CN115317625A - 一种小干扰rna在制备改善鼻咽癌预后的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种小干扰RNA在制备改善鼻咽癌预后的药物中的应用。裸鼠体内实验证明，以造模成功的临床高度相关裸鼠鼻咽癌原位转移模型和裸鼠皮下复发模型作为实验对象，敲减RIPK1的小分子干扰RNA联合顺铂腹腔给药后，复发及转移率降低，生存率提高。本发明对鼻咽癌的治疗效果有一定的改善，一定程度上可以抑制鼻咽癌的复发和转移，从而提高鼻咽癌患者的生存率，改善其预后，具有重要的开发和应用前景。

Description

一种小干扰RNA在制备改善鼻咽癌预后的药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种小干扰RNA在制备改善鼻咽癌预后的药物中的应用。
背景技术
鼻咽癌(NPC)是一种鼻咽上皮鳞状细胞癌。根据美国国家综合癌症网络(NCCN)的指南，早期鼻咽癌的主要治疗方法是放疗，然而超过70％的新诊断鼻咽癌病例被归类为局部晚期疾病，其治疗方式主要为化疗联合放疗。尽管放疗技术提高了生存率，但导致鼻咽癌相关死亡的主要原因是治疗后的复发和播散性转移。虽然大多数鼻咽癌患者在诊断时并未出现明显的转移，但在成功治疗原发肿瘤数年后，仍有相当一部分人死于播散性转移。因此，晚期鼻咽癌的治疗后复发和转移可能是休眠肿瘤细胞被特定信号重新激活的结果。研究表明，治疗诱导的休眠已被证明会导致持久的增殖停滞，导致多倍体巨大肿瘤细胞(PGCC)的形成，PGCC有助于癌症的维持、复发和转移。目前，临床缺乏靶向休眠多倍体肿瘤细胞从而抑制鼻咽癌的复发、转移，改善其预后的特异性治疗方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了小干扰RNA在制备改善鼻咽癌预后的药物中的应用。
为了实现上述发明目的，提供了如下技术方案：
本发明提供了一种小干扰RNA在制备改善鼻咽癌预后的药物中的应用，所述小干扰RNA用于敲减RIPK1基因表达，所述小干扰RNA具有与RIPK1的信使RNA互补的核苷酸序列。
进一步的，所述小干扰RNA为si-RIPK1，所述小干扰RNA的核苷酸序列为SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列，所述小干扰RNA的3’端修饰有两个呈单链悬挂结构的脱氧核糖核苷酸。
进一步的，所述改善鼻咽癌预后的药物为抑制鼻咽癌复发和/或转移的药物。
进一步的，所述抑制鼻咽癌复发和/或转移的药物通过敲减RIPK1基因表达抑制休眠多倍体巨大肿瘤细胞的生成，进而抑制鼻咽癌复发和/或转移。
本发明还提供了一种改善鼻咽癌预后的药物，所述药物的活性成分包括si-RIPK1。
进一步的，所述药物组合物包括si-RIPK1和化疗药物。
进一步，所述化疗药物为用于杀死鼻咽癌肿瘤细胞的药物。
进一步的，所述化疗药物为紫杉醇或顺铂。
本发明还提供了一种用于治疗鼻咽癌的药物组合物，所述药物组合物包括化合物si-RIPK1和化疗药物。
进一步的，所述化疗药物为用于杀死鼻咽癌肿瘤细胞的药物。
进一步的，所述化疗药物为紫杉醇或顺铂。
上述药物或药物组合物的剂型可以为任何一种适合于临床上使用的剂型，包括注射剂、胶囊剂、片剂、丸剂或颗粒剂。
进一步的，上述药物或药物组合物的剂型为注射剂。
相对于现有技术，本发明具有以下技术效果：
1.本发明提供的si-RIPK1可以高效敲减RIPK1基因表达。
2.si-RIPK1在体外实验中，可以抑制休眠多倍体巨大肿瘤细胞的形成。
3.以造模成功的临床高度相关裸鼠皮下复发模型作为实验对象，发现si-RIPK1可以显著抑制休眠多倍体巨大肿瘤细胞的形成，显著抑制鼻咽癌的复发。
4.以造模成功的临床高度相关裸鼠鼻咽癌原位转移模型作为实验对象，发现si-RIPK1可以显著抑制休眠多倍体巨大肿瘤细胞的形成，显著抑制鼻咽癌的转移。
5.以造模成功的临床高度相关裸鼠鼻咽癌原位转移模型作为实验对象，发现si-RIPK1可以使模型裸鼠的生存率显著提高。
5.si-RIPK1用于制备治疗鼻咽癌的药物，成本较低，在安全剂量范围内，药物毒性小，稳定性好，具有重要的开发与应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需使用的附图做简单的介绍。
图1为si-RIPK1敲减RIPK1基因表达效率示意图；
图2为体外实验第7天对照组1和si-RIPK1组1细胞形态的光学显微镜下图；
图3为体外实验对照组2和si-RIPK1组2细胞活性变化图；
图4为临床高度相关裸鼠皮下复发模型实验结果示意图；其中，A图为对照组3、顺铂组3、si-RIPK1组3皮下肿瘤生长情况折线图；B图为对照组3、顺铂组3、si-RIPK1组3皮下原发肿瘤中休眠多倍体巨大肿瘤细胞数量柱状图；C图为对照组3、顺铂组3、si-RIPK1组3复发率折线图；
图5为临床高度相关裸鼠鼻咽癌原位转移模型实验结果示意图；其中，A图为对照组4、顺铂组4、si-RIPK1组4裸鼠鼻咽癌原位肿瘤中休眠多倍体巨大肿瘤细胞数量柱状图；B图为对照组4、顺铂组4、si-RIPK1组4转移率折线图；C图为对照组4、顺铂组4、si-RIPK1组4生存率折线图。D图为对照组4、顺铂组4、si-RIPK1组4裸鼠体重变化折线图。
具体实施方式
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明中，所有原料及试剂均可由市场购得。
实施例1：si-RIPK1的设计及干扰效果验证
根据siRNA靶序列基本原则，针对RIPK1基因设计1条siRNA序列，即si-RIPK1，包括正义链和反义链，其碱基序列如下：
正义链(下划线为SEQ ID NO:1)
5’-GGGCGAUAUUUGCAAAUAAdTdT-3’；
反义链(下划线为SEQ ID NO:2)
5’-UUAUUUGCAAAUAUCGCCCdTdT-3’；
本实施例选择的阴性对照(NC)siRNA碱基序列如下：
正义链5’-GGCUCUAGAAAAGCCUAUGCdTdT-3’；
反义链5’-GCAUAGGCUUUUCUAGAGCCdTdT-3’。
本发明所用核酸序列均由RIBOBIO公司合成。
(1)细胞转染
根据siRNA合成报告，加入适量DEPC水配制20μM贮存液。鼻咽癌细胞系CNE-2，接种于6孔板，培养一天。无菌EP管中将5μL Lip2000加入245μL的1640培养基中，另一无菌EP管中将5μL si-RIPK1或si-NC加入245μL的1640培养基中，室温静置5分钟。然后将上述两管EP管内的液体混合后温和混匀，室温静置20分钟。在上述混合物中加入1500μL 1640培养基，温和混匀后加入6孔板中的1个孔，培养24小时。
(2)干扰效果检测：
转染siRNA24h后，去除培养基，PBS洗涤一遍，加入蛋白裂解液提取对照组和si-RIPK1组蛋白，对对照组和si-RIPK1组进行蛋白免疫印迹分析，分析结果如图1所示。图1表明，si-RIPK1可以高效敲减RIPK1基因表达。
实施例2：
对照组1：鼻咽癌细胞系CNE-2，接种于6孔板，培养一天后，无菌EP管中将5μLLip2000加入245μL的1640培养基中，另一无菌EP管中将5μL si-NC加入245μL的1640培养基中，室温静置5分钟。然后将上述两管EP管内的液体混合后温和混匀，室温静置20分钟。在上述混合物中加入1500μL 1640培养基，温和混匀后加入6孔板中的1个孔，培养24小时后，加入紫杉醇(PTX)，使培养基中PTX的浓度达到150ng/μL，培养18h后，更换含10％FBS(胎牛血清)的1640培养基，培养6天。
si-RIPK1组1：鼻咽癌细胞系CNE-2，接种于6孔板，培养一天后，无菌EP管中将5μLLip2000加入245μL的1640培养基中，另一无菌EP管中将5μL si-RIPK1加入245μL的1640培养基中，室温静置5分钟。然后将上述两管EP管内的液体混合后温和混匀，室温静置20分钟。在上述混合物中加入1500μL 1640培养基，温和混匀后加入6孔板中的1个孔，培养24小时后，加入紫杉醇(PTX)，使培养基中PTX的浓度达到150ng/μL，培养18h后，更换含10％FBS(胎牛血清)的1640培养基，培养6天。
对对照组1和si-RIPK1组1进行光学显微镜观察，观察结果如图2所示。
图2显示，对照组1的细胞呈现休眠多倍体巨大肿瘤细胞特征，说明形成存活状态的休眠多倍体巨大肿瘤细胞；si-RIPK1组1细胞未能形成休眠多倍体巨大肿瘤细胞，所有细胞均死亡。
实施例3:
对照组2：鼻咽癌细胞系CNE-2，接种于96孔板，培养1天后，无菌EP管中将5μLLip2000加入245μL的1640培养基中，另一无菌EP管中将5μL si-NC加入245μL的1640培养基中，室温静置5分钟。然后将上述两管EP管内的液体混合后温和混匀，室温静置20分钟。在上述混合物中加入1500μL 1640培养基，温和混匀后加入6孔板中的1个孔，培养24小时后，加入紫杉醇(PTX)，使培养基中PTX的浓度达到150ng/μL，培养18h后，更换含10％FBS(胎牛血清)的1640培养基，培养15天。
si-RIPK1组2：鼻咽癌细胞系CNE-2，接种于96孔板，培养1天后，无菌EP管中将5μLLip2000加入245μL的1640培养基中，另一无菌EP管中将5μL si-RIPK1加入245μL的1640培养基中，室温静置5分钟。然后将上述两管EP管内的液体混合后温和混匀，室温静置20分钟。在上述混合物中加入1500μL 1640培养基，温和混匀后加入6孔板中的1个孔，培养24小时后，加入紫杉醇(PTX)，使培养基中PTX的浓度达到150ng/μL，培养18h后，更换含10％FBS(胎牛血清)的1640培养基，培养15天。
每天对对照组2和si-RIPK1组2使用CCK8试剂进行细胞活性检测，CCK8试剂与1640基础培养基1:9混合后制成混合液，每孔加入100μl混合液，避光放入细胞孵育箱孵育1小时，后使用分光光度仪检测OD450数值，从而反映细胞活性。每天每组检测3个孔，检测结果如图3所示。
根据图3可以看到，对照组2中，第1天至第7天，细胞数量逐步减少，第7天至第10天，细胞数量维持一定的水平，但变化不明显，第10天后，细胞数量逐渐上升。si-RIPK1组2中，第1天至第7天，细胞数量逐步减少至较低水平(远低于对照组2第7天的细胞数量水平，接近0)，此后，细胞数量不再增长。
图2、图3的结果显示，si-RIPK1可以抑制休眠多倍体巨大肿瘤细胞的形成。
实施例4
将顺铂(Cisplatin)稀释入PBS中，制成顺铂注射剂。
对照组3：BALB/c裸鼠，雄，6周龄，体重20±5g。在每只裸鼠肩胛间区皮下种植5×106数量的被荧光素酶标记的转染了si-NC的CNE-2细胞，每72小时用游标卡尺监测小鼠肿瘤大小的变化。肿瘤接种后第5天开始药物治疗，每次腹腔注射PBS 200μL，每周注射两次，持续至第25天。用水合氯醛(4％溶液，400mg/kg)对小鼠进行深度麻醉，并在肿瘤底部上方1cm处进行切口，轻轻挖出肿瘤组织后缝合切口。为了确认没有残留的原发肿瘤细胞，进行了全身BLI成像(生物发光成像)。原发肿瘤切除后，每隔两天观测一次裸鼠肿瘤复发情况，并用游标卡尺监测小鼠复发肿瘤大小的变化。
顺铂组3：BALB/c裸鼠，雄，6周龄，体重20±5g。在每只裸鼠肩胛间区皮下种植5×106数量的被荧光素酶标记的转染了si-NC的CNE-2细胞，每72小时用游标卡尺监测小鼠肿瘤大小的变化。肿瘤接种后第5天开始药物治疗，每次每只裸鼠腹腔注射顺铂注射剂，注射药量为5mg/kg，每周注射两次，持续至第25天。用水合氯醛(4％溶液，400mg/kg)对小鼠进行深度麻醉，并在肿瘤底部上方1cm处进行切口，轻轻挖出肿瘤组织后缝合切口。为了确认没有残留的原发肿瘤细胞，进行了全身BLI成像(生物发光成像)。原发肿瘤切除后，每隔两天观测一次裸鼠肿瘤复发情况，并用游标卡尺监测小鼠复发肿瘤大小的变化。
si-RIPK1组3:BALB/c裸鼠，雄，6周龄，体重20±5g。在每只裸鼠肩胛间区皮下种植5×106数量的被荧光素酶标记的转染了si-RIPK1的CNE-2细胞，每72小时用游标卡尺监测小鼠肿瘤大小的变化。肿瘤接种后第5天开始药物治疗，每次每只裸鼠腹腔注射顺铂注射剂，注射药量为5mg/kg，每周注射两次，持续至第25天。用水合氯醛(4％溶液，400mg/kg)对小鼠进行深度麻醉，并在肿瘤底部上方1cm处进行切口，轻轻挖出肿瘤组织后缝合切口。为了确认没有残留的原发肿瘤细胞，进行了全身BLI成像(生物发光成像)。原发肿瘤切除后，每隔两天观测一次裸鼠肿瘤复发情况，并用游标卡尺监测小鼠复发肿瘤大小的变化。
将三组所有原发瘤均包埋在石蜡中进行HE染色，计数切片中PGCC细胞数量。
图4为临床高度相关裸鼠皮下复发模型实验结果示意图。
图4的A图中，左图为对照组3原发及复发肿瘤的生长情况，中图为顺铂组3原发及复发肿瘤的生长情况，右图为si-RIPK1组3原发及复发肿瘤的生长情况。根据图4A图可以看出，对照组3肿瘤生长最快且最多裸鼠长出复发瘤，si-RIPK1组3肿瘤生长明显减慢长出复发瘤的裸鼠数量最少。
图4的B图为对照组3、顺铂组3、si-RIPK1组3皮下原发肿瘤中休眠多倍体巨大肿瘤细胞数量。根据图4B图可以看出，顺铂组3中休眠多倍体巨大肿瘤细胞数量最多，si-RIPK1组3中休眠多倍体巨大肿瘤细胞数量最少。
计算对照组3、顺铂组3、si-RIPK1组3的复发率，结果如图4中C图所示。
复发率＝复发裸鼠数量/裸鼠总数*100％。
根据图4的C图可以看出，对照组3复发率最高，si-RIPK1组3复发率最低。
实施例5
将顺铂(Cisplatin)稀释入PBS中，制成顺铂注射剂。
对照组4：BALB/c裸鼠，雄，6周龄，体重20±5g。用水合氯醛(4％溶液，400mg/kg)进行深度麻醉，并以仰卧位放置在立体定向框架中。嘴巴张开，用弯钳将舌头拉到一边，然后用1mL无菌注射器将含有2×106个荧光素酶标记的转染了si-NC的CNE-2细胞的50μL细胞悬液注射到软腭与硬腭的交界处。肿瘤接种后第5天开始药物治疗，每次腹腔注射PBS 200μL，每周注射两次。
顺铂组4：BALB/c裸鼠，雄，6周龄，体重20±5g。用水合氯醛(4％溶液，400mg/kg)进行深度麻醉，并以仰卧位放置在立体定向框架中。嘴巴张开，用弯钳将舌头拉到一边，然后用1mL无菌注射器将含有2×106个荧光素酶标记的转染了si-NC的CNE-2细胞的50μL细胞悬液注射到软腭与硬腭的交界处。肿瘤接种后第5天开始药物治疗，每次每只裸鼠腹腔注射顺铂注射剂，注射药量为5mg/kg，每周注射两次。
si-RIPK1组4：BALB/c裸鼠，雄，6周龄，体重20±5g。用水合氯醛(4％溶液，400mg/kg)进行深度麻醉，并以仰卧位放置在立体定向框架中。嘴巴张开，用弯钳将舌头拉到一边，然后用1mL无菌注射器将含有2×106个荧光素酶标记的转染了si-RIPK1的CNE-2细胞的50μL细胞悬液注射到软腭与硬腭的交界处。肿瘤接种后第5天开始药物治疗，每次每只裸鼠腹腔注射顺铂注射剂，注射药量为5mg/kg，每周注射两次。
每隔一天测量各组裸鼠体重一次。
使用全身BLI成像(生物发光成像)检测鼻咽癌原位肿瘤的生长及远离鼻咽癌原位部位的肿瘤转移情况。裸鼠死亡后，原位肿瘤包埋在石蜡中并进行免疫组化染色，并计数切片中PGCC细胞数量。结果示意图如图5所示。
图5的A图显示，对照组4、顺铂组4、si-RIPK1组4裸鼠鼻咽癌原位肿瘤中休眠多倍体巨大肿瘤细胞数量。顺铂组4中休眠多倍体巨大肿瘤细胞数量最多，si-RIPK1组4中休眠多倍体巨大肿瘤细胞数量最少。
图5的B图显示，对照组4、顺铂组4、si-RIPK1组4的转移率；对照组4转移率最高，而si-RIPK1组4未有裸鼠发生转移。
图5的C图显示，对照组4、顺铂组4、si-RIPK1组4的生存率。对照组4生存率最低、预后最差，而si-RIPK1组4生存率最高、预后得到显著改善。
图5的D图显示，对照组4、顺铂组4、si-RIPK1组4裸鼠体重变化折线图。顺铂组4裸鼠体重较对照组5裸鼠体重略有下降，而si-RIPK1组4裸鼠体重与顺铂组4裸鼠体重在统计学上无差异。
图5结果显示，si-RIPK1可显著抑制休眠多倍体巨大肿瘤细胞的形成，显著抑制鼻咽癌的转移，可以使模型裸鼠的生存率显著提高。将si-RIPK1用于制备治疗鼻咽癌的药物，药物毒性小。
以上所述的实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在不脱离本发明基本原理的前提下，所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南通大学附属医院
<120> 用于敲减ripk1的小干扰RNA在制备PGCCs抑制剂中的应用
<130> 2021.12.24
<141> 2021-12-24
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
gggcgauauu ugcaaauaa 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
uuauuugcaa auaucgccc 19

Claims (10)

1.一种小干扰RNA在制备改善鼻咽癌预后的药物中的应用，所述小干扰RNA用于敲减RIPK1基因表达，所述小干扰RNA具有与RIPK1的信使RNA互补的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的应用，所述小干扰RNA为si-RIPK1，所述小干扰RNA的核苷酸序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列，所述小干扰RNA的3’端修饰有两个呈单链悬挂结构的脱氧核糖核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述改善鼻咽癌预后的药物为抑制鼻咽癌复发和/或转移的药物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抑制鼻咽癌复发和/或转移的药物通过敲减RIPK1基因表达抑制休眠多倍体巨大肿瘤细胞的生成，进而抑制鼻咽癌复发和/或转移。
5.一种改善鼻咽癌预后的药物，其特征在于，所述药物的活性成分包括小干扰RNA，所述小干扰RNA为si-RIPK1，所述小干扰RNA的核苷酸序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列，所述小干扰RNA的的3’端修饰有两个呈单链悬挂结构的脱氧核糖核苷酸。
6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂。
7.一种用于治疗鼻咽癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括小干扰RNA和化疗药物，所述小干扰RNA为si-RIPK1，所述小干扰RNA的核苷酸序列为SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示核苷酸序列，所述小干扰RNA的的3’端修饰有两个呈单链悬挂结构的脱氧核糖核苷酸。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述化疗药物为用于杀死鼻咽癌肿瘤细胞的药物。
9.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述化疗药物为紫杉醇或顺铂。
10.根据权利要求7-9任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为注射剂。
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