CN104878076A - 一种Her-2基因的cDNA原位杂交探针及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种Her-2基因的cDNA原位杂交探针及其制备方法，属于分子病理诊断领域。所述探针的制备方法，包括：收集Her-2基因高表达的乳腺癌患者的新鲜肿瘤组织，提取所述肿瘤组织的总mRNA，将所述总mRNA逆转录为cDNA，将所述cDNA与引物进行PCR扩增，得到扩增产物，所述扩增产物为长度987bp的Her-2基因片段，即为所述探针的片段，构建含有所述Her-2基因的cDNA原位杂交探针序列的质粒；将所述质粒作为模板，并利用所述引物和罗氏的聚合酶链式反应地高辛探针合成试剂盒进行探针标记，得到所述探针。本发明使用的Her-2基因的cDNA原位杂交的探针序列，对Her-2基因DNA的显示有明确的特异性，实现了对Her-2基因DNA水平扩增情况的检测。
Description
技术领域
本发明涉及分子病理诊断领域，特别涉及一种Her-2基因的cDNA原位杂交探针及其制备方法。
背景技术
人表皮生长因子受体-2（Epidermal growth factor receptor-2，HER-2）是表皮生长因子受体EGFR家族的第二个成员，大约20%～30%的乳腺癌病例中存在Her-2基因和/或HER-2蛋白水平增加，它是乳腺癌的独立预后因子，在乳腺癌的靶向治疗和预后判断中的作用已经得到了全世界临床医生的认可。Her-2基因阳性肿瘤是一种高危肿瘤，Her-2基因的扩增预示病情进展迅速，局部复发的危险性高，化疗缓解期短，无病生存期（Disease free survival，DFS）和总生存期（Overall Survival，OS）缩短，对某些常规的化疗和激素治疗反应性差。基于Her-2基因在乳腺癌诊断及治疗中重要的指导意义，使用标准的检测手段和准确的判别标准检测乳腺癌样本中Her-2基因的扩增情况，对于评价预后、预测化疗与内分泌治疗效果及是否选择赫赛汀治疗具有指导意义。
临床上常用免疫组织化学法（Immunohistochemistry，IHC）检测HER-2受体蛋白在肿瘤细胞表面的过表达，该方法简便、费用低廉、对材料的要求不高，是初步筛查的首选方法。
在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：
在进行免疫组织化学法检测时，肿瘤细胞标本在固定和处理过程中，其HER-2受体蛋白容易受到破坏，HER-2受体蛋白受到破坏后，抗原会对此进行修复，使得HER-2受体蛋白的特异性会降低，进而降低了免疫组织化学法检测的准确性。
发明内容
为了解决现有技术只能够采用免疫组织化学法检测HER-2受体蛋白准确性 低的问题，本发明实施例提供了一种Her-2基因的cDNA原位杂交探针及其制备方法。所述技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种Her-2基因的cDNA原位杂交探针，所述探针的序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
另一方面，本发明提供了一种制备上述的探针的方法，所述方法包括：
收集Her-2基因高表达的乳腺癌患者的新鲜肿瘤组织，提取所述肿瘤组织的总mRNA，将所述总mRNA逆转录为cDNA，将所述cDNA与引物进行PCR扩增，得到扩增产物，所述扩增产物为长度987bp的Her-2基因片段，即为所述探针的片段，构建含有所述Her-2基因的cDNA原位杂交探针序列的质粒。将所述质粒作为模板，并利用所述引物和罗氏的聚合酶链式反应地高辛探针合成试剂盒进行探针标记，得到所述探针；其中，所述引物包括：
上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，下游引物的序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。
进一步地，所述构建含有所述Her-2基因的cDNA原位杂交探针序列的质粒的方式为：将所述扩增产物进行电泳，得到凝胶产物，并在所述凝胶产物上切取所需目的产物条带，并对所述目的产物条带进行回收，得到回收的所述扩增产物，再将所述回收的扩增产物连接至pUM-T载体上，并转化到大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆，所述阳性克隆即为所述含有Her-2基因的cDNA原位杂交探针序列的质粒。
具体地，所述扩增程序为：
（1）95℃3分钟；
（2）95℃30秒；
（3）58℃30秒；
（4）72℃30秒；
（5）重复步骤（2）-（4）30个循环；
（6）72℃10分钟。
具体地，所述扩增的反应液为：所述模板1μl，所述上游引物1μl，所述下游引物1μl，dNTP1μl，10×buffer2.5μl，MgCl22μl，rTaq酶0.5μl，蒸馏水16μl，总体积25μl。
进一步地，所述电泳时采用浓度为1%的琼脂糖凝胶。
进一步地，所述方法还包括：在所述挑取阳性克隆后进行测序。
进一步地，采用RNA裂解液提取所述总mRNA。
进一步地，利用定量反转录试剂盒将所述总mRNA逆转录为cDNA。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明对乳腺癌患者肿瘤组织进行取材、切片，通过罗氏的聚合酶链式反应地高辛探针合成试剂盒标记的探针与组织中Her-2基因的DNA发生特异性的结合，从而方便、准确的观察到组织中Her-2基因DNA水平的变化，本发明使用的Her-2基因的cDNA原位杂交探针序列，对Her-2基因DNA的显示有明确的特异性，实现了对Her-2基因DNA水平扩增情况的检测。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例
1.引物的设计
根据Her-2基因的Gene bank序列设计了Her-2基因特异性的引物，引物序列为：上游引物：5'-AGGAGTGCGTGGAGGAAT-3'，如序列表中SEQ ID NO.2所示；下游引物：5'-CCAGCCCGAAGTCTGTAAT-3'，如序列表中SEQ ID NO.3所示。
2.制备含有Her-2基因的cDNA原位杂交探针序列的质粒
(1)收集60例Her-2基因高表达的乳腺癌患者的新鲜肿瘤组织（60例患者来自武汉市六医院，自2011年2月至2013年6月），利用RNA裂解液（Trizol法）提取该肿瘤组织的总mRNA，将提取出的总mRNA利用定量反转录试剂盒（Quanti Tect Reverse Transcription Kit）逆转录为cDNA；
(2)将该cDNA用设计的引物进行PCR扩增，得到扩增产物，该扩增产物为长度987bp的Her-2基因片段，即为探针的片段；
其中，扩增的程序为：
（1）95℃3分钟；
（2）95℃30秒；
（3）58℃30秒；
（4）72℃30秒；
（5）重复步骤（2）-（4）30个循环；
（6）72℃10分钟。
扩增的反应液为：
所述模板1μl，所述上游引物1μl，所述下游引物1μl，dNTP1μl，10×buffer2.5μl，MgCl22μl，rTaq酶0.5μl，蒸馏水16μl，总体积25μl。
(3)将该扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，参照DNA Marker切取位置在凝胶产物上的987bp处的条带切取所需目的产物条带；
(4)将切取的目的产物条带，用胶回收试剂盒进行回收，得到回收的扩增产物；
(5)将该回收的扩增产物连接至pUM-T载体上，得到连接后的质粒；
(6)将连接后的质粒转化到大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆，该阳性克隆即为含有所述Her-2基因的cDNA原位杂交探针序列的质粒。
(7)在挑取阳性克隆后进行测序。
3.标记Her-2基因的cDNA原位杂交探针
(1)测序正确后，经判断Her-2基因的cDNA原位杂交探针序列插入载体的顺序是正向的，该探针的序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)少量培养阳性菌株，提取含有Her-2基因的cDNA原位杂交探针序列的质粒；
(3)以含有Her-2基因的cDNA原位杂交探针序列的质粒为模板，利用上述引物和罗氏的聚合酶链式反应地高辛探针合成试剂盒（PCR DIG Probe SynthesisKit）进行探针标记。
4.Her-2基因的cDNA原位杂交探针的显色原位杂交检测
(1)收集上述60例Her-2基因高表达的乳腺癌患者的新鲜肿瘤组织标本；
(2)60例标本分别用中性福尔马林液固定24～48小时后再用石蜡包埋、连续切片4张，每张厚度4～5μm，室温（23℃±2℃）干燥后60℃烤片2～4小时；
(3)二甲苯脱蜡两次，每次5分钟（未指明温度处均为室温环境）；
(4)用质量分数为100%的酒精洗涤3次，每次洗涤3分钟；
(5)双蒸水洗涤2次，每次3分钟；
(6)将切片放至已经加热煮沸的热处理液（热处理液为0.05M Tris-EDTA缓冲液，该缓冲液pH值为8.0）中，保证热处理液温度在98℃-100℃之间，处理15分钟后将切片快速移至双蒸水中，双蒸水洗涤3次，每次3分钟；
(7)在切片上加足量的蛋白酶K消化液，室温消化5分钟，再用双蒸水洗涤2次，每次3分钟；
(8)梯度酒精脱水，浓度为70%酒精2分钟，浓度为85%酒精2分钟，浓度为95%酒精2分钟；浓度为100%酒精2次，每次2分钟，室温晾干；
(9)在盖玻片上滴加适量探针，翻转盖在切片合适位置上，用橡胶水泥封口，待其干燥后95℃变性5分钟，37℃杂交过夜；
(10)小心去掉橡胶水泥，先将切片在室温SSC洗涤液（SSC洗涤液为柠檬酸缓冲液，包括浓度为0.15M的氯化钠和0.015M的柠檬酸钠，且该SSC洗涤液的pH值为7.4）中浸泡2～3分钟，待盖玻片洗掉后将切片移至70℃SSC洗涤液中浸泡5分钟，双蒸水洗涤3次，每次3分钟；
(11)将切片在含3%双氧水的无水甲醇中浸泡10分钟，用含0.01%Tween20（吐温-20）的PBS缓冲液（PBS缓冲液为磷酸盐缓冲液，包括浓度为0.1M的磷酸二氢钠，浓度为0.1M的磷酸二氢钾，浓度为0.1M的氯化钾，浓度为0.1M的氯化钠，且该磷酸盐缓冲液的pH值为7.0）洗涤3次，每次3分钟；
(12)每张切片加2-3滴CAS-BlockTM封闭液，室温温育10分钟；
(13)用滤纸吸干，加入2-3滴鼠抗地高辛抗体，室温温育30分钟，用含0.01%Tween20的PBS洗涤3次，每次3分钟；
(14)加入2-3滴羊抗鼠HRP（辣根过氧化物酶）标记二抗，室温温育30分钟用含0.01%Tween20的PBS缓冲液洗涤3次，每次3分钟；
(15)每张切片加入2-3滴DAB工作液（DAB工作液为3,3-四盐酸二氨基联苯胺染色液，配制时将质量分数为0.1%DAB（3,3’-diaminobenzidine，二氨基联苯胺）溶液和0.05M的TBS缓冲液1:1混合，现用现配，其中，TBS缓冲液为1M Tris-HCl缓冲溶液，该TBS缓冲液pH值为7.0），室温温育5-10分钟，流水冲洗2分钟；
(16)浓度为0.45%的苏木精复染3-5秒，流水冲洗2分钟；
(17)梯度酒精脱水，浓度70%酒精2分钟；浓度85%酒精2分钟，浓度95%酒精2分钟；浓度100%酒精2次，每次2分钟；
(18)二甲苯透明2次（二甲苯作为透明剂），每次5分钟；
(19)中性树胶封片，显微镜下计算Her-2基因的信号颗粒数目。
5.HER-2受体蛋白免疫组织化学法（Immunohistochemistry，IHC）检测
(1)标本前期处理同上，临用前经60℃烤片0.5～1小时；
(2)二甲苯脱蜡两次，每次5分钟；
(3)梯度酒精水化，浓度100%酒精5分钟，浓度95%酒精5分钟，浓度85%酒精5分钟，浓度70%酒精5分钟；
(4)将切片在含3%双氧水的无水甲醇中浸泡10分钟，用PBS缓冲液洗涤3次，每次3分钟；
(5)0.01mol/l的枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）加热煮沸，放入组织切片煮沸15分钟，进行抗原修复；
(6)用PBS缓冲液洗涤3次，每次3分钟；
(7)每张切片加2-3滴山羊血清，室温温育10分钟；
(8)用滤纸吸干，加入2-3滴鼠HER-2受体蛋白抗体，4℃温育过夜；
(9)4℃温育过夜后室温复温1小时，用PBS缓冲液洗涤3次，每次3分钟；
(10)加入2-3滴羊抗鼠HRP标记二抗，室温温育1小时
(11)用PBS缓冲液洗涤3次，每次3分钟；
(12)每张切片加入2-3滴DAB工作液，室温显色5-10分钟，流水冲洗2分钟；
(13)浓度为0.45%的苏木精复染3-5秒，流水冲洗2分钟；
(14)梯度酒精脱水，浓度70%酒精2分钟；浓度85%酒精2分钟，浓度95%酒精2分钟；浓度100%酒精2次，每次2分钟；
(15)二甲苯透明2次，每次5分钟；
(16)中性树胶封片，显微镜下观察计数。
6.结果分析
本发明提供的Her-2基因的cDNA原位杂交探针可用于显色原位杂交实验，能够对乳腺癌组织Her-2基因的扩增情况进行检测，且能够更加准确地进行乳腺癌分型，指导临床个体化治疗方法制定，结果判定标准如表1所示：
表1为显色原位杂交Her-2基因的扩增情况判定标准
利用本发明提供的Her-2基因的cDNA原位杂交探针对60例标本进行显色原位杂交，结果如表2所示：
表2为显色原位杂交实验结果
由上表可见，60例标本中有40例标本Her-2基因无扩增，5例标本Her-2基因低扩增，15例标本Her-2基因高扩增，Her-2基因高扩增的标本数占总标本数的25%，采用显色原位杂交检测的结果与已证实的Her-2基因高扩增乳腺癌患者在乳腺癌患者中所占比例20～30%相符。
用免疫组织化学法进行对照，其判读标准参考《乳腺癌HER-2检测指南》，该判读标准如表3所示，检测结果如表4所示：
表3为免疫组化HER-2检测结果判定标准
表3中结果表示着色程度，其中，0表示阴性；1+表示弱阳性；2++表示中等阳性；3+++表示强阳性。
表4免疫组织化学实验结果
| 序号 | 免疫组化结果 | 序号 | 免疫组化结果 | 序号 | 免疫组化结果 |
| 1 | 0 | 21 | 0 | 41 | 1+ |
[0102]
| 2 | 0 | 22 | 0 | 42 | 2++ |
| 3 | 1+ | 23 | 1+ | 43 | 2++ |
| 4 | 3+++ | 24 | 3+++ | 44 | 3+++ |
| 5 | 0 | 25 | 0 | 45 | 2++ |
| 6 | 3+++ | 26 | 0 | 46 | 1+ |
| 7 | 3+++ | 27 | 3+++ | 47 | 3+++ |
| 8 | 0 | 28 | 1+ | 48 | 0 |
| 9 | 0 | 29 | 0 | 49 | 0 |
| 10 | 0 | 30 | 0 | 50 | 3+++ |
| 11 | 3+++ | 31 | 2++ | 51 | 2++ |
| 12 | 0 | 32 | 2++ | 52 | 0 |
| 13 | 0 | 33 | 0 | 53 | 3+++ |
| 14 | 3+++ | 34 | 0 | 54 | 3+++ |
| 15 | 1+ | 35 | 1+ | 55 | 3+++ |
| 16 | 0 | 36 | 3+++ | 56 | 3+++ |
| 17 | 0 | 37 | 0 | 57 | 3+++ |
| 18 | 3+++ | 38 | 1+ | 58 | 3+++ |
| 19 | 2++ | 39 | 0 | 59 | 3+++ |
| 20 | 3+++ | 40 | 3+++ | 60 | 0 |
对两者检测结果进行统计，统计结果如表5所示：
表5为显色原位杂交和免疫组化实验结果统计
由此可见，显色原位杂交和免疫组化实验的结果总相关百分比为95%，说明两者检测结果一致。
对两者检测进行结果一致性比较，如表6所示：
表6为显色原位杂交和免疫组化实验结果一致性比较
针对60例样本，采用显色原位杂交检测到20例扩增，40例不扩增（与样本的实际结果一致），采用免疫组化检测到21例扩增，39例不扩增。
综上所述，利用本发明中制备的Her-2基因的cDNA原位杂交探针进行显色原位杂交能准确特异性地检测临床乳腺癌患者Her-2基因的扩增情况，检测结果与临床常用的免疫组化检测结果一致性为95%，且采用显色原位杂交检测的结果与已证实的Her-2基因高扩增乳腺癌患者在乳腺癌患者中所占比例20～30%相符，说明本发明中制备的Her-2基因的cDNA原位杂交探针可以用于临床乳腺癌患者Her-2基因的扩增情况检测，且准确性高于免疫组化法。
本发明对乳腺癌患者肿瘤组织进行取材、切片，通过地高辛标记的cDNA探针与组织中Her-2基因的DNA发生特异性的结合，从而方便、准确的观察到组织中Her-2基因DNA水平的变化，本发明使用的Her-2基因的cDNA原位杂交探针序列，对Her-2基因DNA的显示有明确的特异性，实现了对Her-2基因DNA水平扩增情况的检测，效果明显优于采用免疫组化法检测的结果，具有高稳定性、高准确性和高灵敏性的特点，可以在组织和细胞结构相对完整的前提下，基于癌细胞原位分析单细胞核内基因的变化，能准确的检测乳腺癌患者瘤组织中Her-2基因扩增情况。本发明提供的方法在标本在固定和处理过程中，该 HER-2受体蛋白不易受到破坏，同时，本发明提供的探针避免了假阳性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种Her-2基因的cDNA原位杂交探针，其特征在于，所述探针的序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
2.一种制备如权利要求1所述的探针的方法，其特征在于，所述方法包括：
收集Her-2基因高表达的乳腺癌患者的新鲜肿瘤组织，提取所述肿瘤组织的总mRNA，将所述总mRNA逆转录为cDNA，将所述cDNA与引物进行PCR扩增，得到扩增产物，所述扩增产物为长度987bp的Her-2基因片段，即为所述探针的片段，构建含有所述Her-2基因的cDNA原位杂交探针序列的质粒；
将所述质粒作为模板，并利用所述引物和罗氏的聚合酶链式反应地高辛探针合成试剂盒进行探针标记，得到所述探针；
其中，所述引物包括：
上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，
下游引物的序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述构建含有所述Her-2基因的cDNA原位杂交探针序列的质粒的方式为：
将所述扩增产物进行电泳，得到凝胶产物，并在所述凝胶产物上切取所需目的产物条带，并对所述目的产物条带进行回收，得到回收的所述扩增产物，再将所述回收的扩增产物连接至pUM-T载体上，并转化到大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆，所述阳性克隆即为所述含有Her-2基因的cDNA原位杂交探针序列的质粒。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述扩增的程序为：
（1）95℃3分钟；
（2）95℃30秒；
（3）58℃30秒；
（4）72℃30秒；
（5）重复步骤（2）-（4）30个循环；
（6）72℃10分钟。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述扩增的反应液为：
所述模板1μl，所述上游引物1μl，所述下游引物1μl，dNTP1μl，10×buffer2.5μl，MgCl22μl，rTaq酶0.5μl，蒸馏水16μl，总体积25μl。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述电泳时采用浓度为1%的琼脂糖凝胶。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括：在所述挑取阳性克隆后进行测序。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，采用RNA裂解液提取所述总mRNA。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，利用定量反转录试剂盒将所述总mRNA逆转录为cDNA。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115947823A (zh) * | 2022-09-29 | 2023-04-11 | 江汉大学 | 一种用于筛选结合和/或激活egfr的有毒金属的表达蛋白及制备方法 |
| CN116041482A (zh) * | 2022-09-29 | 2023-05-02 | 江汉大学 | 一种结构肽段的cDNA、结构肽段和制备方法及应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102094070A (zh) * | 2009-12-11 | 2011-06-15 | 上海裕隆临床检验中心有限公司 | HER2过量表达的mRNA原位杂交检测试剂盒 |
| CN103409504A (zh) * | 2013-06-26 | 2013-11-27 | 武汉康录生物技术有限公司 | 一种用于检测Her2基因不含重复序列的FISH探针、试剂盒及其检测方法 |
-
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102094070A (zh) * | 2009-12-11 | 2011-06-15 | 上海裕隆临床检验中心有限公司 | HER2过量表达的mRNA原位杂交检测试剂盒 |
| CN103409504A (zh) * | 2013-06-26 | 2013-11-27 | 武汉康录生物技术有限公司 | 一种用于检测Her2基因不含重复序列的FISH探针、试剂盒及其检测方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ANNE CAYRE等: "Comparison of different commercial kits for HER2 testing in breast cancer: looking for the accurate cutoff for amplification", 《BREAST CANCER RESEARCH》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115947823A (zh) * | 2022-09-29 | 2023-04-11 | 江汉大学 | 一种用于筛选结合和/或激活egfr的有毒金属的表达蛋白及制备方法 |
| CN116041482A (zh) * | 2022-09-29 | 2023-05-02 | 江汉大学 | 一种结构肽段的cDNA、结构肽段和制备方法及应用 |
| CN115947823B (zh) * | 2022-09-29 | 2024-05-03 | 江汉大学 | 一种用于筛选结合和/或激活egfr的有毒金属的表达蛋白及制备方法 |
| CN116041482B (zh) * | 2022-09-29 | 2024-05-03 | 江汉大学 | 一种结构肽段的cDNA、结构肽段和制备方法及应用 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20180213 |