JP2013198492A - 抗ｅｐｈａ２抗体 - Google Patents

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Abstract

【課題】 細胞の癌化及び／又は腫瘍細胞増殖抑制活性を有する抗体等を提供すること。
【解決手段】ハイブリドーマＳＨ３４８−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３６）又はハイブリドーマＳＨ３５７−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３７）が産生する抗体によって認識されるエピトープを認識する抗体、ハイブリドーマＳＨ３４８−１又はハイブリドーマＳＨ３５７−１が産生する抗体、ハイブリドーマＳＨ３４８−１又はハイブリドーマＳＨ３５７−１が産生する抗体をヒト化した抗体、該抗体を有効成分として含有する医薬等の提供。
【選択図】なし

Description

本発明は、細胞の癌化及び／又は腫瘍細胞増殖抑制活性を有する抗体、より具体的には、ＥＰＨＡ２に対する抗体、該抗体を含有する医薬組成物に関する。
ＥＰＨＡ２は、分子量１３０ｋＤａの１回膜貫通構造を有するレセプター型チロシンキナーゼである（Ｍｏｃｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９０年、第１０巻、ｐ．６３１６−６３２４）。ＥＰＨＡ２のＮ末端側の細胞外領域には、リガンド結合ドメインと２ヶ所のフィブロネクチンタイプ３ドメインが存在し、Ｃ末端側の細胞内領域にはチロシンキナーゼドメインとｓｔｅｒｉｌｅ−α−ｍｏｔｉｆ（ＳＡＭ）ドメインが存在している。
ＥＰＨＡ２のリガンドとしては、ＧＰＩアンカー型細胞膜蛋白質のＥｐｈｒｉｎ−Ａ１〜Ａ５が知られている（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８年、第２１巻、ｐ．３０９−３４５）。ＥＰＨＡ２にリガンドが結合することによりチロシンキナーゼドメインが活性化され、ＥＰＨＡ２の細胞内領域に存在するチロシン残基がリン酸化され、細胞内にシグナルが伝達される。また、リガンドと結合したＥＰＨＡ２はエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれ、最終的にプロテアソームで分解されることが報告されている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００２年、第１巻、ｐ．７９−８７）。
ＥＰＨＡ２は臨床的に多くの癌、特に乳癌、食道癌、前立腺癌、胃癌、非小細胞肺癌、大腸癌、多形神経膠芽腫での高発現が報告されている（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００１年、第６１巻、ｐ．２３０１−２３０６、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、２００３年、第１０３巻、ｐ．６５７−６６３、Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ、１９９９年、第４１巻、ｐ．２７５−２８０、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２００３年、第１６３巻、ｐ．２２７１−２２７６、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００５年、第９６巻、ｐ．４２−４７、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００３年、第９巻、ｐ．６１３−６１８、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ、２００４年、第１１巻、ｐ．６０５−６１１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００５年、第３巻、ｐ．５４１−５５１）。また、食道癌では、ＥＰＨＡ２発現陽性の患者で局所リンパ節転移の頻度やリンパ節転移の数、癌の低分化度が高いこと、また、ＥＰＨＡ２発現陽性の患者では５年生存率が低いこと（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、２００３年、第１０３巻、ｐ．６５７−６６３）、非小細胞肺癌ではＥＰＨＡ２を高発現している患者で無病生存率が低いこと、再発、特に脳への転移が起こりやすいこと（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００３年、第９巻、ｐ．６１３−６１８）、大腸癌においてはＥＰＨＡ２発現陽性の患者で肝転移、リンパ管浸潤、リンパ節転移が起こりやすいこと、臨床ステージの高い患者にＥＰＨＡ２発現陽性の患者が多いことが報告されている（Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ、２００４年、第１１巻、ｐ．６０５−６１１）。
また、ＥＰＨＡ２遺伝子を細胞に導入することによって、非癌細胞が足場非依存的増殖能や細胞外基質上での管状形態形成能、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍増殖能といった癌形質を獲得するようになること（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００１年、第６１巻、ｐ．２３０１−２３０６）、癌細胞の細胞外基質に対する浸潤性が亢進すること（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２００４年、第３２０巻、 ｐ．１０９６−１１０２、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００４年、第２３巻、ｐ．１４４８−１４５６）が報告されている。逆にＥＰＨＡ２の発現をｓｉＲＮＡで抑制すると癌細胞の浸潤性や足場非依存的増殖、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍増殖が抑制されること（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００４年、第２３巻、ｐ．１４４８−１４５６、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００２年、第６２巻、ｐ．２８４０−２８４７）及び、リガンドであるＥｐｈｒｉｎ−Ａ１とヒトＩｇＧのＦｃ領域との融合蛋白質を使用してＥＰＨＡ２を活性化し、エンドサイトーシスによるＥＰＨＡ２の分解を誘導することで癌細胞の浸潤性や足場非依存的増殖、管状形態形成能が抑制されること（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００１年、第６１巻、ｐ．２３０１−２３０６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００５年、第３巻、ｐ．５４１−５５１、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２００４年、第３２０巻、 ｐ．１０９６−１１０２）が報告されている。
一方でＥＰＨＡ２は、癌細胞のみならず腫瘍内または周囲の血管にも発現していることが報告されている（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２０００年、第１９巻、ｐ．６０４３−６０５２）。マウスにおいてはＥｐｈｒｉｎ−Ａ１によって誘導される血管新生にＥＰＨＡ２シグナルが関与していること、特に血管内皮細胞に発現するＥＰＨＡ２が血管内皮細胞の管空形成や生存に必要とされることが報告されており（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００４年、第１１７巻、ｐ．２０３７−２０４９）、ＥＰＨＡ２の細胞外領域とヒトＩｇＧのＦｃ領域との融合蛋白質がｉｎ ｖｉｖｏで血管新生を抑制し、抗腫瘍効果を示すことも報告されている（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００２年、第２１巻、ｐ．７０１１−７０２６）。
モノクローナル抗体は、診断薬としてのみならず治療薬としても有用であり、特に癌治療の分野でモノクローナル抗体の利用が積極的に行われており、ＨＥＲ２やＥＧＦＲなどのレセプター型チロシンキナーゼやＣＤ２０の細胞外領域に対するモノクローナル抗体が癌治療に用いられ優れた効果を発揮している（Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００７年、第３５７巻、ｐ．３９−５１、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００７年、第２６巻、ｐ．３６６１−３６７８、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００７年、第２６巻、ｐ．３６０３−３６１３）。癌治療に用いられるモノクローナル抗体の作用機構としては、アポトーシスの誘導や増殖シグナルの阻害の他、ＡＤＣＣやＣＤＣなどの免疫反応を介した作用も非常に重要な役割を果たしていると考えられている。実際、抗ＨＥＲ２抗体（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）や抗ＣＤ２０抗体（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）を、ＡＤＣＣの誘導に必要なＦｃγＲを欠損させたヌードマウスｘｅｎｏｇｒａｆｔに投与すると、ＦｃγＲを欠損していないヌードマウスに投与した場合と比較しこれらの抗体の抗腫瘍効果が著しく減弱されることが報告されており（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０００年、第６巻、ｐ．４４３−４４６）、また、コブラ毒素を投与し補体を枯渇させたマウスに抗ＣＤ２０抗体（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）を投与すると、補体を枯渇させていないマウスに投与した場合と比較し抗腫瘍効果が減弱することが報告されている（Ｂｌｏｏｄ、２００４年、第１０３巻、ｐ．２７３８−２７４３）。
ＥＰＨＡ２に関しては、リガンドと同じようにＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化誘導活性とＥＰＨＡ２の分解誘導活性を持つアゴニスト抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体が乳癌細胞株の足場非依存的増殖や細胞外基質上での管状形態形成を阻害することが報告されている（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００２年、第６２巻、ｐ．２８４０−２８４７）。また、非癌細胞に比べ癌細胞で露出しているＥＰＨＡ２上のエピトープを認識し、ＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化誘導活性とＥＰＨＡ２の分解誘導活性を有するアゴニスト抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体がｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍効果を示すことが報告されている（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００３年、第６３巻、ｐ．７９０７−７９１２、国際公開第ＷＯ０３／０９４８５９号パンフレット）。一方で、Ｋｉｅｗｌｉｃｈらの抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体は、ＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化誘導活性とＥＰＨＡ２の分解誘導活性を有するもののｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍効果を示さなかったことが報告されている（Ｎｅｏｐｌａｓｉａ、２００６年、第８巻、ｐ．１８−３０）。
また、国際公開WO２００６／０８４２２６号パンフレットには、癌細胞をマウスに免疫して取得した抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体であるＬＵＣＡ１９、ＳＧ５、ＬＵＣＡ４０、ＳＰＬ１が記載されており、これらの抗体については、ＬＵＣＡ１９とＳＧ５がＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化に影響を及ぼさないこと、ＬＵＣＡ４０がｉｎ ｖｉｔｒｏで癌細胞の増殖を阻害すること、ＬＵＣＡ１９、ＳＧ５及びＬＵＣＡ４０が毒素（ｓａｐｏｒｉｎ）標識された抗マウス抗体存在下で癌細胞内にインターナライズされることが記載されている。また、ＬＵＣＡ４０とＳＰＬ１については、ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍効果を示すことが報告されているが、アゴニスト活性を有するか否かについては明らかとなっていない。
これらの研究にもかかわらず、現在までのところｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍効果を示す抗ＥＰＨＡ２抗体のエピトープについては明確になっておらず、ＥＰＨＡ２の細胞外領域中の特定のアミノ酸配列が癌治療を目的としたモノクローナル抗体のエピトープとして有用であるという報告はない。
同一の抗原に対する抗体であっても、エピトープや抗体の配列が異なることによって、抗体の性質は異なる。そして、これらの性質が異なることによって、臨床でヒトに投与した場合に薬剤の有効性や治療応答性の頻度、副作用や薬剤耐性の発生頻度等の点で異なる反応を示すことになる。
したがって、どのような性質を持つ薬剤が臨床上最良かは患者によっても異なり、実際に薬剤を投与してみないと分からない場合も多く、新規作用機作を有する薬剤の創出が強く望まれている。ＥＰＨＡ２に対する抗体についても、従来とは異なる性質を有する抗体の創出が強く求められていた。
本発明の１つの課題は、ＥＰＨＡ２に対する抗体を提供することである。
本発明の他の１つの課題は癌に対して治療効果を有する抗ＥＰＨＡ２抗体を含有する医薬組成物等を提供することである。
本発明の他の一つの課題は、該抗体の製造方法を提供することである。
本発明の他の一つの課題は、該抗体を用いた腫瘍の増殖の抑制方法等を提供することである。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意、検討を行ったところ、ＥＰＨＡ２のチロシン残基のリン酸化誘導活性を有さずにＥＰＨＡ２発現癌細胞に対しＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性を有する新規の抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体を取得することに成功した。そして、この抗体のエピトープを調べることによりＥＰＨＡ２中に２つ存在するフィブロネクチンタイプ３ドメインのＣ末端側のドメインを含む領域に結合する抗体がｉｎ ｖｉｖｏで優れた抗腫瘍活性を持つことを初めて見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
（１）ハイブリドーマＳＨ３４８−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３６）が産生する抗体によって認識されるエピトープを認識する抗体、
（２）以下のａ）乃至ｄ）に示される性質を有する、（１）に記載の抗体：
ａ）ＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化能を有さない；
ｂ）ＥＰＨＡ２発現細胞に対してＡＤＣＣ活性を有する；
ｃ）ＥＰＨＡ２発現細胞に対してＣＤＣ活性を有する；
ｄ）Ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する、
（３）以下のａ）乃至ｅ）に示される性質を有する、（１）に記載の抗体：
ａ）ＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化能を有さない；
ｂ）ＥＰＨＡ２蛋白質量の減少作用を示す；
ｃ）ＥＰＨＡ２発現細胞に対してＡＤＣＣ活性を有する；
ｄ）ＥＰＨＡ２発現細胞に対してＣＤＣ活性を有する；
ｅ）Ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する、
（４）配列表の配列番号８のアミノ酸番号４２６乃至５３４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体、
（５）配列表の配列番号８のアミノ酸番号４２６乃至５３４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合し、以下のａ）乃至ｄ）に示される性質を有する抗体：
ａ）ＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化能を有さない；
ｂ）ＥＰＨＡ２発現細胞に対してＡＤＣＣ活性を有する；
ｃ）ＥＰＨＡ２発現細胞に対してＣＤＣ活性を有する；
ｄ）Ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する、
（６）配列表の配列番号８のアミノ酸番号４２６乃至５３４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合し、以下のａ）乃至ｅ）に示される性質を有する抗体：
ａ）ＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化能を有さない；
ｂ）ＥＰＨＡ２蛋白質量の減少作用を示す；
ｃ）ＥＰＨＡ２発現細胞に対してＡＤＣＣ活性を有する；
ｄ）ＥＰＨＡ２発現細胞に対してＣＤＣ活性を有する；
ｅ）Ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する、
（７）配列表の配列番号８のアミノ酸番号４３９乃至５３４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する、（１）乃至（６）から選択されるいずれか一つに記載の抗体、
（８）ＥＰＨＡ２リガンドにより誘導されるＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化を抑制する、（１）乃至（７）から選択されるいずれか一つに記載の抗体、
（９）ＥＰＨＡ２リガンドのＥＰＨＡ２に対する結合を阻害するのではなく、リガンドにより誘導されるＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化を抑制する、（１）乃至（７）から選択されるいずれか一つに記載の抗体、
（１０）重鎖可変領域の相補性決定領域として、配列表の配列番号５９、６１及び６３に示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域の相補性決定領域として、配列表の配列番号６５、６７及び６９に示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する、配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体、
（１１）以下の１）及び２）の特徴を有する、配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体：
１）一般式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ペプチドを有する；
−ＦＲＨ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲＨ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲＨ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲＨ４−（Ｉ）
（式中、ＦＲＨ１は１８乃至３０個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＨ１は配列表の配列番号５９で示されるアミノ酸配列又は１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ２は１４個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、ＣＤＲＨ２は配列表の配列番号６１で示されるアミノ酸配列又は１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ３は３２個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、ＣＤＲＨ３は配列表の配列番号６３で示されるアミノ酸配列又は１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ４は１１個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。）；
２）一般式（ＩＩ）で示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖ポリペプチドを有する；
−ＦＲＬ１−ＣＤＲＬ１−ＦＲＬ２−ＣＤＲＬ２−ＦＲＬ３−ＣＤＲＬ３−ＦＲＬ４−（ＩＩ）
（式中、ＦＲＬ１は２３個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＬ１は配列表の配列番号６５で示されるアミノ酸配列又は１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ２は１５個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、ＣＤＲＬ２は配列表の配列番号６７で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ３は３２個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、ＣＤＲＬ３は配列表の配列番号６９で示されるアミノ酸配列又は１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ４は１０個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。）、
（１２）ハイブリドーマＳＨ３５７−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３７）が産生する抗体によって認識されるエピトープを認識する抗体、
（１３）以下のａ）乃至ｄ）に示される性質を有する、（１２）に記載の抗体：
ａ）ＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化能を有さない；
ｂ）ＥＰＨＡ２発現細胞に対してＡＤＣＣ活性を有する；
ｃ）ＥＰＨＡ２発現細胞に対してＣＤＣ活性を有する；
ｄ）Ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する、
（１４）配列表の配列番号８のアミノ酸番号４２６乃至５３４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合し、以下のａ）乃至ｅ）に示される性質を有する抗体：
ａ）ＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化能を有さない；
ｂ）ＥＰＨＡ２蛋白質量の減少作用を示さない；
ｃ）ＥＰＨＡ２発現細胞に対してＡＤＣＣ活性を有する；
ｄ）ＥＰＨＡ２発現細胞に対してＣＤＣ活性を有する；
ｅ）Ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する、
（１５）配列表の配列番号８のアミノ酸番号４３９乃至５３４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する、（１２）乃至（１４）から選択されるいずれか一つに記載の抗体、
（１６）ＥＰＨＡ２リガンドにより誘導されるＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化を抑制する、（１２）乃至（１５）から選択されるいずれか一つに記載の抗体、
（１７）ＥＰＨＡ２リガンドのＥＰＨＡ２に対する結合を阻害するのではなく、リガンドにより誘導されるＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化を抑制する、（１２）乃至（１５）から選択されるいずれか一つに記載の抗体、
（１８）重鎖可変領域の相補性決定領域として、配列表の配列番号７１、７３及び７５に示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域の相補性決定領域として、配列表の配列番号７７、７９及び８１に示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する、配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体、
（１９）以下の１）及び２）に示される特徴を有する、配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体：
１）一般式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ペプチドを有する；
−ＦＲＨ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲＨ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲＨ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲＨ４−（Ｉ）
（式中、ＦＲＨ１は１８乃至３０個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＨ１は配列表の配列番号７１で示されるアミノ酸配列又は１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ２は１４個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、ＣＤＲＨ２は配列表の配列番号７３で示されるアミノ酸配列又は１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ３は３２個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、ＣＤＲＨ３は配列表の配列番号７５で示されるアミノ酸配列又は１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ４は１１個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。）；
２）一般式（ＩＩ）で示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖ポリペプチドを有する；
−ＦＲＬ１−ＣＤＲＬ１−ＦＲＬ２−ＣＤＲＬ２−ＦＲＬ３−ＣＤＲＬ３−ＦＲＬ４−（ＩＩ）
（式中、ＦＲＬ１は２３個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＬ１は配列表の配列番号７７で示されるアミノ酸配列又は１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ２は１５個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、ＣＤＲＬ２は配列表の配列番号７９で示されるアミノ酸配列又は１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ３は３２個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、ＣＤＲＬ３は配列表の配列番号８１で示されるアミノ酸配列又は１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ４は１０個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。）、
（２０）ヒト化抗体であることを特徴とする、（１）乃至（１９）から選択されるいずれか１つに記載の抗体、
（２１）ヒト抗体であることを特徴とする、（１）乃至（１９）から選択されるいずれか１つに記載の抗体、
（２２）ＩｇＧ抗体であることを特徴とする、（１）乃至（１９）から選択されるいずれか１つに記載の抗体、
（２３）Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦＶ、ディアボディー、線状抗体及び多特異的抗体から選択されるいずれかであることを特徴とする、（１）乃至（９）及び、（１２）乃至（１７）から選択されるいずれか１つに記載の抗体、
（２４）ハイブリドーマＳＨ３４８−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３６）が産生する抗体、
（２５）ハイブリドーマＳＨ３５７−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３７）が産生する抗体、
（２６）以下の１）及び２）からなる抗体：
１）配列表の配列番号３５のアミノ酸番号１乃至１１９に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド又は配列表の配列番号３９のアミノ酸番号１乃至１１９に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド；
２）配列表の配列番号３７のアミノ酸番号１乃至１１２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド又は配列表の配列番号４１のアミノ酸番号１乃至１１２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド、
（２７）以下の１）又は２）からなる抗体：
１）配列表の配列番号３５のアミノ酸番号１乃至１１９に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド及び、配列表の配列番号３７のアミノ酸番号１乃至１１２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド；
２）配列表の配列番号３９のアミノ酸番号１乃至１１９に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド及び、配列表の配列番号４１のアミノ酸番号１乃至１１２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド、
（２８）以下の１）及び２）からなる抗体：
１）配列表の配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド又は配列表の配列番号３９に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド；
２）配列表の配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド又は配列表の配列番号４１に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド。
（２９）以下の１）又は２）からなる抗体：
１）配列表の配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド及び、配列表の配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド；
２）配列表の配列番号３９に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド及び、配列表の配列番号４１に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド、
（３０）（２４）乃至（２９）から選択されるいずれか１つに記載の抗体をヒト化した抗体、
（３１）以下の１）及び２）からなる抗体：
１）配列表の配列番号１０７のアミノ酸番号２０乃至４６８に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド又は配列表の配列番号１１５のアミノ酸番号２０乃至４６８に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド；
２）配列表の配列番号９１のアミノ酸番号２１乃至２３９に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド又は配列表の配列番号９９のアミノ酸番号２１乃至２３９に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド、
（３２）以下の１）又は２）からなる抗体：
１）配列表の配列番号１０７のアミノ酸番号２０乃至４６８に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド及び、配列表の配列番号９１のアミノ酸番号２１乃至２３９に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド；
２）配列表の配列番号１１５のアミノ酸番号２０乃至４６８に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド及び、配列表の配列番号９９のアミノ酸番号２１乃至２３９に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド、
（３３）以下の１）及び２）からなる抗体：
１）配列表の配列番号１３９のアミノ酸番号２０乃至４６８に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド又は配列表の配列番号１４７のアミノ酸番号２０乃至４６８に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド；
２）配列表の配列番号１２３のアミノ酸番号２１乃至２３９に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド又は配列表の配列番号１３１のアミノ酸番号２１乃至２３９に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド、
（３４）以下の１）又は２）からなる抗体：
１）配列表の配列番号１３９のアミノ酸番号２０乃至４６８に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド及び、配列表の配列番号１２３のアミノ酸番号２１乃至２３９に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド；
２）配列表の配列番号１４７のアミノ酸番号２０乃至４６８に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド及び、配列表の配列番号１３１のアミノ酸番号２１乃至２３９に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド、
（３５）（２４）乃至（３４）から選択されるいずれかに記載の抗体の、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦＶ、ディアボディー、線状抗体及び多特異的抗体から選択されるいずれか一つ、
（３６）以下の１）乃至２０）からなる群から選択されるいずれか一つのポリペプチド：
１）配列表の配列番号３５のアミノ酸番号１乃至１１９に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
２）配列表の配列番号３９のアミノ酸番号１乃至１１９に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
３）配列表の配列番号３７のアミノ酸番号１乃至１１２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
４）配列表の配列番号４１のアミノ酸番号１乃至１１２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
５）配列表の配列番号１０７のアミノ酸番号２０乃至４６８に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
６）配列表の配列番号１１５のアミノ酸番号２０乃至４６８に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
７）配列表の配列番号１０７のアミノ酸番号２０乃至１３８に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
８）配列表の配列番号１１５のアミノ酸番号２０乃至１３８に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
９）配列表の配列番号９１のアミノ酸番号２１乃至２３９に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
１０）配列表の配列番号９９のアミノ酸番号２１乃至２３９に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
１１）配列表の配列表の配列番号９１のアミノ酸番号２１乃至１３４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
１２）配列表の配列番号９９のアミノ酸番号２１乃至１３４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
１３）配列表の配列番号１３９のアミノ酸番号２０乃至４６８に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
１４）配列表の配列番号１４７のアミノ酸番号２０乃至４６８に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
１５）配列表の配列番号１３９のアミノ酸番号２０乃至１３８に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
１６）配列表の配列番号１４７のアミノ酸番号２０乃至１３８に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
１７）配列表の配列番号１２３のアミノ酸番号２１乃至２３９に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
１８）配列表の配列番号１３１のアミノ酸番号２１乃至２３９に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
１９）配列表の配列番号１２３のアミノ酸番号２１乃至１３４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
２０）配列表の配列番号１３１のアミノ酸番号２１乃至１３４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（３７）マウスハイブリドーマＳＨ３４８−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３６）、
（３８）マウスハイブリドーマＳＨ３５７−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３７）。
（３９）（１）乃至（３６）から選択される抗体の少なくともいずれか１つを含有することを特徴とする、医薬組成物、
（４０（１）乃至（３６）から選択される抗体の少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、癌の治療用医薬組成物、
（４１）（１）乃至（３６）、及び、（３９）、（４０）からなる群から選択されるいずれかを投与することによる、哺乳動物の有する腫瘍の増殖の抑制方法、
（４２）腫瘍が、ＥＰＨＡ２を発現している腫瘍であることを特徴とする、（４１）に記載の腫瘍の増殖の抑制方法、
（４３）（１）乃至（３６）から選択されるいずれか一つに記載の抗体又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（４４）（４３）に記載のポリヌクレオチドによって形質転換された宿主細胞、
（４５）（４４）に記載の宿主細胞を用いた抗体の製造方法、
からなる。
本発明により、ＥＰＨＡ２のチロシン残基のリン酸化誘導活性を有さずにＥＰＨＡ２発現癌細胞に対しＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性を有する新規の抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体を取得することに成功した。そして、該抗体がｉｎ ｖｉｖｏで優れた抗腫瘍活性を持つことが見出された。
そして、該抗体を含む癌治療用医薬組成物が提供された。
抗ＥＰＨＡ２抗体によるＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化誘導活性の有無を示すウエスタンブロッティングの結果を示す図。Ａ）：架橋抗体非存在下の結果を示す図、上段は４Ｇ１０抗体の結果を示し、下段は抗ＥＰＨＡ２抗体（Ｄ７）の結果を示す。Ｂ）：架橋抗体存在下の結果を示す図、上段は４Ｇ１０抗体での結果を示し、下段は抗ＥＰＨＡ２抗体（Ｄ７）での結果を示す。 抗ＥＰＨＡ２抗体によるＥＰＨＡ２蛋白質量の低下を誘導する活性の有無を示すウエスタンブロッティングの結果を示す図。Ａ）：架橋抗体非存在下の結果を示す図、上段は抗ＥＰＨＡ２抗体（Ｄ７）での結果を示し、下段は抗β−ａｃｔｉｎ抗体での結果を示す。Ｂ）：架橋抗体存在下の結果を示す図、上段は抗ＥＰＨＡ２抗体（Ｄ７）での結果を示し、下段は抗β−ａｃｔｉｎ抗体での結果を示す。 抗ＥＰＨＡ２抗体の各種細胞に対するＡＤＣＣ活性の有無を示す図。図中の「＊＊」はＰ＜０．０１を示し、「＊＊＊」はＰ＜０．００１を示す。Ａ）：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するＡＤＣＣ活性を示す図。Ｂ）：Ａ５４９細胞に対するＡＤＣＣ活性を示す図。Ｃ）：ＰＣ−３細胞に対するＡＤＣＣ活性を示す図。 抗ＥＰＨＡ２抗体の各種細胞に対するＣＤＣ活性の有無を示す図。図中の「＊＊＊」はＰ＜０．００１を示す。Ａ）：ＳＨ３４８−１のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するＣＤＣ活性を示す図。Ｂ）：ＳＨ３４８−１のＡ５４９細胞に対するＣＤＣ活性を示す図。Ｃ）：ＳＨ３４８−１のＰＣ−３細胞に対するＣＤＣ活性を示す図。Ｄ）：ＳＨ３５７−１のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するＣＤＣ活性を示す図。Ｅ）：ＳＨ３５７−１のＡ５４９細胞に対するＣＤＣ活性を示す図。Ｆ）：ＳＨ３５７−１のＰＣ−３細胞に対するＣＤＣ活性を示す図。 Ａ）ＥＰＨＡ２のドメイン構造予測及びエピトープ決定用のペプチドＥＰＨＡ２−ＥＣＤ、ＦＮＩＩＩ−ＮＣ、ＦＮＩＩＩ−Ｎ、ＦＮＩＩＩ−ＣのＥＰＨＡ２中での位置を示す図。図中でＬｉｇａｎｄ−ＢＤはリガンド結合ドメイン、ＦＮ３はフィブロネクチンタイプ３ドメイン、ＴＭは膜貫通領域、Ｔｒｋ ｋｉｎａｓｅはチロシンキナーゼドメイン、ＳＡＭはＳＡＭドメインを示す。
Ｂ）ＥＰＨＡ２−ＥＣＤ、ＦＮＩＩＩ−ＮＣ、ＦＮＩＩＩ−Ｎ及びＦＮＩＩＩ−Ｃに対する抗ＥＰＨＡ２抗体の結合性の有無を示す図。
Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を移植されたマウスに対するＳＨ３４８−１の抗腫瘍活性を示す図。
Ｂ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を移植されたマウスに対するＳＨ３５７−１の抗腫瘍活性を示す図。図中のエラーバーは標準誤差（ｎ＝９）を示す。
Ａ）ＳＨ３４８−１のＥＰＨＡ２細胞外領域ポリペプチドに対する結合活性を示す図。
Ｂ）ＳＨ３５７−１のＥＰＨＡ２細胞外領域ポリペプチドに対する結合活性を示す図。
Ｃ）Ａｂ９６−１のＥＰＨＡ２細胞外領域ポリペプチドに対する結合活性を示す図。
ＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１及びＡｂ９６−１のリガンド結合阻害活性を示す図。 ＳＨ３４８−１及びＳＨ３５７−１がＥｐｈｒｉｎ−Ａ１依存的ＥＰＨＡ２チロシン残基リン酸化を阻害する活性を有することを示す図。 エピトープ同定用のＥＰＨＡ２欠損変異体の概略を示す図。 Ａ）ＳＨ３４８−１のＥＰＨＡ２欠損変異体に対する反応性を示す図。
Ｂ）図１１Ａ）のＰＶＤＦ膜上のＥＰＨＡ２欠損変異体の検出を示す図。
Ｃ）ＳＨ３５７−１のＥＰＨＡ２欠損変異体に対する反応性を示す図。
Ｄ）図１１Ｃ）のＰＶＤＦ膜上のＥＰＨＡ２欠損変異体の検出を示す図。
Ａ）ｈＳＨ３４８−１−Ｔ１のＥＰＨＡ２細胞外領域ポリペプチドに対する結合活性を示す図。
Ｂ）ｈＳＨ３４８−１−Ｔ３のＥＰＨＡ２細胞外領域ポリペプチドに対する結合活性を示す図。
Ｃ）ｈＳＨ３５７−１−Ｔ１のＥＰＨＡ２細胞外領域ポリペプチドに対する結合活性を示す図。
Ｄ）ｈＳＨ３５７−１−Ｔ３のＥＰＨＡ２細胞外領域ポリペプチドに対する結合活性を示す図。
Ａ）ＳＨ３４８−１の抗原結合に対するｈＳＨ３４８−１−Ｔ１及びｈＳＨ３４８−１−Ｔ３の競合阻害活性を示す図。
Ｂ）ＳＨ３５７−１の抗原結合に対するｈＳＨ３５７−１−Ｔ１及びｈＳＨ３５７−１−Ｔ３の競合阻害活性を示す図。
Ａ）ｈＳＨ３４８−１−Ｔ１、ｈＳＨ３４８−１−Ｔ３がＥｐｈｒｉｎ−Ａ１依存的ＥＰＨＡ２チロシン残基リン酸化を阻害する活性を示す図。
Ｂ）ｈＳＨ３５７−１−Ｔ１、ｈＳＨ３５７−１−Ｔ３がＥｐｈｒｉｎ−Ａ１依存的ＥＰＨＡ２チロシン残基リン酸化を阻害する活性を示す図。
１．定義
本明細書中においては、「癌」と「腫瘍」は同じ意味に用いている。
本明細書中において、「遺伝子」という語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びそのｃＲＮＡも含まれるものとする。したがって、本発明における「ＥＰＨＡ２遺伝子」には、ＥＰＨＡ２のＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びｃＲＮＡが含まれる。
本明細書中において、「ポリヌクレオチド」という語は核酸と同じ意味で用いており、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、及びプライマーも含まれている。
本明細中においては、「ポリペプチド」と「蛋白質」は区別せずに用いている。
本明細書中において、「細胞」には、動物個体内の細胞、培養細胞も含んでいる。
本明細書中において、「細胞の癌化」とは、細胞が接触阻止現象への感受性を喪失することや、足場非依存性増殖を示すこと等、細胞が異常な増殖を示すことをいい、このような異常な増殖を示す細胞を「癌細胞」という。
本明細書中においては、ＥＰＨＡ２が有する細胞の癌化活性及び／又は細胞増殖活性等と同等の機能を有する蛋白質もＥＰＨＡ２という。
本明細書中における、「チロシン残基のリン酸化」とは、ペプチドのアミノ酸配列に含まれるチロシン残基がリン酸化されることをいい、チロシン残基がリン酸化されているか否かは、例えば、ペプチドと抗リン酸化チロシン抗体（例えば、Ａｎｔｉ−Ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ４Ｇ１０ ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｕｐｓａｔｅ）社製 ＃１６−１８４）との結合性を調べ、該抗体と結合するときには、チロシン残基がリン酸化されていると判定することが出来る。本明細書中における「ＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化能」とは、ＥＰＨＡ２のアミノ酸配列中のチロシン残基をリン酸化する能力をいい、抗体がＥＰＨＡ２のチロシン残基のリン酸化能を有するか否かは、例えば、抗体とＥＰＨＡ２をインキュベーションした後に、ＥＰＨＡ２と抗リン酸化チロシン抗体との結合性があるかないかで判定することが出来る。
本明細書中において、「ＥＰＨＡ２蛋白質の発現量が減少する」とは、ＥＰＨＡ２蛋白質の量が減少することをいい、抗体がＥＰＨＡ２蛋白質の量を減少させる作用を有するか否かは、例えば、抗体とＥＰＨＡ２をインキュベーションした後に、ＥＰＨＡ２の量を定量することによって調べることが出来る。
本明細書中において、「ＥＰＨＡ２リガンド」とは、ＥＰＨＡ２のリガンドとなり得る物質を示し、その具体例としては、ＧＰＩアンカー型細胞膜蛋白質のＥｐｈｒｉｎ−Ａ１〜Ａ５を挙げることができる（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８年、第２１巻、ｐ．３０９−３４５）。
本明細書中における、「細胞傷害」とは、何らかの形で、細胞に病理的な変化をもたらすことをいい、直接的な外傷にとどまらず、ＤＮＡの切断や塩基の二量体の形成、染色体の切断、細胞分裂装置の損傷、各種酵素活性の低下などあらゆる細胞の構造や機能上の損傷をいう。本明細書中における「細胞障害活性」とは上記細胞傷害を引き起こすことをいう。
本明細書中における、ＡＤＣＣとは、抗体依存性細胞障害（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）と同義であり、Ｆｃγレセプター保有細胞が、標的細胞の表面抗原に結合した抗体のＦｃ部分にＦｃγレセプターを介して付着し、標的細胞を殺す反応のことをいい、ＡＤＣＣ活性とは、抗体依存性細胞障害活性ともいい、上記反応の活性のことをいう。ＡＤＣＣ活性は当業者が通常行う方法で測定することが出来るが、例えば、本明細書中の実施例３の３）−２の項目に記載の方法によって測定することが出来る。
本明細書中における、「ＣＤＣ」とは、補体依存性細胞障害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）と同義であり、ＣＤＣ活性とは補体依存性細胞障害を起こす活性のことをいう。ＣＤＣ活性は当業者が通常行う方法によって測定することが出来るが、例えば、本明細書中の実施例３の３）−３に記載の方法によって測定することが出来る。
本明細書中において、「Ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する。」とは、腫瘍を有する動物個体の腫瘍の増殖を抑制又は減少させる活性を有することを意味する。抗ＥＰＨＡ２抗体が「Ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する。」か否かは当業者が通常行う方法によって調べることが出来るが、例えば以下の方法によっても調べることが出来る。すなわち、腫瘍細胞（例えば、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）が皮下移植されているヌードマウス（例えば、ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃ１−ｎｕ／ｎｕ；日本クレア社より入手）に被験物質として抗ＥＰＨＡ２抗体を腹腔内に適当量投与し、腫瘍体積の経時変化を抗ＥＰＨＡ２抗体を投与しなかったコントロールと比較し、コントロールに比して腫瘍の体積が有意に小さい場合には、被験物質である該抗ＥＰＨＡ２抗体は「Ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する。」と判断することが出来る。
抗体分子の重鎖及び軽鎖にはそれぞれ３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｔａｒｙ ｄｅｔｅｒｒｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）があることが知られている。本明細書中においては、抗体の相補性決定領域について、重鎖の相補性決定領域をＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３と表記し、軽鎖の相補性決定領域をＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３と表記する。
本明細書における、「エピトープ」とは、動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、マウス又はヒトの体内において、抗原性及び／又は免疫原性を有するＥＰＨＡ２の部分ペプチドを意味する。抗原性を有するＥＰＨＡ２の部分ペプチドであるエピトープは、免疫アッセイ法等当業者によく知られている方法によって決定することができるが、例えば以下の方法によって行うことが出来る。ＥＰＨＡ２の様々な部分構造を作製する。部分構造の作製にあたっては、公知のオリゴペプチド合成技術を用いることが出来る。例えば、ＥＰＨＡ２のＣ末端あるいはＮ末端から適当な長さで順次短くした一連のポリペプチドを当業者に周知の遺伝子組み換え技術を用いて作製した後、それらに対する抗体の反応性を検討し、大まかな認識部位を決定した後に、さらに短いペプチドを合成してそれらのペプチドとの反応性を検討することによって、エピトープを決定することが出来る。
１．ＥＰＨＡ２について
（１）ＥＰＨＡ２遺伝子
ＥＰＨＡ２遺伝子のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋにＥＰＨ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａ２（アクセッション番号はそれぞれＮＭ＿００４４３１、ＮＰ＿００４４２２）として登録されている。また、ＥＰＨＡ２遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列は配列表の配列番号１に記載されており、そのアミノ酸配列は配列表の配列番号２に記載されている。
なお、ＥＰＨＡ２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加されたアミノ酸配列からなり、これらの酵素と同等の生物活性を有する蛋白質もＥＰＨＡ２に含まれる。
（２）ＥＰＨＡ２遺伝子の癌部特異的発現
ＥＰＨＡ２遺伝子は、多くの癌、特に乳癌、食道癌、前立腺癌、胃癌、非小細胞肺癌、大腸癌、多形神経膠芽腫での高発現が報告されている。
すなわち、ＥＰＨＡ２の各細胞、及び／又は各組織における発現量を測定することで被験者のＥＰＨＡ２の過剰発現に起因して発生する癌化及び／又は癌細胞の増殖の状態を判定することができる。
また、ＥＰＨＡ２の発現量及び／又は活性を抑制する物質はＥＰＨＡ２に起因する細胞の癌化の抑制及び／又は癌細胞の増殖を抑制する活性を有する。
したがって、ＥＰＨＡ２を発現している細胞に、被験物質を接触させて、ＥＰＨＡ２の発現量及び／又は活性を抑制する物質を選択することによって、抗腫瘍物質をスクリーニングすることが可能となる。
なお、ＥＰＨＡ２に対するｓｉＲＮＡはＥＰＨＡ２の発現を抑制し、抗腫瘍剤となり得る。ＥＰＨＡ２に対するｓｉＲＮＡは、ＥＰＨＡ２ ｍＲＮＡの部分配列からなるＲＮＡ（センスＲＮＡ）と該ＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列からなるＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）とを、ＥＰＨＡ２ ｍＲＮＡの塩基配列に基づいて設計し、自体公知の化学合成法により合成し、得られた両ＲＮＡをハイブリダイゼーションさせることにより製造できる。ｓｉＲＮＡを構成するセンスＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡは、それぞれ、その３’末端に、オーバーハング配列と呼ばれる１個ないし数個の塩基配列からなるヌクレオチドを結合させることが好ましい。オーバーハング配列は、該ＲＮＡをヌクレアーゼから保護する限りにおいて特に制限されず、好ましくは１個ないし１０個、より好ましくは１個ないし４個、さらに好ましくは２個のヌクレオチドからなるものをいずれも用いることができる。
２．ＥＰＨＡ２に対する抗体
（１）抗原の調製
本発明のＥＰＨＡ２に対する抗体を得るための抗原としては、ＥＰＨＡ２の全長ポリペプチド又はその部分ポリペプチドを挙げることができ、より具体的には、ＥＰＨＡ２の全長ポリペプチド又は、好ましくはＥＰＨＡ２の細胞外領域ポリペプチド（配列表の配列番号８のアミノ酸番号１乃至５３４に示されるアミノ酸配列からなる。）、更に好ましくは配列表の配列番号８のアミノ酸番号４２６乃至５３４に示されるアミノ酸配列を含むＥＰＨＡ２の細胞外領域ポリペプチドの部分ポリペプチド、更により好ましくは、配列表の配列番号８のアミノ酸番号４３９乃至５３４に示されるアミノ酸配列を含むＥＰＨＡ２の細胞外領域ポリペプチドの部分ペプチド、あるいはこれらに任意のアミノ酸配列や担体が付加された誘導体を挙げることができる。また、上記各ポリペプチドの少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはこれらに任意のアミノ酸配列や担体が付加された誘導体を挙げることができる。
なお、抗原となる、ＥＰＨＡ２全長ポリペプチド又はその部分ポリペプチドはＥＰＨＡ２遺伝子又はその部分ポリペプチドの遺伝子を遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。
ＥＰＨＡ２は、ヒトの腫瘍組織あるいは腫瘍細胞から直接精製して使用することができ、また、ＥＰＨＡ２全長ポリペプチド又はその部分ポリペプチドはｉｎ ｖｉｔｒｏにて合成する、あるいは遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。
遺伝子操作では、具体的には、ＥＰＨＡ２又はその部分ポリペプチドを発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質及びエネルギー物質を含む溶液中で合成する、あるいは他の原核生物、又は真核生物の宿主細胞を形質転換させることによってＥＰＨＡ２又はその部分ポリペプチドを発現させることにより、該蛋白質を得ることが出来る。
ＥＰＨＡ２のその部分ポリペプチドのｃＤＮＡは例えば、ＥＰＨＡ２を発現しているｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＥＰＨＡ２ ｃＤＮＡ又はその部分ポリペプチドをコードするＤＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）（Ｓａｉｋｉ， Ｒ． Ｋ．， ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９，ｐ．４８７−４８９参照）を行なう、いわゆるＰＣＲ法により取得することができる。
ポリペプチドのイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）合成としては、例えばロシュ・ダイアグノスティックス社製のラピッドトランスレーションシステム（ＲＴＳ）が挙げられるが、これに限定されない。
原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。また、ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与することができる配列を有するものが好ましい。
真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ， Ｙ． Ｃｅｌｌ（１９８１）２３， ｐ．１７５−１８２、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５０）、マウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５８）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ， Ｇ． ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ， Ｌ． Ａ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，ｐ．４１２６−４２２０）等がよく用いられているが、これらに限定されない。
上記のようにして得られる形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞内、又は細胞外に目的のポリペプチドが産生される。
該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、大腸菌であれば、例えば、ＬＢ培地に必要に応じて、アンピシリン等の抗生物質やＩＰＴＧを添加して用いることができる。
上記培養により、形質転換体の細胞内又は細胞外に産生される組換え蛋白質は、該蛋白質の物理的性質や化学的性質などを利用した各種の公知の分離操作法により分離・精製することができる。
該方法としては、具体的には例えば、通常の蛋白質沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せなどを例示できる。
また、発現させる組換え蛋白質に６残基からなるヒスチジンを繋げることにより、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。
上記方法を組合せることにより容易に高収率、高純度で目的とするポリペプチドを大量に製造できる。
本発明の抗体は、常法を用いて上記の抗原を動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。
また、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ （１９７５）２５６，ｐ．４９５−４９７、Ｋｅｎｎｅｔ， Ｒ． ｅｄ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｐ．３６５−３６７， Ｐｒｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．（１９８０））に従って、ＥＰＨＡ２に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。
（２）抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体の製造
ＥＰＨＡ２と特異的に結合する抗体の例として、ＥＰＨＡ２と特異的に結合するモノクローナル抗体を挙げることができるが、その取得方法は、以下に記載する通りである。
モノクローナル抗体の製造にあたっては、一般に下記のような作業工程が必要である。
すなわち、
（ａ）抗原として使用する生体高分子の精製、
（ｂ）抗原を動物に注射することにより免疫した後、血液を採取しその抗体価を検定して脾臓摘出の時期を決定してから、抗体産生細胞を調製する工程、
（ｃ）骨髄腫細胞（以下「ミエローマ」という）の調製、
（ｄ）抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、
（ｅ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、
（ｆ）単一細胞クローンへの分割（クローニング）、
（ｇ）場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培養、又はハイブリドーマを移植した動物の飼育、
（ｈ）このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性、及びその結合特異性の検討、あるいは標識試薬としての特性の検定、等である。
以下、モノクローナル抗体の作製法を上記工程に沿って詳述するが、該抗体の作製法はこれに制限されず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞及びミエローマを使用することもできる。
（ａ）抗原の精製
抗原としては、前記したような方法で調製したＥＰＨＡ２又はその部分ポリペプチドを使用することができる。
また、ＥＰＨＡ２発現組換え体細胞より調製した膜画分、又はＥＰＨＡ２発現組換え体細胞自身、さらに、当業者に周知の方法を用いて、化学合成した本発明の蛋白質の部分ペプチドを抗原として使用することもできる。
（ｂ）抗体産生細胞の調製
工程（ａ）で得られた抗原と、当業者に周知のアジュバント、例えば、フロインドの完全又は不完全アジュバント、又はカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物は公知のハイブリドーマ作製法に用いられる動物を支障なく使用することができる。具体的には、たとえばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ等を使用することができる。ただし、摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞の入手容易性等の観点から、マウス又はラットを被免疫動物とするのが好ましい。
また、実際に使用するマウス及びラットの系統は特に制限はなく、マウスの場合には、たとえば各系統 Ａ、ＡＫＲ、ＢＡＬＢ／ｃ、ＢＤＰ、ＢＡ、ＣＥ、Ｃ３Ｈ、５７ＢＬ、Ｃ５７ＢＲ、Ｃ５７Ｌ、ＤＢＡ、ＦＬ、ＨＴＨ、ＨＴ１、ＬＰ、ＮＺＢ、ＮＺＷ、ＲＦ、Ｒ ＩＩＩ、ＳＪＬ、ＳＷＲ、ＷＢ、１２９等が、またラットの場合には、たとえば、Ｌｏｗ、Ｌｅｗｉｓ、Ｓｐｒａｑｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、ＡＣＩ、ＢＮ、Ｆｉｓｃｈｅｒ等を用いることができる。
これらのマウス及びラットは例えば日本クレア、日本チャ−ルスリバー等実験動物飼育販売業者より入手することができる。
このうち、後述のミエローマ細胞との融合適合性を勘案すれば、マウスではＢＡＬＢ／ｃ系統が、ラットではｌｏｗ系統が被免疫動物として特に好ましい。
また、抗原のヒトとマウスでの相同性を考慮し、自己抗体を除去する生体機構を低下させたマウス、すなわち自己免疫疾患マウスを用いることも好ましい。
なお、これらマウス又はラットの免疫時の週齢は、好ましくは５〜１２週齢、さらに好ましくは６〜８週齢である。
ＥＰＨＡ２又はこの組換え体によって動物を免疫するには、例えば、Ｗｅｉｒ， Ｄ． Ｍ．， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．Ｉ． ＩＩ． ＩＩＩ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）、Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ． ａｎｄ Ｍａｙｅｒ，Ｍ．Ｍ．， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｃｈａｒｌｅｓ Ｃ Ｔｈｏｍａｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ Ｓｐｉｇｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９６４）等に詳しく記載されている公知の方法を用いることができる。
これらの免疫法のうち、本発明において好適な方法を具体的に示せば、たとえば以下のとおりである。
すなわち、まず、抗原である膜蛋白画分、もしくは抗原を発現させた細胞を動物の皮内又は腹腔内に投与する。
ただし、免疫効率を高めるためには両者の併用が好ましく、前半は皮内投与を行い、後半又は最終回のみ腹腔内投与を行うと、特に免疫効率を高めることができる。
抗原の投与スケジュールは、被免疫動物の種類、個体差等により異なるが、一般には、抗原投与回数３〜６回、投与間隔２〜６週間が好ましく、投与回数３〜４回、投与間隔２〜４週間がさらに好ましい。
また、抗原の投与量は、動物の種類、個体差等により異なるが、一般には、０．０５〜５ｍｇ、好ましくは０．１〜０．５ｍｇ程度とする。
追加免疫は、以上の通りの抗原投与の１〜６週間後、好ましくは２〜４週間後、さらに好ましくは２〜３週間後に行う。
なお、追加免疫を行う際の抗原投与量は、動物の種類、大きさ等により異なるが、一般に、例えばマウスの場合には、０．０５〜５ｍｇ、好ましくは０．１〜０．５ｍｇ、さらに好ましくは０．１〜０．２ｍｇ程度とする。
上記追加免疫から１〜１０日後、好ましくは２〜５日後、さらに好ましくは２〜３日後に被免疫動物から抗体産生細胞を含む脾臓細胞又はリンパ球を無菌的に取り出す。
なお、その際に抗体価を測定し、抗体価が十分高くなった動物を抗体産生細胞の供給源として用いれば、以後の操作の効率を高めることができる。
ここで用いられる抗体価の測定法としては、例えば、ＲＩＡ法又はＥＬＩＳＡ法を挙げることができるがこれらの方法に制限されない。
本発明における抗体価の測定は、例えばＥＬＩＳＡ法によれば、以下に記載するような手順により行うことができる。
まず、精製又は部分精製した抗原をＥＬＩＳＡ用９６穴プレート等の固相表面に吸着させ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係な蛋白質、例えばウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）により覆い、該表面を洗浄後、第一抗体として段階希釈した試料（例えばマウス血清）に接触させ、上記抗原に試料中の抗体を結合させる。
さらに第二抗体として酵素標識されたマウス抗体に対する抗体を加えてマウス抗体に結合させ、洗浄後該酵素の基質を加え、基質分解に基づく発色による吸光度の変化等を測定することにより、抗体価を算出する。
これらの脾臓細胞又はリンパ球からの抗体産生細胞の分離は、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，ｐ．４９５，；Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７７）６，ｐ．５１１，；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ（１９７７），２６６，ｐ．５５０，；Ｗａｌｓｈ，Ｎａｔｕｒｅ，（１９７７）２６６，ｐ．４９５，）に従って行うことができる。
例えば、脾臓細胞の場合には、細胞を細切してステンレスメッシュで濾過した後、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）に浮遊させて抗体産生細胞を分離する一般的方法を採用することができる。
（ｃ）骨髄腫細胞（以下、「ミエローマ」という）の調製
細胞融合に用いるミエローマ細胞には特段の制限はなく、公知の細胞株から適宜に選択して用いることができる。ただし、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続が確立しているＨＧＰＲＴ（Ｈｉｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）欠損株を用いるのが好ましい。
すなわち、マウス由来のＸ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）、ＮＳ１−ＡＮＳ／１（ＮＳ１）、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕｌ（Ｐ３Ｕｌ）、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（Ｘ６３．６５３）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２／０）、ＭＰＣ１１−４５．６ＴＧ１．７（４５．６ＴＧ）、ＦＯ、Ｓ１４９／５ＸＸＯ、ＢＵ．１等、ラット由来の２１０．ＲＳＹ３．Ａｇ．１．２．３（Ｙ３）等、ヒト由来のＵ２６６ＡＲ（ＳＫＯ−００７）、ＧＭ１５００・ＧＴＧ−Ａ１２（ＧＭ１５００）、ＵＣ７２９−６、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２（ＨＭｙ２）、８２２６ＡＲ／ＮＩＰ４−１（ＮＰ４１）等である。
これらのＨＧＰＲＴ欠損株は例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）等から入手することができる。
これらの細胞株は、適当な培地、例えば８−アザグアニン培地［ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン、２−メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、及びウシ胎児血清（以下「ＦＢＳ」という）を加えた培地に８−アザグアニンを加えた培地］ 、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ ；以下「ＩＭＤＭ」という）、又はダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＤＭＥＭ」という）で継代培養するが、細胞融合の３乃至４日前に正常培地［例えば、１０％ＦＢＳを含むＡＳＦ１０４培地（味の素（株）社製）］で継代培養し、融合当日に２×１０７以上の細胞数を確保しておく。
（ｄ）細胞融合
抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法（Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．Ｉ． ＩＩ． ＩＩＩ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ． ａｎｄ Ｍａｙｅｒ，Ｍ．Ｍ．， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｃｈａｒｌｅｓ Ｃ Ｔｈｏｍａｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ Ｓｐｉｇｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９６４）等）に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件下で適宜実施することができる。
そのような方法は、例えば、ポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法等を用いることができる。
このうち、上記化学的方法の具体例を示せば以下のとおりである。
すなわち、高濃度ポリマー溶液としてポリエチレングリコールを用いる場合には、分子量１５００〜６０００、好ましくは２０００〜４０００のポリエチレングリコール溶液中で、３０〜４０℃、好ましくは３５〜３８℃の温度で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを１〜１０分間、好ましくは５〜８分間混合する。
（ｅ）ハイブリドーマ群の選択
上記細胞融合により得られるハイブリドーマの選択方法は特に制限はないが、通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）選択法（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，ｐ．４９５；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）２６６，ｐ．５５０）が用いられる。
この方法は、アミノプテリンで生存し得ないＨＧＰＲＴ欠損株のミエローマ細胞を用いてハイブリドーマを得る場合に有効である。
すなわち、未融合細胞及びハイブリドーマをＨＡＴ培地で培養することにより、アミノプテリンに対する耐性を持ち合わせたハイブリドーマのみを選択的に残存させ、かつ増殖させることができる。
（ｆ）単一細胞クローンへの分割（クローニング）
ハイブリドーマのクローニング法としては、例えばメチルセルロース法、軟アガロース法、限界希釈法等の公知の方法を用いることができる（例えばＢａｒｂａｒａ， Ｂ．Ｍ． ａｎｄ Ｓｔａｎｌｅｙ， Ｍ．Ｓ．：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８０）参照）。これらの方法のうち、特に限界希釈法が好適である。
この方法では、マイクロプレートにラット胎児由来繊維芽細胞株、あるいは正常マウス脾臓細胞、胸腺細胞、腹水細胞などのフィーダー（ｆｅｅｄｅｒ）を接種しておく。
一方、あらかじめハイブリドーマを０．２〜０．５個／０．２ｍｌになるように培地中で希釈し、この希釈したハイブリドーマの浮遊液を各ウェルに０．１ｍｌずつ入れ、一定期間毎（例えば３日毎）に約１／３の培地を新しいものに交換しながら２週間程度培養を続けることによってハイブリドーマのクローンを増殖させることができる。
抗体価の認められたウェルについて、例えば限界希釈法によるクローニングを２〜４回繰返し、安定して抗体価の認められたものを抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択することができる。
このようにしてクローニングされたハイブリドーマ株の例としては、ハイブリドーマＳＨ３４８−１及びハイブリドーマＳＨ３５７−１を挙げることができる。ハイブリドーマＳＨ３４８−１及びハイブリドーマＳＨ３５７−１は日本国独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（住所：日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に２００７年６月８日付けで寄託され、ハイブリドーマＳＨ３４８−１はＳＨ３４８−１の名称で寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３６が付与され、ハイブリドーマＳＨ３５７−１はＳＨ３５７−１の名称で寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３７が付与されている。
なお、本明細書中においては、ハイブリドーマＳＨ３４８−１が産生する抗体を、「ＳＨ３４８−１」といい、ハイブリドーマＳＨ３５７−１が産生する抗体を、「ＳＨ３５７−１」と記載する。
（ｇ）ハイブリドーマ培養によるモノクローナル抗体の調製
このようにして選択されたハイブリドーマは、これを培養することにより、モノクローナル抗体を効率よく得ることができるが、培養に先立ち、目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることが望ましい。
このスクリーニングにはそれ自体既知の方法が採用できる。
本発明における抗体価の測定は、例えば上記（ｂ）の項目で説明したＥＬＩＳＡ法により行うことができる。
以上の通りの方法によって得たハイブリドーマは、液体窒素中又は−８０℃以下の冷凍庫中に凍結状態で保存することができる。
また、クローニングを完了したハイブリドーマは、ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたＨＴ培地で数回継代した後、正常培地に換えて培養することができる。
大量培養は、大型培養瓶を用いた回転培養、あるいはスピナー培養で行われる。
この大量培養における上清を、ゲル濾過等、当業者に周知の方法を用いて精製することにより、本発明の蛋白質に特異的に結合するモノクローナル抗体を得ることができる。
また、同系統のマウス（例えば、上記のＢＡＬＢ／ｃ）、あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内にハイブリドーマを注射し、該ハイブリド−マを増殖させることにより、本発明のモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることができる。
腹腔内に投与する場合には、事前（３〜７日前）に２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（２，６，１０，１４−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ）（プリスタン）等の鉱物油を投与すると、より多量の腹水が得られる。
たとえば，ハイブリドーマと同系統のマウスの腹腔内に予め免疫抑制剤を注射し、Ｔ細胞を不活性化した後、２０日後に１０６〜１０７個のハイブリドーマ・クローン細胞を血清を含まない培地中に浮遊（０．５ｍｌ）させて腹腔内に投与し、通常腹部が膨満し、腹水にたまったところでマウスより腹水を採取する。
この方法により、培養液中に比べて約１００倍以上の濃度のモノクローナル抗体が得られる。
上記方法により得たモノクローナル抗体は、例えばＷｅｉｒ， Ｄ．Ｍ．：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｏｘｆｏｒｄ（１９７８）に記載されている方法で精製することができる。
すなわち、硫安塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法等である。
精製の簡便な方法としては、市販のモノクローナル抗体精製キット（例えば、ＭＡｂＴｒａｐ ＧＩＩキット；ファルマシア社製）等を利用することもできる。
かくして得られるモノクローナル抗体は、ＥＰＨＡ２に対して高い抗原特異性を有する。
（ｈ）モノクローナル抗体の検定
かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスの決定は以下のように行うことができる。
まず、同定法としてはオクテルロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、ＥＬＩＳＡ法、又はＲＩＡ法が挙げられる。
オクテルロニー法は簡便ではあるが、モノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。
一方、ＥＬＩＳＡ法又はＲＩＡ法を用いた場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに第二次抗体として各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対応する抗体を用いることにより、モノクローナル抗体のアイソタイプ、サブクラスを同定することが可能である。
また、さらに簡便な方法として、市販の同定用のキット（例えば、マウスタイパーキット；バイオラッド社製）等を利用することもできる。
さらに、蛋白質の定量は、フォーリンロウリー法、及び２８０ｎｍにおける吸光度［１．４（ＯＤ２８０）＝イムノグロブリン１ｍｇ／ｍｌ］より算出する方法により行うことができる。
（３）その他の抗体
本発明の抗体には、上記ＥＰＨＡ２に対するモノクローナル抗体に加え、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体、ヒト抗体なども含まれる。これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
キメラ抗体としては、抗体の可変領域と定常領域が互いに異種である抗体が挙げられ、例えば、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体が挙げられる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，６８５１−６８５５， （１９８４）参照）。
ヒト化抗体としては、相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）のみをヒト由来の抗体に組み込んだ抗体（Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１，ｐ．５２２−５２５参照）、ＣＤＲ移植法によって、ＣＤＲの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体（ＷＯ９０／０７８６１号、ＵＳ６９７２３２３号公報参照）を挙げることができる。
さらに、抗ヒト抗体を挙げることができる。抗ＥＰＨＡ２ヒト抗体とは、ヒト染色体由来の抗体の遺伝子配列のみを有するヒト抗体を意味する。抗ＥＰＨＡ２ヒト抗体は、ヒト抗体のＨ鎖とＬ鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Ｔｏｍｉｚｕｋａ， Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７）１６，ｐ．１３３−１４３，；Ｋｕｒｏｉｗａ， Ｙ．ｅｔ．ａｌ．， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９８）２６，ｐ．３４４７−３４４８；Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｈ．ｅｔ．ａｌ．， Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ａｓｐｅｃｔｓ ｖｏｌ．１０，ｐ．６９−７３（Ｋｉｔａｇａｗａ， Ｙ．，Ｍａｔｕｄａ， Ｔ．ａｎｄ Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｄｓ．）， Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， １９９９．；Ｔｏｍｉｚｕｋａ， Ｋ．ｅｔ．ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７，ｐ．７２２−７２７等を参照。）によって取得することができる。
このようなトランスジェニック動物は、具体的には、非ヒト哺乳動物の内在性免疫グロブリン重鎖および軽鎖の遺伝子座が破壊され、代わりに酵母人工染色体（Ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ＹＡＣ）ベクターなどを介してヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖の遺伝子座が導入された遺伝子組み換え動物を、ノックアウト動物およびトランスジェニック動物の作製、およびこれらの動物同士を掛け合わせることにより作り出すことができる。
また、遺伝子組換え技術により、そのようなヒト抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコードするｃＤＮＡ、好ましくは該ｃＤＮＡを含むベクターにより真核細胞を形質転換し、遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する形質転換細胞を培養することにより、この抗体を培養上清中から得ることもできる。
ここで、宿主としては例えば真核細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、リンパ球やミエローマ等の哺乳動物細胞を用いることができる。
また、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（Ｗｏｒｍｓｔｏｎｅ， Ｉ． Ｍ．ｅｔ．ａｌ， Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２００２）４３（７），ｐ．２３０１−２３０８；Ｃａｒｍｅｎ， Ｓ． ｅｔ．ａｌ．， Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ ｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（２００２），１（２），ｐ．１８９−２０３；Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａ， Ｄ． ｅｔ．ａｌ．， Ｏｐｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ（２００２）１０９（３），ｐ．４２７−４３１等参照。）も知られている。
例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージ表面に発現させて、抗原に結合するファージを選択するファージディスプレイ法（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，（９），ｐ．１１０５−１１１６）を用いることができる。
また、同様にヒト抗体のＦａｂ（抗原結合断片；Ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ Ｆｒａｇｍｅｎｔ）をファージ表面に発現させて、抗原に結合するファージを選択するファージディスプレイ法（国際公開ＷＯ９７／０８３２０号、ＷＯ０１／０５９５０号）を用いることもできる。
抗原に結合することで選択されたファージの遺伝子を解析することによって、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。
抗原に結合するｓｃＦｖやＦａｂのＤＮＡ配列が明らかになれば、そこよりＣＤＲの配列を取り出して当該配列を有する発現ベクターを作製し、適当な宿主に導入して発現させることによりヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９２／０１０４７号，ＷＯ９２／２０７９１号，ＷＯ９３／０６２１３号，ＷＯ９３／１１２３６号，ＷＯ９３／１９１７２号，ＷＯ９５／０１４３８号，ＷＯ９５／１５３８８号，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９４）１２，ｐ．４３３−４５５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３（９），ｐ．１１０５−１１１６）。
抗体遺伝子を一旦単離した後、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。
真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真核微生物を用いることができる。
動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ， Ｙ． Ｃｅｌｌ（１９８１）２３，ｐ．１７５−１８２、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５０）、マウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５８）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８０）７７，ｐ．４１２６−４２２０）を挙げることができる。
また、これらの宿主としては、糖鎖構造が改変され、抗体のＡＤＣＣ活性（抗体依存性細胞障害活性）やＣＤＣ活性が高められた抗体を発現するように改変された宿主を用いることもでき、そのような宿主としては、抗体のＦｃ領域に結合するＮ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が２０％以上である抗体組成物を産生する抗体分子をコードする遺伝子を導入されたＣＨＯ細胞を挙げることができる（ＷＯ０２／３１１４０号参照。）
原核細胞を使用する場合は、例えば、大腸菌、枯草菌を挙げることができる。
これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。
本発明の抗体のアイソタイプとしては制限はなく、例えばＩｇＧ（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１，ＩｇＡ２）、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等が挙げられるが、好ましくはＩｇＧまたはＩｇＭを挙げることができる。
また本発明の抗体は、抗体の抗原結合部を有する抗体の断片又はその修飾物であってもよい。
例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、または重鎖および軽鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）、ディアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ））、線状抗体、及び抗体断片より形成された多特異性抗体などが挙げられる。
さらに、本発明の抗体は少なくとも２種類の異なる抗原に対して特異性を有する多特異性抗体であってもよい。
通常このような分子は２個の抗原を結合するものであるが（即ち、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ））、本発明における「多特異性抗体」は、それ以上（例えば、３種類）の抗原に対して特異性を有する抗体を包含するものである。
本発明の抗体は、多特異性抗体は全長からなる抗体、またはそのような抗体の断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二特異性抗体）でもよい。二重特異性抗体は２種類の抗体の重鎖と軽鎖（ＨＬ対）を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することによっても、作製することができる（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８３）３０５，ｐ．５３７−５３９）。
本発明の抗体は一本鎖抗体（ｓｃＦｖとも記載する）でもよい。一本鎖抗体は、抗体の重鎖Ｖ領域と軽鎖Ｖ領域とをポリペプチドのリンカーで連結することにより得られる（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，１１３（Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．２６９−３１５（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，ｐ．１１２６−１１３６）。
一本鎖抗体を作成する方法は当技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４５５，０３０号等を参照）。このｓｃＦｖにおいて、重鎖Ｖ領域と軽鎖Ｖ領域は、コンジュゲートを作らないようなリンカー、好ましくはポリペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８），８５，ｐ．５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおける重鎖Ｖ領域および軽鎖Ｖ領域は、同一の抗体に由来してもよく、別々の抗体に由来してもよい。
Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えば１２〜１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体の重鎖または重鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、および軽鎖または軽鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々重鎖、軽鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅することにより得られる。
また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。
これらの抗体断片は、前記と同様にして遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。
本発明の抗体は、アミノ酸配列が異なる複数種類の抗ＥＰＨＡ２抗体の混合物である、ポリクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体の一例としては、ＣＤＲが異なる複数種類の抗体の混合物を挙げることができる。そのようなポリクローナル抗体としては、異なる抗体を産生する細胞の混合物を培養し、該培養物から精製された抗体を用いることが出来る（ＷＯ２００４／０６１１０４号参照）。
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。
本発明の抗体は、更にこれらの抗体と他の薬剤とコンジュゲートを形成しているもの（Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）でもよい。このような抗体の例としては、該抗体が放射性物質や薬理作用を有する化合物と結合している物を挙げることができる（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３，ｐ．１１３７−１１４６）。
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。
例えばクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｄａｎｉｅｌ Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））が、これらに限定されるものではない。
クロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる。
これらのクロマトグラフィーは、ＨＰＬＣやＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。
例えばプロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等が挙げられる。
また抗原を固定化した担体を用いて、抗原への結合性を利用して抗体を精製することも可能である。
３．本発明の抗体の性質
上記方法によって取得される本発明の抗ＥＰＨＡ２抗体は以下の性質を有する。
（１）本発明の１つの抗体は下記のａ）乃至ｅ）に示される性質を有する。
ａ）ＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化能を有さない。：
ｂ）ＥＰＨＡ２発現細胞に対してＡＤＣＣ活性を有する。：
ｃ）ＥＰＨＡ２発現細胞に対してＣＤＣ活性を有する。：
ｄ）Ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する。：
ｅ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号４２６乃至５３４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する。
このような性質を有する抗体の例としては、以下の１）乃至８）からなる群から選択されるいずれか１つの抗体を挙げることができる。
１）ＳＨ３４８−１、
２）ハイブリドーマＳＨ３４８−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３６）が産生する抗体によって認識されるエピトープを認識する抗体、
３）重鎖可変領域の相補性決定領域として、配列表の配列番号５９、６１及び６３に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域の相補性決定領域として、配列表の配列番号６５、６７及び６９に示されるアミノ酸配列を有する抗体、
４）以下のｉ）及びｉｉ）の特徴を有する抗体：
ｉ）一般式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ペプチドを有する：
−ＦＲＨ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲＨ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲＨ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲＨ４−（Ｉ）
（式中、ＦＲＨ１は１８乃至３０個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＨ１は配列表の配列番号５９で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ２は１４個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、ＣＤＲＨ２は配列表の配列番号６１で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ３は３２個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、ＣＤＲＨ３は配列表の配列番号６３で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ４は１１個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。）；
ｉｉ）一般式（ＩＩ）で示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖ポリペプチドを有する：
−ＦＲＬ１−ＣＤＲＬ１−ＦＲＬ２−ＣＤＲＬ２−ＦＲＬ３−ＣＤＲＬ３−ＦＲＬ４−（ＩＩ）
（式中、ＦＲＬ１は２３個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＬ１は配列表の配列番号６５で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ２は１５個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、ＣＤＲＬ２は配列表の配列番号６７で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ３は３２個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、ＣＤＲＬ３は配列表の配列番号６９で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ４は１０個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。）、
５）ＳＨ３５７−１、
６）ハイブリドーマＳＨ３５７−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３７）が産生する抗体によって認識されるエピトープを認識する抗体、
７）重鎖可変領域の相補性決定領域として、配列表の配列番号７１、７３及び７５に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域の相補性決定領域として、配列表の配列番号７７、７９及び８１に示されるアミノ酸配列を有する抗体、
８）以下のｉ）及びｉｉ）に示される特徴を有する、５）乃至７）から選択されるいずれか１つに記載の抗体：
ｉ）一般式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ペプチドを有する：
−ＦＲＨ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲＨ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲＨ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲＨ４−（Ｉ）
（式中、ＦＲＨ１は１８乃至３０個のアミノ酸配列からなる任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＨ１は配列表の配列番号７１で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ２は１４個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、ＣＤＲＨ２は配列表の配列番号７３で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ３は３２個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、ＣＤＲＨ３は配列表の配列番号７５で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ４は１１個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。）；
ｉｉ）一般式（ＩＩ）で示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖ポリペプチドを有する：
−ＦＲＬ１−ＣＤＲＬ１−ＦＲＬ２−ＣＤＲＬ２−ＦＲＬ３−ＣＤＲＬ３−ＦＲＬ４−（ＩＩ）
（式中、ＦＲＬ１は２３個のアミノ酸配列からなる任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＬ１は配列表の配列番号７７で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ２は１５個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、ＣＤＲＬ２は配列表の配列番号７９で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ３は３２個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、ＣＤＲＬ３は配列表の配列番号８１で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ４は１０個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。）。
（２）本発明の他の１つの抗体は下記のａ）乃至ｆ）に示される性質を有する。
ａ）ＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化能を有さない。：
ｂ）ＥＰＨＡ２蛋白質量の減少作用を示す。
ｃ）ＥＰＨＡ２発現細胞に対してＡＤＣＣ活性を有する。：
ｄ）ＥＰＨＡ２発現細胞に対してＣＤＣ活性を有する。：
ｅ）Ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する。：
ｆ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号４２６乃至５３４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する。
このような性質を有する抗体の例としては、以下の１）乃至４）からなる群から選択されるいずれか１つの抗体を挙げることができる。
１）ＳＨ３４８−１、
２）ハイブリドーマＳＨ３４８−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３６）が産生する抗体によって認識されるエピトープを認識する抗体、
３）重鎖可変領域の相補性決定領域として、配列表の配列番号５９、６１及び６３に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域の相補性決定領域として、配列表の配列番号６５、６７及び６９に示されるアミノ酸配列を有する抗体、
４）以下のｉ）及びｉｉ）の特徴を有する抗体：
ｉ）一般式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ペプチドを有する：
−ＦＲＨ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲＨ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲＨ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲＨ４−（Ｉ）
（式中、ＦＲＨ１は１８乃至３０個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＨ１は配列表の配列番号５９で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ２は１４個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、ＣＤＲＨ２は配列表の配列番号６１で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ３は３２個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、ＣＤＲＨ３は配列表の配列番号６３で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ４は１１個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。）；
ｉｉ）一般式（ＩＩ）で示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖ポリペプチドを有する：
−ＦＲＬ１−ＣＤＲＬ１−ＦＲＬ２−ＣＤＲＬ２−ＦＲＬ３−ＣＤＲＬ３−ＦＲＬ４−（ＩＩ）
（式中、ＦＲＬ１は２３個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＬ１は配列表の配列番号６５で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ２は１５個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、ＣＤＲＬ２は配列表の配列番号６７で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ３は３２個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、ＣＤＲＬ３は配列表の配列番号６９で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ４は１０個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。）。
（３）本発明の他の１つの抗体は下記のａ）乃至ｅ）に示される性質を有する。
ａ）ＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化能を有さない。
ｂ）ＥＰＨＡ２蛋白質量の減少作用を示さない。
ｃ）ＡＤＣＣ活性を有する。
ｄ）ＣＤＣ活性を有する。
ｅ）Ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する。
ｆ）配列表の配列番号８のアミノ酸番号４２６乃至５３４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する。
このような性質を有する抗体の例としては、以下の１）乃至４）からなる群から選択されるいずれか１つの抗体を挙げることができる。
１）ＳＨ３５７−１、
２）ハイブリドーマＳＨ３５７−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３７）が産生する抗体によって認識されるエピトープを認識する抗体、
３）重鎖可変領域の相補性決定領域として、配列表の配列番号７１、７３及び７５に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域の相補性決定領域として、配列表の配列番号７７、７９及び８１に示されるアミノ酸配列を有する抗体、
４）以下のｉ）及びｉｉ）に示される性質を有する抗体：
ｉ）一般式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ペプチドを有する：
−ＦＲＨ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲＨ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲＨ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲＨ４−（Ｉ）
（式中、ＦＲＨ１は１８乃至３０個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＨ１は配列表の配列番号７１で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ２は１４個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、ＣＤＲＨ２は配列表の配列番号７３で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ３は３２個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、ＣＤＲＨ３は配列表の配列番号７５で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ４は１１個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。）；
ｉｉ）一般式（ＩＩ）で示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖ポリペプチドを有する：
−ＦＲＬ１−ＣＤＲＬ１−ＦＲＬ２−ＣＤＲＬ２−ＦＲＬ３−ＣＤＲＬ３−ＦＲＬ４−（ＩＩ）
（式中、ＦＲＬ１は２３個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＬ１は配列表の配列番号７７で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ２は１５個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、ＣＤＲＬ２は配列表の配列番号７９で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ３は３２個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、ＣＤＲＬ３は配列表の配列番号８１で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ４は１０個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。）。
４．抗ＥＰＨＡ２抗体を含有する医薬
本発明の抗ＥＰＨＡ２抗体は、医薬として特に癌の治療を目的とした医薬組成物として、あるいはこのような疾患の免疫学的診断のための抗体として有用である。
癌の種類としては、乳癌、食道癌、前立腺癌、胃癌、非小細胞肺癌、大腸癌及び多形神経膠芽腫を好適に挙げることができるがこれらに限定されない。
本発明は、治療に有効な量の抗ＥＰＨＡ２抗体と薬学上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び／又は補助剤を含む医薬組成物も提供する。
本発明の医薬組成物において許容される製剤に用いる物質としては好ましくは投与量や投与濃度において、医薬組成物を投与される者に対して非毒性のものが好ましい。
本発明の医薬組成物は、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、無菌性、安定性、溶解率、徐放率、吸収率、浸透率を変えたり、維持したり、保持したりするための製剤用の物質を含むことができる。
製剤用の物質として以下のものを挙げることができるが、これらに制限されない；グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸類、抗菌剤、アスコルビン酸、硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤、リン酸、クエン酸、ホウ酸バッファー、炭酸水素、トリス−塩酸（Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ）溶液等の緩衝剤、マンニトールやグリシン等の充填剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤、カフェイン、ポリビニルピロリジン、β−シクロデキストリンやヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン等の錯化剤、グルコース、マンノース又はデキストリン等の増量剤、単糖類、二糖類やグルコース、マンノースやデキストリン等の他の炭水化物、着色剤、香味剤、希釈剤、乳化剤やポリビニルピロリジン等の親水ポリマー、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン、塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロレキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素等の防腐剤、グリセリン、プロピレン・グリコール又はポリエチレングリコール等の溶媒、マンニトール又はソルビトール等の当アルコール、懸濁剤、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルビテート２０やポリソルビテート８０等ポリソルビテート、トリトン（ｔｒｉｔｏｎ）、トロメタミン（ｔｒｏｍｅｔｈａｍｉｎｅ）、レシチン又はコレステロール等の界面活性剤、スクロースやソルビトール等の安定化増強剤、塩化ナトリウム、塩化カリウムやマンニトール・ソルビトール等の弾性増強剤、輸送剤、希釈剤、賦形剤、及び／又は薬学上の補助剤。
これらの製剤用の物質の添加量は、抗ＥＰＨＡ２抗体の重量に対して０．０１〜１００倍、特に０．１〜１０倍添加するのが好ましい。
なお、抗ＥＰＨＡ２抗体をリポソーム中に含有するようにしたイムノリポソームや抗ＥＰＨＡ２抗体とリポソームを結合した抗体（米国特許第６２１４３８８号）を含有する医薬組成物も本発明に含まれる。
製剤中の好適な医薬組成物の組成は当業者によって、適用疾患、適用投与経路などに応じて適宜決定することができる。
医薬組成物中の賦形剤や担体は液体でも固体でもよい。
適当な賦形剤や担体は注射用の水や生理食塩水、人工脳脊髄液や非経口投与に通常用いられている他の物質でもよい。
中性の生理食塩水や血清アルブミンを含む生理食塩水を担体に用いることもできる。
医薬組成物にはｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓバッファーやｐＨ４．０−５．５の酢酸バッファーやそれらにソルビトールや他の化合物を含むこともできる。
本発明の医薬組成物は選択された組成で必要な純度で適当な薬剤として、凍結乾燥品あるいは液体として準備される。
抗ＥＰＨＡ２抗体を含む医薬組成物はスクロースのような適当な賦形剤を用いた凍結乾燥品として成型されることもできる。
本発明の医薬組成物は非経口投与用に調製することもできるし、経口による消化管吸収用に調製することもできる。
製剤の組成及び濃度は投与方法によって決定することができるし、本発明の医薬組成物に含まれる、抗ＥＰＨＡ２抗体のＥＰＨＡ２に対する親和性、即ち、ＥＰＨＡ２に対する解離定数（Ｋｄ値）に対し、親和性が高い（Ｋｄ値が低い）ほど、ヒトへの投与量を少なく薬効を発揮することができるので、この結果に基づいて本発明の医薬組成物の人に対する投与量を決定することもできる。
投与量は、抗ＥＰＨＡ２抗体をヒトに対して投与する際には、通常約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇを１〜１８０日間に１回投与すればよい。
本発明の医薬組成物の形態としては、点滴を含む注射剤、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤などが挙げられる。
本発明の医薬組成物を投与することによってEPHA2を発現している腫瘍の増殖を抑制することが可能になる。
以下、実施例において本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
なお、下記実施例において遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓより１９８９年発刊）に記載の方法及びその他の当業者が使用する実験書に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って行った。
（実施例１）プラスミド作製
１）−１ ヒトＥＰＨＡ２発現ベクターの作製
１）−１−１ 全長ヒトＥＰＨＡ２発現ベクターの作製
ＳＫ−ＯＶ−３細胞ｔｏｔａｌ ＲＮＡより合成したｃＤＮＡを鋳型にプライマーセット：
プライマー１：５’−ｇｇｇｇａｃａａｇｔｔｔｇｔａｃａａａａａａｇｃａｇｇｃｔｔｃｇｇｇｇａｔｃｇｇａｃｃｇａｇａｇｃｇａｇａａｇ−３’（配列表の配列番号３）及び、
プライマー２：
５’−ｇｇｇｇａｃｃａｃｔｔｔｇｔａｃａａｇａａａｇｃｔｇｇｇｔｃｃｔａｇａｔｇｇｇｇａｔｃｃｃｃａｃａｇｔｇｔｔｃａｃｃｔｇｇｔｃｃｔｔ−３’
（配列表の配列番号４）
を用いてＰＣＲ反応を行い、ヒトＥＰＨＡ２をコードするｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ産物をＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｐＤＯＮＲ２２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に組み込みエントリーベクターを作製した。ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とプライマーセット：
プライマー３：５’−ｃｔｇｔｇｇｇｇａｔｃｃｃｃａｔｃｇａｃｃｃａｇｃｔｔｔｃ−３’（配列表の配列番号５）及び、
プライマー４：５’−ｇａｔｇｇｇｇａｔｃｃｃｃａｃａｇｔｇｔｔｃａｃｃｔｇｇｔｃ−３’（配列表の配列番号６）
を用いて、エントリーベクター中のＥＰＨＡ２遺伝子からストップコドンを除去した。得られたエントリーベクターからｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０ Ｇａｔｅｗａｙ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）へＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて組み換え反応を行い、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０−ＥＰＨＡ２を作製した（本ベクターはａｔｔＢ１とａｔｔＢ２配列の間に配列表の配列番号７に示されるヌクレオチド配列を有する。）。また本ベクターにクローニングされたＥＰＨＡ２遺伝子のＯＲＦ部分の配列は配列表の配列番号７のヌクレオチド番号３３乃至２９６０に示されている。またＥＰＨＡ２のアミノ酸配列は配列表の配列番号８に示されている。
１）−１−２ ＥＰＨＡ２細胞外領域発現ベクターの作製
ヒトＥＰＨＡ２細胞外領域ポリペプチド（配列表の配列番号８のアミノ酸番号１乃至５３４に示されるアミノ酸配列からなる。以下「ＥＰＨＡ２−ＥＣＤ」と略す）をコードするｃＤＮＡをプライマーセット：
プライマー５：５’−ａａａａａｇｃｔｔａｔｇｇａｇｃｔｃｃａｇｇｃａｇｃｃｃｇｃ−３’（配列表の配列番号９）及び、
プライマー６：５’−ａａａｇｇｇｃｃｃｔｃａｇｔｔｇｃｃａｇａｔｃｃｃｔｃｃｇｇ−３’（配列表の配列番号１０）
を用いてＰＣＲ反応で増幅した。得られたＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａＩで切断し、ｐｃＤＮＡ３．１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｐａＩサイトにクローニングした（以下「ｐｃＤＮＡ３．１−ＥＰＨＡ２−ＥＣＤ」と略す。また、以下及び図中で「ｐｃＤＮＡ３．１−ＥＰＨＡ２−ＥＣＤ」によって発現する組換え蛋白質を「ｒＥＰＨＡ２−ＥＣＤ」と記す。）。
１）−１−３ ＥＰＨＡ２部分蛋白質発現ベクターの作製
ＥＰＨＡ２の配列表の配列番号８のアミノ酸番号３１５−５４０に示されるアミノ酸配列からなる領域（以下「ＦｎＩＩＩ−ＮＣ」と記す。）、アミノ酸番号３１５−４３０に示されるアミノ酸配列からなる領域（以下「ＦｎＩＩＩ−Ｎ」と記す。）、アミノ酸番号４２６−５４０に示されるアミノ酸配列からなる領域（以下「ＦｎＩＩＩ−Ｃ」と記す。）を発現するベクターを構築するため、ＦｎＩＩＩ−ＮＣ増幅用プライマーセット：
プライマー７：５’−ｇｃａｇｇｃｔｔｃａｔｃｇａａｇｇｔｃｇｔｇｇｇｃｇｇｇｃａｃｃｔｃａｇｇａｃｃｃａｇ−３’（配列表の配列番号１１）及び、
プライマー８：５’−ｇｔａｃａａｇａａａｇｃｔｇｇｇｔｇｃｔａｇｃｃｇｃｃａａｔｃａｃｃｇｃｃａａｇ−３’（配列表の配列番号１２）、
ＦｎＩＩＩ−Ｎ増幅用プライマーセット：
プライマー７及び、
プライマー９：５’−ｇｔａｃａａｇａａａｇｃｔｇｇｇｔｇｃｔａｇｇｃａｇｔａｃｇｇａａｇｃｔｇｃｇｇ−３’（配列表の配列番号１３）、
ＦｎＩＩＩ−Ｃ増幅用プライマーセット：
プライマー１０：５’−ｇｃａｇｇｃｔｔｃａｔｃｇａａｇｇｔｃｇｔｇｇｇａｇｃｔｔｃｃｇｔａｃｔｇｃｃａｇｔｇ−３’（配列表の配列番号１４）及び、
プライマー８、
のそれぞれのプライマーセットを用いてｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０−ＥＰＨＡ２を鋳型にしてＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物の両末端にａｔｔＢ１、ａｔｔＢ２サイトを付加するため、各ＰＣＲ産物を鋳型にプライマーセット：
プライマー１１：５’−ｇｇｇｇａｃａａｇｔｔｔｇｔａｃａａａａａａｇｃａｇｇｃｔｔｃａｔｃｇａａｇｇｔｃｇｔｇｇｇ−３’（配列表の配列番号１５）及び、
プライマー１２：５’−ｇｇｇｇａｃｃａｃｔｔｔｇｔａｃａａｇａａａｇｃｔｇｇｇｔ−３’（配列表の配列番号１６）、
を用いてＰＣＲ反応を行い、ここで得られたＰＣＲ産物をＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅを用いてｐＤＯＮＲ２２１に組み込みエントリーベクターを作製した。各エントリーベクターからｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｄｅＩとＢａｍＨＩサイトを制限酵素で切断後平滑化したサイトにＧａｔｅｗａｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＲｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ Ｃａｓｓｅｔｔｅ Ｃ．１を組み込んで作製したデスティネーションベクターとの間で、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅを使用した組み換え反応を行い発現ベクターを作製した（以下、ＦｎＩＩＩ−ＮＣ、ＦｎＩＩＩ−Ｎ、ＦｎＩＩＩ−Ｃを組み込んだ発現ベクターによって発現する組換え蛋白質をそれぞれｒＦｎＩＩＩ−ＮＣ、ｒＦｎＩＩＩ−Ｎ、ｒＦｎＩＩＩ−Ｃと記す）。
１）−２ ヒトＥＰＨＢ２細胞外領域発現ベクターの作製
ＨＣＣ７０細胞ｔｏｔａｌ ＲＮＡより合成したｃＤＮＡを鋳型にプライマーセット：
プライマー１３：５’−ｇｇｇｇａｃａａｇｔｔｔｇｔａｃａａａａａａｇｃａｇｇｃｔｔｃｇｃｃｃｃｇｇｇａａｇｃｇｃａｇｃｃ−３’（配列表の配列番号１７）及び、
プライマー１４：
５’−ｇｇｇｇａｃｃａｃｔｔｔｇｔａｃａａｇａａａｇｃｔｇｇｇｔｃｃｔａａａｃｃｔｃｃａｃａｇａｃｔｇａａｔｃｔｇｇｔｔｃａｔｃｔｇ−３’（配列表の配列番号１８）
を用いてＰＣＲ反応を行い、ヒトＥＰＨＢ２をコードするｃＤＮＡを取得した。ヒトＥＰＨＢ２のｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列表の配列番号１９に、アミノ酸配列を配列表の配列番号２０に示した。ヒトＥＰＨＢ２細胞外領域（配列表の配列番号２０のアミノ酸番号１−５４２に示されるアミノ酸配列からなる領域）（以下「ＥＰＨＢ２−ＥＣＤ」と略す）をコードするｃＤＮＡを増幅するためプライマーセット：
プライマー１５：５’−ａａａａａｇｃｔｔａｔｇｇｃｔｃｔｇｃｇｇａｇｇｃｔｇｇｇｇ−３’（配列表の配列番号２１）及び、
プライマー１６：５’−ａａａｇａｔａｔｃｔｃａｔｇｇｃａａｃｔｔｃｔｃｃｔｇｇａｔ−３’（配列表の配列番号２２）
を用いてＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＶで切断し、ｐｃＤＮＡ３．１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＶサイトにクローニングした（以下「ｐｃＤＮＡ３．１−ＥＰＨＢ２−ＥＣＤ」と略す。また、以下及び図中で「ｐｃＤＮＡ３．１−ＥＰＨＢ２−ＥＣＤ」によって発現する組換え蛋白質をｒＥＰＨＢ２−ＥＣＤと記す）。
１）−３ ヒトＥＲＢＢ２発現ベクターの作製
Ｈｕｍａｎ ｃｌｏｎｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製 ＃Ｃ３３８３０）を鋳型にプライマーセット：
プライマー１７：５’−ｃａｃｃａｔｇｇａｇｃｔｇｇｃｇｇｃｃｔｔｇ−３’（配列表の配列番号２３）及び、
プライマー１８：５’−ｔｃｃｃａｃｔｇｇｃａｃｇｔｃｃａｇａｃｃ−３’（配列表の配列番号２４）
を用いＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物をｐＥＮＴＲ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に組み込みエントリーベクターを作製した。アミノ酸置換を伴う変異を修復するため、エントリーベクターを ＥｃｏＲＩ処理して得られた断片の内、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ由来配列を含む方の断片とＨｕｍａｎ ｃｌｏｎｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製 ＃Ｃ１４６４０）をＥｃｏＲＩ処理して得られた断片の内、２番目に大きな断片（約１．６ｋｂｐ）とをライゲーションした。得られたエントリーベクターからｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０ Ｇａｔｅｗａｙ ｖｅｃｔｏｒへＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅを用いて組み換え反応を行い、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０−ＥＲＢＢ２を作製した（ａｔｔＢ１とａｔｔＢ２配列の間に配列表の配列番号２５に示されるヌクレオチド配列を有する。）。
（実施例２）モノクローナル抗体作製
２）−１ 抗原蛋白質の調製
ＥＰＨＡ２−ＥＣＤを発現させるため、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）にｐｃＤＮＡ３．１−ＥＰＨＡ２−ＥＣＤを２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を用いてトランスフェクションし、３７℃、８％ ＣＯ２で５日間培養した。培養後、遠心分離により培養液を回収し、ｒＥＰＨＡ２−ＥＣＤの精製原料とした。得られた培養上清を分子量分画１５０００の透析チューブを用いて２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５に対して透析し、フィルター濾過（０．４５μｍ， ＰＥＳ）した後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ １６／１０ Ｑ ＸＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に添加した。溶出はＮａＣｌの直線濃度勾配（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、０−１Ｍ ＮａＣｌ）で行った。溶出画分の一部をＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」と略す。）で分離後、ゲルをクマシーブリリアントブルー染色（以下「ＣＢＢ染色」と略す）し、ｒＥＰＨＡ２−ＥＣＤの含まれる画分を確認した。次にｒＥＰＨＡ２−ＥＣＤを含む画分を集め、ＰＢＳで平衡化されたＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に添加した。ＰＢＳで溶出し、溶出分画の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離後、ゲルをＣＢＢ染色し、ｒＥＰＨＡ２−ＥＣＤの含まれる画分を確認した。ｒＥＰＨＡ２−ＥＣＤを含む画分を集め、免疫用抗原、エピトープ決定時の抗原として使用した。蛋白質濃度はＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて測定した。
２）−２ 免疫
４〜６週齢のＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌＣｒｌｊマウス（日本チャールス・リバー社）を使用した。０日目に５０μｇのｒＥＰＨＡ２−ＥＣＤ とＡｄｊｕｖａｎｔ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ Ｈ３７ Ｒｖ（和光純薬社製）を混合（体積比で１：１）したものをマウス背部皮下に投与した。同様に別の個体に５０μｇのｒＥＰＨＡ２−ＥＣＤ とＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＳＩＧＭＡ社製）を混合（体積比で１：１）したものを背部皮下に投与した。２２日目と３６日目に５０μｇのｒＥＰＨＡ２−ＥＣＤとＡｄｊｕｖａｎｔ Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ（和光純薬社製）を混合（体積比で１：１）したものを各マウスの背部皮下に投与した。５３日目に５０μｇのｒＥＰＨＡ２−ＥＣＤを各マウスの腹腔内に投与し、５６日目にマウス脾臓を採取しハイブリドーマ作製に用いた。
２）−３ ハイブリドーマ作製
脾臓細胞とマウスミエローマＰ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１細胞とをＰＥＧ４０００（ＩＢＬ社製）を用いて細胞融合しハイブリドーマを作製した。得られたハイブリドーマ培養上清用いて抗ＥＰＨＡ２抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行った。
２）−４ 抗体スクリーニング
２）−４−１ 抗原遺伝子発現細胞の調製
２９３Ｔ細胞を５×１０４細胞／ｃｍ２になるようｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ Ｉコートフラスコ（ＩＷＡＫＩ社製）に播種し１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中で３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で１晩培養した。翌日、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０−ＥＰＨＡ２とコントロールとしてｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０−ＥＲＢＢ２をそれぞれ２９３Ｔ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてトランスフェクションし、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下でさらに１晩培養した。翌日、トランスフェクションされた２９３Ｔ細胞をトリプシン処理し、１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで細胞を洗浄した後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁した。得られた細胞懸濁液をＣｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー解析に使用した。
２）−４−２ Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ
２）−４−１で調製した細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、ＥＰＨＡ２発現２９３Ｔ細胞とＥＲＢＢ２発現２９３Ｔ細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。ウェル中の細胞を５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで５００倍に希釈したＧｏａｔ ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ，Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）社製 ＃ＡＰ１８１Ｐ）を加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。ウェル中の細胞を５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、ＯＰＤ発色液（ＯＰＤ溶解液（０．０５ Ｍ クエン酸３ナトリウム、０．１Ｍ リン酸水素２ナトリウム・１２水 ｐＨ４．５）にｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（和光純薬社製）、Ｈ２Ｏ２をそれぞれ０．４ｍｇ／ｍｌ、０．６％（ｖ／ｖ）になるように溶解）を１００μｌ／ウェルで添加した。攪拌しながら発色反応を行い、１Ｍ ＨＣｌを１００μｌ／ウェルで添加して発色反応を停止させた。遠心して細胞を沈殿させた後、上清を新しい９６穴平底マイクロプレートに移し、プレートリーダー（ＡＲＶＯ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。細胞膜表面上に発現するＥＰＨＡ２に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択するため、ＥＲＢＢ２発現２９３Ｔ細胞（コントロール）と比較し、ＥＰＨＡ２発現２９３Ｔ細胞の方でより高い吸光度を示す培養上清を産生するハイブリドーマを抗ＥＰＨＡ２抗体産生陽性として選択した。
２）−４−３ フローサイトメトリー解析
Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡでの擬陽性を除くため、Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡで陽性と判定されたハイブリドーマが産生する抗体のＥＰＨＡ２に対する結合特異性をフローサイトメトリー法によりさらに確認した。２）−４−１で調製した細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、ＥＰＨＡ２発現２９３Ｔ細胞とＥＲＢＢ２発現２９３Ｔ細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで１０００倍に希釈したＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ＩｇＧ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｔｏ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｗｈｏｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）（ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社製 ＃５５４９３）を加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、２μｇ／ｍｌ ７−ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）社製）を含む５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーター（ＦＣ５００：ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗｊｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社）で行った。７−ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のＦＩＴＣ蛍光強度のヒストグラムを作成した。コントロールであるＥＲＢＢ２発現２９３Ｔ細胞の蛍光強度ヒストグラムに対しＥＰＨＡ２発現２９３Ｔ細胞のヒストグラムが強蛍光強度側にシフトしているサンプルを産生するハイブリドーマを抗ＥＰＨＡ２抗体産生ハイブリドーマとして取得した。
２）−５ ハイブリドーマのモノクローン化
抗ＥＰＨＡ２抗体を産生するハイブリドーマはＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ Ｄ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製 ＃０３８０４）に希釈して培養され、出現したコロニーを回収することでモノクローン化された。回収された各コロニーを培養し、その培養上清を用いてＥＰＨＡ２に対する結合性を２）−４−３と同じ方法で確認し、モノクローナル抗ＥＰＨＡ２抗体（ＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１、Ａｂ５７−１、Ａｂ６５−１、Ａｂ９６−１、Ａｂ１００−１、Ａｂ１０５−１、Ａｂ１０６−１３、Ａｂ１３６−１、Ａｂ１４８−１、Ａｂ１５１−４、Ａｂ２３０−１、Ａｂ３７３−１、Ａｂ３８２−１）を産生するハイブリドーマを樹立した。
２）−６ モノクローナル抗体の癌細胞株に対する結合性の確認
２）−５で取得されたモノクローナル抗体がＥＰＨＡ２を高発現する癌細胞に結合するかどうかを２）−４−３と同様のフローサイトメトリー法で検討した。トランスフェクションした２９３Ｔ細胞の代わりにヒト乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）、ヒト前立腺癌細胞株（ＰＣ−３）が用いられた。その結果、樹立したモノクローナル抗体はいずれもこれらの癌細胞株に結合することが確認された。
２）−７ モノクローナル抗体のアイソタイプ決定
モノクローナル抗体のアイソタイプは、Ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ ｋｉｔ（Ｓｅｒｏｔｅｃ社製）により決定された。その結果、ＩｇＧ１（Ａｂ ５７−１、Ａｂ２３０−１）、ＩｇＧ２ａ（ＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１、Ａｂ６５−１、Ａｂ９６−１、Ａｂ１００−１、Ａｂ１３６−１、Ａｂ１４８−１、Ａｂ１５１−４）、ＩｇＧ２ｂ（Ａｂ１０５−１、Ａｂ１０６−１３、Ａｂ３７３−１、Ａｂ３８２−１）であった。
２）−８ モノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ移植マウスの腹水またはハイブリドーマ培養上清（以下「抗体精製原料」という。）から精製した。
マウス腹水は以下のように調製した。まず、７‐８週齢のＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕ／ｎｕ（日本クレア）をプリスタン（Ｓｉｇｍａ社製）処理し、約３週間後に生理食塩水で洗浄したハイブリドーマをマウス１匹あたり１×１０７細胞で腹腔内に移植した。１‐２週間後に腹腔内に貯留した腹水を採取し０．２２μｍのフィルターを通して滅菌し抗体精製原料として用いた。
ハイブリドーマ培養上清はＣＥＬＬｉｎｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用し調製した。培地にＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製 ＃０３８０５）を用いる点以外はメーカーの指示書に従い培養した。回収された培養上清は０．４５μｍフィルターで濾過し、抗体精製原料として用いた。
抗体はＲｅｃｏｍｂｉｎａｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｒＰＡ５０（ＲｅｐｌｉＧｅｎ社製）をホルミル−セルロファイン（生化学工業社製）に固定化したアフィニテイーカラム（以下「ホルミルセルロファインＰｒｏｔｅｉｎ Ａ」と略す）もしくは Ｈｉｔｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で精製された。ホルミルセルロファインＰｒｏｔｅｉｎ Ａでは、抗体精製原料を結合バッファー（３Ｍ ＮａＣｌ，１．５Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｐＨ８．９）で３倍希釈したものをカラムに添加し、結合バッファーで洗浄後、０．１Ｍ クエン酸 ｐＨ４．０で溶出した。一方、Ｈｉｔｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅでは、抗体精製原料をカラムに添加しＰＢＳで洗浄後、２Ｍ Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ＨＣｌ ｐＨ４．０で溶出した。溶出された抗体溶液は中和後、ＰＢＳにバッファー置換された。
抗体の濃度はＰＯＲＯＳ Ｇ ２０μｍ Ｃｏｌｕｍｎ，ＰＥＥＫ，４．６ｍｍ×１００ｍｍ，１．７ｍｌ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に結合させた抗体を溶出し、溶出液の吸光度（Ｏ．Ｄ．２８０ｎｍ）を測定することにより求めた。具体的には、平衡化バッファー（３０．６ｍＭ リン酸２水素ナトリウム・１２水、１９．５ｍＭ リン酸１カリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で平衡化したＰＯＲＯＳ Ｇ ２０μｍにＰＢＳで希釈した抗体サンプルを添加し、平衡化バッファーでカラムを洗浄後、カラムに結合した抗体を溶離液（０．１％（ｖ／ｖ） ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）で溶出した。溶出液の吸光度（Ｏ．Ｄ．２８０ｎｍ）のピーク面積を測定し、次式で濃度を算出した。
抗体サンプル濃度（ｍｇ／ｍｌ）＝（抗体サンプルのピーク面積）／（標準品（ヒトＩｇＧ１）のピーク面積）×標準品の濃度（ｍｇ／ｍｌ）×サンプルの希釈倍率
また、得られた抗体に含まれるエンドトキシン濃度をエンドスペシーＥＳ−５０Ｍセット（生化学工業 ＃０２０１５０）とエンドトキシン標準品ＣＳＥ−Ｌセット（生化学工業 ＃０２００５５）を用いて測定し、１ＥＵ／ｍｇ以下であることを確認し以下の実験に使用した。
（実施例３）ＳＨＥＤＣ３４８−１、ＳＨ３５７−１の性質
３）−１ 抗ＥＰＨＡ２抗体によるＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化誘導活性及びＥＰＨＡ２蛋白質量の低下を誘導する活性の検討
３）−１−１ 抗体刺激細胞溶解液の調製
１０％ ＦＢＳ、５０単位／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有ＲＰＭＩ１６４０（以下「１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０（抗生物質入り）」と略す。）に懸濁したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を６×１０５細胞／ウェルになるよう６ウェルディッシュに播種し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、培地を捨てＲＰＭＩ１６４０を添加し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下でさらに一晩培養した。その翌日、ＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１、アイソタイプコントロール抗体としてＭｏｕｓｅ ＩｇＧ２Ａ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（以下及び図中で「ｍＩｇＧ２ａ」と略す；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製：＃ＭＡＢ００３。）、ＥＰＨＡ２の可溶性リガンドとしてＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍｏｕｓｅ Ｅｐｈｒｉｎ−Ａ１／Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ（以下及び図中で「Ｅｐｈｒｉｎ−Ａ１／Ｆｃ」と略す；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製：＃６０２−Ａ１−２００。）、可溶性リガンドのコントロール蛋白質としてＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ Ｆｃ（以下及び図中で「ｈＧ１Ｆｃ」と略す；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製：＃１１０−ＨＧ−１００。）を図１、図２に示された濃度（ＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１、ｍＩｇＧ２ａは、図１Ａでは１０μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌ、図２Ａでは５０μｇ／ｍｌ、Ｅｐｈｒｉｎ−Ａ１／ＦｃとｈＧ１Ｆｃは、図１、図２で１μｇ／ｍｌ）になるようＲＰＭＩ１６４０で希釈した溶液を、培地を捨てたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に添加し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で指定の時間インキュベーションした。また、架橋抗体存在下の実験では、ＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１、ｍＩｇＧ２ａのそれぞれと架橋抗体としてＧｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ， Ｆｃγ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ（ｍｉｎ Ｘ Ｈｕ， Ｂｏｖ， Ｈｒｓ Ｓｒ Ｐｒｏｔ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製 ＃１１５−００５−０７１）をそれぞれ１０μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌ（図１Ｂ）、５０μｇ／ｍｌ（図２Ｂ）の濃度になるようＲＰＭＩ１６４０中で混合した溶液を、培地を捨てたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に添加し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で指定の時間インキュベーションした。指定の時間になったところで上清を除去し、１ｍＭ ＰＭＳＦ（ＳＩＧＭＡ社製）含有１×Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を加え細胞を溶解し、１５０００ｒｐｍで５分間遠心した細胞溶解液上清を免疫沈降、ウエスタンブロッティングのサンプルとして使用した。サンプルの蛋白質濃度はＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）により測定した。
３）−１−２ ＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化誘導活性の検証
ＥＰＨＡ２を免疫沈降するため、まず１サンプル当たり２５μｌのＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ懸濁液（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ社製）に８μｇのａｎｔｉ−Ｅｃｋ／ＥｐｈＡ２，ｃｌｏｎｅ Ｄ７（以下及び図中で「抗ＥＰＨＡ２抗体（Ｄ７）」と略す：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｕｐｓｔａｔｅ）社製 ＃０５−４８０）を加え、４℃で２時間転倒混和した。
その後、終濃度で１０％になるようＦＢＳを加え、さらに４℃で３０分間転倒混和した。ビーズを１ｍＭ ＰＭＳＦ含有１×Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄したあと、３）−１−１で調製した細胞溶解液上清を２００μｇ加え、４℃で一晩転倒混和した。翌日、ビーズを１ｍＭ ＰＭＳＦ含有１×Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した後、ビーズにＳＤＳ−ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（５６．３ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８、１．８％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ、９％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．７２Ｍ ２‐メルカプトエタノール、０．０４５ｍｇ／ｍｌ ブロモフェノールブルー）を加えて９８℃で５分間過熱し、ビーズから解離した蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。
ウエスタンブロッティングを行うため、分離後のゲルから蛋白質をポリビニリデンジフルオリド膜（以下「ＰＶＤＦ膜」と略す；ポアサイズ ０．４５μｍ：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜をブロッキング液（ブロックエース粉末（大日本住友製薬（雪印乳業）社製）１袋を１００ｍｌの超純水に溶解後、Ｔｗｅｅｎ ２０、アジ化ナトリウムをそれぞれ終濃度で０．１％（ｖ／ｖ）、０．０２％（ｗ／ｖ）になるよう添加）中で振とうし、ブロッキングした。初めに、免疫沈降されたＥＰＨＡ２を検出するため、ブロッキング後のＰＶＤＦ膜をブロッキング液で０．２５μｇ／ｍｌに希釈した抗ＥＰＨＡ２抗体（Ｄ７）溶液に浸し、室温で１時間振とうした。ＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１３８ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０）で１０分間、３回洗浄した後、ＴＢＳＴで３０００倍に希釈したＡｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ，ＨＲＰ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｗｈｏｌｅ Ａｂ Ｓｈｅｅｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）溶液に浸して室温で３０分間振とうした。さらにＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴで１０分間、３回洗浄した後、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用し化学発光用フィルムでシグナルを検出した。
次に、このＰＶＤＦ膜上から抗体を除去するため、ＰＶＤＦ膜をＳｔｒｉｐ液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８、２％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ、１００ｍＭ ２‐メルカプトエタノール）に浸して５５℃で３０分間振とうした後、Ｑｕｅｎｃｈ液（１％（ｖ／ｖ） Ｈ２Ｏ２、０．１％（ｗ／ｖ） ＮａＮ３含有ＴＢＳＴ）に浸して室温で２０分間振とう処理を行い、さらにＴＢＳＴで１０分間、３回洗浄した。ＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化状態を検出するため、このＰＶＤＦ膜をアジ化ナトリウム不含ブロッキング液（ブロックエース粉末１袋を１００ｍｌの超純水に溶解後、Ｔｗｅｅｎ ２０を終濃度で０．１％（ｖ／ｖ）になるよう添加）中で振とうしてブロッキングした後、アジ化ナトリウム不含ブロッキング液で１００００倍に希釈したＡｎｔｉ−Ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ４Ｇ１０ ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（図中で「４Ｇ１０抗体」と略す；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ （Ｕｐｓａｔｅ）社製 ＃１６−１８４）溶液に浸し室温で１時間振とうした。ＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴで１０分間、３回洗浄後、さらにＨ２Ｏで５分間、３回洗浄し、ＥＣＬ Ｐｌｕｓを使用し化学発光用フィルムでシグナルを検出した。
その結果、可溶性リガンドであるＥｐｈｒｉｎ−Ａ１／Ｆｃの添加によってインキュベーション後１０分でＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化が検出されるのに対し、ＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１では、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌの濃度で１０分後、３０分後、６０分後のいずれにおいてもリガンドのようなＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化を誘導する作用は認められなかった（図１Ａ）。また、架橋抗体存在下においても同様にＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１にはリガンドのようなＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化を誘導する作用は認められなかった（図１Ｂ）。
３）−１−３ ＥＰＨＡ２蛋白質量の低下を誘導する活性の検証
３）−１−１で調製した細胞溶解液上清１０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ゲル中の蛋白質をＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＥＰＨＡ２抗体（Ｄ７）とサンプル蛋白量のコントロールとしてＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ−β−Ａｃｔｉｎ ｃｌｏｎｅ ＡＣ−１５（以下及び図中では「抗β−ａｃｔｉｎ抗体」と略す：ＳＩＧＭＡ社製 ＃Ａ−５４４１）でウエスタンブロッティングを行った。具体的には、転写したＰＶＤＦ膜をブロッキング液中で振とうしてブロッキングした後、ＰＶＤＦ膜を分子量７０ｋＤａ付近を中心に剃刀で切断した。７０ｋＤａ以上のＰＶＤＦ膜をブロッキング液で０．２５μｇ／ｍｌに希釈した抗ＥＰＨＡ２抗体（Ｄ７）溶液に、７０ｋＤａ以下のＰＶＤＦ膜をブロッキング液で１０００倍希釈した抗β−ａｃｔｉｎ抗体溶液に浸し室温で１時間振とうした。各ＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴで１０分間、３回洗浄後、ＴＢＳＴで３０００倍に希釈したＡｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ，ＨＲＰ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｗｈｏｌｅ Ａｂ Ｓｈｅｅｐ溶液に浸し室温で３０分間振とうした。各ＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴで１０分間、３回洗浄した後、ＥＣＬ Ｐｌｕｓを使用してＮｉｇｈｔＯＷＬ ＬＢ９８３（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で検出した。バンドのシグナル強度の定量はＧｅｌ−Ｐｒｏ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．５ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標；Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社）で行った。
その結果、可溶性リガンドであるＥｐｈｒｉｎ−Ａ１／Ｆｃの添加によって顕著なＥＰＨＡ２蛋白質の減少が観察された（図２Ａ、Ｂ）。この効果と比較すると活性は弱いものの架橋抗体非存在下、存在下でともにＳＨ３４８−１の添加によりＥＰＨＡ２蛋白質の減少が観察された（図２Ａ、Ｂ）。一方、ＳＨ３５７−１では、架橋抗体の有無にかかわらずＥＰＨＡ２蛋白質の量にほとんど変化は観察されなかった（図２Ａ、Ｂ）。
ＳＨ３４８−１添加２４時間後におけるＥＰＨＡ２蛋白質の量を解析するため、リガンド・抗体無添加サンプルで補正した３回の実験結果から「ＥＰＨＡ２バンドのシグナル強度／β−Ａｃｔｉｎバンドのシグナル強度」の平均値を算出したところ、架橋抗体非存在下ではｍＩｇＧ２ａ添加２４時間後の値を１００％としたとき、ＳＨ３４８−１添加２４時間後の値は７０％であり、架橋抗体存在下ではｍＩｇＧ２ａ添加２４時間後の値を１００％としたとき、ＳＨ３４８−１添加２４時間後の値は６９％であった。
３）−２ ＡＤＣＣ活性
３）−２−１ エフェクター細胞の調製
ヌードマウスであるＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ＣｒｌＣｒｌｊ（日本チャールス・リバー社）より無菌的に脾臓を採取した。採取した脾臓を２枚のスライドグラスでホモジナイズし、ＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製 ＃５５５８９９）を用いて溶血処理を行った。得られた脾臓細胞をＦｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ， Ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１０％含むフェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）（以下「ＡＤＣＣ用培地」と略す。）に懸濁し、セルストレイナー（ポアサイズ４０μｍ：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を通した後、生細胞数をトリパンブルー色素排除試験にて計測した。脾臓細胞懸濁液を遠心後、培地を除去し、生細胞密度で１．５×１０７細胞／ｍｌになるようＡＤＣＣ用培地で再懸濁しエフェクター細胞とした。
３）−２−２ 標的細胞の調製
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ａ５４９、ＰＣ−３細胞をトリプシン処理し、１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０で細胞を洗浄後、１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０に再懸濁し、各細胞４×１０６個を０．２２μｍフィルターで滅菌したＣｈｒｏｍｉｕｍ−５１（５５５０ｋＢｑ）と混合し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で１時間ラベルした。ラベルした細胞をＡＤＣＣ用培地で３回洗浄し、ＡＤＣＣ用培地で２×１０５細胞／ｍｌになるよう再懸濁し標的細胞とした。
３）−２−３ ５１Ｃｒリリースアッセイ
２×１０５細胞／ｍｌの標的細胞を５０μｌ／ウェルで９６穴Ｕ底マイクロプレートに分注した。そこにエフェクター細胞添加後の終濃度で２．５μｇ／ｍｌになるようＡＤＣＣ用培地で希釈したＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１、アイソタイプコントロール抗体（ｍＩｇＧ２ａ）を５０μｌ添加し、４℃で１時間静置した。そこに１．５×１０７細胞／ｍｌのエフェクター細胞を１００μｌ添加し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、上清をＬｕｍａＰｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）に回収し、ガンマカウンターで放出されたガンマ線量を測定した。ＡＤＣＣ活性による細胞溶解率は次式で算出した。
細胞溶解率（％）＝（Ａ‐Ｂ）／（Ｃ‐Ｂ）×１００
Ａ：サンプルウェルのカウント
Ｂ：自然放出（抗体・エフェクター細胞非添加ウェル）カウントの平均値（ｎ＝３）。抗体添加時とエフェクター細胞添加時にそれぞれＡＤＣＣ用培地を５０μｌ、１００μｌ添加した。それ以外はサンプルウェルと同様の操作を行った。
Ｃ：最大放出（標的細胞を界面活性剤で溶解させたウェル）カウントの平均値（ｎ＝３）。抗体添加時にＡＤＣＣ用培地を５０μｌ、エフェクター細胞添加時にＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を２％（ｖ／ｖ）含むＡＤＣＣ用培地を１００μｌを添加した。それ以外はサンプルウェルと同様の操作を行った。
図３は、３回の実験の平均値で、エラーバーは、標準偏差を示し、Ｐ値はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔにより算出した。その結果、ＳＨ３４８−１は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（図３Ａ）、Ａ５４９細胞（図３Ｂ）、ＰＣ−３細胞（図３Ｃ）に対しそれぞれ８．２％、９．１％、４．７％の細胞溶解活性を示し、ＳＨ３５７−１は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（図３Ａ）、Ａ５４９細胞（図３Ｂ）、ＰＣ−３細胞（図３Ｃ）に対しそれぞれ８．８％、１３．０％、９．０％の細胞溶解活性を示したことから、いずれの抗体もＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、Ａ５４９細胞、ＰＣ−３細胞に対しＡＤＣＣ活性を有することが示された。
３）−３ ＣＤＣ活性
１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０（抗生物質入り）に懸濁したＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ａ５４９、ＰＣ−３細胞を９６穴マイクロプレートに各５０００細胞／ウェルで播種し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、補体添加後の終濃度で２５μｇ／ｍｌになるように１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０（抗生物質入り）で希釈したＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１、アイソタイプコントロール抗体（ｍＩｇＧ２ａ）を添加し、４℃で１時間静置した。そこにＲＰＭＩ１６４０で３０％に希釈したウサギ補体（ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ社製 ＃ＣＬ３０５１）を終濃度で５％になるよう添加し３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で１時間インキュベートし、さらに室温で３０分間静置した。細胞生存率を測定するため、培養液と等量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、室温で１０分間攪拌した後、プレートリーダーで発光量を計測した。細胞生存率は次式で算出した。
細胞生存率（％）＝（ａ−ｂ）／（ｃ−ｂ）×１００
ａ：サンプルウェルの発光量
ｂ：バックグラウンド（細胞・抗体非添加ウェル）発光量の平均値（ｎ＝８）。細胞播種時に細胞懸濁液の代わりに等量の１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０（抗生物質入り）を添加し、抗体添加時に抗体希釈液と等量の１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０（抗生物質入り）を添加した。それ以外はサンプルウェルと同様の操作を行った。
ｃ：抗体非添加ウェルの発光量の平均値（ｎ＝３）。抗体添加時に抗体希釈液と等量の１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０（抗生物質入り）を添加した。それ以外はサンプルウェルと同様の操作を行った。
図４は、３回の実験の平均値で、エラーバーは、標準偏差を示し、Ｐ値はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔにより算出した。その結果、ＳＨ３４８−１は、補体存在下でＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（図４Ａ）、Ａ５４９細胞（図４Ｂ）、ＰＣ−３細胞（図４Ｃ）に対しそれぞれ４４％、３１％、４１％の細胞生存率の低下を誘導し、ＳＨ３５７−１も補体存在下でＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（図４Ｄ）、Ａ５４９細胞（図４Ｅ）、ＰＣ−３細胞（図４Ｆ）に対しそれぞれ６５％、６０％、６５％の細胞生存率の低下を誘導したことから、いずれの抗体もＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、Ａ５４９細胞、ＰＣ−３細胞に対しＣＤＣ活性を有することが示された。
３）−４ エピトープ決定
３）−４−１ ＥＰＨＡ２部分ポリペプチド（ｒＦｎＩＩＩ−ＮＣ、ｒＦｎＩＩＩ−Ｎ、ｒＦｎＩＩＩ−Ｃ）の作製
１）−１−３で作製した発現プラスミドで大腸菌ＢＬ２１および大腸菌Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ｓｉｇｍａ社製）を添加したＬＢ培地で培養を行い、ＢＬ２１はＡｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）は０．５ｍＭ ＩＰＴＧ添加でＥＰＨＡ２部分ポリペプチドの発現誘導を行った。６０００ｒｐｍ、２０分間遠心して集菌し、破砕バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ） Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１０％（ｖ／ｖ） Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に懸濁した後、氷上で超音波破砕を行った。１４０００ｒｐｍ、１５分間遠心して、上清を回収し、Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製） ０．５ｍｌに供与した。洗浄バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、１０％（ｖ／ｖ） Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）で洗浄した後に、溶出バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、４００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、１０％（ｖ／ｖ） Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）にて溶出した。溶出サンプルは、ＰＢＳを溶媒としたゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００：ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）でさらに精製された。得られた組換え蛋白質の濃度はＰｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で測定した。
３）−４−２ ＥＰＨＢ２細胞外領域ポリペプチド（ｒＥＰＨＢ２−ＥＣＤ）の調製
ＥＰＨＢ２−ＥＣＤを発現させるため、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３−Ｆ細胞に２９３ｆｅｃｔｉｎを用いてｐｃＤＮＡ３．１−ＥｐｈＡ２−ＥＣＤをトランスフェクションし、３７℃、８％ ＣＯ２で７２時間培養した。培養後、遠心分離により培養液を回収し、ｒＥＰＨＢ２−ＥＣＤ精製の原料とした。得られた培養上清を分子量分画１５０００の透析チューブを用いて２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５に対して透析し、フィルター濾過（０．４５μｍ，ＰＥＳ）した後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ １６／１０ Ｑ ＸＬに添加した。溶出はＮａＣｌの直線濃度勾配（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、０−１Ｍ ＮａＣｌ）で行った。溶出画分の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ゲルをＣＢＢ染色し、ｒＥＰＨＢ２−ＥＣＤの含まれる画分を確認した。次にｒＥＰＨＢ２−ＥＣＤを含む画分を集め、ＰＢＳで平衡化されたＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇに添加した。ＰＢＳで溶出し、溶出分画の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離後、ゲルをＣＢＢ染色し、ｒＥＰＨＢ２−ＥＣＤの含まれる画分を確認した。ｒＥＰＨＢ２−ＥＣＤを含む画分を集め、エピトープ決定時の抗原として使用した。蛋白質濃度はＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔにより決定した。
３）−４−３ ＥＬＩＳＡ法による抗原結合部位の決定
ｒＥＰＨＡ２−ＥＣＤ、ｒＦｎＩＩＩ−ＮＣ、ｒＦｎＩＩＩ−Ｎ、ｒＦｎＩＩＩ−Ｃとコントロール蛋白質のｒＥＰＨＢ２−ＥＣＤをＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈し、イムノプレート（Ｎｕｎｃ社製 ＃４４２４０４）にそれぞれ１００μｌ／ウェルで分注し、４℃で一晩静置することでプレートに蛋白質を吸着させた。翌日、ウェル中の液を除去し、ブロックエース溶液（ブロックエース粉末１袋を１００ｍｌの超純水で溶解）をＰＢＳで４倍希釈した溶液を２００μｌ／ウェルで分注し、室温で１時間静置した。ウェル中の液を除去後、ＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１、アイソタイプコントロール抗体（ｍＩｇＧ２ａ）を希釈緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０）で５μｇ／ｍｌに希釈したものを５０μｌ／ウェルで添加した。室温で１時間静置後、ウェル中の液を除去し、希釈緩衝液で２回ウェルを洗浄した。希釈緩衝液で３０００倍に希釈したＧｏａｔ ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ， Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄを５０μｌ／ウェルで添加し、室温で１時間静置した。ウェル中の液を除去し、希釈緩衝液で２回ウェルを洗浄した後、ＯＰＤ発色液を１００μｌ／ウェルで添加し攪拌しながら発色反応を行った。発色後、１Ｍ ＨＣｌを１００μｌ／ウェルで添加して発色反応を止め、プレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定した。
ＥＰＨＡ２のドメイン構造予測（ＮＣＢＩ ＣＤＤ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１１、ＣＢＳ ＴＭＨＭＭ Ｓｅｒｖｅｒ ｖ．２．０）およびＥＰＨＡ２−ＥＣＤ、ＦｎＩＩＩ−ＮＣ、ＦｎＩＩＩ−Ｎ、ＦｎＩＩＩ−ＣのＥＰＨＡ２中での位置を図５Ａに示す。Ｌｉｇａｎｄ−ＢＤはリガンド結合ドメイン、ＦＮ３はフィブロネクチンタイプ３ドメイン、ＴＭは膜貫通領域、Ｔｒｋ ｋｉｎａｓｅはチロシンキナーゼドメイン、ＳＡＭはＳＡＭドメインを示す。
ＥＰＨＡ２細胞外領域（ＥＰＨＡ２−ＥＣＤ）、２つのフィブロネクチンタイプ３ドメインを含む領域（ＦｎＩＩＩ−ＮＣ）、Ｎ末端側のフィブロネクチンタイプ３ドメインを含む領域（ＦｎＩＩＩ−Ｎ）、Ｃ末端側のフィブロネクチンタイプ３ドメインを含む領域（ＦｎＩＩＩ−Ｃ）の組換え蛋白質を作製し、ＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１の結合性を検討したところ、ＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１は、ｒＥＰＨＡ２−ＥＣＤ、ｒＦｎＩＩＩ−ＮＣ、ｒＦｎＩＩＩ−Ｃに結合性を示した（図５Ｂ）。したがってＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１はＣ末端側のフィブロネクチンタイプ３ドメインを含む４２６番目〜５３４番目のアミノ酸（配列表の配列番号８のアミノ酸番号４２６乃至５３４に示されるアミノ酸配列）の領域に結合することが示された。
（実施例４）Ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をトリプシン処理して培養フラスコより剥がした後、１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０（抗生物質入り）に懸濁後遠心し、上清を除去した。細胞を同培地で２回洗浄したあと、ＢＤマトリゲル基底膜マトリックス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に懸濁し、６週齢のＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕ／ｎｕ（（日本クレア社）に５×１０６細胞／マウスで背部皮下に移植した。移植日を０日目として９、１６、２３、３０日目にＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１を５００μｇ／マウスで腹腔内投与した。コントロールには抗体と同体積（５００μｌ）のＰＢＳを腹腔内投与した。腫瘍体積を９、１３、１６、２０、２３、２８、３０、３４、３７日目に測定し、抗体投与による抗腫瘍効果を検討した。その結果、ＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１投与群ではＰＢＳ投与群に比べ、有意に腫瘍増殖が抑制された（３７日目時点の腫瘍体積についてＰＢＳ投与群との比較でＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１のＰ値は共にＰ＜０．００１であった。Ｐ値はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔにより算出）。また、３７日目時点での腫瘍増殖阻害率（＝１００‐（抗体投与群の腫瘍体積の平均値）／（ＰＢＳ投与群の腫瘍体積の平均値）×１００）はＳＨ３４８−１で８９．５％、ＳＨ３５７−１で８４．１％であり、Ｉｎ ｖｉｖｏで非常に強い抗腫瘍効果が観察された（図６Ａ、Ｂ）。
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞移植マウスで抗腫瘍効果を検討した１４のモノクローナル抗ＥＰＨＡ２抗体の内、効果を示したのはＦｎＩＩＩ−Ｃに結合するＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１のみであった（表１）。
以上の結果より、ＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１が従来報告のないエピトープ（配列表の配列番号８のアミノ酸番号４２６乃至５３４に示されるアミノ酸配列）を認識し抗腫瘍効果を示す抗体であることが明らかとなった。またＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１の結合領域がＥＰＨＡ２を標的とした抗腫瘍モノクローナル抗体の有望な標的となることが示された。
（実施例５）ＳＨ３４８−１，ＳＨ３５７−１の抗体遺伝子の同定
マウス抗ヒトＥＰＨＡ２抗体であるＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１の重鎖および軽鎖のＮ末端アミノ酸配列を決定するために、２）−８で精製したＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１を含む溶液の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。分離後のゲルからＰＶＤＦ膜（ポアサイズ ０．４５μｍ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にゲル中の蛋白質を転写し、洗浄バッファー（２５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ホウ酸ナトリウムバッファー ｐＨ８．０）で洗浄した後、染色液（５０％ メタノール、２０％ 酢酸、０．０５％ クマシーブリリアントブルー）に５分間浸して染色してから、９０％ メタノールで脱色した。ＰＶＤＦ膜上で可視化された重鎖（移動度が小さい方のバンド）および軽鎖（移動度が大きい方のバンド）に相当するバンド部分を切りとり、Ｐｒｏｃｉｓｅ（登録商標） ｃＬＣ プロテインシーケンサー Ｍｏｄｅｌ ４９２ｃＬＣ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、自動エドマン法（Ｅｄｍａｎ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ． （１９６７） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １， ８０参照）によりそれぞれのＮ末端アミノ酸配列の同定を試みた。ＳＨ３４８−１の重鎖については、上述の方法ではアミノ酸配列が同定できなかったため、Ｐｆｕ Ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍａｔｅ Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いてＮ末端ピログルタミン酸を除去後に同様の操作を行いＮ末端から２番目以降のアミノ酸配列を同定した。
その結果、ＳＨ３４８−１の重鎖に相当するバンドのＮ末端から２番目以降のアミノ酸配列は、
Ｉ−Ｑ−Ｌ−Ｖ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｐ（配列表の配列番号２６）であり、軽鎖に相当するバンドのＮ末端アミノ酸配列は、
Ｄ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｔ−Ｑ−Ｓ−Ｐ−Ｌ−Ｓ−Ｌ（配列表の配列番号２７）
であり、ＳＨ３５７−１の重鎖に相当するバンドのＮ末端アミノ酸配列は、
Ｑ−Ｉ−Ｑ−Ｌ−Ｖ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｐ（配列表の配列番号２８）
であり、軽鎖に相当するバンドのＮ末端アミノ酸配列は、
Ｄ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｔ−Ｑ−Ｔ−Ｐ−Ｌ−Ｓ−Ｌ−Ｐ−Ｖ−Ｓ−Ｌ−Ｇ−Ｄ−Ｑ−Ａ（配列表の配列番号２９）であった。これらのアミノ酸配列を、カバトらにより作成された抗体のアミノ酸配列データベース（Ｋａｂａｔ， Ｅ． Ａ． ｅｔ ａｌ．，（１９９１） ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｖｏｌ． Ｉ及びＩＩ， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ参照）と比較したところ、ＳＨ３４８−１の重鎖（γ２ａ鎖）のサブタイプはｍｉｓｃｅｌｌａｎｅｏｕｓであり、軽鎖のサブタイプはｋａｐｐａ ｌｉｇｈｔ ＩＩであった。また、ＳＨ３５７−１の重鎖（γ２ａ鎖）のサブタイプはｍｉｓｃｅｌｌａｎｅｏｕｓであり、軽鎖のサブタイプはｋａｐｐａ ｌｉｇｈｔ ＩＩであることが判明した。
そこでこれらのマウスサブタイプに属する抗体遺伝子翻訳領域の５’末端側と終止コドンを含む３’末端部分にそれぞれハイブリダイズする下記のオリゴヌクレオチドプライマーを合成した（前出カバトらの文献、Ｍａｔｔｉ Ｋａｒｔｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８） ２５， ８５９−８６５およびＨｅｉｎｒｉｃｈ， Ｇ． ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １５９，ｐ．４１７−４３５参照）：
５’−ｃａｇａｔｃｃａｇｔｔｇｇｔｇｃａｇｔｃｔｇｇａｃｃｔ−３’（ＤＢ３Ｆ１：配列表の配列番号３０）
５’−ａａｇａｔａｔｃｔｃａｔｔｔａｃｃｃｇｇａｇｔｃｃｇｇｇａｇａａ−３’（ＭＩＧ２ＡＥＶＲ１：配列表の配列番号３１）
５’−ａａｇａａｔｔｃａｔｇａａｇｔｔｇｃｃｔｇｔｔａｇｇ−３’（ＭＫ１９ＥＩＦ１：配列表の配列番号３２）
５’−ａａｇａｔａｔｃｔｔａａｃａｃｔｃａｔｔｃｃｔｇｔｔｇａａｇｃｔ−３’（ＫＥＶＲ１：配列表の配列番号３３）
ＳＨ３４８−１，ＳＨ３５７−１の重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡをクローニングするため、ＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１産生ハイブリドーマよりＱｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製 ＃２７−９２５４−０１）を用いてｍＲＮＡを調製した。このようにして得られたそれぞれのｍＲＮＡからＴａＫａＲａ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ）（タカラバイオ社製 ＃ＲＲ０２４Ａ）と重鎖用プライマーセット（ＤＢ３Ｆ１及びＭＩＧ２ＡＥＶＲ１の組み合わせ）または軽鎖用プライマーセット（ＭＫ１９ＥＩＦ１及びＫＥＶＲ１の組み合わせ）を用いて各抗体の重鎖、軽鎖をコードするｃＤＮＡを増幅した。これらＰＣＲで増幅されたｃＤＮＡをＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてクローニングし、クローニングされた重鎖、軽鎖の各ヌクレオチド配列を遺伝子配列解析装置（「ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ」あるいは「Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ｘｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ」）を用いて決定した。シーケンスの反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。
決定されたＳＨ３４８−１の重鎖をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列表の配列番号３４に示し、アミノ酸配列を配列番号３５に示した。ＳＨ３４８−１の軽鎖をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列表の配列番号３６に示し、アミノ酸配列を配列表の配列番号３７に示した。ＳＨ３５７−１の重鎖をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列表の配列番号３８に示し、アミノ酸配列を配列番号３９に示した。ＳＨ３５７−１の軽鎖をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列表の配列番号４０に示し、アミノ酸配列を配列番号４１に示した。配列番号３４のヌクレオチド番号１〜２７及び１３２７〜１３５０の配列、配列番号３６のヌクレオチド番号６３７〜６６０の配列、配列番号３８のヌクレオチド番号１〜２７及び１３２７〜１３５０の配列、配列番号４０のヌクレオチド番号６３７〜６６０の配列はプライマー部分の配列である。
また、各重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を、カバトらによる抗体のアミノ酸配列のデータベース（Ｋａｂａｔ， Ｅ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．（１９９１） ｉｎ “Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｖｏｌ．Ｉ及びＩＩ”：Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ参照）と比較検討した結果、ＳＨ３４８−１の重鎖については、配列表の配列番号３５のアミノ酸番号１乃至１１９に示されるアミノ酸配列が可変領域であり、アミノ酸番号１２０乃至４４９に示されるアミノ酸配列が定常領域であることが明らかになった。またＳＨ３４８−１の軽鎖については、配列表の配列番号３７のアミノ酸番号１乃至１１２に示されるアミノ酸配列が可変領域であり、アミノ酸番号１１３乃至２１９に示されるアミノ酸配列が定常領域であることが明らかとなった。
ＳＨ３５７−１の重鎖については、配列表の配列番号３９のアミノ酸番号１乃至１１９に示されるアミノ酸配列が可変領域であり、アミノ酸番号１２０乃至４４９に示されるアミノ酸配列が定常領域であることが明らかになった。またＳＨ３５７−１の軽鎖については、配列表の配列番号４１のアミノ酸番号１乃至１１２に示されるアミノ酸配列が可変領域であり、アミノ酸番号１１３乃至２１９に示されるアミノ酸配列が定常領域であることが明らかとなった。
ＳＨ３４８−１の重鎖可変領域のヌクレオチド配列を配列表の配列番号４２に、アミノ酸配列を配列番号４３に、重鎖定常領域のヌクレオチド配列を配列番号４４に、アミノ酸配列を配列番号４５に示した。ＳＨ３４８−１の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を配列表の配列番号４６に、アミノ酸配列を配列番号４７に、軽鎖定常領域のヌクレオチド配列を配列番号４８に、アミノ酸配列を配列番号４９に示した。配列番号４２のヌクレオチド番号１〜２７の配列、配列番号４４のヌクレオチド番号９７０〜９９３の配列、配列番号４８のヌクレオチド番号３０１〜３２４の配列はプライマー部分の配列である。
またＳＨ３５７−１の重鎖可変領域のヌクレオチド配列を配列表の配列番号５０に、アミノ酸配列を配列番号５１に、重鎖定常領域のヌクレオチド配列を配列番号５２に、アミノ酸配列を配列番号５３に示した。ＳＨ３５７−１の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を配列番号５４に、アミノ酸配列を配列番号５５に、軽鎖定常領域のヌクレオチド配列を配列番号５６に、アミノ酸配列を配列番号５７に示した。配列番号５０のヌクレオチド番号１〜２７の配列、配列番号５２のヌクレオチド番号９７０〜９９３の配列、配列番号５６のヌクレオチド番号３０１〜３２４の配列はプライマー部分の配列である。
さらに、重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列における、それぞれのＣＤＲの位置および配列は、カバトらの文献（前記Ｋａｂａｔ， Ｅ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．（１９９１）参照。）による抗体のアミノ酸配列のデータベースとの相同性を比較検討することによって決定された。該文献によれば、異なる抗体間でもサブタイプが同じであれば可変領域中のフレームワーク領域の鎖長はほぼ一定であり、またそのアミノ酸配列には共通性が認められる。一方、ＣＤＲは、それらのフレームワーク領域にはさまれて存在する固有の配列である。そこで、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を同じサブタイプのものと比較検討した結果、ＳＨ３４８−１の重鎖のＣＤＲは、配列表の配列番号３５のアミノ酸番号２６〜３５（ＣＤＲＨ１）、同アミノ酸番号５０〜６６（ＣＤＲＨ２）および同アミノ酸番号９９〜１０８（ＣＤＲＨ３）で示されるアミノ酸配列と決定された。ＳＨ３４８−１の軽鎖のＣＤＲは、配列表の配列番号３７のアミノ酸番号２４〜３９（ＣＤＲＬ１）、同アミノ酸番号５５〜６１（ＣＤＲＬ２）および同アミノ酸番号９４〜１０２（ＣＤＲＬ３）で示されるアミノ酸配列と決定された。ＳＨ３５７−１重鎖のＣＤＲは、配列表の配列番号３９のアミノ酸番号２６〜３５（ＣＤＲＨ１）、同アミノ酸番号５０〜６６（ＣＤＲＨ２）および同アミノ酸番号９９〜１０８（ＣＤＲＨ３）で示されるアミノ酸配列と決定された。ＳＨ３５７−１の軽鎖ＣＤＲは、配列表の配列番号４１のアミノ酸番号２４〜３９（ＣＤＲＬ１）、同アミノ酸番号５５〜６１（ＣＤＲＬ２）および同アミノ酸番号９４〜１０２（ＣＤＲＬ３）で示されるアミノ酸配列と決定された。
ＳＨ３４８−１のＣＤＲＨ１のヌクレオチド配列を配列表の配列番号５８に、アミノ酸配列を配列番号５９に、ＣＤＲＨ２のヌクレオチド配列を配列番号６０に、アミノ酸配列を配列番号６１に、ＣＤＲＨ３のヌクレオチド配列を配列番号６２に、アミノ酸配列を配列番号６３に、ＣＤＲＬ１のヌクレオチド配列を配列番号６４に、アミノ酸配列を配列番号６５に、ＣＤＲＬ２のヌクレオチド配列を配列番号６６に、アミノ酸配列を配列番号６７に、ＣＤＲＬ３のヌクレオチド配列を配列番号６８に、アミノ酸配列を配列番号６９に示した。また、ＳＨ３５７−１のＣＤＲＨ１のヌクレオチド配列を配列番号７０に、アミノ酸配列を配列番号７１に、ＣＤＲＨ２のヌクレオチド配列を配列番号７２に、アミノ酸配列を配列番号７３に、ＣＤＲＨ３のヌクレオチド配列を配列番号７４に、アミノ酸配列を配列番号７５に、ＣＤＲＬ１のヌクレオチド配列を配列番号７６に、アミノ酸配列を配列番号７７に、ＣＤＲＬ２のヌクレオチド配列を配列番号７８に、アミノ酸配列を配列番号７９に、ＣＤＲＬ３のヌクレオチド配列を配列番号８０に、アミノ酸配列を配列番号８１に示した。
（実施例６）抗ＥＰＨＡ２抗体のＥＰＨＡ２細胞外領域に対する結合性
ＥＰＨＡ２細胞外領域ポリペプチド（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製。＃３０３５−Ａ２−１００）又はコントロールとしてとしてＢｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｍｉｎ（以下、本文及び図中で「ＢＳＡ」と略す。）をＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈した溶液を、イムノプレート（Ｎｕｎｃ社製 ＃４４２４０４）に１００μｌ／ウェルで分注し、４℃で一晩静置することでプレートに吸着させた。
翌日、ウェル中の液を除去し、ブロックエース溶液（ブロックエース粉末（大日本住友製薬（雪印乳業）社製）１袋を１００ｍｌの超純水で溶解）をＰＢＳで４倍希釈した溶液を２００μｌ／ウェルで分注し、室温で１時間静置した。ウェルを希釈緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０）で２回洗浄後、ＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１、Ａｂ９６−１をそれぞれ１．２５×１０−４μｇ／ｍｌ、１．２５×１０−３μｇ／ｍｌ、１．２５×１０−２μｇ／ｍｌ、１．２５×１０−１μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、１２５μｇ／ｍｌの濃度になるようＰＢＳで希釈した溶液（最終濃度で０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０含有）を１００μｌ／ウェルで添加した。
室温で１時間静置後、ウェル中の液を除去し、希釈緩衝液で２回ウェルを洗浄した。希釈緩衝液で１０００倍に希釈したＧｏａｔ ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ，Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）社製 ＃ＡＰ１８１Ｐ）を１００μｌ／ウェルで添加し、室温で１時間静置した。ウェル中の液を除去し、希釈緩衝液で２回ウェルを洗浄した後、ＯＰＤ発色液を１００μｌ／ウェルで添加し攪拌しながら発色反応を行った。発色後、１Ｍ ＨＣｌを１００μｌ／ウェルで添加して発色反応を止め、プレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定した（図７）。
図７Ａ）はＳＨ３４８−１、図７Ｂ）はＳＨ３５７−１、図７Ｃ）はＡｂ９６−１の結果を示す。各グラフ中の吸光度は平均値±標準偏差（ｎ＝３）で示し、吸光度が強いほど、結合活性が強いことを示している。グラフに示されるように、ＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１、Ａｂ９６−１はいずれもＢＳＡに対する結合性を示さずに、ＥＰＨＡ２細胞外領域に特異的に結合することが確認された。
（実施例７）抗ＥＰＨＡ２抗体のリガンド結合に対する影響
実施例６に記載の方法に準じてＥＰＨＡ２細胞外領域ポリペプチド（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製：＃３０３５−Ａ２−１００）が固定されたイムノプレートを作製した。イムノプレートのウェルを希釈緩衝液で２回洗浄した後、ＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１、Ａｂ９６−１、アイソタイプコントロール抗体としてＭｏｕｓｅ ＩｇＧ２Ａ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（以下及び図中で「ｍＩｇＧ２ａ」と略す；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製：＃ＭＡＢ００３）を希釈緩衝液で１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌに希釈したものをそれぞれ１００μｌ／ウェルで添加した。室温で１時間静置後、終濃度で１μｇ／ｍｌになるよう、可溶性リガンドであるＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍｏｕｓｅ Ｅｐｈｒｉｎ−Ａ１／Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ（以下及び図中で「Ｅｐｈｒｉｎ−Ａ１／Ｆｃ」と略す；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製：＃６０２−Ａ１−２００。）又は可溶性リガンドに対する陰性コントロール蛋白質としてＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ Ｆｃ（以下及び図中で「ｈＧ１Ｆｃ」と略す；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製：＃１１０−ＨＧ−１００）を添加し室温で１時間静置した。
次に実施例６に記載の方法に準じてウェル中の液を除去し、希釈緩衝液で洗浄し、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製 ＃１０９−０３５−０９８）を添加し、ＯＰＤ発色液による発色反応を行い、プレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定した（図８）。
図８中の吸光度は平均値±標準偏差（ｎ＝３）で示した。Ａｂ９６−１は１０μｇ／ｍｌの濃度でもＥＰＨＡ２のリガンドであるＥｐｈｒｉｎ−Ａ１のＥＰＨＡ２に対する結合を強く阻害したのに対し、ＳＨ３４８−１及びＳＨ３５７−１は、Ａｂ９６−１の５倍の濃度である５０μｇ／ｍｌで添加した場合でもＥｐｈｒｉｎ−Ａ１／ＦｃのＥＰＨＡ２に対する結合を阻害しなかった。以上の結果から、ＳＨ３４８−１及びＳＨ３５７−１はＥｐｈｒｉｎ−Ａ１／ＦｃのＥＰＨＡ２に対する結合を阻害しないことが確認された。
（実施例８）抗ＥＰＨＡ２抗体のＥｐｈｒｉｎ−Ａ１依存的ＥＰＨＡ２チロシン残基リン酸化抑制活性の検証
８）−１ 細胞溶解液の調製
１０％ ＦＢＳ、５０単位／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有ＲＰＭＩ１６４０（以下、「１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０（抗生物質入り）」と略す。）に懸濁したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を２．５×１０５細胞／ウェルになるよう１２ウェルディッシュに播種し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で一晩培養した。次にウェル中の培地を捨て、新たにＲＰＭＩ１６４０を添加し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下でさらに一晩培養した。次にウェル中の培地を除去し、各ウェルにＲＰＭＩ１６４０のみ、または１０μｇ/ｍｌ又は５０μｇ/ｍｌの濃度の抗体（ｍＩｇＧ２ａ、ＳＨ３４８−１又はＳＨ３５７−１）を含むＲＰＭＩ１６４０を各ウェルに添加し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で１時間プレインキュベーションした。
プレインキュベーション後、ＲＰＭＩ１６４０のみを添加したウェルには５０分の１容量のＥｐｈｒｉｎ−Ａ１／Ｆｃ、ｈＧ１Ｆｃ（それぞれ最終濃度で１μｇ/ｍｌ）又はこれらと同体積のＲＰＭＩ１６４０（図９で（−）と表記）を添加した。またｍＩｇＧ２ａ、ＳＨ３４８−１又はＳＨ３５７−１を添加したウェルには、５０分の１容量のＥｐｈｒｉｎ−Ａ１／Ｆｃ（最終濃度で１μｇ/ｍｌ）を添加した。
ディッシュを３７℃、５％ ＣＯ２の条件下でさらに１５分間インキュベーションし、上清を除去した後、１ｍＭ ＰＭＳＦ（ＳＩＧＭＡ社製）とプロテアーゼインヒビターカクテル（ＳＩＧＭＡ社製 ＃Ｐ８３４０）を含有する１×Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）（以下、ＰＰＣＬＢと略す）を加え細胞を溶解した。溶解液を１５０００ｒｐｍで５分間遠心し、得られた上清を免疫沈降のサンプルとした。サンプルの蛋白質濃度はＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）により測定した。
８）−２ 免疫沈降によるＥＰＨＡ２リン酸化状態の検出
１サンプル当たり、２５μｌのＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ懸濁液（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ社製）及び４μｇのａｎｔｉ−ＥｐｈＡ２ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製 ＃ｓｃ−９２４）を加え、４℃で２時間転倒混和した。次に、終濃度で１０％になるようＦＢＳを加え、さらに４℃で３０分間転倒混和した。次にビーズ（ｂｅａｄｓ）をＰＰＣＬＢで洗浄し、８）−１で調製した細胞溶解液上清を２００μｇ加え、４℃で一晩転倒混和した。
翌日、ビーズをＰＰＣＬＢで３回洗浄した後、ビーズにＳＤＳ−ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（５６．３ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８、１．８％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ、９％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．７２Ｍ ２‐メルカプトエタノール、０．０４５ｍｇ／ｍｌ ブロモフェノールブルー）を加えて９８℃で５分間過熱し、ビーズから解離した蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。
分離後のゲルから蛋白質をＰＶＤＦ膜（ポアサイズ ０．４５μｍ：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に転写し、ＰＶＤＦ膜をアジ化ナトリウム不含ブロッキング液（ブロックエース粉末１袋を１００ｍｌの超純水に溶解後、Ｔｗｅｅｎ ２０を最終濃度で０．１％（ｖ／ｖ）添加）中で振とうしてブロッキングした。
ＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化状態を検出するため、Ａｎｔｉ−Ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ４Ｇ１０ ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｕｐｓｔａｔｅ社製 ＃１６−１８４）をアジ化ナトリウム不含ブロッキング液で１００００倍に希釈した溶液にＰＶＤＦ膜を浸し、室温で１時間反応させた。ＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１３８ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０）で１０分間、３回洗浄後、さらにＨ２Ｏで５分間、３回洗浄し、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用し化学発光用フィルム上にシグナルを検出した。
次に、このＰＶＤＦ膜上に存在する免疫沈降されたＥＰＨＡ２を検出するため、ＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化状態を検出した後のＰＶＤＦ膜をＳｔｒｉｐ液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８、２％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ、１００ｍＭ ２‐メルカプトエタノール）に浸して５５℃で３０分間振とうした後、Ｑｕｅｎｃｈ液（１％（ｖ／ｖ） Ｈ２Ｏ２、０．１％（ｗ／ｖ） ＮａＮ３含有ＴＢＳＴ）に浸して室温で２０分間振とうし、ＰＶＤＦ膜上の抗体を除去した。ＴＢＳＴで１０分間、３回洗浄し、ブロッキング液（ブロックエース粉末１袋を１００ｍｌの超純水に溶解後、Ｔｗｅｅｎ ２０、アジ化ナトリウムをそれぞれ終濃度で０．１％（ｖ／ｖ）、０．０２％（ｗ／ｖ）になるよう添加）中でブロッキングした後、ａｎｔｉ−ＥｐｈＡ２ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製 ＃ｓｃ−９２４）をブロッキング溶液で４０００倍に希釈した溶液にＰＶＤＦ膜を浸し、室温で１時間反応させた。ＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴで１０分間、３回洗浄した後、Ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ， ＨＲＰ−ｌｉｎｋｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製 ＃７０７４）をＴＢＳＴで１００００倍に希釈した溶液に浸して室温で３０分間反応させた。その後このＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴで１０分間、３回洗浄した後、ＥＣＬ Ｐｌｕｓを使用し化学発光用フィルム上にシグナルを検出した。
可溶性リガンドであるＥｐｈｒｉｎ−Ａ１／Ｆｃにより誘導されるＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化は、アイソタイプコントロール抗体であるｍＩｇＧ２ａでは阻害されないのに対し、ＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１の添加により用量依存的に抑制されていた（図９）。
以上の結果より、ＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１は、リガンドであるＥｐｈｒｉｎ−Ａ１のＥＰＨＡ２に対する結合を阻害するのではなく、リガンドにより誘導されるＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化を抑制することが示された。
（実施例９）抗ＥＰＨＡ２抗体のエピトープ同定
図１０に示される領域からなるＥＰＨＡ２の欠損変異体を作製し、ＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１結合領域を決定した。
９）−１ ＥＰＨＡ２欠損変異体の作製
ＥＰＨＡ２欠損変異体をＮ末端にＧＳＴ−ＴａｇとＨｉｓ−Ｔａｇ、Ｃ末端にＳ−Ｔａｇを付加した形で蛋白質を発現させるため、下記のプライマーを合成し、以下の方法で増幅した遺伝子断片をｐＥＴ−４９ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にクローニングした。
５’−ａｔｔａｇｇａｔｃｃｇａｇｃｔｔｃｃｇｔａｃｔｇｃｃａｇｔｇｔｃ−３’（プライマーＮ１：配列番号８２）
５’−ａｔｔａｇｇａｔｃｃｇｃｃｃｃｃｃａａｇｇｔｇａｇｇｃｔ−３’（プライマーＮ２：配列番号８３）
５’−ａｔｔａｇｇａｔｃｃｇｇｔｃａｃｔｔａｃｃｇｃａａｇａａｇｇｇａｇａ−３’（プライマーＮ３：配列番号８４）
５’−ａｔｔａｇｇａｔｃｃｇｇｔｃｃａｇｇｔｇｃａｇｇｃａｃｔｇａｃｇ−３’（プライマーＮ４：配列番号８５）
５’−ａａｔｔａａｇｃｔｔｇｃｃｇｃｃａａｔｃａｃｃｇｃｃａａｇｔｔ−３’（プライマーＣ１：配列番号８６）
５’−ａａｔｔａａｇｃｔｔｇｔｔｇｃｃａｇａｔｃｃｃｔｃｃｇｇｇｇａｃ−３’（プライマーＣ２：配列番号８７）
５’−ａａｔｔａａｇｃｔｔｃａｇｇｔａｇｇｔｇｇｔｇｔｃｔｇｇｇ−３’（プライマーＣ３：配列番号８８）
５’−ａａｔｔａａｇｃｔｔｃｔｃｇｔａｃｔｔｃｃａｃａｃｔｃｇｇｃ−３’（プライマーＣ４：配列番号８９）
配列表の配列番号８の、アミノ酸番号４２６乃至５４０に示されるアミノ酸配列からなる領域（以下、「ｍ１」という。）をプライマーＮ１とＣ１を用いて、アミノ酸番号４２６乃至５３４に示されるアミノ酸配列からなる領域（以下、「ｍ２」という。）をプライマーＮ１とＣ２を用いて、アミノ酸番号４２６乃至５０４に示されるアミノ酸配列からなる領域（以下、「ｍ３」という。）をプライマーＮ１とＣ３を用いて、アミノ酸番号４２６乃至４７０に示されるアミノ酸配列からなる領域（以下、「ｍ４」という。）をプライマーＮ１とＣ４を用いて、アミノ酸番号４３９乃至５３４に示されるアミノ酸配列からなる領域（以下、「ｍ５」という。）をプライマーＮ２とＣ２を用いて、アミノ酸番号４７１乃至５３４に示されるアミノ酸配列からなる領域（以下、「ｍ６」という。）をプライマーＮ３とＣ２を用いて、アミノ酸番号５０５乃至５３４に示されるアミノ酸配列からなる領域（以下、「ｍ７」という。）をプライマーＮ４とＣ２を用いて、アミノ酸番号４３９乃至５０４に示されるアミノ酸配列からなる領域（以下、「ｍ８」という。）をプライマーＮ２とＣ３を用いて、アミノ酸番号４３９乃至４７０に示されるアミノ酸配列からなる領域（以下、「ｍ９」という。）をプライマーＮ２とＣ４を用いて、それぞれｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０−ＥＰＨＡ２を鋳型にＰＣＲ反応で増幅した。得られたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｐＥＴ−４９ｂ（＋）のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトにサブクローニングした。
９）−２ ＥＰＨＡ２欠損変異体の発現
上記９）−１で構築したプラスミドＤＮＡ及び陰性コントロールとしてｐＥＴ−４９ｂ（＋）を用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。得られた形質転換体を３０μｇ／ｍｌのカナマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＬＢ培地で培養し、Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）によりＥＰＨＡ２欠損変異体の発現誘導を行った。菌体を遠心により回収し、ＰＢＳで洗浄後、菌体を１ｍＭ ＰＭＳＦとプロテアーゼインヒビターカクテル（ＳＩＧＭＡ社製：＃Ｐ８３４０）を含有する２％ＳＤＳ溶液で溶解した。遠心して上清を回収し、エピトープ同定に用いた。
ｐＥＴ−４９ｂ（＋）で形質転換した大腸菌の菌体溶解液中で発現したｐＥＴ−４９ｂ（＋）由来のＧＳＴ−Ｔａｇ、Ｈｉｓ−Ｔａｇ、Ｓ−Ｔａｇとそれらを繋ぐリンカー部分からなる蛋白質（以下及び図中で、「Ｖｅｃ」という。）の発現量は以下の方法で計算した。Ｖｅｃ発現菌体溶解液の希釈液系列と６ｘ Ｈｉｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ社製）の希釈系列をＳＤＳ−ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒに溶解して９８℃で５分間過熱した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ゲル中の蛋白質をＰＶＤＦ膜に転写した。５％ ＢＳＡを含むＴＢＳＴ中でブロッキングした後、５％ ＢＳＡを含むＴＢＳＴでＰｅｎｔａ−Ｈｉｓ ＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を１０００倍希釈した溶液にＰＶＤＦ膜を浸し、室温で１時間反応させた。このＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴで１０分間、３回洗浄した後、ＥＣＬ Ｐｌｕｓを使用しシグナルを検出した。Ｖｅｃ発現菌体溶解液の希釈液系列と６ｘ Ｈｉｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒの希釈系列のシグナル強度を比較することで６ｘ Ｈｉｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒに含まれる１バンド辺りの蛋白量からＶｅｃ発現菌体溶解液に含まれるＶｅｃの蛋白質濃度を見積もった。Ｓ−Ｔａｇ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いたウエスタンブロットで２０ｎｇのＶｅｃと同程度の反応性を示す量のＥＰＨＡ２欠損変異体を以下のエピトープ同定実験に用いた。
９）−３） エピトープの同定
上記９）−２で調製したＥＰＨＡ２欠損変異体を含む溶解液をＳＤＳ−ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒに溶解して９８℃で５分間過熱したサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ゲル中の蛋白質をＰＶＤＦ膜に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜を、ブロッキング液（ブロックエース粉末１袋を１００ｍｌの超純水に溶解後、Ｔｗｅｅｎ ２０、アジ化ナトリウムをそれぞれ終濃度で０．１％（ｖ／ｖ）、０．０２％（ｗ／ｖ）になるよう添加）中で振とうしブロッキングした後、このＰＶＤＦ膜を２μｇ／ｍｌのＳＨ３４８−１又はＳＨ３５７−１を含むブロッキング液中で４℃で一晩反応させた。このＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴで１０分間、３回洗浄し、Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ，ＨＲＰ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｗｈｏｌｅ Ａｂ ＳｈｅｅｐをＴＢＳＴで５０００倍希釈した溶液中でさらに室温で３０分間反応させた。続いてＴＢＳＴで１０分間、３回洗浄した後、ＥＣＬ Ｐｌｕｓを使用し化学発光用フィルム上にシグナルを検出した。
次に、ＰＶＤＦ膜をＳｔｒｉｐ液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８、２％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ、１００ｍＭ ２‐メルカプトエタノール）に浸して５５℃で３０分間振とうした後、ＴＢＳＴで１０分間、３回洗浄した。このＰＶＤＦ膜をブロッキング液中でブロッキングした後、ＴＢＳＴで１０分間、３回洗浄し、Ｓ−Ｔａｇ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＡｎｔｉｂｏｄｙをＴＢＳＴで１００００倍に希釈した溶液に浸し室温で３０分間反応させた。ＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴで１０分間、３回洗浄後、Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ，ＨＲＰ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｗｈｏｌｅ Ａｂ ＳｈｅｅｐをＴＢＳＴで５０００倍に希釈した溶液に浸し室温で３０分間反応させた。次にＴＢＳＴで１０分間、３回洗浄した後、ＥＣＬ Ｐｌｕｓを使用し化学発光用フィルム上にシグナルを検出した。
その結果、ＳＨ３４８−１（図１１Ａ）、ＳＨ３５７−１（図１１Ｃ）は共にｍ１、ｍ２、ｍ５のみに結合性を示した。また、そのときのＰＶＤＦ膜上に存在するＥＰＨＡ２欠損変異体の量はほぼ一定であった（ＳＨ３４８−１：図１１Ｂ、ＳＨ３５７−１：図１１Ｄ）。以上の結果よりＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１はＥＰＨＡ２のアミノ酸配列中で、配列表の配列番号８のアミノ酸番号４３９乃至５３４に示されるアミノ酸配列からなる領域に結合することが示された。
（実施例１０）ヒト化抗体の設計
１０）−１ ＳＨ３４８−１のヒト化抗体の設計
１０）−１−１ ＳＨ３４８−１の可変領域の分子モデリング
ＳＨ３４８−１の可変領域の分子モデリングを相同性モデリング（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３，１２１−１５３，（１９９１））によって行った。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３５，Ｄ３０１−Ｄ３０３（２００７））に登録されるヒト免疫グロブリンの可変領域の１次配列（Ｘ線結晶構造から誘導される三次元構造が入手可能である）を、実施例５で決定されたＳＨ３４８−１の可変領域と比較した。結果として、２ＪＥＬおよび１Ａ４Ｊが、それぞれ、ＳＨ３４８−１の軽鎖および重鎖の可変領域に対して最も高い配列相同性を有する配列として選択された。フレームワーク領域の三次元構造は、ＳＨ３４８−１の軽鎖および重鎖に対応する２ＪＥＬおよび１Ａ４Ｊの座標を組み合わせて、「フレームワークモデル」を得ることによって作製した。ＳＨ３４８−１のＣＤＲは、Ｔｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６３，８００−８１５，（１９９６））の分類に従って、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１及びＣＤＲＨ２は、それぞれクラスター１６Ａ、７Ａ、９Ａ、１０Ａ、１０Ａに割り当てられた。ＣＤＲＨ３は、Ｈ３ルール（ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒ ３９９，１−８（１９９６））を使用して、ｅ（９）Ｄに分類された。次いで、それぞれのＣＤＲについての代表的なコンホメーションがフレームワークモデルに組み込んだ。
最後に、エネルギーの点でＳＨ３４８−１の可変領域の可能性のある分子モデルを得るために、不利な原子間接触を除くためのエネルギー計算を行った。上記手順を、市販の蛋白質立体構造予測プログラムＰｒｉｍｅおよび配座探索プログラムＭａｃｒｏＭｏｄｅｌ（Ｓｃｈｒoｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ）を使用して行った。
１０）−１−２ ヒト化ＳＨ３４８−１に対するアミノ酸配列の設計
ヒト化ＳＨ３４８−１抗体の構築は、ＣＤＲグラフティング（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１００２９−１００３３（１９８９））によって行った。アクセプター抗体は、フレームワーク領域内のアミノ酸相同性に基づいて選択された。ＳＨ３４８−１のフレームワーク領域の配列を、抗体のアミノ酸配列のＫａｂａｔデータベース（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２９，２０５−２０６（２００１））の全てのヒトフレームワークと比較し、ＧＳＤ２Ｂ５Ｂ１０‘ＣＬ抗体がフレームワーク領域についての７２％の最も高い配列相同性に起因して、アクセプターとして選択された。ＧＳＤ２Ｂ５Ｂ１０‘ＣＬについてのフレームワーク領域のアミノ酸残基を、ＳＨ３４８−１についてのアミノ酸残基と整列させ、異なるアミノ酸が使用される位置を同定した。これらの残基の位置は、上で構築されたＳＨ３４８−１の三次元モデルを使用して分析され、そしてアクセプター上にグラフティングされるべきドナー残基が、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１００２９−１００３３（１９８９））によって与えられる基準によって選択された。選択されたいくつかのドナー残基をアクセプター抗体ＧＳＤ２Ｂ５Ｂ１０‘ＣＬに移入することによって、ヒト化ＳＨ３４８−１配列を決定した。その結果、以下に示すように、軽鎖について２タイプ、重鎖について２タイプのヒト化配列を取得した。以下、可変領域、定常領域、ＣＤＲについてはカバトらにより作成された抗体のアミノ酸配列データベースを元に分類された。
１０−１−３）ＳＨ３４８−１軽鎖のヒト化
１０−１−３−１）ｈＳＨ３４８−１−Ｔ１Ｌタイプ軽鎖：
配列表の配列番号３７に示されるＳＨ３４８−１の軽鎖可変領域のアミノ酸番号２（バリン）、３（ロイシン）、１４（セリン）、１５（ロイシン）、１７（アスパラギン酸）、１８（グルタミン）、５０（リジン）、７９（アルギニン）、８８（ロイシン）、１０５（グリシン）、１０９（ロイシン）、１１４（アラニン）をそれぞれイソロイシン、バリン、トレオニン、プロリン、グルタミン酸、プロリン、グルタミン、リジン、バリン、グルタミン、バリン、トレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化ＳＨ３４８−１軽鎖を設計し、「ｈＳＨ３４８−１−Ｔ１Ｌタイプ軽鎖」と命名した。
ｈＳＨ３４８−１−Ｔ１Ｌタイプ軽鎖のヌクレオチド配列を配列表の配列番号９０に示し、アミノ酸配列を配列番号９１に示した。配列番号９０のヌクレオチド番号１乃至６０に示されるヌクレオチド配列が分泌シグナル配列、ヌクレオチド番号６１乃至４０２に示されるヌクレオチド配列が可変領域、ヌクレオチド番号４０３乃至７１７に示されるヌクレオチド配列が定常領域、ヌクレオチド番号１３０乃至１７７に示されるヌクレオチド配列がＣＤＲＬ１、ヌクレオチド番号２２３乃至２４３に示されるヌクレオチド配列がＣＤＲＬ２、ヌクレオチド番号３４０乃至３６３に示されるヌクレオチド配列がＣＤＲＬ３、の各ヌクレオチド配列である。
配列表の配列番号９１のアミノ酸番号１乃至２０に示されるアミノ酸配列が分泌シグナル配列であり、アミノ酸番号２１乃至１３４に示されるアミノ酸配列が可変領域、アミノ酸番号１３５乃至２３９に示されるアミノ酸配列が定常領域、アミノ酸番号４４乃至５９に示されるアミノ酸配列がＣＤＲＬ１、アミノ酸番号７５乃至８１に示されるアミノ酸配列がＣＤＲＬ２、アミノ酸番号１１４乃至１２１に示されるアミノ酸配列がＣＤＲＬ３、の各アミノ酸配列である。
また、ｈＳＨ３４８−１−Ｔ１Ｌタイプ軽鎖のＣＤＲＬ１のヌクレオチド配列を配列表の配列番号９２に、アミノ酸配列を配列番号９３に、ＣＤＲＬ２のヌクレオチド配列を配列表の配列番号９４に、アミノ酸配列を配列番号９５に、ＣＤＲＬ３のヌクレオチド配列を配列表の配列番号９６に、アミノ酸配列を配列番号９７に示した。
１０−１−３−２）ｈＳＨ３４８−Ｔ３Ｌタイプ軽鎖：
配列表の配列番号３７に示されるＳＨ３４８−１の軽鎖可変領域のアミノ酸番号１４（セリン）、１５（ロイシン）、１７（アスパラギン酸）、１８（グルタミン）、５０（リジン）、７９（アルギニン）、８８（ロイシン）、１０５（グリシン）、１０９（ロイシン）、１１４（アラニン）、をそれぞれトレオニン、プロリン、グルタミン酸、プロリン、グルタミン、リジン、バリン、グルタミン、バリン、トレオニンにることを伴い設計されたヒト化ＳＨ３４８−１軽鎖を設計し、「ｈＳＨ３４８−１−Ｔ３Ｌタイプ軽鎖」と命名した。
ｈＳＨ３４８−１−Ｔ３Ｌタイプ軽鎖のヌクレオチド配列を配列表の配列番号９８に示し、アミノ酸配列を配列番号９９に示した。配列番号９８のヌクレオチド番号１乃至６０に示されるヌクレオチド配列が分泌シグナル配列、ヌクレオチド番号６１乃至４０２に示されるヌクレオチド配列が可変領域、ヌクレオチド番号４０３乃至７１７に示されるヌクレオチド配列が定常領域、ヌクレオチド番号１３０乃至１７７に示されるヌクレオチド配列がＣＤＲＬ１、ヌクレオチド番号２２３乃至２４３に示されるヌクレオチド配列がＣＤＲＬ２、ヌクレオチド番号３４０乃至３６３に示されるヌクレオチド配列がＣＤＲＬ３、の各ヌクレオチド配列である。
配列表の配列番号９９のアミノ酸番号１乃至２０に示されるアミノ酸配列が分泌シグナル配列であり、アミノ酸番号２１乃至１３４に示されるアミノ酸配列が可変領域、アミノ酸番号１３５乃至２３９に示されるアミノ酸配列が定常領域、アミノ酸番号４４乃至５９に示されるアミノ酸配列がＣＤＲＬ１、アミノ酸番号７５乃至８１に示されるアミノ酸配列がＣＤＲＬ２、アミノ酸番号１１４乃至１２１に示されるアミノ酸配列がＣＤＲＬ３、の各アミノ酸配列である。
また、ｈＳＨ３４８−１−Ｔ３Ｌタイプ軽鎖のＣＤＲＬ１のヌクレオチド配列を配列表の配列番号１００に、アミノ酸配列を配列番号１０１に、ＣＤＲＬ２のヌクレオチド配列を配列表の配列番号１０２に、アミノ酸配列を配列番号１０３に、ＣＤＲＬ３のヌクレオチド配列を配列表の配列番号１０４に、アミノ酸配列を配列番号１０５に示した。
１０−１−４）ＳＨ３４８−１重鎖のヒト化
１０−１−４−１）ｈＳＨ３４８−１−Ｔ１Ｈタイプ重鎖：
配列表の配列番号４３に示されるＳＨ３４８−１の重鎖可変領域のアミノ酸番号２（イソロイシン）、９（プロリン）、１１（ロイシン）、１６（グルタミン酸）、１７（トレオニン）、２０（イソロイシン）、３８（リジン）、４３（リジン）、４６（リジン）、６８（フェニルアラニン）、６９（アラニン）、７０（フェニルアラニン）、７１（セリン）、７２（ロイシン）、７３（グルタミン酸）、７６（アラニン）、８０（フェニルアラニン）、８２（グルタミン）、８３（イソロイシン）、８４（アスパラギン）、８５（アスパラギン）、８７（リジン）、８８（アスパラギン）、９３（トレオニン）、９５（フェニルアラニン）、１１４（トレオニン）、１１５（ロイシン）、をそれぞれバリン、アラニン、バリン、セリン、セリン、バリン、アルギニン、グルタミン、グルタミン酸、バリン、トレオニン、イソロイシン、トレオニン、アラニン、アスパラギン酸、トレオニン、チロシン、グルタミン酸、ロイシン、セリン、セリン、アルギニン、セリン、バリン、チロシン、ロイシン、バリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化ＳＨ３４８−１重鎖を設計し、「ｈＳＨ３４８−１−Ｔ１Ｈタイプ重鎖」と命名した。
ｈＳＨ３４８−１−Ｔ１Ｈタイプ重鎖のヌクレオチド配列を配列表の配列番号１０６に示し、アミノ酸配列を配列番号１０７に示した。配列番号１０６のヌクレオチド番号１乃至５７に示されるヌクレオチド配列が分泌シグナル配列、ヌクレオチド番号５８乃至４１４に示されるヌクレオチド配列が可変領域、ヌクレオチド番号４１５乃至１４０４に示されるヌクレオチド配列が定常領域、ヌクレオチド番号１４８乃至１６２に示されるヌクレオチド配列がＣＤＲＨ１、ヌクレオチド番号２０５乃至２５５に示されるヌクレオチド配列がＣＤＲＨ２、ヌクレオチド番号３５２乃至３８１に示されるヌクレオチド配列がＣＤＲＬ３、の各ヌクレオチド配列である。
配列表の配列番号１０７のアミノ酸番号１乃至１９に示されるアミノ酸配列が分泌シグナル配列であり、アミノ酸番号２０乃至１３８に示されるアミノ酸配列が可変領域、アミノ酸番号１３９乃至４６８に示されるアミノ酸配列が定常領域、アミノ酸番号５０乃至５４に示されるアミノ酸配列がＣＤＲＨ１、アミノ酸番号６９乃至８５に示されるアミノ酸配列がＣＤＲＨ２、アミノ酸番号１１８乃至１２７に示されるアミノ酸配列がＣＤＲＨ３、の各アミノ酸配列である。
また、ｈＳＨ３４８−１−Ｔ１Ｈタイプ重鎖のＣＤＲＨ１のヌクレオチド配列を配列表の配列番号１０８に、アミノ酸配列を配列番号１０９に、ＣＤＲＨ２のヌクレオチド配列を配列表の配列番号１１０に、アミノ酸配列を配列番号１１１にＣＤＲＨ３のヌクレオチド配列を配列表の配列番号１１２に、アミノ酸配列を配列番号１１３に示した。
１０−１−４−２）ｈＳＨ３４８−１−Ｔ３Ｈタイプ重鎖：
配列表の配列番号４３に示されるＳＨ３４８−１の重鎖可変領域のアミノ酸番号９（プロリン）、１１（ロイシン）、１６（グルタミン酸）、１７（トレオニン）、２０（イソロイシン）、３８（リジン）、４３（リジン）、７３（グルタミン酸）、７６（アラニン）、８０（フェニルアラニン）、８２（グルタミン）、８３（イソロイシン）、８４（アスパラギン）、８５（アスパラギン）、８７（リジン）、８８（アスパラギン）、９３（トレオニン）、９５（フェニルアラニン）、１１４（トレオニン）、１１５（ロイシン）をそれぞれアラニン、バリン、セリン、セリン、バリン、アルギニン、グルタミン、アスパラギン酸、トレオニン、チロシン、グルタミン酸、ロイシン、セリン、セリン、アルギニン、セリン、バリン、チロシン、ロイシン、バリン、に置き換えることを伴い設計されたヒト化ＳＨ３４８−１重鎖を設計し、「ｈＳＨ３４８−１−Ｔ３Ｈタイプ重鎖」と命名した。
ｈＳＨ３４８−１−Ｔ３Ｈタイプ重鎖のヌクレオチド配列を配列表の配列番号１１４に示し、アミノ酸配列を配列番号１１５に示した。配列番号１１４のヌクレオチド番号１乃至５７に示されるヌクレオチド配列が分泌シグナル配列、ヌクレオチド番号５８乃至４１４に示されるヌクレオチド配列が可変領域、ヌクレオチド番号４１５乃至１４０４に示されるヌクレオチド配列が定常領域、ヌクレオチド番号１４８乃至１６２に示されるヌクレオチド配列がＣＤＲＨ１、ヌクレオチド番号２０５乃至２５５に示されるヌクレオチド配列がＣＤＲＨ２、ヌクレオチド番号３５２乃至３８１に示されるヌクレオチド配列がＣＤＲＬ３、の各ヌクレオチド配列である。
配列表の配列番号１１５のアミノ酸番号１乃至１９に示されるアミノ酸配列が分泌シグナル配列であり、アミノ酸番号２０乃至１３８に示されるアミノ酸配列が可変領域、アミノ酸番号１３９乃至４６８に示されるアミノ酸配列が定常領域、アミノ酸番号５０乃至５４に示されるアミノ酸配列がＣＤＲＨ１、アミノ酸番号６９乃至８５に示されるアミノ酸配列がＣＤＲＨ２、アミノ酸番号１１８乃至１２７に示されるアミノ酸配列がＣＤＲＨ３、の各アミノ酸配列である。
また、ｈＳＨ３４８−１−Ｔ３Ｈタイプ重鎖のＣＤＲＨ１のヌクレオチド配列を配列表の配列番号１１６に、アミノ酸配列を配列番号１１７に、ＣＤＲＨ２のヌクレオチド配列を配列表の配列番号１１８に、アミノ酸配列を配列番号１１９に、ＣＤＲＨ３のヌクレオチド配列を配列表の配列番号１２０に、アミノ酸配列を配列番号１２１に示した。
１０）−２ ＳＨ３５７−１のヒト化抗体の設計
１０）−２−１ ＳＨ３５７−１の可変領域の分子モデリング
上記１０）−１−１と同様の方法で、２ＪＥＬおよび１Ａ４Ｊが、それぞれ、ＳＨ３５７−１の軽鎖および重鎖の可変領域に対して最も高い配列相同性を有する配列として選択され、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１及びＣＤＲＨ２は、それぞれクラスター１６Ａ、７Ａ、９Ａ、１０Ａ、１０Ａに割り当てられた。ＣＤＲＨ３は、ｅ（９）Ｄに分類された。
１０）−２−２ ヒト化ＳＨ３５７−１に対するアミノ酸配列の設計
１０）−１−２と同様の方法によって、ＧＳＤ２Ｂ５Ｂ１０‘ＣＬ抗体がアクセプターとして選択され、ヒト化ＳＨ３５７−１の配列を決定した。その結果、以下に示すように、軽鎖について２タイプ、重鎖について２タイプのヒト化配列を取得した。
１０−２−３）ＳＨ３５７−１軽鎖のヒト化
１０−２−３−１）ｈＳＨ３５７−１−Ｔ１Ｌタイプ軽鎖：
配列表の配列番号４１に示されるＳＨ３５７−１の軽鎖のアミノ酸番号２（バリン）、３（ロイシン）、７（トレオニン）、１４（セリン）、１５（ロイシン）、１７（アスパラギン酸）、１８（グルタミン）、５０（リジン）、８８（ロイシン）、１０５（グリシン）、１０９（ロイシン）、１１４（アラニン）をそれぞれイソロイシン、バリン、セリン、トレオニン、プロリン、グルタミン酸、プロリン、グルタミン、バリン、グルタミン、バリン、トレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化ＳＨ３５７−１軽鎖を、「ｈＳＨ３５７−１−Ｔ１Ｌタイプ軽鎖」と命名した。
ｈＳＨ３５７−１−Ｔ１Ｌタイプ軽鎖のヌクレオチド配列を配列表の配列番号１２２に示し、アミノ酸配列を配列番号１２３に示した。配列番号１２２のヌクレオチド番号１乃至６０に示されるヌクレオチド配列が分泌シグナル配列、ヌクレオチド番号６１乃至４０２に示されるヌクレオチド配列が可変領域、ヌクレオチド番号４０３乃至７１７に示されるヌクレオチド配列が定常領域、ヌクレオチド番号１３０乃至１７７に示されるヌクレオチド配列がＣＤＲＬ１、ヌクレオチド番号２２３乃至２４３に示されるヌクレオチド配列がＣＤＲＬ２、ヌクレオチド番号３４０乃至３６３に示されるヌクレオチド配列がＣＤＲＬ３、の各ヌクレオチド配列である。
配列表の配列番号１２３のアミノ酸番号１乃至２０に示されるアミノ酸配列が分泌シグナル配列であり、アミノ酸番号２１乃至１３４に示されるアミノ酸配列が可変領域、アミノ酸番号１３５乃至２３９に示されるアミノ酸配列が定常領域、アミノ酸番号４４乃至５９に示されるアミノ酸配列がＣＤＲＬ１、アミノ酸番号７５乃至８１に示されるアミノ酸配列がＣＤＲＬ２、アミノ酸番号１１４乃至１２１に示されるアミノ酸配列がＣＤＲＬ３である。
また、ｈＳＨ３５７−１−Ｔ１Ｌタイプ軽鎖のＣＤＲＬ１のヌクレオチド配列を配列表の配列番号１２４に、アミノ酸配列を配列番号１２５に、ＣＤＲＬ２のヌクレオチド配列を配列表の配列番号１２６に、アミノ酸配列を配列番号１２７に、ＣＤＲＬ３のヌクレオチド配列を配列表の配列番号１２８に、アミノ酸配列を配列番号１２９に示した。
１０−２−３−２）ｈＳＨ３５７−１−Ｔ３Ｌタイプ軽鎖：
配列番号４１に示されるＳＨ３５７−１軽鎖のアミノ酸番号７（トレオニン）、１４（セリン）、１５（ロイシン）、１７（アスパラギン酸）、１８（グルタミン）、５０（リジン）、８８（ロイシン）、１０５（グリシン）、１０９（ロイシン）、１１４（アラニン）をそれぞれセリン、トレオニン、プロリン、グルタミン酸、プロリン、グルタミン、バリン、グルタミン、バリン、トレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化ＳＨ３５７−１軽鎖を、「ｈＳＨ３５７−１−Ｔ３Ｌタイプ軽鎖」と命名した。
ｈＳＨ３５７−１−Ｔ３Ｌタイプ軽鎖のヌクレオチド配列を配列表の配列番号１３０に示し、アミノ酸配列を配列番号１３１に示した。配列番号１３０のヌクレオチド番号１乃至６０に示されるヌクレオチド配列が分泌シグナル配列、ヌクレオチド番号６１乃至４０２に示されるヌクレオチド配列が可変領域、ヌクレオチド番号４０３乃至７１７に示されるヌクレオチド配列が定常領域、ヌクレオチド番号１３０乃至１７７に示されるヌクレオチド配列がＣＤＲＬ１、ヌクレオチド番号２２３乃至２４３に示されるヌクレオチド配列がＣＤＲＬ２、ヌクレオチド番号３４０乃至３６３に示されるヌクレオチド配列がＣＤＲＬ３、の各ヌクレオチド配列である。
配列表の配列番号１３１のアミノ酸番号１乃至２０に示されるアミノ酸配列が分泌シグナル配列であり、アミノ酸番号２１乃至１３４に示されるアミノ酸配列が可変領域、アミノ酸番号１３５乃至２３９に示されるアミノ酸配列が定常領域、アミノ酸番号４４乃至５９に示されるアミノ酸配列がＣＤＲＬ１、アミノ酸番号７５乃至８１に示されるアミノ酸配列がＣＤＲＬ２、アミノ酸番号１１４乃至１２１に示されるアミノ酸配列がＣＤＲＬ３、の各アミノ酸配列である。
また、ｈＳＨ３５７−１−Ｔ３Ｌタイプ軽鎖のＣＤＲＬ１のヌクレオチド配列を配列表の配列番号１３２に、アミノ酸配列を配列番号１３３に、ＣＤＲＬ２のヌクレオチド配列を配列表の配列番号１３４に、アミノ酸配列を配列番号１３５に、ＣＤＲＬ３のヌクレオチド配列を配列表の配列番号１３６に、アミノ酸配列を配列番号１３７に示した。
１０−２−４）ＳＨ３５７−１重鎖のヒト化
１０−２−４−１）ｈＳＨ３５７−１−Ｔ１Ｈタイプ重鎖：
配列表の配列番号５１に示されるＳＨ３５７−１の重鎖可変領域のアミノ酸番号２（イソロイシン）、９（プロリン）、１１（ロイシン）、１６（グルタミン酸）、１７（トレオニン）、２０（イソロイシン）、３８（リジン）、４３（リジン）、４６（リジン）、６８（フェニルアラニン）、６９（アラニン）、７０（フェニルアラニン）、７１（セリン）、７２（ロイシン）、７３（グルタミン酸）、７６（アラニン）、８２（グルタミン）、８３（イソロイシン）、８５（アスパラギン）、８７（リジン）、８８（アスパラギン）、９３（セリン）、９５（フェニルアラニン）、１１４（トレオニン）、１１５（ロイシン）をそれぞれバリン、アラニン、バリン、アラニン、セリン、バリン、アルギニン、グルタミン、グルタミン酸、バリン、トレオニン、イソロイシン、トレオニン、アラニン、アスパラギン酸、トレオニン、グルタミン酸、ロイシン、セリン、アルギニン、セリン、バリン、チロシン、ロイシン、バリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化ＳＨ３５７−１重鎖を設計し、「ｈＳＨ３５７−１−Ｔ１Ｈタイプ重鎖」と命名した。
ｈＳＨ３５７−１−Ｔ１Ｈタイプ重鎖のヌクレオチド配列を配列表の配列番号１３８に示し、アミノ酸配列を配列番号１３９に示した。配列番号１３８のヌクレオチド番号１乃至５７に示されるヌクレオチド配列が分泌シグナル配列、ヌクレオチド番号５８乃至４１４に示されるヌクレオチド配列が可変領域、ヌクレオチド番号４１５乃至１４０４に示されるヌクレオチド配列が定常領域、ヌクレオチド番号１４５乃至１６２に示されるヌクレオチド配列がＣＤＲＨ１、ヌクレオチド番号２０５乃至２５５に示されるヌクレオチド配列がＣＤＲＨ２、ヌクレオチド番号３５２乃至３８１に示されるヌクレオチド配列がＣＤＲＬ３、の各ヌクレオチド配列である。
配列表の配列番号１３９のアミノ酸番号１乃至１９に示されるアミノ酸配列が分泌シグナル配列であり、アミノ酸番号２０乃至１３８に示されるアミノ酸配列が可変領域、アミノ酸番号１３９乃至４６８に示されるアミノ酸配列が定常領域、アミノ酸番号４９乃至５４に示されるアミノ酸配列がＣＤＲＨ１、アミノ酸番号６９乃至８５に示されるアミノ酸配列がＣＤＲＨ２、アミノ酸番号１１８乃至１２７に示されるアミノ酸配列がＣＤＲＨ３、の各アミノ酸配列である。
また、ｈＳＨ３５７−１−Ｔ１Ｈタイプ重鎖のＣＤＲＨ１のヌクレオチド配列を配列表の配列番号１４０に、アミノ酸配列を配列番号１４１に、ＣＤＲＨ２のヌクレオチド配列を配列表の配列番号１４２に、アミノ酸配列を配列番号１４３に、ＣＤＲＨ３のヌクレオチド配列を配列表の配列番号１４４に、アミノ酸配列を配列番号１４５に示した。
１０−２−４−２）ｈＳＨ３５７−１−Ｔ３Ｈタイプ重鎖：
配列番号５１に示されるＳＨ３５７−１の重鎖可変領域のアミノ酸番号９（プロリン）、１１（ロイシン）、１６（グルタミン酸）、１７（トレオニン）、２０（イソロイシン）、３８（リジン）、４３（リジン）、７３（グルタミン酸）、７６（アラニン）、８２（グルタミン）、８３（イソロイシン）、８５（アスパラギン）、８７（リジン）、８８（アスパラギン）、９３（セリン）、９５（フェニルアラニン）、１１４（トレオニン）、１１５（ロイシン）をそれぞれアラニン、バリン、アラニン、セリン、バリン、アルギニン、グルタミン、アスパラギン酸、トレオニン、グルタミン酸、ロイシン、セリン、アルギニン、セリン、バリン、チロシン、ロイシン、バリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化ＳＨ３５７−１重鎖を設計し、「ｈＳＨ３５７−１−Ｔ３Ｈタイプ重鎖」と命名した。
ｈＳＨ３５７−１−Ｔ３Ｈタイプ重鎖のヌクレオチド配列を配列表の配列番号１４６に示し、アミノ酸配列を配列番号１４７に示した。配列番号１４６のヌクレオチド番号１乃至５７に示されるヌクレオチド配列が分泌シグナル配列、ヌクレオチド番号５８乃至４１４に示されるヌクレオチド配列が可変領域、ヌクレオチド番号４１５乃至１４０４に示されるヌクレオチド配列が定常領域、ヌクレオチド番号１４５乃至１６２に示されるヌクレオチド配列がＣＤＲＨ１、ヌクレオチド番号２０５乃至２５５に示されるヌクレオチド配列がＣＤＲＨ２、ヌクレオチド番号３５２乃至３８１に示されるヌクレオチド配列がＣＤＲＬ３、の各ヌクレオチド配列である。
配列表の配列番号１４７のアミノ酸番号１乃至１９に示されるアミノ酸配列が分泌シグナル配列であり、アミノ酸番号２０乃至１３８に示されるアミノ酸配列が可変領域、アミノ酸番号１３９乃至４６８に示されるアミノ酸配列が定常領域、アミノ酸番号４９乃至５４に示されるアミノ酸配列がＣＤＲＨ１、アミノ酸番号６９乃至８５に示されるアミノ酸配列がＣＤＲＨ２、アミノ酸番号１１８乃至１２７に示されるアミノ酸配列がＣＤＲＨ３、の各アミノ酸配列である。
また、ｈＳＨ３５７−１−Ｔ３Ｈタイプ重鎖のＣＤＲＨ１のヌクレオチド配列を配列表の配列番号１４８に、アミノ酸配列を配列番号１４９に、ＣＤＲＨ２のヌクレオチド配列を配列表の配列番号１５０に、アミノ酸配列を配列番号１５１に、ＣＤＲＨ３のヌクレオチド配列を配列表の配列番号１５２に、アミノ酸配列を配列番号１５３に示した。
（実施例１１）ヒト化抗ＥＰＨＡ２抗体の作製
ヒト化ＳＨ３４８−１及びヒト化ＳＨ３５７−１の活性を測定するために、実施例１０で取得されたヒト化抗ＥＰＨＡ２抗体の重鎖又は軽鎖を有するプラスミドを以下のように構築した。
１１）−１ ヒト化抗ＥＰＨＡ２抗体発現ベクターの構築
１１）−１−１ ヒト化抗体軽鎖発現汎用ベクター（ｐＥＦ６／ＫＣＬ）の作製
配列表の配列番号１５４に記されるヒト抗体軽鎖シグナル配列およびヒトＩｇ軽鎖（κ鎖）定常領域をコードする遺伝子を合成し（インビトロジェン社 人工遺伝子合成サービス）、制限酵素ＮｈｅＩおよびＰｍｅＩで切り出されるＤＮＡ断片を、ベクターｐＥＦ６／Ｖ５−ＨｉｓＢ（インビトロジェン社）のＮｈｅＩ／ＰｍｅＩサイトに導入し、ヒト化抗体軽鎖発現汎用ベクター（ｐＥＦ６／ＫＣＬ）を構築した。

１１）−１−２ ヒト化抗体重鎖発現汎用ベクター（ｐＥＦ１／ＦＣＣＵ−１）の作製
配列表の配列番号１５５に記されるヒト抗体重鎖シグナル配列およびヒトＩｇＧ１定常領域をコードする遺伝子を合成し（インビトロジェン社 人工遺伝子合成サービス）、制限酵素ＮｈｅＩおよびＰｍｅＩで切り出されるＤＮＡ断片を、ベクターｐＥＦ１／ｍｙｃ−ＨｉｓＢ（インビトロジェン社）のＮｈｅＩ／ＰｍｅＩサイトに導入し、ヒト化抗体Ｈ鎖発現汎用ベクター（ｐＥＦ１／ＦＣＣＵ−１）を構築した。
１１）−１−３ ｈＳＨ３４８−１−Ｔ１Ｌ、ｈＳＨ３４８−１−Ｔ３Ｌタイプ軽鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号１５６、１５７にそれぞれ示される、分泌シグナルと融合したｈＳＨ３４８−１−Ｔ１Ｌ又はｈＳＨ３４８−１−Ｔ３Ｌタイプ軽鎖可変領域をコードする遺伝子を含むＤＮＡを合成し（インビトロジェン社 人工遺伝子合成サービス）、制限酵素ＮｄｅＩおよびＢｓｉＷＩで切り出されたＤＮＡ断片を、ヒト化抗体軽鎖発現汎用ベクター（ｐＥＦ６／ＫＣＬ）を制限酵素ＮｄｅＩおよびＢｓｉＷＩで切断した箇所に挿入することにより、ｈＳＨ３４８−１−Ｔ１Ｌ、ｈＳＨ３４８−１−Ｔ３Ｌタイプ軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターをそれぞれ「ｐＥＦ６／ＫＣＬ／ｈＳＨ３４８−１−Ｔ１Ｌ」、「ｐＥＦ６／ＫＣＬ／ｈＳＨ３４８−１−Ｔ３Ｌ」と命名した。
１１）−１−４ ｈＳＨ３４８−１−Ｔ１Ｈ、ｈＳＨ３４８−１−Ｔ３Ｈ タイプ重鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号１５８、１５９にそれぞれ示される、ｈＳＨ３４８−１−Ｔ１Ｈ又はｈＳＨ３４８−１−Ｔ３Ｈタイプ重鎖可変領域をコードするする遺伝子を含むＤＮＡを合成し（インビトロジェン社 人工遺伝子合成サービス）、制限酵素ＢｌｐＩで切り出されるＤＮＡ断片を、ヒト化抗体Ｈ鎖発現汎用ベクター（ｐＥＦ１／ＦＣＣＵ−１）を制限酵素ＢｌｐＩで切断した箇所に挿入することにより、ｈＳＨ３４８−１−Ｔ１Ｈ、ｈＳＨ３４８−１−Ｔ３Ｈタイプ重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターをそれぞれ「ｐＥＦ１／ＦＣＣＵ／ｈＳＨ３４８−１−Ｔ１Ｈ」、「ｐＥＦ１／ＦＣＣＵ／ｈＳＨ３４８−１−Ｔ３Ｈ」と命名した。
１１）−１−５ ｈＳＨ３５７−１−Ｔ１Ｌ、ｈＳＨ３５７−１−Ｔ３Ｌタイプ軽鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号１６０、１６１にそれぞれ示される分泌シグナルと融合したｈＳＨ３５７−１−Ｔ１ＬまたはｈＳＨ３５７−１−Ｔ３Ｌタイプ軽鎖可変領域をコードする遺伝子を含むＤＮＡを合成し（インビトロジェン社 人工遺伝子合成サービス）、制限酵素ＮｄｅＩおよびＢｓｉＷＩで切り出されたＤＮＡ断片を、ヒト化抗体Ｌ鎖発現汎用ベクター（ｐＥＦ６／ＫＣＬ）を制限酵素ＮｄｅＩおよびＢｓｉＷＩで切断した箇所に挿入することにより、ｈＳＨ３５７−１−Ｔ１Ｌ、ｈＳＨ３５７−１−Ｔ３Ｌタイプ軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターをそれぞれ「ｐＥＦ６／ＫＣＬ／ｈＳＨ３５７−１−Ｔ１Ｌ」、「ｐＥＦ６／ＫＣＬ／ｈＳＨ３５７−１−Ｔ３Ｌ」と命名した。
１１）−１−６ ｈＳＨ３５７−１−Ｔ１Ｈ、ｈＳＨ３５７−１−Ｔ３ Ｈタイプ重鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号１６２、１６３にそれぞれ示される、ｈＳＨ３５７−１−Ｔ１ＨまたはｈＳＨ３５７−１−Ｔ３Ｈタイプ重鎖可変領域をコードするする遺伝子を含むＤＮＡを合成し（インビトロジェン社 人工遺伝子合成サービス）、制限酵素ＢｌｐＩで切り出されたＤＮＡ断片を、ヒト化抗体Ｈ鎖発現汎用ベクター（ｐＥＦ１／ＦＣＣＵ−１）を制限酵素ＢｌｐＩで切断した箇所に挿入することにより、ｈＳＨ３５７−１−Ｔ１Ｈ、ｈＳＨ３５７−１−Ｔ３Ｈタイプ重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターをそれぞれ「ｐＥＦ１／ＦＣＣＵ／ｈＳＨ３５７−１−Ｔ１Ｈ」、「ｐＥＦ１／ＦＣＣＵ／ｈＳＨ３５７−１−Ｔ３Ｈ」と命名した。
１１）−２ ヒト化抗体の生産
対数増殖期の２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ細胞 １．２×１０９ を新鮮な１．２ＬのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に播種し、３７℃、８％ＣＯ２インキュベータで振とう培養した（１２５ｒｐｍ）。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ ＃２４７６５）１２ｍｇをＯｐｔｉ−ＰｒｏＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）４０ｍＬに溶解し、室温で５分間放置した。ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＨｉＰｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて調製したＨ鎖発現プラスミド（０．６ｍｇ）およびＬ鎖発現プラスミド（１．８ｍｇ）を４０ｍＬのＯｐｔｉ−ＰｒｏＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に懸濁した。室温で５分間放置したＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ／ＯｐｔｉＰｒｏＳＦＭ混合液４０ｍＬに、発現プラスミド／ＯｐｔｉＰｒｏＳＦＭ混合液４０ｍＬを加え、さらに室温５分間放置した。次にＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ／発現プラスミド／ＯｐｔｉＰｒｏＳＦＭ混合液８０ｍＬを２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ細胞懸濁液に添加し、振とう培養を続けた。３７℃、８％ＣＯ２中で７日間培養したのち、培養上清を回収した。
１１）−３ ヒト化抗体の精製
上記１１）−２で得られた培養上清をＤｉｓｐｏｓａｂｌｅ Ｃａｐｓｕ２ｌｅ Ｆｉｌｔｅｒ （Ａｄｖａｂｔｅｃ ＃ＣＣＳ−０４５−Ｅ１Ｈ）でろ過したのち、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティカラムクロマトグラフィーで精製した。ＰＢＳで平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅＨｉＴｒａｐ １ｍＬ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅ社製）に培養上清をアプライし、ＰＢＳで洗浄した。次に２Ｍアルギニン溶液（ｐＨ４．０）をアプライし、抗体の含まれる画分を集めた。ｐＨを７に調整し、あらかじめＰＢＳで平衡化したＨｉＰｒｅｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ カラム（２６／１０， ５０ｍＬ）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）に供与し、ＰＢＳに置換したのち、０．２μｍのフィルターを通して精製サンプルとした。
抗体の濃度はＰＯＲＯＳ Ｇ ２０μｍ Ｃｏｌｕｍｎ，ＰＥＥＫ，４．６ｍｍ×１００ｍｍ，１．７ｍｌ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）に結合させた抗体を溶出し、溶出液の吸光度（Ｏ．Ｄ．２８０ｎｍ）を測定し、標準品（ヒトＩｇＧ１）のピーク面積と比較することにより求めた。
ｐＥＦ６／ＫＣＬ／ｈＳＨ３４８−１−Ｔ１ＬとｐＥＦ１／ＦＣＣＵ／ｈＳＨ３４８−１−Ｔ１Ｈとの組合せによって取得されたＳＨ３４８−１のヒト化抗体をｈＳＨ３４８−１−Ｔ１、ｐＥＦ６／ＫＣＬ／ｈＳＨ３４８−１−Ｔ３ＬとｐＥＦ１／ＦＣＣＵ／ｈＳＨ３４８−１−Ｔ３Ｈとの組合せによって取得されたＳＨ３４８−１のヒト化抗体を「ｈＳＨ３４８−１−Ｔ３」と命名した。
また、ｐＥＦ６／ＫＣＬ／ｈＳＨ３５７−１−Ｔ１ＬとｐＥＦ１／ＦＣＣＵ／ｈＳＨ３５７−１−Ｔ１Ｈとの組合せによって取得されたＳＨ３５７−１のヒト化抗体をｈＳＨ３５７−１−Ｔ１、ｐＥＦ６／ＫＣＬ／ｈＳＨ３５７−１−Ｔ３ＬとｐＥＦ１／ＦＣＣＵ／ｈＳＨ３５７−１−Ｔ３Ｈとの組合せによって取得されたＳＨ３５７−１のヒト化抗体を「ｈＳＨ３５７−１−Ｔ３」と命名した。
（実施例１２）ヒト化抗ＥＰＨＡ２抗体の抗原結合性の確認
ｈＳＨ３４８−１−Ｔ１、ｈＳＨ３４８−１−Ｔ３、ｈＳＨ３５７−１−Ｔ１及びｈＳＨ３５７−１−Ｔ３の抗原結合能を２次抗体としてＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製 ＃１０９−０３５−０９８）を用いる点を除き、実施例６に記載の方法に準じて行った。
図１２Ａ−Ｄ）のグラフ中の吸光度は平均値±標準偏差（ｎ＝３）で示している。その結果、ヒト化抗ＥＰＨＡ２抗体であるｈＳＨ３４８−１−Ｔ１、ｈＳＨ３４８−１−Ｔ３、ｈＳＨ３５７−１−Ｔ１、ｈＳＨ３５７−１−Ｔ３はいずれもＥＰＨＡ２細胞外領域に結合性を有することが確認された。
（実施例１３）ＳＨ３４８−１またはＳＨ３５７−１のＥＰＨＡ２結合に対する競合阻害活性の測定
ＳＨ３４８−１のＥＰＨＡ２への結合に対するｈＳＨ３４８−１−Ｔ１、ｈＳＨ３４８−１−Ｔ３の競合阻害活性およびＳＨ３５７−１のＥＰＨＡ２への結合に対するｈＳＨ３５７−１−Ｔ１、ｈＳＨ３５７−１−Ｔ３の競合阻害活性を以下の方法で測定した。
ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製 ＃２１４３５）を使用し添付のプロトコールに従い、マウスモノクローナル抗体ＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１をそれぞれビオチン化した（以下、ビオチン化ＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１をそれぞれ、「ｂＳＨ３４８−１」、「ｂＳＨ３５７−１」と表記する。）。ｂＳＨ３４８−１、ｂＳＨ３５７−１及び競合阻害実験に使用する非標識抗体（ＳＨ３４８−１、ＳＨ３５７−１、ｈＳＨ３４８−１−Ｔ１、ｈＳＨ３４８−１−Ｔ３、ｈＳＨ３５７−１−Ｔ１、ｈＳＨ３５７−１−Ｔ３及びＡｂ９６−１）の濃度はＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）により測定した。
ＥＰＨＡ２の細胞外領域ポリペプチド（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製：＃３０３５−Ａ２−１００）をＰＢＳで０．５μｇ／ｍｌに希釈してイムノプレート（Ｎｕｎｃ社製 ＃４４２４０４）に１００μｌ／ウェルで分注し、４℃で一晩静置することでプレートに蛋白質を吸着させた。翌日、ウェルを希釈緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０）で１回洗浄した後、、ブロックエース溶液（ブロックエース粉末１袋を１００ｍｌの超純水で溶解）をＰＢＳで４倍希釈した溶液を２００μｌ／ウェルで分注し、室温で４時間静置した。ウェル中の液を除去後、５μｇ／ｍｌのビオチン化抗体と各種濃度（０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１２５μｇ／ｍｌ）の非標識抗体の混合溶液（溶媒はＰＢＳ。最終濃度で０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０含有）をそれぞれ１００μｌ／ウェルで分注し、１時間室温で静置した。希釈緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０）で２回ウェルを洗浄した後、希釈緩衝液で５００倍に希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製 ＃ＲＰＮ１２３１Ｖ）を１００μｌ／ウェルで添加し、室温で１時間静置した。ウェル中の液を除去し、希釈緩衝液で２回ウェルを洗浄した後、ＯＰＤ発色液を１００μｌ／ウェルで添加し攪拌しながら発色反応を行った。発色後、１Ｍ ＨＣｌを１００μｌ／ウェルで添加して発色反応を止め、プレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定した。
その結果、ｂＳＨ３４８−１、またはｂＳＨ３５７−１のみを添加したウェルの吸光度はそれぞれ０．７８０±０．０１６、０．９７８±０．００７（平均値±標準偏差（ｎ＝３））であった。
図１３Ａ）、Ｂ）のグラフ中の吸光度はそれぞれ平均値±標準偏差（ｎ＝３）で示している。エピトープの異なるＡｂ９６−１は、ＳＨ３４８−１またはＳＨ３５７−１のＥＰＨＡ２に対する結合を阻害しなかった。一方、ＳＨ３４８−１のＥＰＨＡ２に対する結合は、ＳＨ３４８−１自身またはそのヒト化抗体であるｈＳＨ３４８−１−Ｔ１、ｈＳＨ３４８−１−Ｔ３により阻害されることが示された（図１３Ａ）。同様にＳＨ３５７−１のＥＰＨＡ２に対する結合はＳＨ３５７−１自身またはそのヒト化抗体であるｈＳＨ３５７−１−Ｔ１、ｈＳＨ３５７−１−Ｔ３により阻害されることが示された（図１３Ｂ）。
（実施例１４）Ｅｐｈｒｉｎ−Ａ１依存的ＥＰＨＡ２チロシン残基リン酸化のヒト化抗ＥＰＨＡ２抗体による抑制作用
実施例８に記載の方法に準じてヒト化抗ＥＰＨＡ２抗体のＥｐｈｒｉｎ−Ａ１依存的ＥＰＨＡ２チロシン残基リン酸化能を調べた。その結果、ｈＳＨ３４８−１−Ｔ１、ｈＳＨ３４８−１−Ｔ３、ｈＳＨ３５７−１−Ｔ１、ｈＳＨ３５７−１−Ｔ３のいずれもＥｐｈｒｉｎ−Ａ１／Ｆｃにより誘導されるＥＰＨＡ２チロシン残基リン酸化を抑制する活性を維持していることが示された（図１４）。
本発明の抗ＥＰＨＡ２抗体は抗腫瘍活性を有し、該抗ＥＰＨＡ２抗体を含む医薬組成物は抗癌剤となり得る。

Claims (42)

  1. ハイブリドーマＳＨ３４８−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３６）が産生する抗体によって認識されるエピトープを認識する、ＥＰＨＡ２に特異的に結合する抗体。
  2. 以下のａ）乃至ｄ）に示される性質を有する、請求項１に記載の抗体：
    ａ）ＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化能を有さない；
    ｂ）ＥＰＨＡ２発現細胞に対してＡＤＣＣ活性を有する；
    ｃ）ＥＰＨＡ２発現細胞に対してＣＤＣ活性を有する；
    ｄ）Ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する。
  3. 以下のａ）乃至ｅ）に示される性質を有する、請求項１に記載の抗体：
    ａ）ＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化能を有さない；
    ｂ）ＥＰＨＡ２蛋白質量の減少作用を示す；
    ｃ）ＥＰＨＡ２発現細胞に対してＡＤＣＣ活性を有する；
    ｄ）ＥＰＨＡ２発現細胞に対してＣＤＣ活性を有する；
    ｅ）Ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する。
  4. 配列表の配列番号８のアミノ酸番号４２６乃至５３４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合し、以下のａ）乃至ｄ）に示される性質を有する抗体：
    ａ）ＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化能を有さない；
    ｂ）ＥＰＨＡ２発現細胞に対してＡＤＣＣ活性を有する；
    ｃ）ＥＰＨＡ２発現細胞に対してＣＤＣ活性を有する；
    ｄ）Ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する。
  5. 配列表の配列番号８のアミノ酸番号４２６乃至５３４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合し、以下のａ）乃至ｅ）に示される性質を有する抗体：
    ａ）ＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化能を有さない；
    ｂ）ＥＰＨＡ２蛋白質量の減少作用を示す；
    ｃ）ＥＰＨＡ２発現細胞に対してＡＤＣＣ活性を有する；
    ｄ）ＥＰＨＡ２発現細胞に対してＣＤＣ活性を有する；
    ｅ）Ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する。
  6. 配列表の配列番号８のアミノ酸番号４３９乃至５３４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する、請求項１乃至５から選択されるいずれか一つに記載の抗体。
  7. ＥＰＨＡ２リガンドにより誘導されるＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化を抑制する、請求項１乃至６から選択されるいずれか一つに記載の抗体。
  8. ＥＰＨＡ２リガンドのＥＰＨＡ２に対する結合を阻害するのではなく、リガンドにより誘導されるＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化を抑制する、請求項１乃至６から選択されるいずれか一つに記載の抗体。
  9. 重鎖可変領域の相補性決定領域として、配列表の配列番号５９、６１及び６３に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域の相補性決定領域として、配列表の配列番号６５、６７及び６９に示されるアミノ酸配列を有する、配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体。
  10. 以下の１）及び２）の特徴を有する、配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体：
    １）一般式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ペプチドを有する；
    −ＦＲＨ1−ＣＤＲＨ1−ＦＲＨ2−ＣＤＲＨ2−ＦＲＨ3−ＣＤＲＨ3−ＦＲＨ4−（Ｉ）
    （式中、ＦＲＨ1は１８乃至３０個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＨ1は配列表の配列番号５９で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ2は１４個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、ＣＤＲＨ2は配列表の配列番号６１で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ3は３２個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、ＣＤＲＨ3は配列表の配列番号６３で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ4は１１個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配
    列を示し、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。）；
    ２）一般式（ＩＩ）で示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖ポリペプチドを有する；
    −ＦＲＬ1−ＣＤＲＬ1−ＦＲＬ2−ＣＤＲＬ2−ＦＲＬ3−ＣＤＲＬ3−ＦＲＬ4−（ＩＩ）
    （式中、ＦＲＬ1は２３個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＬ1は配列表の配列番号６５で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ2は１５個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、ＣＤＲＬ2は配列表の配列番号６７で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ3は３２個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、ＣＤＲＬ3は配列表の配列番号６９で示されるアミノ酸配列示し、ＦＲＬ4は１０個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。）。
  11. ハイブリドーマＳＨ３５７−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３７）が産生する抗体によって認識されるエピトープを認識する、ＥＰＨＡ２に特異的に結合する抗体。
  12. 以下のａ）乃至ｄ）に示される性質を有する、請求項１１に記載の抗体：
    ａ）ＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化能を有さない；
    ｂ）ＥＰＨＡ２発現細胞に対してＡＤＣＣ活性を有する；
    ｃ）ＥＰＨＡ２発現細胞に対してＣＤＣ活性を有する；
    ｄ）Ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する。
  13. 配列表の配列番号８のアミノ酸番号４２６乃至５３４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合し、以下のａ）乃至ｅ）に示される性質を有する抗体：
    ａ）ＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化能を有さない；
    ｂ）ＥＰＨＡ２蛋白質量の減少作用を示さない；
    ｃ）ＥＰＨＡ２発現細胞に対してＡＤＣＣ活性を有する；
    ｄ）ＥＰＨＡ２発現細胞に対してＣＤＣ活性を有する；
    ｅ）Ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する。
  14. 配列表の配列番号８のアミノ酸番号４３９乃至５３４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する、請求項１１乃至１３から選択されるいずれか一つに記載の抗体。
  15. ＥＰＨＡ２リガンドにより誘導されるＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化を抑制する、請求項１１乃至１４から選択されるいずれか一つに記載の抗体。
  16. ＥＰＨＡ２リガンドのＥＰＨＡ２に対する結合を阻害するのではなく、リガンドにより誘導されるＥＰＨＡ２チロシン残基のリン酸化を抑制する、請求項１１乃至１４から選択されるいずれか一つに記載の抗体。
  17. 重鎖可変領域の相補性決定領域として、配列表の配列番号７１、７３及び７５に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域の相補性決定領域として、配列表の配列番号７７、７９及び８１に示されるアミノ酸配列を有する、配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体。
  18. 以下の１）及び２）に示される特徴を有する、配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体：
    １）一般式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ペプチドを有する；
    −ＦＲＨ1−ＣＤＲＨ1−ＦＲＨ2−ＣＤＲＨ2−ＦＲＨ3−ＣＤＲＨ3−ＦＲＨ4−（Ｉ）
    （式中、ＦＲＨ1は１８乃至３０個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＨ1は配列表の配列番号７１で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ2は１４個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、ＣＤＲＨ2は配列表の配列番号７３で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ3は３２個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、ＣＤＲＨ3は配列表の配列番号７５で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ4は１１個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配
    列を示し、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。）；
    ２）一般式（ＩＩ）で示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖ポリペプチドを有する； −ＦＲＬ1−ＣＤＲＬ1−ＦＲＬ2−ＣＤＲＬ2−ＦＲＬ3−ＣＤＲＬ3−ＦＲＬ4−（ＩＩ）
    （式中、ＦＲＬ1は２３個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＬ1は配列表の配列番号７７で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ2は１５個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、ＣＤＲＬ2は配列表の配列番号７９で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ3は３２個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、ＣＤＲＬ3は配列表の配列番号８１で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ4は１０個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。）。
  19. 重鎖可変領域のＣＤＲＨ1、ＣＤＲＨ2及びＣＤＲＨ3が、それぞれ、配列表の配列番号１０９、１１１及び１１３に示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域のＣＤＲＬ1、ＣＤＲＬ2及びＣＤＲＬ3が、それぞれ配列表の配列番号９３、９５及び９７に示されるアミノ酸配列を含む、配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する、ヒト抗体であることを特徴とする抗体。
  20. 重鎖可変領域のＣＤＲＨ1、ＣＤＲＨ2及びＣＤＲＨ3が、それぞれ、配列表 の配列番号１４１、１４３及び１４５に示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域のＣＤＲＬ1、ＣＤＲＬ2及びＣＤＲＬ3が、それぞれ配列表の配列番号１２５、１２７及び１２９に示されるアミノ酸配列を含む、配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する、ヒト抗体であることを特徴とする抗体。
  21. ヒト化抗体であることを特徴とする、請求項１乃至１８から選択されるいずれか１つに記載の抗体。
  22. ヒト抗体であることを特徴とする、請求項１乃至１８から選択されるいずれか１つに記載の抗体。
  23. ＩｇＧ抗体であることを特徴とする、請求項１乃至２０から選択されるいずれか１つに記載の抗体。
  24. Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦＶ、ディアボディー、線状抗体及び多特異的抗体から選択されるいずれかであることを特徴とする、請求項１乃至８及び、１１乃至１６から選択されるいずれか１つに記載の抗体。
  25. ハイブリドーマＳＨ３４８−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３６）が産生する、ＥＰＨＡ２に特異的に結合する抗体。
  26. ハイブリドーマＳＨ３５７−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３７）が産生する、ＥＰＨＡ２に特異的に結合する抗体。
  27. 配列表の配列番号３５のアミノ酸番号１乃至１１９に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド及び、配列表の配列番号３７のアミノ酸番号１乃至１１２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドからなり、ＥＰＨＡ２に特異的に結合する抗体。
  28. 配列表の配列番号３９のアミノ酸番号１乃至１１９に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド及び、配列表の配列番号４１のアミノ酸番号１乃至１１２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドからなり、ＥＰＨＡ２に特異的に結合する抗体。
  29. 配列表の配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド及び、配列表の配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドからなる抗体。
  30. 配列表の配列番号３９に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド及び、配列表の配列番号４１に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドからなる抗体。
  31. 請求項２５乃至３０から選択されるいずれか１つに記載の抗体をヒト化した抗体。
  32. Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦＶ、ディアボディー、線状抗体及び多特異的抗体から選択されるいずれかであることを特徴とする、請求項２５乃至３０から選択されるいずれかに１つに記載の抗体。
  33. マウスハイブリドーマＳＨ３４８−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３６）。
  34. マウスハイブリドーマＳＨ３５７−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３７）。
  35. 請求項１乃至３２から選択される抗体の少なくともいずれか１つを含有することを特徴とする、医薬組成物。
  36. 請求項１乃至３２から選択される抗体の少なくともいずれか１つを含有することを特徴とする、癌の治療用医薬組成物。
  37. 請求項１乃至３２から選択される抗体のいずれか１つを有効成分として含有することを特徴とする、哺乳動物の有する腫瘍の増殖の抑制剤。
  38. 腫瘍が、ＥＰＨＡ２を発現している腫瘍であることを特徴とする、請求項３７に記載の腫瘍の増殖の抑制剤。
  39. 請求項１乃至３２ら選択されるいずれか一つに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
  40. 請求項３９に記載のポリヌクレオチドによって形質転換された宿主細胞。
  41. 請求項４０に記載の宿主細胞を用いた抗体の製造方法。
  42. 癌が、乳癌、食道癌、前立腺癌、胃癌、非小細胞肺癌、大腸癌、及び多形神経膠芽腫であることを特徴とする、請求項３６に記載の医薬組成物。
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