CN101365712A - Pan-HER拮抗剂及其使用方法 - Google Patents

Pan-HER拮抗剂及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明描述了人类表皮受体拮抗剂(HER)。这类拮抗剂是人类表皮受体的配位体多肽变体。本发明所述的人类表皮受体配位体多肽变体具有广泛针对人类表皮受体的特性，并且能够抑制一种或者多种人类表皮受体亚型中由人类表皮受体介导的生物活性的至少一种，例如可以抑制受体激酶的活化活性和随后的细胞增殖。这类多肽变体以及编码该多肽变体的核酸可以被临床用于需要抑制人类表皮受体活性的情况中。

Description

Pan-HER拮抗剂及其使用方法
相关申请
本申请要求申请日为2005年1月11日的美国临时申请NO.60643089的权利，上述申请的全部教导在此通过引证全部并入本文。
背景技术
表皮生长因子(EGF)是一种含有53个氨基酸的细胞生长因子，通过蛋白水解作用从一个大的膜内在蛋白质前体中裂解开来。表皮生长因子在哺乳动物细胞的生长调节方面起着非常重要的作用。人类表皮生长因子的氨基酸和核酸序列公开在例如Hollenberg编写的《表皮生长因子-尿抑霉素，一种形成激素状态的多肽》，Academic Press，Inc.，纽约(1979)，69-110页；或者参见Urdea等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA.807461(1983)中的文章。表皮生长因子的氨基酸序列也被公开在美国专利NO.5102789以及美国专利申请NO.10820640中，上述两篇文献的全部教导也在此引入作为参考。
人类表皮受体(HER)，包括表皮生长因子受体(EGFR)，是公知的受体酪氨酸激酶的范例。人类表皮受体同其关联配位体或结构相关的配位体间的相互作用会导致激酶结构域的二聚及活化。这将引发一个信号级联，并导致细胞分裂。在许多癌症中都牵涉到编码人类表皮受体家族成员的基因的过表达，例如在乳腺癌、卵巢癌、脑癌以及颈癌中。已经表明，作用于表皮生长因子受体(人类表皮受体1)的分子通过抑制表皮生长因子受体(人类表皮受体1)的激酶活性或通过干扰表皮生长因子与表皮生长因子受体的结合来抑制细胞的增殖，这类分子已经被用于抗癌治疗当中，例如(gefitinib)，一种酪氨酸激酶抑制剂；和ErbituxTM(cetuximab)，一种对表皮生长因子受体具有特异性的单克隆抗体。其他分子，包括例如Herceptin的单克隆抗体能作用于人类表皮受体家族的其他不同成员。近来，已经开展进行了几种单克隆抗体和小分子激酶抑制剂(例如Panituzumab和Lapatnib)的研制，作为能作用于多种人类表皮受体的分子的范例。尽管这些治疗制剂已经在一些病例中显出成效，但是仍然需要找到能够针对与人类表皮受体相关的癌症的新式疗法，特别是需要找到能够作用于整个人类表皮受体家族的治疗制剂组合物。
发明内容
本发明描述了新的Pan-HER拮抗剂。“Pan-HER拮抗剂”意味着能够抑制、消除多种由人类表皮受体介导的生物活性的任何分子，或者能够导致多种由人类表皮受体介导的生物活性的终止的任何分子，例如通过减少、干扰、阻遏或其他能够阻止天然的或激活的人类表皮受体配位体与人类表皮受体相结合和相互作用的方式，这类分子优选是人类表皮受体1、人类表皮受体2、人类表皮受体3和/或人类表皮受体4以及这些受体的变体形式。对人类表皮受体1、人类表皮受体3和人类表皮受体4的直接干扰能够达到间接干扰人类表皮受体2的作用，这是通过消除保持活性必需的二聚配偶子来实现的。这些Pan-HER拮抗剂是人类表皮受体的配位体多肽变体。本发明优选的Pan-HER拮抗剂是那些能够阻遏或者打断全部人类表皮受体家族成员的至少一种生物活性的非天然产生的多肽分子，例如，它们广泛的减少或者抑制人类表皮受体激酶活性，信号反应，调节机制，二聚反应，或者抑制全部的人类表皮受体调节的细胞增殖。本发明优选的配位体变体是那些能够选择性的抑制至少一种由人类表皮受体介导的生物活性的变体。这类人类表皮受体配位体多肽变体以及编码这类多肽变体的核酸可以被临床应用于需要抑制人类表皮受体生物活性的治疗中，例如癌症。这里所说的术语“多肽”是指通常意义的多肽，指天然蛋白，相关多肽序列的碎片、同系物或者类似物。
在一个方面，本发明描述了一种衍生于天然形成的人类表皮受体配位体的人类表皮受体配位体变体，相应于野生型表皮生长因子的Gly39位置，所述配位体变体在位置39处的甘氨酸上(G39或Gly39)具有至少一个氨基酸取代基，具有至少一个来自于另一个不同的人类表皮受体配位体的区域(“取代区域”)，并且具有至少一种广泛拮抗人类表皮受体的活性。在一个优选的实施方式中，优选甘氨酸在相应于野生型表皮生长因子Gly39处的位置上被亮氨酸取代(G39L)，并且所述取代区域优选在表皮生长因子的氨基酸末端区域。
本发明还描述了一种用于处理病人体内由人类表皮受体过表达导致的状况的方法，包括向病人施以能起到有效治疗作用的量(治疗有效量)的药物组合物，所述药物组合物包含至少一种本发明所述的人类表皮受体多肽变体。
附图的简要说明
附图1表示的是表皮生长因子、HRGβ1与BiR的序列对比。
附图2的图表描绘出A431细胞中的表皮生长因子受体的自动磷酸化作用，使用表皮生长因子受体、表皮生长因子和BiRegulin的两个拮抗性配位体刺激上皮肿瘤细胞系。使用V35E和G39L取代的BiRegulin不会刺激产生自动磷酸化作用。
附图3和附图4的图表分别描绘了人类表皮受体5细胞(过表达人类表皮生长因子受体的小鼠成纤维细胞)和MCF-7细胞(表达人类表皮受体2和人类表皮受体3的人类乳腺癌细胞系)的刺激反应。人类表皮受体5细胞能够被表皮生长因子及BiR所刺激，不会被HRG所刺激。MCF-7细胞能够被BiR及HRG所刺激，不会被表皮生长因子所刺激。没有细胞系会被BiRV35EG39L所刺激。
附图5A到5D的图表描述了在本发明所述的人类表皮受体配位体多肽变体的存在下的细胞增殖试验。
具体实施方式
本发明描述了一种新的广泛作用于人类表皮受体的拮抗剂。这种广泛作用于人类表皮受体拮抗剂是人类表皮受体的配位体多肽变体。人类表皮受体配位体的例子包括哺乳动物表皮生长因子(例如人类(表皮生长因子)，猪，猫，狗，鼠类，马以及兔)。其他的人类表皮受体的例子包括转化生长因子-α(TGFα)，β细胞调节素，肝素结合性表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)，神经调节因子，heregulin(HRG)，两性调节蛋白(AR)以及上皮调节蛋白，其中HRG包括HRGα、HRGβ1、HRGβ2和HRG因子(NDF)。本发明优选的人类表皮受体配位体变体是基于能够选择性的抑制由人类表皮受体介导的生物活性的人类表皮受体配位体变体。
本发明是以本发明人过去的发现为基础，发明人发现：使用其他氨基酸优选亮氨酸(指这里所说的“EGF G39L”)取代表皮生长因子39位置上的甘氨酸，经过这样的修饰会使表皮生长因子变成一个表皮生长因子受体(人类表皮受体1)拮抗剂(参见Attorney Docket NO.35301002US2、题名为“表皮生长因子受体拮抗剂及其使用方法”、申请日为2005年6月30日的美国有效申请，该申请的内容在此引入作为参考)。现在，本发明人已经发现，将其他人类表皮受体家族成员配位体的区域“交换”到表皮生长因子G39L中，生成的新的人类表皮受体配位体嵌合分子不但能够保持表皮生长因子G39L的拮抗活性，而且进一步提供了更广泛的适应性，这是因为同样的人类表皮受体配位体变体还可以作用于额外添加的人类表皮受体分子以产生抑制作用。非常希望得到能够特异于人类表皮受体1、人类表皮受体3和人类表皮受体4的一种人类表皮受体配位体变体，它能够为多种癌症提供强有力的治疗，在这些癌症中都包含了不希望的、由一个或者多个人类表皮受体家族成员产生的由人类表皮受体介导的生物活性。
考虑到受体和人类表皮受体配位体之间显著的结构相似性，可以相信，G39残基、或者在其他人类表皮受体配位体中与G39残基相对应的氨基酸在整个人类表皮受体配位体家族中起着相同的作用，因此，可以确信，任何具有G39L取代的人类表皮受体配位体或其等价物都可以作为制备本发明所述的人类表皮受体配位体多肽变体(例如，嵌合体)的起始物。
在一个方面，本发明描述了一种衍生于天然形成的人类表皮受体配位体的人类表皮受体配位体多肽变体，相应于野生型表皮生长因子Gly39，所述配位体多肽变体在位置39处的甘氨酸上(G39或Gly39)具有至少一个氨基酸取代基，具有至少一个来自于另一个不同的人类表皮受体配位体的区域(“取代区域”)，并且具有至少一种广泛拮抗人类表皮受体的活性。在这个实施方式中，配位体被定义为在区域III的结合断裂，却在区域I与其受体相结合。在一个优选的实施方式中，优选在相应于野生型表皮生长因子的Gly39位置处的甘氨酸被亮氨酸(G39L)所取代，且取代的区域是表皮生长因子的氨基末端区域。这里使用的短语“相应于野生型人类表皮生长因子的氨基酸G39的位置处的氨基酸”是指，当把来自于不同种类哺乳动物的未经修饰的人类表皮受体配位体与人类野生型表皮生长因子一一对应以进行最佳的比较时，在与人类野生型表皮生长因子的G39位置相对应的位置上或位置旁的甘氨酸是对应好的(参见AttorneyDocket NO.35301002US2、题名为“表皮生长因子受体拮抗剂及其使用方法”、申请日为2005年6月30日的美国有效申请，该申请通过引证在此并入本文)。
在另一个方面，本发明描述了一种合成的人类表皮受体配位体多肽变体，例如被称为BiRegulin(附图1)的合成的heregulin/表皮生长因子嵌合体，它在与野生型表皮生长因子Gly39位置相对应的位置39处的甘氨酸具有至少一个氨基酸取代。BiRegulin(BiR)是一种嵌合的表皮生长因子同系物，其中表皮生长因子的氨基末端残基(NSDSE)被HRGβ1的相应残基(SHLVK)所取代。
在另一个方面，本发明描述了一种合成的配位体多肽变体，其中区域I或区域III中的一个的结合被断裂开来，但保留了或增加了与区域I或区域III中另外一个的结合。这些变体可以通过修饰在区域I和/或区域III中的其他氨基酸来制备(例如，R41D)，正如这里所列举的那些变体一样。这些变体可以容易的被修饰或者被加工，来改变其天然的受体特异性(或者扩展了其特异性，例如所述变体结合了额外添加的受体或者能够特异的作用于特异性受体)。这可以通过前面所述的额外突变或者区域交换方法中的任意一个来完成。
这里所说的“由人类表皮受体介导的生物活性”是指人类表皮受体内在固有的蛋白质-酪氨酸激酶活性，以及能够最终导致DNA合成和细胞增殖的下游信号转导级联。
这里所说的“广泛的作用于人类表皮受体的拮抗剂”是指能够抑制、消除多种由人类表皮受体介导的生物活性的、或能够导致多种由人类表皮受体介导的生物活性的终止的任何分子，例如通过减少、干扰、阻遏或其他能够阻止天然的或激活的人类表皮受体配位体与一种或多种人类表皮受体亚型相结合和相互作用的方式。术语“拮抗剂”用在这里只是一种功能性的表述，并非有意将本发明限制在一类具有特殊反应机制的化合物的范围内。例如，术语“拮抗剂”可以包括，但并非局限于，具有竞争性拮抗作用的分子。该竞争性拮抗剂与人类表皮受体结合，但并不会触发人类表皮受体的生物活性。
本发明所述的配位体多肽变体(包括“人类表皮受体”配位体“嵌合体”)具有许多有效的性质。例如，本发明所述的多肽变体能够被用来治疗某些疾病，这些疾病在病变过程中都涉及到人类表皮受体的过表达(例如，癌症)。
依照本发明所述，G39可以被任何适合的氨基酸所取代，而经过取代的人类表皮受体配位体多肽仍然具有完整的广泛拮抗人类表皮受体的活性。例如，G39可以被谷氨酸盐取代(G39E)、被谷酰胺取代(G39Q)、被赖氨酸取代(G39K)、被天冬氨酸取代(G39D)、被异亮氨酸取代(G39I)、或者被亮氨酸取代(G39L)。在一种特别优选的实施方式中，G39被苯丙氨酸取代(G39F)、被亮氨酸取代(G39L)、被天冬氨酸取代(G39D)、或者被异亮氨酸取代(G39I)。优选被亮氨酸取代(G39L)。
除G39位置发生了氨基酸修饰之外，本发明所述的人类表皮受体多肽变体还包含一种取代区域，它来自于另外一种不同的人类表皮受体配位体。在一种优选的实施方式中，所述的取代区域是整个的或者一部分的SHLVK残基，取自HRGβ-1并且用以取代表皮生长因子的相应残基，优选选取氨基酸NSDSE的某一部分，使得表皮生长因子的1-5的氨基终点对应于该氨基酸NSDSE。在本发明的一种优选实施方式中，所述人类表皮受体的多肽变体是BiRegulin(BiR)，在相应于野生型表皮生长因子的39位置处，所述多肽变体在该位置处的甘氨酸具有至少一个氨基酸取代基，且其中相对应于野生型表皮生长因子Gly39或G39的位置39处的甘氨酸已经被亮氨酸(BiRG39L)或其他合适的氨基酸所取代。在另一种优选的实施方式中，BiRG39L进一步在氨基酸位置35处被取代，在该位置处的缬氨酸被谷酰胺取代(BiRV35EG39L)。本发明所述这些人类表皮受体多肽变体还具有至少一种广泛作用于人类表皮受体的拮抗活性，并且优选能够拮抗每一种人类表皮受体亚型——人类表皮受体1、人类表皮受体3和人类表皮受体4。
本领域已经知晓，能够结合人类表皮受体的配位体可以被分为三类：1)与人类表皮受体1单独结合的配位体(表皮生长因子，转化生长因子α，两性调节蛋白)，2)与人类表皮受体3和/或人类表皮受体4结合的配位体(heregulins和神经调节因子)和3)与人类表皮受体1和人类表皮受体4结合的配位体(β细胞调节素，肝素结合性表皮生长因子，神经调节因子3，上皮调节蛋白)(参见Riese和Stern于1998年在《生物文章》20：41上发表的文章)。每种人类表皮受体的受体都以一种处于未激活状态的单体形式存在。配位体的结合促进了结合受体与其他人类表皮受体家族成员之间的均二聚作用或者杂二聚作用。不同的表皮生长因子样的生长因子高亲和性的与除人类表皮受体2之外的每个表皮生长因子受体相结合，其中人类表皮受体2没有已知的配位体，并且具有能形成均二聚体和杂二聚体的组成能力。均二聚体通常并不是出现在肿瘤细胞的生长过程中，但其对于心肌的生长和修复是具有重要作用的(参见Dougall等人于1994年在《致癌基因》9：2109上发表的文章；Hynes和Stern于1994年在《Biochims Biophys Acta》1198：165上发表的文章；Tzahar和Yarden于1998年在《BiochimsBiophys Acta》1377：M25上发表的文章；以及Negro等人于2004年在《近期激素研究进展》59：1上发表的文章)。人类表皮受体2是优选的与其他人类表皮受体进行杂二聚反应的配偶子(参见Tzahar等人于1996年在《生物细胞分子》16：5276上发表的文章；Beerli等人于1995年在《生物细胞分子》15：6469上发表的文章；Karunagaran等人于1996年在《EMBO J》15：254上发表的文章；以及Wang等人于1998年在《PNAS》95：6809上发表的文章)。人类表皮受体2与其他人类表皮受体家族成员的不同之处在于：它具有一种缺陷型酪氨酸激酶区域(参见Guy等人于1994年在《PNAS》91：8132上发表的文章)，必须与另外一种人类表皮受体家族的受体相结合才能触发信号反应。
本发明所述的人类表皮受体多肽变体例如BiRG39L或者BiRV35EG39L的优点在于：它们能够特异性的作用于多种人类表皮受体目标，例如人类表皮受体1，人类表皮受体3和人类表皮受体4，并且能够对每一种人类表皮受体亚型产生拮抗作用。本发明所述的变体不需要直接作用于人类表皮受体2，因为它通过对人类表皮受体1、人类表皮受体3和人类表皮受体4的作用，能够有效阻止它们与人类表皮受体2发生杂二聚作用，从而阻遏了人类表皮受体2的不希望具有的生物活性。这种方法有利于避免对人类表皮受体2均二聚作用的阻遏，因为已经表明，阻遏人类表皮受体2的均二聚作用将导致心肌症，是一种威胁生命的副作用。
也可以设想另外一种“区域交换”的方法，这种方法也包含在本发明之中。例如，相对应于成熟的表皮生长因子的氨基酸位置21-30处的表皮生长因子B环可以被另一种不同的人类表皮受体配位体的相应B环区域所取代，优选人类的人类表皮受体配位体，例如人类转化生长因子-α(TGFα)，β细胞调节素，肝素结合性表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)，神经调节因子，heregulin(HRG)，两性调节蛋白(AR)和上皮调节蛋白。可以通过导入相应的B环区域来改变拮抗剂对人类表皮受体的特异性。因此，当使用表皮生长因子G39L作为制备本发明所述人类表皮受体配位体多肽的起始物时，需要使用一个不同的人类表皮受体配位体的相应B环区域来取代表皮生长因子G39L的B环区域，其中所使用的人类表皮受体配位体是已知的能够与希望被拮抗的特异性人类表皮受体分子产生相互作用的。通过这种方法获得的经修饰的嵌合体具有被改变了结合特异性的表皮生长因子G39L变体所拥有的拮抗活性，这种拮抗活性取决于交换得到的B环的来源。
因此，为了制备本发明所述的具有对人类表皮受体1增强的作用力的、Pan-HER配位体多肽变体，可以使用转化生长因子-α或者两性调节蛋白的相应B环区域来取代表皮生长因子的B环区域。为了制备本发明所述的具有对人类表皮受体3和/或人类表皮受体4增强的作用力的、Pan-HER配位体多肽变体，可以使用神经调节因子的相应B环区域来取代表皮生长因子的B环区域。为了制备本发明所述的具有对人类表皮受体1和人类表皮受体4增强的作用力的、Pan-HER配位体多肽变体，可以使用β细胞调节素、肝素结合性表皮生长因子样生长因子、神经调节因子3或者上皮调节蛋白的相应B环区域来取代表皮生长因子的B环区域。由于人类表皮受体2没有已知的配位体，可以通过消除人类表皮受体1、人类表皮受体3或人类表皮受体4这些维持活性所需的二聚化配偶子来达到间接作用于负调节的目的，即使用本发明所述的多肽变体来拮抗人类表皮受体1、人类表皮受体3和人类表皮受体4，进而达到拮抗人类表皮受体2的目的。B环交换区域的拮抗活性的示例表示在附图5A-5D中。
此外，人类表皮受体配位体多肽变体的同系物、类似物及碎片也包含在本发明的范围之内。“同系物”意指来自于其他种类哺乳动物的人类表皮受体配位体的相应多肽，在本质上等同于人类野生型人类表皮受体配位体，只要这类同系物保留了广泛作用于人类表皮受体的拮抗活性即可。例如，来自于不同种类哺乳动物的表皮生长因子多肽同系物序列如下：
NSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR人类(序列1)
NSYSECPPSHDGYCLHGGVCMYIEAVDSYACNCVFGYVGERCQHRDLKWWELR猪(序列2)
NSYQECPPSYDGYCLYNGVCMYIEAVDRYACNCVFGYVGERCQHRDLK-WELR猫(序列3)
NGYRECPSSYDGYCLYNGVCMYIEAVDRYACNCVFGYVGERCQHRDLK-WELR狗(序列4)
NSYPGCPSSYDGYCLNGGVCMHIESLDSYTCNCVIGYSGDRCQTRDLRWWELR鼠(序列5)
NSYQECSQSYDGYCLHGGKCVYLVQVDTHACNCVVGYVGERCQHQDLR马(序列6)
NSNTGCPPSYDGYCLNGGVCMYVESVDRYVCNCVIGYIGERCQHRDLRWWKLR兔(序列7)
“类似物”意指包括那些发生了一个或者多个氨基酸改变的多肽变体，例如氨基酸残基的取代、添加或者缺失，但其仍然具备了相关太的表皮生长因子受体拮抗特性。
除了在表皮生长因的位置G39处发生的突变，或者在其他Pan-HER配位体相应于野生型表皮生长因子氨基酸位置39的氨基酸位置处发生的突变，还可能发生其他的突变，这些突变将在本质上完整的保留Pan-HER配位体多肽变体那种广泛作用于人类表皮受体的抑制活性或者拮抗活性。这些突变体可以是具有单个的氨基酸取代、缺失或者插入的形式，也可以是具有多个氨基酸取代、缺失或者插入的形式。用于取代的氨基酸取代基可以以保守取代或者非保守取代的形式在多肽的一个或者多个位置上进行取代。这里使用的术语“保守的氨基酸取代”是指那些通常存在于序列中的、与被取代的氨基酸具有相似大小、电荷或者极性的氨基酸取代基。保守取代的例子包括用一个非极性(疏水)残基例如异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸来取代另外一个非极性残基。同样的，保守取代的例子还包括用一个极性(亲水)残基来取代另外一个极性残基，例如在精氨酸和赖氨酸之间发生的取代，在谷酰胺和天冬酰胺之间发生的取代，以及在甘氨酸和丝氨酸之间发生的取代。此外，碱性残基之间的取代，例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸对其他碱性残基的取代，或者酸性残基之间的取代，例如天冬氨酸、谷氨酸对其他酸性残基的取代，这些都属于保守取代的例子。非保守取代的例子包括用一个非极性(疏水)残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸来取代一种极性(亲水)残基例如半胱氨酸、谷酰胺、谷氨酸或者赖氨酸，和/或使用极性残基来取代非极性残基，都属于非保守取代。
本发明所述的人类表皮受体配位体多肽变体的治疗效果还可以通过在其他位置处发生的氨基酸取代、缺失和插入来进一步增强，作为选择，其他位置可以是G39处。所述增强的治疗效果包括但不局限于，增强的亲和性，延长的半衰期，增加的可溶性，以及增加的生物可利用性。在一个优选的实施方式中，在BiR的位置G18、V35、G39和/或R41处的任意几个位置之上进行的氨基酸的取代、缺失或插入，或者在其他人类表皮受体配位体上与野生型表皮生长因子的位置G18、V35、G39和/或R41相对应的位置之上进行的氨基酸的取代、缺失或插入，这些方法都可能用于制备本发明所述的人类表皮受体配位体嵌合体。特别优选的是制备一个变体，这个变体在一个结合区域(区域I或区域III)的结合是断裂的，而在其他区域的结合是增强的(增加亲和性)。本发明的一个优选的人类表皮受体变体是BiRV35EG39L。
可以使用许多方法来设计、制备和测试本发明所述的人类表皮受体配位体多肽变体。区域交换，氨基酸的取代、缺失或插入都可以使用本领域已知的方法来完成，例如使用定点诱变的方法。得到的诱变多肽随后可以使用体外荧光试验例如本发明描述的荧光试验或者其他任何适合的荧光试验来测试它的广泛拮抗人类表皮受体的活性。
这里记载的数据以及附图5A-5D显示的数据表明，以表皮生长因子为基础的、在其位置39处有氨基酸取代的、并且具有来自于另外一个不同人类表皮受体配位体的取代区域的人类表皮受体配位体多肽变体能够抑制细胞的增殖，其中提供取代区域的人类表皮受体配位体是例如两性调节蛋白、β细胞调节素、上皮调节蛋白和转化生长因子-α。可以使用其他任何适当的试验或其他方法对本发明中的待测多肽的抑制性或者广泛针对人类表皮受体的拮抗活性进行进一步的评定，并且与野生型人类配位体多肽的人类表皮受体活性进行比较。
如前所述，本发明的多肽变体和它们的同系物以及类似物在本质上等同于野生型配位体。这里使用的“本质上等同”意指与野生型人类配位体的氨基酸序列相比较(当所述变体是由区域交换而获得的嵌合体时，与交换的区域的氨基酸序列相比较)，具有至少60％的序列同一性，优选具有至少70％的序列同一性，更优选具有至少80％的序列同一性，更更优选具有至少90％的序列同一性，并且保持了人类表皮受体的抑制性或者其他的广泛针对人类表皮受体的拮抗活性。在其他的实施方式中，本发明所述的多肽变体与野生型人类配位体相比，具有至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、或者至少98％的氨基酸同一性，并且保持了人类表皮受体的抑制性或者其他的广泛针对人类表皮受体的拮抗活性。为了识别两种核酸序列或者氨基酸序列的同一性百分数，可以将两个序列一一对准，以达到最佳比较的目的(例如，可以在最优序列中导入一些缺口)。然后把位置相对应的氨基酸进行比较，两个序列间的同一性百分数是一个关于由两个序列共有的等同位置的函数(例如，同一性％＝等同的位置/位置总数×100)。可以使用已知的方法来完成对两个序列的实际比较，例如使用数学运算的方法。这种数学运算方法的一个优选的、并非限制的例子在Karilin等人于1993年在《Proc.Natl.Acad.Sci》(美国)90：5873-5877上发表的文章中有所描述。Schaffer等人于2001年在《核酸研究》29：2994-3005上发表的文章中描述了将这样的算法导入了BLASTN程序和BLASTX程序(版本2.2)中。
可以使用几种技术来制备本发明所述的多肽变体。在一个优选的实施方式中，本发明所述的多肽变体通过将编码该多肽变体的基因在适合的宿主中表达的方法来制备。所述的基因最容易通过前述的野生型人类基因的定点诱变而得到。然而，本发明所述的多肽变体全部或者部分通过化学合成技术来获得，例如通过梅里菲尔德合成法来获得。当使用非天然存在的氨基酸对多肽变体进行取代的时候，尤其希望通过化学方法合成全部的或者部分的修饰多肽。
本发明还提供了能够编码本发明所述人类表皮受体配位体多肽的核酸分子。本发明所述的核酸分子可以是RNA，例如信使RNA，或是DNA。所述DNA分子可以是双链的或者单链的。所述核酸分子也可以与一个标记序列进行融合，例如，一种能编码多肽、有助于多肽的分离和纯化的标记序列。这类序列包括但不局限于，编码一种谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白的序列，编码来自于流感病毒的血凝素A(HA)多肽标记的序列，以及编码组氨酸标记物的序列。
本领域技术人员能够理解，对表达载体的设计可以依据宿主细胞选择的被转化形式和所希望的多肽的表达水平这类因素来决定。本发明使用的表达载体可以被导入到宿主细胞中，从而制备本发明所述的经过修饰的多肽，包括由前述核酸分子编码的融合多肽。用于制备本发明所述的经过修饰的多肽的重组产物的分子生物技术是本领域已知的，并且在例如Sambrook等人于2000年发表的文章《分子克隆：一项实验室手工技术》(冷泉港实验室出版社)第3版中有所描述。
本发明同样涉及到包含这里所述的人类表皮受体配位体多肽变体的药物组合物。例如，可以将本发明所述的多肽变体与生理可接受载体或者赋形剂配制成药物组合物。所述载体及组合物可以是无菌的，其用量配方应当与给药形式相适应。
适合的药物可接受载体的例子包括但不局限于：水，盐溶液(例如氯化钠)，盐水，盐水缓冲液，酒精，甘油，乙醇，阿拉伯树胶，植物油，苄基乙醇，聚乙二醇，明胶，碳水化合物例如乳糖，淀粉酶或淀粉，葡萄糖，硬脂酸镁，滑石，硅酸，粘性石蜡，芳香油，脂肪酸酯，羟甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮等等，以及它们的混合物。此外，可以使用例如脂质体和微乳状液之类的载体。也可以将本发明所述的多肽变体共价结合到蛋白载体例如白蛋白之上，或者将所述多肽变体共价结合到一个多聚物例如聚乙二醇之上，以减少多肽的早期纯化。如果需要，可以将所述药物制剂与辅助剂进行混合，辅助剂是例如润滑剂，防腐剂，稳定剂，润湿剂，乳化剂，影响渗透压力的盐类，缓冲剂，着色剂，风味剂和/或芳香物质及其类似物这些不会与组合物中的活性成分发生有害反应的物质(例如，本发明所述的多肽和/或核酸分子)。
如果需要，上述组合物还可以包含少剂量的润湿剂或乳化剂，或者PH缓冲剂。该组合物可以是溶液形式，悬浮液形式，乳液形式，片剂形式，丸剂形式，胶囊形式，缓释剂形式，或者粉末形式。该组合物还可以被制成栓剂形式，使用传统的粘合剂以及载体，例如甘油三酯。口服形式的配方可以包括标准载体，例如药用级的甘露糖醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，糖精钠，纤维素，碳酸镁等等。
所述组合物的给药方式包括但不局限于：透皮给药，肌肉内给药，腹膜内给药，眼内给药，静脉内给药，皮下给药，局部给药，口服给药以及鼻内给药。其他适合的给药方式还可以包括基因治疗(将在下面进行描述)，使用再充电式装置或者生物可降解装置，例子加速装置(“基因枪”)以及缓慢释放聚合装置。本发明所述组合物还可以作为一部分与其他组合物一并给药进行治疗。
本发明所述的人类表皮受体配位体多肽变体可以采用常规程序配制成适合施用于人类的药物组合物。例如，以静脉注射方式给药的组合物可以被制成典型的无菌等渗水性缓冲液溶液的形式。如果需要，该组合物还可以含有增溶剂和局部麻醉剂，以缓解注射位点处的疼痛。一般的，这些组分可以按照个体用药剂量分别供给或者混合在一起供给，例如，可以将制成干的冻干粉末形式或制成无水浓缩液形式的组分装在密封的容器中供给，所述密封的容器例如安瓿瓶或者装液袋这类注明了活性组合物(多肽和/或核酸)的量的容器。如果该组合物是以输液的形式给药，可以将其溶解于装有无菌药用级水、盐水或葡萄糖/水的输液瓶中。如果该组合物是以注射的形式给药，可以将其置于装有注射用无菌水或盐水的安培瓶中供给，以便在给药之前使各组分混合均匀。
本发明所述的人类表皮受体配位体多肽变体可以被制成中性形式或是盐的形式。药学上可接受的盐包括那些能够结合游离氨基的盐，例如盐酸盐，磷酸盐，醋酸盐，草酸盐，酒石酸盐等等，以及那些能够结合游离羧基的例如钠盐，钾盐，胺盐，钙盐，氢氧化铁，异丙胺，三乙胺，2-乙氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等等。
本发明所述的人类表皮受体配位体多肽变体以能起到有效治疗作用的剂量(治疗有效量)给药。针对特定疾病或状况的治疗有效量的剂量取决于所述疾病或状况的性质，可以凭借标准的临床技术来测定。此外，可以选择性的使用体内试验或者体外试验来帮助确定最优剂量范围。药方中使用的精确剂量还取决于给药的方式，以及疾病或状况的症兆的严重程度，并且应该根据执业医生的判断以及每个病人的具体情况来决定。可以通过体外试验或者动物模型试验体系得到的剂量响应曲线来推断有效剂量。
本发明同样涉及到处理由人类表皮受体的过表达而引起的状况的方法(预防、诊断、和/或治疗)。“由人类表皮受体的过表达而引起的状况”是指在引入本发明所述的多肽变体后能有助于治疗的状况。这类状况包含许多类型的癌症，例如，由人类表皮受体家族成员的过表达引起的中胚层肿瘤和外胚层肿瘤。已经表明，人类表皮受体在许多神经胶质瘤、扁平细胞瘤、乳腺瘤、黑素瘤、侵入性膀胱瘤和食道癌中存在过表达。此外，对原始人类乳腺肿瘤的研究表明了人类表皮受体基因的高水平表达与癌细胞的转移、高速率的增殖、以及病人存活时间的缩短都具有相关性。人类表皮受体基因的过表达同样存在于其他不同种类的疾病中，例如牛皮癣和纤维症。
这里使用的术语“处理”不仅仅是指改善疾病或状况的症状，还包括防止或者延缓疾病的发作，以及减轻所述疾病或状况的症状的严重程度及发作频率。如果需要，可以协同使用不止一种的本发明所述的多肽变体，作为一种协同治疗处理体系。这里使用的“协同治疗处理体系”是指将两种药物以单独形式或者混合形式同时给药的处理体系，或者将两种药物以间隔数分钟、数小时或数天的不同时间按顺序给药、但各自药效同时作用以达到所希望的治疗响应的处理体系。还可以将本发明所述的多肽与其他药物联合使用，以达到抑制人类表皮受体受体的各种异常活性的目的。这类联合使用的药物包括但不局限于人类表皮受体特异性抗体，小分子激酶抑制剂，以及传统化疗剂。
本发明所述的治疗组合物以治疗有效量的剂量给药(例如，足以有效处理疾病或状况的剂量，例如能有效改善疾病或状况的症状、防止或者延缓疾病的发作、和/或减轻所述疾病或状况的症状的严重程度及发作频率的剂量)。针对特定个体疾病或状况的治疗有效量的剂量取决于所述疾病的症状及严重程度，可以凭借标准的临床技术来测定。此外，可以选择性的使用体内试验或者体外试验来帮助确定最优剂量范围。药方中使用的精确剂量还取决于给药的方式，以及疾病或状况的严重程度，并且应该根据执业医生的判断以及每个病人的具体情况来决定。可以通过体外试验或者动物模型试验体系得到的剂量响应曲线来推断有效剂量。
本发明所述的治疗组合物可以单独使用，也可以以如前所述的药物组合物的形式使用。例如，本发明所述的修饰多肽的基因可以以单独的形式或者被包含于载体之中的形式导入到细胞中(体内形式或者体外形式)，然后所述细胞可以制备所希望的多肽。如果需要，可以将已经转染了本发明所述的核酸分子的细胞导入(或者重导入)到侵染了疾病的个体当中。
可以使用其他的基因转移体系，包括病毒性转移体系和非病毒性转移体系。可选择的，非病毒基因转移方法例如磷酸钙共同沉淀、机械技术(例如显微注射)、电穿孔、经由脂质体的膜融合介导的转移、或者DNA的直接摄取，这些方法同样可以被用于将所希望的核酸分子导入到细胞中去。
实施例
实施例1：方法和材料
克隆和基因表达。化学合成人类表皮生长因子(EGF)基因，并将其连结到Pet-9载体(Novagen公司)的Nde I和BamH I克隆位点上。所述表皮生长因子基因包含OmpA前导序列，其后是一个N末端6x-组氨酸标记物和一个Xa分裂位点因子，该因子在需要的情况下能够进行之后的组氨酸标记物的去除。对应于下述氨基酸序列：
-------OmpA---------leader----------------------his-tag--Xa-----EGF-------------------------------------------------MKKTAIAIAVALAGFATVAQAHHHHHHIEGRNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEAUDKYACNCWGYIGERCQYRDLKWWELR
(序列8)
这个被指定为pMLP P1的最初的克隆被用来作为制备所有的广泛人类表皮受体配位体变体(包括发生了取代、缺失、插入和区域交换的变体)的基础，通过使用快速改变诱变工具(Stratagene公司)来制备。为了获得蛋白制品，将表皮生长因子质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)pLysS(Novagen公司)中。
配位体变体的制备。将单个的克隆接种到含有培养基的摇瓶中，所述培养基中含有15ml的LB培养基、25单位的卡那霉素以及30单位的氯霉素。生长过夜后，取样品量的培养物用于繁殖，并用于质粒的制备，以确保同样的表皮生长因子基因的插入。其余的培养物用来接种培养在Terrific肉汤、25单位的卡那霉素以及30单位的氯霉素中的产物。在早期对数生长阶段使用0.2mM的IPTG使细胞诱导表达，并令培养物生长过夜。通过离心方法收集培养基上层清液，通过斑点印迹对表达产物进行确认，并且使用小鼠WesternBreeze显色免疫检测体系(Invitrogen公司生产，编号为cat# WB7103)，将初级抗体与小鼠抗6x组氨酸单克隆抗体(anti-penta his antibody)(Qiagen公司生产，编号为cat #34660)按1:1000的比例对产物进行鉴定。
表皮生长因子蛋白的纯化。将3ml的Ni-NTA树脂(Qiagen公司生产，编号为# 30230)装5ml的层析柱(Qiagen公司生产，编号为cat # 34964)中，该层析柱已经使用了PH8.0的PBS进行平衡。在将培养基上层清液上柱之前，先使用1
N盐酸将其PH调整至7.5-8.0。然后使用PBS和PBS与10mM的咪唑混和液洗涤该层析柱；用PBS与250mM的咪唑的混和液将表皮生长因子变体蛋白从层析柱洗脱出来，并使用Bradford蛋白测试方法来监测蛋白浓度。
蛋白浓缩和缓冲液交换。在4℃下，在一个缓冲液交换器中使用PBS对柱层析洗脱液进行透析，然后使用3000MWCO Macrosep离心装置(ISC#OD003C41)对其进行浓缩。使用BCA方法测试最终产物的蛋白浓度，并使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测试其纯度。
实施例2：细胞增殖刺激试验
人类表皮受体5细胞系，一种经过稳定转染能够表达人类表皮生长因子受体的鼠类成纤维细胞系(NR-6细胞系衍生而来)，由M.C.Hung博士提供(MD Anderson癌症中心)。使人类表皮受体5的繁殖培养物在D-MEM/F12培养基中进行繁殖培养，该培养基包含10％的胎牛血清、100单位/毫升的盘尼西林和100微克/毫升的链霉素，繁殖培养过程在水套孵化器中进行，在37℃、相对湿度5％的二氧化碳气体中进行。为了对人类表皮受体5进行增殖试验，将细胞置入不添加胎牛血清的D-MEM/F12培养基中培养24小时。然后将细胞胰酶化并按照105个细胞/毫升的水平进行悬浮。连续稀释表皮生长因子(Pepro Tech，Pocky Hill，NJ)，在不含胎牛血清的D-MEM/F12培养基中以2倍的最终浓度培养人类表皮受体配位体多肽变体，并将其置于96孔培养板中。将50微升细胞悬浮液(5000个细胞)加入到适合的孔中，使具有所希望的浓度的液体总体积达到100微升。将培养板进行一个48小时增殖周期的孵化。在增殖周期的最后三小时里以每孔10微升的量加入WST-1细胞增殖试剂(罗氏应用科学公司生产，印第安纳波利斯，印第安纳州)以检测细胞的增殖。WST-1是一种通过成活细胞内的线粒体脱氢酶与甲臜染料相粘附的四唑化盐。使用装有MRX相关性软件的微量培养板读数器(Dynex Technologies公司)在450纳米下测量所述甲臜的剂量。
MCF-7细胞是从美国典型培养中心(ATCC)获得的。将MCF-7细胞的繁殖培养物培养在补充有1％的ITS-X(Invitrogen公司)和10％的胎牛血清的Eagle’s MEM培养基中。为了对其进行增殖试验，将MCF-7细胞转移至没有添加胎牛血清的培养基(S FM)中培养24小时，然后将细胞胰酶化并按照105个细胞/毫升的水平悬浮于SFM中。在96孔微量培养板的每个孔中加入50微升细胞悬浮液(5000个细胞)。制备人类表皮受体配位体或者突变蛋白的连续稀释物，其具有两倍于SFM中浓度的最终浓度，并将50微升这样的连续稀释物加入到孔中，使具有所希望的浓度的液体总体积达到100微升。在37℃、相对湿度5％的二氧化碳气体中对所述培养板培养72小时。在增殖周期的最后三小时里以每孔10微升的量加入WST-1细胞增殖试剂(罗氏应用科学公司生产，印第安纳波利斯，印第安纳州)以检测细胞的增殖。
参与测试的人类表皮受体配位体多肽变体是：其B环区域被来自于两性调节蛋白的相应区域所取代的BiRegulin，BiRV35EG39L以及表皮生长因子G39L(G39L+Amp ds)；其B环区域被来自于β细胞调节素的相应区域所取代的表皮生长因子G39L(G39L+BTC ds)；其B环区域被来自于上皮调节蛋白的相应区域所取代的表皮生长因子G39L(G39L+Epi ds)；以及其B环区域被来自于转化生长因子-α的相应区域所取代的表皮生长因子G39L(G39L+TGF-α ds)。
存在于一种上皮肿瘤细胞系——A431细胞系中的表皮生长因子受体的自身磷酸化是由两个针对表皮生长因子受体的拮抗性配位体刺激发生的，所述的两个拮抗体是附图2中所示的表皮生长因子和BiRegulin。同时，附图3也显示出具有V35E和G39L取代基的BiRegulin不会刺激自身磷酸化的发生。
附图3和附图4分别表示出人类表皮受体5细胞(过表达人类表皮生长因子受体的小鼠成纤维细胞)和MCF-7细胞(能够表达人类表皮受体2和人类表皮受体3的人类乳腺癌细胞系)的刺激情况。人类表皮受体5细胞能够被表皮生长因子和BiR所刺激，但不能够被HRG所刺激。MCF-7细胞能够被BiR和HRG所刺激，但不能够被表皮生长因子所刺激。BiRV35EG39L对两种细胞都不产生刺激作用。
如附图5所示，试验结果表明，区域交换保留了表皮生长因子G39L的拮抗活性，使其仍然能够抑制细胞的增殖。
本发明所涉及的专利文献和科技文献公开了本领域技术人员能够使用的知识。在此引用的全部美国专利文献、公开的或者未公开的美国专利申请的全部内容在此引入作为参考。在此引用的所有公开的外国专利文献以及外国专利申请的全部内容在此引入作为参考。在此引用的其他所有公开的参考书、文献、手稿以及科技文献的全部内容在此引入作为参考。
尽管本发明只是对其中的优选的实施方式进行了详细的描述和表示，但是本领域技术人员能够理解，在不背离本发明包含的附加权利要求的范围的情况下，各种形式和细节上的改变同样包含在本发明中。

Claims (38)

1.一种人类表皮受体(HER)配位体多肽变体，它包括一种人类表皮受体配位体多肽，所述多肽在相对应于人类野生型表皮生长因子(EGF)的氨基酸Gly39位置处的氨基酸被另一种氨基酸所取代，且所述人类表皮受体配位体多肽进一步包含至少一个取代区域，且所述变体具有至少一种能广泛作用于人类表皮受体的拮抗活性。
2.根据权利要求1所述的变体，其中所述的人类表皮受体配位体多肽是表皮生长因子。
3.根据权利要求1所述的变体，其中所述的氨基酸取代基选自苯丙氨酸，亮氨酸，天冬氨酸和异亮氨酸。
4.根据权利要求1所述的变体，其中所述的氨基酸取代基是亮氨酸。
5.根据权利要求1所述的变体，其中所述的取代区域是表皮生长因子的氨基末端区域。
6.根据权利要求1所述的变体，其中所述的人类表皮受体配位体多肽是表皮生长因子，并且其取代区域是相应于氨基酸NSD SE的成熟表皮生长因子的第1-5个氨基酸。
7.根据权利要求6所述的变体，其中所述的表皮生长因子的取代区域被相应于氨基酸SHLVK的HRGβ1同源氨基酸所取代。
8.根据权利要求1所述的变体，其中所述的人类表皮受体配位体多肽是BiRegulin(BiR)。
9.根据权利要求8所述的变体，其中所述的氨基酸Gly39被亮氨酸所取代。
10.根据权利要求1所述的变体，其中还包含至少一个额外的氨基酸取代，取代在相对应于野生型人类表皮生长因子Gly39位置处以外的位置上。
11.根据权利要求10所述的变体，其中所述的额外的氨基酸取代至少有一个取代在相对应于野生型人类表皮生长因子的G18、V35、和R41的位置上，或是这些位置的任意组合。
12.根据权利要求8所述的变体，其中在氨基酸位置V35处含有额外的氨基酸取代。
13.根据权利要求12所述的变体，其中在氨基酸位置35处的缬氨酸被谷氨酸取代。
14.根据权利要求1所述的变体，其中包含BiRV35EG39L。
15.根据权利要求1所述的变体，其中所述的变体含有至少一种能针对人类表皮受体1、人类表皮受体3和人类表皮受体4的拮抗活性。
16.一种药物组合物，其含有权利要求15所述的人类表皮受体配位体多肽变体和一种药物可接受载体。
17.一种治疗病人的方法，该病人患有由人类表皮受体的过表达而引起的疾病，包括给病人施用治疗有效量的权利要求16所述的药物组合物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述的疾病是癌症。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述的癌症选自神经胶质瘤、扁平细胞瘤、乳腺瘤、黑素瘤、侵入性膀胱瘤、直肠瘤和食道癌。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述的疾病是牛皮癣。
21.根据权利要求1所述的变体，其中所述的人类表皮受体配位体多肽选自：人类表皮生长因子，转化生长因子-α(TGFα)，β细胞调节素，肝素结合性表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)，神经调节因子，heregulin，两性调节蛋白(AR)和上皮调节蛋白。
22.根据权利要求1所述的变体，其中所述的取代区域是B环区域。
23.权利要求1所述的人类表皮受体配位体多肽变体，包括其B环区域被来自于另外的人类表皮受体配位体多肽的相应B环区域所取代的表皮生长因子G39L，其中所述的另外的人类表皮受体配位体多肽选自：人类表皮生长因子(EGF)，转化生长因子-α(TGFα)，β细胞调节素，肝素结合性表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)，神经调节因子，heregulin，两性调节蛋白(AR)和上皮调节蛋白，并且所述变体具有至少一种能广泛作用于人类表皮受体的拮抗活性。
24.一种药物组合物，含有权利要求1所述的人类表皮受体配位体多肽变体和一种药学上可接受的载体。
25.一种药物组合物，含有权利要求23所述的人类表皮受体配位体多肽变体和一种药学上可接受的载体。
26.一种治疗病人的方法，该病人患有由人类表皮受体的过表达而引起的疾病，该方法包括给病人施用治疗有效量的权利要求16所述的药物组合物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述的疾病是癌症。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述的癌症选自神经胶质瘤、扁平细胞瘤、乳腺瘤、黑素瘤、侵入性膀胱瘤、直肠瘤和食道癌。
29.根据权利要求26所述的方法，其中所述的疾病是牛皮癣。
30.一种人类表皮受体(HER)配位体多肽变体，其具有至少一种能广泛作用于人类表皮受体的拮抗活性，并且所述变体发生一种突变，导致区域I和/或区域III的结合断裂。
31.根据权利要求30所述的变体，其中所述变体发生一种突变，导致区域I的结合断裂。
32.根据权利要求31所述的变体，其中所述变体进一步发生一种突变，导致区域III的结合亲和性增强。
33.根据权利要求30所述的变体，其中所述变体发生一种突变，导致区域III的结合断裂，还发生了一种突变，导致区域I的结合亲和性增强。
34.根据权利要求30所述的变体，其中所述变体进一步发生一种突变，这种突变改良了受体的结合特异性。
35.一种编码权利要求1所述变体的核酸。
36.一种编码权利要求14所述变体的核酸。
37.一种编码权利要求23所述变体的核酸。
38.一种编码权利要求30所述变体的核酸。
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