CN108004323A - 组织中与结直肠癌转移相关的miRNA标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了组织中与结直肠癌转移相关的miRNA标志物及其应用，属于生物技术和医学技术领域，其中，组织中与结直肠癌转移相关的miRNA标志物为miR‑96、miR‑99b、miR‑155、let‑7a和let‑7b中的任意一种或几种。本发明筛选出的组织中与结直肠癌转移相关的miRNA对预测结直肠癌转移的特异性和灵敏度均显著高于目前临床上使用的肿瘤标志物CEA，大大提高了诊断的准确性。

Description

组织中与结直肠癌转移相关的miRNA标志物及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术和医学技术领域。更具体地说，本发明涉及组织中与结直肠癌转移相关的miRNA标志物及其应用。
背景技术
结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是常见的消化道癌症之一，并且是全世界癌症相关死亡的第三主要原因。结直肠癌肝转移的发生是一个多因素和多步骤的过程。约20-25％的CRC患者最初被诊断为肝转移，并且高达40-50％的患者在原发性肿瘤切除术后发生肝转移。大多数结直肠肝转移患者不适合根治性手术切除，五年存活率≤10％。
结直肠癌患者肝转移的发生除了与原癌基因及抑癌基因表达情况异常或丢失有关，也与“表观遗传学”，如乙酰化、甲基化和非编码RNA调控紧密相关。有研究证实，在结直肠癌的肝转移发生进展过程中，miRNA广泛参与其调控，有学者称这类miRNA为“metastamiR”。
微小RNA(miRNA)是类长度为18-25个核苷酸的内源非编码RNA，其通过与信使RNA的3'非翻译区(UTR)碱基结合，在转录后水平调节靶基因的表达，从而使翻译受到抑制或信使RNA裂解。高达20-30％的基因的表达由miRNA来调节。通过调节生理和病理过程，差异表达的miRNA在肿瘤的发生、进展、转移和复发中起着重要作用。2003年，Michael首次提出结直肠癌中存在差异表达的miRNA。随后，关于结直肠癌的miRNA的研究越来越多。某研究表明，存在miRNA在结直肠肿瘤发生和发展的不同阶段差异表达(高级别腺瘤-肿瘤早期-肿瘤晚期)。miR-543通过靶向HMGA2，KRAS和MTA1来抑制结直肠癌细胞系的增殖和转移，并且有望成为转移性结直肠癌的新型诊断和预后生物标志物。与健康受试者相比，CRC患者中较高水平的miR-211提示较差的预后。大量的研究表明，循环miRNA可作为潜在的诊断和预后标志物。近年，虽然miRNA已经得到大量的研究和验证，但是结直肠癌肝转移相关miRNA潜在的作用和功能很大程度上仍然未知，需要进一步发现和验证。
结直肠癌肝转移的病人，以手术为主，辅以放化疗、介入治疗及靶向治疗的综合治疗使患者生存时间得到了显著提高。但随着治疗策略的不断提升，新的问题也不断涌现。根治性手术治疗可将结直肠癌肝转移的5年生存率提高至50％，对于选择性高的结直肠癌肝转移患者，甚至可以达到60％；但对于可切除的结直肠癌肝转移病人，术后仍有将近50％的患者会出现肿瘤复发。
传统的筛检方法，如腹腔镜，细针抽吸细胞学和影像学方法，如增强计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)为侵入性的、并发症高或典型指征不足，因此难以成为结直肠癌肝转移患者早期筛选的有效方法。因此，迫切需要寻找早期诊断和预后评估的非侵入性精准的生物标志物，用于结直肠癌患者的诊断和治疗。
发明内容
本发明的目的是提供组织中与结直肠癌转移相关的miRNA标志物及其应用，通过生物信息学方法挖掘与结直肠癌肝转移有关的miRNA标志物，进一步釆用结直肠癌患者的石蜡包埋组织标本进行验证，同时分析差异表达miRNA与结直肠癌诊断的关系。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了与结直肠癌转移相关的miRNA标志物，该标志物在组织中为miR-96、miR-99b、miR-155、let-7a和let-7b中的任意一种或几种。
优选的是，所述的与结直肠癌转移相关的miRNA标志物中，该标志物在组织中为miR-99b、miR-155和let-7a中的任意一种或几种。
优选的是，所述的与结直肠癌转移相关的miRNA标志物中，该标志物在组织中为miR-99b、miR-155和let-7a的组合。
所述的与结直肠癌转移相关的miRNA标志物在制备结直肠癌早期诊断试剂、试剂盒中的应用。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明所筛选出的与结直肠癌转移相关的miRNA或miRNA的组合对预测结直肠癌转移的特异性和灵敏度均显著高于目前临床上使用的肿瘤标志物CEA，大大提高了诊断的准确性。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明所述的技术方法和数据分析流程框图；
图2为本发明所述的肝癌组织及其癌旁正常肝组织差异性miRNA聚类分析表达谱图；
图3为本发明所述的组织中总RNA凝胶电泳图；
图4为本发明所述的组织中miRNAs实时荧光定量PCR的扩增和熔解曲线图；
图5为本发明所述的结直肠癌患者无远处转移患者和肝转移患者福尔马林固定石蜡包埋组织中miRNA的表达水平图；
图6为本发明所述的结直肠癌肝转移患者肠癌组织和相应肝转移瘤组织中miRNA的表达情况图；
图7为本发明所述的分析miRNA在结直肠癌患者不同组间的诊断效能的ROC曲线；
图8为本发明所述的Kaplan–Meier法分析miR-99b和结直肠癌肝转移患者总体生存期的关系图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
第一部分：结直肠癌转移相关miRNA的生物信息学分析和筛选
材料与方法
1.技术方法和数据分析流程(见图1)
2.miRNA及基因表达数据的获取
本研究在GEO数据库中的检索关键词为“Colorectal cancer”，“Colon cancer”，“rectal cancer”，“Colonic carcinoma”，“Metastasis”，“Hepatic metastasis”，“livermetastasis”，“MicroRNAs”。并补充检索了Google Scholar和百度学术，在不同时间点检索两次，纳入芯片集在2010年之后，没有语言限制。纳入芯片集见表1-1。
表1-1结直肠癌转移相关的芯片集
其中，*：芯片集类型为安捷伦品牌的miRNA芯片。
3.肝癌组织及其癌旁正常肝组织miRNA芯片数据处理
本研究选取的miRNA芯片数据来自于本课题组前期研究(①Gao B,Ning S,Li J,et al.Integrated analysis of differentially expressed mRNAs and miRNAsbetween hepatocellular carcinoma and their matched adjacent normal livertissues.Oncol Rep.2015.34(1):325-33.②高冰,宁淑芳,唐艳萍,刘海洲,利基林,张力图.人肝癌组织及癌旁正常肝组织的mRNA差异表达谱.世界华人消化杂志.2014.(31):4734-4744.)中肝癌患者的2对肝癌组织及癌旁正常肝组织，组织均源自广西医科大学附属肿瘤医院标本库，所有患者对参与科学研究均知情同意，所有标本均为原发病灶的首次手术切除样本，均未接受过化疗，放疗等。切除的组织标本经液氮速冻后立即予以-80℃保存。
miRNA芯片实验数据提取及分析，芯片通过Agilent芯片扫描仪进行扫描，获得杂交图片。使用Agilent Feature Extraction(v10.7)软件分析杂交图片并获取数据，使用AgilentGeneSpring软件对数据进行归一化和差异分析。
4.PUBMED文献检索
为了综合评价以上差异微小RNA(microRNA，miRNA)对结直肠癌转移/肝转移的诊断及预后价值。本研究对差异基因进行了全面的文献检索(包括Pub Med、The CochraneLibrary、ISI Web of Science、CNKI、万方和维普数据库)，按照纳入与排除标准收集各数据库从2010年至2017年3月发表的关于不同miRNA与肿瘤相关的文献。在文献检索中我们按照：差异miRNA与肿瘤转移相关(包括参与调控EMT、细胞增殖与侵袭；参与某些致癌基因的调控，例如P53、KRAS等)，由此选出miR-96、miR-99b、miR-155、let-7a、let-7b五个基因做详细的文献检索表格并列出文献中涉及miRNA的差异表达倍数。
5.统计方法
5.1主要统计软件
R-3.3.3网址：https://www.r-project.org/
Fun rich网址：http://www.funrich.org/
GraphPad Prism 7网址：http://www.graphpad.com/
5.2芯片数据的标准化处理
数据获取后，首先我们将RNA原始数据和相关芯片的注释文件相结合，并进行分组，然后运用R语言的limma包进行标准化和表达差异分析，如果芯片所属文献中包含临床数据，我们将对其中信息重命名，并将差异基因和临床信息进行比对，找到完整信息的芯片集纳入研究。
筛选差异表达的miRNA，我们使用目前国内外研究都普遍使用的SAM方法，由斯坦福大学开发，并被广泛使用，是一种以t检验为基础的筛选差异基因的算法。本研究的筛选条件为P<0.1。即miRNA在转移灶和原发灶组织表达差异有统计学意义。本课题组前期研究的肝癌miRNA芯片数据的差异化筛选同上。
结果：
1.GEO数据集中差异表达的miRNA
1.1结直肠癌原发灶/转移灶组织相关的差异表达miRNA
入选的数据集为GSE72199，芯片标本分别来自结直肠癌原发灶和肝转移灶，应用28例结直肠癌原发灶和8例肝转移灶对照样本的标准化表达数据，进行分析筛选，根据是否有统计学意义及其差异倍数，符合条件的差异表达的miRNA共有83个，其中在转移灶组织中上调的33个，下调的50个，上调、下调的miRNA表达情况见表1-2。由于差异表达的miRNA数据相对较多，后续我们结合前期研究和文献分析再缩小研究范围。
表1-2 GSE72199中人结肠癌组织相对其肝转移组织差异表达的miRNA
2.前期研究中肝癌组织与相匹配癌旁正常组织中差异表达的miRNA
利用miRNA芯片技术，对原始数据进行处理后，我们得到了33个差异性表达的miRNA，其中上调的miRNA有21个，下调的miRNA有12个，结果见表1-3。
表1-3人肝癌组织相对其正常肝组织差异性表达miRNA
对差异性的miRNA进行聚类分析，结果显示肝癌组织(C)及其癌旁肝组织(N)有明显不同的表达谱，见图2，图2中，C1和C2代表肝癌组织，N1和N2代表癌旁肝组织。
3.差异表达miRNA与肿瘤相关关键词的文本挖掘与文献检索
在pubmed数据库中，我们在差异表达的miRNA中，将miR-96、miR-99b、miR-155、let-7a、let-7b与“Neoplasms(disease)”、“Colorectal Neoplasms(aliasCOLORECTALCANCER)”关键词共同检索。miR-96与结直肠癌关联检索的结果发现其与肝癌、肿瘤转移、生存及预后等关键词有密切关联；miR-99b与肿瘤、结直肠癌联合检索皆没有发现其与其他关键词有关联；miR-155与肿瘤联合检索发现其与细胞迁移、肿瘤分期、生存和TP53等关键词有密切关联；let-7a与结直肠癌关联检索结果发现其与肿瘤的表达调控，甲基化，DNA修复，腹腔内化疗及TP53、MYC、ras家族基因等关键词密切相关；let-7b与结直肠癌关联检索的结果发现其与肿瘤的表达调控，肿瘤转移、帕尼单抗、生存及预后、KRAS基因等关键词密切相关。
利用文本挖掘的上述5个miRNA，符合我们进一步研究的入组要求。我们对其中一些重点文献进行了检索，其结果见表1-4。其中，研究普遍认为miR-96、miR-155、let-7a、let-7b四个基因参与了肿瘤的转移，并且被认为是潜在的预后标志物；其中miR-96、let-7a、let-7b的表达被认为与TP53，ras家族基因，KRAS基因相关；由于miR-99b在GEO数据库和前期研究中均发现为高表达，但是其在肿瘤和结直肠癌中的报道相对较少，为了探究其在结直肠癌中的潜在作用机制和价值，因此，我们将miR-99b纳入我们分析研究的指标中。
表1-4文献中miR-96、miR-99b、miR-155、let-7a、let-7b表达情况一览表
注：*在癌组织/细胞/循环血中的表达。
综上所述，通过生物信息学方法，我们分析和筛选得到了在结直肠癌中与转移相关的5个miRNA，分别是miR-96、miR-99b、miR-155、let-7a和let-7b，各自的序列见表1-5。它们可能在结直肠癌的发生、发展或转移中有重要作用，针对此推测可进行进一步分子生物学实验。
表1-5 miR-96、miR-99b、miR-155、let-7a和let-7b的序列
第二部分结直肠癌患者石蜡包埋组织中肝转移相关miRNA的表达及其诊断和预后价值
1.实验材料
病例选择和标本收集
本研究已通过广西医科大学附属肿瘤医院医学伦理委员会的批准，每位受试者均已签署知情同意书同意使用标本及临床资料。收集于2008年12月30日至2011年12月30日期间在广西医科大学附属肿瘤医院就诊的结直肠癌患者58例。患者中位年龄为57岁(波动范围为33-89岁)。男性28例，女性30例；左半结肠13例，右半结肠23例，直肠22例；低分化肿瘤15例，中分化肿瘤26例，高分化肿瘤17例；肿瘤直径＜5cm的35例，肿瘤直径≥5cm的23例；T1+T2有27例，T3+T4有31例；N0有20例，N1+N2有38例；临床分期为I+II的有14例，临床分期III+IV的有44例；无远处转移患者25例，肝转移患者33例。通过UICC和AJCC进行临床分期评估。详见表2-1。
结直肠癌肝转移患者入组标准：收集时所有患者均未接受过化疗、放疗、靶向治疗等综合治疗，收集的肿瘤组织均为术前组织；未合并其他位置的远处转移和/或复发，未同时患有其他良性疾病。
结直肠癌无远处转移患者入组标准：无远处转移和/或复发，未同时患有其他良性疾病。
表2-1结直肠癌患者的临床特征
*P＜0.05
2实验方法
2.1患者手术标本的处理
肿瘤组织经手术切取后，立马放置于体积分数为4％的中性福尔马林溶液内固定，经取材、脱水、透明、浸蜡和包埋等处理后制成石蜡包埋(FFPE)的组织，切片经HE染色病理确诊，然后长期保存。所有无远处转移患者均留取肠癌组织和肠癌旁组织的蜡块；所有肝转移患者均留取肠癌组织、肠癌旁组织及相匹配的肝转移瘤组织的蜡块。
2.2石蜡包埋组织中总RNA的提取
2.2.1用手术刀削去石蜡层；
2.2.2切成5-20μm厚的片状(如果样本已经暴露在空气中，将头2-3层弃掉)；
2.2.3去石蜡操作：
2.2.3.1加1mL二甲苯、二戊烯或聚丙烯，涡旋震荡10s，全速离心2min；
2.2.3.2小心用枪头吸取上清，吸取上清的时候不要碰到沉淀物；
2.2.3.3在沉淀中加入1mL乙醇(体积分数为96-100％)，涡旋混匀，全速离心2min(乙醇的作用是将样本中的二甲苯去除)；
2.2.3.4小心用枪头吸取上清，吸取上清时不要碰到沉淀物，并用小枪头小心吸掉残留的庚烷/甲醇；
2.2.3.5开盖在室温下孵育(15-25℃，最高不要超过37℃)10min，或者孵育至所有残液挥发；
2.2.3.6加入150μL或240μL(切片数量大于2时)石蜡标本处理缓冲液，涡旋混匀；
2.2.3.7加入10μL蛋白酶K，用枪头温和混匀(反复吸打)；
2.2.3.在56℃下孵育15min，80℃下孵育15min。
2.2.4冰上孵育3min后，20,000×g(13,500rpm)离心15min；
2.2.5将上清转移至一个新的离心管，注意不要碰到沉淀物；
2.2.6加入约1/10样本体积的基因组脱氧核糖核酸去除缓冲液(约16μL或25μL—取决于样本量)，以及10μL的脱氧核糖核酸消化酶。正反倒置离心管混匀液体。简单离心以收集管壁上的残液；
2.2.7室温下孵育15min；
2.2.8加入320μL或500μL(样本大于2个切片时)红细胞缓冲液，彻底混合溶解产物；
2.2.9加入1120μL或1750μL乙醇(100％)至样本中，用枪头混匀，立即进行下一步；
2.2.10将700μL的样本(包括可能存在的沉淀)转移至微量核糖核酸抽提试剂盒上(将微量核糖核酸抽提试剂放置在2mL的收集管里，收集管试剂盒中已提供)。盖上收集管的盖子，在大于8,000×g(10,000rpm)条件下离心15s，丢弃收集管中的收集液；
2.2.11重复上面的步骤，直到之前的样本都处理完毕；
2.2.12加入500μL膜结合核糖核酸冲洗液至微量核糖核酸抽提试剂盒。小心盖上收集管的盖子，大于8,000×g(10,000rpm)条件下离心15s，丢弃收集管中的收集液；
2.2.13加入500μL膜结合核糖核酸冲洗液至微量核糖核酸抽提试剂盒。盖上收集管的盖子，大于8,000×g(10,000rpm)条件下离心2min，丢弃收集管；
2.2.14将微量核糖核酸抽提试剂放在一个新的2mL的收集管里，打开盖子，全速离心5min，丢掉收集管；
2.2.15将微量核糖核酸抽提试剂放在一个新的1.5mL的收集管里，直接加14-30μL无酶水至试剂盒的膜上，小心盖上盖子，全速离心1min，收集洗脱液。1.5mL离心管内收集到的即为提取的总RNA。
2.3组织总RNA的逆转录及实时荧光定量PCR
2.3.1组织总RNA的逆转录
取12μL上述总RNA，按照凯捷公司小RNA逆转录试剂盒进行逆转录。整个配制过程在4℃中进行，37℃中反应60分钟，进行Poly(A)加尾和逆转录反应，95℃中5分钟灭活酶小RNA逆转录体系。反应体系见表2-2：
表2-2反应体系
在得到的20μL逆转录产物中加入200μL无酶水，将所得产物cDNA进行浓度和纯度检测后置于-20℃冰箱保存备用。保存于-80℃冰箱中待用。
2.4.2荧光定量PCR
以逆转录后的cDNA为模板，按照小RNA聚合酶链反应染料法试剂盒的说明书配制PCR反应体系，引物均来自天根。每条引物重复3个复孔，每次试验重复3次。上游引物为天根公司设计的引物，下游引物为凯捷公司设计的通用引物。反应的条件按照试剂盒的要求设置：预变性95℃中15min；变性94℃中15s；退火延伸55℃中30s；40次循环，在70℃时绘制熔解曲线。反应体系见表2-3。引物序列见表2-4。
表2-3反应体系
表2-4引物序列
我们以miR-16为标准计算各个miRNA的差异表达水平，每个miRNA的表达水平采用2-△△CT方法进行计算，其中-△△CT＝(CT实验组-CT标准参照)-(CT对照组-CT标准参照)，分析miRNA在结直肠癌患者和健康对照人群中的差异表达情况。
我们以U6为标准参照来归一化各个miRNA的表达。
2.4生存分析
收集于2008年12月30日至2011年12月30日期间在广西医科大学附属肿瘤医院就诊的结直肠癌患者，采用电话和走访的形式定期随访，以死亡为终点事件，截止至末次随访时未发生终点事件或失访都归入截尾数据。随访截止时间为2016年9月，中位随访时间为53.8月。
2.5统计分析
采用SPSS 20.0、GraphPad Prism5.0或者Medcalc12.2.1进行数据分析。正态分布资料采用均数±标准差(Mean±SD)表示；采用t检验、单因素方差分析或者非参数检验评估不同组之间各个的miRNA表达差异；采用受试者工作曲线(ROC)和二元线性回归评估miRNA组合的诊断效能；采用单因素和多因素生存分析评估各个miRNA的预后价值。P值小于0.05视为有统计学意义。
结果：
1结直肠癌患者组织中miRNAs表达水平和临床病理参数的关系
1.1提取的总RNA质量鉴定及PCR扩增和熔解曲线图
经微量核酸测定仪检测，各样本总RNA的260/280的OD值在1.8-2.0间；经琼脂糖凝胶电泳实验，各样本28S、18S、5S的条带清晰，28S条带亮度大于18S和5S，故提取的RNA质量可靠完整，可用于下一步研究，见图3，图3中从左至右第1-3为结直肠癌患者癌组织，4-6为结直肠癌患者癌旁组织，7-9为结直肠癌患者肝转移瘤组织。
本研究中，内参和目的miRNA的荧光定量PCR的扩增曲线均呈现出S型，走形光滑，有明显的扩增期和平台期，表示扩增结果理想；内参和目的miRNA的荧光定量PCR的熔解曲线均为一狭窄的单峰曲线，熔点峰均在76-80℃之间，无明显双峰，表明扩增产物特异性好。见图4，图4中A，U6；B，miR-96；C，miR-99b；D，miR-155；E，let-7a；F，let-7b。图4中A-F横坐标为：Cycle；纵坐标为：Fluorescence(dR)。A-D横坐标由0开始，所标数值大小间隔2；纵坐标由0开始，所标数值大小间隔1000。E和F横坐标由0开始，所标数值大小间隔2；纵坐标由0开始，所标数值大小间隔10000。
1.2福尔马林固定石蜡包埋组织中miRNAs表达水平和临床病理参数的关系
我们检测了25例结直肠癌无远处转移患者和33例结直肠癌肝转移患者的5个miRNA的表达水平，其和临床特征的关系如下表2-5。由表2-5可知，本研究中5个miRNA的表达与肿瘤的T分期或肝转移等临床参数有关，差异有统计学意义(P＜0.05)。
表2-5结直肠癌患者肠癌组织miRNA的表达与临床病理参数的关系
*非参数检验
2结直肠癌患者癌组织和癌旁组织中miRNAs表达水平
为了探索本研究中5个miRNA在结直肠癌患者癌组织和癌旁组织之间是否有差异表达，我们采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)来检测这5个miRNA在组织的表达水平。如表2-6所示，统计分析表明，miR-96、miR-155和let-7a在CRC患者组织中高表达，而在癌旁组织中呈现低表达；miR-99b和let-7b在结直肠癌患者组织中低表达，在癌旁组织中呈现高表达，差异均有统计学意义(P＜0.05)。
表2-6结直肠癌患者组织中miRNAs表达水平
为了进一步寻找上述5个差异表达的miRNA与肝转移的关系，我们将58例结直肠癌患者分为无远处转移组(临床分期I-III，n＝25)和肝转移组(临床分期IV，n＝33)，比较两组中miRNA的表达水平是否有差异。统计分析表明，福尔马林固定石蜡包埋组织中miR-96、miR-155和let-7a在肝转移组中高表达，在无远处转移组中低表达，差异有统计学意义(P＜0.05)；而miR-99b在肝转移组中低表达，在无远处转移组中高表达，差异有统计学意义(P＜0.05)，未发现let-7b在两组之间差异表达，见图5，图5中，A：miR-96；B：miR-99b；C：miR-155；D：Let-7a；E：Let-7b。*为P＜0.05；**为P＜0.01；***为P＜0.001。
3结直肠癌肝转移患者肠癌组织和相匹配肝转移瘤中miRNA的表达
为了进一步分析这5个miRNA在结直肠癌肝转移患者中的表达情况，我们对33例有肝转移瘤的肠癌患者进行了详细的研究。我们通过配对t检验比较了每位患者的肠癌原发组织和相匹配的肝转移灶组织中这5个miRNA的表达情况，见图6，图6中A：miR-96；B：miR-99b；C：miR-155；D：Let-7a；E：Let-7b。我们发现，与相匹配肝转移灶相比，miR-96和miR-155在肠癌原发灶中表达上调，而miR-99b表达下调，差异有统计学意义(P为0.027，＜0.001，0.032)，然而我们未发现let-7a和let-7b在肝转移患者肠癌和肝转移瘤组织中存在差异表达(P＝0.098,0.131)。
4结直肠癌患者FFPE组织中miRNA的诊断效能分析
为了检测上述差异表达的组织miRNA在检出肝转移方面是否具有诊断价值，我们采用受试者工作曲线(ROC)和二元线性回归模型进行分析各个miRNA在各组之间的诊断效能，见表2-7和图7。首先，我们分析了上述5个差异表达的血浆miRNA在结直肠癌组织和癌旁正常组织之间的诊断效能，ROC和曲线下面积(AUC)表明本研究中5个miRNA均有较好的诊断效能，miR-96、miR-99b、miR-155、let-7a和let-7b的ROC曲线如图7所示，差异均有统计学意义(P<0.0001)。
接着，我们比较了无远处转移患者和肝转移患者的肠癌组织中各个miRNA的诊断效能，发现miR-99b、miR-155和let-7a具有较优的诊断价值，差异均有统计学意义(P<0.0001)，而miR-96和let-7b的诊断价值较低(P＞0.05)；将具有统计学意义的3个指标miR-99b、miR-155和let-7a联合，评价其联合诊断效能，发现AUC＝0.954(0.864-0.992)均高于这3个指标的单独诊断效能及其它miRNAs的联合诊断效能，见图7。图7中，A：5个miRNA鉴别无远处转移和肝转移结直肠癌患者的ROC曲线；B:miR-99b，miR-155和let-7b联合鉴别无远处转移和肝转移结直肠癌患者的ROC曲线。
表2-7结直肠癌患者FFPE组织中miRNA诊断效能的评估
5生存分析
为了评估本研究中5个miRNA和结直肠癌肝转移患者预后的关系，我们将33例肝转移患者根据各个miRNA表达水平的中位数将患分为高表达组和低表达组，通过Kaplan–Meier法和Cox多因素回归模型分析FFPE组织中miRNA的表达和总体生存期的关系，如表2-8。单因素分析结果表明miR-99b，let-7b和N分期与患者总体生存时间有关，P＜0.05)，未发现其它miRNA及临床病理参数，例如年龄、性别和肿瘤直径等与总体生存时间的差异有统计学意义(P＞0.05)。多因素Cox回归模型示miR-99b、N分期是结直肠癌肝转移患者预后的独立危险因素，见图8。
表2-8结直肠癌肝转移患者总体生存时间的单因素和多因素分析
与结直肠癌转移相关的miRNA标志物，该标志物在组织中为miR-96、miR-99b、miR-155、let-7a和let-7b中的任意一种或几种。
在上述方案中，组织中5个miRNA的诊断效能均优于CEA。
一个优选的方案中，与结直肠癌转移相关的miRNA标志物中，该标志物在组织中为miR-99b、miR-155和let-7a中的任意一种或几种。
在上述方案中，组织中miR-99b、miR-155和let-7a在诊断无远处转移患者和肝转移患者中的单独或组合诊断价值较高。
一个优选的方案中，与结直肠癌转移相关的miRNA标志物中，该标志物在组织中为miR-99b、miR-155和let-7a的组合。
在上述方案中，组织中miR-99b、miR-155和let-7a三个指标联合的诊断价值优于CEA及其它指标。
所述的与结直肠癌转移相关的miRNA标志物在制备结直肠癌早期诊断试剂、试剂盒中的应用。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
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Claims (4)

1.组织中与结直肠癌转移相关的miRNA标志物，其特征在于，该标志物为miR-96、miR-99b、miR-155、let-7a和let-7b中的任意一种或几种。
2.如权利要求1所述的组织中与结直肠癌转移相关的miRNA标志物，其特征在于，该标志物为miR-99b、miR-155和let-7a中的任意一种或几种。
3.如权利要求1所述的组织中与结直肠癌转移相关的miRNA标志物，其特征在于，该标志物为miR-99b、miR-155和let-7a的组合。
4.如权利要求1所述的组织中与结直肠癌转移相关的miRNA标志物在制备结直肠癌早期诊断试剂、试剂盒中的应用。
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