CN109879965A - 抗epha2单链抗体、抗cd3e单链抗体及融合蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

抗EPHA2单链抗体、抗CD3E单链抗体及融合蛋白及其应用。本发明公开了一种抗跨膜酪氨酸激酶受体的单链抗体、一种抗CD3E的单链抗体及其融合蛋白及其应用，所述融合蛋白具有高度特异性的抗原识别能力，既具有抗体的特异性识别作用，同时又具有优异的抗肿瘤效果，其对三种不同类型的肿瘤细胞系，均有明显的生长抑制作用，而且该抗体融合蛋白的分子量小，可以在原核细胞表达系统中表达，大大降低了抗体药物的生产成本，具有良好的临床应用前景。

Description

抗EPHA2单链抗体、抗CD3E单链抗体及融合蛋白及其应用

技术领域

本发明公开了一种抗EPHA2单链抗体、抗CD3E单链抗体及融合蛋白及其应用，属于免疫学和分子生物学领域。

背景技术

肿瘤是威胁人类生存最大的疾病。世界卫生组织研究显示，2012 年中国癌症发病人数为306.5万，约占全球发病的五分之一；癌症死亡人数为220.5万，约占全球癌症死亡人数的四分之一。

肿瘤的形成和发展具有非常复杂的调节机制，有非常多的生物效应分子参与其中。明晰这些生物效应分子的作用机制，对于肿瘤疾病的预防和治疗具有重要的意义。

EphA2是一个跨膜酪氨酸激酶受体，属于酪氨酸激酶受体 (receptor tyrosinekinases，RTKs)超家族成员之一。EphA2通常以相对较低的水平表达在成人各种上皮细胞中，其在介导相应的信息传递过程中起着关键性的作用，调控着许多方面的细胞行为。近来研究显示，EphA2在多种肿瘤组织中高表达，进一步的研究证实 EphA2过表达促进肿瘤向恶性发展。因其在正常及肿瘤组织中表达的差异性，加之其有别于其他RTKs的结构及功能的特异性，目前EphA2 被认为是一个很有潜力的靶点，正成为各种肿瘤防治研究的焦点。

在许多肿瘤细胞模型和临床样本中，均报道EphA2高水平的表达，包括乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、高侵袭性黑色素瘤、宫颈癌、卵巢癌、恶性间皮细胞瘤等。并且研究发现，EphA2的表达与多种恶性肿瘤的病理分级及临床分期相关。

CD3分子是T淋巴细胞表面抗原和TCR一起活化T细胞，引起细胞免疫应答。CD3分子由4条不同的链组成，其中E链是作为协同TCR 向胞内传递活化信号的重要亚基。已上市的人源化CD3抗体OKT3就是特异性针对CD3E链的活化抗体。

传统的治疗肿瘤的方法是手术或者放、化疗。随着近年生物制药技术的发展，一批优质的抗肿瘤抗体药物的问世，使得一些难治性肿瘤的生存率大大提高。抗体药物已作为肿瘤患者常规的治疗药物之一，预计2020年，单抗药物的销售额将达到2000亿美元。自从1984 年第一个基因工程抗体人－鼠嵌合抗体诞生以来，新型基因工程抗体不断出现，如人源化抗体、单价小分子抗体(Fab、单链抗体、单域抗体、超变区多肽等)、多价小分子抗体(双链抗体，三链抗体，微型抗体)、某些特殊类型抗体(双特异抗体、抗原化抗体、细胞内抗体、催化抗体、免疫脂质体)及抗体融合蛋白(免疫毒素、免疫粘连素)等等。另外，用于制备新型抗体的噬菌体抗体库技术成为继杂交瘤技术之后生命科学研究中又一突破性进展。

对于血液性肿瘤，全分子抗体药物具有优势，它们可以激活补体和免疫细胞将血液中游走的肿瘤细胞杀死，但是对于实体肿瘤，由于全分子抗体药物分子量大，进入不到实体瘤内部，它们的抗肿瘤效果不理想。而小分子抗体却可以轻松进入实体瘤内部发挥抗肿瘤作用。未来的抗体药物将以小分子抗体药物为主。小分子抗体药物尤其对中国来说更为必须，因为在中国多发的肺癌、肝癌和消化道系统肿瘤中绝大多数都是实体性肿瘤。中国男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。而在肺癌中也有些是死亡率非常高的转移性肿瘤，如肺癌的脑转移发生率可以达到35％～50％，多个部位的骨转移发生率可以达到50％。对于脑和骨转移的癌症治疗，小分子抗体药物就可以发挥其无法替代的抑制转移作用。

目前小分子抗体开发成药物主要以两种形式为主，一种是抗体偶联复合物(Antibody conjugate complex，ADC)，另一种是双特异抗体。抗体-药物偶联物是一种新型的靶向治疗，比如抗肿瘤治疗中，ADCs 由一个抗体或一个抗体片段ScFv连接着一个有效载荷的药物(通常是毒素)形成一个免疫复合物。抗体使这个免疫复合物结合到特定的肿瘤细胞上，通常这个免疫复合物会内化到肿瘤细胞内部，然后药物释放到细胞内引起肿瘤细胞损伤和死亡。抗体偶联复合物虽然具有很好的肿瘤识别能力和抗瘤效应，但是其制备过程中需要与另外的化学基团偶联，不仅增加了制备成本，还难以保证产物的均一性，偶联的化学基团与抗体的抗原识别区往往还容易产生空间位阻效应，有时对机体还具有毒副作用，这些因素都影响抗体偶联复合物实际的抗瘤效果。

小分子抗体片段的另外一个应用方面是双特异抗体。双特异性抗体(BsAbs)就是可以识别两个不同表位的抗体。相比正常抗体，BsAbs 在癌症治疗中有一些无法比拟的优势：1.BsAbs可增强特异性免疫细胞对肿瘤细胞杀伤作用。2.BsAbs可以同时作用于两种不同的通路，发挥独特或加倍的抗肿瘤作用。3.BsAbs可识别靶细胞表面两个抗原表位，增强结合能力。

发明内容

基于现有技术存在的问题，本发明的目的是研发出一种具有双重识别功能的特异性单链抗体，进而提供一种介于上述两种新型抗体药物之间的具有增强了的抗肿瘤作用的双特异抗体。

基于上述发明目的，本发明首先提供了一种抗酪氨酸激酶受体的单链抗体，所述抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2和3所示，所述抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3 区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、6和7所示。

在一个优选的技术方案中，所述抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4和8所示。

在一个更为优选的技术方案中，所述抗体的轻链可变区和重链可变区通过连接多肽相连。作为优选,所述连接多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

其次，本发明还提供了另一种抗CD3E的单链抗体。所述抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10、11 和12所示，所述抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.14、15和16所示。

在一个优选的技术方案中，所述抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13和17所示。

在一个更为优选的技术方案中，所述抗体的轻链可变区和重链可变区通过连接多肽相连，作为优选,所述连接多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。

在一个最为优选的技术方案中，所述双特异单链抗体的连接顺序为抗跨膜酪氨酸激酶受体单链抗体的重链可变区和轻链可变区连接抗 CD3E单链抗体的轻链可变区和重链可变区。

本发明还提供含有抗跨膜酪氨酸激酶受体和CD3E单链抗体的融合蛋白。作为优选，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示。

本发明将两种特异性的单链抗体用分子生物学技术串联在一起，利用其抗酪氨酸激酶受体一端识别肿瘤细胞，另一端利用抗CD3E单链抗体识别并活化T淋巴细胞，从而达到清除肿瘤细胞的作用。

最后，本发明提供了上述融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用，作为优选，所述抗肿瘤药物为治疗肺癌、胰腺癌的药物。

本发明选取具有确定性肿瘤组织表面标记酪氨酸激酶受体蛋白 EpHA2和具有确定性T淋巴细胞激活作用的CD3E入手，利用噬菌体抗体库方法筛选高亲和力抗EpHA2和CD3E的ScFv，然后利用连接短肽 linker将两种单链抗体串联起来，构建成双特异抗体。

本发明独特的发明构思在于将两种单链抗体串联成双特异识别抗体，不仅能拓宽了抗肿瘤方式，而且还具有增强了的抗肿瘤作用。在结合试验中，两种单链抗体均与各自的蛋白具有较高水平的亲和力，而且该双特异抗体对多种肿瘤细胞呈高亲和力结合，但对正常组织细胞的结合稍弱。同时该双特异抗体还可以活化T细胞使其分泌IL2的能力增高。而且由于本发明选用的是抗体小分子片段，该双特异性抗体的分子量小，可以在原核细胞表达系统中表达，大大降低了抗体药物的生产成本。

附图说明

图1.VH和VL PCR产物鉴定图；

图2.载体图谱和重组载体鉴定图；

图3.筛选出的抗EpHA2ScFv与EpHA2蛋白的结合试验；

图4.筛选出的抗CD3E ScFv与CD3蛋白的结合试验；

图5.EpHA2-CD3E双特异抗体聚丙烯酰氨凝胶电泳鉴定图；

图6.EpHA2-CD3E双特异抗体与多种肿瘤细胞系的结合；

图7.EpHA2-CD3E双特异抗体活化T淋巴细胞后IL2分泌增高；

图8.EpHA2-CD3E双特异抗体能明显增强T淋巴细胞对肿瘤细胞的非特异性杀伤。

具体实施方式

本发明公开了一种跨膜酪氨酸激酶受体和CD3E链的双特异单链抗体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1抗EpHA2和抗CD3E双特异抗体的制备

1.1高库容量天然抗体库的建立。

分离人外周血单个核淋巴细胞：随机选取100个健康成年人，抽取每人外周血10ml。用含10％肝素的RPMI-1640培养液1:1稀释，加到装有淋巴细胞分离液的离心管(稀释静脉血与淋巴细胞分离液的体积比为2:1)中，2,000×g，离心17分钟。吸取淋巴细胞分离液界面乳白色单个核细胞层，PBS缓冲液洗两次。

1.2细胞总RNA的提取

按每5×10⁶cells/ml的比例加入Trizol试剂，吹打细胞使之裂解。室温孵育5min，移入经DEPC处理的EP管中，加入1/5体积的氯仿，剧烈振荡15sec，室温孵育3min。4℃，10,000×g离心15min，吸取上层水相至一个新的离心管中，加入1/2体积的异丙醇，冰浴10min。4℃，12,000×g离心10min，弃上清，加入1ml 75％乙醇清洗沉淀。4℃，7,500×g离心5min，弃上清，室温干燥沉淀，溶于无RNase 的水或沉淀于无水乙醇内，-80℃保存备用。

1.3逆转录合成cDNA第一链

先用无RNase的DNaseⅠ处理总RNA以消除残存的基因组DNA。取处理过的RNA样品2μg和Oligo(dT)15(500μg/ml)1μl，补加 DEPC水至12μl，70℃，加热10min。取出后马上置于冰浴中，依次加入5×Buffer 5μl；dNTP(10mmol/L)5μl；RNA酶抑制剂1μl,MMLV 逆转录酶1μl,补加DEPC水至25μl，42℃，保温60min进行逆转录反应，70℃，15min灭活酶活性。

1.4PCR扩增VH和VL基因

以逆转录合成cDNA第一链为模板，采用人ScFv抗体库引物扩增所表达的VH和VL基因。反应体系如下：

cDNA第一链产物1μl

引物1(正向)1μl

引物2(反向)1μl

10×buffer 5μl

10mmol/L dNTP 1μl

Pyrobest高保真酶0.5μl

加去离子水至终体积为50μl。

PCR参数：94℃变性3min后，再以94℃30sec；61℃30sec； 72℃1min，进行PCR，共30个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后取5μl反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析。

PCR产物回收

(1)PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，从琼脂糖凝胶上切下目的DNA片段，放入1.5ml离心管中。

(2)加入400μl溶胶液A，70℃溶解5分钟，至凝胶全部溶解。

(3)加入200μl溶胶液B，混均后将全部液体吸入回收柱中。

(4)12,000×g离心1分钟，弃废液。

(5)加入500μl中和液，12,000×g离心1分钟，弃废液。

(6)加入700μl洗涤液，12,000×g离心1分钟，弃废液。

重复步骤6)1次。

(7)12,000×g离心2分钟，弃废液，将回收柱移入新的接收管上，室温干燥5分钟。

(8)加入30μl去离子水，12,000×g离心1分钟，洗脱DNA片段，于-20℃保存备用。

1.5搭桥PCR法进行VH和VL的拼接

将制备的VH和VL片段作为模板，进行VH和VL片段的串联。

PCR反应体系：

10×PCR反应缓冲液	5μl
		dNTP(2.5mM)	2μl
VH PCR产物	1μl
		VL PCR产物	1μl
RSC-F	1μl
		RSC-B	1μl
Pfu DNA聚合酶	1μl
		ddH2O	39μl
Total	50μl

PCR反应条件为94℃预变性5分钟，然后按如下参数进行30个循环：94℃变性30秒，60℃退火45秒，72℃延伸1分钟半，最后72℃延伸10分钟。重复胶回收步骤，PCR产物溶于30μl ddH2O中。图1 为VH和VL PCR产物鉴定图，其中泳道1VL，泳道2VH，泳道3VH+VL 串联体。

1.6连接到噬菌体载体上，

Sfi1酶切载体和PCR产物

10×酶切反应缓冲液	6μl
		PCR产物(或载体)	15μl
Sfi I	6μl
		ddH<sub>2</sub>O	33μl
合计	60μl

37℃酶切2小时，用相同的方法回收酶切片段。

连接反应

10×连接反应缓冲液	1μl
		酶切后PCR产物	7μl
酶切后的载体	1μl
		T4DNA连接酶	1μl
合计	10μl

上述反应物充分混匀并离心使其沉于管底后，4℃连接过夜。酶切后的片段与pComb3XSS载体片段连接，构建成重组质粒。图2为重组载体电泳鉴定图。其中，1为重组体片段pComb3XSS载体酶切图谱， 2为分子量标记。

1.7转化和表达

将构建好的载体(质粒)转化(电转)到大肠杆菌内(特定的大肠杆菌)，扩增大肠杆菌并加辅助噬菌体，收集重组后的噬菌体就是噬菌体抗体库。

经检测百人天然ScFv抗体库的库容量为2*10¹⁰，完全满足抗体筛选的需要。

1.8EpHA2和CD3E抗体的筛选

从抗体库中取出10ul在大肠杆菌中扩增，收集扩增后的抗体库， EpHA2和CD3E蛋白分别包被ELISA板后加入抗体库，孵育后冲洗非特异噬菌体，消化特异结合噬菌体，富集后将消化的噬菌体感染大肠杆菌涂板，挑取单克隆菌团并小量诱导，小量诱导后的单克隆菌上清做 ELISA筛选阳性克隆，经过多次验证，选取亲和力和特异性都高(亲和力达到10^-8-10^-9KD)的阳性克隆进行抗体表达。图3为筛选出的 EpHA2ScFv与EpHA2蛋白的结合试验。图4为筛选出的CD3E ScFv与 CD3E蛋白的结合试验。其中OD值最高的抗EpHA2ScFv 11号克隆和抗CD3E ScFv 8号克隆是本发明要保护的序列。

将阳性克隆中的质粒提取并转化到其他表达菌，或将抗体基因连接到其他载体再转化到相应表达菌中，筛选最佳表达条件进行大量诱导表达，最后选择最佳的纯化方法及缓冲液，获得抗体蛋白。图5为表达的抗EpHA2ScFv、抗CD3E ScFv、EpHA2-CD3E双特异ScFv的聚丙烯酰氨凝胶电泳鉴定图。泳道1为抗EpHA2ScFv，泳道2为抗CD3E ScFv，泳道3为空白孔，泳道4为纯化后EpHA2-CD3E双特异ScFv (10ug/ml)，泳道5为EpHA2-CD3E双特异ScFv。EpHA2-CD3E双特异 ScFv分子量为50KD左右，而抗EpHA2ScFv和抗CD3E ScFv分子量均为30KD。

大肠杆菌DH5α为本室保存，基因型为：supE44ΔlacU169 hsdR17 recA1 end1 gyr96 thi-1 relA1,用于质粒的扩增与转化。

大肠杆菌BL21(DE3),基因型为hsdS gal(λcIts857ind1 Sam7 nin5 lacUV5-T7),用于重组蛋白质的表达。

pGEM-T Easy：用于PCR产物的克隆，购自Promega公司。

原核表达质粒载体pET30，pET42，pGEX-4t-1均为本室保存。

实施例2.双特异抗体的纯化

将两种ScFv的序列进行重新基因合成，使其按照抗跨膜酪氨酸激酶受体单链抗体的重链可变区和轻链可变区连接抗CD3E单链抗体的轻链可变区和重链可变区的顺序重新组成新的双特异抗体。

抗酪氨酸激酶受体的单链抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2和3所示，重链的CDR1、CDR2和 CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、6和7所示。其轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4和8所示。连接多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

抗CD3E的单链抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.10、11和12所示，重链的CDR1、CDR2和CDR3 区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.14、15和16所示。其轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13和17所示。所述抗体的轻链可变区和重链可变区通过连接多肽相连,连接多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。

抗跨膜酪氨酸激酶受体和CD3E单链抗体的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.19所示。

以上由北京诺赛生物科技有限公司合成。

挑单菌落接种于5ml LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜。

将上述菌液按1:100的比例接种到一个含有400ml LB(抗生素) 的锥形瓶中，37℃剧烈振荡培养2h。

加入终浓度为1mmol/L IPTG，于37℃诱导表达3-4h。

收集培养液，5,000rpm离心10min，弃上清。PBS洗菌体沉淀。

用PBS按照5ml/g重悬，冰浴下以工作10sec/300W/30次，每次间隔15sec的参数，超声破碎细胞。12,000rpm离心20min，收集上清。

重组蛋白质的纯化

将含有六个组氨酸标记的融合蛋白VEGF ScFv-GH-His6以0.45 μm滤膜过滤，准备过柱。

HisTrap kit亲和柱用Binding Buffer 10ml平衡后，加入已经准备好的待纯化样品。调节流速约为8-10滴/min。

使用Binding Buffer洗柱。

使用6ml Elution Buffer洗脱柱子。分管收集洗脱液。取少量进行SDS-PAGE鉴定，富含目的蛋白的各管于-70℃保存。

实施例3.抗EpHA2 ScFv对不同肿瘤细胞的结合

基本步骤与ELISA常规步骤一致。

包被：将生长状态良好的A549，Hela，Panc-1，U87细胞调成浓度为4×106cells/mL的细胞悬液，在96孔细胞培养板中，每孔100 μL，设置三个复孔及没有细胞的空白对照，37℃5％CO2培养待细胞贴壁；弃培养基，加入1％戊二醛固定液，室温作用1小时固定；

封闭：用5％脱脂奶粉封闭液封闭，4℃过夜；

一抗：抗EpHA2 ScFv或抗EpHA2-CD3E双特异抗体，浓度为10 μg/mL，每孔100μL。同时设置用洗液对照孔，37℃1小时；

二抗：1:10000稀释的辣根过氧化物酶标记的抗His单抗，每孔加入100μL，37℃1小时。

实验结果：

由图6可见，无论是抗EpHA2 ScFv亦或抗EpHA2-CD3E双特异抗体均对肿瘤细胞具有较强的结合特性。而且两种抗体的结合强度相似。对不同的肿瘤细胞来说，肺癌A549细胞和胰腺癌Panc-1细胞的结合力最强。而对大脑胶质瘤U87细胞的结合相对弱。但这两种抗体对正常人成纤维细胞的结合都非常弱，有统计学差异。可见它们可以作为肿瘤特异性识别抗体应用。

实施例4.抗EpHA2-CD3E双特异抗体对人外周血单个核细胞的活化作用

(1)外周血单个核细胞(PBMC)的分离

采集正常人静脉肝素抗凝血，以无血清的1640培养基1:1稀释，加到装有淋巴细胞分离液的离心管(稀释静脉血与淋巴细胞分离液的体积比为2:1)中，2000rpm，离心20分钟。吸取淋巴细胞分离液界面乳白色单核细胞层，洗涤三次，用含10％FCS的RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×10⁶cells/mL，备用。

(2)CD3⁺T细胞的扩增

24孔塑料培养板孔内加入500μL/孔用无血清RPMI-1640培养液配置的浓度为1μg/mL的抗EpHA2-CD3E双特异抗体和对照抗体OKT3 进行包被，37℃孵育2小时。弃包被液，将重悬好的细胞加到包被有抗体的24孔培养板中，1mL/孔，设置没有包被抗体的空白对照孔。37℃，5％CO2环境培养，48h后，取出培养上清，用人IL-2 ELISA 试剂盒检测上清中IL-2的分泌情况。

结果见图7。使用商品化OKT3抗体活化T淋巴细胞后，上清中的 IL2含量达到400pg/ml，本发明保护的双特异抗体活化T细胞后，上清中的IL2也有370pg/ml。结果不分伯仲。无CD3活化抗体包被孔的上清中IL2含量仅有35pg/ml。可以看出本发明的双特异抗体可以活化CD3+T细胞，使其分泌IL2。

实施例5.抗EpHA2-CD3E双特异抗体体外活化CD3⁺T细胞对 Panc-1细胞的细胞毒活性实验

(1)PBMC中CD3+T细胞的扩增培养。

采集正常人静脉肝素抗凝血，以无血清的1640培养基1:1稀释，加到装有淋巴细胞分离液的离心管(稀释静脉血与淋巴细胞分离液的体积比为2:1)中，2000rpm，离心20分钟。吸取淋巴细胞分离液界面乳白色单核细胞层，洗涤三次，用含10％FCS的RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×10⁶cells/mL，备用。

(2)CD3+T细胞的扩增

24孔塑料培养板孔内加入500μL/孔用无血清RPMI-1640培养液配置的浓度为1μg/mL的抗EpHA2-CD3E双特异抗体的进行包被，37℃孵育2小时。弃包被液，将重悬好的细胞加到包被有抗体的24孔培养板中，1mL/孔，加入IL-2，使其终浓度为200U/mL，设置没有包被抗体的空白对照孔。37℃，5％CO2环境培养，根据细胞生长状态每1～3 天换液或分孔，补加IL-2至相应浓度。两周以后收集细胞。

(3)细胞毒活性试验

靶细胞制备：将传代培养的Panc-1细胞消化收集，用RPMI-1640 培养液洗涤两次后，重悬于RPMI-1640培养液(5％FCS)中，调整细胞浓度为1×10⁵cells/mL，100μL/孔，加入96孔板。

效应细胞制备：CD3⁺T细胞在进行杀伤实验前，先静息24小时，然后将培养的CD3⁺T细胞洗涤后重悬于RPMI-1640培养液(含5％FCS)，调整细胞浓度，使效靶比分别为5:1、10:1将各组效应细胞分别加入各靶细胞孔内，每组3个平行孔。此外，设只加靶细胞或效应细胞的对照孔。

MTT法检测杀伤活性：将混和后的反应体系置于37℃，5％CO₂培养8小时后，每孔吸去100μL上清，加入10μL MTT，继续孵育。8 小时后，每孔加入150μL MTT溶解液，震荡10分钟，于测定波长570 nm，参考波长630nm处测定OD值，并按下列公式计算杀伤活性。

结果由图8所示，抗EpHA2-CD3E双特异抗体活化后的T淋巴细胞在校靶比为5:1时对Panc-1细胞的杀伤效率为20％，在校靶比为 10:1时对Panc-1的杀伤效率为30％。对照抗体OKT3活化后的T淋巴细胞在校靶比为5:1时对Panc-1细胞的杀伤效率为18％，在校靶比为10:1时对Panc-1的杀伤效率为26％。可以看出由抗EpHA2 ScFv和抗 CD3E ScFv组成的双特异抗体的杀伤肿瘤效果要好于单纯的CD3活化抗体。由于本试验是将混合的CD3+T细胞作为效应细胞去杀伤肿瘤细胞，而且T细胞的杀伤都是具有个体特异性的，所以这个试验并不能真正反映机体在这种双特异抗体刺激下对肿瘤的杀伤作用，但是本试验的确是反应出该双特异抗体具有抗肿瘤的效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

。

序列表

<110> 瑞菲特（北京）生物科技有限公司

<120> 抗EPHA2单链抗体、抗CD3E单链抗体及融合蛋白及其应用

<130> PT20171112

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> Artifial

<400> 1

Gln Gly Ile Ser Ser Ala

1 5

<210> 2

<211> 3

<212> PRT

<213> Artifial

<400> 2

Asp Ala Ser

1

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Artifial

<400> 3

Gln Gln Phe Asn Asn Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 4

<211> 95

<212> PRT

<213> Artifial

<400> 4

Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg

1 5 10 15

Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

20 25 30

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp

35 40 45

Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp

65 70 75 80

Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Asn Tyr Pro Leu Thr

85 90 95

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> Artifial

<400> 5

Gly Ala Ser Ile Ser Asp Arg Asn Trp

1 5

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> Artifial

<400> 6

Ile Phe Pro Thr Gly Ala Thr

1 5

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> Artifial

<400> 7

Ala Arg Glu Lys Pro Phe Thr Tyr Gly Ala Ile Asp Tyr

1 5 10

<210> 8

<211> 108

<212> PRT

<213> Artifial

<400> 8

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr

1 5 10 15

Leu Ser Leu Thr Cys Gly Val Ser Gly Ala Ser Ile Ser Asp Arg Asn

20 25 30

Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Phe Pro Thr Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Ile Thr Ile Ser Leu Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Ser Ile Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Glu Lys Pro Phe Thr Tyr Gly Ala Ile Asp Tyr

100 105

<210> 9

<211> 18

<212> PRT

<213> Artifial

<400> 9

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Gly Gly Ser Ser Arg Ser

1 5 10 15

Ser Glu

<210> 10

<211> 6

<212> PRT

<213> Artifial

<400> 10

Gln Ser Val Asn Asp Arg

1 5

<210> 11

<211> 3

<212> PRT

<213> Artifial

<400> 11

Gly Ala Ser

1

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> Artifial

<400> 12

Gln His Tyr Asn Ser Phe Thr

1 5

<210> 13

<211> 93

<212> PRT

<213> Artifial

<400> 13

Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg

1 5 10 15

Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Asp Arg Leu Ala

20 25 30

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly

35 40 45

Ala Ser Thr Leu Ala Ser Ala Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Ala

50 55 60

Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro Asp Asp

65 70 75 80

Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asn Ser Phe Thr

85 90

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> Artifial

<400> 14

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly

1 5

<210> 15

<211> 8

<212> PRT

<213> Artifial

<400> 15

Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys

1 5

<210> 16

<211> 15

<212> PRT

<213> Artifial

<400> 16

Ala Arg Val Arg Leu Val Ala Thr Ile Arg Gly Pro Phe Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 17

<211> 111

<212> PRT

<213> Artifial

<400> 17

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Arg Leu Val Ala Thr Ile Arg Gly Pro Phe Asp Tyr

100 105 110

<210> 18

<211> 17

<212> PRT

<213> Artifial

<400> 18

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Ser Ser Arg Ser

1 5 10 15

Ser

<210> 19

<211> 506

<212> PRT

<213> Artifial

<400> 19

Glu Leu Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Asn Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Gly Gly Ser Ser Arg

100 105 110

Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro

115 120 125

Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Gly Val Ser Gly Ala Ser Ile Ser

130 135 140

Asp Arg Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu

145 150 155 160

Gln Trp Ile Gly Glu Ile Phe Pro Thr Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro

165 170 175

Ser Leu Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Leu Asp Lys Ser Lys Asn Gln

180 185 190

Phe Ser Leu Ser Ile Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr

195 200 205

Tyr Cys Ala Arg Glu Lys Pro Phe Thr Tyr Gly Ala Ile Asp Tyr Trp

210 215 220

Gly His Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Gln Ser Pro

225 230 235 240

Ser Asp Thr Ser Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly

245 250 255

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Leu Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr

260 265 270

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

275 280 285

Gln Ser Val Asn Asp Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

290 295 300

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Ala Val

305 310 315 320

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Ala Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr

325 330 335

Ile Thr Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His

340 345 350

Tyr Asn Ser Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly

355 360 365

Gly Ser Ser Arg Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly

370 375 380

Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

385 390 395 400

Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

405 410 415

Lys Gly Pro Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys

420 425 430

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

435 440 445

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

450 455 460

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Arg Leu Val Ala Thr Ile Arg

465 470 475 480

Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Pro

485 490 495

Ala Ser Thr Gln Ser Pro Ser Val Thr Ser

500 505

Claims (10)

1.一种抗跨膜酪氨酸激酶受体的单链抗体，其特征在于，所述抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2和3所示，所述抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、6和7所示。

2.根据权利要求1所述的单链抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4和8所示。

3.根据权利要求2所述的单链抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区和重链可变区通过连接多肽相连,作为优选,所述连接多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

4.一种抗CD3E的单链抗体，其特征在于，所述抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10、11和12所示，所述抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.14、15和16所示。

5.根据权利要求4所述的单链抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13和17所示。

6.根据权利要求4或5所述的单链抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区和重链可变区通过连接多肽相连,作为优选,所述连接多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。

7.一种含有权利要求1和4所述单链抗体的融合蛋白。

8.根据权利要求7所述的融合蛋白，其特征在于，所述氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示。

9.根据权利要求1-6任一述所述单链抗体、权利要求7-8任一项所述融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为治疗肺癌、胰腺癌的药物。