CN110713546A - 靶向survivin-XIAP复合物的抗肿瘤多肽Sur-X与用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肿瘤的靶向治疗药物领域，尤其涉及一种基于靶向survivin‑XIAP复合物的抗肿瘤多肽Sur‑X，及其在包括结直肠癌和胃癌在内的多种肿瘤治疗中的应用。本发明的抗肿瘤多肽Sur‑X通过抑制survivin‑XIAP复合物的形成迅速高效地诱导结直肠癌和胃癌细胞死亡，而对人类正常细胞无影响，从而发挥特异性靶向肿瘤细胞的治疗作用。另外，该多肽易于在体外合成，方便临床应用。因此，多肽Sur‑X具有潜在的商业产业价值，可广泛应用于肿瘤靶向治疗技术领域之中。

Description

靶向survivin-XIAP复合物的抗肿瘤多肽Sur-X与用途

技术领域

本发明涉及肿瘤的靶向治疗药物领域，尤其涉及一种基于survivin-XIAP复合物而设计的多肽药物Sur-X，以及它们在包括结直肠癌和胃癌在内的多种肿瘤治疗中的应用，特别涉及Sur-X通过干扰survivin-XIAP复合物的形成，促进肿瘤细胞的凋亡和程序性坏死，发挥肿瘤靶向治疗的作用。

背景技术

近几十年来，随着人类平均寿命的延长、生活环境以及生活方式的改变，癌症已成为威胁人类生命健康的第一大杀手。全球癌症统计(GLOBOCAN)结果显示2018年有1810万癌症新发病例和960万癌症死亡病例。其中，结直肠癌及胃癌的发病率分别位居第三位和第五位，二者之和为15.9％。另外，结直肠癌和胃癌的死亡率分别为9.2％和8.2％，仅次于肺癌。目前，对于不可手术切除的晚期及复发结直肠癌和胃癌，以氟尿嘧啶+铂类为基础的化疗仍是主要治疗手段。近年来，虽然贝伐单抗、西妥昔单抗、阿帕替尼、曲妥珠单抗等靶向药物及免疫治疗在部分结直肠癌及胃癌患者中有一定的疗效，但仅部分患者能从中获益。因此，亟需开发更多更有效的靶向药物以提高胃肠肿瘤的疗效，延长患者生存。

早在1997年，Ambrosini等首次应用效应细胞蛋白酶受体-1cDNA在人类基因组中筛选并克隆出survivin。作为凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)的重要一员，survivin在胚胎组织和绝大多数肿瘤组织中高表达，而在正常成人组织中表达很少。很多研究表明，survivin在肿瘤的增殖、侵袭、转移、耐药以及血管生成方面也发挥了重要作用。因此，survivin一直是肿瘤领域的研究热点，被认为是肿瘤治疗的一个重要靶点。

survivin是IAPs家族中分子量最小的成员，仅由142个氨基酸组成。与其他成员含有2-3个串联的含有半胱氨酸、组氨酸的杆状病毒IAP重复序列(baculoviral IAP repeat,BIR)不同，survivin仅在氨基末端含有一个为抑制细胞凋亡所必须的BIR结构域。在羧基末端，survivin缺乏RING结构域，仅含有一个由40个氨基酸组成的兼性α螺旋，组成蛋白质-蛋白质相互作用结构域，其和BIR结构域之间由核输出信号连接。此外，survivin还有一个二聚体结构域，可以领结样同源二聚体的形式稳定存在。

现有研究表明，survivin具有调节细胞有丝分裂和抑制细胞凋亡两大主要功能。一方面，survivin和Aurora B、Borealin、INCENP共同构成chromosomal passengercomplex(CPC)。CPC是染色体-微管相互作用、纺锤体形成、染色体分离以及胞质分裂的重要调节因子，而survivin主要是在有丝分裂过程中负责将CPC靶向到着丝粒和中间体，从而使CPC发挥作用。既往研究发现，沉默survivin可导致细胞发生各种各样有丝分裂缺陷，提示survivin在细胞有丝分裂过程中发挥着重要的调节作用。

另一方面，survivin可通过抑制caspase家族活化发挥抗凋亡作用。既往研究显示，survivin能够抑制Bax或Fas诱导的细胞凋亡；survivin主要是通过与活化的caspase3和caspase7结合而抑制细胞凋亡，而它们是Bax凋亡途径和Fas凋亡途径的下游汇集点；survivin仅有的BIR拥有与XIAP的BIR2相似的氨基酸序列，而BIR2被认为是IAPs与caspase3、caspase7结合所必须的；survivin还可通过与乙肝病毒X蛋白相互作用蛋白(hepatitis B X-interacting protein,HBIXP)相互作用，结合pro-caspase9并阻止凋亡小体对其的募集，从而抑制caspase9的活化。还有研究显示，survivin除通过直接与caspase结合对其产生抑制作用外，还能通过与Smac等促凋亡中间蛋白相互作用来间接阻止caspase的活化，从而抑制细胞凋亡。此外，我们关注到，Dohi T等研究者于2004年发现survivin能够通过与XIAP结合形成IAP-IAP复合物来稳定XIAP，从而抑制caspase9活化，阻止细胞凋亡的发生。

XIAP作为IAP家族的另外一个重要成员，能够通过直接与caspase3、7、9结合而抑制其活化，发挥抗凋亡作用。既往研究结果显示，XIAP在包括肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌以及结直肠癌等多种肿瘤组织中高表达。高表达XIAP的直肠癌患者术后表现出明显的化疗抵抗现象。在基底细胞样乳腺癌患者中，XIAP表达增高，肿瘤复发的风险明显增加。此外，高表达XIAP的甲状腺乳头状癌患者的预后明显比低表达患者预后差，而XIAP抑制剂在体内体外均可以显著抑制甲状腺癌细胞的生长。因此，XIAP也被视为一个潜在的肿瘤治疗靶点。

综上所述，设计靶向survivin-XIAP复合物的多肽可能为肿瘤治疗提供新的研究思路、方法和策略。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种靶向survivin-XIAP复合物的抗肿瘤多肽Sur-X。

本发明的第二目的在于提供靶向survivin-XIAP复合物的抗肿瘤多肽Sur-X在制备抗肿瘤产品中的用途。

本发明通过以下技术方案进行实现：

一种靶向survivin-XIAP复合物的抗肿瘤多肽Sur-X，由35个氨基酸组成，包含TAT透膜序列(YGRKKRRQRRR)，其全部的氨基酸序列为YGRKKRRQRRRKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERM，即：Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-Asp-His-Arg-Ile-Ser-Thr-Phe-Lys-Asn-Trp-Pro-Phe-Leu-Glu-Gly-Cys-Ala-Cys-Thr-Pro-Glu-Arg-Met。

所述靶向survivin-XIAP复合物的抗肿瘤多肽Sur-X通过人工合成获得。

靶向survivin-XIAP复合物的抗肿瘤多肽Sur-X在制备抗肿瘤药物中的用途。

一种药物组合物，包括所述靶向survivin-XIAP复合物的抗肿瘤多肽Sur-X和能杀死肿瘤细胞的制剂。

优选地，所述靶向survivin-XIAP复合物的抗肿瘤多肽Sur-X作为靶向多肽，与能杀死肿瘤细胞的制剂相缀合或混合。

优选地，所述制剂为能杀伤癌细胞的化学药物、生物药物、靶向药物、纳米药物、放射性药物、光热治疗或光动力治疗药物或包裹这些药物的载体中的任意一种。

进一步优选地，所述制剂为烷化剂、抗代谢药物、抗肿瘤天然药物、抗肿瘤抗生素、抗血管新生药物/酪氨酸激酶受体抑制剂/西妥昔单抗/曲妥珠单抗等靶向药物、抗PD-1/PD-L1单抗等免疫抑制剂、激素及金属络合物或肿瘤放射靶向标记物中的任意一种。

进一步优选地，所述载体为纳米材料、脂质体、聚乙二醇修饰或油性化合物中的任意一种，或者由多种油性化合物所组成的混合物。

所述肿瘤包括结直肠癌和胃癌在内的多种肿瘤。

本发明的有益技术效果在于：本发明提供了一种靶向survivin-XIAP复合物的多肽Sur-X，其通过抑制survivin-XIAP复合物的形成迅速高效地诱导结直肠癌和胃癌细胞死亡，而对人类正常细胞无影响，从而发挥特异性靶向肿瘤细胞的治疗作用。另外，该多肽易于在体外合成，方便临床应用。因此，多肽Sur-X(以下简称为S)具有潜在的商业产业价值，可广泛应用于肿瘤靶向治疗技术领域之中。

附图说明

图1为本发明多肽S的质谱分析图；其中1-1为多肽S的质谱分析结果；1-2为阴性对照多肽Con的质谱分析结果；1-3为多肽NS的质谱分析结果。

图2为本发明多肽S的高效液相色谱分析图；其中2-1为多肽S的高效液相色谱分析结果；2-2为阴性对照多肽Con的高效液相色谱分析结果；2-3为多肽NS的高效液相色谱分析结果。

图3为实施例2中共聚焦显微镜观察多肽S和对照多肽Con进入细胞图。

图4为实施例3中MTT检测多肽S对人结直肠癌细胞系HCT116和RKO、人胃癌细胞系MGC-803和MKN45、及人正常细胞SV5活力的影响图。

图5为实施例4中实时检测多肽S诱导肿瘤细胞发生凋亡&坏死图；其中5-1为实时检测不同浓度多肽S诱导肿瘤细胞发生凋亡的结果；5-2为实时检测不同浓度多肽S诱导肿瘤细胞发生坏死的结果；5-3为实时检测10μM多肽S诱导肿瘤细胞发生凋亡和坏死的结果；5-4为实时检测20μM多肽S诱导肿瘤细胞发生凋亡和坏死的结果。

图6为实施例5中western blot检测多肽S作用后肿瘤细胞的凋亡、程序性坏死指标图；其中6-1为WB检测多肽S(10μM)处理后，肿瘤细胞内凋亡相关指标的蛋白水平变化；6-2为WB检测多肽S(10μM)处理后，肿瘤细胞内程序性坏死相关指标的蛋白水平变化。

图7为实施例6中裸鼠移植瘤模型检测多肽S在体内的肿瘤抑制作用图；其中7-1为多肽S处理组与Con处理组小鼠移植瘤体积对比结果；7-2为多肽S处理组与Con处理组小鼠体重监测结果。

图8为实施例7中多肽S抑制survivin与XIAP结合图；其中8-1为免疫共沉淀检测肿瘤细胞中survivin与XIAP结合情况的结果；8-2为免疫共沉淀检测多肽S对survivin、XIAP结合的影响。

图9为实施例8中MTT检测多肽NS对人结直肠癌细胞系HCT116和RKO活力的影响图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明做进一步的说明，以助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。

实施例1多肽S的合成、纯化及分子量测定

本发明抗肿瘤多肽S是根据既往文献报道的survivin上与XIAP结合的具体氨基酸序列，并在氨基端加上TAT透膜序列所得，其最终序列见于SEQ ID No:1。选择一段不表达在人类细胞中的肽段作为验证本发明多肽S具有特异性抗肿瘤作用的对照，记为多肽Con，其最终序列见于SEQ ID No:2。多肽NS是将多肽S缩短而得到，包含S氨基末端三分之二的残基。NS的最终序列见于SEQ ID No:3。多肽S、Con和NS均采用Fmoc固相肽合成法合成，简述如下：根据多肽序列使肽链从羧基端向氨基端逐个残基依次延申，待多肽合成后，用95切割液(三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3，异丙基硅烷:水＝95:2:2:1)将多肽从树脂上切割下来(每克树脂加10ml切割液)，并用冰乙醚(切割液：乙醚＝1:9)离心沉降四次，然后用HPLC(NexeraUHPLC，岛津公司)分离纯化，再冻干，得到一定纯度的多肽，并利用质谱仪(LC3000，岛津公司)进行分子量大小鉴定。

图1-1、1-2和1-3所示分别为多肽S、Con、和NS的质谱鉴定结果。

图2-1、2-2和2-3所示分别为多肽S、Con和NS的HPLC分析结果，纯度均大于95％。

实施例2共聚焦显微镜下观察多肽能够进入细胞

将Hoechst33342以1:1000的比例、FITC标记的多肽S和Con以10μM的浓度处理人结直肠癌细胞HCT116和RKO 1h后，在共聚焦显微镜下观察多肽进入细胞的情况。

图3所示为共聚焦显微镜下观察到多肽S和Con均能够快速进入细胞内，说明多肽S具有良好的膜通透性。

实施例3MTT检测S对人结直肠癌细胞系HCT116和RKO、人胃癌细胞系MGC-803和MKN45、及人正常细胞系SV5细胞活力的影响

收集对数生长期细胞，计数细胞并调整细胞浓度，以4000个细胞/孔接种于96孔培养板中；设置实验组(S)和阴性对照组(Con)，每组设置浓度梯度：0，2.5μM，5μM，10μM，15μM，20μM，每个浓度设置3个复孔；待细胞贴壁后，给予相应处理，分别孵育6h、24h；每孔加入20μL MTT(5g/L)，37℃孵育4h后弃上清，每孔加入200μL二甲基亚砜(DMSO)，置酶标仪测570nm波长处的吸光度(OD)值；计算不同浓度下细胞相对活力；重复三次。

图4所示为S对人结直肠癌细胞系HCT116和RKO、人胃癌细胞系MGC-803和MKN45、及人正常细胞SV5活力的影响。结果显示，与Con多肽相比，多肽S仅作用6h后，上述各细胞系的活力即随着S浓度的增加而明显受抑；其中20μM多肽S作用后HCT116、RKO、MGC-803和MKN45细胞的活力分别仅为对照的22.31％，42.98％，25.42％和28.38％；作用24h后，抑制作用仍然显著。此外，S对人正常细胞系SV5的活力没有明显的影响。这一结果说明，多肽S具有靶向肿瘤细胞的特异性抗肿瘤作用，抑制作用快速且显著。

实施例4实时检测S诱导肿瘤细胞发生凋亡&坏死的作用

收集对数生长期细胞HCT116，计数细胞并调整细胞浓度，以4000个细胞/孔接种于白色不透明96孔培养板中；6-8小时后细胞贴壁；配制工作液，即取适量培养基，将实时凋亡&坏死检测试剂盒(Promega)中的五种试剂分别加入到所取培养基中，使之从1000×稀释到2×；将工作液与含有不同浓度多肽S的培养基混合，使S终浓度分别为0，2.5μM，5μM，7.5μM，10μM，15μM，20μM，以换液的形式每孔加入200uL混合液，每个浓度设置3个复孔；在酶标仪上设置相关参数后进行实时检测，读取RLU值(凋亡)和RFU值(坏死)。

图5所示为实时检测S诱导肿瘤细胞发生凋亡&坏死。实时检测结果表明，经多肽S处理后，所检测到的肿瘤细胞的凋亡、坏死信号在3h内快速增加，并在4h左右进入平台期。其中图5-1为不同浓度S引起肿瘤细胞凋亡信号的检测结果，图5-2为不同浓度S导致肿瘤细胞坏死的检测结果，图5-3和图5-4分别为多肽S浓度为10μM、20μM时，肿瘤细胞发生凋亡和坏死的共同检测结果。这一结果说明，多肽S能够快速诱导肿瘤细胞发生凋亡和坏死。

实施例5western blot检测凋亡、坏死通路关键蛋白水平

收集对照组和处理组细胞并制备蛋白样品，进行SDS-PAGE凝胶电泳并转印至PVDF膜上，用5％脱脂牛奶封闭转印后的PVDF膜1h，一抗4℃孵育过夜，1×TTBS洗膜10min×4次，二抗室温孵育30min，1×TTBS洗膜10min×4次，采用ECL法进行显色，最后用GIS凝胶图像分析系统进行拍照及分析处理。

图6所示为western blot检测S作用后，凋亡、坏死通路关键蛋白水平的变化。图6-1为凋亡相关蛋白检测结果；图6-2为程序性坏死相关蛋白。结果显示，多肽S作用30min、1h、3h、6h后，肿瘤细胞内survivin、XIAP蛋白水平有所降低；caspase家族成员，包括caspase9、3、7发生活化；PARP裂解带增加；程序性坏死相关蛋白RIPK1和RIPK3增加，MLKL的磷酸化水平升高。这些结果表明，多肽S能够同时促进肿瘤细胞快速发生凋亡和程序性坏死。

实施例6利用裸鼠移植瘤模型检测多肽S在体内的抗肿瘤作用

购买10只4-6周龄、体重为14-20克的雌性胸腺裸鼠，将1×10⁷个HCT116细胞以100ul体系注射于裸鼠腋窝处皮下；待瘤体大小达到100mm³后，将裸鼠分为Con组和S组，按照10mg/kg的剂量，以50μL体系开始进行瘤内注射给药，每隔一天给药一次，总共给药7次。

图7所示为多肽S能够在体内抑制肿瘤细胞生长而无明显毒性作用，其中图7-1显示与Con组相比，多肽S肿瘤显著较小，而图7-2中对裸鼠体重的监测结果显示，S组裸鼠体重与Con组无明显差异，由此可推断多肽S无明显的毒副作用。这一结果表明，多肽S在体内能够特异性抑制肿瘤细胞生长而对正常细胞无毒副作用。

实施例7免疫共沉淀验证多肽S能够抑制survivin与XIAP结合

收集对照组和处理组(多肽S作用2h)细胞并制备蛋白样品，分别从每组样品中取出10％作为Input，加入3×上样缓冲液，95℃煮样5min。清洗beads后，将每组样品、IgG(R/M)、IP抗体分别加入相应的beads中，4℃缓慢摇晃过夜。待慢摇结束后，离心弃上清，然后清洗beads 4次。弃上清后，向beads中加入适量的2×上样缓冲液，95℃煮样5min，将样品进行westernblot检测。

图8所示为免疫共沉淀检测多肽S能够抑制survivin与XIAP结合，其中图8-1为survivin能够与XIAP结合形成IAP-IAP复合物，图8-2为多肽S抑制survivin与XIAP结合。结果显示，多肽S确实能够抑制survivin-XIAP复合物的形成。

实施例8MTT检测NS对人结直肠癌细胞系HCT116、RKO活力的影响

收集对数生长期细胞，计数细胞并调整细胞浓度，以4000个细胞/孔接种于96孔培养板中；设置S组和NS组，每组设置浓度梯度：0，2.5μM，5μM，10μM，15μM，20μM，每个浓度设置3个复孔；待细胞贴壁后，给予相应处理，孵育6h、24h；每孔加入20μL MTT(5g/L)，37℃孵育4h后弃上清，每孔加入200μL二甲基亚砜(DMSO)，置酶标仪测570nm波长处的吸光度(OD)值；计算不同浓度下细胞相对活力；重复三次。

图9所示为NS对人结直肠癌细胞系HCT116、RKO活力的影响。结果显示，与S相比，NS在作用24h仍未显示出对肿瘤细胞活力的抑制作用，提示S全长序列具有抗肿瘤活性。

序列表

<110> 中国医科大学

<120> 靶向survivin-XIAP复合物的抗肿瘤多肽Sur-X与用途

<160> 4

<210> 1

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Asp His Arg

15

Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala Cys

30

Thr Pro Glu Arg Met

<210> 2

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Asp Asp Gly

15

Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu

30

Val Asn Arg Ile Glu

<210> 3

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Asp His Arg

15

Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly

25

Claims (10)

1.一种靶向survivin-XIAP复合物的抗肿瘤多肽Sur-X，其特征在于，由35个氨基酸组成，包含TAT透膜序列(YGRKKRRQRRR)，其全部的氨基酸序列为YGRKKRRQRRRKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERM。

2.根据权利要求1所述的多肽Sur-X，其特征在于，所述多肽Sur-X通过人工合成获得，具体采用Fmoc固相肽合成法合成。

3.靶向survivin-XIAP复合物的抗肿瘤多肽Sur-X在制备抗肿瘤药物中的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述肿瘤包括结直肠癌和胃癌在内的多种肿瘤。

5.一种药物组合物，其特征在于，包括所述靶向survivin-XIAP复合物的抗肿瘤多肽Sur-X和能杀死肿瘤细胞的制剂。

6.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述多肽Sur-X作为靶向多肽，与能杀死肿瘤细胞的制剂相缀合或混合。

7.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述制剂为能杀伤肿瘤细胞的化学药物、生物药物、靶向药物、纳米药物、放射性药物、光热治疗或光动力治疗药物或包裹这些药物的载体中的任意一种。

8.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述制剂为烷化剂、抗代谢药物、抗肿瘤天然药物、抗肿瘤抗生素、抗血管新生药物/酪氨酸激酶受体抑制剂/西妥昔单抗/曲妥珠单抗等靶向药物、抗PD-1/PD-L1单抗等免疫抑制剂、激素及金属络合物或肿瘤放射靶向标记物中的任意一种。

9.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述载体为纳米材料、脂质体、聚乙二醇修饰或油性化合物中的任意一种，或者由多种油性化合物所组成的混合物。

10.根据权利要求5-8任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述肿瘤包括结直肠癌和胃癌在内的多种肿瘤。

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