CN101591669A

CN101591669A - 一种野生型egfr高表达的重组hek293细胞

Info

Publication number: CN101591669A
Application number: CNA2009100225659A
Authority: CN
Inventors: 贺浪冲; 罗文娟; 李旭; 许雪梅; 王嗣岑; 葛晓雯; 李聪
Original assignee: Xian Jiaotong University
Current assignee: Xian Jiaotong University
Priority date: 2009-05-15
Filing date: 2009-05-15
Publication date: 2009-12-02
Anticipated expiration: 2029-05-15
Also published as: CN101591669B

Abstract

本发明公开了一种基于外源重组质粒pcDNA3.1(+)－EGFR构建的稳定高表达野生型EGFR的重组HEK293－EGFR细胞，EGFR表达较转染前高4－5倍。用EGFR的促进剂EGF及酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼对转染的HEK293细胞诱导作用，检测细胞内磷酸化EGFR及ERK表达量的变化，表明转染后的EGFR具有活性功能；药物吉非替尼对转染的EGFR也具有抑制作用，以EGFR为靶点的药物筛选，可提高筛选的特异性及灵敏性；并可应用于EGFR通路蛋白的差异性比较研究。

Description

一种野生型EGFR高表达的重组HEK293细胞

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及野生型EGFR高表达的非癌细胞的构建，特别涉及一种基于外源重组质粒的野生型EGFR高表达的重组HEK293细胞，以及其应用。

技术背景

表皮生长因子受体(EGFR)是原癌基因cerbB1(HER1)的表达产物，在许多恶性肿瘤中高表达。EGFR是由1186个氨基酸构成，相对分子量为170kD的跨膜糖蛋白，由胞外区、跨膜区和胞内区三部分组成。糖基化的胞外区折叠成4个亚区，由配体结合位点和2个富含半胱氨酸区域所构成，能结合具有激动功能的多种配体，主要有表皮生长因子，转化生长因子α，B细胞生长因子，肝素结合表皮生长因子样生长因子和表皮调节素等(Cancer Letters，2007，254(2)：165-177)；跨膜区由一短列疏水氨基酸和一跨越脂质双层的α-螺旋桥组成，对激酶激活和信号传导起推动作用；胞内区包括酪氨酸激酶结构域和羧基末端结构域，具有酪氨酸激酶活性，因此EGFR属于受体酪氨酸激酶家族。

EGFR介导的信号转导通路主要有：①MAPK通路：EGFR配体和EGFR结合后，磷酸化酪氨酸残基与下游的生长因子受体结合蛋白2特异性结合，通过Ras活化，激活MAPK上其它因子，再激活一些转录因子、蛋白激酶等，引发多种生物学效应。②PI3K通路：EGFR配体和EGFR结合后，激活PI3K，PI3K对磷脂酰肌醇环上的3位羟基进行磷酸化，产生磷酸化的磷脂酰肌醇，PI3K激活产生的磷脂酰肌醇与Akt结合，进一步激活其下游的因子，对细胞生存、增殖、细胞周期、凋亡和血管新生等产生调节作用(Biochim BiophysActa，2006，1766(1)：120-39)。

EGFR的高表达对一些恶性肿瘤细胞的增殖、细胞周期、侵袭及新生血管形成等方面起关键作用(Mendelsohn J，J Clin Oncol，2003，21(14)：2787-2799)，EGFR成为抗肿瘤药物或者疫苗的重要靶点。目前，研发抑制恶性肿瘤中EGFR高表达的药物已成为治疗恶性肿瘤生长和转移的重要手段之一。然而，在EGFR抑制剂研发中，虽有吉非替尼、西妥昔单抗等已被应用于临床，但疗效并非理想，其它一些生物抑制剂仍处于基础研究和临床研究阶段。

同时，以EGFR作为靶点，寻找抑制恶性肿瘤中EGFR高表达的药物是研发抗肿瘤新药或类似化合物的重要途径之一。目前已有突变型EGFR基因、干扰RNA等相关载体的构建、转染，以及EGFR家族其它成员相关载体的构建与研究的报道(Nat Biotechnol，2002，20(5)：505-508；Genes Dev，2002，16(8)：948-958.Nat Rev Genet，2002，3(10)：737-747.)。然而，野生型全长EGFR基因细胞的相关生物学特性及其应用的研究未见报道。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种野生型EGFR高表达的非癌细胞，在构建野生型EGFR全长基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-EGFR的基础上，转染HEK293细胞，获得稳定、高表达EGFR分子的HEK293细胞株。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种EGFR真核表达载体，通过多克隆位点将EGFR全长基因构建于真核质粒pcDNA3.1(+)，所述的多克隆位点为kpn I和xba I酶切位点。

所述的EGFR全长基因其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

一种野生型EGFR高表达的转化体，该转化体为HEK293-EGFR重组细胞，其宿主细胞为HEK293细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体是包含EGFR全长基因的pcDNA3.1(+)-EGFR表达载体。

所述的野生型EGFR高表达的HEK293-EGFR重组细胞应用于以EGFR为靶点的药物筛选。

比较野生型EGFR高表达细胞HEK293-EGFR与癌化高表达EGFR的细胞株，应用于EGFR为靶点的药物筛选中，增加筛药灵敏度与特异性，应用于EGFR的生物学特性的研究及EGFR通路蛋白的差异性比较，提高发现功能蛋白的有效性。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1、本发明构建了人表皮生长因子受体(EGFR)的真核表达载体pcDNA3.1(+)-EGFR，测序结果与基因库人EGFR(Transcript variant 1)除2个碱基外，其余碱基完全一致，它们所编码的氨基酸完全一致；pcDNA3.1(+)-EGFR载体脂质体法转染HEK293细胞，经过筛选获得了获得稳定、高表达EGFR分子的重组HEK293-EGFR细胞株。

2、HEK293细胞为原代人胚肾细胞转染5型腺病毒(Ad5)DNA的永生化细胞，是载体构建理想的工具细胞；所得重组HEK293-EGFR细胞经过流式细胞术检测EGFR表达量比转染前高4～5倍，免疫荧光检测也显示EGFR的表达有明显的增高。

3、pcDNA3.1(+)-EGFR载体转染前后对HEK293细胞的生长无显著影响，用EGF对HEK293-EGFR细胞作用，细胞内p-EGFR及p-ERK表达量增加，表明转染后的EGFR具有生物活性功能，激活了通路蛋白ERK。

4、以吉非替尼和吉非替尼加EGF作为诱导因子，分别对转染后HEK293-EGFR细胞诱导15分钟后，检测细胞内磷酸化EGFR及ERK表达量，结果表明吉非替尼对转染后细胞的通路蛋白具有抑制作用，表明EGFR重组后依然介导了HEK293-EGFR细胞内的信号转导。

5、细胞膜色谱检测HEK293-EGFR细胞对吉非替尼具有一定的保留，提高了以EGFR为靶点的药物筛选的特异性及灵敏性，为进一步研究其生物学特性及EGFR通路蛋白的差异性比较研究，提高发现功能蛋白的有效性提供细胞模型。

附图说明

图1是pcDNA3.1(+)载体的质粒图谱；

图2是纯化的EGFR电泳检测图谱；

图3是pcDNA3.1(+)-EGFR载体BamH I酶切鉴定图谱；

图4是HEK293-EGFR细胞的EGFR表达水平的RT-PCR检测图；

图5是流式细胞术检测EGFR在各种细胞膜上的表达量，横坐标代表所测EGFR分子的荧光强度(即“荧光道数”)，纵坐标代表细胞的相对数；

图6是免疫荧光染色定性鉴定EGFR在EGFR-293细胞中的表达图；

图7是EGFR表达载体转染HEK293细胞前后生长曲线图；

图8是EGF及吉非替尼作用于转染的HEK293细胞，western blot检测p-EGFR的表达量；

图9是EGF及吉非替尼作用于转染的HEK293细胞，western blot检测通路蛋白p-ERK的表达量；

图10是采用细胞膜色谱HEK293-EGFR细胞对吉非替尼的保留，其中，第二个峰为吉非替尼的保留峰。

具体实施方式

本发明在构建野生型EGFR全长基因的真核表达载pcDNA3.1(+)-EGFR的基础上，转染HEK293细胞，获得稳定、高表达EGFR分子的重组HEK293-EGFR细胞株。

与未转染表达载体的阴性对照细胞相比，该重组HEK293-EGFR细胞株的EGFR表达量增加了4～5倍，应用于EGFR为靶点的药物筛选中，增加筛药灵敏度与特异性；

并且比较野生型EGFR高表达细胞HEK293-EGFR与癌化高表达EGFR的细胞株A431，应用于EGFR的生物学特性的研究及EGFR通路蛋白的差异性比较，提高发现功能蛋白的有效性。

下面对本方面做详细的说明：

本发明是以pcDNA3.1(+)为基础载体，(来源于西安交通大学第一附属医院所赠)，其质粒图谱，如图1所示，本发明选择Kpn I和Xba I酶切位点作为连接外源基因的多克隆位点，以BamH I酶切位点作为检测位点。

1)构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-EGFR

a、设计包含酶切位点的引物对，以pBabe-Puro EGFR WT质粒(其包含EGFR全长基因，来源于美国肿瘤防治中心，上海药物所赠)为模板，PCR扩增EGFR基因全长，所述的引物对为：

上游引物：cggggtacca ttatgcgacc ctccgggac 29bp；

下游引物：gctctagatc atgctccaat aaattc 26bp；

其中，上游引物中ggtacc为Kpn I酶切位点，下游引物中ctaga为XbaI酶切位点；

PCR反应体系为：HS PCR多聚酶0.5μL；10×Buffer 5μL；dNTP4μL；上游引物(sense，10μmol/L)1μL；下游引物(antisense，10μmol/L)1μL；模板(cDNA)2μL；ddH₂O 36.5μL；Total：50μL。

PCR的反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸4min，循环数35；72℃延伸5min；回收PCR产物，将目的基因EGFR纯化，对纯化的EGFR做凝胶电泳检测，结果如图2所示，其中，泳道1、2为Marker，泳道3、4、5均为纯化的EGFR。

b、将纯化的EGFR、pcDNA3.1(+)载体在M缓冲液(M Buffer，Takara生物公司试剂)作用下，分别kpn I、xba I双酶切过夜；酶切体系如下：kpnI 1μL；Xba I 1μL，10×M Buffer 2μL；目的基因EGFR片段或载体pcDNA3.18μL；ddH₂O 8μL；Total 20μL。

分别纯化回收带黏性末端的EGFR片段和pcDNA3.1(+)载体片段，然后通过T₄ DNA连接酶连接，16℃条件下反应20小时，构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-EGFR。

将所得载体常规转化大肠菌DH5a，在含氨苄青霉素的LB琼脂平板中37℃培养，挑取阳性克隆提取质粒，并进行电泳检测和测序。质粒酶切鉴定：用BamH I 37℃酶切3h，然后琼脂糖凝胶电泳检测。

由于EGFR基因含有三个BamH1酶切位点，pcDNA3.1(+)载体上含一个该酶切位点，因而，pcDNA3.1(+)-EGFR环形载体可被BamH1酶切为四段，其中一段因分子量小，电泳可能跑出凝胶，其余三段及其大小如图3所示的7427bp、1031bp和539bp，泳道1、2、3、6分别为4个连接成功的质粒，泳道4为marker，泳道5为未连接成功的。

将电泳检测正确的质粒进行测序，构建的载体中EGFR的测序结果如SEQ.ID.NO.1所示，其中，1267-1272bp、2298-2303bp、2837-2842bp为所包含的3个BamH1酶切位点，与基因库中EGFR比较(Transcript variant 1)，第2242bp、2467bp两2处核苷酸发生点突变，上述2处突变均为同义突变，其编码的氨基酸与Transcript variant 1完全一致，说明真核表达载体pcDNA3.1(+)-EGFR构建成功。

2)pcDNA3.1(+)-EGFR表达载体转染HEK293细胞

c、采用脂质体2000将质粒转入HEK293细胞(脂质体2000购自美国GIBCO，Invitrogen公司，按照脂质体2000试剂盒说明书操作)，DMEM培养基(Dulbecco′s Modified Eagle Media)加G418浓度600ng/ml筛选14天，挑取G418抗性单克隆传代培养，将调整G418浓度调整为300ng/ml，DMEM培养基筛选培养，得到pcDNA3.1(+)-EGFR阳性转染的克隆。

d、对转染细胞株的RT-PCR检测：采用TRIZOL试剂盒分别提取未转染和转染的细胞总RNA，并以总RNA为模板采用Fermentas公司的cDNA合成试剂盒进行反转录，得到cDNA；

分别以所得cDNA为模板，PCR扩增EGFR基因全长，PCR扩增条件与上述EGFR基因的PCR扩增方法相同，RT-PCR检测EGFR在HEK293-EGFR细胞中基因水平的表达，结果如图4所示，其中，泳道1为重组HEK293-EGFR细胞的EGFR表达检测，泳道2为未转染的HEK293细胞检测，泳道3为Marker，泳道4为空质粒作阴性对照，泳道5为pBabe-Puro EGFR WT质粒，作为阳性对照，与泳道2、4、5相比，泳道1和泳道5均分别得到了3800bp左右的条带，泳道2和4均没有得到相应的条带，RT-PCR检测结果表明重组HEK293-EGFR细胞的EGFR得到表达。

e、流式细胞术检测HEK293-EGFR细胞株中EGFR的表达：

加入0.5-0.8ml胰酶，约5分钟后显微镜下可见贴壁的细胞变圆，吸管吸出胰酶，加入鲜培养基轻轻吹打培养瓶上的细胞，然后收集吹打下的贴壁HEK293-EGFR细胞，1×PBS洗涤三次。用含3％胎牛血清的PBS稀释HEK293-EGFR细胞至1×10⁷个细胞/ml；

在HEK293-EGFR细胞悬浮液中加入鼠单克隆EGFR1作为一抗，(abcom公司，1∶2000稀释)，室温孵育45min，然后用PBS洗涤三次；用含3％BSA的PBS以1∶50稀释，有荧光标记的抗鼠源性的IgG作为二抗(美国KPL公司)。加入细胞中室温孵育45min，用流式细胞仪检测，结果如图5所示，其中，图A为HEK293细胞的阴性对照，图B为癌细胞A431的EGFR表达量的检测图，图C为未转染的HEK293的EGFR表达量的检测图，图D为HEK293-EGFR的EGFR表达量的检测图，图中横坐标标注的M1是以阴性细胞为准标出的，落在M1右侧的细胞越多，说明细胞表达的EGFR含量越高，对比图A、图C可见未转染的HEK293的EGFR表达量与阴性对照相比，EGFR的表达量基本一致，对比图A、图C与图D，可见重组的HEK293-EGFR的EGFR表达量明显增加，流式细胞术检测图具体数据为，转染前细胞的平均荧光强度为11.25±1.68，转染重组后的HEK293-EGF其平均荧光强度为43.94±1.98，表达量比转染前高4～5倍；对比图A、图B可见，HEK293-EGFR细胞与A431细胞的EGFR表达量相比也明显增加。

f、免疫荧光染色定性鉴定EGFR在EGFR-293细胞中的表达，其中使用的一抗、二抗同流式细胞检测的试剂，染色方法也同流式细胞检测的染色方法，检测使用的是共聚焦显微镜(Leica TCS-SP2，德国)。结果如图6所示，其中，荧光分布于细胞膜，一抗为鼠单克隆EGFR1，二抗为有绿色荧光标记的，抗鼠源性的IgG。EGFR与一抗、二抗结合形成免疫复合物并发出荧光，EGFR表达越高，与之结合的一抗、二抗就越多，所发出的荧光就越显著。

3)HEK293-EGFR细胞生长及活性分析

取生长良好接近汇合的细胞，用胰酶消化，加入新鲜的DMEM培养基制成细胞悬液后细胞计数。根据细胞计数结果稀释细胞悬液至浓度为1×10⁴/mL，每25ml小瓶接种1mL细胞悬液，共接种30瓶细胞。

24h后开始计数细胞，以后每隔24h计数一次，每次取3瓶细胞，分别进行计数，计算平均值。连续计数10d，结果如表1所示。根据细胞计数结果，以细胞数为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线，如图7所示，同时结合表1所示的HEK293-EGFR细胞生长计数，可以得出HEK293在转染外源表达载体pcDNA3.1(+)-EGFR前后其生长曲线并没有明显的区别。

表1.HEK293-EGFR细胞生长计数

HEK293-EGFR	天数	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
HEK293-EGFR	天数	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	细胞数×10000	1.000	1.917	4.167	9.083	14.83	34.86	56.87	69.87	76.06	78.31	76.00
Hek293	天数	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	细胞数×10000	1.000	1.917	4.167	9.083	14.83	34.86	56.87	69.87	76.06	78.31	76.00

细胞数×10000

1.000

1.229

3.573

8.854

16.71

36.72

63.50

72.08

74.94

78.00

76.87

4)HEK293-EGFR细胞部分信号通路蛋白的western blot检测

采用western blot方法，检测转染细胞中p-EGFR的变化。用表皮生长因子(EGF)及吉非替尼分别处理转染的HEK293细胞，用RIPA裂解细胞提取细胞总蛋白，100℃变性5min，测蛋白定量。取30μg变性后蛋白上样于12％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，经过SDS-PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体硝酸纤维素薄膜上，以兔抗人磷酸化EGFR抗体为一抗，4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG为二抗孵育2h，经过显影，对细胞内磷酸化EGFR的表达检测，如图8所示的western blot检测结果图，无任何刺激的HEK293-EGFR为空白；给EGF试剂刺激15min后，p-EGFR表达会增加，如图第二泳道；对HEK293-EGFR给予吉非替尼抑制剂的刺激后，p-EGFR表达会降低，如图第三泳道和第二泳道的对比；给予吉非替尼抑制剂后再给予EGF诱导剂刺激15min，p-EGFR表达又会出现，其表达量比第二泳道低，比第三泳道高，表明转染后细胞的p-EGFR受外界作用后，同样会改变。

利用同样方法检测HEK293-EGFR细胞内磷酸化ERK的表达，如图9所示，得到相同的结论。以上实验说明了：

以EGF作为EGFR的刺激剂，对HEK293-EGFR细胞诱导后，细胞内p-EGFR及p-ERK表达量增加，表明转染后的EGFR具有生物活性功能，激活了通路蛋白ERK；

以吉非替尼作为EGFR的抑制剂，对EGF诱导后的HEK293-EGFR细胞作用，细胞内p-EGFR及p-ERK表达量降低；然后再用EGF刺激15min，细胞内磷酸化EGFR及ERK表达量又得到回升，表明吉非替尼对转染后细胞的通路蛋白有影响作用。

5)细胞膜色谱检测HEK293-EGFR细胞对吉非替尼的保留

用水平衡EGFR高表达的HEK293-EGFR细胞膜色谱柱后，用包含吉非替尼(1.16mg/ml)的甲醇对HEK293-EGFR细胞膜色谱柱上样，上样完成之后用水洗脱，同时紫外检测波长249nm测定HEK293-EGFR细胞膜对吉非替尼的保留时间，同时以未转染的HEK293细胞作为阴性对照。

HEK293-EGFR细胞膜对吉非替尼的保留如图10所示，横坐标为时间(分钟)，纵坐标为保留量(洗脱量)；HEK293-EGFR细胞膜对吉非替尼具有一定的保留，水洗脱在1.8分钟的时候达到峰值，HEK293-EGFR细胞株在细胞膜色谱分析筛选针对EGFR靶点或者能与EGFR结合的药物，具有一定的亲和力、高灵敏度，说明HEK293-EGFR细胞可用于以EGFR为靶点的药物筛选。

核苷酸序列表

<110>西安交通大学

<120>一种野生型EGFR高表达的重组HEK293细胞

<160>1

<210>1

<211>3813

<212>DNA

<213>人EGFR全长基因

<400>1

tggactttgg ctcagagacc actgcttact ggcttatcga aattaatacg actcactata 60

gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt accattatgc gaccctccgg 120

gacggccggg gcagcgctcc tggcgctgct ggctgcgctc tgcccggcga gtcgggctct 180

ggaggaaaag aaagtttgcc aaggcacgag taacaagctc acgcagttgg gcacttttga 240

agatcatttt ctcagcctcc agaggatgtt caataactgt gaggtggtcc ttgggaattt 300

ggaaattacc tatgtgcaga ggaattatga tctttccttc ttaaagacca tccaggaggt 360

ggctggttat gtcctcattg ccctcaacac agtggagcga attcctttgg aaaacctgca 420

gatcatcaga ggaaatatgt actacgaaaa ttcctatgcc ttagcagtct tatctaacta 480

tgatgcaaat aaaaccggac tgaaggagct gcccatgaga aatttacagg aaatcctgca 540

tggcgccgtg cggttcagca acaaccctgc cctgtgcaac gtggagagca tccagtggcg 600

ggacatagtc agcagtgact ttctcagcaa catgtcgatg gacttccaga accacctggg 660

cagctgccaa aagtgtgatc caagctgtcc caatgggagc tgctggggtg caggagagga 720

gaactgccag aaactgacca aaatcatctg tgcccagcag tgctccgggc gctgccgtgg 780

caagtccccc agtgactgct gccacaacca gtgtgctgca ggctgcacag gcccccggga 840

gagcgactgc ctggtctgcc gcaaattccg agacgaagcc acgtgcaagg acacctgccc 900

cccactcatg ctctacaacc ccaccacgta ccagatggat gtgaaccccg agggcaaata 960

cagctttggt gccacctgcg tgaagaagtg tccccgtaat tatgtggtga cagatcacgg 1020

ctcgtgcgtc cgagcctgtg gggccgacag ctatgagatg gaggaagacg gcgtccgcaa 1080

gtgtaagaag tgcgaagggc cttgccgcaa agtgtgtaac ggaataggta ttggtgaatt 1140

taaagactca ctctccataa atgctacgaa tattaaacac ttcaaaaact gcacctccat 1200

cagtggcgat ctccacatcc tgccggtggc atttaggggt gactccttca cacatactcc 1260

tcctctggat ccacaggaac tggatattct gaaaaccgta aaggaaatca cagggttttt 1320

gctgattcag gcttggcctg aaaacaggac ggacctccat gcctttgaga acctagaaat 1380

catacgcggc aggaccaagc aacatggtca gttttctctt gcagtcgtca gcctgaacat 1440

aacatccttg ggattacgct ccctcaagga gataagtgat ggagatgtga taatttcagg 1500

aaacaaaaat ttgtgctatg caaatacaat aaactggaaa aaactgtttg ggacctccgg 1560

tcagaaaacc aaaattataa gcaacagagg tgaaaacagc tgcaaggcca caggccaggt 1620

ctgccatgcc ttgtgctccc ccgagggctg ctggggcccg gagcccaggg actgcgtctc 1680

ttgccggaat gtcagccgag gcagggaatg cgtggacaag tgcaaccttc tggagggtga 1740

gccaagggag tttgtggaga actctgagtg catacagtgc cacccagagt gcctgcctca 1800

ggccatgaac atcacctgca caggacgggg accagacaac tgtatccagt gtgcccacta 1860

cattgacggc ccccactgcg tcaagacctg cccggcagga gtcatgggag aaaacaacac 1920

cctggtctgg aagtacgcag acgccggcca tgtgtgccac ctgtgccatc caaactgcac 1980

ctacggatgc actgggccag gtcttgaagg ctgtccaacg aatgggccta agatcccgtc 2040

catcgccact gggatggtgg gggccctcct cttgctgctg gtggtggccc tggggatcgg 2100

cctcttcatg cgaaggcgcc acatcgttcg gaagcgcacg ctgcggaggc tgctgcagga 2160

gagggagctt gtggagcctc ttacacccag tggagaagct cccaaccaag ctctcttgag 2220

gatcttgaag gaaactgaat ttaaaaagat caaagtgctg ggctccggtg cgttcggcac 2280

ggtgtataag ggactctgga tcccagaagg tgagaaagtt aaaattcccg tcgctatcaa 2340

ggaattaaga gaagcaacat ctccgaaagc caacaaggaa atcctcgatg aagcctacgt 2400

gatggccagc gtggacaacc cccacgtgtg ccgcctgctg ggcatctgcc tcacctccac 2460

cgtgcaactc atcacgcagc tcatgccctt cggctgcctc ctggactatg tccgggaaca 2520

caaagacaat attggctccc agtacctgct caactggtgt gtgcagatcg caaagggcat 2580

gaactacttg gaggaccgtc gcttggtgca ccgcgacctg gcagccagga acgtactggt 2640

gaaaacaccg cagcatgtca agatcacaga ttttgggctg gccaaactgc tgggtgcgga 2700

agagaaagaa taccatgcag aaggaggcaa agtgcctatc aagtggatgg cattggaatc 2760

aattttacac agaatctata cccaccagag tgatgtctgg agctacgggg tgaccgtttg 2820

ggagttgatg acctttggat ccaagccata tgacggaatc cctgccagcg agatctcctc 2880

catcctggag aaaggagaac gcctccctca gccacccata tgtaccatcg atgtctacat 2940

gatcatggtc aagtgctgga tgatagacgc agatagtcgc ccaaagttcc gtgagttgat 3000

catcgaattc tccaaaatgg cccgagaccc ccagcgctac cttgtcattc agggggatga 3060

aagaatgcat ttgccaagtc ctacagactc caacttctac cgtgccctga tggatgaaga 3120

agacatggac gacgtggtgg atgccgacga gtacctcatc ccacagcagg gcttcttcag 3180

cagcccctcc acgtcacgga ctcccctcct gagctctctg agtgcaacca gcaacaattc 3240

caccgtggct tgcattgata gaaatgggct gcaaagctgt cccatcaagg aagacagctt 3300

cttgcagcga tacagctcag accccacagg cgccttgact gaggacagca tagacgacac 3360

cttcctccca gtgcctgaat acataaacca gtccgttccc aaaaggcccg ctggctctgt 3420

gcagaatcct gtctatcaca atcagcctct gaaccccgcg cccagcagag acccacacta 3480

ccaggacccc cacagcactg cagtgggcaa ccccgagtat ctcaacactg tccagcccac 3540

ctgtgtcaac agcacattcg acagccctgc ccactgggcc cagaaaggca gccaccaaat 3600

tagcctggac aaccctgact accagcagga cttctttccc aaggaagcca agccaaatgg 3660

catctttaag ggctccacag ctgaaaatgc agaataccta agggtcgcgc cacaaagcag 3720

tgaatttatt ggagcatgat ctagagggcc cgtttaaacc cgctgatcag cctcgactgt 3780

gccttctagt tgtcagcata ctcgtgtgtg gta 3813

Claims

1、一种EGFR真核表达载体，其特征在于，该载体为pcDNA3.1(+)-EGFR表达载体，通过多克隆位点将EGFR全长基因构建于真核质粒pcDNA3.1(+)，所述的多克隆位点为kpn I和xba I酶切位点。

2、如权利要求1所述一种EGFR真核表达载体，其特征在于，所述的EGFR全长基因其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

3、一种野生型EGFR高表达的转化体，其特征在于，该转化体为HEK293-EGFR重组细胞，其宿主细胞为HEK293细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体是包含EGFR全长基因的pcDNA3.1(+)-EGFR表达载体。

4、如权利要求2所述的野生型EGFR高表达的HEK293-EGFR重组细胞应用于以EGFR为靶点的药物筛选。