CN104558102A - 凋亡抑制蛋白抑制剂及其用途 - Google Patents

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CN104558102A CN201310488655.3A CN201310488655A CN104558102A CN 104558102 A CN104558102 A CN 104558102A CN 201310488655 A CN201310488655 A CN 201310488655A CN 104558102 A CN104558102 A CN 104558102A
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聂爱华
顾为
王鑫
苏瑞斌
李玉蕾
李斐
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Abstract

本发明属于医药化工领域，涉及凋亡抑制蛋白抑制剂及其用途。具体地，本发明涉及一种杂环烷类衍生物及其作为凋亡抑制蛋白抑制剂或者用于制备抗肿瘤药物的用途。更具体地，本发明涉及通式I所示的化合物，其异构体或其可药用盐。本发明的化合物能够有效地抑制IAPs的活性，具有应用于防治肿瘤等疾病的潜力。

Description

凋亡抑制蛋白抑制剂及其用途
发明领域
本发明属于医药化工领域，涉及凋亡抑制蛋白抑制剂及其用途。具体地，本发明涉及一种杂环烷类衍生物及其作为凋亡抑制蛋白抑制剂或者用于制备抗肿瘤药物的用途。
背景技术
细胞凋亡（程序性细胞死亡），通常发生在多细胞生物中健康组织的发育和保养阶段。已知细胞凋亡途径在胚胎发育、病毒性发病机理、癌症、自身免疫性疾病和神经变性疾病，以及其它事件中具有重要的作用。已发现细胞凋亡反应中的改变与癌症、自身免疫性疾病例如系统性红斑狼疮和多发性硬化症的发展并且与包括与疱疹病毒、痘病毒和腺病毒相关的病毒感染有关。
凋亡抑制蛋白IAPs(Inhibitor of Apoptosis Proteins)是凋亡主要调节者Caspases(半胱天冬酶)的内源性抑制物，它们选择性地与Caspase–3、Caspase–7和/或Caspase–9结合，阻断细胞凋亡所必须依赖的Caspases的蛋白水解活性，进而抑制细胞凋亡（Cell Death and Differentiation(2006),13:179–188，.以及Apoptosis(2007),12:1543–1568。）。迄今为止，在人体中发现的IAPs有8个成员，包括NAIP、XIAP、cIAP1、cIAP2、ILP2、Bruce、Survivin和Livin(ML-IAP)。其中，NAIP、XIAP、cIAP1和cIAP2含有三个BIR结构域(BIR1、BIR2、BIR3)，而ILP2、Bruce、Survivin和Livin只含有一个BIR结构域。已经证明许多IAPs在癌细胞中异常表达，Survivin在多种恶性肿瘤中有高表达，但在正常细胞中没有检查到该蛋白的存在。其它的IAPs成员虽然在多种正常组织中存在，但也像Survivin一样在多种恶性肿瘤中过量表达。过量表达的IAPs诱导肿瘤细胞对化疗产生耐药性，同时也抑制化疗或放疗引起的细胞凋亡。
另一方面，线粒体中释放的Smac/Diablo蛋白可以与IAPs结合，其结合的位点正是IAPs与Caspase–3、–7和Caspase–9结合的位置，从而抑制了IAPs的抗凋亡活性。根据IAPs家族蛋白在凋亡通路中的功能以及IAPs与Caspases和Smac相互作用的机制，目前已经发现了多种能抑制IAPs功能并具有抗肿瘤活性的化合物。
Smac蛋白是IAPs的内源性抑制剂，能对抗其对凋亡的抑制作用；大多数已知的IAPs抑制剂从结构上来说属于Smac蛋白残基片段的类似物。Smac蛋白在体内以双价的形式发挥作用，因此IAPs抑制剂也有单价和双价等不同形式。研究表明，双价的IAPs抑制剂（同时能与2个IAPs结合的，或是同时与一个IAPs的两个结构域结合的化合物，基本上都是对称结构）具有更强的抑制活性。
目前，尽管一系列IAPs抑制剂已被开发出来，但目前还没有上市药物，不少化合物也还涉及到效能、稳定性或毒性等方面的局限。因此，开发不同结构类型的安全有效IAPs抑制剂具有积极的社会意义和良好的市场前景。
发明内容
本发明的一个目的是寻找新结构的选择性IAPs受体高亲和性的抑制剂，用于抑制人体内IAPs的活性，进而增强Caspases的蛋白水解活性，从而起到治疗癌症的目的。
本发明人发现了一系列结合IAPs并通过调节IAPs功能而促进细胞凋亡的新化合物，且它们具有药学可接受的稳定性和生物利用度。该类化合物能够阻断IAPs与Caspase-3、Caspase-7和Caspase-9的相互作用。本发明结果表明该类小分子可以在细胞凋亡前下调节IAPs蛋白，由此说明当与其它细胞凋亡的诱导物一起给药时，该化合物的应用在临床上可提供有益的效果。本发明人已证明本发明化合物与哺乳动物XIAP-BIR3、cIAP1-BIR3结构域结合，从而促进癌细胞凋亡。本文中描述的化合物在多种癌细胞系中具有促凋亡活性，这些细胞系例如膀胱癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、多发性脊髓瘤和卵巢癌细胞系，并且还可能用于其它癌细胞系和细胞对 细胞凋亡具有抗性的疾病中。这些结果表明本发明的化合物将具有针对实体瘤和起源于恶性血液疾病的肿瘤的治疗活性。此外，本发明的化合物还可用于预防癌细胞的转移、入侵、发炎，和其它具有抗凋亡细胞的特征的疾病中。本发明人经过研究发现，本发明化合物能够抑制IAPs的活性，进而增强Caspases的蛋白水解活性，恢复Caspases的凋亡调节作用。因此，该类化合物可以用于肿瘤的治疗。本发明基于上述发现而得以完成。
发明概述：
本发明的一个方面涉及通式I所示的化合物，其异构体或其可药用盐，
通式I由如下三种结构片段组成：
其中：
选自
R1选自H、C1-C6烷基；
R2选自H、C1-C6烷基；
R3选自H、环戊基、环己基、环庚基、C1-C6烷基、苯基、C1-C6烷基苯基、芳环上被一个或多个羟基或卤素原子取代的C1-C6烷基苯基；
R4选自下列基团：
，其中，Y为H或卤素原子。
根据本发明任一项所述的化合物，其异构体或其可药用盐，其满足如下的（1）-（4）中的任意一项、两项、三项或者四项：
（1）R1选自H、C1-C3烷基；
（2）R2选自H、C1-C3烷基；
（3）R3选自H及下列基团：
（4）Y为H或者F。
本发明的另一方面涉及一种化合物，其异构体或其可药用盐，其为由两个相同或者不同的通式I化合物通过连接链将连接位点进行连接形成的双价化合物，所述连接位点选自如下三种之一：
1）当X是-CHOH时，羟基可作为连接位点，经二价连接后得到第一类双价化合物；
2）当R3为对羟基苯基甲基时，羟基可作为连接位点，经二价连接后得到第二类双价化合物；
3）当R4为含羟基的咪唑并哒嗪类结构时，羟基可作为连接位点，经二价连接后得到第三类双价化合物；
包含连接位点和连接链的结构选自如下结构：
上述的n=4-10表示n为4至10的整数，例如4、5、6、7、8、9或10。
在本发明中，最多同时进行一种双价连接，不同时存在两种及以 上的双价连接。下文中，需要反应式图示里不需要区分的表示连接链时，将统一使用“—link—”代替。
在本发明具体的实施方案中，部分化合物如表1-2中所示。
本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明中任一项所述的化合物，以及药学上可接受的辅料。
本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的化合物在制备治疗和/或预防和/或辅助治疗IAPs过度表达相关的疾病的药物中的用途；具体地，所述疾病选自膀胱癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、多发性脊髓瘤、卵巢癌和宫颈癌，尤其是乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、系统性红斑狼疮和多发性硬化症。
本发明的再一方面涉及一种治疗和/或预防和/或辅助治疗IAPs过度表达相关的疾病的方法，包括给予受试者有效量的本发明中任一项所示的化合物的步骤；具体地，所述疾病选自膀胱癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、多发性脊髓瘤、卵巢癌和宫颈癌，尤其是乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、系统性红斑狼疮和多发性硬化症。
本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的化合物在制备抑制肿瘤细胞的药物中的用途；
具体地，所述肿瘤细胞为下列肿瘤的细胞：
膀胱癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、多发性脊髓瘤、卵巢癌和宫颈癌，尤其是乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌；
具体地，所述肿瘤细胞为SK-OV-3细胞或MDA-MB231细胞。
本发明的再一方面涉及一种在体内或体外抑制肿瘤细胞的方法，包括使用有效量的本发明中任一项所示的化合物的步骤。
本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的化合物在制备或者作为凋亡抑制蛋白抑制剂中的用途；具体地，所述凋亡抑制蛋白选自 NAIP、XIAP、cIAP1、cIAP2、ILP2、Bruce、Survivin和Livin中的任意一种或者多种。
本发明的再一方面涉及一种在体内或体外消除或者减少细胞凋亡抑制的方法，包括使用有效量的本发明中任一项所述的化合物的步骤。在本发明的一个实施方案中，所述方法为非治疗目的的。
本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的化合物在制备阻断凋亡抑制蛋白与Caspase-3、Caspase-7和Caspase-9的相互作用的药物或者试剂中的用途；具体地，所述凋亡抑制蛋白选自NAIP、XIAP、cIAP1、cIAP2、ILP2、Bruce、Survivin和Livin中的任意一种或者多种。
本发明的再一方面涉及一种在体内或体外阻断凋亡抑制蛋白与Caspase-3、Caspase-7和Caspase-9的相互作用的方法，包括使用有效量的本发明中任一项所述的化合物的步骤；具体地，所述凋亡抑制蛋白选自NAIP、XIAP、cIAP1、cIAP2、ILP2、Bruce、Survivin和Livin中的任意一种或者多种。在本发明的一个实施方案中，所述方法为非治疗目的的。
发明详述：
本发明涉及制备通式I化合物或其双价化合物及其药学可接受的盐的制备方法。以下对该方法的一般性描述中，各变量或取代基的具体定义如本发明第一方面化合物的定义。
在本发明的上下文中，使用如下缩略语：
基本合成方案
根据取代基的不同，本发明涉及化合物有着不同的合成方案；同时，根据连接位点和连接链的不同，本发明涉及双价化合物也有不同的连接方案。
通式I化合物的合成遵循以下策略：先将结构片段二和结构片段三进行连接，再与结构片段一相连接。如下图式所示：
对于前两种R4基团（芳基并咪唑类结构），可采取下列路线进行合成：
对于另外4种R4基团（酰胺类结构），直接一步缩合反应即可完成，如：
对于片段，可采用作为合成原料进行，在整体分子合成完成之后用NaOH/MeOH脱除乙酰基保护。
对于带有F取代苯环的R4基团，合成方法同上。
该片段是一个简单的天然/非天然二肽结构，反应时以原料形式存在，可通过以下路线合成：
通式 I 结构（单价结构）的获得：
将上述两个片段通过缩合反应连接，再脱去保护基，得到单价的通式I化合物，最终产物以盐酸盐形式存在。如：
双价化合物的合成：
当单价的通式I化合物结构当中带有可连接位点时，可通过使用适当连接链将其连接为双价化合物。如：
位点1：
位点2：
位点3：
以上三类连接链与带有不同连接位点的单价通式I化合物可以随意组合，并不局限于图例当中的组合方式。以下的发明详述当中，需要反应路线中不加区分的表示连接链时，将统一使用“—link—”代替；连接链的实际反应原料统一使用“Br—link—Br”表示。需要注意的是，如果使用1,6-二氧-2,4-二炔-己二基作为连接链时，实际上是通过“3-溴丙炔取代→二炔基连接”两步反应进行，但为了便于书写，统一使用上述表示方法。
该路线当中涉及的原料片段，如联二芳基、二肽片段以及杂环烷基酰氯等的合成，均有现有成熟路线可以选择。合成详细操作见实施例部分。
通常情况下，最终产物以盐酸盐形式获得；其他形式的药学可接受的盐，可通过先将盐酸盐在碱性水溶液（如NaOH、KOH、K2CO3 等）当中游离，用有机溶剂（如乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷等）提取之后再成盐的方式获取；这一操作也是本领域内常用和成熟的技术方案。
具体合成方案 A
以下图式为例，说明带连接点1型化合物单价结构（如实施例1）的合成，以及相应的二价结构（如实施例23）的合成。
通过suzuki反应、咪唑环构建、缩合形成酰胺键等反应将联二芳基、杂环烷基以及二肽片段等结构组合起来，形成通式I的单价结构。通过亲核取代反应用连接链将哒嗪当中的羟基连接起来，成为相应的二价结构。
合成详细操作及数据见实施例部分。
具体合成方案 B
以下图式为例，说明带连接点2型化合物单价结构（如实施例7）的合成， 以及相应的二价结构（如实施例28）的合成。
通过suzuki反应、咪唑环构建、缩合形成酰胺键等反应将联二芳基、杂环烷基以及二肽片段等结构组合起来，形成通式I的单价结构。因为连接位点处于羟脯氨酸的羟基上，因此开始要用乙酰基将此位点保护起来，在缩合反应之后再水解使其暴露。该羟基可以和3-溴丙炔发生亲核取代反应，再通过炔基之间的偶联反应，将单体连接成为相应的二价结构。如果采用脯氨酸作为原料，则最后生成不带连接位点的单价化合物。
合成详细操作及数据见实施例部分。
具体合成方案 C
以下图式为例，说明带连接点3型化合物单价结构（如实施例17）的合成，以及相应的二价结构（如实施例48）的合成。
本系列合成在二肽中间体当中引入带有羟基连接位点的酪氨酸，在形成二肽中间体之后直接进行二价连接。将二价连接之后的中间体C-4与杂环烷基片段缩合形成酰胺，再经脱保护得到二价化合物。
该系列双价连接在反应路线前半段，因此如果想要合成单价化合物，只需要采用未经双价连接的二肽中间体C-3与中间体C-6缩合形成酰胺键即可。
合成详细操作及数据见实施例部分。
通式I化合物可以用常规方法单个合成，亦可用组合化学的混-分方法或平行合成的方法以库为单位合成，即可以在液相中合成也可以用固相合成方法。反应所用的各种原材料是本领域技术人员根据已有知识可以制备得到的，或者是可以通过文献公知的方法制得的，或者是可以通过商业购得的。以上反应方案中所用的中间体、原材料、试剂、反应条件等均可以根据本领域技术人员已有知识可以作适当改变的。关于制备通式I化 合物更详尽的资料可以参见下文具体实施方式部分。
本发明中，术语“组合物”意指包括包含指定量的各指定成分的产品，以及直接或间接从指定量的各指定成分的组合产生的任何产品。
通常本发明药物组合物含有0.001-90重量％的本发明化合物和/或其药学上可接受的盐。药物组合物可根据本领域已知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明化合物和/或其药学上可接受的盐与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人用的适当的施用形式或剂量形式。
本发明的化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。给药剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、 乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将给药单元制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将给药单元制成胶囊，将有效成分化合物或其可药用盐与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明明胶囊或软胶囊中。也可将有效成分化合物或其可药用盐制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。为了将给药单元制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。
此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
本发明的化合物，或其可药用盐的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，所用的具体化合物，给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。
可改变本发明药物组合物中各活性成分的实际剂量水平，以便所得的活性化合物量能有效针对具体患者、组合物和给药方式得到所需的治疗反应。剂量水平须根据具体化合物的活性、给药途径、所治疗病况的严重程度以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。但是，本领域的做法是，化合物的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。
术语“预防和/或治疗有效量”的本发明化合物指以适用于任何医 学预防和/或治疗的合理效果/风险比治疗障碍的足够量的化合物。
本发明的化合物或者药物组合物的给药对象（受试者）可以是患者或者其它接受本发明组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。
术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。
但应认识到，本发明化合物或药物组合物的总日用量须由主诊医师在可靠的医学判断范围内作出决定。对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体化合物的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体化合物的给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与所采用的具体化合物组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，化合物的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。一般说来，本发明的化合物用于哺乳动物特别是人的剂量可以介于0.001-1000mg/kg体重/天，例如介于0.01-100mg/kg体重/天，例如介于0.01-10mg/kg体重/天。
根据本发明的化合物可以有效地预防和/或治疗本发明所述的各种疾病或病症。
在本发明中，
术语“C1-C6烷基”是指具有1-6个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、2-戊基、异戊基、新戊基、己基、2-己基、3-己基等；C1-C3烷基也可做类似理解。优选的是C1-C3烷基。
术语“C1-C6烷基苯基”是指苯环上被一个或者多个上述的“C1-C6烷基”取代的苯基。C1-C3烷基苯基也可做类似理解。优选的是C1-C3烷基苯基。例如苄基、苯乙基。
术语“芳环上被一个或多个羟基或卤素原子取代的C1-C6烷基苯 基”是指芳环上被一个或多个羟基或卤素原子取代的上述C1-C6烷基苯基。优选地，被芳环上一个羟基或卤素原子取代；更优选地，羟基或卤素原子在对位上取代。
术语“卤素”或“卤原子”是指氟、氯、溴以及碘原子。
具体实施方式：
下面通过具体的中间体和实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些中间体和实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。化合物的熔点由RY-1熔点仪测定，温度计未较正。质谱由Micromass ZabSpec高分辨率质谱仪(分辨率1000)测定。1H-NMR由JNM-ECA-400超导NMR仪测定，工作频率1H-NMR400MHz。
采用合成路线 A 合成实施例 1 及实施例 23 的详细操作
中间体 A-2 ～ A-10 的合成
100g(0.55mol)三氯哒嗪（A-1）溶于330mL无水乙醇，在冰浴的条件下滴加253g甲胺乙醇溶液（滴加过程中保持内温25℃以下）。加毕在室温（21℃）下继续搅拌，有固体生成。5h后过滤，滤饼用水洗涤，大部分溶解，剩余用石油醚洗涤，得白色固体。收集母液（乙醇层），减压旋干溶剂，残余物加入300mL水充分搅拌，过滤后滤饼再次用石油醚洗涤，得米黄色固体，将白色固体和米黄色固体合并，干燥，得63.2g中间体A-2，收率为64.3%。
把37g（0.66mol）氢氧化钾固体粉末充分溶解于300mL无水甲醇，向此溶液中加入58g(0.33mol)中间体A-2，升高温度至80℃使其产生回流。8h后将反应体系冷却至室温，用冰醋酸调节pH至中性，将此混 合液缓慢倾倒入约2500mL冰水中，有固体析出。静置10min后过滤，得米黄色固体（46.1g），将固体干燥后溶于88mL98%的浓硫酸，在冰浴的条件下缓慢滴加27mL浓硝酸。6h后，将反应混合液缓慢倾倒入约2500mL冰水中，有黄色固体析出。静置10min，过滤，滤饼用水、石油醚各洗涤两次，干燥，得42.3g中间体A-3，两步收率是56.3%。
取38g（0.17mol）中间体A-3溶于800mL无水甲醇，升高温度至30℃使固体充分溶解，待完全溶解后，加入雷尼镍18g，通入氢气使压力为30kg·m-3，在40℃条件下反应5h后，过滤，用2mol·L-1盐酸水溶液浸泡滤出的雷尼镍，甲醇相减压浓缩并静置过夜，析出白色固体。过滤后固体烘干得10.5g中间体A-4，收率是32.3%。
10.0g中间体A-4与苯硼酸6.0g、1,1-双二苯基膦二茂铁二氯化钯复合物1.80g、1,1-双二苯基膦二茂铁1.50g以及10.0g饱和碳酸钾水溶液混悬于300mL二氧六环当中，回流加热3小时。冷却后减压蒸干溶剂，将残余物溶解在300mL乙酸乙酯当中，过滤去除不溶物，再用饱和食盐水100mL洗涤2次，有机相用无水硫酸钠干燥。过滤去除干燥剂，柱色谱分离（梯度洗脱，石油醚/乙酸乙酯=2:1～1:1），得到浅黄色油状物，放置后逐渐固化。得中间体A-5，重量7.40g，收率67.2%。
苄氧羰酰基保护的脯氨酸12.5g（50mmol），用15mL二氯亚砜和10mL二氯甲烷的混合溶剂溶解，加热回流1小时后冷却，减压蒸去残余溶剂，得到棕色油状物，再将其溶于25mL二氯甲烷中待用。将9.5g中间体A-5溶于100mL二氯甲烷中，并加入13.8mL三乙胺，形成混悬液。冰浴下，向此混悬液中滴加酰氯溶液，15分钟滴完，滴完后反应1小时，减压蒸干溶剂。将残余物溶解在200mL乙酸乙酯当中，用饱和食盐水100mL洗涤2次，有机相用无水硫酸钠干燥。过滤去除干燥剂，柱色谱分离（洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯=1/1），得中间体A-6，淡黄色固体14.8g，收率70.5%。
中间体A-6取6.40g（13.9mmol）溶解在100mL乙酸当中，60℃加热反应1小时，减压蒸除溶剂，得白色固体。用少量石油醚/乙酸乙酯（1:1）的混合溶剂洗涤，得到中间体A-7，纯白色固体5.90g，收率为 95.8%。
将此固体溶解于80mL无水甲醇当中，加入10%钯碳0.60g，通过氢气（压力为5bar），反应7小时后过滤，滤液减压浓缩得中间体A-8（3.58g），无色油状物，收率为84.6%。
冰浴控温0℃以下，将Boc-丙氨酸1.89g(10mmol)溶于二氯甲烷中，依次小心加入DCC2.27g，HOBt1.49g，2S-环己基-L-甘氨酸甲酯盐酸盐2.07g(10mmol)，三乙胺1.01g，室温反应过夜，过滤除去白色沉淀DCU，有机相依次用10%的柠檬酸、饱和食盐水、4%的碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，减压旋干后经硅胶柱层析得白色固体2.73g。将此固体溶于15mL甲醇，加入2NNaOH 10mL，室温反应2小时，TLC检测反应进程，1N HCl调节pH近中性，减压旋去部分甲醇，加水稀释，滤去不溶性杂质，滤液于冰浴中1N HCl酸化，立即有白色固体析出，过滤收集，水洗至洗液近中性，干燥，甲醇-水重结晶得到A-9，A-9为无色针状结晶2.05g，两步总收率为63.4%。
将A-9（3.80mmol）与A-8（3.11mmol）组分混合溶于3mL干燥二氯甲烷中，在冰浴的条件下，依次加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（3.80mmol）与1-羟基苯骈三氮唑（3.80mmol），加毕自然升至常温，3h后减压浓缩，加入30mL乙酸乙酯溶解，依次用10%柠檬酸水溶液（质量分数）、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液各30mL洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱分离纯化，得中间体A-10（1.46g，2.55mmol），收率82.1%。
实施例 1 的合成
将中间体A-10（0.5mmol）溶于尽量少的乙酸乙酯中，在冰浴条件下，加入3mol·L-1氯化氢/乙酸乙酯溶液3mL，低温反应0.5h,室温继续搅拌3h。有白色固体析出，过滤，用乙醚洗涤固体，干燥得白色固体221mg，即单价实施例1（盐酸盐形式），收率为83.2%。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)，δ(ppm):0.85-0.93(m,5H),1.32-1.34(d,3H,J=7.2Hz),1.36-1.52(m,7H),2.00-2.10(m,2H),2.29-2.34(m,2H),2.46-2.49(m,3H), 3.80-3.95(m,3H),4.20(s,3H),4.46-4.48(t,1H,J=8.0Hz),5.23-5.26(m,1H),7.45-7.48(m,3H),8.32-8.35(m,2H),8.66-8.69(d,1H,J=8.0Hz),8.86(br s,1H),9.36(br s,1H),12.89(s,1H),MS m/e:520.3([M+1]+).
实施例 23 的合成
向全自动组合微波合成仪器（CEM公司产品）专用10mL密闭反应管当中加入中间体A-10（80mg，0.138mmol）、1,6-二溴己烷（100mg，0.415mmol）、催化量的碘化钾以及3mL丙酮，设定反应条件为120℃/20分钟。反应体系减压蒸干溶剂后柱色谱分离，洗脱溶剂为二氯甲烷/甲醇（20:1），得到62mg油状物，收率为72.5%。
将此油状物溶解在尽量少的乙酸乙酯中，在冰浴条件下，加入3mol·L-1氯化氢/乙酸乙酯溶液3mL，低温反应0.5h,室温继续搅拌1h。有白色固体析出，过滤，用乙醚洗涤固体。干燥得白色固体46mg，即双价化合物实施例23（二盐酸盐形式），收率为81.4%。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)，δ(ppm):0.88-0.97(m,5H),1.32-1.34(d,3H,J=7.2Hz),1.35-1.62(m,8H),1.70-2.12(m,6H),2.22-2.35(m,2H),2.47-2.49(m,3H),3.50-3.53(t,1H,J=6.4Hz),3.58-3.62(m,1H),3.79-3.82(m,1H),3.88-3.94(m,2H),4.20(s,3H),4.21-4.30(m,2H),4.44-4.48(t,1H,J=7.6Hz),5.23-5.26(m,1H),7.46-7.49(m,3H),8.34-8.36(m,2H),8.67-8.69(d,1H,J=8.0Hz),8.81(br s,1H),9.01(br s,1H)(由于是对称结构，实际氢数应为该数据的两倍)；MS m/e:1121.6([M+1]+).
采用合成路线 B 合成实施例 7 及实施例 28 的详细操作
中间体 B-2 ～ B-8 的合成
145g2,3-二氯硝基苯（0.76mol）溶于1800mL的NH3的乙醇饱和溶液，在高压釜中，反应体系密闭并升温至140℃。2天后停止反应，减压浓缩后有黄色固体析出。将黄色固体用水洗涤直至水相呈中性，过滤后将固体烘干，得2-氯-6-硝基-苯胺124g，粗品收率为95%，不需要纯化直接投入下一步。
取2-氯-6-硝基-苯胺0.14mol与0.17mol苯硼酸溶于750mL1,4-二氧六 环，加入0.81mol的碳酸钾固体粉末，依次加入0.014mol的1,1-双二苯基膦二茂铁、0.014mol的1,1-双二苯基膦二茂铁二氯化钯复合物，升温至120℃使体系回流。经10h反应完成，减压浓缩，用500mL乙酸乙酯稀释后，乙酸乙酯层用水洗涤至水相呈中性，无水硫酸钠干燥，硅胶柱分离纯化，得中间体B-2（19.6g），收率为65.5%。
将84mmol中间体B-2溶于370ml甲醇/水=1/1的混合溶剂中，加入115g（2.15mol）氯化铵固体粉末，在冰浴下加入67g(1.03mol)锌粉。经1h反应完全，过滤除去混合液中的固体，母液减压浓缩，加入300mL乙酸乙酯稀释，用300mL水洗涤一次,有机相用无水硫酸钠干燥。得中间体B-3(13.4g)，收率为87.2%，不需要纯化直接投入下一步反应。
在-15℃条件下，将N-Cbz保护的羟脯氨酸衍生物11.3mmol同等摩尔的N-甲基吗啡啉混溶于60mL干燥二氯甲烷，搅拌10min后滴加11.3mmol氯甲酸异丁酯，加毕继续搅拌20min，将14.7mmol中间体B-3溶于15mL二氯甲烷溶液滴加至上述体系中，加毕低温反应1h后移到室温反应2h即可生成中间体B-4（5.58g），收率为80.3%。
将14.2mmol中间体B-4溶于100mL冰醋酸，升高温度至60℃。1h后减压浓缩，得中间体B-5（6.14g），收率为95%。
将上一步所得中间体B-5溶于80mL无水甲醇，加入10%钯碳（质量分数）0.60g，通入氢气（压力为4bar），反应7h即可完成催化氢化，过滤使反应液澄清，减压浓缩，得中间体B-6（3.55g），收率为82.2%。
将N-Boc保护的二肽片段N-甲基-丙氨酸-缬氨酸(9.2mmol)与中间体B-6（8.0mmol）组分混合溶于40mL干燥二氯甲烷中，在冰浴的条件下，依次加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（9.2mmol）与1-羟基苯骈三氮唑（9.2mmol），加毕自然升至常温，3h后减压浓缩，加入150mL乙酸乙酯溶解，依次用10%柠檬酸水溶液（质量分数）、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液各40mL洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱分离纯化，得到淡黄色油状物。将其使其溶于30mL甲醇，冷却到0℃后加入2mol·L-1氢氧化钠水溶液30mL。搅拌1h后蒸除大部分溶剂，向残留液中缓慢滴加1mol·L-1盐酸水溶液，调节残留液pH值为中性，用60mL乙酸乙酯萃取，干 燥后硅胶柱分离纯化，得中间体B-7（1.95g），收率43.2%。
实施例 7 的合成
将中间体B-7（1mmol，536mg）溶于尽量少的乙酸乙酯中，在冰浴条件下，加入3mol·L-1氯化氢/乙酸乙酯溶液3mL，低温反应0.5h,室温继续搅拌3h。有白色固体析出，过滤，用乙醚洗涤固体，干燥得白色固体402mg，即单价实施例7（盐酸盐形式），收率为80.2%。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)，δ(ppm):0.80-0.91(d,6H,J=6.6Hz),1.33-1.35(d,3H,J=6.8Hz),2.15-2.21(m,2H),2.45(s,3H),2.50-2.57(m,1H),3.60(brs,1H),3.72(br s,1H),3.83-3.91(m,3H),4.47-4.50(m,2H),5.35-5.37(m,1H),7.56-8.73(m,8H),8.94(brs,1H),9.58(br s,1H)；MS m/e:464.4([M+1]+)。
实施例 28 的合成
将1.38mmol70%氢化钠（质量分数）在冰浴条件下悬浮于5ml N,N-二甲基甲酰胺中，加入中间体B-7(0.55mmol)，低温搅拌10min，加入1.10mmol3-溴丙炔，4h后，向反应液中加入30mL水和30mL乙酸乙酯，分层，弃去水相，无水硫酸钠干燥，硅胶柱分离纯化，得中间体B-8（193mg），收率60.6%。
将中间体B-8(0.19mmol)溶于3mL无水丙酮中，常温下加入四甲基乙二胺(0.38mmol)和氯化亚铜(0.38mmol)，反应5h后，减压浓缩，加入30mL乙酸乙酯稀释，依次用10%柠檬酸水溶液（质量分数）、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液各30mL洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱分离纯化，得中间体B-9（61.8mg），收率54.5%。同上方法脱除N-Boc保护基，干燥得白色固体45.6mg，即双价实施例28（二盐酸盐形式），收率为81%。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)，δ(ppm):0.73-0.81(d,6H,J=8.0Hz),1.32-1.34(d,3H,J=8.2Hz),1.91-2.04(m,2H),2.43(s,3H),2.51-2.60(m,1H),3.75-3.90(m,2H),4.02-4.06(m,1H),4.38-4.42(m,2H),4.40(brs,1H),5.44-5.45(d,1H),5.65(s,2H),7.45-8.74(m,8H),8.91(br s,1H),9.56(br s,1H)(由于是对称结构，实际氢数应为该数据的两倍)；MS m/e:1002.2([M+1]+)。
采用合成路线 C 合成实施例 17 及实施例 48 的详细操作
中间体 C-2 ～ C-8 的合成
L-酪氨酸10g溶于100mL无水甲醇，将此溶液冷却至0℃，缓慢加入20mL二氯甲砜。室温反应2d，减压浓缩，再加入30mL甲醇，反复浓缩两次，减压旋干得白色固体，甲醇-乙醚重结晶得白色结晶C-2（12.1g），产率为95%。
冷却槽控温-15℃下，将N-甲基-Boc-L-丙氨酸8.8g（43.3mmol）与等摩尔的N-甲基吗啡啉混溶于200mL无水二氯甲烷，搅拌10min后滴加43.3mmol氯甲酸异丁酯，加完后继续搅拌20min。将10g（43.3mmol）C-2溶于20mL二氯甲烷溶液，加入等摩尔N-甲基吗啡啉游离后滴加至上述体系中，加毕低温反应1h后移到室温反应2h后处理。减压浓缩，加入150mL乙酸乙酯溶解，依次用10%柠檬酸水溶液（质量分数）、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液各150mL洗涤。收集有机相，减压旋干得到淡黄色油状物，使其溶于50mL甲醇，冷却到0℃后加入2mol·L-1氢氧化钠水溶液50mL。搅拌1h后蒸除大部分溶剂，向残留液中缓慢滴加1mol·L-1盐酸水溶液，调节残留液pH值约为2-3，有白色固体析出，过滤后将固体烘干得中间体C-3，称重10.1g，产率63.3%。
将C-3（3.80g，10mmol）溶于无水N,N-二甲基甲酰胺20mL当中，常温下加入1.5g碳酸钾固体粉末搅拌数分钟，然后向其中加入1,6-二溴己烷1.25g，反应2天。TLC检测反应进程，反应完成后，向反应体系中加入水和乙酸乙酯各50mL，再用乙酸乙酯萃取水相30mL×3次后，收集有机相，将收集后的有机相再用饱和氯化钠水溶液30mL×3次洗涤，无水硫酸钠干燥有机相。经硅胶柱层析分离（洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯=2/1）得淡黄色油状物3.84g，直接投入下一步。
将此油状物溶于20mL甲醇，冰浴下加入2N NaOH水溶液20mL，缓慢升至室温反应2小时，TLC检测反应进程，反应完成用1N HCl调节pH约为3，减压旋干甲醇，加水稀释，乙酸乙酯30mL×2次萃取水相，无水硫酸钠干燥有机相，过滤，蒸干溶剂得到透明油状物中间体C-4（3.42g）。
冷却槽控温-15℃下，将Boc-L-脯氨酸2.15g（10mmol）与等摩尔的N-甲基吗啡啉混溶于20mL无水二氯甲烷，搅拌10min后滴加10mmol氯甲 酸异丁酯，加完后继续搅拌20min。将1.83g（10mmol）二苯基甲胺溶于10mL二氯甲烷后滴加至上述体系中，加毕低温反应1h后移到室温反应2h后处理。减压浓缩，加入30mL乙酸乙酯溶解，依次用10%柠檬酸水溶液（质量分数）、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液各20mL洗涤。收集有机相，干燥后过滤旋干得C-5粗品。将C-5粗品用少量乙酸乙酯溶解后，加入3mol·L-1氯化氢/乙酸乙酯溶液10mL，搅拌30min。有白色固体析出，过滤后将固体烘干得中间体C-6（二盐酸盐形式），称重1.98g，两步收率63.3%。
实施例 17 的合成
将C-3（1.90g，5mmol）溶于10mL甲醇当中，冰浴下加入2N NaOH水溶液10mL，缓慢升至室温反应2小时，TLC检测反应进程，反应完成用1N HCl调节pH约为3，减压旋干甲醇，加水稀释，乙酸乙酯15mL×2次萃取水相，无水硫酸钠干燥有机相，过滤，蒸干溶剂得到透明油状物中间体C-3`（1.52g）。
取133mg中间体C-3`（0.50mmol）、158mg中间体C-6（0.50mmol）和0.50mmol N-甲基吗啡啉加入到3mL二氯甲烷中，在冰浴下，依次加入EDC(0.50mmol)、HOBt(0.50mmol)，加毕自然升至常温，3h后减压浓缩，加入10mL乙酸乙酯溶解，依次用5mL10%柠檬酸水溶液（质量分数）、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱分离纯化，得到固体。将此固体溶于尽量少的乙酸乙酯中，在冰浴条件下，加入3mol·L-1氯化氢/乙酸乙酯溶液3mL，低温反应0.5h，室温继续搅拌3h。有白色固体析出，过滤，用乙醚洗涤固体，干燥得白色粉末状固体122mg，即单价实施例17（盐酸盐形式），收率43%。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δppm：1.30-1.32(3H,d,J=8Hz),2.09-2.14(3H,s),2.09-2.51(4H,m),2.53-2.54(2H,m),3.52(1H,brs),3.66-3.75(2H,m),4.22(1H,m),4.79-4.82(1H,t,J=6Hz),5.38-5.41(1H,d,J=8Hz),6.09-6.11(1H,d,J=8Hz),6.76-8.97(14H,m),8.69(1H,brs),9.30(1H,brs),9.50(1H,brs)；ESI-MS m/e(%)：529.3([M+1]+)。
实施例 48 的合成
150mg中间体C-4(0.18mmol)、117mg中间体C-6(0.37mmol)和0.37 mmol N-甲基吗啡啉加入到3mL二氯甲烷中，在冰浴下，依次加入EDC(0.37mmol)、HOBt(0.37mmol)，加毕自然升至常温，3h后减压浓缩，加入10mL乙酸乙酯溶解，依次用5mL10%柠檬酸水溶液（质量分数）、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱分离纯化，得到固体。将此固体溶于尽量少的乙酸乙酯中，在冰浴条件下，加入3mol·L-1氯化氢/乙酸乙酯溶液3mL，低温反应0.5h，室温继续搅拌3h。有白色固体析出，过滤，用乙醚洗涤固体，干燥得白色粉末状固体55mg，即双价实施例48（二盐酸盐形式），收率30%。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):1.32-1.33(3H,d,J=4.0Hz),1.44-2.39(8H,m),2.13(3H,s),2.62-3.01(2H,m),3.39-3.42(2H,m),3.61-3.65(1H,t,J=8.2Hz),3.69(1H,brs),3.88-3.91(2H,t,J=8.4Hz),4.49-4.52(1H,q,J=4.0Hz),4.72-4.76(1H,t,J=8.2Hz),6.10-6.12(1H,d,J=8.4Hz),6.75-8.98(14H,m),8.70(1H,brs),9.57(1H,brs)(由于是对称结构，实际氢数应为该数据的两倍)；ESI-MS m/e(%)：1140.1([M+1]+)。
通过以上合成策略，获得以下的单价通式I化合物。如下面的表1：
表1：本发明的部分化合物（单价）
通过以上合成策略，获得以下的双价化合物。如下面的表2：
表2：本发明的部分化合物（双价）
药理学试验例：
XIAP、cIAP1/2都有三个BIR结构域。本领域公认，如果抑制其中一个结构域（一般选择BIR3）即可抑制其抗凋亡能力，如果能够同时抑制两个BIR结构域（如BIR2-BIR3，简写成LB2B3）即可更大程度的抑制其活性。
IAPs有8个成员，但是最为重要的是XIAP，目前动物、临床结果也证明，单独抑制XIAP就能起到治疗癌症的作用，如果能同时抑制cIAP1/2或者ML-IAP则更好。
化合物活性评价的方法
A）分子水平活性评价：荧光极化法测定合成的化合物与IAPs-BIR的结合
①荧光示踪剂结合XIAP-BIR3和cIAP1-BIR3的平衡解离常数（Kd）的测定：将固定浓度的荧光示踪剂（SM-F2，IAPs抑制剂）与靶标蛋白质组成混合物，其中蛋白质浓度不断增加直至饱和。通过对该混合物总荧光极化强度的监测，从而测定SM-F2分别结合XIAP-BIR3(残基241–356)和cIAP1-BIR3(残基253–363)的平衡解离常数（Kd）。 荧光极化强度值在96-孔荧光检测微孔板（Microfluor 2，黑色极低背景、圆底）（Thermo Scientific）中使用超酶标仪（Tecan U.S.,Research Triangle Park,NC）测定。向每个孔的试验缓冲液（含100mM磷酸氢二钾、pH7.5,100μg/ml牛γ-球蛋白,0.02%叠氮化纳，4%DMSO,Invitrogen公司）中加入浓度分别为2nM（测定与XIAP-BIR3的结合）和1nM（测定与cIAP1-BIR3的结合）SM-F2和相应的浓度不断升高的靶标蛋白，体系最终的体积为125μL。将96-孔板在室温培养3小时并轻轻的摇动以确保达到平衡。在激发波长为485nm和发射波长为530nm处测定极化强度，以毫极化单位（mP）表示测定值。使用Graphpad Prism 5.0软件（Graphpad Software,San Diego,CA）通过拟合S型（sigmoidal）剂量-依赖FP增加值作为蛋白浓度的函数计算平衡解离常数（Kd）。
②通过竞争结合实验测定抑制剂的Ki值：通过抑制剂的剂量-依赖竞争结合实验测定抑制剂的Ki值。在该实验中，逐渐稀释抑制剂的浓度，不同浓度的抑制剂分别与固定浓度的荧光示踪剂（SM-F2）对固定浓度（为上述测定Kd值的2-3倍）的靶标蛋白展开竞争性结合。将5μL不同浓度的受试化合物的DMSO溶液和120μL含有预先孵育的靶标蛋白/SM-F2复合物的缓冲溶液（含100mM磷酸氢二钾、pH7.5,100μg/ml牛γ-球蛋白，0.02%叠氮化纳，4%DMSO,Invitrogen公司）加入到96-孔板中，室温孵育3小时并轻轻摇动。对于测定受试化合物与SM-F2同XIAP-BIR3的竞争性结合，体系中XIAP-BIR3与SM-F2的最终浓度分别为10nM和2nM；而对于同cIAP1-BIR3的结合，体系中cIAP1-BIR3和SM-F2的最终浓度分别为3nM和1nM。每一块96-孔板中，均含有阴性对照组和阳性对照组，阴性对照组只含有靶标蛋白/SM-F2复合物（抑制率相当于0%），阳性对照组只含有游离的SM-F2（抑制率相当于100%）。FP值的测定与上述描述的方法相同。受试化合物的IC50通过竞争曲线的非线性回归拟合确定。
竞争性抑制剂的Ki通过下面方程计算得到：
Ki=[I]50/([L]50/Kd+[P]0/Kd+1)
其中，
[I]50表示50%抑制时的抑制剂浓度，[L]50是50%抑制时的标记配体（SM-F2）浓度，[P]0是0%抑制时的蛋白浓度，Kd是平衡解离常数。
B）细胞水平活性评价：采用WST-8方法评价化合物对肿瘤细胞系（MDA-MB231、SK-OV-3）增殖的抑制作用。具体操作为：
收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入200μl，铺板使待测细胞调密度至10000/孔，(边缘孔用无菌PBS填充)。设置空白对照，阳性对照和阴性对照。5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入一定浓度药物。5%CO2，37℃孵育28小时，倒置显微镜下观察。每孔加入20μlWST-8溶液(5mg/ml)，继续培养1.5h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150 μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD450nm处测量各孔的吸光值。同时设置调零孔(培养基、WST-8、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、WST-8、二甲基亚砜)。
由上述原始数据，按下列公式求出生长抑制率(IR)。
试验结果
如下面的表3和表4。
表3：实施例化合物对IAPs的体外活性强度（IC50）
编号 XIAP-BIR3 cIAP1-BIR3 cIAP2-BIR3 XIAP-LB2B3
实施例1 B C nd B
实施例2 B C nd B
实施例3 B C nd B
实施例4 B A A A
实施例5 B A A B
实施例6 B A A A
实施例7 B B B B
[0195]
实施例8 B A A A
实施例9 B B B B
实施例10 B A A B
实施例11 B B A B
实施例12 B A A B
实施例13 C A A B
实施例14 B A A B
实施例15 B A B B
实施例16 C B B C
实施例17 C B B C
实施例18 C B B C
实施例19 C C nd C
实施例20 C D nd C
实施例21 C C nd C
实施例22 C C nd C
实施例23 C C nd C
实施例24 D D nd D
实施例25 D D nd D
实施例26 D D nd D
实施例27 D D D C
实施例28 D D D B
实施例29 D D C B
实施例30 D D C B
实施例31 D C D A
实施例32 D C D A
实施例33 D D D B
实施例34 D D D B
实施例35 D D D D
实施例36 D D D B
[0196]
实施例37 C C C A
实施例38 D C C B
实施例39 D C D B
实施例40 D D D C
实施例41 D B C A
实施例42 D B C A
实施例43 D B C A
实施例44 D B C A
实施例45 C A B A
实施例46 D A B A
实施例47 C A B A
实施例48 D A B A
实施例49 D A B A
实施例50 C A B A
实施例51 C A B A
实施例52 C B B A
实施例53 C A B A
实施例54 D A B A
实施例55 D B B A
说明：A、B、C、D代表不同的IC50值范围。
A≤100nM；100nM＜B≤500nM；500nM＜B≤1μM；D＞1μM；
“nd”表示未测定。
表4：实施例化合物细胞水平活性评价（100μM，抑制率%）
编号 SK-OV-3 MDA-MB231 编号 SK-OV-3 MDA-MB231
紫杉醇 76.8 38.5 实施例28 -2.8 18.4
实施例1 97.8 80.3 实施例29 9.4 21.2
实施例2 -11.7 51 实施例30 -1.2 10.3
实施例3 92.3 72 实施例31 5.2 27.2
[0202]
实施例4 -7.1 70.9 实施例32 -4.0 27.8
实施例5 10.7 64.4 实施例33 3.3 17.9
实施例6 10.1 57.2 实施例34 4.1 18.5
实施例7 -7.2 15.2 实施例35 16.3 21.4
实施例8 12.1 66.7 实施例36 22.4 46.9
实施例9 3.4 14.8 实施例37 36.1 58.3
实施例10 33.6 71.5 实施例38 20.8 33.4
实施例11 9.7 21.2 实施例39 17.9 41.1
实施例12 25.9 63.7 实施例40 19.4 46.3
实施例13 -11.2 21.3 实施例41 85.4 94.0
实施例14 -3.8 44.3 实施例42 12.5 76.4
实施例15 -0.1 27.5 实施例43 44.8 65.1
实施例16 6.8 32.8 实施例44 68.2 77.0
实施例17 23.7 55.9 实施例45 5.0 83.5
实施例18 0.6 25.6 实施例46 20.3 72.4
实施例19 88.5 66.3 实施例47 28.3 83.9
实施例20 98.0 79.3 实施例48 6.7 85.7
实施例21 95.6 89.1 实施例49 70.0 91.1
实施例22 95.7 55.7 实施例50 10.4 66.4
实施例23 93.9 22.0 实施例51 8.9 70.2
实施例24 92.0 3.7 实施例52 22.6 69.5
实施例25 93.0 9.7 实施例53 27.5 77.3
实施例26 85.7 25.4 实施例54 10.2 82.4
实施例27 10.9 33.2 实施例55 2.8 70.9
从上述数据可以看出，本发明的化合物对肿瘤细胞系有着较强的生长抑制作用；部分化合物对特定的肿瘤细胞具有较为明显的选择性。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (12)

1.通式I所示的化合物，其异构体或其可药用盐，
通式I由如下三种结构片段组成：
其中：
选自
R1选自H、C1-C6烷基；
R2选自H、C1-C6烷基；
R3选自H、环戊基、环己基、环庚基、C1-C6烷基、苯基、C1-C6烷基苯基、芳环上被一个或多个羟基或卤素原子取代的C1-C6烷基苯基；
R4选自下列基团：
，其中，Y为H或卤素原子。
2.根据权利要求1所述的化合物，其异构体或其可药用盐，其满足如下的（1）-（4）中的任意一项、两项、三项或者四项：
（1）R1选自H、C1-C3烷基；
（2）R2选自H、C1-C3烷基；
（3）R3选自H及下列基团：
（4）Y为H或者F。
3.一种化合物，其异构体或其可药用盐，其为由两个相同或者不同的通式I化合物通过连接链将连接位点进行连接形成的双价化合物，所述连接位点选自如下三种之一：
1）当X是-CHOH时，羟基可作为连接位点，经二价连接后得到第一类双价化合物；
2）当R3为对羟基苯基甲基时，羟基可作为连接位点，经二价连接后得到第二类双价化合物；
3）当R4为含羟基的咪唑并哒嗪类结构时，羟基可作为连接位点，经二价连接后得到第三类双价化合物；
包含连接位点和连接链的结构选自如下结构：
4.根据权利要求1所述的化合物，其异构体或其可药用盐，其中所述化合物选自：
3 -->
4 -->
5 -->
5.根据权利要求3所述的化合物，其异构体或其可药用盐，其中所述化合物选自：
7 -->
8 -->
9 -->
10 -->
11 -->
12 -->
13 -->
14 -->
6.一种药物组合物，其包含权利要求1至5中任一项所述的化合物，以及药学上可接受的辅料。
7.权利要求1至5中任一项所述的化合物在制备治疗和/或预防和/或辅助治疗IAPs过度表达相关的疾病的药物中的用途；具体地，所述疾病选自膀胱癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、多发性脊髓瘤、卵巢癌和宫颈癌，尤其是乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、系统性红斑狼疮和多发性硬化症。
8.权利要求1至5中任一项所述的化合物在制备抑制肿瘤细胞的药物中的用途；
具体地，所述肿瘤细胞为下列肿瘤的细胞：
膀胱癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、多发性脊髓瘤、卵巢癌和宫颈癌，尤其是乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌；
具体地，所述肿瘤细胞为SK-OV-3细胞或MDA-MB231细胞。
9.权利要求1至5中任一项所述的化合物在制备或者作为凋亡抑制蛋白抑制剂中的用途；具体地，所述凋亡抑制蛋白选自NAIP、XIAP、cIAP1、cIAP2、ILP2、Bruce、Survivin和Livin中的任意一种或者多种。
10.一种非治疗目的的在体内或体外消除或者减少细胞凋亡抑制的方法，包括使用有效量的权利要求1至5中任一项所述的化合物的步骤。
11.权利要求1至5中任一项所述的化合物在制备阻断凋亡抑制蛋白与Caspase-3、Caspase-7和Caspase-9的相互作用的药物或者试剂中的用途；具体地，所述凋亡抑制蛋白选自NAIP、XIAP、cIAP1、cIAP2、ILP2、Bruce、Survivin和Livin中的任意一种或者多种。
12.一种非治疗目的的在体内或体外阻断凋亡抑制蛋白与Caspase-3、Caspase-7和Caspase-9的相互作用的方法，包括使用有效量的权利要求1至5中任一项所述的化合物的步骤；具体地，所述凋亡抑制蛋白选自NAIP、XIAP、cIAP1、cIAP2、ILP2、Bruce、Survivin和Livin中的任意一种或者多种。
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