行12 小时搅拌后，用1 M 的盐酸停止反应，通过硅胶柱色谱，用甲醇洗涤。减压下蒸馏除去溶剂，将所得粗产物通过硅胶柱色谱 (二氯甲烷-甲醇) 进行纯化，则得到标题化合物51(700 μg、二阶段收率 73%、白色固体) 。

3-羟基-2-(羟基甲基)-2-甲基丙基 4-((3aR,7aR)-2-氧代-3,3a,4,7a-四氢-2H-硫代吡喃并[3,4-d]噁唑-6-基)丁酸酯 (17)

[化49]

在15 (50 mg, 0.13 mmol)的丙酮 (1 mL)和H₂O (100 μL) 混合溶液中，加入氟化银(I) (34 mg, 0.26 mmol)。进行9 小时搅拌后，用硅藻土（Celite）过滤，用乙酸乙酯进行洗脱。将所得粗产物通过硅胶柱色谱 (乙酸乙酯) 进行纯化，则标题化合物 17得到 38mg (收率 77%, 白色固体)。

3-羟基-2-(羟基甲基)-2-甲基丙基 4-((3aR,6S,7aR)-2-氧代六氢-2H-硫代吡喃并[3,4-d]噁唑-6-基)丁酸酯 (52)

[化50]

在17 (10 mg, 0.029 mmol) 、2-溴吡啶 (28 μL, 0.29 mmol)的MeOH 1 mL 溶液中加入氢氧化钯碳 (10 w/w% Pd, 40 mol%, 0.011 mmol)。在30 atm 的氢气存在下，继续24 小时搅拌。将反应液通过硅藻土（Celite）的短柱，用甲醇洗涤硅藻土（Celite）。减压下蒸馏除去溶剂，将所得粗产物通过硅胶柱色谱 (二氯甲烷-甲醇) 进行纯化，则得到标题化合物52 (7 mg、收率 69%、无色油状)。

[化51]

在52(2 mg, 5.4 μmol)的CH₃CN (500 μL)和H₂O(500 μL)的混合溶液中，加入氢氧化锂(10 μmol)。进行12 小时搅拌后，用1 M 的盐酸停止反应，通过硅胶柱色谱，用甲醇洗涤。减压下蒸馏除去溶剂，将所得粗产物通过硅胶柱色谱 (二氯甲烷-甲醇) 进行纯化，则得到标题化合物37（1.1 mg、收率 83%、白色固体)。

实施例2：突变体链霉亲和素的制造

（1）表达载体的构建

编码野生型核心链霉亲和素的基因的碱基序列示于序列表的SEQ ID No:1。此外，本发明中，作为低免疫原性（改变体）链霉亲和素，使用了国际公开WO2010/09455中记载的mcSA314（本说明书中，也称为LISA314WT或LISA314）。mcSA314是在SEQ ID No:2中记载的核心链霉亲和素的氨基酸序列中具有以下全部突变的链霉亲和素突变体。

（1）第10位氨基酸残基的酪氨酸替换为丝氨酸的突变；

（2）第71位氨基酸残基的酪氨酸替换为丝氨酸的突变；

（3）第72位氨基酸残基的精氨酸替换为赖氨酸的突变；

（4）第89位氨基酸残基的谷氨酸替换为天冬氨酸的突变；

（5）第91位氨基酸残基的精氨酸替换为赖氨酸的突变；和

（6）第104位氨基酸残基的谷氨酸替换为天冬酰胺的突变。

表达载体是以表达上述野生型链霉亲和素和改变体链霉亲和素与纯化用标签枯草杆菌蛋白酶原结构域部分的融合体蛋白的方式来进行设计。利用N’末端侧插入有枯草杆菌蛋白酶原结构域基因序列的载体、pPAL7载体（BIO-RAD社制），匹配密码子而制备表达野生型链霉亲和素或改变体链霉亲和素融合于C末端侧的蛋白的载体。

具体地，以上述序列为模板，使用通过PCR在5’端侧添加HindIII位点、在3’端侧添加EcoRI位点的下述的引物1和2，在PCR后通过限制酶HindIII、EcoRI进行处理。

引物1:（SEQ ID No:13）

引物2：（SEQ ID No:14）。

进行了限制酶处理的样品在电泳后，进行凝胶纯化。相同地，pPAL7载体（BIO-RAD社制）也实施酶处理，进行凝胶纯化。纯化得到的载体和PCR产物使用2xRapid LigationBuffer和T4DNA Polymerase（供にPromega社），以指定的方法实施连接。大肠杆菌的转化是对50微升的DH5α感受态细胞（TOYOBO社制）添加2微升的连接产物来实施。质粒的提取是使用Miniprep Kit（QIAGEN社制）来实施，对于所得质粒，通过序列分析来实施序列的确认。

（2）突变株制作

各变体制作中所用的寡聚DNA是以5’侧发生15个碱基重叠的方式，依照PrimerSTAR Mutagenesis Basal Kit（タカラバイオ）的说明书来设计。使用下述引物，以插入有 LISA314的pCold TF 载体为模板，通过定点诱变法利用碱基序列的替换来改变密码子序列，进行氨基酸序列的变换。然后，通过限制酶DpnI将模板质粒切断，进行大肠杆菌的转化。

引物：

（SEQ ID No:15）

（SEQ ID No:16）

（SEQ ID No:17）

（SEQ ID No:18）。

S45N意指SEQ ID No:2中记载的核心链霉亲和素的氨基酸序列中第33位氨基酸残基的丝氨酸（S）替换为天冬酰胺（N）的突变。

D128N意指SEQ ID No:2中记载的核心链霉亲和素的氨基酸序列中第116位天冬氨酸（D）替换为天冬酰胺（N）的突变。

通过上述，制作产生在SEQ ID No:2中记载的核心链霉亲和素的氨基酸序列中具有

（1）第10位氨基酸残基的酪氨酸替换为丝氨酸的突变；

（2）第71位氨基酸残基的酪氨酸替换为丝氨酸的突变；

（3）第72位氨基酸残基的精氨酸替换为赖氨酸的突变；

（4）第89位氨基酸残基的谷氨酸替换为天冬氨酸的突变；

（5）第91位氨基酸残基的精氨酸替换为赖氨酸的突变；

（6）第104位氨基酸残基的谷氨酸替换为天冬酰胺的突变；

（7）第33位氨基酸残基的丝氨酸替换为天冬酰胺的突变；和

（8）第116位天冬氨酸替换为天冬酰胺的突变

的突变体链霉亲和素（本文中，也称为LISA314 N45 N128）的大肠杆菌。SEQ IDNo:2中记载的氨基酸序列中具有上述（1）～（8）的突变的氨基酸序列示于SEQ ID No:3。

（3）重组蛋白的表达

将插入有突变体链霉亲和素的基因序列的pPAL7表达载体依照常法对大肠杆菌BL21（BIO-RAD社）进行转染。蛋白的表达如下所述实施。即，在37度进行培养，直至大肠杆菌培养液的细胞密度为OD（600nm）0.5-0.7，以最终浓度为1mM的方式添加IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷），诱导蛋白表达，在10℃～30℃、优选16℃进行24小时以上的培养。培养后，通过离心分离菌体收集细胞，在负20℃下保存，直至蛋白纯化。

（4）重组蛋白的粗纯化

重组蛋白（LISA314-V11）的粗纯化是进行利用改变枯草杆菌蛋白酶与枯草杆菌蛋白酶原结构域的结合性的亲和层析。具体地，使用了将改变枯草杆菌蛋白酶固定于Sperflow 6% 琼脂糖珠上的柱（Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridge, BIO-RAD社）。

大肠杆菌的制备中，添加作为细胞裂解液的10mM 磷酸钠, pH7.2 - 5.6、10xBugBuser 试剂 (Novagen)、核酸分解酶（Benzonase），进行细胞的裂解。裂解在室温下进行，裂解得到的液体进行35,000xg、30分钟的离心分离。离心分离后将上清作为可溶性总蛋白。

将结合缓冲液・洗涤缓冲液1：10 mM 磷酸钠、洗涤缓冲液2：10 M 磷酸钠, 300mM、洗脱缓冲液：10 M 乙酸钠, 100 mM 氟化钠、柱再生缓冲液：100 mM 磷酸、柱保存缓冲液：10 mM 磷酸钠用于纯化。需要说明的是，对于缓冲液pH，天然型链霉亲和素的纯化中调节为pH6.1，改变体链霉亲和素的纯化中调节为pH6.8。

纯化通过以下步骤进行。

用10柱体积的缓冲液对柱进行平衡。接着，将大肠杆菌的可用性总蛋白以2ml/min的流速对柱上样。对柱上样后用10柱体积的洗涤缓冲液1对柱进行洗涤。接着用10柱体积的洗涤缓冲液2进行柱的洗涤。然后，注入1柱体积的洗脱缓冲液，在室温进行30分钟孵育。孵育后，用洗脱缓冲液3柱体积进行蛋白的洗脱。然后，用5柱体积的柱再生缓冲液进行柱的再生。最后用5柱体积的柱保存缓冲液对柱进行洗涤，结束纯化。

纯化的结果示于图1。

（5）经粗纯化的重组蛋白的高纯度化纯化

以下，对于缓冲液的pH，改变体链霉亲和素则设为pH7.0。

对于经粗纯化的重组蛋白，作为利用陶瓷羟磷灰石柱的纯化的准备，使用10,000MWCO的超滤膜通过离心过滤进行浓缩。浓缩后使用脱盐柱，将缓冲液替换为5 mM 磷酸钠溶液。陶瓷羟磷灰石柱使用CHT2-1(BIO-RAD社)，全部操作均在流速2ml/min下进行。起初用10柱体积的5mM磷酸钠进行柱的平衡。接着上样进行了缓冲液替换的粗纯化样品，使之吸附于柱。进行6柱体积的洗涤后，用5mM 磷酸钠、500mM 氯化钠缓冲液进行蛋白的洗脱。

实施例3：与生物素-HRP标记体的竞争分析

在ELISA用板H（住友ベークライト）中将经纯化的突变体蛋白按照5μg/mL、100μl、4℃过夜的条件进行固相化。固相化后，使用SuperBlock Bloking Buffer（サーモサイエンティフィック社）进行200μl/孔、5分钟的封闭。然后，按照10μM、100μl/孔使实施例1中记载的化合物11(即，(3aS,4S,6aR)-2-氧代四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)戊酸）在室温反应1小时。洗涤后，按照12.5nM、100μl/孔，在室温使生物素-HRP标记体反应1小时。洗涤后，按照100μl/孔，在室温反应30分钟。比较显色的程度，结果（图2）确认到化合物11与标记体发生竞争的状况。

实施例4：LISA314变体的制造

（1）LISA314变体的表达载体的制备

引物：

（SEQ ID No:19）

（SEQ ID No:20）。

作为LISA314变体的LISA314 V21对LISA314进一步具有N23D、S27D突变。N23D意指SEQ ID No:2中记载的核心链霉亲和素的氨基酸序列中第11位氨基酸残基的天冬酰胺（N）替换为天冬氨酸（D）的突变。S27D意指SEQ ID No:2中记载的核心链霉亲和素的氨基酸序列中第15位氨基酸残基的丝氨酸（S）替换为天冬氨酸（D）的突变。

即，LISA314 V21是在SEQ ID No:2中记载的核心链霉亲和素的氨基酸序列中具有

（1）第10位氨基酸残基的酪氨酸替换为丝氨酸的突变；

（2）第71位氨基酸残基的酪氨酸替换为丝氨酸的突变；

（3）第72位氨基酸残基的精氨酸替换为赖氨酸的突变；

（4）第89位氨基酸残基的谷氨酸替换为天冬氨酸的突变；

（5）第91位氨基酸残基的精氨酸替换为赖氨酸的突变；

（6）第104位氨基酸残基的谷氨酸替换为天冬酰胺的突变；

（7）第11位氨基酸残基的天冬酰胺替换为天冬氨酸的突变；

（8）第15位氨基酸残基的丝氨酸替换为天冬氨酸的突变

的突变体链霉亲和素，该氨基酸序列示于SEQ ID No:4。

（2）重组蛋白的表达

各突变体蛋白的表达依照pCold TF载体（タカラバイオ）的指南来实施。具体地，将表达载体依照常法对大肠杆菌BL21（タカラバイオ）进行转化，在37度进行培养，直至大肠杆菌培养液的细胞密度为OD（600nm）＝ 0.5-0.7，然后在15度进行1小时静置，以最终浓度为1mM的方式添加IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷），诱导蛋白表达，在15度进行24小时的培养。培养后，通过离心分离菌体收集细胞，在负20℃下保存，直至蛋白纯化。

（3）重组蛋白的粗纯化

重组蛋白的粗纯化是进行使用6xHis-tag的亲和层析。具体地，使用Ni Sepharose6 Fast Flow（GEヘルスケア）作为担载体。

大肠杆菌的制备中，将作为细胞裂解液的B-PER（Thermo SCIETIFIC）、LisonaseBioprocessing Reagent按照B-PER每1mL添加3mL的Lisonase Bioprocessing Reagent来进行细胞的裂解。裂解在室温下进行，裂解得到的液体进行27，000xg、20分钟的离心分离。离心分离后，将上清作为可溶性总蛋白。

用10柱体积的结合/洗涤缓冲液（20mM Tris-NaCl、500mM NaCl、pH8）进行柱的平衡化和样品上样后的柱的洗涤。此外，用3柱体积的洗脱缓冲液（20mM Tris-NaCl、500mMNaCl、400mM 咪唑、pH8）进行结合蛋白的洗脱。

（4）TF标签的切断和除去

对于5μg的粗纯化蛋白，使用5U的HRV 3C 蛋白酶进行标签的切断。在4℃反应24小时后，用变性缓冲液（20mM Tris-NaCl、6M胍盐酸盐、500mM NaCl、pH8）进行变性，进行使用了Ni Sepharose 6 Fast Flow的亲和层析。

实施例5：结晶结构分析

（1）结晶化条件

LISA314―生物素

使用坐滴蒸气扩散法，在20 ℃进行结晶化(图3)。蛋白溶液设为 9 mg/mlLISA314, 15 mM tris-HCl pH7.5, 150 mM NaCl。生物素是在 LISA314纯化中途过量添加。结晶化母液(60 μl)使用 0.2 M 硫酸铵, 0.1 M 三水乙酸钠 pH5.2, 22% (w/v) 聚乙二醇 4000，结晶化内液设为混合蛋白溶液0.5 μl, 结晶化母液0.5 μl而得的混合液。

LISA314-V21―亚氨基生物素尾（iminobiotintail）

使用坐滴蒸气扩散法，在20 ℃进行结晶化。蛋白溶液设为 10 mg/ml LISA314-V21, 20 mM tris-HCl pH7.5, 250 mM NaCl。亚氨基生物素尾（实施例1的化合物29，以下示出结构）是在LISA314-V21纯化中途过量添加。

[化52]

结晶化母液(60 μl)使用0.1 M 三水乙酸钠 pH4.5, 30% (w/v) 聚乙二醇 1500，结晶化内液设为混合蛋白溶液0.5 μl, 结晶化母液0.5 μl而得的混合液。

（2）结果

结晶结构的分析结果示于图4和图5。

据报道，链霉亲和素的与生物素形成氢键的第23位（SEQ ID No:2中记载的核心链霉亲和素的氨基酸序列中第11位）的氨基酸Asn23替换为Ala而得的N23A的突变型链霉亲和素与生物素的结合力大幅降低。此外，还报道有该突变型链霉亲和素的与生物素形成复合体的结晶结构（PDB ID、1N43。对于1N43的立体结构和N23A的附近，将我们的LISA314的结晶结构进行比较，则LISA314中Asn23与附近的Gly26形成氢键而发生相互作用（用连接图4右上的LISA314的N23与G26的虚线、空白箭头来表示）。另一方面，1N43中，Ala23与Gly26上不存在与之相当的氢键（图4左下的1N43的黑色箭头所示的部分）。因此，认为与LISA314相比，1N43中的N23A突变使得从N23至S27的环结构变得不稳定，认为通过实施N23D突变，该第23位（SEQ ID No:2中记载的核心链霉亲和素的氨基酸序列中第11位）的氨基酸与Gly26的氢键得到维持，不是使从N23至S27的环结构变得稳定吗？实际上，如图4右下所示，实施了N23D突变的LISA314-V21的结晶结构中，保留了该氢键（空白箭头所示的虚线）。期待突变型链霉亲和素LISA314-V21与亚氨基生物素而非生物素的相互作用变强，而进行制作。因此，除了N23D突变之外还实施S27D突变，LISA314-V21的Asp27与亚氨基生物素的N原子发生相互作用。

实施例6：利用SPR的亲和力分析

（1）表达载体的构建（LISA314 V21；N23D、S27等）

利用Biacore的亲和力分析中使用的蛋白是通过pET-21a（＋）载体（ミリポア・メルク社）表达，将内含体复性从而制备重组蛋白。具体地，对于pET-21a（＋）载体，使用限制酶BamHI和XhoI进行直链化。接着，设计与依照In-Fusion HD Cloning Kit（クローンテック社）的指南实施直链化的载体对应的PCR引物，以前述各变体LISA314 V21表达载体（pColdTF）为模板实施PCR。扩增的序列通过琼脂糖凝胶电泳切出目标条带，提取DNA进行纯化。将直链化的载体和纯化的PCR产物用In-Fusion HD Cloning Kit进行连接。

引物：

对于（SEQ ID No:21）

对于（SEQ ID No:22）。

（2）LISA314 V21 变体表达载体的构建

LISA314 V21的各种变体制作中所用的寡聚DNA是以5’侧发生15个碱基重叠的方式，依照PrimerSTAR Mutagenesis Basal Kit（タカラバイオ）的说明书来设计。使用以下引物，以插入有上述LISA314 V21的载体为模板，通过定点诱变法利用碱基序列的替换来改变密码子序列，进行氨基酸序列的变换。然后，通过限制酶DpnI将模板质粒切断，进行大肠杆菌的转化。

引物

（SEQ ID No:23）

（SEQ ID No:24）

（SEQ ID No:25）

（SEQ ID No:26）

（SEQ ID No:27）

（SEQ ID No:28）

（SEQ ID No:29）

（SEQ ID No:30）

（SEQ ID No:31）

（SEQ ID No:32）

（SEQ ID No:33）

（SEQ ID No:34）

（SEQ ID No:35）

（SEQ ID No:36）

（SEQ ID No:37）

（SEQ ID No:38）。

S45A、S45Q、S45L、S45I、S45H、S45T、S45V、和S45N各自显示在SEQ ID No:2中记载的核心链霉亲和素的氨基酸序列中第33位氨基酸残基的丝氨酸替换为丙氨酸（A）、谷氨酰胺（Q）、亮氨酸（L）、异亮氨酸（I）、组氨酸（H）、苏氨酸（T）、缬氨酸（V）和天冬酰胺（N）。即，制造了对LISA314 V21进一步导入了上述S45A、S45Q、S45L、S45I、S45H、S45T、S45V和S45N的任一氨基酸突变的突变体。这些突变体的氨基酸序列示于序列表的SEQ ID No:5～12。

（3）重组蛋白的表达

各突变体蛋白的表达是：将插入有目标变体表达基因的pET-21a（＋）载体依照常法对大肠杆菌BL21（DE3）（ミリポア・メルク社）进行转化，在37度进行培养直至大肠杆菌培养液的细胞密度为OD（600nm）＝0.5-0.8，以最终浓度为1mM的方式添加IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷），诱导蛋白表达。以4-16小时培养之后，通过离心分离菌体来收集细胞，在负20℃下保存直至蛋白纯化。

（4）重组蛋白（内含体）的制备

大肠杆菌的制备中，将作为细胞裂解液的B-PER（Thermo SCIETIFIC）、LisonaseBioprocessing Reagent按照B-PER每1mL添加3mL的Lisonase Bioprocessing Reagent来进行细胞的裂解。裂解在室温下进行，裂解得到的液体进行27，000xg、20分钟的离心分离。离心分离后，废弃上清并将团粒作为内含体回收。将回收的内含体在用MilliQ水进行了10倍稀释的B-PER10mL中再悬浮，通过27，000xg、20分钟的离心分离进行再回收，该洗涤操作进行3次。最后为了除去表面活性剂而利用MilliQ进行再悬浮，通过离心分离进行回收。回收的内含体分成小份分注，在负80℃冷冻保存。

（5）内含体的重折叠

内含体的重折叠是将冷冻保存的内含体用变性缓冲液（20mM Tris-HCl、6M胍盐酸盐、200mM NaCl、pH1.5）进行可溶化。为了进行生物素的除去而对100倍体积的透析缓冲液（与变性缓冲液相同）实施4小时、2次。然后，以可溶化的溶液的吸光度280nm的蛋白浓度为40-50mg/mL的方式用透析缓冲液调节浓度。重折叠使用稀释法。具体地，在用搅拌器搅拌着的50mL稀释缓冲液（20mM Tris-HCl、200mM NaCl、pH8.0）中滴加调节了浓度的蛋白溶液100微升进行稀释，由此进行重折叠。

（6）重折叠蛋白的纯化

通过稀释法进行了重折叠的蛋白，使用cOmplete His-Tag Purification Resin（ロシュ社）实施亲和层析。对这些纯化蛋白进行浓缩，通过凝胶过滤色谱实施4聚体级分的制备。

重折叠蛋白的纯化的一例示于图6。

（7）利用SPR的与化合物的亲和力分析

亲和力分析中使用了Biacore T100。具体地，将通过凝胶过滤色谱制备的蛋白用Sensor Chip NTA进行固定化。工作缓冲液使用了0.5% Tween20、HBS-P＋。镍的对NTA的固定化、配体的捕获通过附属的模板程序来实施。

（8）Biacore测定

为了抑制质量传递限制（mass transport limitation）而使配体在传感器芯片上的固定化量落于1608RU～8042RU的范围。分析物使用了生物胞素和实施例1中合成的化合物29（结构如下所示）。需要说明的是，生物胞素是生物素的主要存在形态。

[化53]

（生物胞素）

（化合物29）。

对于分析物的浓度，生物胞素的情形是从1μM进行2倍稀释制备8个系列，化合物29的情形是从16μM进行2倍稀释制备12个系列。测定是以流速30μl/分钟、接触时间为120秒、解离时间为600秒进行测定。数据分析是将全浓度传感图输入分析软件，进行平衡值分析，进行离解常数KD的计算。其图表示于图7～图9，算出的KD值示于表1。结果可知，LISA314V21与化合物29的相互作用是与生物胞素的相互作用的约2倍左右强。

[表1]

	离解常数：KD（M)
		生物胞素和LISA314　WT	2.378E-9
生物胞素和LISA314　V21	3.480E-7
		化合物29和LISA314　V21	1.540E-7

序列表

<110> Molecular Dinamics for Antibody Drug Development AllianceCooperation

<120> 生物素改变体、链霉亲和素突变体和它们的用途

<130> 141213A

<160> 38

<210> 1

<211> 381

<212> DNA

<213> 卵白链霉菌(Streptomyces avidinii)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(381)

<400> 1

gcc gaa gct ggt atc act ggc acc tgg tat aac caa ctg ggg tcg act 48

Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr

1 5 10 15

ttc att gtg acc gct ggt gcg gac gga gct ctg act ggc acc tac gaa 96

Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu

20 25 30

tct gcg gtt ggt aac gca gaa tcc cgc tac gta ctg act ggc cgt tat 144

Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr

35 40 45

gac tct gca cct gcc acc gat ggc tct ggt acc gct ctg ggc tgg act 192

Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr

50 55 60

gtg gct tgg aaa aac aac tat cgt aat gcg cac agc gcc act acg tgg 240

Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp

65 70 75 80

tct ggc caa tac gtt ggc ggt gct gag gct cgt atc aac act cag tgg 288

Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp

85 90 95

ctg tta aca tcc ggc act acc gaa gcg aat gca tgg aaa tcg aca cta 336

Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu

100 105 110

gta ggt cat gac acc ttt acc aaa gtt aag cct tct gct gct agc 381

Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

115 120 125

<210> 2

<211> 127

<212> PRT

<213> 卵白链霉菌

<400> 2

Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr

1 5 10 15

Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu

20 25 30

Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr

35 40 45

Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr

50 55 60

Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp

65 70 75 80

Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp

85 90 95

Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu

100 105 110

Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

115 120 125

<210> 3

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 重组肽

<400> 3

Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Ser Asn Gln Leu Gly Ser Thr

1 5 10 15

Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu

20 25 30

Asn Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr

35 40 45

Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr

50 55 60

Val Ala Trp Lys Asn Asn Ser Lys Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp

65 70 75 80

Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Asp Ala Lys Ile Asn Thr Gln Trp

85 90 95

Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Asn Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu

100 105 110

Val Gly His Asn Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

115 120 125

<210> 4

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 重组肽

<400> 4

Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Ser Asp Gln Leu Gly Asp Thr

1 5 10 15

Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu

20 25 30

Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr

35 40 45

Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr

50 55 60

Val Ala Trp Lys Asn Asn Ser Lys Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp

65 70 75 80

Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Asp Ala Lys Ile Asn Thr Gln Trp

85 90 95

Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Asn Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu

100 105 110

Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

115 120 125

<210> 5

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 重组肽

<400> 5

Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Ser Asp Gln Leu Gly Asp Thr

1 5 10 15

Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu

20 25 30

Ala Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr

35 40 45

Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr

50 55 60

Val Ala Trp Lys Asn Asn Ser Lys Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp

65 70 75 80

Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Asp Ala Lys Ile Asn Thr Gln Trp

85 90 95

Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Asn Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu

100 105 110

Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

115 120 125

<210> 6

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 重组肽

<400> 6

Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Ser Asp Gln Leu Gly Asp Thr

1 5 10 15

Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu

20 25 30

Gln Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr

35 40 45

Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr

50 55 60

Val Ala Trp Lys Asn Asn Ser Lys Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp

65 70 75 80

Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Asp Ala Lys Ile Asn Thr Gln Trp

85 90 95

Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Asn Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu

100 105 110

Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

115 120 125

<210> 7

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 重组肽

<400> 7

Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Ser Asp Gln Leu Gly Asp Thr

1 5 10 15

Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu

20 25 30

Leu Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr

35 40 45

Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr

50 55 60

Val Ala Trp Lys Asn Asn Ser Lys Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp

65 70 75 80

Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Asp Ala Lys Ile Asn Thr Gln Trp

85 90 95

Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Asn Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu

100 105 110

Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

115 120 125

<210> 8

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 重组肽

<400> 8

Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Ser Asp Gln Leu Gly Asp Thr

1 5 10 15

Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu

20 25 30

Ile Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr

35 40 45

Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr

50 55 60

Val Ala Trp Lys Asn Asn Ser Lys Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp

65 70 75 80

Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Asp Ala Lys Ile Asn Thr Gln Trp

85 90 95

Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Asn Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu

100 105 110

Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

115 120 125

<210> 9

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 重组肽

<400> 9

Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Ser Asp Gln Leu Gly Asp Thr

1 5 10 15

Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu

20 25 30

His Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr

35 40 45

Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr

50 55 60

Val Ala Trp Lys Asn Asn Ser Lys Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp

65 70 75 80

Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Asp Ala Lys Ile Asn Thr Gln Trp

85 90 95

Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Asn Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu

100 105 110

Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

115 120 125

<210> 10

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 重组肽

<400> 10

Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Ser Asp Gln Leu Gly Asp Thr

1 5 10 15

Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu

20 25 30

Thr Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr

35 40 45

Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr

50 55 60

Val Ala Trp Lys Asn Asn Ser Lys Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp

65 70 75 80

Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Asp Ala Lys Ile Asn Thr Gln Trp

85 90 95

Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Asn Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu

100 105 110

Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

115 120 125

<210> 11

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 重组肽

<400> 11

Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Ser Asp Gln Leu Gly Asp Thr

1 5 10 15

Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu

20 25 30

Val Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr

35 40 45

Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr

50 55 60

Val Ala Trp Lys Asn Asn Ser Lys Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp

65 70 75 80

Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Asp Ala Lys Ile Asn Thr Gln Trp

85 90 95

Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Asn Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu

100 105 110

Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

115 120 125

<210> 12

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 重组肽

<400> 12

Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Ser Asp Gln Leu Gly Asp Thr

1 5 10 15

Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu

20 25 30

Asn Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr

35 40 45

Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr

50 55 60

Val Ala Trp Lys Asn Asn Ser Lys Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp

65 70 75 80

Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Asp Ala Lys Ile Asn Thr Gln Trp

85 90 95

Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Asn Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu

100 105 110

Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

115 120 125

<210> 13

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成DNA

<400> 13

gctcttcaaa gctttggccg aagctggtat cactg 35

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成DNA

<400> 14

ctcgaggaat tcttagctag cagcagaagg cttaac 36

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成DNA

<400> 15

tatgaaaacg ccgtgggtaa tgcggaa 27

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成DNA

<400> 16

cacggcgttt tcataggtgc cggtcag 27

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成DNA

<400> 17

cgttggcggt gctgatgctc gtatcaacac 30

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成DNA

<400> 18

ggtgctgatg ctaagatcaa cactcagtgg丂 30

<210> 19

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成DNA

<400> 19

tggagcgatc agctgggcga taccttt 27

<210> 20

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成DNA

<400> 20

cagctgatcg ctccaggtgc cggtaat丂 27

<210> 21

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成DNA

<400> 21

aatgggtcgc ggatccgccg aagcaggtat taccggcac 39

<210> 22

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成DNA

<400> 22

ggtggtggtg ctcgaggctg gccgcgctcg gtttaacttt 41

<210> 23

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成DNA

<400> 23

tatgaagcag ccgtgggtaa tgcggaa 27

<210> 24

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成DNA

<400> 24

cacggctgct tcataggtgc cggtcag 27

<210> 25

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成DNA

<400> 25

tatgaacagg ccgtgggtaa tgcggaa 27

<210> 26

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成DNA

<400> 26

cacggcctgt tcataggtgc cggtcag 27

<210> 27

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成DNA

<400> 27

tatgaactgg ccgtgggtaa tgcggaa 27

<210> 28

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成DNA

<400> 28

cacggccagt tcataggtgc cggtcag 27

<210> 29

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成DNA

<400> 29

tatgaaattg ccgtgggtaa tgcggaa 27

<210> 30

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成DNA

<400> 30

ctgaccggca cctatgaaat tgccgtg 27

<210> 31

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成DNA

<400> 31

tatgaacatg ccgtgggtaa tgcggaa 27

<210> 32

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成DNA

<400> 32

cacggcatgt tcataggtgc cggtcag 27

<210> 33

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成DNA

<400> 33

tatgaaaccg ccgtgggtaa tgcggaa 27

<210> 34

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成DNA

<400> 34

cacggcggtt tcataggtgc cggtcag 27

<210> 35

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成DNA

<400> 35

tatgaagtgg ccgtgggtaa tgcggaa 27

<210> 36

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成DNA

<400> 36

cacggccact tcataggtgc cggtcag 27

<210> 37

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成DNA

<400> 37

tatgaaaacg ccgtgggtaa tgcggaa 27

<210> 38

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成DNA

<400> 38

cacggcgttt tcataggtgc cggtcag 27

Claims

1.链霉亲和素突变体，其含有SEQ ID No:4至12中任一者所记载的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述的链霉亲和素突变体的DNA。

3.链霉亲和素突变体-分子探针结合物，其是通过使分子探针与权利要求1所述的链霉亲和素突变体结合而得的。

4.治疗剂或体内或体外诊断剂，其含有权利要求3所述的链霉亲和素突变体-分子探针结合物。

5.治疗或体内或体外诊断试剂盒，其含有：

（a）权利要求3所述的链霉亲和素突变体―分子探针结合物；和

（b）经下述式（1）所示的化合物标记的体内或体外诊断用或治疗用物质，

所述式（1）所示的化合物为

式中，X1和X2各自独立地表示O或NH，Y表示C或S，Z表示O、S或NH，V表示S或S^＋-O^-，n表示0或1的整数，m表示1至10的整数，W表示-OH、-NH（CH₂）_pCOOH、或-NH（CH₂）_qCH（NH₂）COOH；其中，p和q各自独立地表示1至10的整数。

6.权利要求5所述的治疗或体内或体外诊断试剂盒，其中，所述式（1）所示的化合物是n为0的下述式（2）所示的化合物，

式中，X1、X2、Y、Z、V、m、和W与权利要求5中含义相同。

7.治疗或体内或体外诊断试剂盒，其含有：

（b）经下述的任一化合物标记的体内或体外诊断用或治疗用物质，

。

8.用于治疗或体内或体外诊断的试剂盒，其含有：

（a）链霉亲和素突变体、和

（b）生物素改变体，

所述链霉亲和素突变体含有SEQ ID No:4至12中任一者所记载的氨基酸序列，

所述生物素改变体是下述式（1）所示的化合物，

9.治疗或体内或体外诊断试剂盒，其含有：

（a）链霉亲和素突变体与分子探针的结合物、和

（b）经生物素改变体标记的体内或体外诊断用或治疗用物质，

所述生物素改变体是下述式（1）所示的化合物，