CN116041482B - 一种结构肽段的cDNA、结构肽段和制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种结构肽段的cDNA、结构肽段和制备方法及应用；所述cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述方法包括：向宿主菌体中导入所述载体，得到重组菌体；培养所述重组菌体并诱导蛋白表达，后进行提取和纯化，并进行酶切，得到结构肽段；所述应用包括将所述结构肽段用于筛选结合了和/或激活了EGFR的有毒金属中的应用；根据选取的多肽肽段的基因序列进行综合设计，剔除掉基因序列中的内含子，从而得到结构肽段的cDNA片段，由于设计的cDNA片段能够转化并表达出包含多个半胱氨酸残基的结构肽段，而含有多个半胱氨酸残基的结构肽段能够结合有毒金属，从而实现EGFR蛋白同有毒金属的结合，利用这一结合特性可以对有毒金属进行筛选。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种结构肽段的cDNA、结构肽段和制备方法及应用。
背景技术
表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)是表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)家族的细胞外蛋白受体，它广泛分布于如上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等多种哺乳动物细胞表面。EGFR是一种跨膜糖蛋白，属于酪氨酸激酶型受体，其N端位于细胞外，是富含半胱氨酸(Cysteine，Cys)的结构域，可与EGF、TGFα(Transforming Growth Factorα，TGFα)等配体结合，导致受体二聚化，并激活EGFR的酪氨酸激酶活性。当酪氨酸残基发生进一步构象改变时，EGFR即作为多种下游信号蛋白的锚定位点，从而启动相关信号传导，导致细胞凋亡、增殖、侵袭和转移，以上均为癌症发生、发展的关键。由于配体结合并磷酸化激活EGFR过程往往是细胞恶性转化中的起始事件，因此，配体/EGFR途径也被认为是癌症研究的中心。
目前与配体/EGFR途径的癌症研究相关的是慢性有毒金属相关的癌症，由于人体在慢性有毒金属的环境中暴露后，在人体内会诱导产生毒性和致癌性，同时许多重要的癌症相关通路被激活，例如HIF-1α、NF-κB、RAS和PI3K-Akt。据报道长期砷暴露的环境与肺癌、肝癌、膀胱癌、肾癌、皮肤癌等癌症疾病相关；同时镉被归为一类人类肺癌致癌物，且在前列腺癌、肾癌、肝癌、膀胱癌和胃癌中也起着重要的作用；慢性铅暴露的环境则会引发淋巴癌，目前有针对蛋白中的半胱氨酸残基和部分金属结合的报道，但是并未有毒金属和EGFR上的半胱氨酸残基结合形成金属-EGFR复合物的相关报道，同时也没有利用该金属-EGFR复合物对有毒金属进行筛选的报道。
因此如何提供一种结构肽段的cDNA，以实现利用结构肽段和有毒金属结合的特性对有毒金属进行筛选。
发明内容
本申请提供了一种结构肽段的cDNA、结构肽段和制备方法及应用，以解决现有技术中暂未有利用结构肽段和有毒金属结合的特性对有毒金属进行筛选的问题。
第一方面，本申请提供一种结构肽段的cDNA，所述cDNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
第二方面，本申请提供了一种载体，所述载体包括第一方面所述的cDNA的核苷酸序列。
第三方面，本申请提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括第一方面所述的cDNA的核苷酸序列或第二方面所述的载体。
第四方面，本申请提供了一种结构肽段，所述结构肽段由第三方面所述的宿主细胞表达得到。
可选的，所述结构肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
第五方面，本申请提供了一种制备第四方面所述的结构肽段的方法，所述方法包括：
向宿主菌体中导入第二方面所述的载体，得到重组菌体；
培养所述重组菌体并诱导蛋白表达，后进行提取和纯化，并进行酶切，得到结构肽段。
可选的，所述导入的方式包括热激法、电穿孔法和化学转化法中的至少一种。
第六方面，本申请提供了一种结构肽段的应用，所述应用包括将第四方面所述的结构肽段用于筛选结合了和/或激活了EGFR的有毒金属中的应用。
本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本申请实施例提供的一种结构肽段的cDNA，根据EGFR蛋白的特征多肽区域进行设计，避开EGFR的主功能区域的同时选取多个靠近且游离半胱氨酸残基的多肽肽段，并根据选取的多肽肽段的基因序列进行综合设计，剔除掉基因序列中的内含子，从而得到结构肽段的cDNA片段，由于设计的cDNA片段能够转化并表达出包含多个半胱氨酸残基的结构肽段，而含有多个半胱氨酸残基的结构肽段能够结合有毒金属，从而实现EGFR蛋白同有毒金属的结合，利用这一结合特性可以对有毒金属进行筛选。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本申请的实施例，并与说明书一起用于解释本申请的原理。
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的制备方法的流程示意图；
图2为本申请实施例所构建的表达载体pGEX6P-1-E1的示意图；
图3为本申请实施例提供的E1基因表达GST标签融合蛋白纯化后对目标组检测图；
图4为带GST标签融合蛋白酶切后得到目的蛋白示意图；
图5为本申请实施例提供的部分目的蛋白E1测序肽段的结果示意图；
图6为本申请实施例提供的部分目的蛋白E1测序肽段的结果示意图；
图7为本申请实施例提供的部分目的蛋白E1测序肽段的结果示意图；
图8为本申请实施例提供的有毒金属As以NaAsO2的形式与蛋白E1作用的结果数据图；
图9为本申请实施例提供的有毒金属Hg以HgCl2的形式与蛋白E1作用的结果数据图；
图10为本申请实施例提供的有毒金属Pb以PbCl2的形式与蛋白E1作用的结果数据图；
图11为本申请实施例提供的有毒金属暴露HaCaT细胞后磷酸化EGFR的WB结果图；
图12为本申请实施例提供的有毒金属暴露HaCaT细胞后磷酸化EGFR的WB结果分析图。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
除非另有特别说明，本申请中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本申请的创造性思维为：
已有研究明确了蛋白中的半胱氨酸残基可与部分金属结合，其中巯基位点(–SH)与亲硫金属(如汞、砷、镉、铜和铅)的亲和力特别高，而当金属占据锌离子上的金属结合位点时，它们与半胱氨酸残基配位，形成R-S键，其为与半胱氨酸残基上巯基相互作用的关键，同时致癌性金属(如镉、铅)大多为软酸性，半胱氨酸残基则显示碱性，又软酸与软碱能通过配位形成稳定的配合物，且致癌性金属中的亲硫金属(如汞、砷、镉)形成的金属-巯基的稳定常数通常比相应的金属-羧基和金属-磷酰基络合物高几个数量级。
因此合理推测这些致癌性金属能够作为配体与EGFR上的半胱氨酸残基结合，导致EGFR磷酸化，从而启动配体/EGFR的致癌途径。
因此通过研究EGFR和有毒金属结合的结构肽段，对于筛选有潜在致癌风险的有毒金属具有重要意义。
本申请实施例提供一种结构肽段的cDNA，所述cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
如图2所示，基于一个总的发明构思，本申请实施例还提供一种载体，所述载体包括所述cDNA的核苷酸序列。
该载体是基于上述的cDNA的来实现其功能的，该载体的具体功能性核苷酸的组成可参照上述实施例，由于该载体中包括了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。
基于一个总的发明构思，本申请实施例还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包括所述cDNA的核苷酸序列或所述载体。
该宿主细胞是基于上述的cDNA或载体的来实现其功能的，该宿主细胞的具体的组成可参照上述实施例，由于该宿主细胞中包括了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。
基于一个总的发明构思，本申请实施例还提供一种结构肽段，所述结构肽段由所述宿主细胞表达得到。
该结构肽段是基于上述的宿主细胞的来表达，该结构肽段的具体的序列组成可参照上述实施例，由于该结构肽段中包括了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。
在一些可选的实施方式中，所述结构肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本申请实施例中，控制结构肽段的氨基酸序列，由于cDNA是采用多个游离半胱氨酸残基的多肽肽段所对应的基因序列所组成的，而其转化到宿主细胞进行表达时，会产生多个不同的氨基酸，因此控制氨基酸序列的具体序列，表明cDNA所代表的最接近EGFR蛋白的部分氨基酸结构。
如图1所示，基于一个总的发明构思，本申请实施例还提供一种结构肽段的制备方法，所述方法包括：
S1.向宿主菌体中导入所述载体，得到重组菌体；
S2.培养所述重组菌体并诱导蛋白表达，后进行提取和纯化，并进行酶切，得到结构肽段。
本申请实施例中，通过在宿主菌体中导入载体，再将导入的载体表达，从而能够得到包含预期氨基酸序列的结构肽段，从而保证结构肽段的准确表达。
该制备方法是基于上述的载体来实现的，该制备方法涉及的具体的载体可参照上述实施例，由于该制备方法中包括了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。
在一些可选的实施方式中，所述导入的方式包括热激法、电穿孔法和化学转化法中的至少一种。
本申请实施例中，控制载体导入宿主菌体的具体方式，保证载体能通过多样的方式导入到宿主菌体中，同时为了实现操作的方便，以热激法为优选项。
基于一个总的发明构思，本申请实施例还提供一种结构肽段的应用，所述应用包括将所述结构肽段用于筛选结合了和/或激活了EGFR的有毒金属中的应用。
本申请实施例中，有毒金属是指能够结合EGFR并且能够使EGFR磷酸化的金属元素，包括但不限于As、Hg和Pb中的至少一种。
下面结合具体的实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。
实施例1
一、E1蛋白中结构肽段的表达载体pGEX6P-1-E1的构建
具体步骤如下：
(1)合成如SEQ ID NO：1所示的带有E1蛋白中结构肽段的cDNA，具体序列为：5’-CCTGCCCTGTGCAACGTGGAGAGCATCCAGTGGCGGGACATAGTCAGCAGTGACTTTC TCAGCAACATGTCGATGGACTTCCAGAACCACCTGGGCAGCTGCCAAAAGTGTGATCCAAGCTGTCCCAATGGGAGCTGCTGGGGTGCAGGAGAGGAGAACTGCCAGAAACTGACCAAAATCATCTGTGCCCAGCAGTGCTCCGGGCGCTGCCGTGGCAAGTCCCCCAGTGACTGCTGCCACAACCAGTGTGCTGCAGGCTGCACAGGCCCCCGGGAGAGCGACTGCCTGGTCTGCCGCAAATTCCGAGACGAAGCCACGTGCAAGGACTGA-3’，再将合成的cDNA序列的T/A克隆用EcoRI/XhoI双酶切，回收目标条带，与EcoRI/XhoI双酶切的表达载体质粒pGEX6P-1(如图2所示)连接，得到连接产物；其中，pGEX6P-1(抗性为Amp，所带标签为GST)是在国际上常用的VECTOR大肠杆菌蛋白表达载体基础上改造的，是携带LacI基因、lacUV5启动子和T7 RNA聚合酶基因的蛋白表达载体。
本申请中的pGEX6P-1载体购自转导精进(武汉)生物技术有限公司。
内切酶EcoRI/XhoI和连接所使用的T4连接酶均来自转导精进(武汉)生物技术有限公司，用法及用量按照该公司提供的产品说明书。
(2)连接产物通过热激的方法导入大肠杆菌DH5α(购自上海昂羽生物技术有限公司)，在含有250ppm氨苄霉素(购自罗氏生物公司产品)的LA抗性培养基上涂皿培养，其中，LA的配方参见J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版。
(3)将LA抗性培养基上长出的单菌落在超净工作台接种于灭菌的10mL离心管，管内预先加入3mL的含250ppm卡那霉素的LB抗性培养基，然后在37℃摇床上培养16h～18h。再按照《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，科学出版社，2002)所述的方法抽提质粒，再用EcoRI/XhoI双酶切和PCR检测，根据插入片段的大小获得阳性的表达质粒载体，并将其命名为pGEX6P-1-E1。
(4)把步骤(3)的表达载体pGEX6P-1-E1通过如步骤(2)所示热激的方法导入Rosetta(DE3)(购自上海昂羽生物技术有限公司)菌株中，将转化后的菌株命名为T-E1。
实施例2
将实施例2和实施例1进行对比，实施例2和实施例1的区别在于：
二、大肠杆菌中可溶性GST标签融合蛋白诱导表达纯化
在T-E1的菌株中加入IPTG(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)，诱导表达出带有GST标签融合蛋白，然后对其进行提取、纯化、最后酶切得到不含GST标签的目的蛋白，所用试剂盒为GST标签蛋白纯化试剂盒(购自碧云天)，具体步骤如下：
1.GST标签蛋白诱导表达
(1)于-80℃取保种菌液50μL，加入5mL含250ppm卡那霉素的LB抗性培养基中，然后在37℃摇床上培养16h～18h后加入到300mL含250ppm卡那霉素的LB抗性培养基中，再在37℃摇床上培养4h～6h至对数生长期。
(2)加入终浓度为0.5mM的IPTG，4℃、140rpm诱导表达32h。
2.提取总蛋白
(1)取出菌液于4℃，于6000g离心10min，弃去上清液，
称量菌体，按照每克细菌沉淀湿重加入4mL的比例加入裂解缓冲液，充分重悬后，加入蛋白酶抑制剂、溶菌酶，置于冰上继续充分裂解30min。
(2)将细菌裂解液取出，于低温超声组织破碎仪中进行破碎。
(3)加入终浓度10μg/mL的RNase和5μg/mL的DNaseⅠ，冰上继续裂解10min。
(4)于4℃，12000g离心20min，收集裂解后的上清液置于冰上，从中取出50μL记为CL作后续检测用。
3.GST标签蛋白的纯化
(1)GST标签蛋白的吸附与挂柱：
1)取1mL摇晃均匀的BeyoGold GST-tag树脂于1.5mL离心管中，4℃离心(条件：1000g×20s)，吸弃上清液，并向树脂中加入0.5mL裂解buffer，充分重悬；再重复平衡2次，吸弃上清液，得到干树脂：
2)将4mL细菌裂解液上清加入已平衡好的树脂中，水平摇床上4℃缓慢充分混合吸附2h～3h。
(2)挂柱GST蛋白的洗涤、洗脱与分离纯化：
1)将充分挂柱的样品用去尖端枪头加入试剂盒提供的亲和层析柱空柱管中；
2)等待一段时间，待有明显固液分层，打开底部盖子，收集流下的穿流液，记为FT；
3)待穿流液流尽后，加入0.8mL裂解buffer(含0.2％的Tween-20)对挂柱蛋白进行洗涤，重复洗涤共15次，收集洗涤流出液，记为Wn(n＝1,2…15)；
4)使用0.4mL洗脱buffer(含1×GSH的10mM)洗脱，重复洗脱目的标签蛋白5次，收集流出洗脱液，记为Eln(n＝1,2…5)，-80℃保存各蛋白样品。
(3)蛋白跑胶检测
分别取CL、FT、W1、W15、El1-5蛋白样品50μL加入12.5μL的5×Loading Buffer(含5％的beta-巯基乙醇)混合后，于金属浴上100℃，加热5min变性；然后于100V电压下，跑15％的SDS-PAGE胶分离，使用R250考马斯亮蓝进行蛋白染色，观察表达纯化情况，结果见图3。
实施例3
将实施例3和实施例1进行对比，实施例3和实施例1的区别在于：
三、可溶性GST标签融合蛋白的酶切及目标多肽分离纯化
具体步骤如下：
1.脱盐
(1)取El2、El3两个洗脱样品混合均匀，取50μL记为“脱盐前”，煮样以待后续检测；
(2)取蛋白脱盐柱进行预处理，于1000g条件下2min离心去除储存液，向柱内加入2.5mL酶切buffer(含0.2％的Tween-20、1mM的DTT)离心，重复平衡2次，弃掉收集管中的缓冲液；
(3)取El2、El3混合液加入离心柱1000g，2min，收集滤液，从滤液中取50μL标记“脱盐后”，煮样以待后续检测；
(4)用Bradford法检测脱盐后的样品的蛋白浓度，得到脱盐液中GST标签融合蛋白总量。
2.酶切
(1)根据脱盐液中所含GST标签融合蛋白总量按照1μg脱盐后样品加入0.04μL的ppase(PreScission Protease)，4℃过夜酶切。
(2)取50μL酶切液加12.5μL的5×Loading Buffer煮样，以待后续检测。
(3)按照1μg脱盐后样品加入4.4μl的BeyoGold GST-tag，并按比例取BeyoGoldGST-tag吹打均匀，于1.5mL离心管中，4℃和1000g离心20s，用去掉尖端枪头吸弃上清液，并向树脂中加入酶切buffer充分重悬，并重复平衡2次。
(4)将酶切溶液加入树脂凝胶中，室温结合20min～30min。
(5)500g离心5min，收集上清，跑15％的SDS-PAGE胶分离，使用银染试剂盒(碧云天)进行蛋白染色，观察酶切情况，结果见图4。
由图4可知，最后得到不含GST标签的目的条带。
上述反应中用到的ppase(PreScission Protease)试剂购自常州天地人和生物科技有限公司，IPTG(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)购自北京酷来搏科技有限公司，其他全部试剂购自碧云天公司。
实施例4
将实施例4和实施例1进行对比，实施例4和实施例1的区别在于：
四、目标多肽的结构测序
将得到的目标多肽进行SDS-PAGE电泳，切胶回收后进行胶内酶解处理，于MICROLC-QTOF-MS上机检测合成的目标多肽，得到其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：PALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKD，具体步骤如下：
1.切胶：将SDS-PAGE电泳后的胶置于玻璃皿中，切下条带，然后将胶条带切成小块，加入蒸馏水润洗2遍。
2.加入适量的脱色液，置于37℃恒温培养箱中(水浴脱色)，脱色至无色或颜色很淡。
3.吸去脱色液，加入适量的乙腈润洗，吸除乙腈，再加入乙腈，放置10min，吸除乙腈，用真空离心浓缩仪脱水使胶块干燥。
4.向干燥的胶块中加入25mM的二硫苏糖醇溶液(DTT)，放置于55℃，孵育45min。
5.加适量乙腈润洗，后吸干，再加入乙腈10min，吸除乙腈，用真空离心浓缩仪脱水使胶块干燥。
6.加入适量的55mM的碘乙酰胺溶液，避光反应30min。
7.乙腈润洗，后用乙腈浸泡10min，用真空离心浓缩仪脱水使胶块干燥。
8.加适量胰蛋白酶，没过胶粒，倒置于37℃恒温箱中，孵育12h～16h。
9.用1μL的10％三氟乙酸溶液终止酶解反应，低速离心，使胶粒和溶液分开，将溶液收集至一个新的2mL的EP管中。
10.向胶粒中加入适量的萃取液(50％乙腈，0.1％甲酸)，放置于37℃，孵育30min，取上清液与步骤9的EP管中的溶液合并，并重复两次该萃取步骤。
11.将上清液放在真空离心浓缩仪中浓缩，剩余约10μL的时候取出离心管，于-20℃保存。
12.上样前，加入20μL的0.1％甲酸溶液复溶。振荡混匀后离心，重复两次，(最后溶液体积约为50μL～70μL)。
13.高速离心5min，取50μL肽段溶液加入质谱上样瓶中，注意瓶底部不能有气泡，保存于4℃以备质谱上机分析。
测序结果见图5至图7，由图5至图7所示，其肽段覆盖率为64.2％，证明纯化、酶切出来的蛋白确为目的蛋白E1，其中，色谱条件为：
液相型号：MicroLC M5(SCIEX，USA)：
C18色谱柱(3.0μm，0.3mm×150mm，Phenomenex，USA)，柱温度为45℃。
流动相A：2％的ACN(含0.1％的FA，v/v)；流动相B：98％的ACN(含0.1％的FA，v/v)。流速为7μL/min；进样量为5μL。
梯度设置如下：5％的B(0～2min)，5％～40％的B(2min～25min)，40％～85％的B(25min～28min)，85％的B(28min～33min)，85％～5％的B(33min～35min)，5％的B(35min～45min)。
质谱条件，质谱型号：TripleTOF 5600+(SCIEX，USA)：
正离子模式；离子源温度350℃；喷雾电压5500V；离子源气体GS1为16psi；离子源气体GS2为17psi；窗帘气CUR为30psi；一级质谱(MS)扫描范围300Da～1250Da；二级质谱(MS/MS)扫描范围100Da～1500Da。
实施例5
将实施例5和实施例1进行对比，实施例5和实施例1的区别在于：
五、目标多肽对可与EGFR结合的有毒金属的筛选应用
用代表性的有毒金属As、Hg、Pb分别以NaAsO2、HgCl2、PbCl2的形式对E1进行暴露后，用350nm处的荧光强度表示不同处理下目标多肽的三级结构状态，具体步骤如下：
1.配制PH7.4含1mM TCEP的20mM磷酸盐缓冲液；其磷酸盐缓冲液是将磷酸二氢钠和磷酸氢二钠溶液混合用pH计调至7.4，得到两者的混合液作为缓冲液储备液。
2.取E1蛋白溶液使用脱盐柱(购自常州天地人和生物科技有限公司)将其缓冲液换为上述磷酸盐缓冲液；
3.使用相同pH的磷酸缓冲液配制的NaAsO2、HgCl2、PbCl2溶液。
4.NaAsO2、HgCl2、PbCl2暴露E1，其中E1终浓度为10μM，NaAsO2、HgCl2终浓度都为50/100μM，PbCl2终浓度为100/500μM。
5.所有样品在37℃，180rpm的条件下培养30min，以确保充分反应达到平衡。
6.使用荧光仪进行检测，激发波长为259nm及发射荧光光谱范围为290～450nm，记录荧光强度。
实验结果如图8至图10所示，随着有毒金属AsIII、Hg2+、Pb2+的浓度的增加，E1的荧光强度逐渐降低，表明有毒金属AsIII、Hg2+、Pb2+能够与E1结合，从而改变其荧光强度。最终得到能够筛选出能结合-激活EGFR有毒金属的肽段。
实施例6
将实施例6和实施例1进行对比，实施例6和实施例1的区别在于：
六、筛选有毒金属对EGFR磷酸化激活的功能应用
用有毒金属As、Hg、Pb分别以NaAsO2、HgCl2、PbCl2的形式分别暴露HaCaT细胞，具体步骤如下：
1.细胞铺板：HaCaT细胞以3×105cells/well的密度置于6孔板中，用DMEM完全培养基(含1％的P/S和10％的FBS)培养36h。
2.血清饥饿细胞：用PBS洗一遍，换用无血清的DMEM(含1％的P/S)血清饥饿12h。
3.暴露：分别用终浓度为0/5/10μM的NaAsO2，0/0.05/0.1μM的HgCl2，0/10/25μM的PbCl2处理30min。
4.免疫印迹分析：
1)制样：
用预冷的PBS洗两次细胞后，加入150μL/well的RIPA裂解缓冲液，140rpm，冰上继续裂解30min，收集细胞到1.5mL的EP管中，加入37.5μL的5xloading buffer(含5％的beta-巯基乙醇)混合，100℃，煮样10min；
2)10％的SDS-PAGE电泳跑胶；
3)转膜；
4)封闭：含5％的BSA的TBST室温封闭2h；
5)一抗：含一抗的2％的BSA-TBST，于4℃孵育过夜，其中一抗为：
Anti-pEGFR(phosphor Tyrosine 1068)的抗体[EP774Y]-Rabbit-170kD；
β-αctin-M-42KD
6)洗膜：TBST，10min/次，3次；
7)二抗：含二抗的2％的BSA-TBST室温孵育1h；其中二抗为：Rabbit和Mouse；
8)洗膜：TBST，10min/次，3次；
9)使用显影液进行显影看结果。
结果如图11至图12所示，随着有毒金属AsIII、Hg2+、Pb2+浓度的增加，磷酸化的EGFR的增多，说明有毒金属AsIII、Hg2+、Pb2+能够激活EGFR，使EGFR磷酸化，从而激活下游信号通路。
其中，HaCaT细胞购自武汉大学典型培养物保藏中心，DMEM培养基、P/S、FBS均购自GIBCO，一抗Anti-pEGFR、β-αctin-M购自abcan，二抗购自Biosharp，显影液购自赛默飞。
综上所述，本申请所保护的cDNA不仅能成功表达出所目的蛋白E1，而且其针对有毒金属具有筛选和激活的作用。
本申请实施例中的一个或多个技术方案，至少还具有如下技术效果或优点：
(1)本申请实施例提供的cDNA，避开EGFR的主功能区域的同时选取多个靠近且游离半胱氨酸残基的多肽肽段，并根据选取的多肽肽段的基因序列进行综合设计，剔除掉基因序列中的内含子，从而能够得到纯净表达结构肽段的cDNA片段，由于设计的cDNA片段能够转化并表达出包含多个半胱氨酸残基的结构肽段，而含有多个半胱氨酸残基的结构肽段能够结合有毒金属，从而实现EGFR蛋白同有毒金属的结合，利用这一结合特性可以对有毒金属进行筛选。
(2)本申请实施例提供的载体，不仅可方便地导入宿主细胞中，且能稳定表达。
(3)本申请实施例提供的应用，通过采用代表性的有毒金属As、Hg、Pb分别以NaAsO2、HgCl2、PbCl2的形式暴露本蛋白，荧光表征结果显示，本蛋白能与有毒金属结合，改变特征氨基酸残所处的微环境，从而使其荧光信号值发生改变，同时采用有毒金属As、Hg、Pb分别以NaAsO2、HgCl2、PbCl2的形式暴露HaCaT细胞时，WB结果显示，所用有毒金属能使细胞激活EGFR，从而使EGFR磷酸化，说明本申请的结构肽段能够筛选结合了或激活了EGFR的有毒金属。
(4)本申请实施例提供的应用，通过采用设计的cDNA表达出的肽段能够筛选结合-激活EGFR的有毒金属，这对能够结合-激活EGFR有毒金属的研究有着重要的指导意义，为筛选可通过结合-激活EGFR致癌的潜在有毒金属提供了新的方法。
本申请的各种实施例可以以一个范围的形式存在；应当理解，以一范围形式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本申请范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所述范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。
在本申请中，在未作相反说明的情况下，使用的方位词如“上”和“下”具体为附图中的图面方向。另外，在本申请说明书的描述中，术语“包括”“包含”等是指“包括但不限于”。在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。在本文中，“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。在本文中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“至少一种”、“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (8)
1.一种结构肽段的cDNA，其特征在于，所述cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种载体，其特征在于，所述载体包括如权利要求1所述的cDNA的核苷酸序列。
3.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求1所述的cDNA的核苷酸序列或如权利要求2所述的载体。
4.一种结构肽段，其特征在于，所述结构肽段由如权利要求3所述的宿主细胞表达得到。
5.根据权利要求4所述的结构肽段，其特征在于，所述结构肽段的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
6.一种制备如权利要求4或5所述的结构肽段的方法，其特征在于，所述方法包括：
向宿主菌体中导入如权利要求2所述的载体，得到重组菌体；
培养所述重组菌体并诱导蛋白表达，后进行提取和纯化，并进行酶切，得到结构肽段。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述导入的方式包括热激法、电穿孔法和化学转化法中的至少一种。
8.一种以非疾病诊断和治疗为目的的结构肽段的应用，其特征在于，所述应用包括将如权利要求4或5所述的结构肽段用于筛选结合了和/或激活了EGFR的有毒金属中的应用。
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Also Published As
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