CN112345757B - Sctag在制备诊断胃癌的试剂盒的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种诊断胃癌的试剂盒，它包括：抗SCTAG蛋白的抗体，它的质控标准品为SCTAG蛋白，所述的一种诊断胃癌的试剂盒为ELISA试剂盒。利用该试剂盒血清SCTAG蛋白在胃腺癌患者诊断的阳性率可高达93.5％，早期胃癌患者诊断的阳性率为96.3%。本发明还公开了一种诊断胃癌的免疫组化试剂盒，它的一抗为抗SCTAG蛋白的抗体，该试剂盒具有着良好的灵敏性与特异性。

Description

SCTAG在制备诊断胃癌的试剂盒的应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及SCTAG在制备诊断胃癌的试剂盒的应用。
背景技术
胃癌是全球最主要的癌症之一，全球每年有超过1,000,000例新发病例、约783,000例因胃癌而死亡。胃癌的早期发病症状极为隐匿，而且缺乏对早期胃癌诊断有效，可靠的检测手段，导致患者被确诊时多已发展至进展期，从而失去了最佳的治疗机会，严重降低患者的总生存期。而血清肿瘤标志物的检测是目前无症状微肿瘤早期检测的唯一途径。因此，寻找灵敏度高，特异性强的肿瘤标志物是提高早期胃癌诊断的重要方法。
癌症/睾丸抗原（Cancer/Testis Antigen，CTA）是肿瘤相关抗原之一，生理状态下仅存在于正常男性机体的睾丸组织中，但却能够在肿瘤组织中特异性表达。这种特殊的表达模式让CTA具有肿瘤表达特异性和高免疫原性的特点。近几年研究表明CTA还发挥着促进肿瘤增殖、侵袭与转移等积极作用。总之，CTA分子的发现为肿瘤诊断和免疫治疗领域的进一步研究和临床发展提供了前所未有的机遇。CTA在大部分类型的肿瘤中均有表达，但不同种类的CTA在不同的肿瘤类型之间的表达差异很大。CT-X抗原更倾向于在膀胱癌、肺癌、卵巢癌和黑色素瘤组织中表达。然而胃、结直肠癌被认为是CTA表达“贫穷”的癌症类型。胃癌特异性肿瘤标志物包括：血清胃蛋白酶原（PG）、胃泌素（G）、胃肿瘤组织标志物、表皮生长因子受体（EGFR）、TP53基因与p53抗体、间质上皮细胞转化因子（EMT）、微卫星不稳定（MSI）等；新型胃肿瘤标志物包括：微核糖核酸(microRNA/miR/miRNA）、长链非编码RNA（lncRNA）、基质金属蛋白酶（MMP）等；CTA在胃癌相对如此低频率的表达也导致CTA在胃癌的临床应用中受到了阻碍，仍需要大量的研究工作去挖掘在胃癌患者中高表达的CTA。
SCTAG（super-sensitive Cancer/Testis Antigenfor Gutdiagnosis）是一种新型的CTA，生理状态下是男性精子中最丰富的核蛋白，发挥调控精子染色质浓缩和转录终止等功能。
发明内容
本发明目的是为解决目前的肿瘤标志物检测阳性率低，作为胃癌筛查手段容易漏诊的问题，而提供的一种SCTAG在制备诊断胃癌的试剂盒的应用。
一种诊断胃癌的试剂盒，它包括：抗SCTAG蛋白的抗体；
所述的一种诊断胃癌的试剂盒，它的质控标准品为SCTAG蛋白；
所述的一种诊断胃癌的试剂盒为ELISA试剂盒。
一种诊断胃癌的试剂盒，它包括：与SCTAG基因匹配的PCR引物；
所述的PCR为RT-PCR、qRT-PCR或real-timePCR；
所述的引物为：
5’-AGAGCCGAGCAGATATTACC-3’
5’-TCTACATCGCGTCTGTACCT-3’；
所述的一种诊断胃癌的试剂盒，还包括内参引物：
5’-CCACCCAGAAGACTGTGGAT-3’
5’-TTCTAGACGGCAGGTCAGGT-3’。
一种诊断胃癌的免疫组化试剂盒，它的一抗为抗SCTAG蛋白的抗体。
本发明提供了一种诊断胃癌的试剂盒，它包括：抗SCTAG蛋白的抗体，它的质控标准品为SCTAG蛋白，所述的一种诊断胃癌的试剂盒为ELISA试剂盒。利用该试剂盒血清SCTAG蛋白在胃腺癌患者诊断的阳性率可高达93.5％，早期胃癌患者诊断的阳性率为96.3%。本发明还提供了一种诊断胃癌的免疫组化试剂盒，它的一抗为抗SCTAG蛋白的抗体，该试剂盒具有着良好的灵敏性与特异性。
附图说明
图1 胃癌，癌旁，正常组织SCTAG基因与内参基因GAPDH的PCR反应溶解曲线；
图2 DNA琼脂糖凝胶电泳分析结果；g：内参GAPDH，1：1号患者；2：2号患者；3：3号患者；a：胃癌组织SCTAG-mRNA的表达；b：胃癌旁组织SCTAG-mRNA的表达；c：胃正常组织SCTAG-mRNA的表达；
图3 SCTAG mRNA表达阳性率的分布；（T）胃腺癌患者的癌组织，（P）癌旁组织，（N）正常组织；
图4 胃腺癌患者的癌组织，癌旁组织和正常组织中SCTAG mRNA表达含量的比较；
图5 SCTAG mRNA在健康人睾丸组织中表达结果；M=DNA分子标记;a= SCTAG mRNA,b=内参。1=睾丸；2=胎盘；3=心脏；4=脑；5=甲状腺；6=气管；7=涎腺；8=胎脑；9=子宫；10=结肠；11=胃；12=脾脏；13=小肠；14=骨髓；
图6 标准品倍比稀释流程示意图；
图7 胃腺癌患者血清中SCTAG物蛋白浓度与临床病理特征之间的关系；（A）胃腺癌患者中的SCTAG蛋白浓度明显高于健康对照组；胃腺癌患者血清中SCTAG蛋白浓度与各个临床变量之间的关系：（B）年龄；（C）细胞分化程度；（D）侵袭深度（T）；（E）淋巴结转移（N）；（F）临床分期（TNM）；（G）肿瘤大小；（H）脉管受侵；（I）神经受侵；
图8 胃腺癌患者血清中SCTAG蛋白浓度与组织胃肿瘤标志物之间的关系：（A）EGFR；（B）P53；（C）HER-2；（D）ki67之间的关系；
图9 血清SCTAG蛋白对胃腺癌诊断能力的评估。（A）血清SCTAG蛋白在胃腺癌总体患者中的诊断能力；血清SCTAG蛋白分别在临床Ⅰ期（B），临床Ⅱ期（C）与临床Ⅲ-Ⅳ期（D）胃腺癌患者中的诊断能力（AUC：曲线下的面积）；
图10 男性和女性血清中SCTAG蛋白水平以及血清SCTAG蛋白对男性与女性患者诊断能力的比较；
图11 临床血清肿瘤标志物对胃腺癌诊断能力的分析；（A）CEA；（B）CA724；（C）CA199；（D）CA242；（E）CA50；（F）AFP；（G）胃癌三项CEA，CA724和CA199；（H）胃癌四项CEA，CA724，CA199和CA242；（I）消化道肿瘤六项CEA，CA724，CA199，CA242，CA50和AFP；
图12 术后血清SCTAG蛋白浓度变化；
图13 免疫组化检测SCTAG蛋白在胃癌组织中的表达（A）胃腺癌中抗SCTAG阴性对照；（B）正常胃组织SCTAG无表达；（C）胃非典型增生组织中SCTAG弱阳性；（D-F）胃腺癌高、中、低分化腺癌抗SCTAG强阳性。
具体实施方式
实施例1 胃腺癌组织总mRNA提取和转录
一、组织样本的收集
从吉林大学中日联谊医院组织标本库挑选胃腺癌组织及其对应的癌旁组织和正常组织，以用于提取组织中mRNA。（癌旁组织取自于胃癌边缘1.5cm以外的部分，正常组织取自于胃癌边缘5cm以外的部分）。同时挑选出胃腺癌组织的病理蜡块，以用于切片免疫组织化学染色实验；共收集到48例胃腺癌患者的组织（包括：癌组织、癌旁组织和正常组）。
二、胃腺癌组织总mRNA提取
利用TRIzol法来提取组织中的总mRNA，具体方法如下：
（1）取50mg组织，将其剪成小块，放入到1mL的TRIzol，用分散匀浆器将组织充分粉碎，混匀。静置室温5 min；
（2）在上述混合液中加入200uL的氯仿，剧烈震荡15s，使其充分混合均匀，在室温条件下，静置3 min；
（3）将上述静置完后的混合液在4℃条件下，12000g离心15 min，取450uL的上层水相，并加入同体积450uL预冷的异丙醇，充分混合，在室温下，静置10 min；
（4）将上述静置完后的混合液在4℃条件下，12000g离心10 min，并弃去上清液，保留沉淀；
（5）向沉淀中加入1mL75％的乙醇，在4℃条件下，7500g离心5 min，弃去上清液；
（6）重复步骤5一次；
（7）最后，在沉淀中加入30uL无RNA酶（RNase）DEPC水，于55℃金属浴充分溶解10min，取出后放置冰上以用于后续实验，或保存于-80℃冰箱里冷冻保存；
三、胃腺癌组织mRNA逆转录成cDNA
将上述组织样本提取的总mRNA进行逆转录以得到对应的总cDNA。具体方法如下：
（1）首先对组织样本总mRNA进行浓度检测与质控（RNA：260/280比值选取范围为1.9-2.0；260/230比值为1.8-2.2）；
（2）依据总mRNA浓度，加入1ug mRNA样本，保证每个样本的mRNA上样浓度的一致性，根据以下体系配置混合物：
Figure 471584DEST_PATH_IMAGE001
（3）将上述反应体系置于70℃度恒温加热5min，然后立即置于冰上恒温5 min；
（4）根据以下体系配置混合物，并加入到上述反应体系中，充分混匀；
Figure 60829DEST_PATH_IMAGE002
(5) 将上述混匀后的反应体系置于42℃度恒温加热60 min，接着置于70℃度恒温加热15 min。将cDNA取出后放置冰上以用于后续实验，或保存于-20℃冰箱里冷冻保存；
以上步骤可通过普通PCR仪完成，并最终得到25μL的cDNA样本。
四、胃腺癌组织免疫组织化学染色
所用试剂：4%福尔马林；石蜡；玻片；不同浓度乙醇水溶液；3%过氧化氢；TE缓冲液；5%的山羊血清；抗SCTAG一抗；DAB显色液；苏木素染液；封片剂。SCTAG蛋白及单克隆抗体Hup1N，Hup1M, Hup2N均购自Briar patch biosciences公司。
1、染色步骤
（1）切片：将经福尔马林浸泡过后的组织，用石蜡包埋，并将单个癌组织蜡块连续切片，切片为3µm厚度。
（2）脱蜡：将玻片上的石蜡切片在65度下烘烤2小时。迅速用二甲苯脱蜡3次，每次2min，
（3）系列乙醇复水：脱蜡完成后将组织切片用一系列稀释的乙醇复水：无水乙醇2min×3次→95％乙醇2 min×3次→80％乙醇2 min×1次→70％乙醇2 min×1次→PBS冲洗2 min×3次。
（4）阻断内源性过氧化物酶：3%过氧化氢浸泡组织切片10min，以淬灭内源性过氧化物。再用PBS冲洗2 min×3次。
（5）抗原修复：将切片放置于装有TE缓冲液（1 mM EDTA和10 mM Tris，pH 9.2）的高压锅中，98℃加热30 min，再PBS冲洗2 min×3次。
（6）封闭非特异性蛋白：使用免疫组化切片笔沿组织周围2mm处画上封闭圆圈，用滤纸轻轻擦去样品周围的液体，滴加5%的山羊血清（二抗来源相同），并置于湿盒中，室温30min。勿洗。
（7）一抗孵育：甩去切片上的山羊血清，用滤纸擦干组织周围残留的血清，直接加入抗SCTAG一抗。对照组加入小鼠IgG。然后放置在摇床上的湿盒中摇晃4℃过夜。从4℃环境中取出室温复温30 min。去除掉一抗液体并用PBS摇床漂洗5 min×3次。
（8）二抗孵育：用滤纸擦干组织周围残留的液体，加入辣根过氧化物酶标记的二抗后，置于湿盒内，室温摇床30 min。去除掉二抗液体并用PBS摇床漂洗5 min×3次。
（9）DAB显色：用滤纸擦干组织周围残留的液体，加入DAB（快速滴入，观察染色变化情况，倒掉染液）。由显微镜镜下观察颜色变化情况来控制显色反应时间，显色时间基本控制在室温2-5 min。自来水冲洗后PBS漂洗5 min×3次。
（10）复染：在切片上滴加一大滴苏木素染液，染色后用自来水冲洗至完全去除苏木素。
（11）逐级脱水，透明，封片：按照与脱蜡复水反向顺序进行脱水，脱水后将切片浸入二甲苯透明，再使用中性树脂对切片进行封片。贴好标签，标记上样本信息，抗体信息与时间。
（12）镜检：待中性树脂完全干燥后，将切片放置在光学显微镜下观察。
2、结果判断
1）免疫组化阳性判断
2名病理学家在不了解临床数据的情况下检查了免疫组织化学（IHC）染色结果，每人至少两次独立读取组织切片的结果。在比较二者的结果之后，他们重新阅读了结果出现差异的切片，直到达成共识。简而言之，IHC染色被半定量标记为“-”（阴性：没有或少于5％阳性细胞），“+”（6-25％阳性细胞），“++”（26-50％阳性细胞）），“+++”（超过50％的阳性细胞）。最后“+”，“++”，“+++”这三组归为IHC染色阳性组；“-”归为IHC染色阴性组。
2）免疫组化阳性强度的计算
利用Image-Pro Plus软件（6.0版）通过积分光密度（IOD）分析组织中阳性染色的强度。在同一光学显微镜，同一曝光强度下，每个样本选取10个数字图像。Image-Pro Plus取色后，计算阳性染色的总IOD值与阳性染色的总面积Area（um2）。取每个图像的IOD/Area比值表示该图像的染色强度。最后取10张数字图像的平均IOD/Area比值作为该切片的染色强度的数值。
实施例2 胃腺癌组织SCTAG基因的检测
一、引物的设计与合成
使用Primer Express 3.0版软件针对SCTAG与内参GAPDH基因序列设计正向和反向寡核苷酸引物。并由上海生工公司进行合成；并根据不同引物的含量，最终都将引物浓度稀释成工作浓度（10μM）。具体引物序列信息如下（表1）：
Figure 27517DEST_PATH_IMAGE003
二、qRT-PCR反应体系的建立
将下列反应体系加入至PCR八联管中：
Figure 360409DEST_PATH_IMAGE004
将上述混匀后的反应体系按照如下qPCR 扩增程序进行反应，扩增。共计完成40次循环；
Figure 39695DEST_PATH_IMAGE005
每个样品制作三副孔，取平均Ct (Cycle threshold)值作为该样品的Ct值。
三、qRT-PCR实验中Ct值的计算
目标cDNA的表达量以ΔCt值为定量值，ΔCt=Ct(目的基因：SCTAG)-Ct(内参基因：GAPDH)。胃癌组织的ΔCt值做为对照组，ΔΔCt=ΔCt（癌旁或正常组织）-ΔCt（癌组织）。相对表达量使用-ΔΔCt法计算，当-ΔΔCt﹥0时，表示癌旁/正常组织中SCTAG mRNA的表达量要高于癌组织。
四、SCTAG mRNA在胃癌组织中的表达
利用Primer Express 3.0版软件针对SCTAG与GAPDH基因序列设计引物，通过溶解曲线显示其溶解峰为单峰状态（图1）；说明了这些引物设计合理，单一性良好；电泳结果也显示SCTAG的表达条带长度符合引物设计预期的片段长度（图2）；并将qPCR产物送到上海生工公司进行产物测序，得到序列的结果与目的基因的序列是一致的。
一共在45例胃癌组织中检测到了SCTAGmRNA的存在（93.75％，45/48）；CTA基因SCTAGmRNA也以一定的比例在非肿瘤组织区域中表达：癌旁组织（60.42％，29/48）和正常组织（25.00％，12/48）；卡方检验结果显示距离肿瘤中心部位越近的区域，SCTAGmRNA表达阳性频率越高（p< 0.001）（表2）。同时该实验也发现表达SCTAGmRNA的正常组织，其配对的癌组织和癌旁组织也一定表达SCTAG mRNA。而表达SCTAG mRNA的癌旁组织，其配对的癌组织也一定表达SCTAGmRNA，但正常组织不一定表达SCTAGmRNA；同样，表达SCTAG mRNA的癌组织并不能预测其配对的癌旁组织和正常组织能否阳性表达SCTAG mRNA（图3）。
Figure 49108DEST_PATH_IMAGE006
。
SCTAG mRNA在不同组织中的表达水平也具有着差异性，在29例癌组织和癌旁组织同时表达SCTAG mRNA的胃癌患者中，其癌旁组织表达SCTAG mRNA水平要普遍高于癌组织（图4A）；而在12例癌，癌旁和正常组织中都表达SCTAG mRNA的患者中，SCTAG mRNA表达水平按癌旁>正常>肿瘤组织（图4B）。总之，癌旁组织中SCTAG mRNA表达水平高于正常组织和肿瘤组织，提示SCTAG在细胞分化、肿瘤发生的过程中发挥作用。图5为SCTAG mRNA在健康人睾丸组织中表达结果；结果显示SCTAG mRNA在健康人中只在睾丸组织中表达，在其他组织器官内无表达。
实施例3人血清中SCTAG蛋白的检测
具体操作流程如下：
（1）将ELISA酶标板，样本稀释液等试剂移至室温（18-25°C），平衡至少30 min；标准品离心30-60s，加入1mL样品稀释液充分稀释成2000pg/mL的标准品原液，稀释后至少平衡10 min；
（2）标准品倍比稀释：如图6所示，移取250uL样品稀释液到每个试管中（编号0-6）；吸取250uL标准原液加入到编号6中，充分吹打混匀，待彻底混和后，从编号6的管中吸取250mL混合液加入到编号5的管中，依次传输到编号1管中。未稀释的标准液作为浓度最高的标准品（2000pg/mL）。样品稀释液用作浓度为零的标准品（0pg/ml）；
（3）样品稀释：采集的血清样品使用样品稀释液以1：5的比例稀释；
（4）加样：分别设标准品孔，待测样品孔。用排枪每孔加入100uL标准液或待测样品，标准品孔做双副孔，待测样品孔需要做三复孔；轻轻晃动混匀，覆盖上板贴，在37°C下孵育2h；
（5）弃去液体，倒置板甩干，并用干净的纸巾吸干，不用洗涤；
（6）每个孔中添加100uL生物素标记抗体工作液（1X）。覆盖上新的板贴。在37°C下孵育1h；
（7）弃去孔内液体，甩干，向每个孔中加入清洗缓冲液（200uL）进行清洗，并每次浸泡2 min，200uL/每孔，甩干。共洗板3次；
（8）向每个孔中加入100uL辣根过氧化物酶标记亲和素（HRP-抗生物素蛋白）工作液（1X）。用新的板贴覆盖上。在37°C 下温育1h；
（9）重复步骤7-8，共洗板5次；
（10）依序向每个孔中加入90ul TMB底物溶液。在37°C下孵育15-30min，避光显色。（反应时间控制：当编号1孔（31.25pg/mL）出现蓝色变化，而编号0孔（0 pg/mL）未出现蓝色变化的时刻进行反应终止）；
（11）依序向每个孔中添加50uL终止液，轻轻敲打滴板以确保充分混合；
（12）在反应终止后5 min内，用酶标仪在450nm波长序列测量各孔的吸光度值（OD值）；
（13）ELISA数据结果计算分析：分别计算出标准品孔和样品孔的平均吸光度OD值，单个孔的检测值不应超出平均值的20%；每个标准品和样品的平均值均减去编号0孔（浓度为0 pg/mL）的OD值；以标准品的吸光度OD值为横坐标（X），相应的标准品的SCTAG蛋白浓度为纵坐标（Y），建立标准曲线；待测样品的SCTAG蛋白含量可根据其OD 值由标准曲线换算出相应的浓度；样品最终的实际浓度应为标准曲线上获得的浓度乘以稀释倍数。
三、血清SCTAG蛋白与胃腺癌患者临床病理特征的相关性
相比较于正常人血清中SCTAG蛋白（94.30±88.70pg/mL），胃腺癌患者血清中SCTAG蛋白（1040.31±826.52pg/mL）显著上升（P＜0.001；图7A）；同时，独立t检验与Kruskal-Wallis检验结果显示：胃癌患者血清中SCTAG蛋白的水平与其他临床病理特征并无显著相关性，如：年龄（P=0.271），细胞分化程度（P=0.531），侵袭深度（T）（P=0.919）, 淋巴结转移（N）（P=0.150），临床分期（P=0.662），肿瘤大小（P=0.100），脉管侵及（P=0.742）和神经侵及（P=0.609）之间的关系无统计学差异（图7B-I）；同时，血清SCTAG蛋白浓度与组织肿瘤标志物EGFR（P=0.384），P53（P=0.925），HER-2（P=0.603），ki67（P=0.1353）之间的关系也无统计学差异（图8）。
实施例4血清SCTAG蛋白对胃腺癌患者诊断能力的评估
一、对早期患者的诊断能力
将所有胃腺癌患者血清SCTAG蛋白的敏感性和特异性绘制在ROC曲线上时，ROC曲线下的面积（AUC）为0.9937（图9A），其展现出血清SCTAG蛋白对胃腺癌患者的诊断有着较高的灵敏度与特异性，具有极强的诊断能力；同时，为了评估血清SCTAG蛋白对早期胃癌的诊断能力，我们分别对临床Ⅰ期，临床Ⅱ期与临床Ⅲ-Ⅳ期三组临床变量进行进一步的亚组分析，并发现在临床Ⅲ-Ⅳ期的胃腺癌患者中，血清SCTAG蛋白的诊断能力是最高的（AUC=0.9963，图9D）；而且血清SCTAG蛋白在早期胃癌（临床Ⅰ期）也具有很高的诊断能力（AUC=0.9941，图9B）；若以健康对照组血清SCTAG蛋白浓度的平均值+3倍标准差（Mean+3SD）作为胃癌诊断阳性的临界值，则血清SCTAG蛋白在胃腺癌患者诊断的阳性率可高达93.5％（159/170），早期胃癌患者（临床Ⅰ期）诊断的阳性率为96.3%（26/27）。
二、诊断能力受患者性别因素的影响
在正常机体中，SCTAG蛋白仅在男性中存在（睾丸部位），对此我们比较了男性和女性健康者，以及男性和女性患者之间血清SCTAG蛋白浓度的差异，以确认SCTAG是否可同时适合作为男性和女性群体诊断的血清肿瘤生物标志物。结果表明，男性（97.08±89.60 pg/mL）和女性（91.64±88.71 pg/mL）健康对照组之间的血清SCTAG蛋白浓度水平没有差异（P=0.771）（图10A）。同时男性胃腺癌患者（1021.99±771.74pg/mL）和女性胃腺癌患者（1083.05±949.09 pg/mL）之间的血清SCTAG蛋白浓度水平也没有差异（P = 0.660）（图10B）。并且，我们绘制ROC曲线进一步分析血清SCTAG蛋白对不同性别患者的诊断能力。结果表明男性的AUC值为0.9960（图10C），女性的AUC值为0.9885（图10D），二者的血清SCTAG蛋白诊断能力基本相近。这些数据均表明，血清SCTAG蛋白浓度对胃腺癌的诊断能力不会受到患者性别因素的影响，可适用于广泛的人群筛查，极有希望成为能够诊断胃腺癌的血清标志物。
三、血清SCTAG蛋白对多指标组合筛查的诊断能力
此外，我们也分析了对已检测血清SCTAG抗原的胃癌患者的临床肿瘤标志物的临床诊断能力，并发现CA724（AUC=0.6917）与CA50（AUC=0.7293）均具有中等的诊断能力（图11B，E）。但其他肿瘤标志物的诊断能力均相对较差，如CEA（AUC=0.5721）； CA199（AUC=0.5152）；CA242（AUC=0.5856）；AFP（AUC=0.5731）（图11A，C，D，F）。对于筛查较困难的胃癌，多指标组合筛查可有效提高胃癌的检出率。胃癌三项（CEA，CA199和CA724）和胃癌四项（CEA，CA724，CA199和CA242）诊断能力分别提高至AUC=0.6689和AUC=0.6680（图11G，H）。消化道肿瘤六项的诊断能力可高达0.9076（图11I）。相比较下，血清SCTAG蛋白拥有着更强的胃腺癌诊断能力，且具有着良好的灵敏性与特异性。
四、胃腺癌患者术前与术后血清中SCTAG蛋白分泌水平的变化
在20例胃腺癌患者的血清中，含有18例手术方式为根治性胃癌切除术的患者，2例为因术中发现肿瘤在腹腔内出现广泛转移而行开关术的患者。在这18例行胃癌根治术的患者术后7天的血清SCTAG蛋白浓度（415.05±207.33 pg/mL）要比术前血清SCTAG蛋白浓度（788.11±214.34 pg/mL）发生明显降低（P ＜0.001）；然而，行开关术的2例胃癌患者术后血清中的SCTAG蛋白浓度（1757.47±160.29 pg/mL）比术前血清SCTAG蛋白浓度（801.78±47.39 pg/mL）却是大幅度上升（图12）。该研究结果也再次验证了血清SCTAG蛋白具有诊断胃腺癌的能力，并可能用于术后监测是否有胃肿瘤细胞的残存，实时检测胃腺癌的存在。
五、胃腺癌肿瘤组织中SCTAG表达
我们发现SCTAG蛋白在胃癌组织中广泛表达，在120个样本里中共有98个样本有着SCTAG蛋白的表达，阳性率高达81.7%（表2）；并且免疫组织化学染色显示SCTAG蛋白阳性染色位于胃腺癌组织的细胞质中（图12）。而在正常组织中却未发现有SCTAG蛋白的表达（0/96，0%）（表2；图13B）。有趣的是，在观察胃癌组织切片表达SCTAG蛋白情况时，我们发现在胃的非典型增生组织中也有着少量的SCTAG蛋白表达，阳性率为61.6%（表2；图13C）；SCTAG蛋白在胃腺癌，非典型增生和正常组织中的表达频率呈下降趋势（P< 0.001）。
卡方分析结果表明：组织中SCTAG蛋白的表达阳性率与细胞病理分化程度的相关性极其密切（表3，P=0.004）。随着细胞分化恶性程度的增加，其SCTAG蛋白的表达阳性率也是呈下降趋势：高分化（100%），中分化（93.2%），低分化（71.2%）（表3）。同时，SCTAG蛋白的表达阳性率与胃癌的临床分期显著相关（表3，p=0.023）。临床分期越高的胃腺癌患者，表达SCTAG蛋白的频率越高。SCTAG蛋白也更易在脉管（P=0.044）与神经（P=0.033）受到肿瘤侵袭的组织中呈阳性表达。而胃腺癌组织中SCTAG蛋白的表达阳性频率与患者的年龄（P=0.94），性别（P=0.119），侵及深度（T分期）（P=0.064），淋巴结转移（P=0.073），大体分型（P=0.744）和肿瘤大小（P=0.082）无统计学差异（表3）。同时，胃癌组织中SCTAG蛋白的表达阳性频率与胃组织肿瘤标志物EGFR（P=0.329），p53（P=0.544）和HER-2（P=0.474）的表达均没有显著的相关性（表3）。
表3 胃腺癌组织中SCTAG蛋白表达频率与临床病理特征的关系
Figure 253825DEST_PATH_IMAGE007
Figure 639676DEST_PATH_IMAGE008
在观察胃癌组织切片时发现：在胃腺癌的腺腔中发现有SCTAG蛋白阳性染色，考虑其是由胃腺癌细胞分泌SCTAG蛋白到腺腔中所导致（图13，箭头所指）。
序列表
<110> 吉林大学
<120> SCTAG在制备诊断胃癌的试剂盒的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 510
<212> DNA/RNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 2
agagctggcc cctgactcac agcccacaga gttccacctg ctcacaggtt ggctggctca 60
gccaaggtgg tgccctgctc tgagcattca ggccaagccc atcctgcacc atggccaggt 120
acagatgctg tcgcagccag agccggagca gatattaccg ccagagacaa agaagtcgca 180
gacgaaggag gcggagctgc cagacacgga ggagagccat gagtaagtgg gcccagctga 240
gggtgggctg gggctgaggc tgggagctct cagggcccag ccttcctctc accacttttc 300
ttggtctcac cagggtgctg ccgccccagg tacagaccgc gatgtagaag acactaattg 360
cacaaaatag cacatccacc aaactcctgc ctgagaatgt taccagactt caagatcctc 420
ttgccacatc ttgaaaatgc caccatccaa taaaaatcag gagcctgcta aggaacaatg 480
ccgcctgtca ataaatgttg aaaagtcatc 510
<210> 2
<211> 51
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 2
Met Ala Arg Tyr Arg Cys Cys Arg Ser Gln Ser Arg Ser Arg Tyr Tyr
1 5 10 15
Arg Gln Arg Gln Arg Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ser Cys Gln Thr
20 25 30
Arg Arg Arg Ala Met Arg Cys Cys Arg Pro Arg Tyr Arg Pro Arg Cys
35 40 45
Arg Arg His
50

Claims (5)

1.抗SCTAG蛋白抗体在制备诊断胃癌的试剂盒方面的应用，其特征在于，所述胃癌为高分化胃腺癌；其中待测样本为组织样本。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的SCTAG蛋白其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的试剂盒的质控标准品为SCTAG蛋白。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的试剂盒为ELISA试剂盒。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的试剂盒为免疫组化试剂盒，它的一抗为抗SCTAG蛋白抗体。
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