CN101848998A - 抗epha2抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的是：能够抑制细胞癌变和/或肿瘤细胞增殖等的抗体。本发明具体公开的是：识别由产生自杂交瘤SH348-1(FERMBP-10836)或杂交瘤SH357-1(FERM BP-10837)的抗体识别的表位的抗体、产生自杂交瘤SH348-1或杂交瘤SH357-1的抗体、通过人源化产生自杂交瘤SH348-1或杂交瘤SH357-1的抗体而得到的抗体以及包含作为有效成分的上述抗体的药物等。

Description

抗EPHA2抗体
技术领域
本发明涉及具有抑制细胞恶性转化和/或肿瘤细胞生长的活性的抗体。更具体地说，本发明涉及针对EPHA2的抗体以及包含所述抗体的药物组合物。
技术背景
EPHA2是一种受体酪氨酸激酶，其分子量为130kDa并且具有单个跨膜结构域(Molecular and Cellular Biology，1990，第10卷，第6316-6324页)。EPHA2在其N端胞外区存在一个配体结合域和两个纤连蛋白III型结构域，而在其C端胞内区存在一个酪氨酸激酶结构域和一个sterile-α-motif(SAM)结构域。
GPI锚定的质膜蛋白ephrin-A1至ephrin-A5已知为EPHA2配体(Annual Review of Neuroscience，1998，第21卷，第309-345页)。所述配体与EPHA2结合激活酪氨酸激酶结构域并使存在于EPHA2胞内区的酪氨酸残基磷酸化，从而引起细胞内的信号转导。还有文献报道与所述配体结合的EPHA2通过内吞作用进入细胞并最终被蛋白酶体降解(Molecular Cancer Research，2002，第1卷，第79-87页)。
已在临床上报道EPHA2在许多癌症中高表达，特别是以下癌症：乳腺癌、食道癌、前列腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、结肠癌和多形性成胶质细胞瘤(Cancer Research，2001，第61卷，第2301-2306页；International Journal of Cancer，2003，第103卷，第657-663页；The Prostate，1999，第41卷，第275-280页；AmericanJournal of Pathology，2003，第163卷，第2271-2276页；CancerScience，2005，第96卷，第42-47页；Clinical Cancer Research，2003，第9卷，第613-618页；Oncology Reports，2004，第11卷，第605-611页和Molecular Cancer Research，2005，第3卷，第541-551页)。还有文献报道：对于食道癌而言，EPHA2表达阳性的患者容易表现高频率的局部淋巴结转移、大量的淋巴结转移、低程度的肿瘤分化和五年存活率低(International Journal of Cancer，2003，第103卷，第657-663页)；对于非小细胞肺癌而言，高度表达EPHA2的患者倾向于无病存活率低和复发，特别是脑转移(Clinical Cancer Research，2003，第9卷，第613-618页)；而对于结肠癌而言，EPHA2表达阳性的患者容易发生肝转移、淋巴管侵袭和淋巴结转移，并且许多临床后期患者为EPHA2表达阳性的患者(Oncology Reports，2004，第11卷，第605-611页)。
此外，有文献报道将EPHA2基因引入细胞后，非癌细胞获得了癌细胞的表型(例如不依赖贴壁生长的能力、胞外基质上形成管状形态的能力以及体内肿瘤生长的能力(Cancer Research，2001，第61卷，第2301-2306页))，并且癌细胞通过细胞外基质的侵袭性增强(Biochemical and Biophysical Research Communications，2004，第320卷，第1096-1102页和Oncogene，2004，第23卷，第1448-1456页)。此外，有文献报道：通过用siRNA敲低(knockdown)EPHA2的表达来抑制肿瘤细胞的侵袭性、不依赖贴壁的生长和体内肿瘤的生长(Oncogene，2004，第23卷，第1448-1456页和Cancer Research，2002，第62卷，第2840-2847页)；以及通过使用EPHA2的配体ephrin-A1和人IgG Fc区的融合蛋白激活EPHA2并经由内吞作用诱导EPHA2降解，来抑制肿瘤细胞的侵袭性、不依赖贴壁的生长和形成管状形态的能力(Cancer Research，2001，第61卷，第2301-2306页；Molecular Cancer Research，2005，第3卷，第541-551页和Biochemical and Biophysical Research Communications，2004，第320卷，第1096-1102页)。
另一方面，据报道，EPHA2不仅在癌细胞中表达，也在肿瘤及其周围的血管中表达(Oncogene，2000，第19卷，第6043-6052页)。据报道，在小鼠中，EPHA2信号涉及由ephrin-A1诱导的血管生成，并且特别地，血管内皮细胞中表达的EPHA2对血管生成或血管内皮细胞的存活是必需的(Journal of Cell Science，2004，第117卷，第2037-2049页)。还有文献报道，EPHA2胞外区与人IgGFc区的融合蛋白在体内抑制血管生成并表现出抗肿瘤作用(Oncogene，2002，第21卷，第7011-7026页)。
单克隆抗体不仅可用作诊断药物也可用作治疗药物。特别地，单克隆抗体被广泛地用于癌症治疗领域，而且针对受体酪氨酸激酶(例如HER2和EGFR)或针对CD20胞外区的单克隆抗体被用于癌症治疗并表现出极佳的效果(The New England Journal of Medicine，2007，第357卷，第39-51页；Oncogene，2007，第26卷，第3661-3678页和Oncogene，2007，第26卷，第3603-3613页)。单克隆抗体在用于癌症治疗中的作用机制包括诱导凋亡和生长信号的抑制。此外，其免疫应答介导的作用(例如ADCC或CDC)也被认为起非常重要的作用。实际上，已有文献报道，当向FcγR(FcγR对于诱导ADCC是必需的)缺陷的裸鼠和非FcγR缺陷的裸鼠给予抗HER2抗体(曲妥珠单抗(trastuzumab))或抗CD20抗体(利妥昔单抗(rituximab))时，这两种抗体在前一种小鼠的异种移植物中比在后一种小鼠中表现出的抗肿瘤效果弱得多(Nature Medicine，2000，第6卷，第443-446页)。还有文献报道，当向补体缺失的小鼠(通过给予眼镜蛇毒(cobra venom))和非补体缺失的小鼠给予抗CD20抗体利妥昔单抗时，所述抗体在前一种小鼠比后一种中表现出更弱的抗肿瘤效果(Blood，2004，第103卷，第2738-2743页)。
据报道，对于EPHA2，拮抗性抗EPHA2单克隆抗体具有诱导EPHA2酪氨酸残基磷酸化活性和诱导EPHA2降解活性，对于其配体而言，所述抗体抑制了乳腺癌细胞系的不依赖贴壁的生长及其在胞外基质上管状形态的形成(Cancer Research，2002，第62卷，第2840-2847页)。还有文献报道，拮抗性抗EPHA2单克隆抗体在体内表现出抗肿瘤效果，所述单克隆抗体识别癌细胞而不是非癌细胞上展示的EPHA2上的表位并且具有诱导EPHA2酪氨酸残基磷酸化活性和诱导EPHA2降解活性(Cancer Research，2003，第63卷，第7907-7912页和WO 03/094859扉页)。另一方面，Kiewlich等报道其抗EPHA2单克隆抗体具有诱导EPHA2酪氨酸残基磷酸化活性和诱导EPHA2降解活性，但并不表现出体内抗肿瘤效果(Neoplasia，2006，第8卷，第18-30页)。
此外，WO 2006/084226扉页公开了通过用癌细胞免疫接种小鼠得到的抗EPHA2单克隆抗体LUCA19、SG5、LUCA40和SPL1，并公开在用毒素(皂草毒蛋白)标记的抗小鼠抗体存在下，在上述这些抗体，LUCA19和SG5不影响EPHA2酪氨酸残基的磷酸化；LUCA40抑制癌细胞体外生长；而LUCA19、SG5和LUCA40被内化到癌细胞内。该文件还报道LUCA40和SPL1在体内表现出抗肿瘤效果。然而，这些抗体的拮抗活性是否存在仍待阐明。
尽管有以上研究，但对应于在体内表现出抗肿瘤效果的抗EPHA2抗体的表位仍未知。现有文件无一报道EPHA2胞外区中的特定氨基酸序列可用作适用于癌症治疗的单克隆抗体所针对的表位。
即使针对相同抗原的抗体在其性质上也会有所不同，视表位或其序列的差异而定。此外，由于它们性质上的所述差异，所述抗体当给予人时根据以下方面以不同的方式诱导临床反应：药物有效性、治疗反应的频率、副作用和耐药性的出现频率等。
因此，在临床上具有最佳性质的药物也可能因患者而不同。在很多情况下，所述性质在实际给药前是未知的。因此，强烈需要开发具有新型作用机制的药物。还强烈需要开发与常规抗体性质不同的针对EPHA2的抗体。
发明公开
待本发明解决的问题
本发明的目标是提供针对EPHA2的抗体。
本发明的另外目标是提供包含对癌症有治疗作用的抗EPHA2抗体的药物组合物等。
本发明的另外目标是提供用于制备所述抗体的方法。
本发明的另外目标是提供利用所述抗体用于抑制肿瘤生长的方法等等。
解决问题的手段
本发明进行努力研究以达到所述目标，由此成功地获得新型抗EPHA2单克隆抗体，所述抗体无诱导EPHA2酪氨酸残基磷酸化活性，但具有针对表达EPHA2的癌细胞的ADCC活性和CDC活性。此外，本发明人分析了上述抗体所针对的表位，从而首次发现了一种抗体具有体内良好抗肿瘤活性，所述抗体结合包含EPHA2中存在的两个纤连蛋白III型结构域的C端结构域的区域。本发明基于这些结果得以完成。
具体而言，本发明包括：
(1)一种抗体，所述抗体识别产生自杂交瘤SH348-1(FERMBP-10836)的抗体所识别的表位；
(2)第(1)项的抗体，其中所述抗体具有以下a)-d)的性质：
a)不具有磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力；
b)具有针对表达EPHA2的细胞的ADCC活性；
c)具有针对表达EPHA2的细胞的CDC活性；和
d)具有体内抗肿瘤活性；
(3)第(1)项的抗体，其中所述抗体具有以下a)-e)的性质：
a)不具有磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力；
b)表现出降低EPHA2蛋白水平的作用；
c)具有针对表达EPHA2的细胞的ADCC活性；
d)具有针对表达EPHA2的细胞的CDC活性；和
e)具有体内抗肿瘤活性；
(4)一种抗体，所述抗体特异性结合由序列表中SEQ ID NO：8的第426-534位氨基酸所表示的氨基酸序列组成的多肽；
(5)一种抗体，所述抗体特异性结合由序列表中SEQ ID NO：8的第426-534位氨基酸所表示的氨基酸序列组成的多肽并且具有以下a)-d)的性质：
a)不具有磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力；
b)具有针对表达EPHA2的细胞的ADCC活性；
c)具有针对表达EPHA2的细胞的CDC活性；和
d)具有体内抗肿瘤活性；
(6)一种抗体，所述抗体特异性结合由序列表中SEQ ID NO：8的第426-534位氨基酸表示的氨基酸序列组成的肽并且具有以下a)-e)的性质：
a)不具有磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力；
b)表现出降低EPHA2蛋白水平的作用；
c)具有针对表达EPHA2的细胞的ADCC活性；
d)具有针对表达EPHA2的细胞的CDC活性；和
e)具有体内抗肿瘤活性；
(7)第(1)-(6)项中任一项的抗体，其中所述抗体特异性结合由序列表中SEQ ID NO：8的第439-534位氨基酸所表示的氨基酸序列组成的肽；
(8)第(1)-(7)项中任一项的抗体，其中所述抗体抑制由EPHA2配体诱导的EPHA2酪氨酸残基的磷酸化；
(9)第(1)-(7)项中任一项的抗体，其中所述抗体不抑制EPHA2配体结合EPHA2但抑制由所述配体诱导的EPHA2酪氨酸残基的磷酸化；
(10)一种抗体，所述抗体特异性结合由序列表中SEQ ID NO：8所表示的氨基酸序列组成的多肽，其中所述抗体具有作为重链可变区中的互补决定区的以下氨基酸序列：由序列表中SEQ ID NO：59、61和63表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列，并且具有作为轻链可变区中的互补决定区的以下氨基酸序列：由序列表中SEQ ID NO：65、67和69表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；
(11)一种特异性结合由序列表中SEQ ID NO：8所表示的氨基酸序列组成的多肽的抗体，所述抗体表征在于以下1)和2)：
1)具有包含由通式(I)表示的氨基酸序列的重链肽：
-FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4-(I)
其中，FRH1表示由18-30个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRH1表示由序列表中SEQ ID NO：59表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；FRH2表示由14个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRH2表示由序列表中SEQ ID NO：61表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；FRH3表示由32个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRH3表示由序列表中SEQ ID NO：63表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；而FRH4表示由11个氨基酸组成的任意氨基酸序列，其中这些氨基酸彼此通过肽键连接；和
2)具有包含由通式(II)表示的氨基酸序列的轻链多肽：
-FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4-(II)
其中，FRL1表示由23个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRL1表示由序列表中SEQ ID NO：65表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；FRL2表示由15个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRL2表示由序列表中SEQ ID NO：67表示的氨基酸序列；FRL3表示由32个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRL3表示由序列表中SEQ ID NO：69表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；而FRL4表示由10个氨基酸组成的任意氨基酸序列；其中这些氨基酸彼此通过肽键连接；
(12)一种抗体，所述抗体识别由产生自杂交瘤SH357-1(FERMBP-10837)的抗体识别的表位；
(13)第(12)项的抗体，其中所述抗体具有以下a)-d)的性质：
a)不具有磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力；
b)具有针对表达EPHA2的细胞的ADCC活性；
c)具有针对表达EPHA2的细胞的CDC活性；和
d)具有体内抗肿瘤活性；
(14)一种抗体，所述抗体特异性结合由序列表中SEQ ID NO：8的第426-534位氨基酸所表示的氨基酸序列组成的肽并且具有以下a)-e)的性质：
a)不具有磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力；
b)不表现出降低EPHA2蛋白水平的作用；
c)具有针对表达EPHA2的细胞的ADCC活性；
d)具有针对表达EPHA2的细胞的CDC活性；和
e)具有体内抗肿瘤活性；
(15)第(12)-(14)项中任一项的抗体，其中所述抗体特异性结合由序列表中SEQ ID NO：8的第439-534位氨基酸所表示的氨基酸序列组成的肽；
(16)第(12)-(15)项中任一项的抗体，其中所述抗体抑制由EPHA2配体诱导的EPHA2酪氨酸残基的磷酸化；
(17)第(12)-(15)项中任一项的抗体，其中所述抗体不抑制EPHA2配体结合EPHA2但抑制由所述配体诱导的EPHA2酪氨酸残基的磷酸化；
(18)一种抗体，所述抗体特异性结合由序列表中SEQ ID NO：8所表示的氨基酸序列组成的多肽，其中所述抗体具有作为重链可变区中的互补决定区的以下氨基酸序列：由序列表中SEQ ID NO：71、73和75表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列，并且具有作为轻链可变区中的互补决定区的以下氨基酸序列：由序列表中SEQ ID NO：77、79和81表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；
(19)一种抗体，所述抗体特异性结合由序列表中SEQ ID NO：8所表示的氨基酸序列组成的多肽，所述抗体特征在于以下1)和2)：
1)具有包含由通式(I)表示的氨基酸序列的重链肽：
-FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4-(I)
其中，FRH1表示由18-30个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRH1表示由序列表中SEQ ID NO：71表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；FRH2表示由14个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRH2表示由序列表中SEQ ID NO：73表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；FRH3表示由32个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRH3表示由序列表中SEQ ID NO：75表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；而FRH4表示由11个氨基酸组成的任意氨基酸序列，其中这些氨基酸彼此通过肽键连接；和
2)具有包含由通式(II)表示的氨基酸序列的轻链多肽：
-FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4-(II)
其中，FRL1表示由23个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRL1表示由序列表中SEQ ID NO：77表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；FRL2表示由15个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRL2表示由序列表中SEQ ID NO：79表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；FRL3表示由32个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRL3表示由序列表中SEQ ID NO：81表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；而FRL4表示由10个氨基酸组成的任意氨基酸序列；其中这些氨基酸彼此通过肽键连接。
(20)第(1)-(19)项中任一项的抗体，其特征在于所述抗体为人源化抗体；
(21)第(1)-(19)项中任一项的抗体，其特征在于所述抗体为人抗体；
(22)第(1)-(19)项中任一项的抗体，其特征在于所述抗体为IgG抗体；
(23)第(1)-(9)和(12)-(17)项中任一项的抗体，其特征在于所述抗体为选自以下的任何抗体：Fab、F(ab′)2、Fv、scFv、双抗体、线性抗体和多特异性抗体；
(24)一种抗体，所述抗体产生自杂交瘤SH348-1(FERMBP-10836)；
(25)一种抗体，所述抗体产生自杂交瘤SH357-1(FERMBP-10837)；
(26)一种抗体，所述抗体由以下1)和2)组成：
1)包含由序列表中SEQ ID NO：35的第1-119位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多肽，或包含由序列表中SEQ ID NO：39的第1-119位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多肽；和
2)包含由序列表中SEQ ID NO：37的第1-112位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽，或包含由SEQ ID NO：41的第1-112位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽；
(27)一种抗体，所述抗体由以下1)或2)组成：
1)包含由序列表中SEQ ID NO：35的第1-119位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多肽，和包含由序列表中SEQ ID NO：37的第1-112位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽；或
2)包含由序列表中SEQ ID NO：39的第1-119位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多肽，和包含由序列表中SEQ ID NO：41的第1-112位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽；
(28)一种抗体，所述抗体由以下1)和2)组成：
1)包含由序列表中SEQ ID NO：35表示的氨基酸序列的重链多肽，或包含由序列表中SEQ ID NO：39表示的氨基酸序列的重链多肽；和
2)包含由序列表中SEQ ID NO：37表示的氨基酸序列的轻链多肽，或包含由序列表中SEQ ID NO：41表示的氨基酸序列的轻链多肽；
(29)一种抗体，所述抗体由以下1)或2)组成：
1)包含由序列表中SEQ ID NO：35表示的氨基酸序列的重链多肽和包含由序列表中SEQ ID NO：37表示的氨基酸序列的轻链多肽；和
2)包含由序列表中SEQ ID NO：39表示的氨基酸序列的重链多肽和包含由序列表中SEQ ID NO：41表示的氨基酸序列的轻链多肽；
(30)一种抗体，所述抗体通过人源化第(24)-(29)项中任一项的抗体得到；
(31)一种抗体，所述抗体由以下1)和2)组成：
1)包含由序列表中SEQ ID NO：107的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多肽，或包含由序列表中SEQ ID NO：115的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多肽；和
2)包含由序列表中SEQ ID NO：91的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽，或包含由序列表中SEQ ID NO：99的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽；
(32)一种抗体，所述抗体由以下1)或2)组成：
1)包含由序列表中SEQ ID NO：107的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多肽，和包含由序列表中SEQ ID NO：91的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽；和
2)包含由序列表中SEQ ID NO：115的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多肽，和包含由序列表中SEQ ID NO：99的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽；
(33)一种抗体，所述抗体由以下1)和2)组成：
1)包含由序列表中SEQ ID NO：139的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多肽，或包含由序列表中SEQ ID NO：147的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多肽；和
2)包含由序列表中SEQ ID NO：123的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽或包含由序列表中SEQ ID NO：131的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽；
(34)一种抗体，所述抗体由以下1)或2)组成：
1)包含由序列表中SEQ ID NO：139的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多肽，和包含由序列表中SEQ ID NO：123的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽；和
2)包含由序列表中SEQ ID NO：147的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多肽，和包含由序列表中SEQ ID NO：131的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽；
(35)衍生自第(24)-(34)项中任一项的抗体的Fab、F(ab′)2、Fv、scFv、双抗体、线性抗体或多特异性抗体；
(36)选自以下1)-20)中任一种的多肽：
1)包含由序列表中SEQ ID NO：35的第1-119位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
2)包含由序列表中SEQ ID NO：39的第1-119位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
3)包含由序列表中SEQ ID NO：37的第1-112位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
4)包含由序列表中SEQ ID NO：41的第1-112位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
5)包含由序列表中SEQ ID NO：107的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
6)包含由序列表中SEQ ID NO：115的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
7)包含由序列表中SEQ ID NO：107的第20-138位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
8)包含由序列表中SEQ ID NO：115的第20-138位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
9)包含由序列表中SEQ ID NO：91的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
10)包含由序列表中SEQ ID NO：99的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
11)包含由序列表中SEQ ID NO：91的第21-134位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
12)包含由序列表中SEQ ID NO：99的第21-134位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
13)包含由序列表中SEQ ID NO：139的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
14)包含由序列表中SEQ ID NO：147的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
15)包含由序列表中SEQ ID NO：139的第20-138位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
16)包含由序列表中SEQ ID NO：147的第20-138位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
17)包含由序列表中SEQ ID NO：123的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
18)包含由序列表中SEQ ID NO：131的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
19)包含由序列表中SEQ ID NO：123的第21-134位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；和
20)包含由序列表中SEQ ID NO：131的第21-134位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
(37)小鼠杂交瘤SH348-1(FERM BP-10836)；
(38)小鼠杂交瘤SH357-1(FERM BP-10837)；
(39)一种药物组合物，其特征在于包含选自第(1)-(35)项的抗体中的至少一种抗体；
(40)一种用于癌症治疗的药物组合物，其特征在于包含选自第(1)-(35)项的抗体中的至少一种抗体；
(41)一种用于抑制哺乳动物中肿瘤生长的方法，所述方法包括给予选自第(1)-(35)、(39)和(40)项的抗体中的任何抗体；
(42)第(41)项的用于抑制肿瘤生长的方法，所述方法特征在于所述肿瘤为表达EPHA2的肿瘤；
(43)一种多核苷酸，所述多核苷酸编码(1)-(36)中任一项的抗体或多肽；
(44)一种宿主细胞，所述宿主细胞转化了第(43)项的多核苷酸；和
(45)一种使用第(44)项的宿主细胞制备抗体的方法。
本发明的优点
本发明已成功得到新型抗EPHA2的单克隆抗体，所述抗体不具有诱导EPHA2酪氨酸残基磷酸化的活性但具有针对表达EPHA2的癌细胞的ADCC活性和CDC活性。此外，业已发现所述抗体在体内具有良好的抗肿瘤活性。
此外，本发明提供了包含所述抗体的用于癌症治疗的药物组合物。
附图简述
图1为显示蛋白印迹的结果的图，该结果显示存在或不存在抗EPHA2抗体诱导EPHA2酪氨酸残基磷酸化的活性。图1A)为显示在没有交联抗体的情况下得到的结果的图，其中上面的条带显示关于4G10抗体的结果，下面的条带显示关于抗EPHA2抗体(D7)的结果。图1B)是显示在存在交联抗体的情况下得到的结果的图，其中上面的条带显示4G10抗体的结果，下面的条带显示抗EPHA2抗体(D7)的结果；
图2为显示蛋白印迹的结果的图，该结果显示存在或不存在抗EPHA2抗体诱导降低EPHA2蛋白水平的活性。图2A)为显示在没有交联抗体的情况下得到的结果的图，其中上面的条带显示关于抗EPHA2抗体(D7)的结果，下面的条带显示关于抗β肌动蛋白抗体的结果。图2B)为显示在存在交联抗体的情况下得到的结果的图，其中上面的条带显示关于抗EPHA2抗体(D7)的结果，而下面的条带显示关于抗β肌动蛋白抗体的结果；
图3为显示存在或不存在抗EPHA2抗体对各种细胞系的ADCC活性的图。图中“**”表示P＜0.01，“***”表示P＜0.001。图3A)为显示对MDA-MB-231细胞的ADCC活性的图。图3B)为显示对A549细胞的ADCC活性的图。图3C)为显示对PC-3细胞的ADCC活性的图；
图4为显示存在或不存在抗EPHA2抗体对各种细胞的CDC活性的图。图中“***”表示P＜0.001。图4A)为显示SH348-1对MDA-MB-231细胞的CDC活性的图。图4B)为显示SH348-1对A549细胞的CDC活性的图。图4C)为显示SH348-1对PC-3细胞的CDC活性的图。图4D)为显示SH357-1对MDA-MB-231细胞的CDC活性的图。图4E)为显示SH357-1对A549细胞的CDC活性的图。图4F)为显示SH357-1对PC-3细胞的CDC活性的图；
图5A)显示EPHA2结构域的结构预测，和在EPHA2中作为表位确定肽的EPHA2-ECD、FNIII-NC、FNIII-N和FNIII-C的位置。在该图中，配体-BD表示配体结合域，FN3表示纤连蛋白III型结构域，TM表示跨膜区，Trk激酶表示酪氨酸激酶结构域，SAM表示SAM结构域；
图5B)为显示存在或不存在抗EPHA2抗体对EPHA2-ECD、FNIII-NC、FNIII-N和FNIII-C的结合活性的图；
图6A)为显示SH348-1对移植了MDA-MB-231细胞的小鼠的抗肿瘤活性的图；
图6B)为显示SH357-1对移植了MDA-MB-231细胞的小鼠的抗肿瘤活性的图。在图中，误差线表示标准误差(n＝9)；
图7A)为显示SH348-1对EPHA2胞外区多肽的结合活性的图；
图7B)为显示SH357-1对EPHA2胞外区多肽的结合活性的图；
图7C)为显示Ab96-1对EPHA2胞外区多肽的结合活性的图；
图8为显示SH348-1、SH357-1和Ab96-1的配体结合抑制活性的图；
图9为显示SH348-1和SH357-1具有抑制EPHA2酪氨酸残基的ephrin-A1依赖性磷酸化的活性的图；
图10为显示用于表位鉴定的EPHA2缺失突变体的概况的图；
图11A)为显示SH348-1对EPHA2缺失突变体的反应性的图；
图11B)为显示图11A)中的EPHA2缺失突变体在PVDF膜上的检测情况的图；
图11C)为显示SH357-1对EPHA2缺失突变体的反应性的图；
图11D)为显示图11C)中的EPHA2缺失突变体在PVDF膜上的检测情况的图；
图12A)为显示hSH348-1-T1对EPHA2胞外区多肽的结合活性的图；
图12B)为显示hSH348-1-T3对EPHA2胞外区多肽的结合活性的图；
图12C)为显示hSH357-1-T1对EPHA2胞外区多肽的结合活性的图；
图12D)为显示hSH357-1-T3对EPHA2胞外区多肽的结合活性的图；
图13A)为显示hSH348-1-T1和hSH348-1-T3对SH348-1的抗原结合的竞争性抑制活性的图；
图13B)为显示hSH348-1-T1和hSH348-1-T3对SH357-1的抗原结合的竞争性抑制活性的图；
图14A)为显示hSH348-1-T1或hSH348-1-T3对EPHA2酪氨酸残基的ephrin-A1依赖性磷酸化的抑制活性的图；和
图14B)为显示hSH357-1-T1或hSH357-1-T3对EPHA2酪氨酸残基的ephrin-A1依赖性磷酸化的抑制活性的图。
本发明最佳实施方式
1.定义
在本说明书中，所用术语“癌症”和“肿瘤”含义相同。
在本说明书中，术语“基因”意指不仅涵盖DNA，还涵盖其RNA、其cDNA和其cRNA。因此，术语“EPHA2基因”在本发明中涵盖EPHA2的DNA、mRNA、cDNA和cRNA。
在本说明书中，所用术语“多核苷酸”与核酸含义相同并且还涵盖DNA、RNA、探针、寡核苷酸和引物。
在本说明书中，所用术语“多肽”和“蛋白”彼此之间没有差别。
在本说明书中，术语“细胞”还涵盖单个动物的细胞和培养的细胞。
在本说明书中，术语“细胞恶性转化”意指表现出异常生长(例如失去对接触抑制的敏感性)或表现出不依赖贴壁生长的细胞。表现出此类异常生长的细胞被称作“癌细胞”。
在本说明书中，具有与EPHA2的细胞恶性转化活性和/或细胞生长活性等功能相当的蛋白也被称作EPHA2。
在本说明书中，术语“酪氨酸残基的磷酸化”意指肽的氨基酸序列中所含的酪氨酸残基被磷酸化。酪氨酸残基是否被磷酸化可基于例如所述肽与抗磷酸酪氨酸的抗体(例如抗磷酸酪氨酸的重组4G10HRP缀合物(购自Millipore(Upstate)，#16-184))的亲和力来检测。当所述肽与抗体结合时，可确定酪氨酸残基被磷酸化。
在本说明书中，术语“磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力”是指磷酸化EPHA2的氨基酸序列中酪氨酸残基的能力。抗体是否具有磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力可通过例如以下方法检测：将抗体与EPHA2温育并随后检测是否存在EPHA2对抗磷酸酪氨酸抗体的亲和力。
在本说明书中，短语“降低EPHA2蛋白表达水平”意指EPHA2的蛋白水平降低了。抗体是否具有降低EPHA2蛋白水平的作用可通过例如以下方法检测：将抗体与EPHA2温育并随后对EPHA2水平定量。
在本说明书中，术语“EPHA2配体”意指能作为EPHA2配体的物质。其具体实例可包括GPI锚定的质膜蛋白ephrin-A1至ephrin-A5(Annual Review of Neuroscience，1998，第21卷，第309-345页)。
在本说明书中，术语“细胞毒性”是指细胞的任何病理改变，并且不仅指对细胞的直接损伤也指对细胞的任何结构损伤或功能损伤，例如DNA裂解、碱基二聚化作用、染色体断裂、有丝分裂器的损伤及各种酶活性降低。
在本说明书中，术语“细胞毒活性”是指引起细胞毒性的活性。
在本说明书中，ADCC与抗体依赖性细胞毒作用同义，并且是指以下反应：荷有Fcγ受体的细胞经由所述反应借助Fcγ受体附着到与靶细胞表面抗原结合的抗体的Fc部分并杀死靶细胞。ADCC活性也被称作抗体依赖性细胞毒活性并指引起所述反应的活性。ADCC活性可通过本领域的技术人员通常进行的方法来检测，也可根据例如本说明书中实施例3的第3)-2节中所述方法检测。
在本说明书中，术语“CDC”与补体依赖性细胞毒作用同义。CDC活性是指导致补体依赖性细胞毒作用的活性。CDC活性可通过本领域的技术人员通常进行的方法来检测，也可根据例如本说明书中实施例3的第3)-3节中所述方法检测。
在本说明书中，短语“具有体内抗肿瘤活性”意指具有抑制或减轻荷瘤动物个体中肿瘤生长的活性。抗EPHA2抗体是否“具有体内抗肿瘤活性”可通过本领域的技术人员通常进行的方法来检测，也可例如依照以下方法检测：向皮下移植了肿瘤细胞(例如MDA-MB-231细胞)的裸鼠(例如ALB/cAJc1-nu/nu；购自CLEAJapan，Inc.)皮下给予作为试验物质的合适剂量的抗EPHA2抗体，并比较所述裸鼠与未给予抗EPHA2抗体的对照之间肿瘤体积的时间依赖性变化。当所述小鼠的肿瘤体积明显小于对照的肿瘤体积时，作为试验物质的抗EPHA2抗体可被确定为“具有体内抗肿瘤活性”。
业已了解抗体分子的每条重链和轻链具有三个互补决定区(CDR)。在本说明书中，抗体的互补决定区由以下表示：重链的互补决定区由CDRH1、CDRH2和CDRH3表示；而轻链的互补决定区由CDRL1、CDRL2和CDRL3表示。
在本说明书中，术语“表位”意指在动物(优选哺乳动物、更优选小鼠或人)体内具有抗原性和/或免疫原性的EPHA2的部分肽。具有抗原性的EPHA2部分肽的表位可通过本领域的技术人员已知的方法(例如通过免疫检测)来确定，还可例如根据以下制备各种EPHA2的部分结构的方法来确定。对于所述部分结构的制备，可使用本领域已知的寡肽合成技术。例如，利用本领域技术人员熟知的基因重组技术制备从EPHA2的C-或N-端开始的一系列连续缩短的合适长度的多肽。随后研究抗体对这些多肽的反应性。大致确定识别位点后合成更短的肽。可研究对这些肽的反应性，从而确定表位。
1.关于EPHA2
(1)EPHA2基因
EPHA2基因的核苷酸序列及其氨基酸序列在GenBank中记录为EPH受体A2(登记号分别为NM_004431和NP_004422)。此外，EPHA2基因的开放阅读框(ORF)的核苷酸序列参见序列表中的SEQ ID NO：1。其氨基酸序列参见序列表中的SEQ ID NO：2。
在本文中，EPHA2还涵盖以下蛋白：所述蛋白由有一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加的EPHA2氨基酸序列所衍生的氨基酸序列组成，并且具有与此酶的生物学活性相当的生物学活性。
(2)EPHA2基因的癌位点特异性表达
据报道，EPHA2基因在许多癌症中高度表达，特别是以下癌症：乳腺癌、食道癌、前列腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、结肠癌和多形性成胶质细胞瘤。
特别地，可检测EPHA2在每种细胞和/或每种组织中的表达水平，从而确定受治疗者中可由EPHA2的过量表达引起的恶性转化和/或肿瘤细胞生长的情况。
此外，抑制EPHA2表达水平和/或活性的物质具有抑制由EPHA2引起的恶性转化和/或癌细胞生长的活性。
因此，将试验物质与表达EPHA2的细胞接触并选定抑制EPHA2的表达水平和/或活性的物质，藉此筛选抗肿瘤物质。
在本文中，针对EPHA2的siRNA抑制EPHA2表达并且可用作抗肿瘤药物。针对EPHA2的siRNA可通过以下方法制备：基于EPHA2mRNA的核苷酸序列设计由EPHA2mRNA的部分序列组成的RNA(正义RNA)和由与所述RNA核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的RNA(反义RNA)；通过本领域本身已知的化学合成方法合成上述RNA并杂交所得的两条RNA。优选的是，称为突出端序列(overhang sequence)的一个或多个核苷酸的序列应与构成siRNA的正义和反义RNA各自的3′-端连接。所述突出端序列不具体受到限制，只要其保护RNA免受核酸酶降解即可。可使用优选1-10个核苷酸、更优选1-4个核苷酸、更优选2个核苷酸的任何序列。
2.针对EPHA2的抗体
(1)抗原的制备
用于获得本发明针对EPHA2的抗体的抗原的实例可包括EPHA2的全长多肽及其部分多肽，并且更具体地可包括EPHA2的全长多肽并优选EPHA2的胞外区多肽(由序列表中SEQ ID NO：8的第1-534位氨基酸表示的氨基酸序列组成)、更优选EPHA2胞外区多肽中的部分多肽(包含序列表中SEQ ID NO：8的第426-534位氨基酸所表示的氨基酸序列)、甚至更优选EPHA2胞外区多肽中的部分多肽(包含序列表中SEQ ID NO：8的第439-534位氨基酸所表示的氨基酸序列)、以及通过向这些序列中添加任意氨基酸序列或载体所得的衍生多肽。其另外的实例可包括由至少6个氨基酸的连续部分氨基酸序列组成的多肽和通过向这些序列中添加任意氨基酸序列或载体所得的衍生多肽。
在本文中，用作抗原的EPHA2的全长多肽或其部分多肽可通过基因工程改造致使EPHA2基因或其部分多肽的基因在宿主细胞中表达而得到。
EPHA2可直接从人的肿瘤组织或肿瘤细胞中纯化以供使用。此外，可在体外合成，或通过基因工程改造致使宿主细胞产生多肽来得到EPHA2的全长多肽或其部分多肽。
在基因工程中，具体而言，将编码EPHA2或其部分多肽的基因引入能表达EPHA2或其部分多肽的载体中，然后可在含有转录和翻译所需的酶、底物和能量物质的溶液中合成EPHA2或其部分多肽。或者，可用所述基因转化其它原核生物或真核生物的宿主细胞并使其表达EPHA2或其部分多肽以得到所需蛋白。
可通过例如所谓的聚合酶链式反应(在下文称作“PCR”)的方法得到EPHA2的部分多肽的cDNA，其中用表达EPHA2的cDNA文库作模板和特异性扩增EPHA2cDNA或编码部分多肽的DNA的引物进行PCR(参见Saiki，R.K.等.Science(1988)239，第487-489页)。
体外多肽合成的实例包括但不限于快速翻译系统(RTS，RapidTranslation System)(购自Roche Diagnostics Corp)。
原核细胞宿主的实例包括大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。为了用目标基因转化这些宿主细胞，用包含复制子(即复制起点)和来源于与所述宿主相容的物种的调控序列的质粒载体转化所述宿主细胞。此外，优选所述载体应具有可赋予经转化的细胞表型性状(表型)选择性的序列。
宿主真核细胞包括脊椎动物、昆虫、酵母等细胞。例如以下细胞通常用作所述脊椎动物细胞：猴COS细胞(Gluzman，Y.Cell(1981)23，第175-182页，ATCC CRL-1650)、小鼠成纤维细胞NIH3T3(ATCC No.CRL-1658)和中国仓鼠卵巢细胞的二氢叶酸还原酶缺陷品系(CHO细胞，ATCC CCL-61)(Urlaub，G.和Chasin，L.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77，第4126-4220页)，但脊椎动物细胞并不限于以上所述。
可按照标准方法培养由此得到的转化子并且所述转化子在培养期间能在胞内或胞外产生目标多肽。
用于培养的培养基可依照所采用的宿主细胞从常规使用的各种培养基中适当地选定。对于大肠杆菌而言，例如可使用任选补充了抗生素(例如氨苄青霉素)或IPTG的LB培养基。
在培养中由所述转化子在胞内或胞外产生的重组蛋白可通过本领域已知的各种分离方法利用重组蛋白的物理性质、化学性质等分离并纯化。
所述方法可具体地例述为：用常用的蛋白沉淀剂处理、超滤、各种液相色谱技术(例如分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、亲和层析和高效液相色谱)和透析以及它们的组合。
此外，待表达的重组蛋白可与6个组氨酸残基连接，藉此在镍层析柱上有效地纯化所得蛋白。
通过将这些方法组合，可容易地以高产率和高纯度大量制备目标多肽。
本发明抗体可由以下方法得到：依照标准方法用抗原免疫接种动物并收集体内产生的抗体，随后进行纯化。
此外，按照本领域已知的方法(例如Kohler和Milstein，Nature(1975)256，第495-497页；和Kennet，R.编辑，MonoclonalAntibodies，第365-367页，Plenum Press，N.Y.(1980))，将产生针对EPHA2的抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合并藉此建立杂交瘤，从中也可得到单克隆抗体。
(2)抗EPHA2单克隆抗体的制备
特异性结合EPHA2的抗体的实例可包括特异性结合EPHA2的单克隆抗体。用于获得所述抗体的方法如下所述。
对于单克隆抗体的制备，通常需要以下程序：
(a)纯化用作抗原的生物聚合体的步骤；
(b)通过注射用所述抗原免疫接种动物后，从所述动物中收集血液，检测其抗体效价以确定脾切除的时间，随后制备产生抗体的细胞的步骤，
(c)制备骨髓瘤细胞(下文称作“骨髓瘤”)的步骤，
(d)将所述产生抗体的细胞与骨髓瘤进行细胞融合的步骤，
(e)选择产生目标抗体的杂交瘤群体的步骤；
(f)分成单细胞克隆(克隆化(cloning))的步骤，
(g)根据情况培养用于制备大量单克隆抗体的杂交瘤或饲养移植了所述杂交瘤的动物的步骤，
(h)研究由此产生的单克隆抗体的生物活性和结合特异性或检测其作为标记试剂的性质的步骤等等。
在下文中，将按照这些步骤详述用于制备单克隆抗体的方法，但用于制备抗体的方法并不仅限于此。例如，也可使用除脾细胞和骨髓瘤之外的产生抗体的细胞。
(a)抗原的纯化
通过上述方法制备的EPHA2或其部分多肽可用作抗原。
此外，依照本领域技术人员熟知的方法，用表达EPHA2的重组体细胞制得的膜分离物或EPHA2的重组体细胞自身化学合成的本发明中蛋白的部分肽也可用作抗原。
(b)产生抗体的细胞的制备
将步骤(a)中所得抗原与本领域技术人员已知的佐剂(例如弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂)或其它辅剂(例如硫酸铝钾)混合，并用这些免疫原免疫接种实验动物。毫无疑问本领域已知的杂交瘤制备方法中所用的动物可用作所述实验动物。具体而言，可使用例如小鼠、大鼠、山羊、绵羊、牛和马。但从与所提取产生抗体的细胞融合的骨髓瘤细胞的易获得性而言，优选使用小鼠和大鼠作为免疫接种动物。
此外，实际所用小鼠和大鼠的品系不具体受到限制。例如可使用以下的小鼠品系：例如A、AKR、BALB/c、BDP、BA、CE、C3H、57BL、C57BR、C57L，DBA、FL、HTH、HT1、LP、NZB、NZW、RF、R III、SJL、SWR、WB或129；以及以下的大鼠品系：例如Low、Lewis、Sprague-Dawley、ACI、BN或Fischer。
这些小鼠和大鼠可获自例如实验动物饲养机构/销售机构例如CLEA Japan，Inc.和Charles River Laboratories Japan，Inc。
在这些谱系中，考虑到下述与骨髓瘤细胞的融合相容性，特别优选BALB/c谱系的小鼠和Low谱系的大鼠作为免疫接种的小鼠。
此外，考虑到人鼠之间的抗原同源性，还特别优选使用生物机能减少以去除了自身抗体的小鼠(即自身免疫病的小鼠)。
在免疫接种时这些小鼠或大鼠优选为5-12周龄、更优选6-8周龄。
对于用EPHA2或其重组抗原对动物免疫接种，可使用以下文献详述的本领域已知方法，例如Weir，D.M.的实验免疫学手册(Handbook of ExperimentalImmunology)第I、II和III卷，BlackwellScientific Publications，Oxford(1987)以及Kabat，E.A.和Mayer，M.M.的免疫化学实验(Experimental Immunochemistry)，Charles C ThomasPublisher Springfield，Illinois(1964)。
在这些免疫接种的方法中，本发明的优选方法将在下文具体阐述。
具体而言，首先向动物皮内或腹膜内给予用作抗原的膜蛋白分离物或表达抗原的细胞。
然而，优选联合使用所述两种给药途径以提高免疫效率。免疫效率尤其可通过以下方法提高：在早期免疫时进行皮内给予抗原而在后期免疫或仅最后一次免疫时进行腹膜内给予。
抗原的给药方案可视被免疫动物的类型及其个体差异等而不同。所述抗原通常优选按2-6周的间隔给予3-6个剂量、更优选按2-4周的间隔给予3-4个剂量。
此外，所述抗原的剂量可视动物类型及其个体差异等而不同，并且通常为约0.05-5mg、优选约0.1-0.5mg。
在给予所述抗原后1-6周、优选2-4周、更优选2-3周进行加强免疫。
在本文中，在加强免疫中所述抗原的剂量因动物类型及其体型等而异，例如对于小鼠而言，所述剂量通常为约0.05-5mg、优选约0.1-0.5mg、更优选约0.1-0.2mg。
在加强免疫1-10天后、优选2-5天后、更优选2-3天后，在无菌条件下从被免疫接种的动物中提取含有产生抗体的细胞的脾细胞或淋巴细胞。
在该方法中测量其抗体效价，抗体效价足够大的动物可用作产生抗体的细胞的来源，从而提高后续方法的效率。
本文所用的测量抗体效价的方法的实例可包括但不限于RIA和ELISA。
本发明抗体效价的测量可通过下述方法(例如按照ELISA)进行。
首先，将纯化或部分纯化的抗原吸附在固相(例如用于ELISA的96孔板)的表面上。此外，用与抗原无关的蛋白(例如牛血清白蛋白(下文称作“BSA”))覆盖未吸附抗原的固相表面。洗涤表面并随后与作为第一抗体的系列稀释的样品(例如小鼠血清)接触，以使所述样品中的抗体与抗原结合。
此外，向其加入作为第二抗体的针对小鼠抗体的酶标记的抗体，从而使第二抗体与鼠抗结合。洗涤后，向其加入所述酶的底物，并且例如通过检测基于底物降解的显色所致的吸光度变化，藉此计算出抗体效价。
可按照本领域已知的方法(例如Kohler等，Nature(1975)256，第495页；Kohler等，Eur.J.Immunol.(1977)6，第511页；Milstein等，Nature(1977)，266，第550页和Walsh，Nature，(1977)266，第495页)从这些脾细胞或淋巴细胞中分离出产生抗体的细胞。
例如，对于脾细胞，可采用常规方法，所述方法包括：将所述细胞切成条状，将其通过不锈钢滤网过滤，随后通过漂浮于Eagle极限必需培养基(MEM)中从中分离出产生抗体的细胞。
(c)骨髓瘤细胞(下文称作“骨髓瘤”)的制备
细胞融合中所用的骨髓瘤细胞不具体受到限制并且可从本领域已知的细胞株中适当地选择以供使用。但考虑到方便从融合细胞中选出杂交瘤，优选使用已建立其选择方法的HGPRT(次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)缺陷株。
其具体实例包括：小鼠来源的X63-Ag8(X63)、NS1-ANS/1(NS1)、P3X63-Ag8.U1(P3U1)、X63-Ag8.653(X63.653)、SP2/0-Ag14(SP2/0)、MPC11-45.6TG1.7(45.6TG)、FO、S149/5XXO和BU.1；大鼠来源的210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3)和人来源的U266AR(SKO-007)、GM1500.GTG-A12(GM1500)、UC729-6、LICR-LON-HMy2(HMy2)和8226AR/NIP4-1(NP41)。
这些HGPRT缺陷株可获自例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC))。
这些细胞株继代培养于合适的培养基中，例如8-氮鸟嘌呤培养基[补充了谷氨酰胺、2-巯基乙醇、庆大霉素和胎牛血清(下文称作“FBS”)并另外补充了8-氮杂鸟嘌呤的培养基]、Iscove改良的Dulbecco培养基(Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium，下文称作“IMDM”)或Dulbecco改良的Eagle培养基(Dulbecco′s ModifiedEagle Medium，下文称作“DMEM”)，并且在细胞融合前3-4天继代培养于普通培养基[例如含10％FBS的ASF104培养基(购自Ajinomoto Co.，Inc.)]中。在融合当天，确保细胞在2×107个以上。
(d)细胞融合
产生抗体的细胞和骨髓瘤细胞之间的融合可依照本领域已知的方法(例如Weir，D.M.的实验免疫学手册(Handbook ofExperimental Immunology)第I、II和III卷，Blackwell ScientificPublications，Oxford(1987)和Kabat，E.A.和Mayer，M.M.，Experimental Immunochemistry，Charles C Thomas PublisherSpringfield，Illinois(1964))在不过度减少细胞存活率的条件下适当进行。
例如，化学方法(其包括将产生抗体的细胞和骨髓瘤细胞在高浓度的聚合物(例如聚乙二醇)溶液中混合)和物理方法(使用电刺激)可用作所述方法。
在这些方法中，下文具体例述了化学方法。
具体而言，当将聚乙二醇用作高浓度聚合物溶液中的聚合物时，在30-40℃、优选35-38℃的温度下，在分子量为1500-6000、优选2000-4000的聚乙二醇溶液中混合产生抗体的细胞和骨髓瘤细胞，持续1-10分钟、优选5-8分钟。
(e)杂交瘤群体的选择
用于选择通过细胞融合得到的杂交瘤的方法不具体受到限制，并且通常使用HAT(次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷)选择法(Kohler等，Nature(1975)256，第495页和Milstein等，Nature(1977)266，第550页)。
通过使用不可在氨基蝶呤中存活的HGPRT缺陷型骨髓瘤细胞株，该方法能有效得到杂交瘤。
具体而言，可在HAT培养基中培养未融合的细胞和杂交瘤，由此仅使抗氨基蝶呤的杂交瘤存活并生长。
(f)分成单细胞克隆(克隆化)
例如，诸如甲基纤维素、软琼脂糖和有限稀释法等本领域已知的方法可用作克隆杂交瘤的方法(参见例如Barbara，B.M.和Stanley，M.S.的细胞免疫学的选择方法(Selected Methods in CellularImmunology)，W.H.Freeman and Company，San Francisco(1980))。在这些方法中，特别优选有限稀释法。
在该方法中，将饲养细胞(feeder)(例如胎鼠来源的成纤维细胞株或普通小鼠的脾细胞、胸腺细胞或腹水细胞)接种在微量培养板上。
另一方面，预先在培养基中将杂交瘤稀释至0.2-0.5个个体/0.2ml。按0.1ml/孔的浓度加入含有悬浮于其中的经稀释的杂交瘤的该液体，并可对杂交瘤连续培养约2周并按固定间隔(例如3天的间隔)用新的培养基更换约1/3的培养基，由此使杂交瘤克隆生长。
对于可观测到抗体效价的孔，例如对通过有限稀释法进行的克隆化重复2-4次，可选出稳定观测到其抗体效价的克隆作为产生抗EPHA2单克隆抗体的杂交瘤株。
由此克隆的杂交瘤株的实例可包括杂交瘤SH348-1和杂交瘤SH357-1。杂交瘤SH348-1和杂交瘤SH357-1已于2007年6月8日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(地址：Tsukuba Central 6，Higashi 1-1-1，Tsukuba，Ibaraki，Japan)中。杂交瘤SH348-1命名为SH348-1，保藏号为FERM BP-10836；杂交瘤SH357-1命名为SH357-1，保藏号为FERM BP-10837。
在本说明书中，产生自杂交瘤SH348-1的抗体称作“SH348-1”，产生自杂交瘤SH357-1的抗体称作“SH357-1”。
(g)通过杂交瘤培养制备单克隆抗体
可培养由此选定的杂交瘤从而有效得到单克隆抗体。在培养前，优选应筛选产生目标单克隆抗体的杂交瘤。
为了进行该筛选，可采用本领域本身已知的方法。
可例如通过(b)节所述的ELISA进行本发明抗体效价测定。
通过上述方法得到的杂交瘤可在液氮或-80℃以下的冰箱中冻存。
此外，完全克隆的杂交瘤可在HT培养基(无氨基蝶呤的HAT培养基)中传代数次，随后从所述培养基换至普通培养基中培养。
通过使用大培养瓶的旋转培养(rotational culture)或旋动培养(spinner culture)进行大规模培养。
所述大规模培养中得到的上清液可按照本领域技术人员已知的方法(例如凝胶过滤)纯化，以得到特异性结合本发明蛋白的单克隆抗体。
此外，可向与杂交瘤谱系相同的小鼠(例如BALB/c)或Nu/Nu小鼠腹膜内注射杂交瘤，并使其生长以获得含大量本发明的单克隆抗体的腹水。
对于腹膜内给药，预先(给药前3-7天)给予矿物油(例如2，6，10，14-四甲基十五烷(降植烷))以得到更大量的腹水。
例如，提前向与杂交瘤谱系相同的小鼠经腹膜内注射免疫抑制剂以使T细胞失活。20天后，使106-107个杂交瘤克隆细胞悬浮于无血清的培养基(0.5ml)中，并向所述小鼠经腹膜内给予所述液体。通常当腹水累积导致腹胀时，从所述小鼠中收集腹水。
通过此方法，所得的单克隆抗体的浓度约比培养液的浓度高约100倍。
通过以上方法得到的单克隆抗体可通过例如下述方法纯化：Weir，D.M.：实验免疫学手册(Handbook of ExperimentalImmunology)，第I、II、III卷，Blackwell Scientific Publications，Oxford(1978)。
所述纯化方法的具体实例包括硫酸铵沉淀、凝胶过滤、离子交换层析和亲和层析。
对于纯化，也可用市售的单克隆抗体纯化试剂盒(例如MAbTrap GII Kit；购自Pharmacia Inc.)等作为便利的方法。
由此得到的单克隆抗体具有针对EPHA2的高抗原特异性。
(h)单克隆抗体的试验
可如下所述测定由此得到的单克隆抗体的同种型和亚类。
首先，鉴定方法的实例包括：奥脱洛尼法(Ouchterlony method)、ELISA和RIA。
奥脱洛尼法很方便但对于低浓度的单克隆抗体而言需要浓缩步骤。
另一方面，当使用ELISA或RIA时，培养上清液直接与吸附了抗原的固相反应，并且另外，与各种免疫球蛋白同种型和亚类相容的抗体可用作第二抗体，由此鉴定出单克隆抗体的同种型或亚类。
此外，用于鉴定的市售试剂盒(例如Mouse Typer Kit；购自Bio-Rad Laboratories，Inc.)等也可用作更便利的方法。
此外，依照福林酚(Folin-Lowry)法并利用280nm处的吸光度的计算方法[1.4(OD280)＝1mg/ml免疫球蛋白]可对蛋白定量。
(3)其它抗体
本发明抗体涵盖针对EPHA2的单克隆抗体以及为了某些目的(例如减少对人的异种抗原性)而人工修饰的遗传重组抗体，例如嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。这些抗体可依照已知方法制备。
嵌合抗体的实例包括具有来源于彼此不同的物种的可变区和恒定区的抗体，并且特别包括含有相连的鼠源可变区与人源恒定区的嵌合抗体(参见Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81，6851-6855，(1984))。
人源化抗体的实例可包括：含有互补决定区(CDR)被另一物种的CDR置换的人源抗体的抗体(参见Nature(1986)321，第522-525页)；以及含有CDR序列和某些构架氨基酸残基通过CDR移植被另一物种的相应CDR序列和残基置换的人抗体的抗体(参见WO90/07861和US6972323)。
本发明抗体的另外的实例可包括抗人抗体。所述抗EPHA2人抗体意指仅具有人染色体来源的抗体的基因序列的人抗体。所述抗EPHA2人抗体可通过以下方法得到：利用具有含人抗体H链和L链基因的人染色体片段的产生人抗体的小鼠(参见例如Tomizuka，K.等，Nature Genetics(1997)16，第133-143页；Kuroiwa，Y.等，Nucl.Acids Res.(1998)26，第3447-3448页；Yoshida，H.等，AnimalCell Technology：Basic and Applied Aspects第10卷，第69-73页(Kitagawa，Y.，Matsuda，T.和Iijima，S.编辑)，Kluwer AcademicPublishers，1999和Tomizuka，K.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97，第722-727页)。
对于这样的转基因动物，具体而言，可通过制备敲除动物和转基因动物并使这些动物杂交得到遗传重组动物，所述遗传重组动物中非人类哺乳动物的内源性免疫球蛋白重链和轻链的基因座被破坏，取而代之，经由酵母人工染色体(YAC)载体等引入人免疫球蛋白重链和轻链的基因座。
此外，通过基因重组技术，用编码这样的人抗体重链和轻链各自的cDNA(优选含所述cDNA的载体)转化真核生物细胞，也可培养产生遗传重组的人单克隆抗体的转化细胞并由此从培养上清液中得到这些抗体。
在本文中，可使用例如真核细胞、优选哺乳动物细胞(例如CHO细胞、淋巴细胞和骨髓瘤)作为宿主。
此外，用于获得从人抗体文库中选择的噬菌体展示的人抗体的方法也是已知的(参见例如Wormstone，I.M.等，InvestigativeOphthalmology & Visual Science.(2002)43(7)，第2301-2308页；Carmen，S.等，Briefings in Functional Genomics and Proteomics(2002)，1(2)，第189-203页和Siriwardena，D.等，Ophthalmology(2002)109(3)，第427-431页)。
例如，可使用噬菌体展示方法，所述方法包括：使人抗体可变区以单链抗体(scFv)表达在噬菌体的表面并选定与抗原结合的噬菌体(Nature Biotechnology(2005)，23，(9)，第1105-1116页)。
同样地，还可使用另一种噬菌体展示方法，所述方法包括：使人抗体Fab(抗原结合片段)表达在噬菌体的表面并选定与抗原结合的噬菌体(WO 97/08320和WO 01/05950)。
可分析基于抗原结合而选定的噬菌体基因，从而确定编码与抗原结合的人抗体可变区的DNA序列。
当清楚与所述抗原结合的scFv或Fab的DNA序列时，从所述DNA序列中析取出CDR序列，可制备具有所述序列的表达载体并引入合适的宿主中，随后通过基因表达获得人抗体(WO 92/01047、WO 92/20791、WO 93/06213、WO 93/11236、WO 93/19172、WO95/01438、WO 95/15388、Annu.Rev.Immunol(1994)12，第433-455页和Nature Biotechnology(2005)23(9)，第1105-1116页)。
可暂时分离所述抗体的基因并随后引入合适的宿主中以制备抗体。在这样的情况下，可结合合适的宿主和表达载体以供使用。
当真核细胞用作宿主时，可使用动物细胞、植物细胞和真核微生物。
动物细胞的实例可包括：(1)哺乳动物细胞，例如猴COS细胞(Gluzman，Y.Cell(1981)23，第175-182页，ATCC CRL-1650)、小鼠成纤维细胞NIH3T3(ATCC No.CRL-1658)和中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞，ATCC CCL-61)的二氢叶酸还原酶缺陷株(Urlaub，G.和Chasin，L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77，第4126-4220页)。
此外，还可修饰这些宿主以表达具有修饰的糖链结构和ADCC活性(抗体依赖的细胞毒活性)或CDC活性增强的抗体以供使用。此类宿主的实例可包括CHO细胞，所述细胞包含其中引入了编码能产生抗体组合物的抗体分子的基因，在所述抗体组合物中，在其还原端具有未结合岩藻糖的N-乙酰葡糖胺的糖链占与抗体Fc区连接的混合型N-糖苷连接的糖链的20％以上(参见WO 02/31140)。
当使用原核细胞时，其实例可包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。
通过转化将目标抗体基因引入这些细胞中，并在体外培养经转化的细胞以得到抗体。
本发明抗体的同种型不受限制，其实例包括IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgM、IgA(IgA1或IgA2)、IgD和IgE，并且可优选包括IgG和IgM。
此外，本发明抗体可为具有所述抗体的抗体结合位点的抗体片段或其修饰形式。
所述抗体片段的实例包括：Fab、F(ab′)2、Fv、含经由合适的接头连接的重链Fv和轻链Fv的单链Fv(scFv)、双抗体、线性抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。
此外，本发明抗体可为对至少两种不同的抗原具有特异性的多特异性抗体。
这样的分子通常结合两种抗原(即双特异性抗体)。本发明的“多特异性抗体”涵盖对多种(例如三种)抗原具有特异性的抗体。
用作本发明抗体的多特异性抗体可为全长抗体或此类抗体的片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)。所述双特异性抗体可通过使两种抗体的重链和轻链(HL对)结合来制备，或者也可通过使产生彼此不同的单克隆抗体的杂交瘤融合以制备产生双特异性抗体的融合细胞(Millstein等，Nature(1983)305，第537-539页)。
本发明抗体可为单链抗体(也称作scFv)。单链抗体通过将抗体的重链和轻链的V区经由多肽接头连接得到(Pluckthun，ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，113(Rosenberg和Moore编辑，Springer Verlag，New York，第269-315页(1994))和NatureBiotechnology(2005)，23，第1126-1136页)。
用于制备单链抗体的方法为本领域所已知(参见例如美国专利第4,946,778号、第5,260,203号、第5,091,513号和第5,455,030号)。在所述scFv中，重链和轻链的V区经由并不形成缀合物的接头(优选多肽接头)连接(Huston，J.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)，85，第5879-5883页)。scFv中重链和轻链的V区可来源于相同或不同的抗体。
例如，12-19个残基的任意单链肽用作连接所述V区的肽接头。
如下得到编码scFv的DNA：将编码抗体重链或重链V区的DNA以及编码其轻链或轻链V区的DNA的全长序列或部分序列(编码所需的氨基酸序列)作为模板，用设计用于其两端的引物对通过PCR法扩增；随后结合设计用于分别使接头序列两端连接至重链和轻链序列的引物对来进一步扩增编码肽接头部分的DNA。
此外，一旦制得编码scFv的DNA，依照标准方法可得到包含所述DNA的表达载体和转化了所述表达载体的宿主。此外，通过利用所述宿主，依照标准方法可得到所述scFv。
对于这些抗体片段，按以上相同的方法得到并表达其基因，并可使宿主产生所述抗体片段。
本发明抗体可为多克隆抗体，其是氨基酸序列不同的多种抗EPHA2抗体的混合物。多克隆抗体的一个实例可包括CDR不同的多种抗体的混合物。培养产生彼此不同的抗体的细胞混合物，并且从培养物中纯化的抗体可用作这样的多克隆抗体(参见WO2004/061104)。
通过将本发明抗体与各种分子(例如聚乙二醇(PEG))结合得到的抗体也可用作所述抗体的修饰形式。
此外，本发明抗体可为这些抗体与其它药物形成的缀合物(免疫缀合物)。此类抗体的实例可包括通过将这些抗体与放射性物质或具有药理作用的化合物结合得到的缀合物(Nature Biotechnology(2005)23，第1137-1146页)。
可纯化所得到的抗体直至均质。在抗体的分离和纯化中，可使用用于普通蛋白的任何分离/纯化方法。
可通过合适地选择和联合以下方法来分离和纯化抗体：例如使用层析柱、过滤、超滤、盐析、透析、制备用聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦(蛋白纯化和表征的策略：实验路线手册(Strategies forProtein Purification and Characterization：A Laboratory CourseManual)，Daniel R.Marshak等编缉，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1996)和抗体：实验室手册(Antibodies：A Laboratory Manual.)Harlow和David Lane编辑，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但分离/纯化方法但不限于以上所述。
层析的实例包括：亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析和吸附层析。
这些层析技术可利用液相色谱(例如HPLC或FPLC)进行。
亲和层析中所用柱的实例包括蛋白A柱和蛋白G柱。
基于蛋白A柱的柱的实例包括Hyper D、POROS和SepharoseF.F.(Pharmacia Inc.)。
此外，抗体还可通过其对抗原的亲和力，使用抗原固定化载体进行纯化。
3.本发明抗体的性质
通过上述方法得到的本发明抗EPHA2抗体具有以下性质：
(1)本发明的一种抗体具有以下a)-e)的性质：
a)不具有磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力；
b)具有针对表达EPHA2的细胞的ADCC活性；
c)具有针对表达EPHA2的细胞的CDC活性；
d)具有体内抗肿瘤活性；和
e)特异性结合由序列表中SEQ ID NO：8的第426-534位氨基酸所表示的氨基酸序列组成的多肽。
具有这样的性质的抗体的实例可包括选自以下1)-8)中任一种抗体：
1)SH348-1，
2)识别由产生自杂交瘤SH348-1(FERM BP-10836)的抗体识别的表位的抗体，
3)一种抗体，所述抗体具有作为重链可变区的互补决定区的序列表中SEQ ID NO：59、61和63表示的氨基酸序列，并且具有作为轻链可变区的互补决定区的序列表中SEQ ID NO：65、67和69表示的氨基酸序列，
4)特征在于以下i)和ii)的抗体：
i)具有包含由通式(I)表示的氨基酸序列的重链肽：
-FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4-(I)
其中，FRH1表示由18-30个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRH1表示由序列表中SEQ ID NO：59表示的氨基酸序列；FRH2表示由14个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRH2表示由序列表中SEQ ID NO：61表示的氨基酸序列；FRH3表示由32个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRH3表示由序列表中SEQ ID NO：63表示的氨基酸序列；而FRH4表示由11个氨基酸组成的任意氨基酸序列，其中这些氨基酸彼此通过肽键连接；和
ii)具有包含由通式(II)表示的氨基酸序列的轻链多肽：
-FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4-(II)
其中，FRL1表示由23个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRL1表示由序列表中SEQ ID NO：65表示的氨基酸序列；FRL2表示由15个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRL2表示由序列表中SEQID NO：67表示的氨基酸序列；FRL3表示由32个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRL3表示由序列表中SEQ ID NO：69表示的氨基酸序列；而FRL4表示由10个氨基酸组成的任意氨基酸序列；其中这些氨基酸彼此通过肽键连接。
5)SH357-1，
6)识别由产生自杂交瘤SH357-1(FERM BP-10837)的抗体识别的表位的抗体，
7)一种抗体，所述抗体具有作为重链可变区的互补决定区的序列表中SEQ ID NO：71、73和75表示的氨基酸序列，并具有作为轻链可变区的互补决定区的序列表中SEQ ID NO：77、79和81表示的氨基酸序列，
8)第(5)-(7)项中任一项的抗体，所述抗体特征在于以下i)和ii)：
i)具有包含由通式(I)表示的氨基酸序列的重链肽：
-FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4-(I)
其中，FRH1表示由18-30个氨基酸的序列组成的任意氨基酸序列；CDRH1表示由序列表中SEQ ID NO：71表示的氨基酸序列；FRH2表示由14个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRH2表示由序列表中SEQ ID NO：73表示的氨基酸序列；FRH3表示由32个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRH3表示由序列表中SEQ ID NO：75表示的氨基酸序列；而FRH4表示由11个氨基酸组成的任意氨基酸序列，其中这些氨基酸彼此通过肽键连接；和
ii)具有包含由通式(II)表示的氨基酸序列的轻链多肽：
-FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4-(II)
其中，FRL1表示由23个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRL1表示由序列表中SEQ ID NO：77表示的氨基酸序列；FRL2表示由15个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRL2表示由序列表中SEQID NO：79表示的氨基酸序列；FRL3表示由32个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRL3表示由序列表中SEQ ID NO：81表示的氨基酸序列；而FRL4表示由10个氨基酸组成的任意氨基酸序列；其中这些氨基酸彼此通过肽键连接。
(2)本发明的另一种抗体具有以下a)-f)的性质：
a)不具有磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力；
b)表现出降低EPHA2蛋白水平的作用；
c)具有针对表达EPHA2的细胞的ADCC活性；
d)具有针对表达EPHA2的细胞的CDC活性；
e)具有体内抗肿瘤活性；和
f)特异性结合由序列表中SEQ ID NO：8的第426-534位氨基酸所表示的氨基酸序列组成的多肽。
具有此类性质的抗体的实例可包括选自以下1)-4)中任一种抗体：
1)SH348-1，
2)识别由产生自杂交瘤SH348-1(FERM BP-10836)的抗体识别的表位的抗体，
3)一种抗体，所述抗体具有作为重链可变区的互补决定区的序列表中SEQ ID NO：59、61和63表示的氨基酸序列，并且具有作为轻链可变区的互补决定区的序列表中SEQ ID NO：65、67和69表示的氨基酸序列，
4)特征在于以下i)和ii)的抗体：
i)具有包含由通式(I)表示的氨基酸序列的重链肽：
-FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4-(I)
其中，FRH1表示由18-30个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRH1表示由序列表中SEQ ID NO：59表示的氨基酸序列；FRH2表示由14个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRH2表示由序列表中SEQ ID NO：61表示的氨基酸序列；FRH3表示由32个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRH3表示由序列表中SEQ ID NO：63表示的氨基酸序列；而FRH4表示由11个氨基酸组成的任意氨基酸序列，其中这些氨基酸彼此通过肽键连接；和
ii)具有包含由通式(II)表示的氨基酸序列的轻链多肽：
-FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4-(II)
其中，FRL1表示由23个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRL1表示由序列表中SEQ ID NO：65表示的氨基酸序列；FRL2表示由15个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRL2表示由序列表中SEQID NO：67表示的氨基酸序列；FRL3表示由32个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRL3表示由序列表中SEQ ID NO：69表示的氨基酸序列；而FRL4表示由10个氨基酸组成的任意氨基酸序列；其中这些氨基酸彼此通过肽键连接。
(3)本发明的另一种抗体具有以下a)-e)的性质：
a)不具有磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力；
b)表现出降低EPHA2蛋白水平的作用；
c)具有ADCC活性；
d)具有CDC活性；
e)具有体内抗肿瘤活性；和
f)特异性结合由序列表中SEQ ID NO：8的第426-534位氨基酸所表示的氨基酸序列组成的多肽。
具有所述性质的抗体的实例可包括选自以下1)-4)中任一种抗体：
1)SH357-1，
2)识别由产生自杂交瘤SH357-1(FERM BP-10836)的抗体识别的表位的抗体，
3)一种抗体，所述抗体具有作为重链可变区的互补决定区的序列表中SEQ ID NO：71、73和75表示的氨基酸序列，并且具有作为轻链可变区的互补决定区的序列表中SEQ ID NO：77、79和81表示的氨基酸序列，
4)具有以下i)和ii)的性质的抗体：
i)具有包含由通式(I)表示的氨基酸序列的重链肽：
-FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4-(I)
其中，FRH1表示由18-30个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRH1表示由序列表中SEQ ID NO：71表示的氨基酸序列；FRH2表示由14个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRH2表示由序列表中SEQ ID NO：73表示的氨基酸序列；FRH3表示由32个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRH3表示由序列表中SEQ ID NO：75表示的氨基酸序列；而FRH4表示由11个氨基酸组成的任意氨基酸序列，其中这些氨基酸彼此通过肽键连接；和
ii)具有包含由通式(II)表示的氨基酸序列的轻链多肽：
-FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4-(II)
其中，FRL1表示由23个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRL1表示由序列表中SEQ ID NO：77表示的氨基酸序列；FRL2表示由15个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRL2表示由序列表中SEQID NO：79表示的氨基酸序列；FRL3表示由32个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRL3表示由序列表中SEQ ID NO：81表示的氨基酸序列；而FRL4表示由10个氨基酸组成的任意氨基酸序列；其中这些氨基酸彼此通过肽键连接。
4.包含抗EPHA2抗体的药物
本发明的抗EPHA2抗体可用作药物，特别地，可用作预期治疗癌症的药物组合物或用作免疫诊断此类疾病的抗体。
癌症类型的优选实例可包括但不限于：乳腺癌、食道癌、前列腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、结肠癌和多形性成胶质细胞瘤。
本发明还提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的抗EPHA2抗体和可药用稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或辅料。
优选的是，对接受所述药物组合物的个体而言，本发明的药物组合物中的可药用物质在所用的剂量或给药浓度下应是无毒的。
本发明的药物组合物可含有用于改变、保持或维持以下性质的药用物质：pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、无菌、稳定性、溶解速率、持续释放速率、吸收性或渗透性。
药用物质的实例可包括但不限于以下：氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(抗坏血酸、硫酸钠和亚硫酸氢钠)；缓冲液(例如磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液)、碳酸氢盐溶液和Tris-HCl溶液；填充剂(例如甘露醇和甘氨酸)；螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(例如咖啡因、聚乙烯吡咯烷、β-环糊精和羟丙基-β-环糊精)；补充剂(例如葡萄糖、甘露糖和糊精)；单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖和其它烃类(例如糊精)；着色剂；矫味剂；稀释剂；乳化剂；亲水聚合物(例如聚乙烯吡咯烷)；低分子量多肽；成盐反荷离子；消毒剂(例如洁尔灭、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、羟苯甲酯、羟苯丙酯、双氯苯双胍己烷、山梨酸和过氧化氢)；溶剂(例如甘油、丙二醇和聚乙二醇)；糖醇(例如甘露醇和山梨醇)；助悬剂；表面活性剂(例如PEG、脱水山梨糖醇酯、吐温类(例如吐温20和吐温80)、曲通、氨丁三醇、卵磷脂和胆固醇)；促稳定剂(例如蔗糖和山梨醇)；强性增强剂(elasticity enhancer)(例如氯化钠、氯化钾、甘露醇和山梨醇)；递送溶媒；稀释剂；赋形剂；和/或药用辅料。
这些药用物质的加入量优选比抗EPHA2抗体的重量高0.01-100倍，特别优选高0.01-10倍。
在本文中，本发明还涵盖一种含免疫脂质体的药物组合物，所述免疫脂质体包含脂质体中的抗EPHA2抗体或与脂质体结合的抗EPHA2抗体(美国专利第6214388号)。
制剂中药物组合物的优选的组成可通过本领域的技术人员根据适应症、适用的给药途径等适当地确定。
药物组合物中的赋形剂或载体可为液体或固体。合适的赋形剂或载体可为注射用水、盐水、脑脊液或常规用于胃肠外给药的其它物质。
中性盐水和含血清白蛋白的盐水也可用作载体。所述药物组合物还可含有Tris缓冲液(pH 7.0-8.5)或醋酸盐缓冲液(pH 4.0-5.5)以及山梨醇或其它化合物。本发明的药物组合物可配制成冻干形式或液态形式作为具有所选组合物和必要纯度的合适的药物。
还可使用合适的赋形剂(例如蔗糖)将含抗EPHA2抗体的药物组合物配制成冻干形式。
本发明的药物组合物可经配制用于肠胃外给药或还可经配制用于胃肠吸收。
所述制剂的组成和浓度可视给药方法而定。当本发明的药物组合物中所含抗EPHA2抗体对EPHA2具有较高的亲和力(即就解离常数(Kd值)而言，对EPHA2具有较高亲和力(较低Kd值))时，包含所述抗体的药物在人体中在较低的剂量下可为有效的。基于该结果，还可确定本发明的药物组合物在人体中的剂量。
抗EPHA2抗体在人体中的剂量通常可为约0.1-100mg/kg，每1-180天给药一次。
本发明的药物组合物的剂型的实例包括：注射剂(包括滴注剂)、栓剂、滴鼻剂、舌下剂和透皮吸收剂。
给予本发明的药物组合物可抑制表达EPHA2的肿瘤的生长。
实施例
下面，根据实施例对本发明作更具体的描述。然而，并不意味着本发明限于以下实施例。
在以下的实施例中，除非另外说明，否则涉及基因工程的方法按照″分子克隆(Molecular Cloning)″(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，由Cold Spring Harbor Laboratory Press出版，1989)中所述方法、或者本领域的技术人员所用其它的实验手册中所述方法或依照所用市售的试剂或试剂盒中所含说明书中所述方法进行。
(实施例1)质粒的制备
1)-1表达人EPHA2的载体的制备
1)-1-1表达全长的人EPHA2的载体的制备
编码人EPHA2的cDNA通过以下PCR反应扩增：利用合成自SK-OV-3细胞来源的总RNA作模板和以下引物组进行PCR：引物1：5′-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcggggatcggaccgagagcgagaag-3′(序列表SEQ ID No.3)；和
引物2：5′-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcctagatggggatccccacagtgttcacctggtcctt-3′(序列表SEQ ID No.4)。
用BP Clonase(购自Invitrogen公司)将所述PCR产物引入pDONR221(购自Invitrogen公司)中以制备中间载体(entry vector)。利用GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System(购自Invitrogen公司)和以下引物组从中间载体的EPHA2基因中去除终止密码子：
引物3：5′-ctgtggggatccccatcgacccagctttc-3′(序列表SEQ ID No.5)；和
引物4：5′-gatggggatccccacagtgttcacctggtc-3′(序列表SEQ ID No.6)。
用LR Clonase(购自Invitrogen公司)进行得到的中间载体和pcDNA-DEST40Gateway载体(购自Invitrogen公司)之间的重组反应，以制备pcDNA-DEST40-EPHA2(本载体具有在attB1和attB2序列之间的由序列表中SEQ ID NO：7表示的核苷酸序列)。此外，克隆至本载体中的EPHA2基因的ORF部分的序列由序列表中SEQID NO：7的第33-2960位核苷酸表示。此外，EPHA2的氨基酸序列由序列表中SEQ ID NO：8表示。
1)-1-2EPHA2胞外区的表达载体的制备
通过PCR反应使用以下引物组扩增编码人EPHA2胞外区多肽(由序列表中SEQ ID NO：8的第1-534位氨基酸表示的氨基酸序列组成；在下文简称为“EPHA2-ECD”)的cDNA：
引物5：5′-aaaaagcttatggagctccaggcagcccgc-3′(序列表SEQ ID No.9)；和
引物6：5′-aaagggccctcagttgccagatccctccgg-3′(序列表SEQ ID No.10)。
用HindIII和ApaI切割所述所得的PCR产物并克隆至pcDNA3.1的HindIII/ApaI位点中(所得载体在下文简称为“pcDNA3.1-EPHA2-ECD”；在以下的描述和附图中，由“pcDNA3.1-EPHA2-ECD”表达的重组蛋白称作“rEPHA2-ECD”)。
1)-1-3截短的EPHA2蛋白的表达载体的制备
为构建表达以下区域的载体：由EPHA2的序列表中SEQ IDNO：8的第315-540位氨基酸表示的氨基酸序列组成的区域(下文称作″FnIII-NC″)、由所述SEQ ID NO：8的第315-430位氨基酸表示的氨基酸序列组成的区域(下文称作″FnIII-N″)或由所述SEQ ID NO：8的第426-540位氨基酸表示的氨基酸序列组成的区域(下文称作″FnIII-C″)，以pcDNA-DEST40-EPHA2作为模板并用以下各引物组进行PCR反应：
用于扩增FnIII-NC的引物组：
引物7：5′-gcaggcttcatcgaaggtcgtgggcgggcacctcaggacccag-3′(序列表SEQ ID No.11)；和
引物8：5′-gtacaagaaagctgggtgctagccgccaatcaccgccaag-3′(序列表SEQ ID No.12)；
用于扩增FnIII-N的引物组：
引物7和
引物9：5′-gtacaagaaagctgggtgctaggcagtacggaagctgcgg-3′(序列表SEQ ID No.13)；
用于扩增FnIII-C的引物组：
引物10：5′-gcaggcttcatcgaaggtcgtgggagcttccgtactgccagtg-3′(序列表SEQ ID No.14)；和引物8。
为了在所得PCR产物的两端添加attB1和attB2位点，以所述各PCR产物作为模板并使用以下引物组进行PCR反应：
引物11：5′-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcatcgaaggtcgtggg-3′(序列表SEQ ID No.15)；和
引物12：5′-ggggaccactttgtacaagaaagctgggt-3′(序列表SEQ IDNo.16)。
用BP Clonase将以上方法中得到的PCR产物引入pDONR221中以制备中间载体。以上各中间载体和目的载体之间的重组反应通过以下步骤制得：用限制性内切酶切割pET15b(购自Novagen)的NdeI和BamHI位点，补平所述切割位点，并随后用LR Clonase将Gateway Vector Conversion System(购自Invitrogen公司)的ReadingFrame Cassette C.1连接至所述补平的位点中以制备表达载体(由引入了FnIII-NC、FnIII-N和FnIII-C的表达载体表达的重组蛋白在下文分别称作rFnIII-NC、rFnIII-N和rFnIII-C)。
1)-2人EPHB2胞外区的表达载体的制备
编码人EPHB2的cDNA如下制得：使用由HCC70细胞来源的总RNA合成的cDNA作为模板和以下引物组进行PCR反应：
引物13：5′-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcgccccgggaagcgcacc-3′(序列表SEQ ID No.17)；和
引物14：5′-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcctaaacctccacagactgaatctggttcatctg-3′(序列表SEQ ID No.18)。
人EPHB2cDNA的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO：19表示。其氨基酸序列由序列表中SEQ ID NO：20表示。使用用于扩增编码人EPHB2胞外区(该区由序列表中SEQ ID NO：20的第1-542位氨基酸表示的氨基酸序列组成)(在下文简称为″EPHB2-ECD″)的cDNA的引物组进行PCR反应：
引物15：5′-aaaaagcttatggctctgcggaggctgggg-3′(序列表SEQ IDNo.21)；和
引物16：5′-aaagatatctcatggcaacttctcctggat-3′(序列表SEQ ID No.22)。
用HindIII和EcoRV切割所得的PCR产物并克隆至pcDNA3.1的HindIII/EcoRV位点中(所得载体在下文简称为″pcDNA3.1-EPHB2-ECD″；在以下的描述和附图中，由″pcDNA3.1-EPHB2-ECD″表达的重组蛋白称作rEPHB2-ECD)。
1)-3人ERBB2的表达载体的制备
用Human clone collection(购自STRATAGENE，#C33830)作为模板，使用以下引物组进行PCR反应：
引物17：5′-caccatggagctggcggccttg-3′(序列表SEQ ID No.23)；知
引物18：5′-tcccactggcacgtccagacc-3′(序列表SEQ ID No.24)。
用pENTR Directional TOPO克隆试剂盒(购自Invitrogen公司)将所得PCR产物掺入至pENTR/D-TOPO(购自Invitrogen公司)中以制备中间载体。为了修复由氨基酸的取代引起的突变，用EcoRI消化所述的中间载体，并且将在所得的片段中的含pENTR/D-TOPO来源的序列的片段与在用EcoRI消化的Human clone collection(购自STRATAGENE，#C14640)所得片段中的第二大的片段(约1.6kbp)连接。所得中间载体与pcDNA-DEST40Gateway载体之间的重组反应用LR Clonase进行，以制得pcDNA-DEST40-ERBB2(所述载体具有在attB 1和attB2序列之间的由序列表中SEQ ID NO：25表示的核苷酸序列)。
(实施例2)单克隆抗体的制备
2)-1抗原的制备
为了表达EPHA2-ECD，用293fectin(购自Invitrogen公司)用pcDNA3.1-EPHA2-ECD转染FreeStyle 293-F细胞(购自Invitrogen公司)中，并在37℃下8％CO2中培养5天。培养后，通过离心收集培养上清液并用作纯化rEPHA2-ECD的来源。所得培养上清液在分子截留为15000的透析管中用pH 7.5的20mM Tris-HCl透析，随后通过滤器(0.45μm，PES)过滤，之后进样至用pH 7.5的20mMTris-HCl平衡的HiPrep 16/10Q XL(购自GE HealthcareBio-Sciences公司)中。用线性浓度梯度的NaCl(20mM Tris-HCl，pH7.5，0-1M NaCl)进行洗脱。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(在以下简称为″SDS-PAGE″)分离洗脱部分的等分试样。然后，用考马斯亮蓝染色(在下文简称为″CBB染色″)凝胶以确定含rEPHA2-ECD的部分。接下来，合并含rEPHA2-ECD的部分并上样至用PBS平衡的HiLoad 26/60Superdex 200pg(购自GE Healthcare Bio-Sciences公司)中。经PBS洗脱后，通过SDS-PAGE分离洗脱部分的等分试样。随后用CBB染色凝胶以确定含rEPHA2-ECD的部分。合并含rEPHA2-ECD的部分并用作免疫接种和表位确定的抗原。用BCAProtein Assay Reagent(购自PIERCE)检测蛋白浓度。
2)-2免疫接种
使用4-6周龄的BALB/cAnNCrlCrlj小鼠(Charles RiverLaboratories Japan，Inc.)。在第0天，向小鼠的背部皮下给予50μgrEPHA2-ECD和弗氏完全佐剂H37Rv(购自Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)(体积比＝1∶1)的混合物。同样地，向另一小鼠的背部皮下给予50μg rEPHA2-ECD和TiterMax Gold Adjuvant(购自Sigma-Aldrich，Inc.)(体积比＝1∶1)的混合物。在第22和第36天，向每只小鼠的背部皮下给予50μg rEPHA2-ECD和弗氏不完全佐剂(购自Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)(体积比＝1∶1)的混合物。在第53天，向每只小鼠腹膜内给予50μg rEPHA2-ECD。在第56天，收集小鼠的脾并将其用于杂交瘤的制备。
2)-3杂交瘤的制备
用PEG4000(购自IBL(Immuno-Biological Laboratories，Co.，Ltd.))进行脾细胞和小鼠骨髓瘤P3X63Ag8U.1细胞之间的细胞融合以制备杂交瘤。所得杂交瘤的培养上清液用于筛选产生抗EPHA2抗体的杂交瘤。
2)-4抗体筛选
2)-4-1表达编码抗原的基因的细胞的制备
将293T细胞按5×104细胞/cm2接种于包被了I型胶原的培养瓶(购自IWAKI)上并在37℃下，5％CO2中在含10％FBS的DMEM中培养过夜。次日，用Lipofectamine 2000(购自Invitrogen公司)将pcDNA-DEST40-EPHA2或作为对照的pcDNA-DEST40-ERBB2转染至293T细胞中并在37℃下，5％CO2中再次培养过夜。次日，用胰蛋白酶处理经转染的293T细胞，接着用含10％FBS的DMEM洗涤并随后悬浮于含5％FBS的PBS中。所得的细胞悬液将用于细胞ELISA和流式细胞术分析。
2)-4-2细胞ELISA
将第2)-4-1节中制得的细胞悬液离心并除去上清液。随后，通过加入杂交瘤培养上清液分别使表达EPHA2的293T细胞和表达ERBB2的293T细胞悬浮，并在4℃下孵育1小时。用含5％FBS的PBS洗涤各孔内细胞两次。然后，通过加入用含5％FBS的PBS稀释500倍的过氧化物酶缀合的羊抗鼠IgG(购自Millipore(Chemicon)，#AP181P)使所述细胞悬浮，并在4℃下孵育1小时。用含5％FBS的PBS洗涤孔内细胞两次。然后，将OPD显色液(OPDColor Developing Solution)(将邻苯二胺盐酸盐(购自Wako PureChemical Industries，Ltd.)和H2O2分别以0.4mg/ml和0.6％(v/v)的浓度溶解于OPD溶液(0.05M柠檬酸三钠、0.1M十二水合磷酸氢二钠，pH 4.5)中)以100μl/孔加入。通过搅拌进行显色反应并通过以100μl/孔加入1M HCl终止反应。通过离心沉淀细胞，接着将上清液转移至新的96孔板平底微量培养板中。用酶标仪(ARVO，PerkinElmer)检测490nm处的吸光度。为了选出产生能特异性结合细胞膜表面上表达的EPHA2的抗体的杂交瘤，选定如下杂交瘤为产抗EPHA2抗体呈阳性：所述杂交瘤产生的培养上清液在表达EPHA2的293T细胞中比在表达ERBB2的293T细胞(对照)中表现出更高的吸光度。
2)-4-3流式细胞术分析
为了消除细胞ELISA中的假阳性，通过流式细胞术，针对在细胞ELISA中测定为阳性的杂交瘤所产生的抗体对EPHA2结合的特异性，进一步地对它们进行检测。将第2)-4-1节中制得的细胞悬液离心并除去上清液。然后通过加入杂交瘤培养上清液分别使表达EPHA2的293T细胞和表达ERBB2的293T细胞悬浮，并在4℃下孵育1小时。用含5％FBS的PBS洗涤孔内细胞两次。然后，通过加入用含5％FBS的PBS稀释了1000倍的“荧光素缀合的抗鼠IgG的羊IgG片段”(Whole Molecule)(购自ICN Pharmaceuticals，Inc.，#55493)，并在4℃下孵育1小时。用含5％FBS的PBS洗涤所述细胞两次并随后重悬浮于含5％FBS并另外含有2μg/ml 7-氨基放线菌素D(购自Invitrogen公司(Molecular Probes))的PBS中，随后用流式细胞仪(FC500，Beckman Coulter，Inc.)分析。用Flowjo(TreeStar，Inc.)分析数据。用门排除7-氨基放线菌素D阳性的死细胞。然后作出活细胞的FITC荧光强度的直方图。若得到的杂交瘤在表达EPHA2的293T细胞的荧光强度直方图中比在作为对照的表达ERBB2的293T细胞的荧光强度强直方图中所提供的荧光强度更强，则所述杂交瘤作为产生抗EPHA2抗体的杂交瘤。
2)-5杂交瘤分离成单克隆
用ClonaCell-HY选择培养基D(购自StemCell Technologies，#03804)稀释产生抗EPHA2抗体的杂交瘤并培养，收集所形成的集落作为单克隆。按第2)-4-3节的相同方法用培养上清液分别培养收集的克隆并检测其对EPHA2的结合活性，以建立产生抗EPHA2单克隆抗体(SH348-1、SH357-1、Ab57-1、Ab65-1、Ab96-1、Ab100-1、Ab105-1、Ab106-13、Ab136-1、Ab148-1、Ab151-4、Ab230-1、Ab373-1和Ab382-1)的杂交瘤。
2)-6单克隆抗体对癌细胞系的结合活性的确证
第2)-5节中所得单克隆抗体是否结合高度表达EPHA2的癌细胞通过第2)-4-3节中方法相同的流式细胞术来研究。用人乳腺癌细胞系(MDA-MB-231)、人肺癌细胞系(A549)和人前列腺癌细胞系(PC-3)代替所述已转染的293T细胞。结果，确证所有已建立的单克隆抗体与这些癌细胞系结合。
2)-7单克隆抗体同种型的确定
用鼠单克隆同种型试剂盒(Mouse monoclonal isotyping kit)(购自AbD Serotec)检测单克隆抗体的同种型。结果显示，所述同种型为IgG1(Ab57-1和Ab230-1)、IgG2a(SH348-1、SH357-1、Ab65-1、Ab96-1、Ab100-1、Ab136-1、Ab148-1和Ab151-4)和IgG2b(Ab105-1、Ab106-13、Ab373-1和Ab382-1)。
2)-8单克隆抗体的制备
从移植了杂交瘤的小鼠的腹水或杂交瘤培养上清液(下文称作“用于抗体纯化的来源”)中纯化单克隆抗体。
小鼠腹水制备如下：首先，用降植烷(pristane)(购自Sigma-Aldrich，Inc.)处理7-8周龄的BALB/cAJcl-nu/nu小鼠(CLEAJapan，Inc.)。约3周后，以1×107细胞/每只小鼠的量向腹膜内移植用盐水洗涤的杂交瘤。1-2周后，收集腹膜腔中累积的腹水，将其通过0.22-μm的滤器除菌并用作抗体纯化的来源。
用CELLine(购自BD Biosciences)制备杂交瘤的培养上清液。依照生产商的说明书培养杂交瘤，除了将ClonaCell-HY GrowthMedium E(购自StemCell Technologies，#03805)用作培养基之外。将收集的培养上清液通过0.45-μm滤器过滤并用作抗体纯化的来源。
用含固定在Formyl-Cellulofine(购自Seikagaku公司)上的重组蛋白A rPA50(Recombinant Protein A rPA50)(购自RepliGen公司)(在下文简称为″Formyl-Cellulofine Protein A″)或HiTrap MabSelectSuRe(购自GE Healthcare Bio-Sciences公司)的亲和柱纯化抗体。对于Formyl-Cellulofine Protein A，用结合缓冲液(Binding Buffer)(3MNaCl，1.5M甘氨酸，pH 8.9)将用于抗体纯化的来源稀释三倍并上柱，然后用结合缓冲液洗涤，接着用pH 4.0的0.1M柠檬酸洗脱。另一方面，对于HiTrap MabSelect SuRe，将用于抗体纯化的来源上柱，随后用PBS洗涤，接着用pH 4.0的2M精氨酸-HCl洗脱。中和含抗体的洗脱液，并随后用PBS代替缓冲液。
通过将与POROS G 20μm Column，PEEK，4.6mm×100mm，1.7ml(Applied Biosystems)结合的抗体洗脱并检测洗脱液吸光度(O.D.280nm)来确定抗体浓度。具体而言，将用PBS稀释的抗体样品上样至用平衡缓冲液(Equilibrating Buffer)(30.6mM十二水合磷酸二氢钠，19.5mM磷酸二氢钾，0.15M NaCl，pH 7.0)平衡的POROS G20μm中。用平衡缓冲液洗柱，接着将与柱结合的抗体用洗脱液(0.1％(v/v)HCl，0.15M NaCl)洗脱。检测洗脱液的吸光度(O.D.280nm)的峰面积并依照以下等式计算浓度：
抗体样品的浓度(mg/ml)＝(抗体样品的峰面积)/(标准品(人IgG1)的峰面积)×标准品的浓度(mg/ml)×稀释倍数。
此外，所得抗体中所含内毒素的浓度用Endospecy ES-50M Set(Seikagaku公司，#020150)和Endotoxin Standard CSE-L Set(Seikagaku公司，#020055)检测并且确保在1EU/mg以下。所得抗体用于后续实验。
(实施例3)SH348-1和SH357-1的性质
3)-1针对抗EPHA2抗体诱导EPHA2酪氨酸残基的磷酸化的活性和其诱导降低EPHA2蛋白水平的活性的研究
3)-1-1抗体刺激的细胞裂解液的制备
将悬浮于含10％FBS、50个单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素的RPMI1640(在下文简称为“含10％FBS的RPMI1640(含抗生素)”)中的MDA-MB-231细胞按6×105细胞/孔接种于6孔板上并在37℃下，5％CO2中培养过夜。次日，弃去培养基并向其加入RPMI1640。将细胞于37℃下，5％CO2下再培养过夜。次日，将SH348-1、SH357-1、作为同种型对照抗体的鼠IgG2A同种型对照(在下文的描述和附图中，简称为“mIgG2a”；购自R&D Systems，Inc.，#MAB003)、作为可溶性EPHA2配体的重组小鼠Ephrin-A1/Fc嵌合体(在下文的描述和附图中，简称为″Ephrin-A1/Fc″；购自R&D Systems，Inc.，#602-A1-200)和作为可溶性配体的对照蛋白的重组人IgG1Fc(在下文的描述和附图中，简称为″hG1Fc″；购自R&D Systems，Inc.，#110-HG-100)分别用RPMI1640按图1或2中所示浓度(SH348-1、SH357-1和mIgG2a：在图1A中按10μg/ml或50μg/ml，而在图2A中按50μg/ml，Ephrin-A1/Fc和hG1Fc：图1和图2中按1μg/ml)稀释。在弃去培养基后将所得溶液加入MDA-MB-231细胞中并37℃下，5％CO2中温育预定时间。此外，在交联抗体存在下的实验中，sH348-1、SH357-1或mIgG2a和羊抗鼠的IgG，Fcγ片段特异性(min X Hu，Bov，Hrs Sr Prot)(购自Jackson ImmunoResearchLaboratories，Inc.，#115-005-071)作为交联抗体按浓度各为10μg/ml或50μg/ml(图1B)和50μg/ml(图2B)混合于RPMI1640中。弃去培养基后将所得溶液加入MDA-MB-231细胞中，并在37℃下，5％CO2中培养预定时间。在预定时间之后，除去上清液，通过加入含1mM PMSF(购自Sigma-Aldrich，Inc.)的1×细胞裂解缓冲液(购自Cell Signaling Technology，Inc.)使细胞裂解并在15000rpm离心5分钟。将细胞裂解物的上清液用作免疫沉淀和蛋白印迹的样品。用BCA Protein Assay Reagent(购自PIERCE)测量样品的蛋白浓度。
3)-1-2鉴定诱导EPHA2酪氨酸残基的磷酸化的活性
为了使EPHA2免疫沉淀，首先将8μg抗Eck/EphA2的clone D7(在下面的描述和附图中简称为″抗EPHA2抗体(D7)″；购自Millipore(Upstate)，#05-480)按每个样品加入25μl含Protein G磁珠(购自NEW ENGLAND BioLabs，Inc.)的混悬液中，并在4℃下将混合物颠倒混合2小时。
接着，向其加入终浓度10％的FBS并在4℃下再将混合物颠倒混合30分钟。用含1mM PMSF的1×细胞裂解缓冲液洗涤珠粒三次。然后向其加入200μg第3)-1-1节中制备的细胞裂解液上清液，并在4℃下将混合物颠倒混合过夜。次日，用含1mM PMSF的1×细胞裂解缓冲液洗涤珠粒三次。随后将SDS-样品缓冲液(56.3mM Tris-HCl，pH 6.8，1.8％(w/v)SDS，9％甘油，0.72M 2-巯基乙醇，0.045mg/ml溴酚蓝)加入珠粒中，并将混合物在98℃下加热5分钟。从珠粒中解离的蛋白通过SDS-PAGE分离。
为进行蛋白印迹，将蛋白从凝胶上转移至聚偏二氟乙烯膜(在下文简称为“PVDF膜”；孔径为0.45μm；购自Millipore)上。转膜后，将PVDF膜在封闭液(Blocking Solution)(将一袋Block Ace粉末(购自Dainippon Sumitomo Pharma Co.，Ltd.(Snow Brand MilkProducts Co.，Ltd.)溶解于100ml超纯水中，向其加入终浓度分别为0.1％(v/v)和0.02％(w/v)的吐温20和叠氮钠)中振荡来封闭。首先，为了检测免疫沉淀的EPHA2，将如上封闭的PVDF膜浸入用封闭液稀释至0.25μg/ml的抗EPHA2抗体(D7)溶液中，并在室温下振荡1小时。用TBST(50mM Tris-HCl，pH 8.0，138mM NaCl，2.7mMKCl，0.1％(v/v)吐温20)洗涤PVDF膜10分钟三次。接着，将PVDF膜浸入用TBST稀释了3000倍的抗鼠Ig，HRP-Linked Whole AbSheep(购自GE Healthcare Bio-Sciences公司)的溶液中并在室温下振荡30分钟。再用TBST洗涤PVDF膜三次，每次10分钟。然后用ECL Plus(购自GE Healthcare Bio-Sciences公司)检测胶片上化学发光的信号。
接下来，为了去除这些PVDF膜上的抗体，将PVDF膜浸入剥离液(Stripping Solution)(50mM Tris-HCl，pH 6.8，2％(w/v)SDS，100mM 2-巯基乙醇)中并在55℃下振荡30分钟。随后将PVDF膜浸入猝灭液(Quenching Solution)(含1％(v/v)H2O2和0.1％(w/v)NaN3的TBST)中，然后在室温下振荡20分钟，再用TBST洗涤三次，每次10分钟。为了检测EPHA2酪氨酸残基的磷酸化情况，通过在无叠氮钠的封闭液(将一袋Block Ace粉末溶解于100ml超纯水中，向其加入终浓度为0.1％(v/v)的吐温20)中振荡来封闭PVDF膜。然后将PVDF膜浸入用无叠氮钠的封闭液稀释了10000倍的抗磷酸酪氨酸重组4G10 HRP缀合物(Anti-Phosphotyrosine，recombinant 4G10HRP-conjugate)(在附图中简称为“4G10抗体”；购自Millipore(Upstate)，#16-184)的溶液中，并在室温下振荡1小时。用TBST洗涤PVDF膜三次，每次10分钟，并随后再用水洗涤三次，每次5分钟。用ECL Plus检测胶片上化学发光的信号。
结果显示，通过加入可溶性配体Ephrin-A1/Fc，EPHA2酪氨酸残基在10分钟内被磷酸化。相比之下，当加入10μg/ml或50μg/ml浓度的抗体SH348-1和SH357-1时，在预定时间(10分钟、30分钟和60分钟)内完全观察不到配体对EPHA2酪氨酸残基的磷酸化的诱导作用(图1A)。同样地，即使在交联抗体存在的情况下，在SH348-1和SH357-1存在下观察不到配体对EPHA2酪氨酸残基的磷酸化的诱导作用(图1B)。
3)-1-3诱导降低EPHA2蛋白水平的活性的鉴定
将第3)-1-1节中制备的10μg细胞裂解物的上清液通过SDS-PAGE分离。然后将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上并用抗EPHA2抗体(D7)和作为样品蛋白水平的对照的单克隆抗β肌动蛋白克隆AC-15(在下面的描述和附图中，简称为“抗β肌动蛋白抗体”；购自Sigma-Aldrich，Inc.，#A-5441)进行蛋白印迹。具体而言，转膜后，通过在封闭液中振荡来封闭PVDF膜并随后以分子量70kDa附近为中心用刀片将膜切成两段。将含70kDa以上蛋白的PVDF膜浸于用封闭液稀释至0.25μg/ml的抗EPHA2抗体(D7)溶液中，而将含70kDa以下蛋白的PVDF膜浸于用封闭液稀释1000倍的抗β肌动蛋白抗体的溶液中。每张PVDF膜在室温下振荡1小时。每张PVDF膜用TBST洗涤三次，每次10分钟。接着，将每张PVDF膜浸于用TBST稀释了3000倍的抗鼠Ig，HRP-Linked Whole AbSheep的溶液中，并在室温下振荡30分钟。各张PVDF膜用TBST洗涤三次，每次10分钟。然后用ECL Plus和NightOWL LB983(Berthold Technologies GmBH & Co.KG)检测信号。用针对Windows的Gel-Pro Analyzer 4.5版(注册商标；Media Cybernetics，Inc.)对条带的信号强度定量。
结果显示，通过加入可溶性配体Ephrin-A1/Fc，观察到EPHA2蛋白水平显著减少(图2A和2B)。在存在和不存在交联抗体的情况下观察到通过加入抗体SH348-1使EPHA2蛋白水平减少，尽管比配体的活性弱(图2A和2B)。另一方面，在抗体SH357-1中，无论存在或不存在交联抗体下，都观察到EPHA2的蛋白水平几乎没有变化(图2A和2B)。
为了分析在加入SH348-124小时后EPHA2的蛋白水平，计算三次实验结果中的平均值(EPHA2带的信号强度/β肌动蛋白带的信号强度)并用未补充配体/抗体的样品校正所述平均值。结果显示，当将加入mIgG2a 24小时后的值定义为100％时，在交联抗体不存在下SH348-1加入24小时后的值为70％，而在交联抗体存在下所述值为69％。
3)-2ADCC活性
3)-2-1效应细胞的制备
在无菌条件下从CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj裸鼠(Charles RiverLaboratories Japan，Inc.)中收集脾。用两个载玻片将收集的脾磨匀并用BD Pharm Lyse(购自BD Biosciences，#555899)使血细胞溶解。将所得脾细胞悬浮于含10％胎牛血清和Ultra-low IgG(购自Invitrogen公司)的无红酚RPMI1640(购自Invitrogen公司)(在下文简称为“针对ADCC的培养基”)中并通过细胞过滤网(孔径40μm；购自BD Biosciences)。然后通过锥虫蓝排斥试验对活细胞计数。将脾细胞悬液离心，然后去除培养基。将细胞以活细胞密度为1.5×107个细胞/ml重悬浮于针对ADCC的培养基中并用作效应细胞。
3)-2-2靶细胞的制备
用胰蛋白酶处理MDA-MB-231、A549或PC-3细胞。用含10％FBS的RPMI1640洗涤细胞并随后重悬浮于含10％FBS的RPMI1640中。用通过0.22-μm滤器除菌的铬-51(5550kBq)混合每种细胞(4×106个细胞)，并在对以上细胞标记后在37℃下，5％CO2中放置1小时。用针对ADCC的培养基洗涤已标记的细胞三次，并以2×105个细胞/ml的浓度重悬浮于针对ADCC的培养基中以制备靶细胞。
3)-2-351Cr释放试验
将靶细胞(2×105细胞/ml)按50μl/孔分配至96孔U形底微量培养板中。向其中加入50μl用针对ADCC的培养基稀释至2.5μg/ml(按加入效应细胞后的终浓度)的SH348-1、SH357-1或同种型对照抗体(mIgG2a)并在4℃下孵育1小时。向其中加入100μl效应细胞(1.5×107细胞/ml)并在37℃下，5％CO2中温育过夜。次日，将上清液收集至LumaPlate(购自PerkinElmer)中。用γ计数器测量所释放γ射线的剂量。由ADCC活性导致的细胞裂解率依照以下等式计算：
细胞裂解率(％)＝(A-B)/(C-B)×100
A：样品孔中的计数
B：自发释放计数(未补充抗体/效应细胞的孔)的平均值(n＝3)。
分别加入50μl和100μl针对ADCC的培养基代替抗体和效应细胞。其它过程按样品孔的相同方法进行。
C：最大释放计数(含溶解于去污剂的靶细胞的孔)的平均值(n＝3)。加入50μl针对ADCC的培养基代替抗体，并加入100μl含2％(v/v)Triton-X100的针对ADCC的培养基代替效应细胞。其它过程按样品孔的相同方法进行。
图3显示了三次实验的平均值，其中误差线表示标准差，P值由学生t检验(Student′s t-test)计算。结果显示，抗体SH348-1对MDA-MB-231细胞(图3A)、A549细胞(图3B)和PC-3细胞(图3C)表现出的细胞溶解活性分别为8.2％、9.1％和4.7％。抗体SH357-1对MDA-MB-231细胞(图3A)、A549细胞(图3B)和PC-3细胞(图3C)表现出的细胞溶解活性分别为8.8％、13.0％和9.0％。这些结果证明所述两种抗体具有对MDA-MB-231细胞、A549细胞和PC-3细胞的ADCC活性。
3)-3CDC活性
将悬浮于含10％FBS的RPMI1640(含抗生素)中的MDA-MB-231、A549或PC-3细胞按5000个细胞/孔接种于96孔微量培养板中并在37℃下，5％CO2中培养过夜。次日，向其加入用含10％FBS的RPMI1640(含抗生素)稀释至25μg/ml(按加入补体后的终浓度)的SH348-1、SH357-1或同种型对照抗体(mIgG2a)并在4℃下温育1小时。向其加入用RPMI 1640稀释至30％、终浓度为5％的兔的补体(购自CEDARLANE，#CL3051)，然后在37℃下，5％CO2中温育1小时，在室温下再静置30分钟。为了检测细胞存活率，加入与培养液相同量的CellTiter-Glo Luminescent Cell ViabilityAssay(购自Promega公司)，并在室温下搅拌混合物10分钟。然后用酶标仪检测发出光的量。依照以下等式计算细胞存活率：
细胞存活率(％)＝(a-b)/(c-b)×100
a：样品孔发出光的量
b：作为本底(未添加细胞/抗体的孔)发出光的量的平均值(n＝8)。加入与细胞悬液等量的含10％FBS的RPMI1640(含抗生素)代替接种的细胞，并加入与抗体稀释液等量的含10％FBS的RPMI1640(含抗生素)来代替抗体。其它过程按样品孔的相同方式进行。
c：未补充抗体的孔中发出光的量的平均值(n＝3)。加入与抗体稀释液等量的含10％FBS的RPMI1640(含抗生素)代替抗体。其它过程按样品孔的相同方式进行。
图4显示了三次实验的平均值，其中误差线表示标准差，P值由学生t检验计算。结果显示，在补体存在的情况下，抗体SH348-1引起MDA-MB-231细胞(图4A)、A549细胞(图4B)和PC-3细胞(图4C)的细胞存活率分别减少44％、31％和41％。在补体存在的情况下，抗体SH357-1也引起MDA-MB-231细胞(图4D)、A549细胞(图4E)和PC-3细胞(图4F)的细胞存活率分别减少65％、60％和65％。这些结果证明所述两种抗体具有对MDA-MB-231细胞、A549细胞和PC-3细胞的CDC活性。
3)-4表位的确定
3)-4-1截短的EPHA2多肽(rFnIII-NC、rFnIII-N和rFnIII-C)的制备
用第1)-1-3节制备的表达质粒分别转化大肠杆菌BL21和大肠杆菌Origami(DE3)(购自Novagen)，并培养在补充有50μg/ml氨苄青霉素(购自Sigma-Aldrich，Inc.)的LB培养基中。对于BL21，使用Autoinduction System(购自Novagen)诱导截短的EPHA2多肽的表达，而对于Origami(DE3)，则加入0.5mM IPTG。通过在6000rpm离心20分钟收集细菌细胞，然后悬浮于均质缓冲液(50mM TrisHCl，pH 7.5，150mM NaCl，0.1％(v/v)Triton-X100，10％(v/v)甘油)中，接着在冰上超声。上清液通过在14000rpm离心15分钟收集并上样至0.5ml Ni-NTA(购自Invitrogen公司)中。用洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5，150mM NaCl，50mM咪唑，10％(v/v)甘油)洗涤Ni-NTA，随后用洗脱缓冲液(50mM Tris HCl，pH 7.5，150mMNaCl，400mM咪唑，10％(v/v)甘油)洗脱。将洗脱下来的样品进一步地通过用PBS作为溶剂的凝胶过滤柱层析(Superdex 75 10/300；购自GE Healthcare Bio-Sciences公司)纯化。用Protein Assay(购自Bio-Rad Laboratories，Inc)测量所得重组蛋白的蛋白浓度。
3)-4-2EPHB2胞外区多肽(rEPHB2-ECD)的制备
为表达EPHB2-ECD，用293fectin将pcDNA3.1-EphA2-ECD转染至FreeStyle 293-F细胞中并在37℃下，8％CO2中培养72小时。培养后，通过离心收集培养液并用作纯化rEPHB2-ECD的来源。所得培养上清液用具有分子截留15000的透析管对pH 7.5的20mM Tris-HCl进行透析，然后通过滤器(0.45μm，PES)过滤，接着上样至用pH 7.5的20mM Tris-HCl平衡的HiPrep 16/10Q XL中。洗脱用线性浓度梯度的NaCl(20mM Tris-HCl、0-1M NaCl)进行。通过SDS-PAGE分离洗脱部分的等分试样。然后，凝胶用CBB染色以确证存在含rEPHB2-ECD的部分。接着，合并含rEPHB2-ECD的部分并上样至用PBS平衡的HiLoad 26/60 Superdex 200pg中。在用PBS洗脱后，通过SDS-PAGE分离洗脱部分的等分试样。然后，凝胶用CBB染色以确证存在含rEPHB2-ECD的部分。合并含rEPHB2-ECD的部分并用作用于确定表位的抗原。用BCA ProteinAssay Reagent测定蛋白浓度。
3)-4-3通过ELISA确定抗原的结合位点
将rEPHA2-ECD、rFnIII-NC、rFnIII-N、rFnIII-C或对照蛋白rEPHB2-ECD用PBS稀释至1μg/ml，然后按100μl/孔分配至免疫微量板(immunoplate)(购自Nunc，#442404)上，并在4℃下孵育过夜从而使蛋白吸附在板上。次日，去除孔内溶液，并将用PBS稀释4倍的Block Ace溶液(一袋Block Ace粉末溶于100ml的超纯水中)按200μl/孔分配至各孔中并在室温下孵育1小时。去除孔内溶液，按50μl/孔加入用稀释缓冲液(Diluting Buffer)(PBS，0.05％(v/v)Tween 20)稀释至5μg/ml的SH348-1、SH357-1或同种型对照抗体(mIgG2a)。在室温下孵育板1小时。然后，去除孔内溶液并用稀释缓冲液洗涤各孔两次。按50μl/孔加入用稀释缓冲液稀释了3000倍的过氧化物酶缀合的羊抗鼠IgG并在室温下孵育1小时。去除孔内溶液并用稀释缓冲液洗涤各孔两次。接着，通过以100μl/孔加入OPD显色液并搅拌进行显色反应。显色后，通过加入100μl/孔的1M HCl终止显色反应。用酶标仪测量490nm处的吸光度。
图5A显示了EPHA2域的结构预测(NCBI CDD 2.11版、CBSTMHMM Server 2.0版)以及EPHA2-ECD、FnIII-NC、FnIII-N和FnIII-C在EPHA2中的位置。配体-BD表示配体结合域，FN3表示纤连蛋白III型结构域，TM表示跨膜区，Trk激酶表示酪氨酸激酶结构域，SAM表示SAM域。
制备了EPHA2胞外区(EPHA2-ECD)的重组蛋白、含两个纤连蛋白III型结构域区(FnIII-NC)的重组蛋白、含N端纤连蛋白III型结构域区(FnIII-N)的重组蛋白和含C端纤连蛋白III型结构域区(FnIII-C)的重组蛋白并研究它们对SH348-1和SH357-1的结合活性。结果显示，所述抗体SH348-1和SH357-1表示出对rEPHA2-ECD、rFnIII-NC和rFnIII-C的结合活性(图5B)。因此，抗体SH348-1和SH357-1显示与含有C端纤连蛋白III型结构域的第426-534位氨基酸区域(由序列表中SEQ ID NO：8的第426-534位氨基酸序列表示的氨基酸序列)结合。
(实施例4)体内抗肿瘤效果
通过胰蛋白酶处理使MDA-MB-231细胞从培养瓶剥离并接着悬浮于含10％FBS的RPMI1640(含抗生素)中。离心后去除上清液。细胞用与如上相同的培养基洗涤两次，然后悬浮于BD MatrigelBasement Membrane Matrix(购自BD Biosciences)中并按5×106个细胞/每只小鼠的浓度皮下移植至6周龄的BALB/cAJcl-nu/nu((CLEAJapan，Inc.)的背部。当将移植当天定为第0天时，在第9、16、23和30天腹膜内给予剂量为500μg/只小鼠的SH348-1或SH357-1。腹膜内给予与所述抗体的体积相等的PBS(500μl)作对照。在第9、13、16、20、23、28、30、34和37天测量肿瘤体积，研究给予抗体所致的抗肿瘤效果。结果显示，与PBS给药组相比，SH348-1和SH357-1给药组中肿瘤的生长明显受到抑制(与在第37天的PBS给药组的肿瘤体积相比，SH348-1-和SH357-1的P值均为P＜0.001；P值由学生t检验计算)。此外，在第37天的肿瘤生长抑制率(＝100-(给予抗体组中肿瘤体积的平均值)/(给予PBS组中肿瘤体积的平均值)×100)方面，对于SH348-1为89.5％，而对于SH357-1为84.1％。在体内观察到它们很强的抗肿瘤效果(图6A和6B)。
在研究其对移植了MDA-MB-231细胞的小鼠的抗肿瘤效果的14种抗EPHA2的单克隆抗体中，仅抗体SH348-1和SH357-1与FnIII-C的结合显示为有效(表1)。
这些结果证明SH348-1和SH357-1为识别以往未报道的表位(由序列表中SEQ ID NO：8的第426-534位氨基酸表示的氨基酸序列)并表现出抗肿瘤效果的抗体。此外，SH348-1或SH357-1所结合的区域显示为作为靶向EPHA2的抗肿瘤单克隆抗体的有前景的靶标。
[表1]
表1
Figure GPA00001127700900621
(实施例5)SH348-1和SH357-1抗体基因的鉴定
为确定小鼠的抗人EPHA2抗体SH348-1和SH357-1的N端氨基酸序列的重链和轻链，通过SDS-PAGE分离含有第2)-8节中纯化的SH348-1或SH357-1的溶液的等分试样。将由此分离到的凝胶中的蛋白从凝胶转移至PVDF膜(孔径0.45μm；购自Invitrogen公司)上。用洗涤缓冲液(25mM NaCl、pH 8.0的10mM硼酸钠缓冲液)洗涤PVDF膜，接着通过浸入染色液(50％甲醇、20％乙酸、0.05％考马斯亮蓝)中染色5分钟，随后用90％甲醇脱色。将在PVDF膜上看到的重链和轻链相应的条带部分(重链：流动性较小的条带；轻链：流动性较大的条带)切出，尝试用自动化的Edman法(参见Edman，P.等.(1967)Eur.J.Biochem.1，80)并用Procise(注册商标)cLC Protein Sequencer Model 492cLC(Applied Biosystems)鉴定其各自的N端氨基酸序列。对于SH348-1的重链，所述方法不能鉴定其氨基酸序列。因此，用Pfu焦谷氨酰氨肽酶(Pfu PyroglutamateAminopeptidase)(购自TAKARA BIO INC.)去除N端的焦谷氨酸，随后进行上述相同的方法以鉴定从N端第二个氨基酸开始的氨基酸序列。
结果显示，SH348-1重链相应条带的氨基酸序列(开始自N端的第二个氨基酸)为：
I-Q-L-V-Q-S-G-P(序列表中SEQ ID NO：26)。
SH348-1轻链相应条带的N端氨基酸序列为
D-V-L-M-T-Q-S-P-L-S-L(序列表中SEQ ID NO：27)。
SH357-1重链相应条带的N端氨基酸序列为
Q-I-Q-L-V-Q-S-G-P(序列表中SEQ ID NO：28)。
SH357-1轻链相应条带的N端氨基酸序列为
D-V-L-M-T-Q-T-P-L-S-L-P-V-S-L-G-D-Q-A(序列表中SEQ IDNO：29)。
将这些氨基酸序列与Kabat等制作的抗体氨基酸序列数据库(参见Kabat，E.A.等，(1991)在Sequences of Proteins ofImmunologicalInterest第I和II卷中，U.S.Department of Health andHuman Services)比较。结果显示，SH348-1重链的亚型(γ2a链)是混杂型，轻链的亚型是κ轻链II。此外，SH357-1重链的亚型(γ2a链)确定为混杂型，轻链的亚型确定为κ轻链II。
因此，合成以下寡核苷酸引物，其分别与属于这些小鼠亚型的抗体基因编码区的5’-端区及其3’-端区(含终止密码子)杂交(参见Kabat等，ibid；Matti Kartinen等.(1988)25，859-865和Heinrich，G.等.(1984)J.Exp.Med.159，p.417-435)：
5′-cagatccagttggtgcagtctggacct-3′(DB3F1：序列表SEQ ID No.30)
5′-aagatatctcatttacccggagtccgggagaa-3′(MIG2AEVR1：序列表SEQ ID No.31)
5′-aagaattcatgaagttgcctgttagg-3′(MK19EIF1：序列表SEQ ID No.32)
5′-aagatatcttaacactcattcctgttgaagct-3′(KEVR1：序列表SEQ IDNo.33)
为了克隆编码SH348-1和SH357-1重链和轻链的cDNA，用Quick Prep mRNA纯化试剂盒(购自GE Healthcare Bio-Sciences公司，#27-9254-01)从产生SH348-1或SH357-1的杂交瘤中制得mRNA。用TaKaRa一步RNA PCR试剂盒(TaKaRa One Step RNAPCR Kit(AMV)(购自TAKARA BIO INC.，#RR024A))并使用针对重链的引物组(DB3F1和MIG2AEVR1的组合)或针对轻链的引物组(MK19EIF1和KEVR1的组合)由所得到的各mRNA扩增编码各抗体的重链或轻链的cDNA。通过PCR扩增的这些cDNA用Zero BluntTOPO PCR Cloning Kit(购自Invitrogen公司)克隆。使用基因序列分析仪(″ABI PRISM 3700DNA Analyzer；Applied Biosystems″或″Applied Biosystems 3730xl Analyzer；Applied Biosystems″)测定克隆的重链和轻链各自的核苷酸序列。在测序反应中，使用GeneAmp9700(Applied Biosystems)。
已测定的编码SH348-1重链的cDNA的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO：34表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：35表示。编码SH348-1轻链的cDNA的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO：36表示，其氨基酸序列由序列表中SEQ ID NO：37表示。编码SH357-1重链的cDNA的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO：38表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：39表示。编码SH357-1轻链的cDNA的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO：40表示，其氨基酸序列由SEQ IDNO：41表示。以下序列是来源于引物的序列：由SEQ ID NO：34的第1-27位和第1327-1350位核苷酸表示的序列、由SEQ ID NO：36的第637-660位核苷酸表示的序列、由SEQ ID NO：38的第1-27位和第1327-1350位核苷酸表示的序列和由SEQ ID NO：40的第637-660位核苷酸表示的序列。
此外，这些重链和轻链的氨基酸序列通过与Kabat等制作的氨基酸序列数据库(参见Kabat，E.A.等.(1991)在″免疫相关蛋白的序列(Sequence of Proteins of Immunological Interest)第I和II卷″中；U.S.Department of Health and Human Services)比较来分析。结果显示，SH348-1重链具有作为可变区的由序列表中SEQ ID NO：35的第1-119位氨基酸表示的氨基酸序列，并且具有作为恒定区的SEQID NO：35的第120-449位氨基酸表示的氨基酸序列。此外，SH348-1轻链显示出具有作为可变区的由序列表中SEQ ID NO：37的第1-112位氨基酸表示的氨基酸序列，并且具有作为恒定区的SEQ IDNO：37的第113-219位氨基酸表示的氨基酸序列。
SH357-1重链显示出具有作为可变区的由序列表中SEQ ID NO：39的第1-119位氨基酸表示的氨基酸序列，并且具有作为恒定区的由SEQ ID NO：39的第120-449位氨基酸表示的氨基酸序列。此外，SH357-1轻链显示出具有作为可变区的由序列表中SEQ ID NO：41的第1-112位氨基酸表示的氨基酸序列，并且具有作为恒定区的由SEQ ID NO：41的第113-219位氨基酸表示的氨基酸序列。
编码SH348-1重链可变区的核苷酸序列由序列表中SEQ IDNO：42表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：43表示。编码SH348-1重链恒定区的核苷酸序列由SEQ ID NO：44表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：45表示。编码SH348-1轻链可变区的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO：46表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：47表示。编码SH348-1轻链恒定区的核苷酸序列由SEQ ID NO：48表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：49表示。以下序列为来源于引物的序列：由SEQ ID NO：42的第1-27位核苷酸表示的序列、由SEQ ID NO：44的第970-993位核苷酸表示的序列和由SEQ ID NO：48的第301-324位核苷酸表示的序列。
此外，编码SH357-1重链可变区的核苷酸序列由序列表中SEQID NO：50表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：51表示。编码SH357-1重链恒定区的核苷酸序列由SEQ ID NO：52表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：53表示。编码SH357-1轻链可变区的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO：54表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：55表示。编码SH357-1轻链恒定区的核苷酸序列由SEQ ID NO：56表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：57表示。以下序列为来源于引物的序列：由SEQ ID NO：50的第1-27位核苷酸表示的序列、由SEQ ID NO：52的第970-993位核苷酸表示的序列和由SEQ ID NO：56的第301-324位核苷酸表示的序列。
此外，上述重链和轻链可变区的各氨基酸序列中CDR的位置和序列通过与Kabat等制作的抗体氨基酸序列数据库(参见Kabat，E.A.等.(1991)ibid)同源性比较来分析并确定。依照该文献，若不同的抗体为相同的亚类，则这些抗体具有彼此氨基酸长度几乎相等的构架区并且观察到可变区的氨基酸序列具有共同性。另一方面，CDR是位于这些构架区侧翼的特定序列。因此，重链和轻链的氨基酸序列通过与其相同亚类的序列比较来进行分析。结果显示，确定SH348-1重链的CDR具有由序列表中SEQ ID NO：35的第26-35位氨基酸表示的氨基酸序列(CDRH1)、由SEQ ID NO：35的第50-66位氨基酸表示的氨基酸序列(CDRH2)和由SEQ ID NO：35的第99-108位氨基酸表示的氨基酸序列(CDRH3)。确定SH348-1轻链的CDR具有由序列表中SEQ ID NO：37的第24-39位氨基酸表示的氨基酸序列(CDRL1)、由SEQ ID NO：37的第55-61位氨基酸表示的氨基酸序列(CDRL2)和由SEQ ID NO：37的第94-102位氨基酸表示的氨基酸序列(CDRL3)。确定SH357-1重链的CDR具有由序列表中SEQ ID NO：39的第26-35位氨基酸表示的氨基酸序列(CDRH1)、由SEQ ID NO：39的第50-66位氨基酸表示的氨基酸序列(CDRH2)和由SEQ ID NO：39的第99-108位氨基酸表示的氨基酸序列(CDRH3)。确定SH357-1轻链的CDR具有由序列表中SEQ ID NO：41的第24-39位氨基酸表示的氨基酸序列(CDRL1)、其第55-61位氨基酸序列(CDRL2)和其第94-102位氨基酸序列(CDRL3)。
编码SH348-1CDRH1的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO：58表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：59表示。编码SH348-1CDRH2的核苷酸序列由SEQ ID NO：60表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：61表示。编码SH348-1CDRH3的核苷酸序列由SEQ ID NO：62表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：63表示。编码SH348-1CDRL1的核苷酸序列由SEQ ID NO：64表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：65表示。编码SH348-1CDRL2的核苷酸序列由SEQ ID NO：66表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：67表示。编码SH348-1CDRL3的核苷酸序列SEQ ID NO：68表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：69表示。此外，编码SH357-1CDRH1的核苷酸序列由SEQ ID NO：70表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：71表示。编码SH357-1CDRH2的核苷酸序列由SEQ ID NO：72表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：73表示。编码SH357-1CDRH3的核苷酸序列由序列表中SEQ IDNO：74表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：75表示。编码SH357-1CDRL1的核苷酸序列由SEQ ID NO：76表示，其氨基酸序列由SEQID NO：77表示。编码SH357-1CDRL2的核苷酸序列由SEQ ID NO：78表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：79表示。编码SH357-1CDRL3的核苷酸序列由SEQ ID NO：80表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：81表示。
(实施例6)抗EPHA2抗体与EPHA2胞外区的结合活性
将用PBS溶液稀释至1μg/ml的EPHA2胞外区多肽(购自R&DSystems，Inc.，#3035-A2-100)或作为对照的牛血清白蛋白(在下文的描述和附图中简称为″BSA″)的溶液按100μl/孔分配至免疫微量板(购自Nunc，#442404)上，并在4℃下孵育过夜，以使蛋白吸附在平板上。
次日，去除孔内溶液，将Block Ace溶液(将一袋Block Ace粉末(购自Dainippon Sumitomo Pharma Co.，Ltd.(Show Brand MilkProducts Co.，Ltd.))溶解于100ml超纯水中)用PBS稀释4倍后以200μl/孔分配，并在室温下温育1小时。各孔用稀释缓冲液(PBS，0.05％(v/v)Tween 20)洗涤两次。接着，用PBS分别稀释SH348-1、SH357-1和Ab96-1至浓度为1.25×10-4μg/ml、1.25×10-3μg/ml、1.25×10-2μg/ml、1.25×10-1μg/ml、1.25μg/ml、12.5μg/ml或125μg/ml，并将所得溶液以100μl/孔(含0.05％(v/v)(终浓度)的吐温20)加入。
在室温下温育平板1小时。然后，去除孔内溶液，各孔用稀释缓冲液洗涤两次。以100μl/孔加入用稀释缓冲液稀释了1000倍的过氧化物酶缀合的羊抗鼠IgG(购自Millipore(Chemicon)，#AP181P)，并在室温下温育1小时。去除各孔内液体，用稀释缓冲液洗涤各孔两次。然后按100μl/孔加入OPD显色液并搅拌进行显色反应。显色后，按100μl/孔加入1M HCl终止显色反应。用酶标仪测量490nm处的吸光度(图7)。
图7A)显示了SH348-1的结果，图7B)显示了SH357-1的结果，图7C)显示了A96-1的结果。在各图中，吸光度表示为平均值±标准差(n＝3)。较强的吸光度表示结合活性更强。如图所示，所有抗体SH348-1、SH357-1和Ab96-1均没有表现出对BSA的亲和力，证明它们特异性结合EPHA2胞外区。
(实施例7)抗EPHA2抗体对配体结合的影响
依照实施例6中所述方法制备固定了EPHA2胞外区多肽(购自R&D Systems，Inc.，#3035-A2-100)的免疫微量板。免疫微量板各孔用稀释缓冲液洗涤两次。然后按100μl/孔加入用稀释缓冲液稀释至10μg/ml或50μg/ml的SH348-1、SH357-1、Ab96-1或作为同种型对照抗体的鼠IgG2A同种型对照(在下面的描述和附图中，简称为″mIgG2a″；购自R&D Systems，Inc.，#MAB003)。在室温下温育板1小时。然后，按1μg/ml的终浓度加入作为可溶性配体的重组鼠Ephrin-A1/Fc嵌合体(在下面的描述和附图中，简称为″Ephrin-A1/Fc″；购自R&D Systems，Inc.，#602-A1-200)或作为可溶性配体的阴性对照蛋白的重组人IgG1 Fc(在下面的描述和附图中，简称为″hG1Fc″；购自R&D Systems，Inc.，#110-HG-100)，并在室温下温育1小时。
接下来，依照实施例6中所述方法，去除孔内溶液，并且用稀释缓冲液洗涤各孔。向其中加入Fcγ片段特异性过氧化物酶AffiniPure羊抗人IgG(Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Human IgGFcγFragment Specific)(Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.，#109-035-098)。用OPD显色液进行显色反应。用酶标仪测量490nm处的吸光度(图8)。
在图8中，吸光度表示为平均值±标准差(n＝3)。抗体Ab96-1甚至在10μg/ml的浓度也强烈抑制EPHA2配体ephrin-A1与EPHA2的结合。相比之下，抗体SH348-1和SH357-1即使在50μg/ml的浓度(Ab96-1浓度的五倍)下也不抑制Ephrin-A1/Fc与EPHA2的结合。这些结果证明抗体SH348-1和SH357-1不抑制Ephrin-A1/Fc与EPHA2的结合。
(实施例8)验证抗EPHA2抗体对ephrin-A1依赖的EPHA2酪氨酸残基磷酸化的抑制活性
8)-1细胞裂解液的制备
将悬浮于含10％FBS、50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素的RPMI1640(在下文简称为″含10％FBS的RPMI1640(含抗生素)″)的MDA-MB-231细胞按2.5×105个细胞/孔铺于12孔板中，并在37℃下，5％CO2中培养过夜。随后弃去各孔内培养基，并向其重新加入RPMI1640。将细胞在37℃下，5％CO2中再培养过夜。接着，去除各孔内培养基，向各孔中加入单独的RPMI1640或含浓度为10μg/ml或50μg/ml的抗体(mIgG2a、SH348-1或SH357-1)的RPMI1640，并在37℃下，5％CO2中预孵育1小时。
向由此预孵育的仅补充了RPMI1640的孔中加入含1/50体积的Ephrin-A1/Fc或hG1Fc(终浓度1μg/ml)或与此体积相同的RPMI1640(在图9中由(-)表示)。此外，向补充了mIgG2a、SH348-1或SH357-1的各孔中加入1/50体积的Ephrin-A1/Fc或hG1Fc(终浓度1μg/ml)。
将所述板在37℃下，5％CO2中另外孵育15分钟。弃上清液后，向其中加入含1mM PMSF(购自Sigma-Aldrich，Inc.)和蛋白酶抑制剂混合物(Protease Inhibitor Cocktail)(购自Sigma-Aldrich，Inc.，#P8340)的1×细胞裂解缓冲液(1×Cell Lysis Buffer)(购自CellSignaling Technology，Inc.)(以下简称为PPCLB)以裂解细胞。将裂解液在15000rpm下离心15分钟，并将所得上清液用作免疫沉淀的样品。用BCA Protein Assay Reagent(购自PIERCE)测量样品的蛋白浓度。
8)-2通过免疫沉淀检测EPHA2的磷酸化情况
将25μl蛋白G磁粒(购自NEW ENGLAND BioLabs，Inc.)和4μg的抗EphA2抗体(购自Santa Cruz Biotechnology，Inc.，#sc-924)的悬浮液加入各孔中，并在4℃下将混合液颠倒混合2小时。接着，向其加入终浓度为10％的FBS，并在4℃下将混合物再颠倒混合30分钟。随后，用PPCLB洗涤珠粒。接着，向其加入200μg第8)-1节中制备的细胞裂解液上清液，并在4℃下将混合物颠倒混合过夜。
次日，用PPCLB洗涤珠粒三次。然后向珠粒中加入SDS-样品缓冲液(56.3mM Tris-HCl，pH 6.8，1.8％(w/v)SDS，9％甘油，0.72M2-巯基乙醇，0.045mg/ml溴酚蓝)并将混合液在98℃加热5分钟。从珠粒中解离的蛋白通过SDS-PAGE分离。
将蛋白从凝胶上转移至PVDF膜(孔径0.45μm；购自Millipore)上。通过在无叠氮钠的封闭液(将一袋Block Ace粉末溶解于100ml超纯水中，然后向其加入终浓度为0.1％(v/v)的Tween 20)振荡来封闭PVDF膜。
为检测EPHA2酪氨酸残基的磷酸化情况，将PVDF膜浸入用无叠氮钠的封闭液稀释了10000倍的抗磷酸酪氨酸重组4G10HRP缀合物(购自Upstate，#16-184)溶液中，并在室温下反应1小时。用TBST(50mM Tris-HCl，pH 8.0的，138mM NaCl，2.7mM KCl，0.1％(v/v)Tween 20)洗涤PVDF膜三次，每次10分钟并接着用水洗三次，每次5分钟。然后用ECL Plus(购自GE Healthcare Bio-Sciences公司)检测胶片上化学发光的信号。
接着，为检测存在于PVDF膜上免疫沉淀的EPHA2，将已检测EPHA2酪氨酸残基的磷酸化情况后的PVDF膜浸入剥离液(50mM Tris-HCl，pH 6.8的，2％(w/v)SDS，100mM 2-巯基乙醇))中并在55℃下振荡30分钟。接着，将PVDF膜浸入猝灭溶液(含1％(v/v)H2O2和0.1％(w/v)NaN3的TBST)中并在室温下振荡20分钟以去除PVDF膜上的抗体。用TBST洗涤PVDF膜三次，每次10分钟，并在封闭液(将一袋Block Ace粉末溶解于100ml超纯水中，然后向其加入终浓度分别为0.1％(v/v)和0.02％(w/v)的Tween 20和叠氮钠)中封闭。然后将PVDF膜浸入用封闭液稀释了4000倍的抗EphA2抗体(购自Santa Cruz Biotechnology，Inc.，#sc-924)的溶液中并在室温下反应1小时。PVDF膜用TBST洗涤三次，每次10分钟。然后将PVDF膜浸入用TBST稀释10000倍的抗兔IgG，HRP连接的抗体(Anti-rabbit IgG，HRP-linked Antibody)(购自Cell SignalingTechnology，Inc.，#7074)的溶液中，并在室温下反应30分钟。然后用TBST洗涤该PVDF膜三次，每次10分钟。然后用ECL Plus检测胶片上化学发光的信号。
可溶性配体Ephrin-A1/Fc诱导的EPHA2酪氨酸残基的磷酸化不被同种型对照抗体mIgG2a抑制，但通过加入抗体SH348-1和SH357-1则呈剂量依赖性形式被抑制(图9)。
这些结果证明：抗体SH348-1和SH357-1不抑制配体Ephrin-A1与EPHA2的结合，并抑制了由所述配体诱导的EPHA2酪氮酸残基的磷酸化。
(实施例9)抗EPHA2抗体的表位鉴定
制备由图10所示的区域组成的EPHA2缺失突变体，并确定与SH348-1或SH357-1结合的区域。
9)-1EPHA2缺失突变体的制备
为使EPHA2的缺失突变体表达成N端添加有GST标签和His标签并且C端添加有S标签的蛋白，合成以下引物，并且将通过以下所示方法扩增的基因片段克隆至pET-49b(+)(购自Novagen)中：
5′-attaggatccgagcttccgtactgccagtgtc-3′(引物N1：SEQ ID No.82)
5′-attaggatccgccccccaaggtgaggct-3′(引物N2：SEQ ID No.83)
5′-attaggatccggtcacttaccgcaagaagggaga-3′(引物N3：SEQ ID No.84)
5′-attaggatccggtccaggtgcaggcactgacg-3′(引物N4：SEQ ID No.85)
5′-aattaagcttgccgccaatcaccgccaagtt-3′(引物C 1：SEQ ID No.86)
5′-aattaagcttgttgccagatccctccggggac-3′(引物C2：SEQ ID No.87)
5′-aattaagcttcaggtaggtggtgtctggg-3′(引物C3：SEQ ID No.88)
5′-aattaagcttctcgtacttccacactcggc-3′(引物C4：SEQ ID No.89)
用作为模板的pcDNA-DEST40-EPHA2和以下引物组通过PCR反应扩增以下各区：引物N1和C1用于由序列表中SEQ ID NO：8的第426-540位氨基酸表示的氨基酸序列组成的区域(下文称作″m1″)；引物N2和C2用于由SEQ ID NO：8的第426-534位氨基酸表示的氨基酸序列组成的区域(下文称作″m2″)；引物N1和C3用于由SEQ ID NO：8的第426-504位氨基酸表示的氨基酸序列组成的区域(下文称作″m3″)；引物N1和C4用于由SEQ ID NO：8的第426-470位氨基酸表示的氨基酸序列组成的区域(下文称作″m4″)；引物N2和C2用于由SEQ ID NO：8的第439-534位氨基酸表示的氨基酸序列组成的区域(下文称作″m5″)；引物N3和C2用于由SEQID NO：8的第471-534位氨基酸表示的氨基酸序列组成的区域(下文称作″m6″)；引物N4和C2用于由SEQ ID NO：8的第505-534位氨基酸表示的氨基酸序列组成的区域(下文称作″m7″)；引物N2和C3用于由SEQ ID NO：8的第439-504位氨基酸表示的氨基酸序列组成的区域(下文称作″m8″)，而引物N2和C4用于由SEQ ID NO：8的第439-470位氨基酸表示的氨基酸序列组成的区域(下文称作″m9″)。所得PCR产物用BamHI和HindIII切割并亚克隆至pET-49b(+)的BamHI/HindIII位点中。
9)-2EPHA2缺失突变体的表达
用第9)-1节构建的质粒DNA或作为阴性对照的pET-49b(+)转化大肠肝菌BL21(DE3)。将所得转化子培养于补充了30μg/ml卡那霉素(购自Invitrogen公司)的LB培养基中。用AutoinductionSystem(购自Novagen)诱导EPHA2缺失突变体的表达。通过离心收集细菌细胞并用PBS洗涤。然后，用含1mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物(购自Sigma-Aldrich，Inc.，#P8340)的2％SDS溶液裂解细菌细胞。通过离心收集上清液并用于表位的鉴定。
通过下述方法估计转化了pET-49b(+)的大肠杆菌的细菌细胞裂解液中表达的蛋白(由pET-49b(+)来源的GST标签、His标签和S标签和用于连接它们的接头部分组成，在以下说明及附图中，称作″Vec″)的表达水平。将表达Vec的细菌细胞裂解液的系列稀释液和6x His Protein Ladder(购自QIAGEN)的系列稀释液分别溶解于SDS样品缓冲液中并在98℃下加热5分钟。然后通过SDS-PAGE分离蛋白，并将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上。PVDF膜用含5％BSA的TBST封闭。然后将PVDF膜浸入用含5％BSA的TBST稀释了1000倍的五His HRP Conjugate(购自QIAGEN)溶液中并在室温下反应1小时。用TBST洗涤该PVDF膜三次，每次10分钟。然后用ECL Plus检测信号。比较表达Vec的细菌细胞裂解液的系列稀释液和6x His Protein Ladder的系列稀释液之间的信号强度，并从6x His Protein Ladder所含每条带的蛋白水平估计表达Vec的细菌细胞裂解液中所含Vec蛋白的浓度。将以下量的EPHA2缺失突变体用于后续的表位鉴定实验：所述量表现出的反应性与20ngVec在用S标签单克隆抗体(Novagen)的蛋白印迹中的反应性相当。
9)-3)表位鉴定
将含第9)-2节中制得的EPHA2缺失突变体的细胞裂解物溶解于SDS样品缓冲液中并在98℃下加热5分钟。所得样品通过SDS-PAGE分离，并将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上。转膜后，通过在封闭液(一袋Block Ace粉末溶解于100ml超纯水中，然后向其加入终浓度分别为0.1％(v/v)和0.02％(w/v)的Tween 20和叠氮钠)振荡封闭PVDF膜。随后，在4℃下将这些PVDF膜在含2μg/ml SH348-1或SH357-1的封闭液中反应过夜。用TBST洗涤这些PVDF膜三次，每次10分钟，并在室温下用TBST稀释了5000倍的Anti-Mouse Ig，HRP-Linked Whole Ab Sheep溶液中另外反应30分钟。随后，PVDF膜用TBST洗涤三次，每次10分钟。接着用ECL Plus检测胶片上化学发光的信号。
接下来，将PVDF膜浸入剥离液(50mM Tris-HCl，pH 6.8，2％(w/v)SDS，100mM 2-巯基乙醇)中并在55℃下振荡30分钟，随后用TBST洗涤三次，每次10分钟。将这些PVDF膜在封闭液中封闭并用TBST洗涤三次，每次10分钟。然后将PVDF膜浸入用TBST稀释了10000倍的S标签单克隆抗体溶液中并在室温下反应30分钟。用TBST洗涤PVDF膜三次，每次10分钟。随后将PVDF膜浸入用TBST稀释了5000倍的Anti-Mouse Ig，HRP-Linked WholeAb Sheep溶液中并在室温下反应30分钟。接着，用TBST洗涤PVDF膜三次，每次10分钟。接着用ECL Plus检测胶片上化学发光的信号。
结果显示，抗体SH348-1(图11A)和SH357-1(图11C)两者仅对m1、m2和m5表现出结合活性。此外，在该方法中，EPHA2的缺失突变体在每张PVDF膜上存在量基本恒定(SH348-1：图11B，SH357-1：图11D)。这些结果证明抗体SH348-1和SH357-1结合EPHA2氨基酸序列中的由序列表中SEQ ID NO：8的第439-534位氨基酸表示的氨基酸序列组成的区域。
(实施例10)人源化抗体的设计
10)-1SH348-1人源化抗体的设计
10)-1-1SH348-1可变区的分子模型
SH348-1可变区的分子模型根据同源建模(Methods inEnzymology，203，121-153，(1991))进行。将登记在蛋白数据库(Protein Data Bank)(Nuc.Acid Res.35，D301-D303(2007))中人免疫球蛋白可变区的一级序列(可用来源于X射线晶体结构的三维结构)与实施例5中确定的SH348-1可变区对比。结果显示，2JEL和1A4J分别被选为与SH348-1轻链或重链的可变区同源性最高的序列。构架区的三维结构基于“构架模型”制作，所述“构架模型”通过结合对应于SH348-1轻链和重链的2JEL和1A4J的坐标而得到。按照Thornton等的分类法(J.Mol.Biol.，263，800-815，(1996))，SH348-1的CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1和CDRH2分别指定为以下簇：16A、7A、9A、10A和10A。按照H3-规则(FEBS letters 399，1-8(1996))CDRH3归类为e(9)D。由此，每个CDR的典型构象都被引入构架模型中。
最后，从能量方面考虑，为了得到SH348-1可变区可能的分子模型，进行排除不利的原子间接触的能量计算。用市售的三维蛋白结构预测程序Prime和坐标搜索程序MacroModel(
Figure GPA00001127700900761
LLC)进行这些方法。
10)-1-2人源化SH348-1的氨基酸序列的设计
依照CDR移植(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，10029-10033(1989))构建人源化SH348-1的抗体。基于构架区内氨基酸的同源性选择受体抗体。将SH348-1构架区的序列与Kabat Database(Nuc.Acid Res.29，205-206(2001))中登记的涉及抗体氨基酸序列的所有人构架区的序列比较。选定GSD2B5B10′CL抗体作为受体，因为他们的构架区之间的序列同源性最高(72％)。将GSD2B5B10′CL构架区的氨基酸残基与SH348-1中相应的氨基酸残基比对，以确定在两者间使用不同氨基酸的位置。使用由此构建的SH348-1的三维模型分析这些残基的位置。然后，按照Queen等提供的标准(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，10029-10033(1989))选定向受体移植的供体残基。通过将某些选定的供体残基转移至受体抗体GSD2B5B10′CL中来确定人源化的SH348-1序列。结果显示，如下所示得到两类轻链和两类重链的人源化序列。在下文中，基于Kabat等制作的抗体氨基酸序列数据库对可变区、恒定区和CDR分类。
10-1-3)SH348-1轻链的人源化
10-1-3-1)hSH348-T1L型轻链：
如下设计人源化SH348-1的轻链并将其命名为“hSH348-T1L型轻链”：将序列表中SEQ ID NO：37所示SH348-1的轻链可变区中第2(缬氨酸)、3(亮氨酸)、14(丝氨酸)、15(亮氨酸)、17(天冬氨酸)、18(谷氨酰胺)、50(赖氨酸)、79(精氨酸)、88(亮氨酸)、105(甘氨酸)、109(亮氨酸)和114(丙氨酸)位氨基酸分别用以下氨基酸取代：异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸和苏氨酸。
编码hSH348-T1L型轻链的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO：90表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：91表示。由SEQ ID NO：90的第1-60位核苷酸表示的核苷酸序列为分泌信号序列。由SEQ IDNO：90的第61-402位核苷酸表示的核苷酸序列为可变区。由SEQID NO：90的第403-717位核苷酸表示的核苷酸序列为恒定区。由SEQ ID NO：90的第130-177位核苷酸表示的核苷酸序列为CDRL1。由SEQ ID NO：90的第223-243位核苷酸表示的核苷酸序列为CDRL2。由SEQ ID NO：90的第340-363位核苷酸表示的核苷酸序列为CDRL3。
由序列表中SEQ ID NO：91的第1-20位氨基酸表示的氨基酸序列为分泌信号序列。由SEQ ID NO：91的第21-134位氨基酸表示的氨基酸序列为可变区。由SEQ ID NO：91的第135-239位氨基酸表示的氨基酸序列为恒定区。由SEQ ID NO：91的第44-59位氨基酸表示的氨基酸序列为CDRL1。由SEQ ID NO：91的第75-81位氨基酸表示的氨基酸序列为CDRL2。由SEQ ID NO：91的第114-121位氨基酸表示的氨基酸序列为CDRL3。
此外，编码hSH-348-T1L型轻链CDRL1的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO：92表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：93表示；CDRL2的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO：94表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：95表示；CDRL3的核苷酸序列由序列表中SEQ IDNO：96表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：97表示。
10-1-3-2)hSH348-T3L型轻链：
如下设计人源化SH348-1的轻链并将其命名为“hSH348-1-T3L型轻链”：将序列表中SEQ ID NO：37所示SH348-1轻链可变区中第14(丝氨酸)、15(亮氨酸)、17(天冬氨酸)、18(谷氨酰胺)、50(赖氨酸)、79(精氨酸)、88(亮氨酸)、105(甘氨酸)、109(亮氨酸)和114(丙氨酸)位氨基酸分别用以下氨基酸取代：苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸和苏氨酸。
编码hSH348-1-T3L型轻链的核苷酸序列由序列表中SEQ IDNO：98表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：99表示。由SEQ ID NO：98的第1-60位核苷酸表示的核苷酸序列为分泌信号序列。由SEQID NO：98的第61-402位核苷酸表示的核苷酸序列为可变区。由SEQ ID NO：98的第403-717位核苷酸表示的核苷酸序列为恒定区。由SEQ ID NO：98的第130-177位核苷酸表示的核苷酸序列为CDRL1。由SEQ ID NO：98的第223-243位核苷酸表示的核苷酸序列为CDRL2。由SEQ ID NO：98的第340-363位核苷酸表示的核苷酸序列为CDRL3。
由序列表中SEQ ID NO：99的第1-20位氨基酸表示的氨基酸序列为分泌信号序列。由SEQ ID NO：99的第21-134位氨基酸表示的氨基酸序列为可变区。由SEQ ID NO：99的第135-239位氨基酸表示的氨基酸序列为恒定区。由SEQ ID NO：99的第44-59位氨基酸表示的氨基酸序列为CDRL1。由SEQ ID NO：99的第75-81位氨基酸表示的氨基酸序列为CDRL2。由SEQ ID NO：99的第114-121位氨基酸表示的氨基酸序列为CDRL3。
此外，编码hSH348-1-T3L型轻链CDRL1的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO：100表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：101表示；CDRL2的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO：102表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：103表示；CDRL3的核苷酸序列由序列表中SEQID NO：104表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：105表示。
10-1-4)SH348-1重链的人源化
10-1-4-1)hSH348-1-T1H型重链：
如下设计人源化SH348-1的重链并将其命名为“hSH348-1-T1H型重链”：将序列表中SEQ ID NO：43所示的SH348-1重链可变区中第2(异亮氨酸)、9(脯氨酸)、11(亮氨酸)、16(谷氨酸)、17(苏氨酸)、20(异亮氨酸)、38(赖氨酸)、43(赖氨酸)、46(赖氨酸)、68(苯丙氨酸)、69(丙氨酸)、70(苯丙氨酸)、71(丝氨酸)、72(亮氨酸)、73(谷氨酸)、76(丙氨酸)、80(苯丙氨酸)、82(谷氨酰胺)、83(异亮氨酸)、84(天冬酰胺)、85(天冬酰胺)、87(赖氨酸)、88(天冬酰胺)、93(苏氨酸)、95(苯丙氨酸)、114(苏氨酸)和115(亮氨酸)位氨基酸分别用以下氨基酸取代：缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、丝氨酸、缬氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酸、亮氨酸、丝氨酸、丝氨酸、精氨酸、丝氨酸、缬氨酸、酪氨酸、亮氨酸和缬氨酸。
编码hSH348-T1H型重链的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO：106表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：107表示。由SEQ ID NO：106的第1-57位核苷酸表示的核苷酸序列为分泌信号序列。由SEQID NO：106的第58-414位核苷酸表示的核苷酸序列为可变区。由SEQ ID NO：106的第415-1404位核苷酸表示的核苷酸序列为恒定区。由SEQ ID NO：106的第148-162位核苷酸表示的核苷酸序列为CDRH1。由SEQ ID NO：106的第205-255位核苷酸表示的核苷酸序列为CDRH2。由SEQ ID NO：106的第352-381位核苷酸表示的核苷酸序列为CDRL3。
由序列表中SEQ ID NO：107的第1-19位氨基酸表示的氨基酸序列为分泌信号序列。由SEQ ID NO：107的第20-138位氨基酸表示的氨基酸序列为可变区。由SEQ ID NO：107的第139-468位氨基酸表示的氨基酸序列为恒定区。由SEQ ID NO：107的第50-54位氨基酸表示的氨基酸序列为CDRH1。由SEQ ID NO：107的第69-85位氨基酸表示的氨基酸序列为CDRH2。由SEQ ID NO：107的第118-127位氨基酸表示的氨基酸序列为CDRH3。
此外，编码hSH348-1-T1H型重链CDRH1的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO：108表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：109表示；CDRH2的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO：110表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：111表示；CDRH3的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO：112表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：113表示。
10-1-4-2)hSH348-1-T3H型重链：
如下设计人源化SH348-1的重链并将其命名为“hSH348-1-T3H型重链”：将序列表中SEQ ID NO：43所示的SH348-1重链可变结构域中第9(脯氨酸)、11(亮氨酸)、16(谷氨酸)、17(苏氨酸)、20(异亮氨酸)、38(赖氨酸)、43(赖氨酸)、73(谷氨酸)、76(丙氨酸)、80(苯丙氨酸)、82(谷氨酰胺)、83(异亮氨酸)、84(天冬酰胺)、85(天冬酰胺)、87(赖氨酸)、88(天冬酰胺)、93(苏氨酸)、95(苯丙氨酸)、114(苏氨酸)和115(亮氨酸)位氨基酸分别用以下氨基酸取代：丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、丝氨酸、缬氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酸、亮氨酸、丝氨酸、丝氨酸、精氨酸、丝氨酸、缬氨酸、酪氨酸、亮氨酸和缬氨酸。
编码hSH348-1-T3H型重链的核苷酸序列由序列表中SEQ IDNO：114表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：115表示。由SEQ ID NO：114的第1-57位核苷酸表示的核苷酸序列为分泌信号序列。由SEQID NO：114的第58-414位核苷酸表示的核苷酸序列为可变区。由SEQ ID NO：114的第415-1404位核苷酸表示的核苷酸序列为恒定区。由SEQ ID NO：114的第148-162位核苷酸表示的核苷酸序列为CDRH1。由SEQ ID NO：114的第205-255位核苷酸表示的核苷酸序列为CDRH2。由SEQ ID NO：114的第352-381位核苷酸表示的核苷酸序列为CDRL3。
由序列表中SEQ ID NO：115的第1-19位氨基酸表示的氨基酸序列为分泌信号序列。由SEQ ID NO：115的其第20-138位氨基酸表示的氨基酸序列为可变区。由SEQ ID NO：115的第139-468位氨基酸表示的氨基酸序列为恒定区。由SEQ ID NO：115的第50-54位氨基酸表示的氨基酸序列为CDRH1。由SEQ ID NO：115的第69-85位氨基酸表示的氨基酸序列为CDRH2。由SEQ ID NO：115的第118-127位氨基酸表示的氨基酸序列为CDRH3。
此外，编码hSH348-1-T3H型重链CDRH1的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO：116表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：117表示；CDRH2的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO：118表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：119表示；CDRH3的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO：120表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：121表示。
10)-2SH357-1的人源化抗体的设计
10)-2-1SH357-1可变区的分子模型
以如第10)-1-1节的相同方法选择2JEL和1A4J分别作为与SH357-1轻链和重链可变区同源性最高的序列。CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1和CDRH2分别指定为以下簇：16A、7A、9A、10A和10A，CDRH3归类为e(9)D。
10)-2-2人源化SH357-1的氨基酸序列的设计
以与第10)-1-2节相同的方法，选择GSD2B5B 10′CL抗体作为受体并确定人源化SH357-1的序列。结果得到如下所示的两类轻链和两类重链的人源化序列。
10-2-3)SH357-1轻链的人源化
10-2-3-1)hSH357-T1L型轻链：
如下设计人源化SH357-1轻链并命名为“hSH357-1-T1L型轻链”：将序列表中SEQ ID NO：41所示的SH357-1轻链中第2(缬氨酸)、3(亮氨酸)、7(苏氨酸)、14(丝氨酸)、15(亮氨酸)、17(天冬氨酸)、18(谷氨酰胺)、50(赖氨酸)、88(亮氨酸)、105(甘氨酸)、109(亮氨酸)和114(丙氨酸)位氨基酸分别用以下氨基酸取代：异亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸和苏氨酸。
编码hSH357-1-T1L型轻链的核苷酸序列由序列表中SEQ IDNO：122表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：123表示。由SEQ ID NO：122的第1-60位核苷酸表示的核苷酸序列为分泌信号序列。由SEQID NO：122的第61-402位核苷酸表示的核苷酸序列为可变区。由SEQ ID NO：122的第403-717位核苷酸表示的核苷酸序列为恒定区。由SEQ ID NO：122的第130-177位核苷酸表示的核苷酸序列为CDRL1。由其第223-243位核苷酸表示的核苷酸序列为CDRL2。由SEQ ID NO：122的第340-363位核苷酸表示的核苷酸序列为CDRL3。
由序列表中SEQ ID NO：123的第1-20位氨基酸表示的氨基酸序列为分泌信号序列。由SEQ ID NO：123的第21-134位氨基酸表示的氨基酸序列为可变区。由SEQ ID NO：123的第135-239位氨基酸表示的氨基酸序列为恒定区。由SEQ ID NO：123的第44-59位氨基酸表示的氨基酸序列为CDRL1。由SEQ ID NO：123的第75-81位氨基酸表示的氨基酸序列为CDRL2。由SEQ ID NO：123的第114-121位氨基酸表示的氨基酸序列为CDRL3。
此外，编码hSH357-1-T1L型轻链CDRL1的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO：124表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：125表示；CDRL2的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO：126表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：127表示；CDRL3的核苷酸序列由序列表中SEQID NO：128表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：129表示。
10-2-3-2)hSH357-1-T3L型轻链：
如下设计人源化SH357-1的轻链并将其命名为“hSH357-1-T3L型轻链”：将序列表中SEQ ID NO：41所示的SH357-1轻链中第7(苏氨酸)、14(丝氨酸)、15(亮氨酸)、17(天冬氨酸)、18(谷氨酰胺)、50(赖氨酸)、88(亮氨酸)、105(甘氨酸)、109(亮氨酸)和114(丙氨酸)位氨基酸分别用以下氨基酸取代：丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸和苏氨酸。
编码hSH357-1-T3L型轻链的核苷酸序列由序列表中SEQ IDNO：130表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：131表示。由SEQ ID NO：130的第1-60位核苷酸表示的核苷酸序列为分泌信号序列。由SEQID NO：130的第61-402位核苷酸表示的核苷酸序列为可变区。由SEQ ID NO：130的第403-717位核苷酸表示的核苷酸序列为恒定区。由SEQ ID NO：130的第130-177位核苷酸表示的核苷酸序列为CDRL1。由SEQ ID NO：130的第223-243位核苷酸表示的核苷酸序列为CDRL2。由SEQ ID NO：130的第340-363位核苷酸表示的核苷酸序列为CDRL3。
由序列表中SEQ ID NO：131的第1-20位氨基酸表示的氨基酸序列为分泌信号序列。由SEQ ID NO：131的第21-134位氨基酸表示的氨基酸序列为可变区。由SEQ ID NO：131的第135-239位氨基酸表示的氨基酸序列为恒定区。由SEQ ID NO：131的第44-59位氨基酸表示的氨基酸序列为CDRL1。由SEQ ID NO：131的第75-81位氨基酸表示的氨基酸序列为CDRL2。由SEQ ID NO：131的第114-121位氨基酸表示的氨基酸序列为CDRL3。
此外，编码hSH357-1-T3L型轻链CDRL1的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO：132表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：133表示；CDRL2的核苷酸序列由序列表的SEQ ID NO：134表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：135表示；CDRL3的核苷酸序列由序列表的SEQID NO：136表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：137表示。
10-2-4)SH357-1重链的人源化
10-2-4-1)hSH-357-1-T1H型重链：
如下设计人源化SH357-1重链并命名为“hSH357-1-T1H型重链”：将序列表中SEQ ID NO：51所示的SH357-1重链可变区中第2(异亮氨酸)、9(脯氨酸)、11(亮氨酸)、16(谷氨酸)、17(苏氨酸)、20(异亮氨酸)、38(赖氨酸)、43(赖氨酸)、46(赖氨酸)、68(苯丙氨酸)、69(丙氨酸)、70(苯丙氨酸)、71(丝氨酸)、72(亮氨酸)、73(谷氨酸)、76(丙氨酸)、82(谷氨酰胺)、83(异亮氨酸)、85(天冬酰胺)、87(赖氨酸)、88(天冬酰胺)、93(丝氨酸)、95(苯丙氨酸)、114(苏氨酸)和115(亮氨酸)位氨基酸分别用以下氨基酸取代：缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、亮氨酸、丝氨酸、精氨酸、丝氨酸、缬氨酸、酪氨酸、亮氨酸和缬氨酸。
编码hSH357-1-T1H型重链的核苷酸序列由序列表中SEQ IDNO：138表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：139表示。由SEQ ID NO：138的第1-57位核苷酸表示的核苷酸序列为分泌信号序列。由SEQID NO：138的第58-414位核苷酸表示的核苷酸序列为可变区。由SEQ ID NO：138的第415-1404位核苷酸表示的核苷酸序列为恒定区。由SEQ ID NO：138的第145-162位核苷酸表示的核苷酸序列为CDRH1。由SEQ ID NO：138的第205-255位核苷酸表示的核苷酸序列为CDRH2。由SEQ ID NO：138的第352-381位核苷酸表示的核苷酸序列为CDRL3。
由序列表中SEQ ID NO：139的第1-19位氨基酸表示的氨基酸序列为分泌信号序列。由SEQ ID NO：139的第20-138位氨基酸表示的氨基酸序列为可变区。由SEQ ID NO：139的第139-468位氨基酸表示的氨基酸序列为恒定区。由其第49-54位氨基酸表示的氨基酸序列为CDRH1。由SEQ ID NO：139的第69-85位氨基酸表示的氨基酸序列为CDRH2。由SEQ ID NO：139的第118-127位氨基酸表示的氨基酸序列为CDRH3。
此外，编码hSH357-1-T1H型重链CDRH1的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO：140表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：141表示；CDRH2的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO：142表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：143表示；CDRH3的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO：144表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：145表示。
10-2-4-2)hSH357-1-T3H-型重链：
如下设计人源化SH357-1重链并命名为“hSH357-1-T3H型重链”：将序列表中SEQ ID NO：51所示的SH357-1重链可变区中第9(脯氨酸)、11(亮氨酸)、16(谷氨酸)、17(苏氨酸)、20(异亮氨酸)、38(赖氨酸)、43(赖氨酸)、73(谷氨酸)、76(丙氨酸)、82(谷氨酰胺)、83(异亮氨酸)、85(天冬酰胺)、87(赖氨酸)、88(天冬酰胺)、93(丝氨酸)、95(苯丙氨酸)、114(苏氨酸)和115(亮氨酸)位氨基酸分别用以下氨基酸取代：丙氨酸、缬氨酸、丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、亮氨酸、丝氨酸、精氨酸、丝氨酸、缬氨酸、酪氨酸、亮氨酸和缬氨酸。
编码hSH357-1-T3H型重链的核苷酸序列由序列表中SEQ IDNO：146表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：147表示。由SEQ ID NO：146的第1-57位核苷酸表示的核苷酸序列为分泌信号序列。由SEQID NO：146的第58-414位核苷酸表示的核苷酸序列为可变区。由SEQ ID NO：146的第415-1404位核苷酸表示的核苷酸序列为恒定区。由SEQ ID NO：146的第145-162位核苷酸表示的核苷酸序列为CDRH1。由SEQ ID NO：146的第205-255位核苷酸表示的核苷酸序列为CDRH2。由SEQ ID NO：146的第352-381位核苷酸表示的核苷酸序列为CDRL3。
由序列表中SEQ ID NO：147的第1-19位氨基酸表示的氨基酸序列为分泌信号序列。由SEQ ID NO：147的第20-138位氨基酸表示的氨基酸序列为可变区。由SEQ ID NO：147的第139-468位氨基酸表示的氨基酸序列为恒定区。由SEQ ID NO：147的第49-54位氨基酸表示的氨基酸序列为CDRH1。由SEQ ID NO：147的第69-85位氨基酸表示的氨基酸序列为CDRH2。由SEQ ID NO：147的第118-127位氨基酸表示的氨基酸序列为CDRH3。
此外，编码hSH357-1-T3H型重链CDRH1的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO：148表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：149表示。CDRH2的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO：150表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：151表示；CDRH3的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO：152表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO：153表示。
(实施例11)人源化抗EPHA2抗体的制备
为检测人源化SH348-1和人源化SH357-1的活性，如下所示构建具有实施例10中得到的人源化抗EPHA2抗体的重链和轻链的质粒。
11)-1人源化抗EPHA2抗体表达载体的构建
11)-1-1多功能人源化抗体轻链的表达载体(pEF6/KCL)的制备
合成序列表中SEQ ID NO：154所述的编码人抗体轻链信号序列和人Ig轻链(κ链)恒定区的基因(Invitrogen公司；人工基因合成服务)并用限制性内切酶NheI和PmeI切割基因，将所切割的DNA片段插入pEF6/V5-HisB(Invitrogen公司)的NheI/PmeI位点中以构建多功能人源化抗体轻链表达载体(pEF6/KCL)。
11)-1-2多功能人源化抗体重链表达载体(pEF1/FCCU-1)的制备
合成序列表中SEQ ID NO：155所述的编码人抗体重链信号序列和人IgG1恒定区的基因(Invitrogen公司；人工基因合成服务)并用限制性内切酶NheI和PmeI切割所述基因，将所切割的DNA片段插入pEF1/myc-HisB载体(InVitrogen公司)的NheI/PmeI位点中，以构建多功能人源化抗体H链表达载体(p EF1/FCCU-1)。
11)-1-3hSH348-1-T1L型轻链和hSH348-1-T3L型轻链的表达载体
合成包含编码由序列表中SEQ ID NO：156和157表示的hSH348-1-T1L型轻链和hSH348-1-T3L型轻链可变区的基因并融合了分泌信号的各DNA(Invitrogen公司；人工基因合成服务)，并用限制性内切酶NdeI和BsiWI切割所述DNA。分别将所得DNA片段插入预先用限制性内切酶NdeI和BsiWI消化的用于人源化抗体轻链表达的多功能载体(pEF6/KCL)的位点中，从而构建出hSH348-1-T1L型轻链和hSH348-1-T3L型轻链的表达载体。所得表达载体分别命名为“pEF6/KCL/hSH348-1-T1L”和“pEF6/KCL/hSH348-1-T3L”。
11)-1-4hSH348-1-T1H型重链和hSH348-1-T3H型重链的表达载体的构建
合成包含编码由序列表中SEQ ID NO：158和159表示的hSH348-1-T1H型重链和hSH348-1-T3H型重链可变区的基因的各DNA(Invitrogen公司；人工基因合成服务)，并用限制性内切酶BlpI消化所述DNA。分别将所得DNA片段插入预先用限制性内切酶BlpI消化的用于人源化抗体H链表达的多功能载体(pEF1/FCCU-1)的位点中，从而构建出hSH348-1-T1H型重链和hSH348-1-T3H型重链的表达载体。所得表达载体分别命名为“pEF1/FCCU/hSH348-1-T1H”和“pEF1/FCCU/hSH348-1-T3H”。
11)-1-5hSH357-1-T1L型轻链和hSH357-1-T3L型轻链的表达载体的构建
合成包含编码分别由序列表中SEQ ID NO：160或161表示的hSH357-1-T1L型轻链和hSH357-1-T3L型轻链可变区的基因并融合了分泌信号的各DNA(Invitrogen公司；人工基因合成服务)，并将用限制性内切酶NdeI和BsiWI消化所述DNA，分别将所得DNA片段插入预先用限制性内切酶NdeI和BsiWI消化的用于人源化抗体L链表达的多功能载体(pEF6/KCL)的位点中，从而构建hSH357-1-T1L型轻链和hSH357-1-T3L型轻链的表达载体。所得表达载体分别命名为“pEF6/KCL/hSH357-1-T1L”和“pEF6/KCL/hSH357-1-T3L”。
11)-1-6hSH357-1-T1H型重链和hSH357-1-T3H型重链的表达载体的构建
合成包含编码分别由序列表中SEQ ID NO：162或163表示的hSH357-1-T1H型重链或hSH357-1-T3H型重链可变区的基因的各DNA(Invitrogen公司；人工基因合成服务)并用限制性内切酶BlpI消化DNA。分别将所得DNA片段插入预先用限制性内切酶BlpI消化的用于人源化抗体H链表达的多功能载体(pEF1/FCCU-1)的位点中，从而构建hSH357-1-T1H型重链和hSH357-1-T3H型重链的表达载体。所得表达载体分别命名为“pEF1/FCCU/hSH357-1-T1H”和“pEF1/FCCU/hSH357-1-T3H”。
11)-2人源化抗体的制备
将处于对数生长期的293FreeStyle细胞按1.2×109个细胞接种于1.2L新鲜FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen公司)中并在保温箱内在37℃下，8％CO2中振荡培养(125rpm)。将12mg的聚乙烯亚胺(Polyscience#24765)溶解于40mL的Opti-Pro SFM培养基(购自Invitrogen公司)中并在室温下放置5分钟。将用PureLink HiPurePlasmid试剂盒(Invitrogen公司)制得的H链表达质粒(0.6mg)和L链表达质粒(1.8mg)悬浮于40mL的Opti-Pro SFM培养基(Invitrogen公司)中。将40mL聚乙烯亚胺/OptiPro SFM的混合液在室温下放置5分钟，向其中加入40mL表达质粒/OptiPro SFM混合液中并在室温下再放置5分钟。然后，将80mL聚乙烯亚胺/表达质粒/OptiPro SFM的混合液加入293FreeStyle细胞悬液中，并持续振荡培养。在37℃下，8％CO2中培养7天后，收集培养上清液。
11)-3人源化抗体的纯化
将第11)-2节中所得培养上清液通过Disposable Capsule Filter(Advantec MFS Inc.，#CCS-045-E1H)过滤，并随后通过蛋白A亲和柱层析纯化。将培养上清液上样至用PBS平衡的MabSelect SuReHiTrap 1mL(购自GE Healthcare Bio-sciences公司)中，并用PBS洗涤。接下来，向其加入2M精氨酸溶液(pH 4.0)并收集含抗体的部分。调整pH至7并将含抗体的部分上样至预先用PBS平衡的HiPrep Desalting Column(26/10，50mL)(GE Healthcare Bio-sciences公司)中。在用PBS替换后，将含抗体的部分通过0.2-μm滤器以制得纯化样品。
通过洗脱与POROS G 20μm Column，PEEK，4.6mm×100mm，1.7ml(购自Applied Biosystems)结合的抗体并检测洗脱液的吸光度(O.D.280nm)以测定抗体的浓度，随后与标准品(人IgG1)比较峰面积。
通过将pEF6/KCL/hSH348-1-T1L与pEF1/FCCU/hSH348-1-T1H组合制得的人源化抗体SH348-1命名为″hSH348-1-T1″；而通过将pEF6/KCL/hSH348-1-T3L与pEF1/FCCU/hSH348-1-T3H组合制得的人源化抗体SH348-1命名为″hSH348-1-T3″。
此外，通过将pEF6/KCL/hSH357-1-T1L与pEF1/FCCU/hSH357-1-T1H组合制得的人源化抗体SH357-1命名为″hSH357-1-T1″；通过将pEF6/KCL/hSH357-1-T3L与pEF1/FCCU/hSH357-1-T3H组合制得的人源化抗体SH357-1命名为″hSH357-1-T3″。
(实施例12)人源化抗EPHA2抗体与抗原的结合活性的确定
依照实施例6中方法(除了使用Fcγ片段特异性过氧化物酶AffiniPure羊抗人IgG(购自Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.，#109-035-098)作为第二抗体之外)确定抗体hSH348-1-T1、hSH348-1-T3、hSH357-1-T1和hSH357-1-T3与抗原结合的能力。
在图12A)-12D)的图表中，吸光度表示为平均值±标准差(n＝3)。结果显示，人源化抗EPHA2抗体hSH348-1-T1、hSH348-1-T3、hSH357-1-T1和hSH357-1-T3均确定为具有与EPHA2胞外区的结合活性。
(实施例13)竞争性抑制SH348-1或SH357-1与EPHA2结合的活性的检测
hSH348-1-T1和hSH348-1-T3竞争性抑制SH348-1与EPHA2结合的活性以及hSH357-1-T1和hSH357-1-T3竞争性抑制SH357-1与EPHA2结合的活性通过下述方法检测。
用EZ-Link Sulfo-NHS-LC生物素化试剂盒(购自Thermo FisherScientific K.K.，#21435)，依照试剂盒中所含方案分别对鼠单克隆抗体SH348-1和SH357-1进行生物素化(在下文中生物素化的SH348-1和SH357-1分别称作″bSH348-1″和″bSH357-1″)。竞争性抑制实验中使用的bSH348-1、bSH357-1和未标记的抗体(SH348-1、SH357-1、hSH348-1-T1、hSH348-1-T3、hSH357-1-T1、hSH357-1-T3和Ab96-1)的浓度用BCA Protein Assay Reagent(购自PIERCE)检测。
用PBS将EPHA2胞外区多肽(购自R&D Systems，Inc.，#3035-A2-100)稀释至0.5μg/ml，然后按100μl/孔分配至免疫微量板(购自Nunc，#442404)上，并在4℃下孵育过夜，从而使蛋白吸附在所述板上。次日，用稀释缓冲液(PBS，0.05％(v/v)Tween 20)洗涤各孔一次。然后将用PBS稀释4倍的Block Ace溶液(将一袋BlockAce粉溶解于100ml超纯水中)以200μl/孔分配于各孔中，并在室温下温育4小时。去除各孔内溶液。然后，将生物素化的抗体(5μg/ml)与各个浓度(0μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml和125μg/ml)的未标记抗体(溶剂：含0.05％(v/v)(终浓度)Tween 20的PBS)分别以100μl/孔分配至各孔中，并在室温下温育1小时。用稀释缓冲液(PBS，0.05％(v/v)Tween 20)洗涤各孔两次。然后，以100μl/孔加入用稀释缓冲液稀释了500倍的链霉亲和素-辣根过氧化物酶缀合物(Streptavidin-horseradish Peroxidase Conjugate)(购自GE Healthcare Bio-Sciences公司，#RPN1231V)，并在室温下温育1小时。去除各孔内液体，用稀释缓冲液洗涤各孔两次。然后通过以100μl/孔加入OPD显色液并搅拌来进行显色反应。显色后，通过加入100μl/孔的1M HCl终止显色反应。用酶标仪检测490nm处的吸光度。
结果显示，补充了单独的bSH348-1或bSH357-1的各孔的吸光度分别为0.780±0.016和0.978±0.007(平均值±标准差(n＝3))。
在图13A)和13B)的图表中，吸光度表示为平均值±标准差(n＝3)。SH348-1或SH357-1对EPHA2的结合不被与其表位不同的Ab96-1所抑制。另一方面，结果显示，SH348-1对EPHA2的结合被抗体SH348-1本身或其人源化抗体hSH348-1-T1和hSH348-1-T3所抑制(图13A)。同样地，结果显示，SH357-1对EPHA2的结合被抗体SH357-1本身或其人源化抗体hSH357-1-T1和hSH357-1-T3所抑制(图13B)。
(实施例14)人源化抗EPHA2抗体对ephrin-A1依赖性EPHA2酪氨酸残基磷酸化的抑制作用
依照实施例8中所述方法，检测人源化抗EPHA2抗体抑制EPHA2酪氨酸残基的ephrin-A1依赖性磷酸化的能力。结果显示，所有抗体hSH348-1-T1、hSH348-1-T3、hSH357-1-T1和hSH357-1-T3均显示出保持抑制Ephrin-A1/Fc诱导的EPHA2酪氨酸残基的磷酸化的活性(图14)。
工业实用性
本发明的抗EPHA2抗体具有抗肿瘤活性。包含抗EPHA2抗体的药物组合物可用作抗癌药物。
序列表
<110>第一三共株式会社
 
<120>抗EPHA2抗体
 
<130>DSPCT-FP0831
 
<150>JP 2007-224007
<151>2007-08-30
 
<160>163
 
<170>PatentIn version 3.4
 
<210>1
<211>2931
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2931)
 
<400>1
atg gag ctc cag gca gcc cgc gcc tgc ttc gcc ctg ctg tgg ggc tgt     48
Met Glu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Cys Phe Ala Leu Leu Trp Gly Cys
1               5                   10                  15
gcg ctg gcc gcg gcc gcg gcg gcg cag ggc aag gaa gtg gta ctg ctg     96
Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln Gly Lys Glu Val Val Leu Leu
            20                  25                  30
gac ttt gct gca gct gga ggg gag ctc ggc tgg ctc aca cac ccg tat    144
Asp Phe Ala Ala Ala Gly Gly Glu Leu Gly Trp Leu Thr His Pro Tyr
        35                  40                  45
ggc aaa ggg tgg gac ctg atg cag aac atc atg aat gac atg ccg atc    192
Gly Lys Gly Trp Asp Leu Met Gln Asn Ile Met Asn Asp Met Pro Ile
    50                  55                  60
tac atg tac tcc gtg tgc aac gtg atg tct ggc gac cag gac aac tgg    240
Tyr Met Tyr Ser Val Cys Asn Val Met Ser Gly Asp Gln Asp Asn Trp
65                  70                  75                  80
ctc cgc acc aac tgg gtg tac cga gga gag gct gag cgt atc ttc att    288
Leu Arg Thr Asn Trp Val Tyr Arg Gly Glu Ala Glu Arg Ile Phe Ile
                85                  90                  95
gag ctc aag ttt act gta cgt gac tgc aac agc ttc cct ggt ggc gcc    336
Glu Leu Lys Phe Thr Val Arg Asp Cys Asn Ser Phe Pro Gly Gly Ala
            100                 105                 110
agc tcc tgc aag gag act ttc aac ctc tac tat gcc gag tcg gac ctg    384
Ser Ser Cys Lys Glu Thr Phe Asn Leu Tyr Tyr Ala Glu Ser Asp Leu
        115                 120                 125
gac tac ggc acc aac ttc cag aag cgc ctg ttc acc aag att gac acc    432
Asp Tyr Gly Thr Asn Phe Gln Lys Arg Leu Phe Thr Lys Ile Asp Thr
    130                 135                 140
att gcg ccc gat gag atc acc gtc agc agc gac ttc gag gca cgc cac    480
Ile Ala Pro Asp Glu Ile Thr Val Ser Ser Asp Phe Glu Ala Arg His
145                 150                 155                 160
gtg aag ctg aac gtg gag gag cgc tcc gtg ggg ccg ctc acc cgc aaa    528
Val Lys Leu Asn Val Glu Glu Arg Ser Val Gly Pro Leu Thr Arg Lys
                165                 170                 175
ggc ttc tac ctg gcc ttc cag gat atc ggt gcc tgt gtg gcg ctg ctc    576
Gly Phe Tyr Leu Ala Phe Gln Asp Ile Gly Ala Cys Val Ala Leu Leu
            180                 185                 190
tcc gtc cgt gtc tac tac aag aag tgc ccc gag ctg ctg cag ggc ctg    624
Ser Val Arg Val Tyr Tyr Lys Lys Cys Pro Glu Leu Leu Gln Gly Leu
        195                 200                 205
gcc cac ttc cct gag acc atc gcc ggc tct gat gca cct tcc ctg gcc    672
Ala His Phe Pro Glu Thr Ile Ala Gly Ser Asp Ala Pro Ser Leu Ala
    210                 215                 220
act gtg gcc ggc acc tgt gtg gac cat gcc gtg gtg cca ccg ggg ggt    720
Thr Val Ala Gly Thr Cys Val Asp His Ala Val Val Pro Pro Gly Gly
225                 230                 235                 240
gaa gag ccc cgt atg cac tgt gca gtg gat ggc gag tgg ctg gtg ccc    768
Glu Glu Pro Arg Met His Cys Ala Val Asp Gly Glu Trp Leu Val Pro
                245                 250                 255
att ggg cag tgc ctg tgc cag gca ggc tac gag aag gtg gag gat gcc    816
Ile Gly Gln Cys Leu Cys Gln Ala Gly Tyr Glu Lys Val Glu Asp Ala
            260                 265                 270
tgc cag gcc tgc tcg cct gga ttt ttt aag ttt gag gca tct gag agc    864
Cys Gln Ala Cys Ser Pro Gly Phe Phe Lys Phe Glu Ala Ser Glu Ser
        275                 280                 285
ccc tgc ttg gag tgc cct gag cac acg ctg cca tcc cct gag ggt gcc    912
Pro Cys Leu Glu Cys Pro Glu His Thr Leu Pro Ser Pro Glu Gly Ala
    290                 295                 300
acc tcc tgc gag tgt gag gaa ggc ttc ttc cgg gca cct cag gac cca     960
Thr Ser Cys Glu Cys Glu Glu Gly Phe Phe Arg Ala Pro Gln Asp Pro
305                 310                 315                 320
gcg tcg atg cct tgc aca cga ccc ccc tcc gcc cca cac tac ctc aca    1008
Ala Ser Met Pro Cys Thr Arg Pro Pro Ser Ala Pro His Tyr Leu Thr
                325                 330                 335
gcc gtg ggc atg ggt gcc aag gtg gag ctg cgc tgg acg ccc cct cag    1056
Ala Val Gly Met Gly Ala Lys Val Glu Leu Arg Trp Thr Pro Pro Gln
            340                 345                 350
gac agc ggg ggc cgc gag gac att gtc tac agc gtc acc tgc gaa cag    1104
Asp Ser Gly Gly Arg Glu Asp Ile Val Tyr Ser Val Thr Cys Glu Gln
        355                 360                 365
tgc tgg ccc gag tct ggg gaa tgc ggg ccg tgt gag gcc agt gtg cgc    1152
Cys Trp Pro Glu Ser Gly Glu Cys Gly Pro Cys Glu Ala Ser Val Arg
    370                 375                 380
tac tcg gag cct cct cac gga ctg acc cgc acc agt gtg aca gtg agc    1200
Tyr Ser Glu Pro Pro His Gly Leu Thr Arg Thr Ser Val Thr Val Ser
385                 390                 395                 400
gac ctg gag ccc cac atg aac tac acc ttc acc gtg gag gcc cgc aat    1248
Asp Leu Glu Pro His Met Asn Tyr Thr Phe Thr Val Glu Ala Arg Asn
                405                 410                 415
ggc gtc tca ggc ctg gta acc agc cgc agc ttc cgt act gcc agt gtc    1296
Gly Val Ser Gly Leu Val Thr Ser Arg Ser Phe Arg Thr Ala Ser Val
            420                 425                 430
agc atc aac cag aca gag ccc ccc aag gtg agg ctg gag ggc cgc agc    1344
Ser Ile Asn Gln Thr Glu Pro Pro Lys Val Arg Leu Glu Gly Arg Ser
        435                 440                 445
acc acc tcg ctt agc gtc tcc tgg agc atc ccc ccg ccg cag cag agc    1392
Thr Thr Ser Leu Ser Val Ser Trp Ser Ile Pro Pro Pro Gln Gln Ser
    450                 455                 460
cga gtg tgg aag tac gag gtc act tac cgc aag aag gga gac tcc aac    1440
Arg Val Trp Lys Tyr Glu Val Thr Tyr Arg Lys Lys Gly Asp Ser Asn
465                 470                 475                 480
agc tac aat gtg cgc cgc acc gag ggt ttc tcc gtg acc ctg gac gac    1488
Ser Tyr Asn Val Arg Arg Thr Glu Gly Phe Ser Val Thr Leu Asp Asp
                485                 490                 495
ctg gcc cca gac acc acc tac ctg gtc cag gtg cag gca ctg acg cag    1536
Leu Ala Pro Asp Thr Thr Tyr Leu Val Gln Val Gln Ala Leu Thr Gln
            500                 505                 510
gag ggc cag ggg gcc ggc agc aag gtg cac gaa ttc cag acg ctg tcc    1584
Glu Gly Gln Gly Ala Gly Ser Lys Val His Glu Phe Gln Thr Leu Ser
        515                 520                 525
ccg gag gga tct ggc aac ttg gcg gtg att ggc ggc gtg gct gtc ggt    1632
Pro Glu Gly Ser Gly Asn Leu Ala Val Ile Gly Gly Val Ala Val Gly
    530                 535                 540
gtg gtc ctg ctt ctg gtg ctg gca gga gtt ggc ttc ttt atc cac cgc    1680
Val Val Leu Leu Leu Val Leu Ala Gly Val Gly Phe Phe Ile His Arg
545                 550                 555                 560
agg agg aag aac cag cgt gcc cgc cag tcc ccg gag gac gtt tac ttc    1728
Arg Arg Lys Asn Gln Arg Ala Arg Gln Ser Pro Glu Asp Val Tyr Phe
                565                 570                 575
tcc aag tca gaa caa ctg aag ccc ctg aag aca tac gtg gac ccc cac    1776
Ser Lys Ser Glu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Thr Tyr Val Asp Pro His
            580                 585                 590
aca tat gag gac ccc aac cag gct gtg ttg aag ttc act acc gag atc    1824
Thr Tyr Glu Asp Pro Asn Gln Ala Val Leu Lys Phe Thr Thr Glu Ile
        595                 600                 605
cat cca tcc tgt gtc act cgg cag aag gtg atc gga gca gga gag ttt    1872
His Pro Ser Cys Val Thr Arg Gln Lys Val Ile Gly Ala Gly Glu Phe
    610                 615                 620
ggg gag gtg tac aag ggc atg ctg aag aca tcc tcg ggg aag aag gag    1920
Gly Glu Val Tyr Lys Gly Met Leu Lys Thr Ser Ser Gly Lys Lys Glu
625                 630                 635                 640
gtg ccg gtg gcc atc aag acg ctg aaa gcc ggc tac aca gag aag cag    1968
Val Pro Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys Ala Gly Tyr Thr Glu Lys Gln
                645                 650                 655
cga gtg gac ttc ctc ggc gag gcc ggc atc atg ggc cag ttc agc cac    2016
Arg Val Asp Phe Leu Gly Glu Ala Gly Ile Met Gly Gln Phe Ser His
            660                 665                 670
cac aac atc atc cgc cta gag ggc gtc atc tcc aaa tac aag ccc atg    2064
His Asn Ile Ile Arg Leu Glu Gly Val Ile Ser Lys Tyr Lys Pro Met
        675                 680                 685
atg atc atc act gag tac atg gag aat ggg gcc ctg gac aag ttc ctt    2112
Met Ile Ile Thr Glu Tyr Met Glu Asn Gly Ala Leu Asp Lys Phe Leu
    690                 695                 700
cgg gag aag gat ggc gag ttc agc gtg ctg cag ctg gtg ggc atg ctg    2160
Arg Glu Lys Asp Gly Glu Phe Ser Val Leu Gln Leu Val Gly Met Leu
705                 710                 715                 720
cgg ggc atc gca gct ggc atg aag tac ctg gcc aac atg aac tat gtg    2208
Arg Gly Ile Ala Ala Gly Met Lys Tyr Leu Ala Asn Met Asn Tyr Val
                725                 730                 735
cac cgt gac ctg gct gcc cgc aac atc ctc gtc aac agc aac ctg gtc    2256
His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Val Asn Ser Asn Leu Val
            740                 745                 750
tgc aag gtg tct gac ttt ggc ctg tcc cgc gtg ctg gag gac gac ccc    2304
Cys Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ser Arg Val Leu Glu Asp Asp Pro
        755                 760                 765
gag gcc acc tac acc acc agt ggc ggc aag atc ccc atc cgc tgg acc    2352
Glu Ala Thr Tyr Thr Thr Ser Gly Gly Lys Ile Pro Ile Arg Trp Thr
    770                 775                 780
gcc ccg gag gcc att tcc tac cgg aag ttc acc tct gcc agc gac gtg    2400
Ala Pro Glu Ala Ile Ser Tyr Arg Lys Phe Thr Ser Ala Ser Asp Val
785                 790                 795                 800
tgg agc ttt ggc att gtc atg tgg gag gtg atg acc tat ggc gag cgg    2448
Trp Ser Phe Gly Ile Val Met Trp Glu Val Met Thr Tyr Gly Glu Arg
                805                 810                 815
ccc tac tgg gag ttg tcc aac cac gag gtg atg aaa gcc atc aat gat    2496
Pro Tyr Trp Glu Leu Ser Asn His Glu Val Met Lys Ala Ile Asn Asp
            820                 825                 830
ggc ttc cgg ctc ccc aca ccc atg gac tgc ccc tcc gcc atc tac cag    2544
Gly Phe Arg Leu Pro Thr Pro Met Asp Cys Pro Ser Ala Ile Tyr Gln
        835                 840                 845
ctc atg atg cag tgc tgg cag cag gag cgt gcc cgc cgc ccc aag ttc    2592
Leu Met Met Gln Cys Trp Gln Gln Glu Arg Ala Arg Arg Pro Lys Phe
    850                 855                 860
gct gac atc gtc agc atc ctg gac aag ctc att cgt gcc cct gac tcc    2640
Ala Asp Ile Val Ser Ile Leu Asp Lys Leu Ile Arg Ala Pro Asp Ser
865                 870                 875                 880
ctc aag acc ctg gct gac ttt gac ccc cgc gtg tct atc cgg ctc ccc    2688
Leu Lys Thr Leu Ala Asp Phe Asp Pro Arg Val Ser Ile Arg Leu Pro
                885                 890                 895
agc acg agc ggc tcg gag ggg gtg ccc ttc cgc acg gtg tcc gag tgg    2736
Ser Thr Ser Gly Ser Glu Gly Val Pro Phe Arg Thr Val Ser Glu Trp
            900                 905                 910
ctg gag tcc atc aag atg cag cag tat acg gag cac ttc atg gcg gcc    2784
Leu Glu Ser Ile Lys Met Gln Gln Tyr Thr Glu His Phe Met Ala Ala
        915                 920                 925
ggc tac act gcc atc gag aag gtg gtg cag atg acc aac gac gac atc    2832
Gly Tyr Thr Ala Ile Glu Lys Val Val Gln Met Thr Asn Asp Asp Ile
    930                 935                 940
aag agg att ggg gtg cgg ctg ccc ggc cac cag aag cgc atc gcc tac    2880
Lys Arg Ile Gly Val Arg Leu Pro Gly His Gln Lys Arg Ile Ala Tyr
945                 950                 955                 960
agc ctg ctg gga ctc aag gac cag gtg aac act gtg ggg atc ccc atc    2928
Ser Leu Leu Gly Leu Lys Asp Gln Val Asn Thr Val Gly Ile Pro Ile
            965                 970                 975
tga                                                                2931
 
<210>2
<211>976
<212>PRT
<213>人
 
<400>2
 
Met Glu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Cys Phe Ala Leu Leu Trp Gly Cys
1               5                   10                  15
Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln Gly Lys Glu Val Val Leu Leu
            20                  25                  30
Asp Phe Ala Ala Ala Gly Gly Glu Leu Gly Trp Leu Thr His Pro Tyr
        35                  40                  45
Gly Lys Gly Trp Asp Leu Met Gln Asn Ile Met Asn Asp Met Pro Ile
    50                  55                  60
Tyr Met Tyr Ser Val Cys Asn Val Met Ser Gly Asp Gln Asp Asn Trp
65                  70                  75                  80
Leu Arg Thr Asn Trp Val Tyr Arg Gly Glu Ala Glu Arg Ile Phe Ile
                85                  90                  95
Glu Leu Lys Phe Thr Val Arg Asp Cys Asn Ser Phe Pro Gly Gly Ala
            100                 105                 110
Ser Ser Cys Lys Glu Thr Phe Asn Leu Tyr Tyr Ala Glu Ser Asp Leu
        115                 120                 125
Asp Tyr Gly Thr Asn Phe Gln Lys Arg Leu Phe Thr Lys Ile Asp Thr
    130                 135                 140
Ile Ala Pro Asp Glu Ile Thr Val Ser Ser Asp Phe Glu Ala Arg His
145                 150                 155                 160
Val Lys Leu Asn Val Glu Glu Arg Ser Val Gly Pro Leu Thr Arg Lys
                165                 170                 175
Gly Phe Tyr Leu Ala Phe Gln Asp Ile Gly Ala Cys Val Ala Leu Leu
            180                 185                 190
Ser Val Arg Val Tyr Tyr Lys Lys Cys Pro Glu Leu Leu Gln Gly Leu
        195                 200                 205
Ala His Phe Pro Glu Thr Ile Ala Gly Ser Asp Ala Pro Ser Leu Ala
    210                 215                 220
Thr Val Ala Gly Thr Cys Val Asp His Ala Val Val Pro Pro Gly Gly
225                 230                 235                 240
Glu Glu Pro Arg Met His Cys Ala Val Asp Gly Glu Trp Leu Val Pro
                245                 250                 255
Ile Gly Gln Cys Leu Cys Gln Ala Gly Tyr Glu Lys Val Glu Asp Ala
            260                 265                 270
Cys Gln Ala Cys Ser Pro Gly Phe Phe Lys Phe Glu Ala Ser Glu Ser
        275                 280                 285
Pro Cys Leu Glu Cys Pro Glu His Thr Leu Pro Ser Pro Glu Gly Ala
    290                 295                 300
Thr Ser Cys Glu Cys Glu Glu Gly Phe Phe Arg Ala Pro Gln Asp Pro
305                 310                 315                 320
Ala Ser Met Pro Cys Thr Arg Pro Pro Ser Ala Pro His Tyr Leu Thr
                325                 330                 335
Ala Val Gly Met Gly Ala Lys Val Glu Leu Arg Trp Thr Pro Pro Gln
            340                 345                 350
Asp Ser Gly Gly Arg Glu Asp Ile Val Tyr Ser Val Thr Cys Glu Gln
        355                 360                 365
Cys Trp Pro Glu Ser Gly Glu Cys Gly Pro Cys Glu Ala Ser Val Arg
    370                 375                 380
Tyr Ser Glu Pro Pro His Gly Leu Thr Arg Thr Ser Val Thr Val Ser
385                 390                 395                 400
Asp Leu Glu Pro His Met Asn Tyr Thr Phe Thr Val Glu Ala Arg Asn
                405                 410                 415
Gly Val Ser Gly Leu Val Thr Ser Arg Ser Phe Arg Thr Ala Ser Val
            420                 425                 430
Ser Ile Asn Gln Thr Glu Pro Pro Lys Val Arg Leu Glu Gly Arg Ser
        435                 440                 445
Thr Thr Ser Leu Ser Val Ser Trp Ser Ile Pro Pro Pro Gln Gln Ser
    450                 455                 460
Arg Val Trp Lys Tyr Glu Val Thr Tyr Arg Lys Lys Gly Asp Ser Asn
465                 470                 475                 480
Ser Tyr Asn Val Arg Arg Thr Glu Gly Phe Ser Val Thr Leu Asp Asp
                485                 490                 495
Leu Ala Pro Asp Thr Thr Tyr Leu Val Gln Val Gln Ala Leu Thr Gln
            500                 505                 510
Glu Gly Gln Gly Ala Gly Ser Lys Val His Glu Phe Gln Thr Leu Ser
        515                 520                 525
Pro Glu Gly Ser Gly Asn Leu Ala Val Ile Gly Gly Val Ala Val Gly
    530                 535                 540
Val Val Leu Leu Leu Val Leu Ala Gly Val Gly Phe Phe Ile His Arg
545                 550                 555                 560
Arg Arg Lys Asn Gln Arg Ala Arg Gln Ser Pro Glu Asp Val Tyr Phe
                565                 570                 575
Ser Lys Ser Glu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Thr Tyr Val Asp Pro His
            580                 585                 590
Thr Tyr Glu Asp Pro Asn Gln Ala Val Leu Lys Phe Thr Thr Glu Ile
        595                 600                 605
His Pro Ser Cys Val Thr Arg Gln Lys Val Ile Gly Ala Gly Glu Phe
    610                 615                 620
Gly Glu Val Tyr Lys Gly Met Leu Lys Thr Ser Ser Gly Lys Lys Glu
625                 630                 635                 640
Val Pro Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys Ala Gly Tyr Thr Glu Lys Gln
                645                 650                 655
Arg Val Asp Phe Leu Gly Glu Ala Gly Ile Met Gly Gln Phe Ser His
            660                 665                 670
His Asn Ile Ile Arg Leu Glu Gly Val Ile Ser Lys Tyr Lys Pro Met
         675                 680                 685
Met Ile Ile Thr Glu Tyr Met Glu Asn Gly Ala Leu Asp Lys Phe Leu
    690                 695                 700
Arg Glu Lys Asp Gly Glu Phe Ser Val Leu Gln Leu Val Gly Met Leu
705                 710                 715                 720
Arg Gly Ile Ala Ala Gly Met Lys Tyr Leu Ala Asn Met Asn Tyr Val
                725                 730                 735
His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Val Asn Ser Asn Leu Val
            740                 745                 750
Cys Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ser Arg Val Leu Glu Asp Asp Pro
        755                 760                 765
Glu Ala Thr Tyr Thr Thr Ser Gly Gly Lys Ile Pro Ile Arg Trp Thr
    770                 775                 780
Ala Pro Glu Ala Ile Ser Tyr Arg Lys Phe Thr Ser Ala Ser Asp Val
785                 790                 795                 800
Trp Ser Phe Gly Ile Val Met Trp Glu Val Met Thr Tyr Gly Glu Arg
                805                 810                 815
Pro Tyr Trp Glu Leu Ser Asn His Glu Val Met Lys Ala Ile Asn Asp
            820                 825                 830
Gly Phe Arg Leu Pro Thr Pro Met Asp Cys Pro Ser Ala Ile Tyr Gln
        835                 840                 845
Leu Met Met Gln Cys Trp Gln Gln Glu Arg Ala Arg Arg Pro Lys Phe
    850                 855                 860
Ala Asp Ile Val Ser Ile Leu Asp Lys Leu Ile Arg Ala Pro Asp Ser
865                 870                 875                 880
Leu Lys Thr Leu Ala Asp Phe Asp Pro Arg Val Ser Ile Arg Leu Pro
                885                 890                 895
Ser Thr Ser Gly Ser Glu Gly Val Pro Phe Arg Thr Val Ser Glu Trp
            900                 905                 910
Leu Glu Ser Ile Lys Met Gln Gln Tyr Thr Glu His Phe Met Ala Ala
        915                 920                 925
Gly Tyr Thr Ala Ile Glu Lys Val Val Gln Met Thr Asn Asp Asp Ile
    930                 935                 940
Lys Arg Ile Gly Val Arg Leu Pro Gly His Gln Lys Arg Ile Ala Tyr
945                 950                 955                 960
Ser Leu Leu Gly Leu Lys Asp Gln Val Asn Thr Val Gly Ile Pro Ile
                965                 970                 975
 
<210>3
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>PCR引物1
 
<400>3
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cggggatcgg accgagagcg agaag        55
 
<210>4
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>PCR引物2
 
<400>4
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ctagatgggg atccccacag tgttcacctg   60
gtcctt                                                              66
 
<210>5
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>Primer 3
 
<400>5
ctgtggggat ccccatcgac ccagctttc                                     29
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物4
 
<400>6
gatggggatc cccacagtgt tcacctggtc                                    30
 
<210>7
<211>2961
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>EPHA2突变序列
 
<220>
<221>CDS
<222>(33)..(2960)
 
<400>7
tcggggatcg gaccgagagc gagaagcgcg gc atg gag ctc cag gca gcc cgc     53
                                    Met Glu Leu Gln Ala Ala Arg
                                    1               5
gcc tgc ttc gcc ctg ctg tgg ggc tgt gcg ctg gcc gcg gcc gcg gcg    101
Ala Cys Phe Ala Leu Leu Trp Gly Cys Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ala
        10                  15                  20
gcg cag ggc aag gaa gtg gta ctg ctg gac ttt gct gca gct gga ggg    149
Ala Gln Gly Lys Glu Val Val Leu Leu Asp Phe Ala Ala Ala Gly Gly
    25                  30                  35
gag ctc ggc tgg ctc aca cac ccg tat ggc aaa ggg tgg gac ctg atg    197
Glu Leu Gly Trp Leu Thr His Pro Tyr Gly Lys Gly Trp Asp Leu Met
40                  45                  50                  55
cag aac atc atg aat gac atg ccg atc tac atg tac tcc gtg tgc aac    245
Gln Asn Ile Met Asn Asp Met Pro Ile Tyr Met Tyr Ser Val Cys Asn
                60                  65                  70
gtg atg tct ggc gac cag gac aac tgg ctc cgc acc aac tgg gtg tac    293
Val Met Ser Gly Asp Gln Asp Asn Trp Leu Arg Thr Asn Trp Val Tyr
            75                  80                  85
cga gga gag gct gag cgt atc ttc att gag ctc aag ttt act gta cgt    341
Arg Gly Glu Ala Glu Arg Ile Phe Ile Glu Leu Lys Phe Thr Val Arg
            90                  95                  100
gac tgc aac agc ttc cct ggt ggc gcc agc tcc tgc aag gag act ttc    389
Asp Cys Asn Ser Phe Pro Gly Gly Ala Ser Ser Cys Lys Glu Thr Phe
        105                 110                 115
aac ctc tac tat gcc gag tcg gac ctg gac tac ggc acc aac ttc cag    437
Asn Leu Tyr Tyr Ala Glu Ser Asp Leu Asp Tyr Gly Thr Asn Phe Gln
120                 125                 130                 135
aag cgc ctg ttc acc aag att gac acc att gcg ccc gat gag atc acc    485
Lys Arg Leu Phe Thr Lys Ile Asp Thr Ile Ala Pro Asp Glu Ile Thr
                140                 145                 150
gtc agc agc gac ttc gag gca cgc cac gtg aag ctg aac gtg gag gag    533
Val Ser Ser Asp Phe Glu Ala Arg His Val Lys Leu Asn Val Glu Glu
            155                 160                 165
cgc tcc gtg ggg ccg ctc acc cgc aaa ggc ttc tac ctg gcc ttc cag    581
Arg Ser Val Gly Pro Leu Thr Arg Lys Gly Phe Tyr Leu Ala Phe Gln
        170                 175                 180
gat atc ggt gcc tgt gtg gca cta ctc tcc gtc cgt gtc tac tac aag    629
Asp Ile Gly Ala Cys Val Ala Leu Leu Ser Val Arg Val Tyr Tyr Lys
    185                 190                 195
aag tgc ccc gag ctg ctg cag ggc ctg gcc cac ttc cct gag acc atc    677
Lys Cys Pro Glu Leu Leu Gln Gly Leu Ala His Phe Pro Glu Thr Ile
200                 205                 210                 215
gcc ggc tct gat gca cct tcc ctg gcc act gtg gcc ggc acc tgt gtg    725
Ala Gly Ser Asp Ala Pro Ser Leu Ala Thr Val Ala Gly Thr Cys Val
                220                 225                 230
gac cat gcc gtg gtg cca ccg ggg ggt gaa gag ccc cgt atg cac tgt    773
Asp His Ala Val Val Pro Pro Gly Gly Glu Glu Pro Arg Met His Cys
            235                 240                 245
gca gtg gat ggc gag tgg ctg gtg ccc att ggg cag tgc ctg tgc cag    821
Ala Val Asp Gly Glu Trp Leu Val Pro Ile Gly Gln Cys Leu Cys Gln
        250                 255                 260
gca ggc tac gag aag gtg gag gat gcc tgc cag gcc tgc tcg cct gga    869
Ala Gly Tyr Glu Lys Val Glu Asp Ala Cys Gln Ala Cys Ser Pro Gly
    265                 270                 275
ttt ttt aag ttt gag gca tct gag agc ccc tgc ttg gag tgc cct gag    917
Phe Phe Lys Phe Glu Ala Ser Glu Ser Pro Cys Leu Glu Cys Pro Glu
280                 285                 290                 295
cac acg ctg cca tcc cct gag ggt gcc acc tcc tgc gag tgt gag gaa     965
His Thr Leu Pro Ser Pro Glu Gly Ala Thr Ser Cys Glu Cys Glu Glu
                300                 305                 310
ggc ttc ttc cgg gca cct cag gac cca gcg tcg atg cct tgc aca cga    1013
Gly Phe Phe Arg Ala Pro Gln Asp Pro Ala Ser Met Pro Cys Thr Arg
            315                 320                 325
ccc cct tcc gcc cca cac tac ctc aca gcc gtg ggc atg ggt gcc aag    1061
Pro Pro Ser Ala Pro His Tyr Leu Thr Ala Val Gly Met Gly Ala Lys
        330                 335                 340
gtg gag ctg cgc tgg acg ccc cct cag gac agc ggg ggc cgc gag gac    1109
Val Glu Leu Arg Trp Thr Pro Pro Gln Asp Ser Gly Gly Arg Glu Asp
    345                 350                 355
att gtc tac agc gtc acc tgc gaa cag tgc tgg ccc gag tct ggg gaa    1157
Ile Val Tyr Ser Val Thr Cys Glu Gln Cys Trp Pro Glu Ser Gly Glu
360                 365                 370                 375
tgc ggg ccg tgt gag gcc agt gtg cgc tac tcg gag cct cct cac gga    1205
Cys Gly Pro Cys Glu Ala Ser Val Arg Tyr Ser Glu Pro Pro His Gly
                380                 385                 390
ctg acc cgc acc agt gtg aca gtg agc gac ctg gag ccc cac atg aac    1253
Leu Thr Arg Thr Ser Val Thr Val Ser Asp Leu Glu Pro His Met Asn
            395                 400                 405
tac acc ttc acc gtg gag gcc cgc aat ggc gtc tca ggc ctg gta acc    1301
Tyr Thr Phe Thr Val Glu Ala Arg Asn Gly Val Ser Gly Leu Val Thr
        410                 415                 420
agc cgc agc ttc cgt act gcc agt gtc agc atc aac cag aca gag ccc    1349
Ser Arg Ser Phe Arg Thr Ala Ser Val Ser Ile Asn Gln Thr Glu Pro
    425                 430                 435
ccc aag gtg agg ctg gag ggc cgc agc acc acc tcg ctt agc gtc tcc    1397
Pro Lys Val Arg Leu Glu Gly Arg Ser Thr Thr Ser Leu Ser Val Ser
440                 445                 450                 455
tgg agc atc ccc ccg ccg cag cag agc cga gtg tgg aag tac gag gtc    1445
Trp Ser Ile Pro Pro Pro Gln Gln Ser Arg Val Trp Lys Tyr Glu Val
                460                 465                 470
act tac cgc aag aag gga gac tcc aac agc tac aat gtg cgc cgc acc    1493
Thr Tyr Arg Lys Lys Gly Asp Ser Asn Ser Tyr Asn Val Arg Arg Thr
            475                 480                 485
gag ggt ttc tcc gtg acc ctg gac gac ctg gcc cca gac acc acc tac    1541
Glu Gly Phe Ser Val Thr Leu Asp Asp Leu Ala Pro Asp Thr Thr Tyr
        490                 495                 500
ctg gtc cag gtg cag gca ctg acg cag gag ggc cag ggg gcc ggc agc    1589
Leu Val Gln Val Gln Ala Leu Thr Gln Glu Gly Gln Gly Ala Gly Ser
    505                 510                 515
aag gtg cac gaa ttc cag acg ctg tcc ccg gag gga tct ggc aac ttg    1637
Lys Val His Glu Phe Gln Thr Leu Ser Pro Glu Gly Ser Gly Asn Leu
520                 525                 530                 535
gcg gtg att ggc ggc gtg gct gtc ggt gtg gtc ctg ctt ctg gtg ctg    1685
Ala Val Ile Gly Gly Val Ala Val Gly Val Val Leu Leu Leu Val Leu
                540                 545                 550
gca gga gtt ggc ttc ttt atc cac cgc agg agg aag aac cag cgt gcc    1733
Ala Gly Val Gly Phe Phe Ile His Arg Arg Arg Lys Asn Gln Arg Ala
            555                 560                 565
cgc cag tcc ccg gag gac gtt tac ttc tcc aag tca gaa caa ctg aag    1781
Arg Gln Ser Pro Glu Asp Val Tyr Phe Ser Lys Ser Glu Gln Leu Lys
        570                 575                 580
ccc ctg aag aca tac gtg gac ccc cac aca tat gag gac ccc aac cag    1829
Pro Leu Lys Thr Tyr Val Asp Pro His Thr Tyr Glu Asp Pro Asn Gln
    585                 590                 595
gct gtg ttg aag ttc act acc gag atc cat cca tcc tgt gtc act cgg    1877
Ala Val Leu Lys Phe Thr Thr Glu Ile His Pro Ser Cys Val Thr Arg
600                 605                 610                 615
cag aag gtg atc gga gca gga gag ttt ggg gag gtg tac aag ggc atg    1925
Gln Lys Val Ile Gly Ala Gly Glu Phe Gly Glu Val Tyr Lys Gly Met
                620                 625                 630
ctg aag aca tcc tcg ggg aag aag gag gtg ccg gtg gcc atc aag acg    1973
Leu Lys Thr Ser Ser Gly Lys Lys Glu Val Pro Val Ala Ile Lys Thr
            635                 640                 645
ctg aaa gcc ggc tac aca gag aag cag cga gtg gac ttc ctc ggc gag    2021
Leu Lys Ala Gly Tyr Thr Glu Lys Gln Arg Val Asp Phe Leu Gly Glu
        650                 655                 660
gcc ggc atc atg ggc cag ttc agc cac cac aac atc atc cgc cta gag    2069
Ala Gly Ile Met Gly Gln Phe Ser His His Asn Ile Ile Arg Leu Glu
    665                 670                 675
ggc gtc atc tcc aaa tac aag ccc atg atg atc atc act gag tac atg    2117
Gly Val Ile Ser Lys Tyr Lys Pro Met Met Ile Ile Thr Glu Tyr Met
680                 685                 690                 695
gag aat ggg gcc ctg gac aag ttc ctt cgg gag aag gat ggc gag ttc    2165
Glu Asn Gly Ala Leu Asp Lys Phe Leu Arg Glu Lys Asp Gly Glu Phe
                700                 705                 710
agc gtg ctg cag ctg gtg ggc atg ctg cgg ggc atc gca gct ggc atg    2213
Ser Val Leu Gln Leu Val Gly Met Leu Arg Gly Ile Ala Ala Gly Met
            715                 720                 725
aag tac ctg gcc aac atg aac tat gtg cac cgt gac ctg gct gcc cgc    2261
Lys Tyr Leu Ala Asn Met Asn Tyr Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg
        730                 735                 740
aac atc ctc gtc aac agc aac ctg gtc tgc aag gtg tct gac ttt ggc    2309
Asn Ile Leu Val Asn Ser Asn Leu Val Cys Lys Val Ser Asp Phe Gly
    745                 750                 755
ctg tcc cgc gtg ctg gag gac gac ccc gag gcc acc tac acc acc agt    2357
Leu Ser Arg Val Leu Glu Asp Asp Pro Glu Ala Thr Tyr Thr Thr Ser
760                 765                 770                 775
ggc ggc aag atc ccc atc cgc tgg acc gcc ccg gag gcc att tcc tac    2405
Gly Gly Lys Ile Pro Ile Arg Trp Thr Ala Pro Glu Ala Ile Ser Tyr
                780                 785                 790
cgg aag ttc acc tct gcc agc gac gtg tgg agc ttt ggc att gtc atg    2453
Arg Lys Phe Thr Ser Ala Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Ile Val Met
            795                 800                 805
tgg gag gtg atg acc tat ggc gag cgg ccc tac tgg gag ttg tcc aac    2501
Trp Glu Val Met Thr Tyr Gly Glu Arg Pro Tyr Trp Glu Leu Ser Asn
        810                 815                 820
cac gag gtg atg aaa gcc atc aat gat ggc ttc cgg ctc ccc aca ccc    2549
His Glu Val Met Lys Ala Ile Asn Asp Gly Phe Arg Leu Pro Thr Pro
    825                 830                 835
atg gac tgc ccc tcc gcc atc tac cag ctc atg atg cag tgc tgg cag    2597
Met Asp Cys Pro Ser Ala Ile Tyr Gln Leu Met Met Gln Cys Trp Gln
840                 845                 850                 855
cag gag cgt gcc cgc cgc ccc aag ttc gct gac atc gtc agc atc ctg    2645
Gln Glu Arg Ala Arg Arg Pro Lys Phe Ala Asp Ile Val Ser Ile Leu
                860                 865                 870
gac aag ctc att cgt gcc cct gac tcc ctc aag acc ctg gct gac ttt    2693
Asp Lys Leu Ile Arg Ala Pro Asp Ser Leu Lys Thr Leu Ala Asp Phe
            875                 880                 885
gac ccc cgc gtg tct atc cgg ctc ccc agc acg agc ggc tcg gag ggg    2741
Asp Pro Arg Val Ser Ile Arg Leu Pro Ser Thr Ser Gly Ser Glu Gly
        890                 895                 900
gtg ccc ttc cgc acg gtg tcc gag tgg ctg gag tcc atc aag atg cag    2789
Val Pro Phe Arg Thr Val Ser Glu Trp Leu Glu Ser Ile Lys Met Gln
    905                 910                 915
cag tat acg gag cac ttc atg gcg gcc ggc tac act gcc atc gag aag    2837
Gln Tyr Thr Glu His Phe Met Ala Ala Gly Tyr Thr Ala Ile Glu Lys
920                 925                 930                 935
gtg gtg cag atg acc aac gac gac atc aag agg att ggg gtg cgg ctg    2885
Val Val Gln Met Thr Asn Asp Asp Ile Lys Arg Ile Gly Val Arg Leu
                940                 945                 950
ccc ggc cac cag aag cgc atc gcc tac agc ctg ctg gga ctc aag gac    2933
Pro Gly His Gln Lys Arg Ile Ala Tyr Ser Leu Leu Gly Leu Lys Asp
            955                 960                 965
cag gtg aac act gtg ggg atc ccc atc g                              2961
Gln Val Asn Thr Val Gly Ile Pro Ile
        970                 975
 
<210>8
<211>976
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>8
 
Met Glu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Cys Phe Ala Leu Leu Trp Gly Cys
1               5                   10                  15
Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln Gly Lys Glu Val Val Leu Leu
            20                  25                  30
Asp Phe Ala Ala Ala Gly Gly Glu Leu Gly Trp Leu Thr His Pro Tyr
        35                  40                  45
Gly Lys Gly Trp Asp Leu Met Gln Asn Ile Met Asn Asp Met Pro Ile
    50                  55                  60
Tyr Met Tyr Ser Val Cys Asn Val Met Ser Gly Asp Gln Asp Asn Trp
65                  70                  75                  80
Leu Arg Thr Asn Trp Val Tyr Arg Gly Glu Ala Glu Arg Ile Phe Ile
                 85                  90                  95
Glu Leu Lys Phe Thr Val Arg Asp Cys Asn Ser Phe Pro Gly Gly Ala
            100                 105                 110
Ser Ser Cys Lys Glu Thr Phe Asn Leu Tyr Tyr Ala Glu Ser Asp Leu
        115                 120                 125
Asp Tyr Gly Thr Asn Phe Gln Lys Arg Leu Phe Thr Lys Ile Asp Thr
    130                 135                 140
Ile Ala Pro Asp Glu Ile Thr Val Ser Ser Asp Phe Glu Ala Arg His
145                 150                 155                 160
Val Lys Leu Asn Val Glu Glu Arg Ser Val Gly Pro Leu Thr Arg Lys
                165                 170                 175
Gly Phe Tyr Leu Ala Phe Gln Asp Ile Gly Ala Cys Val Ala Leu Leu
            180                 185                 190
Ser Val Arg Val Tyr Tyr Lys Lys Cys Pro Glu Leu Leu Gln Gly Leu
        195                 200                 205
Ala His Phe Pro Glu Thr Ile Ala Gly Ser Asp Ala Pro Ser Leu Ala
    210                 215                 220
Thr Val Ala Gly Thr Cys Val Asp His Ala Val Val Pro Pro Gly Gly
225                 230                 235                 240
Glu Glu Pro Arg Met His Cys Ala Val Asp Gly Glu Trp Leu Val Pro
                245                 250                 255
Ile Gly Gln Cys Leu Cys Gln Ala Gly Tyr Glu Lys Val Glu Asp Ala
            260                 265                 270
Cys Gln Ala Cys Ser Pro Gly Phe Phe Lys Phe Glu Ala Ser Glu Ser
        275                 280                 285
Pro Cys Leu Glu Cys Pro Glu His Thr Leu Pro Ser Pro Glu Gly Ala
    290                 295                 300
Thr Ser Cys Glu Cys Glu Glu Gly Phe Phe Arg Ala Pro Gln Asp Pro
305                 310                 315                 320
Ala Ser Met Pro Cys Thr Arg Pro Pro Ser Ala Pro His Tyr Leu Thr
                325                 330                 335
Ala Val Gly Met Gly Ala Lys Val Glu Leu Arg Trp Thr Pro Pro Gln
            340                 345                 350
Asp Ser Gly Gly Arg Glu Asp Ile Val Tyr Ser Val Thr Cys Glu Gln
        355                 360                 365
Cys Trp Pro Glu Ser Gly Glu Cys Gly Pro Cys Glu Ala Ser Val Arg
    370                 375                 380
Tyr Ser Glu Pro Pro His Gly Leu Thr Arg Thr Ser Val Thr Val Ser
385                 390                 395                 400
Asp Leu Glu Pro His Met Asn Tyr Thr Phe Thr Val Glu Ala Arg Asn
                405                 410                 415
Gly Val Ser Gly Leu Val Thr Ser Arg Ser Phe Arg Thr Ala Ser Val
            420                 425                 430
Ser Ile Asn Gln Thr Glu Pro Pro Lys Val Arg Leu Glu Gly Arg Ser
        435                 440                 445
Thr Thr Ser Leu Ser Val Ser Trp Ser Ile Pro Pro Pro Gln Gln Ser
    450                 455                 460
Arg Val Trp Lys Tyr Glu Val Thr Tyr Arg Lys Lys Gly Asp Ser Asn
465                 470                 475                 480
Ser Tyr Asn Val Arg Arg Thr Glu Gly Phe Ser Val Thr Leu Asp Asp
                485                 490                 495
Leu Ala Pro Asp Thr Thr Tyr Leu Val Gln Val Gln Ala Leu Thr Gln
            500                 505                 510
Glu Gly Gln Gly Ala Gly Ser Lys Val His Glu Phe Gln Thr Leu Ser
        515                 520                 525
Pro Glu Gly Ser Gly Asn Leu Ala Val Ile Gly Gly Val Ala Val Gly
    530                 535                 540
Val Val Leu Leu Leu Val Leu Ala Gly Val Gly Phe Phe Ile His Arg
545                 550                 555                 560
Arg Arg Lys Asn Gln Arg Ala Arg Gln Ser Pro Glu Asp Val Tyr Phe
                565                 570                 575
Ser Lys Ser Glu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Thr Tyr Val Asp Pro His
            580                 585                 590
Thr Tyr Glu Asp Pro Asn Gln Ala Val Leu Lys Phe Thr Thr Glu Ile
        595                 600                 605
His Pro Ser Cys Val Thr Arg Gln Lys Val Ile Gly Ala Gly Glu Phe
    610                 615                 620
Gly Glu Val Tyr Lys Gly Met Leu Lys Thr Ser Ser Gly Lys Lys Glu
625                 630                 635                 640
Val Pro Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys Ala Gly Tyr Thr Glu Lys Gln
                645                 650                 655
Arg Val Asp Phe Leu Gly Glu Ala Gly Ile Met Gly Gln Phe Ser His
            660                 665                 670
His Asn Ile Ile Arg Leu Glu Gly Val Ile Ser Lys Tyr Lys Pro Met
        675                 680                 685
Met Ile Ile Thr Glu Tyr Met Glu Asn Gly Ala Leu Asp Lys Phe Leu
    690                 695                 700
Arg Glu Lys Asp Gly Glu Phe Ser Val Leu Gln Leu Val Gly Met Leu
705                 710                 715                 720
Arg Gly Ile Ala Ala Gly Met Lys Tyr Leu Ala Asn Met Asn Tyr Val
                725                 730                 735
His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Val Asn Ser Asn Leu Val
            740                 745                 750
Cys Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ser Arg Val Leu Glu Asp Asp Pro
        755                 760                 765
Glu Ala Thr Tyr Thr Thr Ser Gly Gly Lys Ile Pro Ile Arg Trp Thr
    770                 775                 780
Ala Pro Glu Ala Ile Ser Tyr Arg Lys Phe Thr Ser Ala Ser Asp Val
785                 790                 795                 800
Trp Ser Phe Gly Ile Val Met Trp Glu Val Met Thr Tyr Gly Glu Arg
                805                 810                 815
Pro Tyr Trp Glu Leu Ser Asn His Glu Val Met Lys Ala Ile Asn Asp
            820                 825                 830
Gly Phe Arg Leu Pro Thr Pro Met Asp Cys Pro Ser Ala Ile Tyr Gln
        835                 840                 845
Leu Met Met Gln Cys Trp Gln Gln Glu Arg Ala Arg Arg Pro Lys Phe
    850                 855                 860
Ala Asp Ile Val Ser Ile Leu Asp Lys Leu Ile Arg Ala Pro Asp Ser
865                 870                 875                 880
Leu Lys Thr Leu Ala Asp Phe Asp Pro Arg Val Ser Ile Arg Leu Pro
                885                 890                 895
Ser Thr Ser Gly Ser Glu Gly Val Pro Phe Arg Thr Val Ser Glu Trp
             900                 905                 910
Leu Glu Ser Ile Lys Met Gln Gln Tyr Thr Glu His Phe Met Ala Ala
        915                 920                 925
Gly Tyr Thr Ala Ile Glu Lys Val Val Gln Met Thr Asn Asp Asp Ile
    930                 935                 940
Lys Arg Ile Gly Val Arg Leu Pro Gly His Gln Lys Arg Ile Ala Tyr
945                 950                 955                 960
Ser Leu Leu Gly Leu Lys Asp Gln Val Asn Thr Val Gly Ile Pro Ile
                965                 970                 975
 
<210>9
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>PCR引物5
 
<400>9
aaaaagctta tggagctcca ggcagcccgc                     30
 
<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>PCR引物6
 
<400>10
aaagggccct cagttgccag atccctccgg                     30
 
<210>11
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>PCR引物7
 
<400>11
gcaggcttca tcgaaggtcg tgggcgggca cctcaggacc cag                  43
 
<210>12
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>PCR引物8
 
<400>12
gtacaagaaa gctgggtgct agccgccaat caccgccaag                      40
 
<210>13
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>PCR引物9
 
<400>13
gtacaagaaa gctgggtgct aggcagtacg gaagctgcgg                      40
 
<210>14
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>PCR引物10
 
<400>14
gcaggcttca tcgaaggtcg tgggagcttc cgtactgcca gtg                  43
 
<210>15
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>PCR引物11
 
<400>15
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt catcgaaggt cgtggg                   46
 
<210>16
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>PCR引物12
 
<400>16
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt                                      29
 
<210>17
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>PCR引物13
 
<400>17
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgccccggga agcgcagcc                49
 
<210>18
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>PCR引物14
 
<400>18
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ctaaacctcc acagactgaa tctggttcat    60
ctg                                                                  63
 
<210>19
<211>2961
<212>DNA
<213>人
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2961)
<400>19
atg gct ctg cgg agg ctg ggg gcc gcg ctg ctg ctg ctg ccg ctg ctc     48
Met Ala Leu Arg Arg Leu Gly Ala Ala Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu
1               5                   10                  15
gcc gcc gtg gaa gaa acg cta atg gac tcc act aca gcg act gct gag     96
Ala Ala Val Glu Glu Thr Leu Met Asp Ser Thr Thr Ala Thr Ala Glu
            20                  25                  30
ctg ggc tgg atg gtg cat cct cca tca ggg tgg gaa gag gtg agt ggc    144
Leu Gly Trp Met Val His Pro Pro Ser Gly Trp Glu Glu Val Ser Gly
        35                  40                  45
tac gat gag aac atg aac acg atc cgc acg tac cag gtg tgc aac gtg    192
Tyr Asp Glu Asn Met Asn Thr Ile Arg Thr Tyr Gln Val Cys Asn Val
    50                  55                  60
ttt gag tca agc cag aac aac tgg cta cgg acc aag ttt atc cgg cgc    240
Phe Glu Ser Ser Gln Asn Asn Trp Leu Arg Thr Lys Phe Ile Arg Arg
65                  70                  75                  80
cgt ggc gcc cac cgc atc cac gtg gag atg aag ttt tcg gtg cgt gac    288
Arg Gly Ala His Arg Ile His Val Glu Met Lys Phe Ser Val Arg Asp
                85                  90                  95
tgc agc agc atc ccc agc gtg cct ggc tcc tgc aag gag acc ttc aac    336
Cys Ser Ser Ile Pro Ser Val Pro Gly Ser Cys Lys Glu Thr Phe Asn
            100                 105                 110
ctc tat tac tat gag gct gac ttt gac tcg gcc acc aag acc ttc ccc    384
Leu Tyr Tyr Tyr Glu Ala Asp Phe Asp Ser Ala Thr Lys Thr Phe Pro
        115                 120                 125
aac tgg atg gag aat cca tgg gtg aag gtg gat acc att gca gcc gac    432
Asn Trp Met Glu Asn Pro Trp Val Lys Val Asp Thr Ile Ala Ala Asp
    130                 135                 140
gag agc ttc tcc cag gtg gac ctg ggt ggc cgc gtc atg aaa atc aac    480
Glu Ser Phe Ser Gln Val Asp Leu Gly Gly Arg Val Met Lys Ile Asn
145                 150                 155                 160
acc gag gtg cgg agc ttc gga cct gtg tcc cgc agc ggc ttc tac ctg    528
Thr Glu Val Arg Ser Phe Gly Pro Val Ser Arg Ser Gly Phe Tyr Leu
                165                 170                 175
gcc ttc cag gac tat ggc ggc tgc atg tcc ctc atc gcc gtg cgt gtc    576
Ala Phe Gln Asp Tyr Gly Gly Cys Met Ser Leu Ile Ala Val Arg Val
            180                 185                 190
ttc tac cgc aag tgc ccc cgc atc atc cag aat ggc gcc atc ttc cag    624
Phe Tyr Arg Lys Cys Pro Arg Ile Ile Gln Asn Gly Ala Ile Phe Gln
        195                 200                 205
gaa acc ctg tcg ggg gct gag agc aca tcg ctg gtg gct gcc cgg ggc    672
Glu Thr Leu Ser Gly Ala Glu Ser Thr Ser Leu Val Ala Ala Arg Gly
    210                 215                 220
agc tgc atc gcc aat gcg gaa gag gtg gat gta ccc atc aag ctc tac    720
Ser Cys Ile Ala Asn Ala Glu Glu Val Asp Val Pro Ile Lys Leu Tyr
225                 230                 235                 240
tgt aac ggg gac ggc gag tgg ctg gtg ccc atc ggg cgc tgc atg tgc    768
Cys Asn Gly Asp Gly Glu Trp Leu Val Pro Ile Gly Arg Cys Met Cys
                245                 250                 255
aaa gca ggc ttc gag gcc gtt gag aat ggc acc gtc tgc cga ggt tgt    816
Lys Ala Gly Phe Glu Ala Val Glu Asn Gly Thr Val Cys Arg Gly Cys
            260                 265                 270
cca tct ggg act ttc aag gcc aac caa ggg gat gag gcc tgt acc cac    864
Pro Ser Gly Thr Phe Lys Ala Asn Gln Gly Asp Glu Ala Cys Thr His
        275                 280                 285
tgt ccc atc aac agc cgg acc act tct gaa ggg gcc acc aac tgt gtc    912
Cys Pro Ile Asn Ser Arg Thr Thr Ser Glu Gly Ala Thr Asn Cys Val
    290                 295                 300
tgc cgc aat ggc tac tac aga gca gac ctg gac ccc ctg gac atg ccc    960
Cys Arg Asn Gly Tyr Tyr Arg Ala Asp Leu Asp Pro Leu Asp Met Pro
305                 310                 315                 320
tgc aca acc atc ccc tcc gcg ccc cag gct gtg att tcc agt gtc aat   1008
Cys Thr Thr Ile Pro Ser Ala Pro Gln Ala Val Ile Ser Ser Val Asn
                325                 330                 335
gag acc tcc ctc atg ctg gag tgg acc cct ccc cgc gac tcc gga ggc   1056
Glu Thr Ser Leu Met Leu Glu Trp Thr Pro Pro Arg Asp Ser Gly Gly
            340                 345                 350
cga gag gac ctc gtc tac aac atc atc tgc aag agc tgt ggc tcg ggc   1104
Arg Glu Asp Leu Val Tyr Asn Ile Ile Cys Lys Ser Cys Gly Ser Gly
        355                 360                 365
cgg ggt gcc tgc acc cgc tgc ggg gac aat gta cag tac gca cca cgc   1152
Arg Gly Ala Cys Thr Arg Cys Gly Asp Asn Val Gln Tyr Ala Pro Arg
    370                 375                 380
cag cta ggc ctg acc gag cca cgc att tac atc agt gac ctg ctg gcc   1200
Gln Leu Gly Leu Thr Glu Pro Arg Ile Tyr Ile Ser Asp Leu Leu Ala
385                 390                 395                 400
cac acc cag tac acc ttc gag atc cag gct gtg aac ggc gtt act gac   1248
His Thr Gln Tyr Thr Phe Glu Ile Gln Ala Val Asn Gly Val Thr Asp
                405                 410                 415
cag agc ccc ttc tcg cct cag ttc gcc tct gtg aac atc acc acc aac    1296
Gln Ser Pro Phe Ser Pro Gln Phe Ala Ser Val Asn Ile Thr Thr Asn
            420                 425                 430
cag gca gct cca tcg gca gtg tcc atc atg cat cag gtg agc cgc acc    1344
Gln Ala Ala Pro Ser Ala Val Ser Ile Met His Gln Val Ser Arg Thr
        435                 440                 445
gtg gac agc att acc ctg tcg tgg tcc cag ccg gac cag ccc aat ggc    1392
Val Asp Ser Ile Thr Leu Ser Trp Ser Gln Pro Asp Gln Pro Asn Gly
    450                 455                 460
gtg atc ctg gac tat gag ctg cag tac tat gag aag gag ctc agt gag    1440
Val Ile Leu Asp Tyr Glu Leu Gln Tyr Tyr Glu Lys Glu Leu Ser Glu
465                 470                 475                 480
tac aac gcc aca gcc ata aaa agc ccc acc aac acg gtc acc gtg cag    1488
Tyr Asn Ala Thr Ala Ile Lys Ser Pro Thr Asn Thr Val Thr Val Gln
                485                 490                 495
ggc ctc aaa gcc ggc gcc atc tat gtc ttc cag gtg cgg gca cgc acc    1536
Gly Leu Lys Ala Gly Ala Ile Tyr Val Phe Gln Val Arg Ala Arg Thr
            500                 505                 510
gtg gca ggc tac ggg cgc tac agc ggc aag atg tac ttc cag acc atg    1584
Val Ala Gly Tyr Gly Arg Tyr Ser Gly Lys Met Tyr Phe Gln Thr Met
        515                 520                 525
aca gaa gcc gag tac cag aca agc atc cag gag aag ttg cca ctc atc    1632
Thr Glu Ala Glu Tyr Gln Thr Ser Ile Gln Glu Lys Leu Pro Leu Ile
    530                 535                 540
atc ggc tcc tcg gcc gct ggc ctg gtc ttc ctc att gct gtg gtt gtc    1680
Ile Gly Ser Ser Ala Ala Gly Leu Val Phe Leu Ile Ala Val Val Val
545                 550                 555                 560
atc gcc atc gtg tgt aac aga cgg ggg ttt gag cgt gct gac tcg gag    1728
Ile Ala Ile Val Cys Asn Arg Arg Gly Phe Glu Arg Ala Asp Ser Glu
                565                 570                 575
tac acg gac aag ctg caa cac tac acc agt ggc cac atg acc cca ggc    1776
Tyr Thr Asp Lys Leu Gln His Tyr Thr Ser Gly His Met Thr Pro Gly
            580                 585                 590
atg aag atc tac atc gat cct ttc acc tac gag gac ccc aac gag gca    1824
Met Lys Ile Tyr Ile Asp Pro Phe Thr Tyr Glu Asp Pro Asn Glu Ala
        595                 600                 605
gtg cgg gag ttt gcc aag gaa att gac atc tcc tgt gtc aaa att gag    1872
Val Arg Glu Phe Ala Lys Glu Ile Asp Ile Ser Cys Val Lys Ile Glu
    610                 615                 620
cag gtg atc gga gca ggg gag ttt ggc gag gtc tgc agt ggc cac ctg    1920
Gln Val Ile Gly Ala Gly Glu Phe Gly Glu Val Cys Ser Gly His Leu
625                 630                 635                 640
aag ctg cca ggc aag aga gag atc ttt gtg gcc atc aag acg ctc aag    1968
Lys Leu Pro Gly Lys Arg Glu Ile Phe Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys
                645                 650                 655
tcg ggc tac acg gag aag cag cgc cgg gac ttc ctg agc gaa gcc tcc    2016
Ser Gly Tyr Thr Glu Lys Gln Arg Arg Asp Phe Leu Ser Glu Ala Ser
            660                 665                 670
atc atg ggc cag ttc gac cat ccc aac gtc atc cac ctg gag ggt gtc    2064
Ile Met Gly Gln Phe Asp His Pro Asn Val Ile His Leu Glu Gly Val
        675                 680                 685
gtg acc aag agc aca cct gtg atg atc atc acc gag ttc atg gag aat    2112
Val Thr Lys Ser Thr Pro Val Met Ile Ile Thr Glu Phe Met Glu Asn
    690                 695                 700
ggc tcc ctg gac tcc ttt ctc cgg caa aac gat ggg cag ttc aca gtc    2160
Gly Ser Leu Asp Ser Phe Leu Arg Gln Asn Asp Gly Gln Phe Thr Val
705                 710                 715                 720
atc cag ctg gtg ggc atg ctt cgg ggc atc gca gct ggc atg aag tac    2208
Ile Gln Leu Val Gly Met Leu Arg Gly Ile Ala Ala Gly Met Lys Tyr
                725                 730                 735
ctg gca gac atg aac tat gtt cac cgt gac ctg gct gcc cgc aac atc    2256
Leu Ala Asp Met Asn Tyr Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile
            740                 745                 750
ctc gtc aac agc aac ctg gtc tgc aag gtg tcg gac ttt ggg ctc tca    2304
Leu Val Asn Ser Asn Leu Val Cys Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ser
        755                 760                 765
cgc ttt cta gag gac gat acc tca gac ccc acc tac acc agt gcc ctg    2352
Arg Phe Leu Glu Asp Asp Thr Ser Asp Pro Thr Tyr Thr Ser Ala Leu
    770                 775                 780
ggc gga aag atc ccc atc cgc tgg aca gcc ccg gaa gcc atc cag tac    2400
Gly Gly Lys Ile Pro Ile Arg Trp Thr Ala Pro Glu Ala Ile Gln Tyr
785                 790                 795                 800
cgg aag ttc acc tcg gcc agt gat gtg tgg agc tac ggc att gtc atg    2448
Arg Lys Phe Thr Ser Ala Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Val Met
                805                 810                 815
tgg gag gtg atg tcc tat ggg gag cgg ccc tac tgg gac atg acc aac    2496
Trp Glu Val Met Ser Tyr Gly Glu Arg Pro Tyr Trp Asp Met Thr Asn
            820                 825                 830
cag gat gta atc aat gcc att gag cag gac tat cgg ctg cca ccg ccc    2544
Gln Asp Val Ile Asn Ala Ile Glu Gln Asp Tyr Arg Leu Pro Pro Pro
        835                 840                 845
atg gac tgc ccg agc gcc ctg cac caa ctc atg ctg gac tgt tgg cag    2592
Met Asp Cys Pro Ser Ala Leu His Gln Leu Met Leu Asp Cys Trp Gln
    850                 855                 860
aag gac cgc aac cac cgg ccc aag ttc ggc caa att gtc aac acg cta    2640
Lys Asp Arg Asn His Arg Pro Lys Phe Gly Gln Ile Val Asn Thr Leu
865                 870                 875                 880
gac aag atg atc cgc aat ccc aac agc ctc aaa gcc atg gcg ccc ctc    2688
Asp Lys Met Ile Arg Asn Pro Asn Ser Leu Lys Ala Met Ala Pro Leu
                885                 890                 895
tcc tct ggc atc aac ctg ccg ctg ctg gac cgc acg atc ccc gac tac    2736
Ser Ser Gly Ile Asn Leu Pro Leu Leu Asp Arg Thr Ile Pro Asp Tyr
            900                 905                 910
acc agc ttt aac acg gtg gac gag tgg ctg gag gcc atc aag atg ggg    2784
Thr Ser Phe Asn Thr Val Asp Glu Trp Leu Glu Ala Ile Lys Met Gly
        915                 920                 925
cag tac aag gag agc ttc gcc aat gcc ggc ttc acc tcc ttt gac gtc    2832
Gln Tyr Lys Glu Ser Phe Ala Asn Ala Gly Phe Thr Ser Phe Asp Val
    930                 935                 940
gtg tct cag atg atg atg gag gac att ctc cgg gtt ggg gtc act ttg    2880
Val Ser Gln Met Met Met Glu Asp Ile Leu Arg Val Gly Val Thr Leu
945                 950                 955                 960
gct ggc cac cag aaa aaa atc ctg aac agt atc cag gtg atg cgg gcg    2928
Ala Gly His Gln Lys Lys Ile Leu Asn Ser Ile Gln Val Met Arg Ala
                965                 970                 975
cag atg aac cag att cag tct gtg gag gtt  tag                       2961
Gln Met Asn Gln Ile Gln Ser Val Glu Val
            980                 985
 
<210>20
<211>986
<212>PRT
<213>人
<400>20
 
Met Ala Leu Arg Arg Leu Gly Ala Ala Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu
1               5                   10                  15
Ala Ala Val Glu Glu Thr Leu Met Asp Ser Thr Thr Ala Thr Ala Glu
            20                  25                  30
Leu Gly Trp Met Val His Pro Pro Ser Gly Trp Glu Glu Val Ser Gly
        35                  40                  45
Tyr Asp Glu Asn Met Asn Thr Ile Arg Thr Tyr Gln Val Cys Asn Val
    50                  55                  60
Phe Glu Ser Ser Gln Asn Asn Trp Leu Arg Thr Lys Phe Ile Arg Arg
65                  70                  75                  80
Arg Gly Ala His Arg Ile His Val Glu Met Lys Phe Ser Val Arg Asp
                85                  90                  95
Cys Ser Ser Ile Pro Ser Val Pro Gly Ser Cys Lys Glu Thr Phe Asn
            100                 105                 110
Leu Tyr Tyr Tyr Glu Ala Asp Phe Asp Ser Ala Thr Lys Thr Phe Pro
        115                 120                 125
Asn Trp Met Glu Asn Pro Trp Val Lys Val Asp Thr Ile Ala Ala Asp
    130                 135                 140
Glu Ser Phe Ser Gln Val Asp Leu Gly Gly Arg Val Met Lys Ile Asn
145                 150                 155                 160
Thr Glu Val Arg Ser Phe Gly Pro Val Ser Arg Ser Gly Phe Tyr Leu
                165                 170                 175
Ala Phe Gln Asp Tyr Gly Gly Cys Met Ser Leu Ile Ala Val Arg Val
            180                 185                 190
Phe Tyr Arg Lys Cys Pro Arg Ile Ile Gln Asn Gly Ala Ile Phe Gln
        195                 200                 205
Glu Thr Leu Ser Gly Ala Glu Ser Thr Ser Leu Val Ala Ala Arg Gly
    210                 215                 220
Ser Cys Ile Ala Asn Ala Glu Glu Val Asp Val Pro Ile Lys Leu Tyr
225                 230                 235                 240
Cys Asn Gly Asp Gly Glu Trp Leu Val Pro Ile Gly Arg Cys Met Cys
                245                 250                 255
Lys Ala Gly Phe Glu Ala Val Glu Asn Gly Thr Val Cys Arg Gly Cys
            260                 265                 270
Pro Ser Gly Thr Phe Lys Ala Asn Gln Gly Asp Glu Ala Cys Thr His
        275                 280                 285
Cys Pro Ile Asn Ser Arg Thr Thr Ser Glu Gly Ala Thr Asn Cys Val
    290                 295                 300
Cys Arg Asn Gly Tyr Tyr Arg Ala Asp Leu Asp Pro Leu Asp Met Pro
305                 310                 315                 320
Cys Thr Thr Ile Pro Ser Ala Pro Gln Ala Val Ile Ser Ser Val Asn
                325                 330                 335
Glu Thr Ser Leu Met Leu Glu Trp Thr Pro Pro Arg Asp Ser Gly Gly
            340                 345                 350
Arg Glu Asp Leu Val Tyr Asn Ile Ile Cys Lys Ser Cys Gly Ser Gly
        355                 360                 365
Arg Gly Ala Cys Thr Arg Cys Gly Asp Asn Val Gln Tyr Ala Pro Arg
    370                 375                 380
Gln Leu Gly Leu Thr Glu Pro Arg Ile Tyr Ile Ser Asp Leu Leu Ala
385                 390                 395                 400
His Thr Gln Tyr Thr Phe Glu Ile Gln Ala Val Asn Gly Val Thr Asp
                405                 410                 415
Gln Ser Pro Phe Ser Pro Gln Phe Ala Ser Val Asn Ile Thr Thr Asn
            420                 425                 430
Gln Ala Ala Pro Ser Ala Val Ser Ile Met His Gln Val Ser Arg Thr
        435                 440                 445
Val Asp Ser Ile Thr Leu Ser Trp Ser Gln Pro Asp Gln Pro Asn Gly
    450                 455                 460
Val Ile Leu Asp Tyr Glu Leu Gln Tyr Tyr Glu Lys Glu Leu Ser Glu
465                 470                 475                 480
Tyr Asn Ala Thr Ala Ile Lys Ser Pro Thr Asn Thr Val Thr Val Gln
                485                 490                 495
Gly Leu Lys Ala Gly Ala Ile Tyr Val Phe Gln Val Arg Ala Arg Thr
            500                 505                 510
Val Ala Gly Tyr Gly Arg Tyr Ser Gly Lys Met Tyr Phe Gln Thr Met
        515                 520                 525
Thr Glu Ala Glu Tyr Gln Thr Ser Ile Gln Glu Lys Leu Pro Leu Ile
    530                 535                 540
Ile Gly Ser Ser Ala Ala Gly Leu Val Phe Leu Ile Ala Val Val Val
545                 550                 555                 560
Ile Ala Ile Val Cys Asn Arg Arg Gly Phe Glu Arg Ala Asp Ser Glu
                565                 570                 575
Tyr Thr Asp Lys Leu Gln His Tyr Thr Ser Gly His Met Thr Pro Gly
            580                 585                 590
Met Lys Ile Tyr Ile Asp Pro Phe Thr Tyr Glu Asp Pro Asn Glu Ala
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Val Arg Glu Phe Ala Lys Glu Ile Asp Ile Ser Cys Val Lys Ile Glu
    610                 615                 620
Gln Val Ile Gly Ala Gly Glu Phe Gly Glu Val Cys Ser Gly His Leu
625                 630                 635                 640
Lys Leu Pro Gly Lys Arg Glu Ile Phe Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys
                645                 650                 655
Ser Gly Tyr Thr Glu Lys Gln Arg Arg Asp Phe Leu Ser Glu Ala Ser
            660                 665                 670
Ile Met Gly Gln Phe Asp His Pro Asn Val Ile His Leu Glu Gly Val
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Val Thr Lys Ser Thr Pro Val Met Ile Ile Thr Glu Phe Met Glu Asn
    690                 695                 700
Gly Ser Leu Asp Ser Phe Leu Arg Gln Asn Asp Gly Gln Phe Thr Val
705                 710                 715                 720
Ile Gln Leu Val Gly Met Leu Arg Gly Ile Ala Ala Gly Met Lys Tyr
                725                 730                 735
Leu Ala Asp Met Asn Tyr Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile
            740                 745                 750
Leu Val Asn Ser Asn Leu Val Cys Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ser
        755                 760                 765
Arg Phe Leu Glu Asp Asp Thr Ser Asp Pro Thr Tyr Thr Ser Ala Leu
    770                 775                 780
Gly Gly Lys Ile Pro Ile Arg Trp Thr Ala Pro Glu Ala Ile Gln Tyr
785                 790                 795                 800
Arg Lys Phe Thr Ser Ala Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Val Met
                805                 810                 815
Trp Glu Val Met Ser Tyr Gly Glu Arg Pro Tyr Trp Asp Met Thr Asn
            820                 825                 830
Gln Asp Val Ile Asn Ala Ile Glu Gln Asp Tyr Arg Leu Pro Pro Pro
        835                 840                 845
Met Asp Cys Pro Ser Ala Leu His Gln Leu Met Leu Asp Cys Trp Gln
    850                 855                 860
Lys Asp Arg Asn His Arg Pro Lys Phe Gly Gln Ile Val Asn Thr Leu
865                 870                 875                 880
Asp Lys Met Ile Arg Asn Pro Asn Ser Leu Lys Ala Met Ala Pro Leu
                885                 890                 895
Ser Ser Gly Ile Asn Leu Pro Leu Leu Asp Arg Thr Ile Pro Asp Tyr
            900                 905                 910
Thr Ser Phe Asn Thr Val Asp Glu Trp Leu Glu Ala Ile Lys Met Gly
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Gln Tyr Lys Glu Ser Phe Ala Asn Ala Gly Phe Thr Ser Phe Asp Val
    930                 935                 940
Val Ser Gln Met Met Met Glu Asp Ile Leu Arg Val Gly Val Thr Leu
945                 950                 955                 960
Ala Gly His Gln Lys Lys Ile Leu Asn Ser Ile Gln Val Met Arg Ala
                965                 970                 975
Gln Met Asn Gln Ile Gln Ser Val Glu Val
            980                 985
 
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<220>
<223>PCR引物18
 
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tcccactggc acgtccagac c                                              21
 
<210>25
<211>3804
<212>DNA
<213>人
 
<400>25
ccgcggccgc ccccttcacc atggagctgg cggccttgtg ccgctggggg ctcctcctcg    60
ccctcttgcc ccccggagcc gcgagcaccc aagtgtgcac cggcacagac atgaagctgc    120
ggctccctgc cagtcccgag acccacctgg acatgctccg ccacctctac cagggctgcc    180
aggtggtgca gggaaacctg gaactcacct acctgcccac caatgccagc ctgtccttcc    240
tgcaggatat ccaggaggtg cagggctacg tgctcatcgc tcacaaccaa gtgaggcagg    300
tcccactgca gaggctgcgg attgtgcgag gcacccagct ctttgaggac aactatgccc    360
tggccgtgct agacaatgga gacccgctga acaataccac ccctgtcaca ggggcctccc    420
caggaggcct gcgggagctg cagcttcgaa gcctcacaga gatcttgaaa ggaggggtct    480
tgatccagcg gaacccccag ctctgctacc aggacacgat tttgtggaag gacatcttcc    540
acaagaacaa ccagctggct ctcacactga tagacaccaa ccgctctcgg gcctgccacc    600
cctgttctcc gatgtgtaag ggctcccgct gctggggaga gagttctgag gattgtcaga    660
gcctgacgcg cactgtctgt gccggtggct gtgcccgctg caaggggcca ctgcccactg    720
actgctgcca tgagcagtgt gctgccggct gcacgggccc caagcactct gactgcctgg    780
cctgcctcca cttcaaccac agtggcatct gtgagctgca ctgcccagcc ctggtcacct    840
acaacacaga cacgtttgag tccatgccca atcccgaggg ccggtataca ttcggcgcca    900
gctgtgtgac tgcctgtccc tacaactacc tttctacgga cgtgggatcc tgcaccctcg    960
tctgccccct gcacaaccaa gaggtgacag cagaggatgg aacacagcgg tgtgagaagt   1020
gcagcaagcc ctgtgcccga gtgtgctatg gtctgggcat ggagcacttg cgagaggtga   1080
gggcagttac cagtgccaat atccaggagt ttgctggctg caagaagatc tttgggagcc   1140
tggcatttct gccggagagc tttgatgggg acccagcctc caacactgcc ccgctccagc   1200
cagagcagct ccaagtgttt gagactctgg aagagatcac aggttaccta tacatctcag   1260
catggccgga cagcctgcct gacctcagcg tcttccagaa cctgcaagta atccggggac   1320
gaattctgca caatggcgcc tactcgctga ccctgcaagg gctgggcatc agctggctgg   1380
ggctgcgctc actgagggaa ctgggcagtg gactggccct catccaccat aacacccacc   1440
tctgcttcgt gcacacggtg ccctgggacc agctctttcg gaacccgcac caagctctgc   1500
tccacactgc caaccggcca gaggacgagt gtgtgggcga gggcctggcc tgccaccagc   1560
tgtgcgcccg agggcactgc tggggtccag ggcccaccca gtgtgtcaac tgcagccagt   1620
tccttcgggg ccaggagtgc gtggaggaat gccgagtact gcaggggctc cccagggagt    1680
atgtgaatgc caggcactgt ttgccgtgcc accctgagtg tcagccccag aatggctcag    1740
tgacctgttt tggaccggag gctgaccagt gtgtggcctg tgcccactat aaggaccctc    1800
ccttctgcgt ggcccgctgc cccagcggtg tgaaacctga cctctcctac atgcccatct    1860
ggaagtttcc agatgaggag ggcgcatgcc agccttgccc catcaactgc acccactcct    1920
gtgtggacct ggatgacaag ggctgccccg ccgagcagag agccagccct ctgacgtcca    1980
tcatctctgc ggtggttggc attctgctgg tcgtggtctt gggggtggtc tttgggatcc    2040
tcatcaagcg acggcagcag aagatccgga agtacacgat gcggagactg ctgcaggaaa    2100
cggagctggt ggagccgctg acacctagcg gagcgatgcc caaccaggcg cagatgcgga    2160
tcctgaaaga gacggagctg aggaaggtga aggtgcttgg atctggcgct tttggcacag    2220
tctacaaggg catctggatc cctgatgggg agaatgtgaa aattccagtg gccatcaaag    2280
tgttgaggga aaacacatcc cccaaagcca acaaagaaat cttagacgaa gcatacgtga    2340
tggctggtgt gggctcccca tatgtctccc gccttctggg catctgcctg acatccacgg    2400
tgcagctggt gacacagctt atgccctatg gctgcctctt agaccatgtc cgggaaaacc    2460
gcggacgcct gggctcccag gacctgctga actggtgtat gcagattgcc aaggggatga    2520
gctacctgga ggatgtgcgg ctcgtacaca gggacttggc cgctcggaac gtgctggtca    2580
agagtcccaa ccatgtcaaa attacagact tcgggctggc tcggctgctg gacattgacg    2640
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tgctggaaaa gggggagcgg ctgccccagc cccccatctg caccattgat gtctacatga    2880
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ctgaattctc ccgcatggcc agggaccccc agcgctttgt ggtcatccag aatgaggact    3000
tgggcccagc cagtcccttg gacagcacct tctaccgctc actgctggag gacgatgaca    3060
tgggggacct ggtggatgct gaggagtatc tggtacccca gcagggcttc ttctgtccag    3120
accctgcccc gggcgctggg ggcatggtcc accacaggca ccgcagctca tctaccagga  3180
gtggcggtgg ggacctgaca ctagggctgg agccctctga agaggaggcc cccaggtctc  3240
cactggcacc ctccgaaggg gctggctccg atgtatttga tggtgacctg ggaatggggg  3300
cagccaaggg gctgcaaagc ctccccacac atgaccccag ccctctacag cggtacagtg  3360
aggaccccac agtacccctg ccctctgaga ctgatggcta cgttgccccc ctgacctgca  3420
gcccccagcc tgaatatgtg aaccagccag atgttcggcc ccagccccct tcgccccgag  3480
agggccctct gcctgctgcc cgacctgctg gtgccactct ggaaagggcc aagactctct  3540
ccccagggaa gaatggggtc gtcaaagacg tttttgcctt tgggggtgcc gtggagaacc  3600
ccgagtactt gacaccccag ggaggagctg cccctcagcc ccaccctcct cctgccttca  3660
gcccagcctt cgacaacctc tattactggg accaggaccc accagagcgg ggggctccac  3720
ccagcacctt caaagggaca cctacggcag agaacccaga gtacctgggt ctggacgtgc  3780
cagtgggaaa gggtgggcgc gccg                                         3804
 
<210>26
<211>8
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
 
<400>26
 
Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro
1               5
 
<210>27
<211>11
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>27
 
Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu
1               5                   10
 
<210>28
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>28
 
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro
1               5
 
<210>29
<211>19
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>29
 
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala
 
<210>30
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>PCR引物DB3F1
 
<400>30
cagatccagt tggtgcagtc tggacct                                     27
 
<210>31
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>PCR引物MIG2AEVR1
 
<400>31
aagatatctc atttacccgg agtccgggag aa                               32
 
<210>32
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物MK19EIF1
 
<400>32
aagaattcat gaagttgcct gttagg                                       26
 
<210>33
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>PCR引物KEVR1
 
<400>33
aagatatctt aacactcatt cctgttgaag ct                                32
 
<210>34
<211>1350
<212>DNA
<213>小鼠
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1350)
 
<400>34
cag atc cag ttg gtg cag tct gga cct gag ctg aag aag cct gga gag     48
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
aca gtc aag atc tcc tgc aag gct tct ggg tat acc ttc aca cac tat     96
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr
            20                  25                  30
tca atg cac tgg gtg aag cag gct cca gga aag ggt tta aag tgg atg    144
Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
        35                  40                  45
ggc tgg ata aac acc tac act gga gag cca aca tat gct gat gac ttc    192
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
    50                  55                  60
aag gga cgg ttt gcc ttc tct ttg gaa acc tct gcc agc act gcc ttt    240
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe
65                  70                  75                  80
ttg cag atc aac aac ctc aaa aat gag gac acg gct aca tat ttc tgt    288
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
gca acc tac tat agg tac gaa aga gac ttt gac tac tgg ggc caa ggc    336
Ala Thr Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
acc act ctc aca gtc tcc tca gcc aaa aca aca gcc cca tcg gtc tat    384
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr
        115                 120                 125
cca ctg gcc cct gtg tgt gga gat aca act ggc tcc tcg gtg act cta    432
Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu
    130                 135                 140
gga tgc ctg gtc aag ggt tat ttc cct gag cca gtg acc ttg acc tgg    480
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp
145                 150                 155                 160
aac tct gga tcc ctg tcc agt ggt gtg cac acc ttc cca gct gtc ctg    528
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
cag tct gac ctc tac acc ctc agc agc tca gtg act gta acc tcg agc    576
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser
            180                 185                 190
acc tgg ccc agc cag tcc atc acc tgc aat gtg gcc cac ccg gca agc    624
Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
        195                 200                 205
agc acc aag gta gac aag aaa att gag ccc aga ggg ccc aca atc aag    672
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys
    210                 215                 220
ccc tgt cct cca tgc aaa tgc cca gca cct aac ctc ttg ggt gga cca    720
Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
tcc gtc ttc atc ttc cct cca aag atc aag gat gta ctc atg atc tcc    768
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser
                245                 250                 255
ctg agc ccc ata gtc aca tgt gtg gtg gtg gat gtg agc gag gat gac    816
Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp
            260                 265                 270
cca gat gtc cag atc agc tgg ttt gtg aac aac gtg gaa gta cac aca    864
Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr
        275                 280                 285
gct cag aca caa acc cat aga gag gat tac aac agt act ctc cgg gtg     912
Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val
    290                 295                 300
gtc agt gcc ctc ccc atc cag cac cag gac tgg atg agt ggc aag gag     960
Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
ttc aaa tgc aag gtc aac aac aaa gac ctc cca gcg ccc atc gag aga    1008
Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg
                325                 330                 335
acc atc tca aaa ccc aaa ggg tca gta aga gct cca cag gta tat gtc    1056
Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val
            340                 345                 350
ttg cct cca cca gaa gaa gag atg act aag aaa cag gtc act ctg acc    1104
Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr
        355                 360                 365
tgc atg gtc aca gac ttc atg cct gaa gac att tac gtg gag tgg acc    1152
Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr
    370                 375                 380
aac aac ggg aaa aca gag cta aac tac aag aac act gaa cca gtc ctg    1200
Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val  Leu
385                 390                 395                 400
gac tct gat ggt tct tac ttc atg tac agc aag ctg aga gtg gaa aag    1248
Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys
                405                 410                 415
aag aac tgg gtg gaa aga aat agc tac tcc tgt tca gtg gtc cac gag    1296
Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu
            420                 425                 430
ggt ctg cac aat cac cac acg act aag agc ttc tcc cgg act ccg ggt    1344
Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly
        435                 440                 445
aaa tga                                                            1350
Lys
 
<210>35
<211>449
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>35
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr
            20                  25                  30
Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Thr Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser
            180                 185                 190
Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
        195                 200                 205
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys
    210                 215                 220
Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser
                245                 250                 255
Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp
            260                 265                 270
Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr
        275                 280                 285
Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val
    290                 295                 300
Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg
                325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val
            340                 345                 350
Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr
        355                 360                 365
Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr
    370                 375                 380
Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys
                405                 410                 415
Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu
            420                 425                 430
Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly
        435                 440                 445
Lys
 
<210>36
<211>660
<212>DNA
<213>小鼠
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(660)
 
<400>36
gat gtt ttg atg acc caa agt cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga     48
Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc att gta cat agt     96
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
            20                  25                  30
aat gga aac acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aaa cca ggc cag tct    144
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca    192
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca ctc agg atc    240
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65                  70                  75                  80
agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat tac tgc ttt caa ggt    288
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                85                  90                  95
tca cat gtt ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa    336
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
cgg gct gat gct gca cca act gta tcc atc ttc cca cca tcc agt gag    384
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
        115                 120                 125
cag tta aca tct gga ggt gcc tca gtc gtg tgc ttc ttg aac aac ttc    432
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
    130                 135                 140
tac ccc aaa gac atc aat gtc aag tgg aag att gat ggc agt gaa cga    480
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145                 150                 155                 160
caa aat ggc gtc ctg aac agt tgg act gat cag gac agc aaa gac agc    528
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
                165                 170                 175
acc tac agc atg agc agc acc ctc acg ttg acc aag gac gag tat gaa    576
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
            180                 185                 190
cga cat aac agc tat acc tgt gag gcc act cac aag aca tca act tca    624
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
        195                 200                 205
ccc att gtc aag agc ttc aac agg aat gag tgt taa                    660
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
     210                 215
 
<210>37
<211>219
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>37
 
Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                85                  90                  95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
       115                 120                 125
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
    130                 135                 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145                 150                 155                 160
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
                165                 170                 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
            180                 185                 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
        195                 200                 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
     210                 215
 
<210>38
<211>1350
<212>DNA
<213>小鼠
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1350)
 
<400>38
cag atc cag ttg gtg cag tct gga cct gag ctg aag aag cct gga gag     48
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
aca gtc aag atc tcc tgc aag gct tct ggg tat acc ttc ata gac tat     96
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr
             20                  25                  30
tca atg cac tgg gtg aag cag gct cca gga aag ggt tta aag tgg atg    144
Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
        35                  40                  45
ggc tgg ata aac acc tac act gga gag cca aca tat tct gat gac ttc    192
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ser Asp Asp Phe
    50                  55                  60
aag gga cgg ttt gcc ttc tct ttg gaa acc tct gcc agc act gcc tat    240
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
ttg cag atc agc aac ctc aaa aat gag gac acg gct tca tat ttc tgt    288
Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
gca acc tac tat agg tac gaa aga gac ttt gac tac tgg ggc caa ggc    336
Ala Thr Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
acc act ctc aca gtc tcc tca gcc aaa aca aca gcc cca tcg gtc tat    384
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr
        115                 120                 125
cca ctg gcc cct gtg tgt gga gat aca act ggc tcc tcg gtg act cta    432
Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu
    130                 135                 140
gga tgc ctg gtc aag ggt tat ttc cct gag cca gtg acc ttg acc tgg    480
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp
145                 150                 155                 160
aac tct gga tcc ctg tcc agt ggt gtg cac acc ttc cca gct gtc ctg    528
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
cag tct gac ctc tac acc ctc agc agc tca gtg act gta acc tcg agc    576
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser
            180                 185                 190
acc tgg ccc agc cag tcc atc acc tgc aat gtg gcc cac ccg gca agc    624
Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
        195                 200                 205
agc acc aag gtg gac aag aaa att gag ccc aga ggg ccc aca atc aag    672
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys
    210                 215                 220
ccc tgt cct cca tgc aaa tgc cca gca cct aac ctc ttg ggt gga cca    720
Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
tcc gtc ttc atc ttc cct cca aag atc aag gat gta ctc atg atc tcc    768
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser
                245                 250                 255
ctg agc ccc ata gtc aca tgt gtg gtg gtg gac gtg agc gag gat gac    816
Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp
            260                 265                 270
cca gat gtc cag atc agc tgg ttt gtg aac aac gtg gaa gta cac aca    864
Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr
        275                 280                 285
gct cag aca caa acc cat aga gag gat tac aac agt act ctc cgg gtg    912
Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val
    290                 295                 300
gtc agt gcc ctc ccc atc cag cac cag gac tgg atg agt ggc aag gag    960
Val Ser Ala Leu Pro Ile G1n His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
ttc aaa tgc aag gtc aac aac aaa gac ctc cca gcg ccc atc gag aga   1008
Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg
                325                 330                 335
acc atc tca aaa ccc aaa ggg tca gta aga gct cca cag gta tat gtc   1056
Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val
            340                 345                 350
ttg cct cca cca gaa gaa gag atg act aag aaa cag gtc act ctg acc   1104
Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr
        355                 360                 365
tgc atg gtc aca gac ttc atg cct gaa gac att tac gtg gag tgg acc   1152
Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr
    370                 375                 380
aac aac ggg aaa aca gag cta aac tac aag aac act gaa cca gtc ctg   1200
Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
gac tct gat ggt tct tac ttc atg tac agc aag ctg aga gtg gaa aag    1248
Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys
                405                 410                 415
aag aac tgg gtg gaa aga aat agc tac tcc tgt tca gtg gtc cac gag    1296
Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu
            420                 425                 430
ggt ctg cac aat cac cac acg act aag agc ttc tcc cgg act ccg ggt    1344
Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly
        435                 440                 445
aaa tga                                                            1350
Lys
 
<210>39
<211>449
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>39
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr
            20                  25                  30
Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ser Asp Asp Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Thr Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser
            180                 185                 190
Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
        195                 200                 205
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys
    210                 215                 220
Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser
                245                 250                 255
Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp
            260                 265                 270
Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr
        275                 280                 285
Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val
    290                 295                 300
Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg
                325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val
            340                 345                 350
Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr
        355                 360                 365
Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr
    370                 375                 380
Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys
                405                 410                 415
Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu
            420                 425                 430
Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly
        435                 440                 445
Lys
 
<210>40
<211>660
<212>DNA
<213>小鼠
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(660)
 
<400>40
gat gtt ttg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga     48
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc att gta cat agt     96
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
            20                  25                  30
agt gga atc acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aaa cca ggc cag tct    144
Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca    192
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca ctc aag atc    240
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat tac tgc ttt caa ggt    288
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                85                  90                  95
tca cat gtt ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa    336
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
cgg gct gat gct gca cca act gta tcc atc ttc cca cca tcc agt gag    384
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
        115                 120                 125
cag tta aca tct gga ggt gcc tca gtc gtg tgc ttc ttg aac aac ttc    432
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
    130                 135                 140
tac ccc aaa gac atc aat gtc aag tgg aag att gat ggc agt gaa cga    480
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145                 150                 155                 160
caa aat ggc gtc ctg aac agt tgg act gat cag gac agc aaa gac agc    528
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
                165                 170                 175
acc tac agc atg agc agc acc ctc acg ttg acc aag gac gag tat gaa    576
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
            180                 185                 190
cga cat aac agc tat acc tgt gag gcc act cac aag aca tca act tca    624
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
        195                 200                 205
ccc att gtc aag agc ttc aac agg aat gag tgt taa                 660
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
    210                 215
 
<210>41
<211>219
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>41
 
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
            20                  25                  30
Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                85                  90                  95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
        115                 120                 125
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
    130                 135                 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145                 150                 155                 160
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
                165                 170                 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
            180                 185                 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
        195                 200                 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
    210                 215
 
<210>42
<211>357
<212>DNA
<213>小鼠
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(357)
 
<400>42
cag atc cag ttg gtg cag tct gga cct gag ctg aag aag cct gga gag     48
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
aca gtc aag atc tcc tgc aag gct tct ggg tat acc ttc aca cac tat     96
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr
            20                  25                  30
tca atg cac tgg gtg aag cag gct cca gga aag ggt tta aag tgg atg    144
Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
        35                  40                  45
ggc tgg ata aac acc tac act gga gag cca aca tat gct gat gac ttc    192
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
    50                  55                  60
aag gga cgg ttt gcc ttc tct ttg gaa acc tct gcc agc act gcc ttt    240
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe
65                  70                  75                  80
ttg cag atc aac aac ctc aaa aat gag gac acg gct aca tat ttc tgt    288
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
gca acc tac tat agg tac gaa aga gae ttt gac tac tgg ggc caa ggc    336
Ala Thr Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
        100                 105                 110
acc act ctc aca gtc tcc tca                                        357
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
    115
 
<210>43
<211>119
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>43
 
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr
            20                  25                  30
Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Thr Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
        115
 
<210>44
<211>993
<212>DNA
<213>小鼠
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(993)
 
<400>44
gcc aaa aca aca gcc cca tcg gtc tat cca ctg gcc cct gtg tgt gga     48
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly
1               5                   10                  15 
gat aca act ggc tcc tcg gtg act cta gga tgc ctg gtc aag ggt tat     96
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
            20                  25                  30
ttc cct gag cca gtg acc ttg acc tgg aac tct gga tcc ctg tcc agt    144
Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
        35                  40                  45
ggt gtg cac acc ttc cca gct gtc ctg cag tct gac ctc tac acc ctc    192
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
    50                  55                  60
agc agc  tca gtg act gta acc tcg agc acc tgg ccc agc cagtcc atc    240
Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile
65                  70                  75                  80
acc tgc aat gtg gcc cac ccg gca agc agc acc aag gta gac aag aaa    288
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
                85                  90                  95
att gag ccc aga ggg ccc aca atc aag ccc tgt cct cca tgc aaa tgc    336
Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys
            100                 105                 110
cca gca cct aac ctc ttg ggt gga cca tcc gtc ttc atc ttc cct cca    384
Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
        115                 120                 125
aag atc aag gat gta ctc atg atc tcc ctg agc ccc ata gtc aca tgt    432
Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys
    130                 135                 140
gtg gtg gtg gat gtg agc gag gat gac cca gat gtc cag atc agc tgg    480
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
145                 150                 155                 160
ttt gtg aac aac gtg gaa gta cac aca gct cag aca caa acc cat aga    528
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
                165                 170                 175
gag gat tac aac agt act ctc cgg gtg gtc agt gcc ctc ccc atc cag    576
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
            180                 185                 190
cac cag gac tgg atg agt ggc aag gag ttc aaa tgc aag gtc aac aac    624
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
        195                 200                 205
aaa gac ctc cca gcg ccc atc gag aga acc atc tca aaa ccc aaa ggg    672
Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
    210                 215                 220
tca gta aga gct cca cag gta tat gtc ttg cct cca cca gaa gaa gag    720
Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu
225                 230                 235                 240
atg act aag aaa cag gtc act ctg acc tgc atg gtc aca gac ttc atg    768
Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met
                245                 250                 255
cct gaa gac att tac gtg gag tgg acc aac aac ggg aaa aca gag cta    816
Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu
            260                 265                 270
aac tac aag aac act gaa cca gtc ctg gac tct gat ggt tct tac ttc    864
Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
        275                 280                 285
atg tac agc aag ctg aga gtg gaa aag aag aac tgg gtg gaa aga aat    912
Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn
    290                 295                 300
agc tac tcc tgt tca gtg gtc cac gag ggt ctg cac aat cac cac acg    960
Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
305                 310                 315                 320
act aag agc ttc tcc cgg act ccg ggt aaa tga    993
Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
                325                 330
 
<210>45
<211>330
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>45
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly
1               5                   10                  15
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
    50                  55                  60
Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile
65                  70                  75                  80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
                85                  90                  95
Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
        115                 120                 125
Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys
    130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
145                 150                 155                 160
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
                165                 170                 175
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
            180                 185                 190
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
        195                 200                 205
Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
    210                 215                 220
Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu
225                 230                 235                 240
Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met
                245                 250                 255
Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu
            260                 265                 270
Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
        275                 280                 285
Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn
    290                 295                 300
Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
305                 310                 315                 320
Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
                325                 330
 
<210>46
<211>336
<212>DNA
<213>小鼠
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(336)
 
<400>46
gat gtt ttg atg acc caa agt cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga    48
Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc att gta cat agt    96
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
            20                  25                  30
aat gga aac acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aaa cca ggc cag tct    144
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca    192
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca ctc agg atc    240
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65                  70                  75                  80
agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat tac tgc ttt caa ggt    288
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                85                  90                  95
tca cat gtt ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa    336
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
 
<210>47
<211>112
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>47
 
Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                85                  90                  95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
 
<210>48
<211>324
<212>DNA
<213>小鼠
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(324)
 
<400>48
cgg gct gat gct gca cca act gta tcc atc ttc cca cca tcc agt gag     48
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1               5                   10                  15
cag tta aca tct gga ggt gcc tca gtc gtg tgc ttc ttg aac aac ttc     96
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
            20                  25                  30
tac ccc aaa gac atc aat gtc aag tgg aag att gat ggc agt gaa cga    144
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
        35                  40                  45
caa aat ggc gtc ctg aac agt tgg act gat cag gac agc aaa gac agc    192
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
    50                  55                  60
acc tac agc atg agc agc acc ctc acg ttg acc aag gac gag tat gaa    240
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65                  70                  75                  80
cga cat aac agc tat acc tgt gag gcc act cac aag aca tca act tca    288
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
                85                  90                  95
ccc att gtc aag agc ttc aac agg aat gag tgt taa                    324
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
            100                 105
 
<210>49
<211>107
<212>PRT
<213>小鼠
<400>49
 
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1               5                   10                  15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
            20                  25                  30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
        35                  40                  45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
    50                  55                  60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65                  70                  75                  80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
                85                  90                  95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
            100                 105
 
<210>50
<211>357
<212>DNA
<213>小鼠
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(357)
 
<400>50
cag atc cag ttg gtg cag tct gga cct gag ctg aag aag cct gga gag     48
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
aca gtc aag atc tcc tgc aag gct tct ggg tat acc ttc ata gac tat     96
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr
            20                  25                  30
tca atg cac tgg gtg aag cag gct cca gga aag ggt tta aag tgg atg    144
Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
        35                  40                  45
ggc tgg ata aac acc tac act gga gag cca aca tat tct gat gac ttc    192
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ser Asp Asp Phe
    50                  55                  60
aag gga cgg ttt gcc ttc tct ttg gaa acc tct gcc agc act gcc tat    240
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
ttg cag atc agc aac ctc aaa aat gag gac acg gct tca tat ttc tgt    288
Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
gca acc tac tat agg tac gaa aga gac ttt gac tac tgg ggc caa ggc    336
Ala Thr Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
acc act ctc aca gtc tcc tca                                        357
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
        115
 
<210>51
<211>119
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>51
 
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr
            20                  25                  30
Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ser Asp Asp Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Thr Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
        115
 
<210>52
<211>993
<212>DNA
<213>小鼠
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(993)
 
<400>52
gcc aaa aca aca gcc cca tcg gtc tat cca ctg gcc cct gtg tgt gga     48
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly
1               5                   10                  15
gat aca act ggc tcc tcg gtg act cta gga tgc ctg gtc aag ggt tat     96
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
            20                  25                  30
ttc cct gag cca gtg acc ttg acc tgg aac tct gga tcc ctg tcc agt    144
Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu  Ser Ser
        35                  40                  45
ggt gtg cac acc ttc cca gct gtc ctg cag tct gac ctc tac acc ctc    192
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
    50                  55                  60
agc agc tca gtg act gta acc tcg agc acc tgg ccc agc cag tcc atc    240
Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile
65                  70                  75                  80
acc tgc aat gtg gcc cac ccg gca agc agc acc aag gtg gac aag aaa    288
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
                85                  90                  95
att gag ccc aga ggg ccc aca atc aag ccc tgt cct cca tgc aaa tgc    336
Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys
            100                 105                 110
cca gca cct aac ctc ttg ggt gga cca tcc gtc ttc atc ttc cct cca    384
Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
        115                 120                 125
aag atc aag gat gta ctc atg atc tcc ctg agc ccc ata gtc aca tgt    432
Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys
    130                 135                 140
gtg gtg gtg gac gtg agc gag gat gac cca gat gtc cag atc agc tgg    480
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
145                 150                 155                 160
ttt gtg aac aac gtg gaa gta cac aca gct cag aca caa acc cat aga    528
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
                165                 170                 175
gag gat tac aac agt act ctc cgg gtg gtc agt gcc ctc ccc atc cag    576
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
            180                 185                 190
cac cag gac tgg atg agt ggc aag gag ttc aaa tgc aag gtc aac aac    624
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
        195                 200                 205
aaa gac ctc cca gcg ccc atc gag aga acc atc tca aaa ccc aaa ggg    672
Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
    210                 215                 220
tca gta aga gct cca cag gta tat gtc ttg cct cca cca gaa gaa gag    720
Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu
225                 230                 235                 240
atg act aag aaa cag gtc act ctg acc tgc atg gtc aca gac ttc atg    768
Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met
                245                 250                 255
cct gaa gac att tac gtg gag tgg acc aac aac ggg aaa aca gag cta    816
Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu
            260                 265                 270
aac tac aag aac act gaa cca gtc ctg gac tct gat ggt tct tac ttc    864
Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
        275                 280                 285
atg tac agc aag ctg aga gtg gaa aag aag aac tgg gtg gaa aga aat    912
Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn
    290                 295                 300
agc tac tcc tgt tca gtg gtc cac gag ggt ctg cac aat cac cac acg    960
Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
305                 310                 315                 320
act aag agc ttc tcc cgg act ccg ggt aaa tga                     993
Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
                 325                 330
 
<210>53
<211>330
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>53
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly
1               5                   10                  15
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
    50                  55                  60
Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile
65                  70                  75                  80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
                85                  90                  95
Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
        115                 120                 125
Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys
    130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
145                 150                 155                 160
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
                165                 170                 175
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
            180                 185                 190
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
        195                 200                 205
Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
    210                 215                 220
Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu
225                 230                 235                 240
Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met
                245                 250                 255
Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu
            260                 265                 270
Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
        275                 280                 285
Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn
    290                 295                 300
Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
305                 310                 315                 320
Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
                325                 330
 
<210>54
<211>336
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(336)
 
<400>54
gat gtt ttg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga     48
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc att gta cat agt     96
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
            20                  25                  30
agt gga atc acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aaa cca ggc cag tct    144
Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca    192
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca ctc aag atc    240
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat tac tgc ttt caa ggt    288
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                85                  90                  95
tca cat gtt ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa    336
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
 
<210>55
<211>112
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>55
 
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
            20                  25                  30
Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                85                  90                  95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
 
<210>56
<211>324
<212>DNA
<213>小鼠
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(324)
 
<400>56
cgg gct gat gct gca cca act gta tcc atc ttc cca cca tcc agt gag     48
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1               5                   10                  15
cag tta aca tct gga ggt gcc tca gtc gtg tgc ttc ttg aac aac ttc     96
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
            20                  25                  30
tac ccc aaa gac atc aat gtc aag tgg aag att gat ggc agt gaa cga    144
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
        35                  40                  45
caa aat ggc gtc ctg aac agt tgg act gat cag gac agc aaa gac agc    192
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
    50                  55                  60
acc tac agc atg agc agc acc ctc acg ttg acc aag gac gag tat gaa    240
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65                  70                  75                  80
cga cat aac agc tat acc tgt gag gcc act cac aag aca tca act tca    288
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
                85                  90                  95
ccc att gtc aag agc ttc aac agg aat gag tgt taa                     324
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
            100                 105
 
<210>57
<211>107
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>57
 
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1               5                   10                  15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
            20                  25                  30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
        35                  40                  45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
    50                  55                  60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65                  70                  75                  80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
                85                  90                  95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
            100                 105
 
<210>58
<211>30
<212>DNA
<213>小鼠
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(30)
<400>58
ggg tat acc ttc aca cac tat tca atg cac                            30
Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr Ser Met His
1               5                   10
 
<210>59
<211>10
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>59
Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr Ser Met His
1               5                   10
 
<210>60
<211>51
<212>DNA
<213>小鼠
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(51)
 
<400>60
tgg ata aac acc tac act gga gag cca aca tat gct gat gac ttc aag    48
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys
1               5                   10                  15
gga                                                                51
Gly
 
<210>61
<211>17
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>61
 
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>62
<211>30
<212>DNA
<213>小鼠
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(30)
 
<400>62
tac tat agg tac gaa aga gac ttt gac tac                            30
Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr
1               5                   10
 
<210>63
<211>10
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>63
 
Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr
1               5                   10
 
<210>64
<211>48
<212>DNA
<213>小鼠
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(48)
 
<400>64
aga tct agt cag agc att gta cat agt aat gga aac acc tat tta gaa    48
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1               5                   10                  15
 
<210>65
<211>16
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>65
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1               5                   10                  15
 
<210>66
<211>21
<212>DNA
<213>小鼠
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(21)
 
<400>66
aaa gtt tcc aac cga ttt tct                                        21
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1               5
 
<210>67
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>67
 
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1               5
 
<210>68
<211>27
<212>DNA
<213>小鼠
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(27)
 
<400>68
ttt caa ggt tca cat gtt ccg tac acg                                27
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr
1               5
 
<210>69
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>69
 
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr
1               5
 
<210>70
<211>30
<212>DNA
<213>小鼠
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(30)
 
<400>70
ggg tat acc ttc ata gac tat tca atg cac                            30
Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr Ser Met His
1               5                   10
 
<210>71
<211>10
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>71
 
Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr Ser Met His
1               5                   10
 
<210>72
<211>51
<212>DNA
<213>小鼠
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(51)
 
<400>72
tgg ata aac acc tac act gga gag cca aca tat tct gat gac ttc aag    48
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ser Asp Asp Phe Lys
1               5                   10                  15
gga                                                                51
Gly
<210>73
<211>17
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>73
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ser Asp Asp Phe Lys
1               5                   10                  15
 
Gly
<210>74
<211>30
<212>DNA
<213>小鼠
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(30)
 
<400>74
tac tat agg tac gaa aga gac ttt gac tac                            30
Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr
1               5                   10
 
<210>75
<211>10
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>75
Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr
1               5                   10
 
<210>76
<211>48
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(48)
 
<400>76
aga tct agt cag agc att gta cat agt agt gga atc acc tat tta gaa    48
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Glu
1               5                   10                  15
 
<210>77
<211>16
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>77
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Glu
1               5                   10                  15
 
<210>78
<211>21
<212>DNA
<213>小鼠
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(21)
 
<400>78
aaa gtt tcc aac cga ttt tct                                        21
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1               5
 
<210>79
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>79
 
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1               5
 
<210>80
<211>27
<212>DNA
<213>小鼠
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(27)
 
<400>80
ttt caa ggt tca cat gtt ccg tac acg                                27
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr
1               5
 
<210>81
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>81
 
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr
1               5
 
<210>82
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物N1
 
<400>82
attaggatcc gagcttccgt actgccagtg tc                                32
 
<210>83
<211>28
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>引物N2
 
<400>83
attaggatcc gccccccaag gtgaggc t                                    28
 
<210>84
<211>34
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>引物N3
 
<400>84
attaggatcc ggtcacttac cgcaagaagg gaga    34
 
<210>85
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>引物N4
 
<400>85
attaggatcc ggtccaggtg caggcactga cg       32
 
<210>86
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>引物C1
 
<400>86
aattaagctt gccgccaatc accgccaagt t       31
 
<210>87
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>引物C2
 
<400>87
aattaagctt gttgccagat ccctccgggg ac      32
 
<210>88
<211>29
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>引物C3
 
<400>88
aattaagctt caggtaggtg gtgtctggg                                    29
 
<210>89
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>引物C4
 
<400>89
aattaagctt ctcgtacttc cacactcggc                                   30
 
<210>90
<211>720
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>hSH-348-T1L
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(720)
 
<220>
<221>sig_peptide
<222>(1)..(60)
 
<400>90
atg gtg ctg cag acc cag gtg ttc atc tcc ctg ctg ctg tgg atc tcc     48
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1               5                   10                  15
ggc gca tat ggc gac ata gtg atg acc cag agc ccc ctg agc ctg ccc     96
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro
            20                  25                  30
gtg acc ccc ggc gag ccc gcc tcc atc agc tgc cgg agc agc cag agc    144
Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
        35                  40                  45
atc gtg cac agc aac ggc aac acc tac ctg gag tgg tac ctg cag aag    192
Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys
    50                  55                  60
ccc ggc cag agc ccc cag ctg ctg atc tac aag gtg agc aac cgg ttc    240
Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe
65                  70                  75                  80
agc ggc gtg ccc gac cgg ttc agc ggc agc ggc agc ggc acc gac ttc    288
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
                85                  90                  95
acc ctg aag atc agc cgg gtg gag gcc gag gac gtg ggc gtg tac tac    336
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
            100                 105                 110
tgc ttc cag ggc tcc cac gtg ccc tac acc ttc ggc cag ggc acc aag    384
Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
        115                 120                 125
gtg gag atc aag cgt acg gtg gcc gcc ccc tcc gtg ttc atc ttc ccc    432
Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
    130                 135                 140
ccc tcc gac gag cag ctg aag tcc ggc acc gcc tcc gtg gtg tgc ctg    480
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
ctg aat aac ttc tac ccc aga gag gcc aag gtg cag tgg aag gtg gac    528
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
                165                 170                 175
aac gcc ctg cag tcc ggg aac tcc cag gag agc gtg acc gag cag gac    576
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
            180                 185                 190
agc aag gac agc acc tac agc ctg agc agc acc ctg acc ctg agc aaa    624
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
        195                 200                 205
gcc gac tac gag aag cac aag gtg tac gcc tgc gag gtg acc cac cag    672
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
    210                 215                 220
ggc ctg agc tcc ccc gtc acc aag agc ttc aac agg ggg gag tgt tag    720
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
 
<210>91
<211>239
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>合成构建体
 
<400>91
 
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1               5                   10                  15
Gly Ala Tyr Gly Asp lle Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro
            20                  25                  30
Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
        35                  40                  45
Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys
    50                  55                  60
Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe
65                  70                  75                  80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
                85                  90                  95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
            100                 105                 110
Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
        115                 120                 125
Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
    130                 135                 140
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
                165                 170                 175
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
            180                 185                 190
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
        195                 200                 205
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
    210                 215                 220
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
 
<210>92
<211>48
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH348-1-T1L CDRL1
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(48)
 
<400>92
cgg agc agc cag agc atc gtg cac agc aac ggc aac acc tac ctg gag 48
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1               5                   10                  15
 
<210>93
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>93
 
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1               5                   10                  15
 
<210>94
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH348-1-T1L CDRL2
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(21)
 
<400>94
aag gtg agc aac cgg ttc agc                                      21
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1               5
 
<210>95
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>95
 
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1               5
 
<210>96
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH348-1-T1L CDRL3
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(24)
 
<400>96
ttc cag ggc tcc cac gtg ccc tac                                  24
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr
1               5
 
<210>97
<211>8
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>97
 
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr
1               5
 
<210>98
<211>720
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH348-1-T3L
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(720)
 
<220>
<221>信号肽
<222>(1)..(60)
 
<400>98
atg gtg ctg cag acc cag gtg ttc atc tcc ctg ctg ctg tgg atc tcc     48
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1               5                   10                  15
ggc gca tat ggc gac gtg ctg atg acc cag agc ccc ctg agc ctg ccc     96
Gly Ala Tyr Gly Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro
            20                  25                  30
gtg acc ccc ggc gag ccc gcc tcc atc agc tgc cgg agc agc cag agc    144
Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
        35                  40                  45
atc gtg cac agc aac ggc aac acc tac ctg gag tgg tac ctg cag aag    192
Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys
    50                  55                  60
ccc ggc cag agc ccc cag ctg ctg atc tac aag gtg agc aac cgg ttc    240
Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe
65                  70                  75                  80
agc ggc gtg ccc gac cgg ttc agc ggc agc ggc agc ggc acc gac ttc    288
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
                85                  90                  95
acc ctg aag atc agc cgg gtg gag gcc gag gac gtg ggc gtg tac tac    336
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
            100                 105                 110
tgc ttc cag ggc tcc cac gtg ccc tac acc ttc ggc cag ggc acc aag    384
Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
        115                 120                 125
gtg gag atc aag cgt acg gtg gcc gcc ccc tcc gtg ttc atc ttc ccc    432
Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lle Phe Pro
    130                 135                 140
ccc tcc gac gag cag ctg aag tcc ggc acc gcc tcc gtg gtg tgc ctg    480
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
ctg aat aac ttc tac ccc aga gag gcc aag gtg cag tgg aag gtg gac    528
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
                165                 170                 175
aac gcc ctg cag tcc ggg aac tcc cag gag agc gtg acc gag cag gac    576
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
            180                 185                 190
agc aag gac agc acc tac agc ctg agc agc acc ctg acc ctg agc aaa    624
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
        195                 200                 205
gcc gac tac gag aag cac aag gtg tac gcc tgc gag gtg acc cac cag    672
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
    210                 215                 220
ggc ctg agc tcc ccc gtc acc aag agc ttc aac agg ggg gag tgt tag    720
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
<210>99
<211>239
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>99
 
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1               5                   10                  15
Gly Ala Tyr Gly Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro
            20                  25                  30
Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
        35                  40                  45
Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys
    50                  55                  60
Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe
65                  70                  75                  80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
                85                  90                  95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
            100                 105                 110
Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
        115                 120                 125
Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
    130                 135                 140
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
                165                 170                 175
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
            180                 185                 190
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
        195                 200                 205
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
    210                 215                 220
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
 
<210>100
<211>48
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH348-1-T3L CDRL1
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(48)
 
<400>100
cgg agc agc cag agc atc gtg cac agc aac ggc aac acc tac ctg gag    48
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1               5                   10                  15
 
<210>101
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>101
 
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1               5                   10                  15
<210>102
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH348-1-T3L CDRL2
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(21)
 
<400>102
aag gtg agc aac cgg ttc agc                                      21
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1               5
 
<210>103
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>103
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1               5
 
<210>104
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH348-1-T3L CDRL3
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(24)
 
<400>104
ttc cag ggc tcc cac gtg ccc tac                                  24
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr
1               5
 
<210>105
<211>8
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>105
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr
1               5
 
<210>106
<211>1407
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH348-1-T1H
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1407)
 
<220>
<221>信号肽
<222>(1)..(57)
 
<400>106
atg aaa cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gca gct ccc aga tgg     48
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1               5                   10                  15
gtg ctg agc cag gtg cag ctg gtg cag agc ggc gcc gag gtg aag aag     96
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
            20                  25                  30
ccc ggc agc agc gtg aag gtg agc tgc aag gcc agc ggc tac acc ttc    144
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
        35                  40                  45
acc cac tac agc atg cac tgg gtg cgg cag gcc ccc ggc cag ggc ctg    192
Thr His Tyr Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
    50                  55                  60
gag tgg atg ggc tgg atc aac acc tac acc ggc gag ccc acc tac gcc    240
Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala
65                 70                  75                  80
gac gac ttc aag ggc cgg gtg acc atc acc gcc gac acc tcc acc tcc    288
Asp Asp Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser
                85                  90                  95
acc gcc tac ctg gaa ctg agc agc ctg cgg agc gag gac acc gcc gtg    336
Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
tac tac tgc gcc acc tac tac cgg tac gag cgg gac ttc gac tac tgg    384
Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr Trp
        115                 120                 125
ggc cag ggc acc ctg gtg acc gtg agc tca gcc tcc acc aag ggc cca    432
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
    130                 135                 140
agc gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggc ggc aca    480
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145                 150                 155                 160
gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccc gtg acc    528
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
                165                 170                 175
gtg agc tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccc    576
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
            180                 185                 190
gct gtc ctg cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc    624
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
        195                 200                 205
gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat    672
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
    210                 215                 220
cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aga gtt gag ccc aaa tct    720
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
225                 230                 235                 240
tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccc tgc cca gca cct gaa ctc ctg    768
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
                245                 250                 255
ggg gga ccc tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc    816
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
            260                 265                 270
atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc    864
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
        275                 280                 285
cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag    912
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
    290                 295                 300
gtg cat aat gcc aag aca aag ccc cgg gag gag cag tac aac agc acg    960
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
305                 310                 315                 320
tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat    1008
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
                325                 330                 335
ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc    1056
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
            340                 345                 350
atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggc cag ccc cgg gaa cca cag    1104
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
        355                 360                 365
gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc    1152
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
    370                 375                 380
agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg    1200
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385                 390                 395                 400
gag tgg gag agc aat ggc cag ccc gag aac aac tac aag acc acc cct    1248
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
                405                 410                 415
ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc    1296
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
            420                 425                 430
gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggc aac gtc ttc tca tgc tcc gtg    1344
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
        435                 440                 445
atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acc cag aag agc ctc tcc ctg    1392
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
    450                 455                 460
tct ccc ggc aaa tga                                                1407
Ser Pro Gly Lys
465
 
<210>107
<211>468
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>107
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1               5                   10                  15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
        35                  40                  45
Thr His Tyr Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Asp Asp Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr Trp
        115                 120                 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
    130                 135                 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145                 150                 155                 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
                165                 170                 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
            180                 185                 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
        195                 200                 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
    210                 215                 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
225                 230                 235                 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
                245                 250                 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
            260                 265                 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
        275                 280                 285
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
    290                 295                 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
305                 310                 315                 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
                325                 330                 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
            340                 345                 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
        355                 360                 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
    370                 375                 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385                 390                 395                 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
                405                 410                 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
            420                 425                 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
        435                 440                 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
    450                 455                 460
Ser Pro Gly Lys
465
 
<210>108
<211>15
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH348-1-T1H CDRH1
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(15)
 
<400>108
cac tac agc atg cac                                            15
His Tyr Ser Met His
1               5
 
<210>109
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>109
 
His Tyr Ser Met His
1               5
<210>110
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH348-1-T1H_CDRH2
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(51)
 
<400>110
tgg atc aac acc tac acc ggc gag ccc acc tac gcc gac gac ttc aag 48
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys
1               5                   10                  15
ggc                                                             51
Gly
 
<210>111
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>111
 
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
 
<210>112
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH348-1-T1H CDRH3
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(30)
 
<400>112
tac tac cgg tac gag cgg gac ttc gac tac                         30
Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr
1               5                   10
 
<210>113
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>113
Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr
1               5                   10
 
<210>114
<211>1407
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH348-1-T3H
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1407)
 
<220>
<221>信号肽
<222>(1)..(57)
 
<400>114
atg aaa cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gca gct ccc aga tgg   48
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1               5                   10                  15
gtg ctg agc cag atc cag ctg gtg cag agc ggc gcc gag gtg aag aag   96
Val Leu Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
            20                  25                  30
ccc ggc agc agc gtg aag gtg agc tgc aag gcc agc ggc tac acc ttc  144
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
        35                  40                  45
acc cac tac agc atg cac tgg gtg cgg cag gcc ccc ggc cag ggc ctg    192
Thr His Tyr Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
    50                  55                  60
aag tgg atg ggc tgg atc aac acc tac acc ggc gag ccc acc tac gcc    240
Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala
65                  70                  75                  80
gac gac ttc aag ggc cgg ttc gcc ttc agc ctg gac acc tcc acc tcc    288
Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Thr Ser
                85                  90                  95
acc gcc tac ctg gaa ctg agc agc ctg cgg agc gag gac acc gcc gtg    336
Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
tac tac tgc gcc acc tac tac cgg tac gag cgg gac ttc gac tac tgg    384
Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr Trp
        115                 120                 125
ggc cag ggc acc ctg gtg acc gtg agc tca gcc tcc acc aag ggc cca    432
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
    130                 135                 140
agc gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggc ggc aca    480
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145                 150                 155                 160
gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccc gtg acc    528
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
                165                 170                 175
gtg agc tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccc    576
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
            180                 185                 190
gct gtc ctg cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc    624
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
        195                 200                 205
gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat    672
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
    210                 215                 220
cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aga gtt gag ccc aaa tct    720
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
225                 230                 235                 240
tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccc tgc cca gca cct gaa ctc ctg     768
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
                245                 250                 255
ggg gga ccc tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc     816
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
            260                 265                 270
atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc     864
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
        275                 280                 285
cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag     912
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
    290                 295                 300
gtg cat aat gcc aag aca aag ccc cgg gag gag cag tac aac agc acg     960
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
305                 310                 315                 320
tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat    1008
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
                325                 330                 335
ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc    1056
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
            340                 345                 350
atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggc cag ccc cgg gaa cca cag    1104
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
        355                 360                 365
gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc    1152
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
    370                 375                 380
agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg    1200
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385                 390                 395                 400
gag tgg gag agc aat ggc cag ccc gag aac aac tac aag acc acc cct    1248
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
                405                 410                 415
ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc    1296
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
            420                 425                 430
gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggc aac gtc ttc tca tgc tcc gtg    1344
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
        435                 440                 445
atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acc cag aag agc ctc tcc ctg    1392
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
    450                 455                 460
tct ccc ggc aaa tga                                                1407
Ser Pro Gly Lys
465
 
<210>115
<211>468
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>115
 
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1               5                   10                  15
Val Leu Ser Gln lle Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
        35                  40                  45
Thr His Tyr Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
    50                  55                  60
Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Thr Ser
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr Trp
        115                 120                 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
    130                 135                 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145                 150                 155                 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
                165                 170                 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
            180                 185                 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
        195                 200                 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
    210                 215                 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
225                 230                 235                 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
                245                 250                 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
            260                 265                 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
        275                 280                 285
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
    290                 295                 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
305                 310                 315                 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
                325                 330                 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
            340                 345                 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
        355                 360                 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
    370                 375                 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385                 390                 395                 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
                405                 410                 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
            420                 425                 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
        435                 440                 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
    450                 455                 460
Ser Pro Gly Lys
465
 
<210>116
<211>15
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH348-1-T3H CDRHl
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(15)
<400>116
cac tac agc atg cac                                             15
His Tyr Ser Met His
1               5
 
<210>117
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>117
 
His Tyr Ser Met His
1               5
 
<210>118
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH348-1-T3H CDRH2
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(51)
 
<400>118
tgg atc aac acc tac acc ggc gag ccc acc tac gcc gac gac ttc aag 48
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys
1               5                   10                  15
ggc                                                             51
Gly
 
<210>119
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>合成构建体
<400>119
 
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
 
<210>120
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH348-1-T3H CDRH3
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(30)
 
<400>120
tac tac cgg tac gag cgg gac ttc gac tac                     30
Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr
1               5                   10
 
<210>121
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>121
 
Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr
1               5                   10
 
<210>122
<211>720
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH357-1-T1L
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(720)
 
<220>
<221>信号肽
<222>(1)..(60)
 
<400>122
atg gtg ctg cag acc cag gtg ttc atc tcc ctg ctg ctg tgg atc tcc     48
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1               5                   10                  15
ggc gca tat ggc gac ata gtg atg acc cag agc ccc ctg agc ctg ccc     96
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro
            20                  25                  30
gtg acc ccc ggc gag ccc gcc agc atc agc tgc cgg agc agc cag agc    144
Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
        35                  40                  45
atc gtg cac agc agc ggc atc acc tac ctg gag tgg tac ctg cag aag    192
Ile Val His Ser Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys
    50                  55                  60
ccc ggc cag agc ccc cag ctg ctg atc tac aag gtg agc aac cgg ttc    240
Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe
65                  70                  75                  80
agc ggc gtg ccc gac cgg ttc agc ggc agc ggc agc ggc acc gac ttc    288
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
                85                  90                  95
acc ctg aag atc agc cgg gtg gag gcc gag gac gtg ggc gtg tac tac    336
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
            100                 105                 110
tgc ttc cag ggc agc cac gtg ccc tac acc ttc ggc cag ggc acc aag    384
Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
        115                 120                 125
gtg gag atc aag cgt acg gtg gcc gcc ccc tcc gtg ttc atc ttc ccc    432
Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
    130                 135                 140
ccc tcc gac gag cag ctg aag tcc ggc acc gcc tcc gtg gtg tgc ctg    480
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
ctg aat aac ttc tac ccc aga gag gcc aag gtg cag tgg aag gtg gac    528
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
                165                 170                 175
aac gcc ctg cag tcc ggg aac tcc cag gag agc gtg acc gag cag gac    576
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
            180                 185                 190
agc aag gac agc acc tac agc ctg agc agc acc ctg acc ctg agc aaa    624
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
        195                 200                 205
gcc gac tac gag aag cac aag gtg tac gcc tgc gag gtg acc cac cag    672
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
    210                 215                 220
ggc ctg agc tcc ccc gtc acc aag agc ttc aac agg ggg gag tgt tag    720
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
22                 5230                 235
 
<210>123
<211>239
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>123
 
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1               5                   10                  15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro
            20                  25                  30
Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
        35                  40                  45
Ile Val His Ser Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys
    50                  55                  60
Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe
65                  70                  75                  80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
                85                  90                  95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
            100                 105                 110
Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
        115                 120                 125
Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
    130                 135                 140
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
                165                 170                 175
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
            180                 185                 190
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
        195                 200                 205
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
    210                 215                 220
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
 
<210>124
<211>48
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH357-1-T1L CDRL1
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(48)
<400>124
cgg agc agc cag agc atc gtg cac agc agc ggc atc acc tac ctg gag 48
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Glu
1               5                   10                  15
 
<210>125
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>125
 
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Glu
1               5                   10                  15
 
<210>126
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH357-1-T1L CDRL2
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(21)
 
<400>126
aag gtg agc aac cgg ttc agc                                     21
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1               5
 
<210>127
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>127
 
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1               5
 
<210>128
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH357-1-T1L_CDRL3
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(24)
 
<400>128
ttc cag ggc agc cac gtg ccc tac                                 24
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr
1               5
 
<210>129
<211>8
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>129
 
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr
1               5
 
<210>130
<211>720
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH357-1-T3L
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(720)
 
<220>
<221>信号肽
<222>(1)..(60)
 
<400>130
atg gtg ctg cag acc cag gtg ttc atc tcc ctg ctg ctg tgg atc tcc     48
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1               5                   10                  15
ggc gca tat ggc gac gtg ctg atg acc cag agc ccc ctg agc ctg ccc     96
Gly Ala Tyr Gly Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro
             20                  25                  30
gtg acc ccc ggc gag ccc gcc agc atc agc tgc cgg agc agc cag agc    144
Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
        35                  40                  45
atc gtg cac agc agc ggc atc acc tac ctg gag tgg tac ctg cag aag    192
Ile Val His Ser Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys
    50                  55                  60
ccc ggc cag agc ccc cag ctg ctg atc tac aag gtg agc aac cgg ttc    240
Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe
65                  70                  75                  80
agc ggc gtg ccc gac cgg ttc agc ggc agc ggc agc ggc acc gac ttc    288
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
                85                  90                  95
acc ctg aag atc agc cgg gtg gag gcc gag gac gtg ggc gtg tac tac    336
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
            100                 105                 110
tgc ttc cag ggc agc cac gtg ccc tac acc ttc ggc cag ggc acc aag    384
Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
        115                 120                 125
gtg gag atc aag cgt acg gtg gcc gcc ccc tcc gtg ttc atc ttc ccc    432
Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
    130                 135                 140
ccc tcc gac gag cag ctg aag tcc ggc acc gcc tcc gtg gtg tgc ctg    480
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
ctg aat aac ttc tac ccc aga gag gcc aag gtg cag tgg aag gtg gac    528
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
                165                 170                 175
aac gcc ctg cag tcc ggg aac tcc cag gag agc gtg acc gag cag gac    576
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
            180                 185                 190
agc aag gac agc acc tac agc ctg agc agc acc ctg acc ctg agc aaa    624
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
        195                 200                 205
gcc gac tac gag aag cac aag gtg tac gcc tgc gag gtg acc cac cag    672
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
    210                 215                 220
ggc ctg agc tcc ccc gtc acc aag agc ttc aac agg ggg gag tgt tag    720
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
 
<210>131
<211>239
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>131
 
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1               5                   10                  15
Gly Ala Tyr Gly Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro
            20                  25                  30
Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
        35                  40                  45
Ile Val His Ser Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys
    50                  55                  60
Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe
65                  70                  75                  80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
                85                  90                  95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
            100                 105                 110
Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
        115                 120                 125
Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
    130                 135                 140
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
                165                 170                 175
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
            180                 185                 190
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
        195                 200                 205
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
    210                 215                 220
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
 
<210>132
<211>48
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH357-1-T3L CDRL1
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(48)
 
<400>132
cgg agc agc cag agc atc gtg cac agc agc ggc atc acc tac ctg gag    48
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Glu
1               5                   10                  15
<210>133
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>合成构建体
<400>133
 
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Glu
1               5                   10                  15
 
<210>134
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH357-1-T3L CDRL2
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(21)
 
<400>134
aag gtg agc aac cgg ttc agc                                      21
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1               5
 
<210>135
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>135
 
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1               5
 
<210>136
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>hSH357-l-T3L CDRL3
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(24)
 
<400>136
ttc cag ggc agc cac gtg ccc tac                                      24
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr
1               5
 
<210>137
<211>8
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>137
 
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr
1               5
 
<210>138
<211>1407
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH357-1-T1H
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1407)
 
<220>
<221>信号肽
<222>(1)..(57)
 
<400>138
atg aaa cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gca gct ccc aga tgg      48
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1               5                   10                  15
gtg ctg agc cag gtg cag ctg gtg cag tcc ggc gcc gag gtg aag aag     96
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
            20                  25                  30
ccc ggc gcc tcc gtg aag gtg tcc tgt aag gcc tcc ggc tac acc ttc    144
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
        35                  40                  45
atc gac tac tcc atg cac tgg gtg agg cag gcc ccc ggc cag ggc ctg    192
Ile Asp Tyr Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
    50                  55                  60
gag tgg atg ggc tgg atc aac acc tac acc ggc gag ccc acc tac tcc    240
Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ser
65                  70                  75                  80
gac gac ttc aag ggc agg gtg acc atc acc gcc gac acc tcc acc agc    288
Asp Asp Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser
                85                  90                  95
acc gcc tac ctg gag ctg tcc tcc ctg agg tcc gag gac acc gcc gtg    336
Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
tac tac tgt gcc acc tac tac agg tac gag agg gac ttc gac tac tgg    384
Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr Trp
        115                 120                 125
ggc cag ggc acc ctg gtg acg gtg agc tca gcc tcc acc aag ggc cca    432
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
    130                 135                 140
agc gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggc ggc aca    480
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145                 150                 155                 160
gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccc gtg acc    528
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
                165                 170                 175
gtg agc tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccc    576
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
            180                 185                 190
gct gtc ctg cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc    624
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
        195                 200                 205
gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat    672
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
    210                 215                 220
cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aga gtt gag ccc aaa tct     720
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
225                 230                 235                 240
tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccc tgc cca gca cct gaa ctc ctg     768
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
                245                 250                 255
ggg gga ccc tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc     816
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
            260                 265                 270
atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc     864
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
        275                 280                 285
cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag     912
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
    290                 295                 300
gtg cat aat gcc aag aca aag ccc cgg gag gag cag tac aac agc acg     960
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
305                 310                 315                 320
tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat    1008
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
                325                 330                 335
ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc    1056
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
            340                 345                 350
atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggc cag ccc cgg gaa cca cag    1104
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
        355                 360                 365
gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc    1152
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
    370                 375                 380
agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg    1200
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385                 390                 395                 400
gag tgg gag agc aat ggc cag ccc gag aac aac tac aag acc acc cct    1248
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
                405                 410                 415
ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc    1296
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
            420                 425                 430
gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggc aac gtc ttc tca tgc tcc gtg    1344
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
        435                 440                 445
atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acc cag aag agc ctc tcc ctg    1392
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
    450                 455                 460
tct ccc ggc aaa tga                                                1407
Ser Pro Gly Lys
465
 
<210>139
<211>468
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>139
 
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1               5                   10                  15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
        35                  40                  45
Ile Asp Tyr Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ser
65                  70                  75                  80
Asp Asp Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser
                 85                  90                  95
Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr Trp
        115                 120                 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
    130                 135                 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145                 150                 155                 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
                165                 170                 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
            180                 185                 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
        195                 200                 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
    210                 215                 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
225                 230                 235                 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
                245                 250                 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
            260                 265                 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
        275                 280                 285
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
    290                 295                 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
305                 310                 315                 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
                325                 330                 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
            340                 345                 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
        355                 360                 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
    370                 375                 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385                 390                 395                 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
                405                 410                 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
            420                 425                 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
        435                 440                 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
    450                 455                 460
Ser Pro Gly Lys
465
 
<210>140
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH357-1-T1H CDRH1
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(18)
 
<400>140
atc gac tac tcc atg cac                                         18
Ile Asp Tyr Ser Met His
1               5
 
<210>141
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>141
 
Ile Asp Tyr Ser Met His
1               5
 
<210>142
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH357-1-T1H CDRH2
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(51)
 
<400>142
tgg atc aac acc tac acc ggc gag ccc acc tac tcc gac gac ttc aag 48
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ser Asp Asp Phe Lys
1               5                   10                  15
ggc                                                             51
Gly
 
<210>143
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>143
 
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ser Asp Asp Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
 
<210>144
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH357-1-T1H CDRH3
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(30)
 
<400>144
tac tac agg tac gag agg gac ttc gac tac                     30
Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr
1               5                   10
 
<210>145
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>145
 
Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr
1               5                   10
 
<210>146
<211>1407
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH357-1-T3H
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1407)
 
<220>
<221>信号肽
<222>(1)..(57)
 
<400>146
atg aaa cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gca gct ccc aga tgg     48
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1               5                   10                  15
gtg ctg agc cag atc cag ctg gtg cag tcc ggc gcc gag gtg aag aag     96
Val Leu Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
            20                  25                  30
ccc ggc gcc tcc gtg aag gtg tcc tgt aag gcc tcc ggc tac acc ttc    144
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
        35                  40                  45
atc gac tac tcc atg cac tgg gtg agg cag gcc ccc ggc cag ggc ctg    192
Ile Asp Tyr Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
    50                  55                  60
aag tgg atg ggc tgg atc aac acc tac acc ggc gag ccc acc tac tcc    240
Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ser
65                  70                  75                  80
gac gac ttc aag ggc agg ttc gcc ttc tcc ctg gac acc tcc acc agc    288
Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Thr Ser
                85                  90                  95
acc gcc tac ctg gag ctg tcc tcc ctg agg tcc gag gac acc gcc gtg    336
Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
tac tac tgt gcc acc tac tac agg tac gag agg gac ttc gac tac tgg    384
Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr Trp
        115                 120                 125
ggc cag ggc acc ctg gtg acg gtg agc tca gcc tcc acc aag ggc cca    432
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
    130                 135                 140
agc gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggc ggc aca    480
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145                 150                 155                 160
gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccc gtg acc    528
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
                165                 170                 175
gtg agc tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccc    576
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
            180                 185                 190
gct gtc ctg cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc    624
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
       195                 200                 205
gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat    672
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
    210                 215                 220
cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aga gtt gag ccc aaa tct    720
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
225                 230                 235                 240
tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccc tgc cca gca cct gaa ctc ctg    768
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
                245                 250                 255
ggg gga ccc tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc    816
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
            260                 265                 270
atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc    864
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
        275                 280                 285
cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag    912
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
    290                 295                 300
gtg cat aat gcc aag aca aag ccc cgg gag gag cag tac aac agc acg    960
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
305                 310                 315                 320
tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat   1008
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
                325                 330                 335
ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc   1056
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
            340                 345                 350
atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggc cag ccc cgg gaa cca cag    1104
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
        355                 360                 365
gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc    1152
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
    370                 375                 380
agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg    1200
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385                 390                 395                 400
gag tgg gag agc aat ggc cag ccc gag aac aac tac aag acc acc cct    1248
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
                405                 410                 415
ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc    1296
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
            420                 425                 430
gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggc aac gtc ttc tca tgc tcc gtg    1344
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
        435                 440                 445
atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acc cag aag agc ctc tcc ctg    1392
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
    450                 455                 460
tct ccc ggc aaa tga                                                1407
Ser Pro Gly Lys
465
 
<210>147
<211>468
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>147
 
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1               5                   10                  15
Val Leu Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
        35                  40                  45
Ile Asp Tyr Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
    50                  55                  60
Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ser
65                  70                  75                  80
Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Thr Ser
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr Trp
        115                 120                 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
    130                 135                 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145                 150                 155                 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
                165                 170                 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
            180                 185                 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
        195                 200                 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
    210                 215                 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
225                 230                 235                 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
                245                 250                 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
            260                 265                 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
        275                 280                 285
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
    290                 295                 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
305                 310                 315                 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
                325                 330                 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
            340                 345                 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
        355                 360                 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
    370                 375                 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385                 390                 395                 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
                405                 410                 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
            420                 425                 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
        435                 440                 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
    450                 455                 460
Ser Pro Gly Lys
465
 
<210>148
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH357-1-T3H CDRH1
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(18)
 
<400>148
atc gac tac tcc atg cac                                      18
Ile Asp Tyr Ser Met His
1               5
 
<210>149
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>149
 
Ile Asp Tyr Ser Met His
1               5
 
<210>150
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH357-1-T3H CDRH2
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(51)
 
<400>150
tgg atc aac acc tac acc ggc gag ccc acc tac tcc gac gac ttc aag 48
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ser Asp Asp Phe Lys
1               5                   10                  15
ggc                                                             51
Gly
 
<210>151
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>151
 
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ser Asp Asp Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
 
<210>152
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH357-1-T3H CDRH3
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(30)
 
<400>152
tac tac agg tac gag agg gac ttc gac tac                         30
Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>153
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>合成构建体
 
<400>153
 
Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr
1               5                   10
 
<210>154
<211>520
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>IgGL恒定区+信号序列
 
<400>154
ctaggtaagc ttggtaccac ccaagctggc taggtaagct tgctagcgcc accatggtgc   60
tgcagaccca ggtgttcatc tccctgctgc tgtggatctc cggcgcatat ggcgatatcg  120
tgatgattaa acgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc tccgacgagc  180
agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac cccagagagg  240
ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag gagagcgtga  300
ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc ctgagcaaag  360
ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc ctgagctccc  420
ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gttaggggcc cgtttaaacg ggtggcatcc  480
ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt                        520
 
<210>155
<211>1140
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>IgGH恒定区+信号序列
<400>155
ttggtaccac ccaagctggc taggtaagct tgctagcgcc accatgaaac acctgtggtt   60
cttcctcctg ctggtggcag ctcccagatg ggtgctgagc caggtgcaat tgtgcaggcg  120
gttagctcag cctccaccaa gggcccaagc gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc  180
acctctggcg gcacagccgc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaacccgtg  240
accgtgagct ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc cgctgtcctg  300
cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc  360
acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga  420
gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cctgcccagc acctgaactc  480
ctggggggac cctcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc  540
cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag  600
ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc ccgggaggag  660
cagtacaaca gcacgtaccg ggtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg  720
aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa  780
accatctcca aagccaaagg ccagccccgg gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc  840
cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc  900
agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat ggccagcccg agaacaacta caagaccacc  960
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1020
agcaggtggc agcagggcaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1080
cactacaccc agaagagcct ctccctgtct cccggcaaat gagatatcgg gcccgtttaa 1140
 
<210>156
<211>442
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH348-1-T1L+信号序列
 
<400>156
aggtaagctt gctagcgcca ccatggtgct gcagacccag gtgttcatct ccctgctgct   60
gtggatctcc ggcgcatatg gcgacatagt gatgacccag agccccctga gcctgcccgt  120
gacccccggc gagcccgcct ccatcagctg ccggagcagc cagagcatcg tgcacagcaa  180
cggcaacacc tacctggagt ggtacctgca gaagcccggc cagagccccc agctgctgat  240
ctacaaggtg agcaaccggt tcagcggcgt gcccgaccgg ttcagcggca gcggcagcgg  300
caccgacttc accctgaaga tcagccgggt ggaggccgag gacgtgggcg tgtactactg  360
cttccagggc tcccacgtgc cctacacctt cggccagggc accaaggtgg agatcaagcg  420
tacggtggcc gccccctccg tg                                           442
 
<210>157
<211>442
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH348-1-T3L+信号序列
 
<400>157
aggtaagctt gctagcgcca ccatggtgct gcagacccag gtgttcatct ccctgctgct     60
gtggatctcc ggcgcatatg gcgacgtgct gatgacccag agccccctga gcctgcccgt    120
gacccccggc gagcccgcct ccatcagctg ccggagcagc cagagcatcg tgcacagcaa    180
cggcaacacc tacctggagt ggtacctgca gaagcccggc cagagccccc agctgctgat    240
ctacaaggtg agcaaccggt tcagcggcgt gcccgaccgg ttcagcggca gcggcagcgg    300
caccgacttc accctgaaga tcagccgggt ggaggccgag gacgtgggcg tgtactactg    360
cttccagggc tcccacgtgc cctacacctt cggccagggc accaaggtgg agatcaagcg    420
tacggtggcc gccccc tccg tg                                            442
 
<210>158
<211>460
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH348-1-T1H+信号序列
 
<400>158
gtaagcttgc tagcgcacca tgaagcacct gtggttcttc ctgctgctgg tggccgcccc   60
cagatgggtg ctgagccagg tgcagctggt gcagagcggc gccgaggtga agaagcccgg  120
cagcagcgtg aaggtgagct gcaaggccag cggctacacc ttcacccact acagcatgca  180
ctgggtgcgg caggcccccg gccagggcct ggagtggatg ggctggatca acacctacac  240
cggcgagccc acctacgccg acgacttcaa gggccgggtg accatcaccg ccgacacctc  300
cacctccacc gcctacctgg aactgagcag cctgcggagc gaggacaccg ccgtgtacta  360
ctgcgccacc tactaccggt acgagcggga cttcgactac tggggccagc gcaccctggt  420
gaccgtgagc tcagcctcct ccaccaaggg cccctccgtg                        460
 
<210>159
<211>460
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH348-1-T3H+信号序列
 
<400>159
gtaagcttgc tagcgcacca tgaagcacct gtggttcttc ctgctgctgg tggccgcccc   60
cagatgggtg ctgagccaga tccagctggt gcagagcggc gccgaggtga agaagcccgg  120
cagcagcgtg aaggtgagct gcaaggccag cggctacacc ttcacccact acagcatgca  180
ctgggtgcgg caggcccccg gccagggcct gaagtggatg ggctggatca acacctacac  240
cggcgagccc acctacgccg acgacttcaa gggccggttc gccttcagcc tggacacctc  300
cacctccacc gcctacctgg aactgagcag cctgcggagc gaggacaccg ccgtgtacta  360
ctgcgccacc tactaccggt acgagcggga cttcgactac tggggccagc gcaccctggt  420
gaccgtgagc tcagcctcct ccaccaaggg cccctccgtg                        460
 
<210>160
<211>442
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH357-1-T1L+信号序列
<400>160
aggtaagctt gctagcgcca ccatggtgct gcagacccag gtgttcatct ccctgctgct     60
gtggatctcc ggcgcatatg gcgacatagt gatgacccag agccccctga gcctgcccgt    120
gacccccggc gagcccgcca gcatcagctg ccggagcagc cagagcatcg tgcacagcag    180
cggcatcacc tacctggagt ggtacctgca gaagcccggc cagagccccc agctgctgat    240
ctacaaggtg agcaaccggt tcagcggcgt gcccgaccgg ttcagcggca gcggcagcgg    300
caccgacttc accctgaaga tcagccgggt ggaggccgag gacgtgggcg tgtactactg    360
cttccagggc agccacgtgc cctacacctt cggccagggc accaaggtgg agatcaagcg    420
tacggtggcc gccccctccg tg                                             442
 
<210>161
<211>442
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH357-1-T3L+信号序列
 
<400>161
aggtaagctt gctagcgcca ccatggtgct gcagacccag gtgttcatct ccctgctgct     60
gtggatctcc ggcgcatatg gcgacgtgct gatgacccag agccccctga gcctgcccgt    120
gacccccggc gagcccgcca gcatcagctg ccggagcagc cagagcatcg tgcacagcag    180
cggcatcacc tacctggagt ggtacctgca gaagcccggc cagagccccc agctgctgat    240
ctacaaggtg agcaaccggt tcagcggcgt gcccgaccgg ttcagcggca gcggcagcgg    300
caccgacttc accctgaaga tcagccgggt ggaggccgag gacgtgggcg tgtactactg    360
cttccagggc agccacgtgc cctacacctt cggccagggc accaaggtgg agatcaagcg    420
tacggtggcc gccccctccg tg                                             442
 
<210>162
<211>460
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH357-1-T1H+信号序列
<400>162
gtaagcttgc tagcgcacca tgaagcacct gtggttcttc ctgctgctgg tggccgcccc   60
cagatgggtg ctgagccagg tgcagctggt gcagtccggc gccgaggtga agaagcccgg  120
cgcctccgtg aaggtgtcct gtaaggcctc cggctacacc ttcatcgact actccatgca  180
ctgggtgagg caggcccccg gccagggcct ggagtggatg ggctggatca acacctacac  240
cggcgagccc acctactccg acgacttcaa gggcagggtg accatcaccg ccgacacctc  300
caccagcacc gcctacctgg agctgtcctc cctgaggtcc gaggacaccg ccgtgtacta  360
ctgtgccacc tactacaggt acgagaggga cttcgactac tggggccagg gcaccctggt  420
gacggtgagc tcagcctcct ccaccaaggg cccctccgtg                        460
 
<210>163
<211>460
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>hSH357-1-T3H+信号序列
 
<400>163
gtaagcttgc tagcgcacca tgaagcacct gtggttcttc ctgctgctgg tggccgcccc   60
cagatgggtg ctgagccaga tccagctggt gcagtccggc gccgaggtga agaagcccgg  120
cgcctccgtg aaggtgtcct gtaaggcctc cggctacacc ttcatcgact actccatgca  180
ctgggtgagg caggcccccg gccagggcct gaagtggatg ggctggatca acacctacac  240
cggcgagccc acctactccg acgacttcaa gggcaggttc gccttctccc tggacacctc  300
caccagcacc gcctacctgg agctgtcctc cctgaggtcc gaggacaccg ccgtgtacta  360
ctgtgccacc tactacaggt acgagaggga cttcgactac tggggccagg gcaccctggt  420
gacggtgagc tcagcctcct ccaccaaggg cccctccgtg                        460

Claims (45)

1.一种抗体，所述抗体识别由产生自杂交瘤SH348-1(FERMBP-10836)的抗体识别的表位。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体具有以下a)-d)的性质：
a)不具有磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力；
b)具有针对表达EPHA2的细胞的ADCC活性；
c)具有针对表达EPHA2的细胞的CDC活性；和
d)具有体内抗肿瘤活性。
3.权利要求1的抗体，其中所述抗体具有以下a)-e)的性质：
a)不具有磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力；
b)表现出降低EPHA2蛋白水平的作用；
c)具有针对表达EPHA2的细胞的ADCC活性；
d)具有针对表达EPHA2的细胞的CDC活性；和
e)具有体内抗肿瘤活性。
4.一种抗体，所述抗体特异性结合由序列表中SEQ ID NO：8的第426-534位氨基酸所表示的氨基酸序列组成的多肽。
5.一种抗体，所述抗体特异性结合由序列表中SEQ ID NO：8的第426-534位氨基酸所表示的氨基酸序列组成的多肽并且具有以下a)-d)的性质：
a)不具有磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力；
b)具有针对表达EPHA2的细胞的ADCC活性；
c)具有针对表达EPHA2的细胞的CDC活性；和
d)具有体内抗肿瘤活性。
6.一种抗体，所述抗体特异性结合由序列表中SEQ ID NO：8的第426-534位氨基酸所表示的氨基酸序列组成的多肽并且具有以下a)-e)的性质：
a)不具有磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力；
b)表现出降低EPHA2蛋白水平的作用；
c)具有针对表达EPHA2的细胞的ADCC活性；
d)具有针对表达EPHA2的细胞的CDC活性；和
e)具有体内抗肿瘤活性。
7.权利要求1-6中任一项的抗体，其中所述抗体特异性结合由序列表中SEQ ID NO：8的第439-534位氨基酸所表示的氨基酸序列组成的肽。
8.权利要求1-7中任一项的抗体，其中所述抗体抑制由EPHA2配体诱导的EPHA2酪氨酸残基的磷酸化。
9.权利要求1-7中任一项的抗体，其中所述抗体不抑制EPHA2配体结合EPHA2，但抑制由所述配体诱导的EPHA2酪氨酸残基的磷酸化。
10.一种抗体，所述抗体特异性结合由序列表中SEQ ID NO：8所表示的氨基酸序列组成的多肽，其中所述抗体具有作为重链可变区中的互补决定区的由序列表中SEQ ID NO：59、61和63表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列，并且具有作为轻链可变区中的互补决定区的由序列表中SEQ ID NO：65、67和69表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列。
11.一种特异性结合由序列表中SEQ ID NO：8所表示的氨基酸序列组成的多肽的抗体，所述抗体特征在于以下1)和2)：
1)具有包含由通式(I)表示的氨基酸序列的重链肽：
-FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4-(I)
其中，FRH1表示由18-30个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRH1表示由序列表中SEQ ID NO：59表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；FRH2表示由14个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRH2表示由序列表中SEQ ID NO：61表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；FRH3表示由32个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRH3表示由序列表中SEQ ID NO：63表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；而FRH4表示由11个氨基酸组成的任意氨基酸序列，其中这些氨基酸彼此通过肽键连接；和
2)具有包含由通式(II)表示的氨基酸序列的轻链多肽：
-FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4-(II)
其中，FRL1表示由23个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRL1表示由序列表中SEQ ID NO：65表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；FRL2表示由15个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRL2表示由序列表中SEQ ID NO：67表示的氨基酸序列；FRL3表示由32个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRL3表示由序列表中SEQ ID NO：69表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；而FRL4表示由10个氨基酸组成的任意氨基酸序列；其中这些氨基酸彼此通过肽键连接。
12.一种抗体，所述抗体识别由产生自杂交瘤SH357-1(FERMBP-10837)的抗体识别的表位。
13.权利要求12的抗体，其中所述抗体具有以下a)-d)的性质：
a)不具有磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力；
b)具有针对表达EPHA2的细胞的ADCC活性；
c)具有针对表达EPHA2的细胞的CDC活性；和
d)具有体内抗肿瘤活性。
14.一种抗体，所述抗体特异性结合由序列表中SEQ ID NO：8的第426-534位氨基酸表示的氨基酸序列组成的肽并且具有以下a)-e)的性质：
a)不具有磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力；
b)不表现出降低EPHA2蛋白水平的作用；
c)具有针对表达EPHA2的细胞的ADCC活性；
d)具有针对表达EPHA2的细胞的CDC活性；和
e)具有体内抗肿瘤活性。
15.权利要求12-14中任一项的抗体，其中所述抗体特异性结合由序列表中SEQ ID NO：8的第439-534位氨基酸表示的氨基酸序列组成的肽。
16.权利要求12-15中任一项的抗体，其中所述抗体抑制由EPHA2配体诱导的EPHA2酪氨酸残基的磷酸化。
17.权利要求12-15中任一项的抗体，其中所述抗体不抑制EPHA2配体结合EPHA2，但抑制由所述配体诱导的EPHA2酪氨酸残基的磷酸化。
18.一种抗体，所述抗体特异性结合由序列表中SEQ ID NO：8表示的氨基酸序列组成的多肽，其中所述抗体具有作为重链可变区中的互补决定区的由序列表中SEQ ID NO：71、73和75表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列，并且具有作为轻链可变区中的互补决定区的由序列表中SEQ ID NO：77、79和81表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列。
19.一种特异性结合由序列表中SEQ ID NO：8所表示的氨基酸序列组成的多肽的抗体，所述抗体特征在于以下1)和2)：
1)具有包含由通式(I)表示的氨基酸序列的重链肽：
-FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4-(I)
其中，FRH1表示由18-30个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRH1表示由序列表中SEQ ID NO：71表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；FRH2表示由14个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRH2表示由序列表中SEQ ID NO：73表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；FRH3表示由32个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRH3表示由序列表中SEQ ID NO：75表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；而FRH4表示由11个氨基酸组成的任意氨基酸序列，其中这些氨基酸彼此通过肽键连接；和
2)具有包含由通式(II)表示的氨基酸序列的轻链多肽：
-FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4-(II)
其中，FRL1表示由23个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRL1表示由序列表中SEQ ID NO：77表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；FRL2表示由15个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRL2表示由序列表中SEQ ID NO：79表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；FRL3表示由32个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRL3表示由序列表中SEQ ID NO：81表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；而FRL4表示由10个氨基酸组成的任意氨基酸序列；其中这些氨基酸彼此通过肽键连接。
20.权利要求1-19中任一项的抗体，其特征在于所述抗体为人源化抗体。
21.权利要求1-19中任一项的抗体，其特征在于所述抗体为人抗体。
22.权利要求1-19中任一项的抗体，其特征在于所述抗体为IgG抗体。
23.权利要求1-9和12-17中任一项的抗体，其特征在于所述抗体为选自以下的任何抗体：Fab、F(ab′)2、Fv、scFv、双抗体、线性抗体和多特异性抗体。
24.一种抗体，所述抗体产生自杂交瘤SH348-1(FERMBP-10836)。
25.一种抗体，所述抗体产生自杂交瘤SH357-1(FERMBP-10837)。
26.一种抗体，所述抗体由以下1)和2)组成：
1)包含由序列表中SEQ ID NO：35的第1-119位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多肽或包含由序列表中SEQ ID NO：39的第1-119位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多肽；和
2)包含由序列表中SEQ ID NO：37的第1-112位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽和包含由序列表中SEQ ID NO：41的第1-112位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽。
27.一种抗体，所述抗体由以下1)或2)组成：
1)包含由序列表中SEQ ID NO：35的第1-119位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多肽，和包含由序列表中SEQ ID NO：37的第1-112位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽；和
2)包含由序列表中SEQ ID NO：39的第1-119位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多肽，和包含由序列表中SEQ ID NO：41的第1-112位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽。
28.一种抗体，所述抗体由以下1)和2)组成：
1)包含由序列表中SEQ ID NO：35表示的氨基酸序列的重链多肽，或包含由序列表中SEQ ID NO：39表示的氨基酸序列的重链多肽；和
2)包含由序列表中SEQ ID NO：37表示的氨基酸序列的轻链多肽，或包含由序列表中SEQ ID NO：41表示的氨基酸序列的轻链多肽。
29.一种抗体，所述抗体由以下1)或2)组成：
1)包含由序列表中SEQ ID NO：35表示的氨基酸序列的重链多肽和包含由序列表中SEQ ID NO：37表示的氨基酸序列的轻链多肽；和
2)包含由序列表中SEQ ID NO：39表示的氨基酸序列的重链多肽和包含由序列表中SEQ ID NO：41表示的氨基酸序列的轻链多肽。
30.一种抗体，所述抗体通过人源化权利要求24-29中任一项的抗体得到。
31.一种抗体，所述抗体由以下1)和2)组成：
1)包含由序列表中SEQ ID NO：107的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多肽，或包含由序列表中SEQ ID NO：115的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多肽；和
2)包含由序列表中SEQ ID NO：91的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽，或包含由序列表中SEQ ID NO：99的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽。
32.一种抗体，所述抗体由以下1)或2)组成：
1)包含由序列表中SEQ ID NO：107的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多肽，和包含由序列表的SEQ ID NO：91的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽；和
2)包含由序列表中SEQ ID NO：115的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多肽，和包含由序列表中SEQ ID NO：99的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽。
33.一种抗体，所述抗体由以下1)和2)组成：
1)包含由序列表中SEQ ID NO：139的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多肽，或包含由序列表中SEQ ID NO：147的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多肽；和
2)包含由序列表中SEQ ID NO：123的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽，或包含由序列表中SEQ ID NO：131的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽。
34.一种抗体，所述抗体由以下1)或2)组成：
1)包含由序列表中SEQ ID NO：139的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多肽，和包含由序列表中SEQ ID NO：123的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽；和
2)包含由序列表中SEQ ID NO：147的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多肽，和包含由序列表中SEQ ID NO：131的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽。
35.衍生自权利要求24-34中任一项的任何抗体的Fab、F(ab′)2、Fv、scFv、双抗体、线性抗体或多特异性抗体。
36.选自以下1)-20)中任何一种的多肽：
1)包含由序列表中SEQ ID NO：35的第1-119位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
2)包含由序列表中SEQ ID NO：39的第1-119位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
3)包含由序列表中SEQ ID NO：37的第1-112位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
4)包含由序列表中SEQ ID NO：41的第1-112位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
5)包含由序列表中SEQ ID NO：107的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
6)包含由序列表中SEQ ID NO：115的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
7)包含由序列表中SEQ ID NO：107的第20-138位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
8)包含由序列表中SEQ ID NO：115的第20-138位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
9)包含由序列表中SEQ ID NO：91的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
10)包含由序列表中SEQ ID NO：99的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
11)包含由序列表中SEQ ID NO：91的第21-134位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
12)包含由序列表中SEQ ID NO：99的第21-134位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
13)包含由序列表中SEQ ID NO：139的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
14)包含由序列表中SEQ ID NO：147的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
15)包含由序列表中SEQ ID NO：139的第20-138位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
16)包含由序列表中SEQ ID NO：147的第20-138位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
17)包含由序列表中SEQ ID NO：123的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
18)包含由序列表中SEQ ID NO：131的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；
19)包含由序列表中SEQ ID NO：123的第21-134位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；和
20)包含由序列表中SEQ ID NO：131的第21-134位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽。
37.小鼠杂交瘤SH348-1(FERM BP-10836)。
38.小鼠杂交瘤SH357-1(FERM BP-10837)。
39.一种药物组合物，所述药物组合物特征在于包含选自权利要求1-35的抗体中的至少一种抗体。
40.一种用于癌症治疗的药物组合物，所述药物组合物特征在于包含选自权利要求1-35的抗体中的至少一种抗体。
41.一种用于抑制哺乳动物中肿瘤生长的方法，所述方法包括给予选自权利要求1-35、39和40的抗体中的任何抗体。
42.权利要求41的用于抑制肿瘤生长的方法，所述方法特征在于所述肿瘤为表达EPHA2的肿瘤。
43.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1-36中任一项的抗体或多肽。
44.一种宿主细胞，所述宿主细胞转化了权利要求43的多核苷酸。
45.一种用于制备抗体的方法，所述方法利用权利要求44的宿主细胞。
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