JPWO2009028639A1 - 抗epha2抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)ハイブリドーマSH348−1(FERM BP−10836)が産生する抗体によって認識されるエピトープを認識する抗体、
(2)以下のa)乃至d)に示される性質を有する、(1)に記載の抗体:
a)EPHA2チロシン残基のリン酸化能を有さない;
b)EPHA2発現細胞に対してADCC活性を有する;
c)EPHA2発現細胞に対してCDC活性を有する;
d)In vivoで抗腫瘍活性を有する、
(3)以下のa)乃至e)に示される性質を有する、(1)に記載の抗体:
a)EPHA2チロシン残基のリン酸化能を有さない;
b)EPHA2蛋白質量の減少作用を示す;
c)EPHA2発現細胞に対してADCC活性を有する;
d)EPHA2発現細胞に対してCDC活性を有する;
e)In vivoで抗腫瘍活性を有する、
(4)配列表の配列番号8のアミノ酸番号426乃至534に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体、
(5)配列表の配列番号8のアミノ酸番号426乃至534に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合し、以下のa)乃至d)に示される性質を有する抗体:
a)EPHA2チロシン残基のリン酸化能を有さない;
b)EPHA2発現細胞に対してADCC活性を有する;
c)EPHA2発現細胞に対してCDC活性を有する;
d)In vivoで抗腫瘍活性を有する、
(6)配列表の配列番号8のアミノ酸番号426乃至534に示されるアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合し、以下のa)乃至e)に示される性質を有する抗体:
a)EPHA2チロシン残基のリン酸化能を有さない;
b)EPHA2蛋白質量の減少作用を示す;
c)EPHA2発現細胞に対してADCC活性を有する;
d)EPHA2発現細胞に対してCDC活性を有する;
e)In vivoで抗腫瘍活性を有する、
(7)配列表の配列番号8のアミノ酸番号439乃至534に示されるアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する、(1)乃至(6)から選択されるいずれか一つに記載の抗体、
(8)EPHA2リガンドにより誘導されるEPHA2チロシン残基のリン酸化を抑制する、(1)乃至(7)から選択されるいずれか一つに記載の抗体、
(9)EPHA2リガンドのEPHA2に対する結合を阻害するのではなく、リガンドにより誘導されるEPHA2チロシン残基のリン酸化を抑制する、(1)乃至(7)から選択されるいずれか一つに記載の抗体、
(10)重鎖可変領域の相補性決定領域として、配列表の配列番号59、61及び63に示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域の相補性決定領域として、配列表の配列番号65、67及び69に示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する、配列表の配列番号8に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体、
(11)以下の1)及び2)の特徴を有する、配列表の配列番号8に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体:
1)一般式(I)で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ペプチドを有する;
−FRH1−CDRH1−FRH2−CDRH2−FRH3−CDRH3−FRH4−(I)
(式中、FRH1は18乃至30個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、CDRH1は配列表の配列番号59で示されるアミノ酸配列又は1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、FRH2は14個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、CDRH2は配列表の配列番号61で示されるアミノ酸配列又は1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、FRH3は32個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、CDRH3は配列表の配列番号63で示されるアミノ酸配列又は1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、FRH4は11個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。);
2)一般式(II)で示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖ポリペプチドを有する;
−FRL1−CDRL1−FRL2−CDRL2−FRL3−CDRL3−FRL4−(II)
(式中、FRL1は23個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、CDRL1は配列表の配列番号65で示されるアミノ酸配列又は1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、FRL2は15個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、CDRL2は配列表の配列番号67で示されるアミノ酸配列を示し、FRL3は32個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、CDRL3は配列表の配列番号69で示されるアミノ酸配列又は1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、FRL4は10個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。)、
(12)ハイブリドーマSH357−1(FERM BP−10837)が産生する抗体によって認識されるエピトープを認識する抗体、
(13)以下のa)乃至d)に示される性質を有する、(12)に記載の抗体:
a)EPHA2チロシン残基のリン酸化能を有さない;
b)EPHA2発現細胞に対してADCC活性を有する;
c)EPHA2発現細胞に対してCDC活性を有する;
d)In vivoで抗腫瘍活性を有する、
(14)配列表の配列番号8のアミノ酸番号426乃至534に示されるアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合し、以下のa)乃至e)に示される性質を有する抗体:
a)EPHA2チロシン残基のリン酸化能を有さない;
b)EPHA2蛋白質量の減少作用を示さない;
c)EPHA2発現細胞に対してADCC活性を有する;
d)EPHA2発現細胞に対してCDC活性を有する;
e)In vivoで抗腫瘍活性を有する、
(15)配列表の配列番号8のアミノ酸番号439乃至534に示されるアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する、(12)乃至(14)から選択されるいずれか一つに記載の抗体、
(16)EPHA2リガンドにより誘導されるEPHA2チロシン残基のリン酸化を抑制する、(12)乃至(15)から選択されるいずれか一つに記載の抗体、
(17)EPHA2リガンドのEPHA2に対する結合を阻害するのではなく、リガンドにより誘導されるEPHA2チロシン残基のリン酸化を抑制する、(12)乃至(15)から選択されるいずれか一つに記載の抗体、
(18)重鎖可変領域の相補性決定領域として、配列表の配列番号71、73及び75に示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域の相補性決定領域として、配列表の配列番号77、79及び81に示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する、配列表の配列番号8に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体、
(19)以下の1)及び2)に示される特徴を有する、配列表の配列番号8に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体:
1)一般式(I)で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ペプチドを有する;
−FRH1−CDRH1−FRH2−CDRH2−FRH3−CDRH3−FRH4−(I)
(式中、FRH1は18乃至30個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、CDRH1は配列表の配列番号71で示されるアミノ酸配列又は1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、FRH2は14個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、CDRH2は配列表の配列番号73で示されるアミノ酸配列又は1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、FRH3は32個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、CDRH3は配列表の配列番号75で示されるアミノ酸配列又は1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、FRH4は11個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。);
2)一般式(II)で示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖ポリペプチドを有する;
−FRL1−CDRL1−FRL2−CDRL2−FRL3−CDRL3−FRL4−(II)
(式中、FRL1は23個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、CDRL1は配列表の配列番号77で示されるアミノ酸配列又は1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、FRL2は15個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、CDRL2は配列表の配列番号79で示されるアミノ酸配列又は1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、FRL3は32個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、CDRL3は配列表の配列番号81で示されるアミノ酸配列又は1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、FRL4は10個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。)、
(20)ヒト化抗体であることを特徴とする、(1)乃至(19)から選択されるいずれか1つに記載の抗体、
(21)ヒト抗体であることを特徴とする、(1)乃至(19)から選択されるいずれか1つに記載の抗体、
(22)IgG抗体であることを特徴とする、(1)乃至(19)から選択されるいずれか1つに記載の抗体、
(23)Fab、F(ab’)2、Fv、scFV、ディアボディー、線状抗体及び多特異的抗体から選択されるいずれかであることを特徴とする、(1)乃至(9)及び、(12)乃至(17)から選択されるいずれか1つに記載の抗体、
(24)ハイブリドーマSH348−1(FERM BP−10836)が産生する抗体、
(25)ハイブリドーマSH357−1(FERM BP−10837)が産生する抗体、
(26)以下の1)及び2)からなる抗体:
1)配列表の配列番号35のアミノ酸番号1乃至119に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド又は配列表の配列番号39のアミノ酸番号1乃至119に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド;
2)配列表の配列番号37のアミノ酸番号1乃至112に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド又は配列表の配列番号41のアミノ酸番号1乃至112に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド、
(27)以下の1)又は2)からなる抗体:
1)配列表の配列番号35のアミノ酸番号1乃至119に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド及び、配列表の配列番号37のアミノ酸番号1乃至112に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド;
2)配列表の配列番号39のアミノ酸番号1乃至119に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド及び、配列表の配列番号41のアミノ酸番号1乃至112に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド、
(28)以下の1)及び2)からなる抗体:
1)配列表の配列番号35に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド又は配列表の配列番号39に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド;
2)配列表の配列番号37に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド又は配列表の配列番号41に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド。
(29)以下の1)又は2)からなる抗体:
1)配列表の配列番号35に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド及び、配列表の配列番号37に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド;
2)配列表の配列番号39に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド及び、配列表の配列番号41に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド、
(30)(24)乃至(29)から選択されるいずれか1つに記載の抗体をヒト化した抗体、
(31)以下の1)及び2)からなる抗体:
1)配列表の配列番号107のアミノ酸番号20乃至468に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド又は配列表の配列番号115のアミノ酸番号20乃至468に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド;
2)配列表の配列番号91のアミノ酸番号21乃至239に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド又は配列表の配列番号99のアミノ酸番号21乃至239に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド、
(32)以下の1)又は2)からなる抗体:
1)配列表の配列番号107のアミノ酸番号20乃至468に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド及び、配列表の配列番号91のアミノ酸番号21乃至239に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド;
2)配列表の配列番号115のアミノ酸番号20乃至468に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド及び、配列表の配列番号99のアミノ酸番号21乃至239に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド、
(33)以下の1)及び2)からなる抗体:
1)配列表の配列番号139のアミノ酸番号20乃至468に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド又は配列表の配列番号147のアミノ酸番号20乃至468に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド;
2)配列表の配列番号123のアミノ酸番号21乃至239に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド又は配列表の配列番号131のアミノ酸番号21乃至239に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド、
(34)以下の1)又は2)からなる抗体:
1)配列表の配列番号139のアミノ酸番号20乃至468に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド及び、配列表の配列番号123のアミノ酸番号21乃至239に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド;
2)配列表の配列番号147のアミノ酸番号20乃至468に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド及び、配列表の配列番号131のアミノ酸番号21乃至239に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド、
(35)(24)乃至(34)から選択されるいずれかに記載の抗体の、Fab、F(ab’)2、Fv、scFV、ディアボディー、線状抗体及び多特異的抗体から選択されるいずれか一つ、
(36)以下の1)乃至20)からなる群から選択されるいずれか一つのポリペプチド:
1)配列表の配列番号35のアミノ酸番号1乃至119に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
2)配列表の配列番号39のアミノ酸番号1乃至119に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
3)配列表の配列番号37のアミノ酸番号1乃至112に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
4)配列表の配列番号41のアミノ酸番号1乃至112に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
5)配列表の配列番号107のアミノ酸番号20乃至468に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
6)配列表の配列番号115のアミノ酸番号20乃至468に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
7)配列表の配列番号107のアミノ酸番号20乃至138に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
8)配列表の配列番号115のアミノ酸番号20乃至138に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
9)配列表の配列番号91のアミノ酸番号21乃至239に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
10)配列表の配列番号99のアミノ酸番号21乃至239に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
11)配列表の配列表の配列番号91のアミノ酸番号21乃至134に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
12)配列表の配列番号99のアミノ酸番号21乃至134に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
13)配列表の配列番号139のアミノ酸番号20乃至468に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
14)配列表の配列番号147のアミノ酸番号20乃至468に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
15)配列表の配列番号139のアミノ酸番号20乃至138に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
16)配列表の配列番号147のアミノ酸番号20乃至138に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
17)配列表の配列番号123のアミノ酸番号21乃至239に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
18)配列表の配列番号131のアミノ酸番号21乃至239に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
19)配列表の配列番号123のアミノ酸番号21乃至134に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
20)配列表の配列番号131のアミノ酸番号21乃至134に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(37)マウスハイブリドーマSH−348−1(FERM BP−10836)、
(38)マウスハイブリドーマSH−357−1(FERM BP−10837)
(39)(1)乃至(36)から選択される抗体の少なくともいずれか1つを含有することを特徴とする、医薬組成物、
(40(1)乃至(36)から選択される抗体の少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、癌の治療用医薬組成物、
(41)(1)乃至(36)、及び、(39)、(40)からなる群から選択されるいずれかを投与することによる、哺乳動物の有する腫瘍の増殖の抑制方法、
(42)腫瘍が、EPHA2を発現している腫瘍であることを特徴とする、(41)に記載の腫瘍の増殖の抑制方法、
(43)(1)乃至(36)から選択されるいずれか一つに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド、
(44)(43)に記載のポリヌクレオチドによって形質転換された宿主細胞、
(45)(44)に記載の宿主細胞を用いた抗体の製造方法、
からなる。
本明細書中においては、「癌」と「腫瘍」は同じ意味に用いている。
(1)EPHA2遺伝子
EPHA2遺伝子のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列はGenBankにEPH receptor A2(アクセッション番号はそれぞれNM_004431、NP_004422)として登録されている。また、EPHA2遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)のヌクレオチド配列は配列表の配列番号1に記載されており、そのアミノ酸配列は配列表の配列番号2に記載されている。
(2)EPHA2遺伝子の癌部特異的発現
EPHA2遺伝子は、多くの癌、特に乳癌、食道癌、前立腺癌、胃癌、非小細胞肺癌、大腸癌、多形神経膠芽腫での高発現が報告されている。
(1)抗原の調製
本発明のEPHA2に対する抗体を得るための抗原としては、EPHA2の全長ポリペプチド又はその部分ポリペプチドを挙げることができ、より具体的には、EPHA2の全長ポリペプチド又は、好ましくはEPHA2の細胞外領域ポリペプチド(配列表の配列番号8のアミノ酸番号1乃至534に示されるアミノ酸配列からなる。)、更に好ましくは配列表の配列番号8のアミノ酸番号426乃至534に示されるアミノ酸配列を含むEPHA2の細胞外領域ポリペプチドの部分ポリペプチド、更により好ましくは、配列表の配列番号8のアミノ酸番号439乃至534に示されるアミノ酸配列を含むEPHA2の細胞外領域ポリペプチドの部分ペプチド、あるいはこれらに任意のアミノ酸配列や担体が付加された誘導体を挙げることができる。また、上記各ポリペプチドの少なくとも6個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはこれらに任意のアミノ酸配列や担体が付加された誘導体を挙げることができる。
EPHA2と特異的に結合する抗体の例として、EPHA2と特異的に結合するモノクローナル抗体を挙げることができるが、その取得方法は、以下に記載する通りである。
すなわち、
(a)抗原として使用する生体高分子の精製、
(b)抗原を動物に注射することにより免疫した後、血液を採取しその抗体価を検定して脾臓摘出の時期を決定してから、抗体産生細胞を調製する工程、
(c)骨髄腫細胞(以下「ミエローマ」という)の調製、
(d)抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、
(e)目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、
(f)単一細胞クローンへの分割(クローニング)、
(g)場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培養、又はハイブリドーマを移植した動物の飼育、
(h)このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性、及びその結合特異性の検討、あるいは標識試薬としての特性の検定、等である。
抗原としては、前記したような方法で調製したEPHA2又はその部分ポリペプチドを使用することができる。
工程(a)で得られた抗原と、当業者に周知のアジュバント、例えば、フロインドの完全又は不完全アジュバント、又はカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物は公知のハイブリドーマ作製法に用いられる動物を支障なく使用することができる。具体的には、たとえばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ等を使用することができる。ただし、摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞の入手容易性等の観点から、マウス又はラットを被免疫動物とするのが好ましい。
細胞融合に用いるミエローマ細胞には特段の制限はなく、公知の細胞株から適宜に選択して用いることができる。ただし、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続が確立しているHGPRT(Hipoxanthine−guanine phosphoribosyl transferase)欠損株を用いるのが好ましい。
抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法(Weir,D.M.,Handbookof Experimental Immunology Vol.I. II. III.,Blackwell Scientific Publications, Oxford(1987)、Kabat,E.A. and Mayer,M.M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Spigfield,Illinois(1964)等)に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件下で適宜実施することができる。
すなわち、高濃度ポリマー溶液としてポリエチレングリコールを用いる場合には、分子量1500〜6000、好ましくは2000〜4000のポリエチレングリコール溶液中で、30〜40℃、好ましくは35〜38℃の温度で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを1〜10分間、好ましくは5〜8分間混合する。
上記細胞融合により得られるハイブリドーマの選択方法は特に制限はないが、通常HAT(ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン)選択法(Kohler et al., Nature(1975)256,p.495;Milstein et al., Nature(1977)266,p.550)が用いられる。
ハイブリドーマのクローニング法としては、例えばメチルセルロース法、軟アガロース法、限界希釈法等の公知の方法を用いることができる(例えばBarbara, B.M. and Stanley, M.S.:Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Company,San Francisco(1980)参照)。これらの方法のうち、特に限界希釈法が好適である。
このようにして選択されたハイブリドーマは、これを培養することにより、モノクローナル抗体を効率よく得ることができるが、培養に先立ち、目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることが望ましい。
かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスの決定は以下のように行うことができる。
本発明の抗体には、上記EPHA2に対するモノクローナル抗体に加え、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ(Chimeric)抗体、ヒト化(Humanized)抗体、ヒト抗体なども含まれる。これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
原核細胞を使用する場合は、例えば、大腸菌、枯草菌を挙げることができる。
上記方法によって取得される本発明の抗EPHA2抗体は以下の性質を有する。
(1)本発明の1つの抗体は下記のa)乃至e)に示される性質を有する。
a)EPHA2チロシン残基のリン酸化能を有さない。:
b)EPHA2発現細胞に対してADCC活性を有する。:
c)EPHA2発現細胞に対してCDC活性を有する。:
d)In vivoで抗腫瘍活性を有する。:
e)配列表の配列番号8のアミノ酸番号426乃至534に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する。
1)SH348−1、
2)ハイブリドーマSH348−1(FERM BP−10836)が産生する抗体によって認識されるエピトープを認識する抗体、
3)重鎖可変領域の相補性決定領域として、配列表の配列番号59、61及び63に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域の相補性決定領域として、配列表の配列番号65、67及び69に示されるアミノ酸配列を有する抗体、
4)以下のi)及びii)の特徴を有する抗体:
i)一般式(I)で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ペプチドを有する:
−FRH1−CDRH1−FRH2−CDRH2−FRH3−CDRH3−FRH4−(I)
(式中、FRH1は18乃至30個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、CDRH1は配列表の配列番号59で示されるアミノ酸配列を示し、FRH2は14個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、CDRH2は配列表の配列番号61で示されるアミノ酸配列を示し、FRH3は32個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、CDRH3は配列表の配列番号63で示されるアミノ酸配列を示し、FRH4は11個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。);
ii)一般式(II)で示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖ポリペプチドを有する:
−FRL1−CDRL1−FRL2−CDRL2−FRL3−CDRL3−FRL4−(II)
(式中、FRL1は23個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、CDRL1は配列表の配列番号65で示されるアミノ酸配列を示し、FRL2は15個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、CDRL2は配列表の配列番号67で示されるアミノ酸配列を示し、FRL3は32個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、CDRL3は配列表の配列番号69で示されるアミノ酸配列を示し、FRL4は10個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。)、
5)SH357−1、
6)ハイブリドーマSH357−1(FERM BP−10837)が産生する抗体によって認識されるエピトープを認識する抗体、
7)重鎖可変領域の相補性決定領域として、配列表の配列番号71、73及び75に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域の相補性決定領域として、配列表の配列番号77、79及び81に示されるアミノ酸配列を有する抗体、
8)以下のi)及びii)に示される特徴を有する、5)乃至7)から選択されるいずれか1つに記載の抗体:
i)一般式(I)で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ペプチドを有する:
−FRH1−CDRH1−FRH2−CDRH2−FRH3−CDRH3−FRH4−(I)
(式中、FRH1は18乃至30個のアミノ酸配列からなる任意のアミノ酸配列を示し、CDRH1は配列表の配列番号71で示されるアミノ酸配列を示し、FRH2は14個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、CDRH2は配列表の配列番号73で示されるアミノ酸配列を示し、FRH3は32個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、CDRH3は配列表の配列番号75で示されるアミノ酸配列を示し、FRH4は11個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。);
ii)一般式(II)で示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖ポリペプチドを有する:
−FRL1−CDRL1−FRL2−CDRL2−FRL3−CDRL3−FRL4−(II)
(式中、FRL1は23個のアミノ酸配列からなる任意のアミノ酸配列を示し、CDRL1は配列表の配列番号77で示されるアミノ酸配列を示し、FRL2は15個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、CDRL2は配列表の配列番号79で示されるアミノ酸配列を示し、FRL3は32個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、CDRL3は配列表の配列番号81で示されるアミノ酸配列を示し、FRL4は10個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。)。
a)EPHA2チロシン残基のリン酸化能を有さない。:
b)EPHA2蛋白質量の減少作用を示す。
c)EPHA2発現細胞に対してADCC活性を有する。:
d)EPHA2発現細胞に対してCDC活性を有する。:
e)In vivoで抗腫瘍活性を有する。:
f)配列表の配列番号8のアミノ酸番号426乃至534に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する。
1)SH348−1、
2)ハイブリドーマSH348−1(FERM BP−10836)が産生する抗体によって認識されるエピトープを認識する抗体、
3)重鎖可変領域の相補性決定領域として、配列表の配列番号59、61及び63に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域の相補性決定領域として、配列表の配列番号65、67及び69に示されるアミノ酸配列を有する抗体、
4)以下のi)及びii)の特徴を有する抗体:
i)一般式(I)で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ペプチドを有する:
−FRH1−CDRH1−FRH2−CDRH2−FRH3−CDRH3−FRH4−(I)
(式中、FRH1は18乃至30個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、CDRH1は配列表の配列番号59で示されるアミノ酸配列を示し、FRH2は14個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、CDRH2は配列表の配列番号61で示されるアミノ酸配列を示し、FRH3は32個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、CDRH3は配列表の配列番号63で示されるアミノ酸配列を示し、FRH4は11個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。);
ii)一般式(II)で示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖ポリペプチドを有する:
−FRL1−CDRL1−FRL2−CDRL2−FRL3−CDRL3−FRL4−(II)
(式中、FRL1は23個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、CDRL1は配列表の配列番号65で示されるアミノ酸配列を示し、FRL2は15個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、CDRL2は配列表の配列番号67で示されるアミノ酸配列を示し、FRL3は32個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、CDRL3は配列表の配列番号69で示されるアミノ酸配列を示し、FRL4は10個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。)。
a)EPHA2チロシン残基のリン酸化能を有さない。
b)EPHA2蛋白質量の減少作用を示さない。
c)ADCC活性を有する。
d)CDC活性を有する。
e)In vivoで抗腫瘍活性を有する。
f)配列表の配列番号8のアミノ酸番号426乃至534に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する。
1)SH357−1、
2)ハイブリドーマSH357−1(FERM BP−10837)が産生する抗体によって認識されるエピトープを認識する抗体、
3)重鎖可変領域の相補性決定領域として、配列表の配列番号71、73及び75に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域の相補性決定領域として、配列表の配列番号77、79及び81に示されるアミノ酸配列を有する抗体、
4)以下のi)及びii)に示される性質を有する抗体:
i)一般式(I)で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ペプチドを有する:
−FRH1−CDRH1−FRH2−CDRH2−FRH3−CDRH3−FRH4−(I)
(式中、FRH1は18乃至30個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、CDRH1は配列表の配列番号71で示されるアミノ酸配列を示し、FRH2は14個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、CDRH2は配列表の配列番号73で示されるアミノ酸配列を示し、FRH3は32個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、CDRH3は配列表の配列番号75で示されるアミノ酸配列を示し、FRH4は11個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。);
ii)一般式(II)で示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖ポリペプチドを有する:
−FRL1−CDRL1−FRL2−CDRL2−FRL3−CDRL3−FRL4−(II)
(式中、FRL1は23個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、CDRL1は配列表の配列番号77で示されるアミノ酸配列を示し、FRL2は15個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、CDRL2は配列表の配列番号79で示されるアミノ酸配列を示し、FRL3は32個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、CDRL3は配列表の配列番号81で示されるアミノ酸配列を示し、FRL4は10個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。)。
本発明の抗EPHA2抗体は、医薬として特に癌の治療を目的とした医薬組成物として、あるいはこのような疾患の免疫学的診断のための抗体として有用である。
適当な賦形剤や担体は注射用の水や生理食塩水、人工脳脊髄液や非経口投与に通常用いられている他の物質でもよい。
医薬組成物にはpH7.0−8.5のTrisバッファーやpH4.0−5.5の酢酸バッファーやそれらにソルビトールや他の化合物を含むこともできる。
本発明の医薬組成物は選択された組成で必要な純度で適当な薬剤として、凍結乾燥品あるいは液体として準備される。
1)−1 ヒトEPHA2発現ベクターの作製
1)−1−1 全長ヒトEPHA2発現ベクターの作製
SK−OV−3細胞total RNAより合成したcDNAを鋳型にプライマーセット:
プライマー1:5’−ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcggggatcggaccgagagcgagaag−3’(配列表の配列番号3)及び、
プライマー2:
5’−ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcctagatggggatccccacagtgttcacctggtcctt−3’
(配列表の配列番号4)
を用いてPCR反応を行い、ヒトEPHA2をコードするcDNAを増幅した。PCR産物をBP Clonase(Invitrogen社製)を用いてpDONR221(Invitrogen社製)に組み込みエントリーベクターを作製した。GeneTailor Site−Directed Mutagenesis System(Invitrogen社製)とプライマーセット:
プライマー3:5’−ctgtggggatccccatcgacccagctttc−3’(配列表の配列番号5)及び、
プライマー4:5’−gatggggatccccacagtgttcacctggtc−3’(配列表の配列番号6)
を用いて、エントリーベクター中のEPHA2遺伝子からストップコドンを除去した。得られたエントリーベクターからpcDNA−DEST40 Gateway Vector(Invitrogen社製)へLR Clonase(Invitrogen社製)を用いて組み換え反応を行い、pcDNA−DEST40−EPHA2を作製した(本ベクターはattB1とattB2配列の間に配列表の配列番号7に示されるヌクレオチド配列を有する。)。また本ベクターにクローニングされたEPHA2遺伝子のORF部分の配列は配列表の配列番号7のヌクレオチド番号33乃至2960に示されている。またEPHA2のアミノ酸配列は配列表の配列番号8に示されている。
ヒトEPHA2細胞外領域ポリペプチド(配列表の配列番号8のアミノ酸番号1乃至534に示されるアミノ酸配列からなる。以下「EPHA2−ECD」と略す)をコードするcDNAをプライマーセット:
プライマー5:5’−aaaaagcttatggagctccaggcagcccgc−3’(配列表の配列番号9)及び、
プライマー6:5’−aaagggccctcagttgccagatccctccgg−3’(配列表の配列番号10)
を用いてPCR反応で増幅した。得られたPCR産物をHindIII及びApaIで切断し、pcDNA3.1のHindIII/ApaIサイトにクローニングした(以下「pcDNA3.1−EPHA2−ECD」と略す。また、以下及び図中で「pcDNA3.1−EPHA2−ECD」によって発現する組換え蛋白質を「rEPHA2−ECD」と記す。)。
EPHA2の配列表の配列番号8のアミノ酸番号315−540に示されるアミノ酸配列からなる領域(以下「FnIII−NC」と記す。)、アミノ酸番号315−430に示されるアミノ酸配列からなる領域(以下「FnIII−N」と記す。)、アミノ酸番号426−540に示されるアミノ酸配列からなる領域(以下「FnIII−C」と記す。)を発現するベクターを構築するため、FnIII−NC増幅用プライマーセット:
プライマー7:5’−gcaggcttcatcgaaggtcgtgggcgggcacctcaggacccag−3’(配列表の配列番号11)及び、
プライマー8:5’−gtacaagaaagctgggtgctagccgccaatcaccgccaag−3’(配列表の配列番号12)、
FnIII−N増幅用プライマーセット:
プライマー7及び、
プライマー9:5’−gtacaagaaagctgggtgctaggcagtacggaagctgcgg−3’(配列表の配列番号13)、
FnIII−C増幅用プライマーセット:
プライマー10:5’−gcaggcttcatcgaaggtcgtgggagcttccgtactgccagtg−3’(配列表の配列番号14)及び、
プライマー8、
のそれぞれのプライマーセットを用いてpcDNA−DEST40−EPHA2を鋳型にしてPCR反応を行った。得られたPCR産物の両末端にattB1、attB2サイトを付加するため、各PCR産物を鋳型にプライマーセット:
プライマー11:5’−ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcatcgaaggtcgtggg−3’(配列表の配列番号15)及び、
プライマー12:5’−ggggaccactttgtacaagaaagctgggt−3’(配列表の配列番号16)、
を用いてPCR反応を行い、ここで得られたPCR産物をBP Clonaseを用いてpDONR221に組み込みエントリーベクターを作製した。各エントリーベクターからpET15b(Novagen社製)のNdeIとBamHIサイトを制限酵素で切断後平滑化したサイトにGateway Vector Conversion System(Invitrogen社製)のReading Frame Cassette C.1を組み込んで作製したデスティネーションベクターとの間で、LR Clonaseを使用した組み換え反応を行い発現ベクターを作製した(以下、FnIII−NC、FnIII−N、FnIII−Cを組み込んだ発現ベクターによって発現する組換え蛋白質をそれぞれrFnIII−NC、rFnIII−N、rFnIII−Cと記す)。
HCC70細胞total RNAより合成したcDNAを鋳型にプライマーセット:
プライマー13:5’−ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcgccccgggaagcgcagcc−3’(配列表の配列番号17)及び、
プライマー14:
5’−ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcctaaacctccacagactgaatctggttcatctg−3’(配列表の配列番号18)
を用いてPCR反応を行い、ヒトEPHB2をコードするcDNAを取得した。ヒトEPHB2のcDNAのヌクレオチド配列を配列表の配列番号19に、アミノ酸配列を配列表の配列番号20に示した。ヒトEPHB2細胞外領域(配列表の配列番号20のアミノ酸番号1−542に示されるアミノ酸配列からなる領域)(以下「EPHB2−ECD」と略す)をコードするcDNAを増幅するためプライマーセット:
プライマー15:5’−aaaaagcttatggctctgcggaggctgggg−3’(配列表の配列番号21)及び、
プライマー16:5’−aaagatatctcatggcaacttctcctggat−3’(配列表の配列番号22)
を用いてPCR反応を行った。得られたPCR産物をHindIII及びEcoRVで切断し、pcDNA3.1のHindIII/EcoRVサイトにクローニングした(以下「pcDNA3.1−EPHB2−ECD」と略す。また、以下及び図中で「pcDNA3.1−EPHB2−ECD」によって発現する組換え蛋白質をrEPHB2−ECDと記す)。
Human clone collection(STRATAGENE社製 #C33830)を鋳型にプライマーセット:
プライマー17:5’−caccatggagctggcggccttg−3’(配列表の配列番号23)及び、
プライマー18:5’−tcccactggcacgtccagacc−3’(配列表の配列番号24)
を用いPCR反応を行った。得られたPCR産物をpENTR Directional TOPO Cloning kit(Invitrogen社製)を用いてpENTR/D−TOPO(Invitrogen社製)に組み込みエントリーベクターを作製した。アミノ酸置換を伴う変異を修復するため、エントリーベクターを EcoRI処理して得られた断片の内、pENTR/D−TOPO由来配列を含む方の断片とHuman clone collection(STRATAGENE社製 #C14640)をEcoRI処理して得られた断片の内、2番目に大きな断片(約1.6kbp)とをライゲーションした。得られたエントリーベクターからpcDNA−DEST40 Gateway vectorへLR Clonaseを用いて組み換え反応を行い、pcDNA−DEST40−ERBB2を作製した(attB1とattB2配列の間に配列表の配列番号25に示されるヌクレオチド配列を有する。)。
2)−1 抗原蛋白質の調製
EPHA2−ECDを発現させるため、FreeStyle 293−F細胞(Invitorogen社製)にpcDNA3.1−EPHA2−ECDを293fectin(Invitorogen社製)を用いてトランスフェクションし、37℃、8% CO2で5日間培養した。培養後、遠心分離により培養液を回収し、rEPHA2−ECDの精製原料とした。得られた培養上清を分子量分画15000の透析チューブを用いて20mM Tris−HCl pH7.5に対して透析し、フィルター濾過(0.45μm, PES)した後、20mM Tris−HCl pH7.5で平衡化されたHiPrep 16/10 Q XL(GE Healthcare Bio−Sciences社製)に添加した。溶出はNaClの直線濃度勾配(20mM Tris−HCl pH7.5、0−1M NaCl)で行った。溶出画分の一部をSDS‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動(以下「SDS−PAGE」と略す。)で分離後、ゲルをクマシーブリリアントブルー染色(以下「CBB染色」と略す)し、rEPHA2−ECDの含まれる画分を確認した。次にrEPHA2−ECDを含む画分を集め、PBSで平衡化されたHiLoad 26/60 Superdex 200pg(GE Healthcare Bio−Sciences社製)に添加した。PBSで溶出し、溶出分画の一部をSDS−PAGEにより分離後、ゲルをCBB染色し、rEPHA2−ECDの含まれる画分を確認した。rEPHA2−ECDを含む画分を集め、免疫用抗原、エピトープ決定時の抗原として使用した。蛋白質濃度はBCA Protein Assay Reagent(PIERCE社製)を用いて測定した。
4〜6週齢のBALB/cAnNCrlCrljマウス(日本チャールス・リバー社)を使用した。0日目に50μgのrEPHA2−ECD とAdjuvant Complete Freund H37 Rv(和光純薬社製)を混合(体積比で1:1)したものをマウス背部皮下に投与した。同様に別の個体に50μgのrEPHA2−ECD とTiterMax Gold Adjuvant(SIGMA社製)を混合(体積比で1:1)したものを背部皮下に投与した。22日目と36日目に50μgのrEPHA2−ECDとAdjuvant Incomplete Freund(和光純薬社製)を混合(体積比で1:1)したものを各マウスの背部皮下に投与した。53日目に50μgのrEPHA2−ECDを各マウスの腹腔内に投与し、56日目にマウス脾臓を採取しハイブリドーマ作製に用いた。
脾臓細胞とマウスミエローマP3X63Ag8U.1細胞とをPEG4000(IBL社製)を用いて細胞融合しハイブリドーマを作製した。得られたハイブリドーマ培養上清用いて抗EPHA2抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行った。
2)−4−1 抗原遺伝子発現細胞の調製
293T細胞を5×104細胞/cm2になるようcollagen type Iコートフラスコ(IWAKI社製)に播種し10% FBS含有DMEM中で37℃、5% CO2の条件下で1晩培養した。翌日、pcDNA−DEST40−EPHA2とコントロールとしてpcDNA−DEST40−ERBB2をそれぞれ293T細胞にLipofectamine 2000(Invitrogen社製)を用いてトランスフェクションし、37℃、5% CO2の条件下でさらに1晩培養した。翌日、トランスフェクションされた293T細胞をトリプシン処理し、10% FBS含有DMEMで細胞を洗浄した後、5% FBS含有PBSに懸濁した。得られた細胞懸濁液をCell−ELISA、フローサイトメトリー解析に使用した。
2)−4−1で調製した細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、EPHA2発現293T細胞とERBB2発現293T細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を加えて懸濁し、4℃で1時間静置した。ウェル中の細胞を5% FBS含有PBSで2回洗浄後、5% FBS含有PBSで500倍に希釈したGoat anti−Mouse IgG,Peroxidase Conjugated(Millipore(Chemicon)社製 #AP181P)を加えて懸濁し、4℃で1時間静置した。ウェル中の細胞を5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、OPD発色液(OPD溶解液(0.05 M クエン酸3ナトリウム、0.1M リン酸水素2ナトリウム・12水 pH4.5)にo−フェニレンジアミン二塩酸塩(和光純薬社製)、H2O2をそれぞれ0.4mg/ml、0.6%(v/v)になるように溶解)を100μl/ウェルで添加した。攪拌しながら発色反応を行い、1M HClを100μl/ウェルで添加して発色反応を停止させた。遠心して細胞を沈殿させた後、上清を新しい96穴平底マイクロプレートに移し、プレートリーダー(ARVO:PerkinElmer社)で490nmの吸光度を測定した。細胞膜表面上に発現するEPHA2に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択するため、ERBB2発現293T細胞(コントロール)と比較し、EPHA2発現293T細胞の方でより高い吸光度を示す培養上清を産生するハイブリドーマを抗EPHA2抗体産生陽性として選択した。
Cell−ELISAでの擬陽性を除くため、Cell−ELISAで陽性と判定されたハイブリドーマが産生する抗体のEPHA2に対する結合特異性をフローサイトメトリー法によりさらに確認した。2)−4−1で調製した細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、EPHA2発現293T細胞とERBB2発現293T細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を加えて懸濁し、4℃で1時間静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、5% FBS含有PBSで1000倍に希釈したFluorescein−conjugated goat IgG fraction to mouse IgG(Whole Molecule)(ICN Pharmaceuticals社製 #55493)を加えて懸濁し、4℃で1時間静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、2μg/ml 7−aminoactinomycin D(Invitrogen(Molecular Probes)社製)を含む5% FBS含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーター(FC500:BeckmanCoulter社)で検出を行った。データ解析はFlowjo(TreeStar社)で行った。7−aminoactinomycin D陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のFITC蛍光強度のヒストグラムを作成した。コントロールであるERBB2発現293T細胞の蛍光強度ヒストグラムに対しEPHA2発現293T細胞のヒストグラムが強蛍光強度側にシフトしているサンプルを産生するハイブリドーマを抗EPHA2抗体産生ハイブリドーマとして取得した。
抗EPHA2抗体を産生するハイブリドーマはClonaCell−HY Selection Medium D(StemCell Technologies社製 #03804)に希釈して培養され、出現したコロニーを回収することでモノクローン化された。回収された各コロニーを培養し、その培養上清を用いてEPHA2に対する結合性を2)−4−3と同じ方法で確認し、モノクローナル抗EPHA2抗体(SH348−1、SH357−1、Ab57−1、Ab65−1、Ab96−1、Ab100−1、Ab105−1、Ab106−13、Ab136−1、Ab148−1、Ab151−4、Ab230−1、Ab373−1、Ab382−1)を産生するハイブリドーマを樹立した。
2)−5で取得されたモノクローナル抗体がEPHA2を高発現する癌細胞に結合するかどうかを2)−4−3と同様のフローサイトメトリー法で検討した。トランスフェクションした293T細胞の代わりにヒト乳癌細胞株(MDA−MB−231)、ヒト肺癌細胞株(A549)、ヒト前立腺癌細胞株(PC−3)が用いられた。その結果、樹立したモノクローナル抗体はいずれもこれらの癌細胞株に結合することが確認された。
モノクローナル抗体のアイソタイプは、Mouse monoclonal isotyping kit(Serotec社製)により決定された。その結果、IgG1(Ab 57−1、Ab230−1)、IgG2a(SH348−1、SH357−1、Ab65−1、Ab96−1、Ab100−1、Ab136−1、Ab148−1、Ab151−4)、IgG2b(Ab105−1、Ab106−13、Ab373−1、Ab382−1)であった。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ移植マウスの腹水またはハイブリドーマ培養上清(以下「抗体精製原料」という。)から精製した。
また、得られた抗体に含まれるエンドトキシン濃度をエンドスペシーES−50Mセット(生化学工業 #020150)とエンドトキシン標準品CSE−Lセット(生化学工業 #020055)を用いて測定し、1EU/mg以下であることを確認し以下の実験に使用した。
3)−1 抗EPHA2抗体によるEPHA2チロシン残基のリン酸化誘導活性及びEPHA2蛋白質量の低下を誘導する活性の検討
3)−1−1 抗体刺激細胞溶解液の調製
10% FBS、50単位/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシン含有RPMI1640(以下「10% FBS含有RPMI1640(抗生物質入り)」と略す。)に懸濁したMDA−MB−231細胞を6×105細胞/ウェルになるよう6ウェルディッシュに播種し、37℃、5% CO2の条件下で一晩培養した。翌日、培地を捨てRPMI1640を添加し、37℃、5% CO2の条件下でさらに一晩培養した。その翌日、SH348−1、SH357−1、アイソタイプコントロール抗体としてMouse IgG2A Isotype Control(以下及び図中で「mIgG2a」と略す;R&D Systems社製:#MAB003。)、EPHA2の可溶性リガンドとしてRecombinant Mouse Ephrin−A1/Fc Chimera(以下及び図中で「Ephrin−A1/Fc」と略す;R&D Systems社製:#602−A1−200。)、可溶性リガンドのコントロール蛋白質としてRecombinant Human IgG1 Fc(以下及び図中で「hG1Fc」と略す;R&D Systems社製:#110−HG−100。)を図1、図2に示された濃度(SH348−1、SH357−1、mIgG2aは、図1Aでは10μg/ml又は50μg/ml、図2Aでは50μg/ml、Ephrin−A1/FcとhG1Fcは、図1、図2で1μg/ml)になるようRPMI1640で希釈した溶液を、培地を捨てたMDA−MB−231細胞に添加し、37℃、5% CO2の条件下で指定の時間インキュベーションした。また、架橋抗体存在下の実験では、SH348−1、SH357−1、mIgG2aのそれぞれと架橋抗体としてGoat anti−mouse IgG, Fcγ fragment specific(min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot)(Jackson ImmunoResearch Laboratories社製 #115−005−071)をそれぞれ10μg/ml又は50μg/ml(図1B)、50μg/ml(図2B)の濃度になるようRPMI1640中で混合した溶液を、培地を捨てたMDA−MB−231細胞に添加し、37℃、5% CO2の条件下で指定の時間インキュベーションした。指定の時間になったところで上清を除去し、1mM PMSF(SIGMA社製)含有1×Cell Lysis Buffer(Cell Signaling technology社製)を加え細胞を溶解し、15000rpmで5分間遠心した細胞溶解液上清を免疫沈降、ウエスタンブロッティングのサンプルとして使用した。サンプルの蛋白質濃度はBCA Protein Assay Reagent(PIERCE社製)により測定した。
EPHA2を免疫沈降するため、まず1サンプル当たり25μlのProtein G magnetic beads懸濁液(NEW ENGLAND Bio−Labs社製)に8μgのanti−Eck/EphA2,clone D7(以下及び図中で「抗EPHA2抗体(D7)」と略す:Millipore(Upstate)社製 #05−480)を加え、4℃で2時間転倒混和した。
3)−1−1で調製した細胞溶解液上清10μgをSDS−PAGEで分離後、ゲル中の蛋白質をPVDF膜に転写し、抗EPHA2抗体(D7)とサンプル蛋白量のコントロールとしてMonoclonal Anti−β−Actin clone AC−15(以下及び図中では「抗β−actin抗体」と略す:SIGMA社製 #A−5441)でウエスタンブロッティングを行った。具体的には、転写したPVDF膜をブロッキング液中で振とうしてブロッキングした後、PVDF膜を分子量70kDa付近を中心に剃刀で切断した。70kDa以上のPVDF膜をブロッキング液で0.25μg/mlに希釈した抗EPHA2抗体(D7)溶液に、70kDa以下のPVDF膜をブロッキング液で1000倍希釈した抗β−actin抗体溶液に浸し室温で1時間振とうした。各PVDF膜をTBSTで10分間、3回洗浄後、TBSTで3000倍に希釈したAnti−Mouse Ig,HRP−Linked Whole Ab Sheep溶液に浸し室温で30分間振とうした。各PVDF膜をTBSTで10分間、3回洗浄した後、ECL Plusを使用してNightOWL LB983(Berthold Technologies社)で検出した。バンドのシグナル強度の定量はGel−Pro Analyzer Version 4.5 for Windows(登録商標;Media Cybernetics社)で行った。
3)−2−1 エフェクター細胞の調製
ヌードマウスであるCAnN.Cg−Foxn1nu/CrlCrlj(日本チャールス・リバー社)より無菌的に脾臓を採取した。採取した脾臓を2枚のスライドグラスでホモジナイズし、BD Pharm Lyse(BD Biosciences社製 #555899)を用いて溶血処理を行った。得られた脾臓細胞をFetal Bovine Serum, Ultra−low IgG(Invitrogen社製)を10%含むフェノールレッド不含RPMI1640(Invitrogen社製)(以下「ADCC用培地」と略す。)に懸濁し、セルストレイナー(ポアサイズ40μm:BD Biosciences社製)を通した後、生細胞数をトリパンブルー色素排除試験にて計測した。脾臓細胞懸濁液を遠心後、培地を除去し、生細胞密度で1.5×107細胞/mlになるようADCC用培地で再懸濁しエフェクター細胞とした。
MDA−MB−231、A549、PC−3細胞をトリプシン処理し、10% FBS含有RPMI1640で細胞を洗浄後、10% FBS含有RPMI1640に再懸濁し、各細胞4×106個を0.22μmフィルターで滅菌したChromium−51(5550kBq)と混合し、37℃、5% CO2の条件下で1時間ラベルした。ラベルした細胞をADCC用培地で3回洗浄し、ADCC用培地で2×105細胞/mlになるよう再懸濁し標的細胞とした。
2×105細胞/mlの標的細胞を50μl/ウェルで96穴U底マイクロプレートに分注した。そこにエフェクター細胞添加後の終濃度で2.5μg/mlになるようADCC用培地で希釈したSH348−1、SH357−1、アイソタイプコントロール抗体(mIgG2a)を50μl添加し、4℃で1時間静置した。そこに1.5×107細胞/mlのエフェクター細胞を100μl添加し、37℃、5% CO2の条件下で一晩培養した。翌日、上清をLumaPlate(PerkinElmer社製)に回収し、ガンマカウンターで放出されたガンマ線量を測定した。ADCC活性による細胞溶解率は次式で算出した。
A:サンプルウェルのカウント
B:自然放出(抗体・エフェクター細胞非添加ウェル)カウントの平均値(n=3)。抗体添加時とエフェクター細胞添加時にそれぞれADCC用培地を50μl、100μl添加した。それ以外はサンプルウェルと同様の操作を行った。
10% FBS含有RPMI1640(抗生物質入り)に懸濁したMDA−MB−231、A549、PC−3細胞を96穴マイクロプレートに各5000細胞/ウェルで播種し、37℃、5% CO2の条件下で一晩培養した。翌日、補体添加後の終濃度で25μg/mlになるように10% FBS含有RPMI1640(抗生物質入り)で希釈したSH348−1、SH357−1、アイソタイプコントロール抗体(mIgG2a)を添加し、4℃で1時間静置した。そこにRPMI1640で30%に希釈したウサギ補体(CEDARLANE社製 #CL3051)を終濃度で5%になるよう添加し37℃、5% CO2の条件下で1時間インキュベートし、さらに室温で30分間静置した。細胞生存率を測定するため、培養液と等量のCellTiter−Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega社製)を添加し、室温で10分間攪拌した後、プレートリーダーで発光量を計測した。細胞生存率は次式で算出した。
a:サンプルウェルの発光量
b:バックグラウンド(細胞・抗体非添加ウェル)発光量の平均値(n=8)。細胞播種時に細胞懸濁液の代わりに等量の10% FBS含有RPMI1640(抗生物質入り)を添加し、抗体添加時に抗体希釈液と等量の10% FBS含有RPMI1640(抗生物質入り)を添加した。それ以外はサンプルウェルと同様の操作を行った。
3)−4−1 EPHA2部分ポリペプチド(rFnIII−NC、rFnIII−N、rFnIII−C)の作製
1)−1−3で作製した発現プラスミドで大腸菌BL21および大腸菌Origami(DE3)(Novagen社製)を形質転換し、50μg/mlのアンピシリン(Sigma社製)を添加したLB培地で培養を行い、BL21はAutoinduction System(Novagen社製)、Origami(DE3)は0.5mM IPTG添加でEPHA2部分ポリペプチドの発現誘導を行った。6000rpm、20分間遠心して集菌し、破砕バッファー(50mM Tris HCl pH7.5、150mM NaCl、0.1%(v/v) Triton−X100、10%(v/v) Glycerol)に懸濁した後、氷上で超音波破砕を行った。14000rpm、15分間遠心して、上清を回収し、Ni−NTA(Invitrogen社製) 0.5mlに供与した。洗浄バッファー(50mM Tris−HCl pH7.5、150mM NaCl、50mM Imidazole、10%(v/v) Glycerol)で洗浄した後に、溶出バッファー(50mM Tris−HCl pH7.5、150mM NaCl、400mM Imidazole、10%(v/v) Glycerol)にて溶出した。溶出サンプルは、PBSを溶媒としたゲル濾過カラムクロマトグラフィー(Superdex 75 10/300:GE Healthcare Bio−Sciences社製)でさらに精製された。得られた組換え蛋白質の濃度はProtein Assay(Bio−Rad社製)で測定した。
EPHB2−ECDを発現させるため、FreeStyle 293−F細胞に293fectinを用いてpcDNA3.1−EphA2−ECDをトランスフェクションし、37℃、8% CO2で72時間培養した。培養後、遠心分離により培養液を回収し、rEPHB2−EDC精製の原料とした。得られた培養上清を分子量分画15000の透析チューブを用いて20mM Tris−HCl pH7.5に対して透析し、フィルター濾過(0.45μm,PES)した後、20mM Tris−HCl pH7.5で平衡化されたHiPrep 16/10 Q XLに添加した。溶出はNaClの直線濃度勾配(20mM Tris−HCl pH7.5、0−1M NaCl)で行った。溶出画分の一部をSDS−PAGEで分離後、ゲルをCBB染色し、rEPHB2−ECDの含まれる画分を確認した。次にrEPHB2−ECDを含む画分を集め、PBSで平衡化されたHiLoad 26/60 Superdex 200pgに添加した。PBSで溶出し、溶出分画の一部をSDS−PAGEにより分離後、ゲルをCBB染色し、rEPHB2−ECDの含まれる画分を確認した。rEPHB2−ECDを含む画分を集め、エピトープ決定時の抗原として使用した。蛋白質濃度はBCA Protein Assay Reagentにより決定した。
rEPHA2−ECD、rFnIII−NC、rFnIII−N、rFnIII−Cとコントロール蛋白質のrEPHB2−ECDをPBSで1μg/mlに希釈し、イムノプレート(Nunc社製 #442404)にそれぞれ100μl/ウェルで分注し、4℃で一晩静置することでプレートに蛋白質を吸着させた。翌日、ウェル中の液を除去し、ブロックエース溶液(ブロックエース粉末1袋を100mlの超純水で溶解)をPBSで4倍希釈した溶液を200μl/ウェルで分注し、室温で1時間静置した。ウェル中の液を除去後、SH348−1、SH357−1、アイソタイプコントロール抗体(mIgG2a)を希釈緩衝液(PBS、0.05%(v/v) Tween 20)で5μg/mlに希釈したものを50μl/ウェルで添加した。室温で1時間静置後、ウェル中の液を除去し、希釈緩衝液で2回ウェルを洗浄した。希釈緩衝液で3000倍に希釈したGoat anti−Mouse IgG, Peroxidase Conjugatedを50μl/ウェルで添加し、室温で1時間静置した。ウェル中の液を除去し、希釈緩衝液で2回ウェルを洗浄した後、OPD発色液を100μl/ウェルで添加し攪拌しながら発色反応を行った。発色後、1M HClを100μl/ウェルで添加して発色反応を止め、プレートリーダーで490nmの吸光度を測定した。
MDA−MB−231細胞をトリプシン処理して培養フラスコより剥がした後、10% FBS含有RPMI1640(抗生物質入り)に懸濁後遠心し、上清を除去した。細胞を同培地で2回洗浄したあと、BDマトリゲル基底膜マトリックス(BD Biosciences社製)に懸濁し、6週齢のBALB/cAJcl−nu/nu((日本クレア社)に5×106細胞/マウスで背部皮下に移植した。移植日を0日目として9、16、23、30日目にSH348−1、SH357−1を500μg/マウスで腹腔内投与した。コントロールには抗体と同体積(500μl)のPBSを腹腔内投与した。腫瘍体積を9、13、16、20、23、28、30、34、37日目に測定し、抗体投与による抗腫瘍効果を検討した。その結果、SH348−1、SH357−1投与群ではPBS投与群に比べ、有意に腫瘍増殖が抑制された(37日目時点の腫瘍体積についてPBS投与群との比較でSH348−1、SH357−1のP値は共にP<0.001であった。P値はStudent’s t−testにより算出)。また、37日目時点での腫瘍増殖阻害率(=100‐(抗体投与群の腫瘍体積の平均値)/(PBS投与群の腫瘍体積の平均値)×100)はSH348−1で89.5%、SH357−1で84.1%であり、In vivoで非常に強い抗腫瘍効果が観察された(図6A、B)。
以上の結果より、SH348−1、SH357−1が従来報告のないエピトープ(配列表の配列番号8のアミノ酸番号426乃至534に示されるアミノ酸配列)を認識し抗腫瘍効果を示す抗体であることが明らかとなった。またSH348−1、SH357−1の結合領域がEPHA2を標的とした抗腫瘍モノクローナル抗体の有望な標的となることが示された。
マウス抗ヒトEPHA2抗体であるSH348−1、SH357−1の重鎖および軽鎖のN末端アミノ酸配列を決定するために、2)−8で精製したSH348−1、SH357−1を含む溶液の一部をSDS−PAGEで分離した。分離後のゲルからPVDF膜(ポアサイズ 0.45μm;Invitrogen社製)にゲル中の蛋白質を転写し、洗浄バッファー(25mM NaCl、10mM ホウ酸ナトリウムバッファー pH8.0)で洗浄した後、染色液(50% メタノール、20% 酢酸、0.05% クマシーブリリアントブルー)に5分間浸して染色してから、90% メタノールで脱色した。PVDF膜上で可視化された重鎖(移動度が小さい方のバンド)および軽鎖(移動度が大きい方のバンド)に相当するバンド部分を切りとり、Procise(登録商標) cLC プロテインシーケンサー Model 492cLC (Applied Biosystems)を用いて、自動エドマン法(Edman, P., et al. (1967) Eur. J. Biochem. 1, 80参照)によりそれぞれのN末端アミノ酸配列の同定を試みた。SH−348−1の重鎖については、上述の方法ではアミノ酸配列が同定できなかったため、Pfu Pyroglutamate Aminopeptidase(TAKARA社製)を用いてN末端ピログルタミン酸を除去後に同様の操作を行いN末端から2番目以降のアミノ酸配列を同定した。
I−Q−L−V−Q−S−G−P(配列表の配列番号26)であり、軽鎖に相当するバンドのN末端アミノ酸配列は、
D−V−L−M−T−Q−S−P−L−S−L(配列表の配列番号27)
であり、SH357−1の重鎖に相当するバンドのN末端アミノ酸配列は、
Q−I−Q−L−V−Q−S−G−P(配列表の配列番号28)
であり、軽鎖に相当するバンドのN末端アミノ酸配列は、
D−V−L−M−T−Q−T−P−L−S−L−P−V−S−L−G−D−Q−A(配列表の配列番号29)であった。これらのアミノ酸配列を、カバトらにより作成された抗体のアミノ酸配列データベース(Kabat, E. A. et al.,(1991) in Sequences of Proteins of Immunological Interest Vol. I及びII, U.S. Department of Health and Human Services参照)と比較したところ、SH348−1の重鎖(γ2a鎖)のサブタイプはmiscellaneousであり、軽鎖のサブタイプはkappa light IIであった。また、SH357−1の重鎖(γ2a鎖)のサブタイプはmiscellaneousであり、軽鎖のサブタイプはkappa light IIであることが判明した。
5’−cagatccagttggtgcagtctggacct−3’(DB3F1:配列表の配列番号30)
5’−aagatatctcatttacccggagtccgggagaa−3’(MIG2AEVR1:配列表の配列番号31)
5’−aagaattcatgaagttgcctgttagg−3’(MK19EIF1:配列表の配列番号32)
5’−aagatatcttaacactcattcctgttgaagct−3’(KEVR1:配列表の配列番号33)
SH348−1,SH357−1の重鎖及び軽鎖をコードするcDNAをクローニングするため、SH348−1、SH357−1産生ハイブリドーマよりQuick Prep mRNA Purification Kit(GE Healthcare Bio−Sciences社製 #27−9254−01)を用いてmRNAを調製した。このようにして得られたそれぞれのmRNAからTaKaRa One Step RNA PCR Kit(AMV)(タカラバイオ社製 #RR024A)と重鎖用プライマーセット(DB3F1及びMIG2AEVR1の組み合わせ)または軽鎖用プライマーセット(MK19EIF1及びKEVR1の組み合わせ)を用いて各抗体の重鎖、軽鎖をコードするcDNAを増幅した。これらPCRで増幅されたcDNAをZero Blunt TOPO PCR Cloning Kit(Invitrogen社製)を用いてクローニングし、クローニングされた重鎖、軽鎖の各ヌクレオチド配列を遺伝子配列解析装置(「ABI PRISM 3700 DNA Analyzer;Applied Biosystems」あるいは「Applied Biosystems 3730xl Analyzer;Applied Biosystems」)を用いて決定した。シーケンスの反応は、GeneAmp 9700(Applied Biosystems)を用いた。
EPHA2細胞外領域ポリペプチド(R&D Systems社製。#3035−A2−100)又はコントロールとしてとしてBovine Serum Albmin(以下、本文及び図中で「BSA」と略す。)をPBSで1μg/mlに希釈した溶液を、イムノプレート(Nunc社製 #442404)に100μl/ウェルで分注し、4℃で一晩静置することでプレートに吸着させた。
実施例6に記載の方法に準じてEPHA2細胞外領域ポリペプチド(R&D Systems社製:#3035−A2−100)が固定されたイムノプレートを作製した。イムノプレートのウェルを希釈緩衝液で2回洗浄した後、SH348−1、SH357−1、Ab96−1、アイソタイプコントロール抗体としてMouse IgG2A Isotype Control(以下及び図中で「mIgG2a」と略す;R&D Systems社製:#MAB003)を希釈緩衝液で10μg/ml、50μg/mlに希釈したものをそれぞれ100μl/ウェルで添加した。室温で1時間静置後、終濃度で1μg/mlになるよう、可溶性リガンドであるRecombinant Mouse Ephrin−A1/Fc Chimera(以下及び図中で「Ephrin−A1/Fc」と略す;R&D Systems社製:#602−A1−200。)又は可溶性リガンドに対する陰性コントロール蛋白質としてRecombinant Human IgG1 Fc(以下及び図中で「hG1Fc」と略す;R&D Systems社製:#110−HG−100)を添加し室温で1時間静置した。
8)−1 細胞溶解液の調製
10% FBS、50単位/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシン含有RPMI1640(以下、「10% FBS含有RPMI1640(抗生物質入り)」と略す。)に懸濁したMDA−MB−231細胞を2.5×105細胞/ウェルになるよう12ウェルディッシュに播種し、37℃、5% CO2の条件下で一晩培養した。次にウェル中の培地を捨て、新たにRPMI1640を添加し、37℃、5% CO2の条件下でさらに一晩培養した。次にウェル中の培地を除去し、各ウェルにRPMI1640のみ、または10μg/ml又は50μg/mlの濃度の抗体(mIgG2a、SH348−1又はSH357−1)を含むRPMI1640を各ウェルに添加し、37℃、5% CO2の条件下で1時間プレインキュベーションした。
1サンプル当たり、25μlのProtein G magnetic beads懸濁液(NEW ENGLAND Bio−Labs社製)及び4μgのanti−EphA2 Antibody(Santa Cruz Biotechnology社製 #sc−924)を加え、4℃で2時間転倒混和した。次に、終濃度で10%になるようFBSを加え、さらに4℃で30分間転倒混和した。次にビーズ(beads)をPPCLBで洗浄し、8)−1で調製した細胞溶解液上清を200μg加え、4℃で一晩転倒混和した。
図10に示される領域からなるEPHA2の欠損変異体を作製し、SH348−1、SH357−1結合領域を決定した。
EPHA2欠損変異体をN末端にGST−TagとHis−Tag、C末端にS−Tagを付加した形で蛋白質を発現させるため、下記のプライマーを合成し、以下の方法で増幅した遺伝子断片をpET−49b(+)(Novagen社製)にクローニングした。
5’−attaggatccgagcttccgtactgccagtgtc−3’(プライマーN1:配列番号82)
5’−attaggatccgccccccaaggtgaggct−3’(プライマーN2:配列番号83)
5’−attaggatccggtcacttaccgcaagaagggaga−3’(プライマーN3:配列番号84)
5’−attaggatccggtccaggtgcaggcactgacg−3’(プライマーN4:配列番号85)
5’−aattaagcttgccgccaatcaccgccaagtt−3’(プライマーC1:配列番号86)
5’−aattaagcttgttgccagatccctccggggac−3’(プライマーC2:配列番号87)
5’−aattaagcttcaggtaggtggtgtctggg−3’(プライマーC3:配列番号88)
5’−aattaagcttctcgtacttccacactcggc−3’(プライマーC4:配列番号89)
配列表の配列番号8の、アミノ酸番号426乃至540に示されるアミノ酸配列からなる領域(以下、「m1」という。)をプライマーN1とC1を用いて、アミノ酸番号426乃至534に示されるアミノ酸配列からなる領域(以下、「m2」という。)をプライマーN1とC2を用いて、アミノ酸番号426乃至504に示されるアミノ酸配列からなる領域(以下、「m3」という。)をプライマーN1とC3を用いて、アミノ酸番号426乃至470に示されるアミノ酸配列からなる領域(以下、「m4」という。)をプライマーN1とC4を用いて、アミノ酸番号439乃至534に示されるアミノ酸配列からなる領域(以下、「m5」という。)をプライマーN2とC2を用いて、アミノ酸番号471乃至534に示されるアミノ酸配列からなる領域(以下、「m6」という。)をプライマーN3とC2を用いて、アミノ酸番号505乃至534に示されるアミノ酸配列からなる領域(以下、「m7」という。)をプライマーN4とC2を用いて、アミノ酸番号439乃至504に示されるアミノ酸配列からなる領域(以下、「m8」という。)をプライマーN2とC3を用いて、アミノ酸番号439乃至470に示されるアミノ酸配列からなる領域(以下、「m9」という。)をプライマーN2とC4を用いて、それぞれpcDNA−DEST40−EPHA2を鋳型にPCR反応で増幅した。得られたPCR産物をBamHI及びHindIIIで切断し、pET−49b(+)のBamHI/HindIIIサイトにサブクローニングした。
上記9)−1で構築したプラスミドDNA及び陰性コントロールとしてpET−49b(+)を用いて、大腸菌BL21(DE3)を形質転換した。得られた形質転換体を30μg/mlのカナマイシン(Invitrogen社製)を添加したLB培地で培養し、Autoinduction System(Novagen社製)によりEPHA2欠損変異体の発現誘導を行った。菌体を遠心により回収し、PBSで洗浄後、菌体を1mM PMSFとプロテアーゼインヒビターカクテル(SIGMA社製:#P8340)を含有する2%SDS溶液で溶解した。遠心して上清を回収し、エピトープ同定に用いた。
上記9)−2で調製したEPHA2欠損変異体を含む溶解液をSDS−sample bufferに溶解して98℃で5分間過熱したサンプルをSDS−PAGEで分離し、ゲル中の蛋白質をPVDF膜に転写した。転写後のPVDF膜を、ブロッキング液(ブロックエース粉末1袋を100mlの超純水に溶解後、Tween 20、アジ化ナトリウムをそれぞれ終濃度で0.1%(v/v)、0.02%(w/v)になるよう添加)中で振とうしブロッキングした後、このPVDF膜を2μg/mlのSH348−1又はSH357−1を含むブロッキング液中で4℃で一晩反応させた。このPVDF膜をTBSTで10分間、3回洗浄し、Anti−Mouse Ig,HRP−Linked Whole Ab SheepをTBSTで5000倍希釈した溶液中でさらに室温で30分間反応させた。続いてTBSTで10分間、3回洗浄した後、ECL Plusを使用し化学発光用フィルム上にシグナルを検出した。
10)−1 SH348−1のヒト化抗体の設計
10)−1−1 SH348−1の可変領域の分子モデリング
SH348−1の可変領域の分子モデリングを相同性モデリング(Methods in Enzymology,203,121−153,(1991))によって行った。Protein Data Bank(Nuc.Acid Res.35,D301−D303(2007))に登録されるヒト免疫グロブリンの可変領域の1次配列(X線結晶構造から誘導される三次元構造が入手可能である)を、実施例5で決定されたSH348−1の可変領域と比較した。結果として、2JELおよび1A4Jが、それぞれ、SH348−1の軽鎖および重鎖の可変領域に対して最も高い配列相同性を有する配列として選択された。フレームワーク領域の三次元構造は、SH348−1の軽鎖および重鎖に対応する2JELおよび1A4Jの座標を組み合わせて、「フレームワークモデル」を得ることによって作製した。SH348−1のCDRは、Thornton et al.(J.Mol.Biol.,263,800−815,(1996))の分類に従って、CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1及びCDRH2は、それぞれクラスター16A、7A、9A、10A、10Aに割り当てられた。CDRH3は、H3ルール(FEBS letter 399,1−8(1996))を使用して、e(9)Dに分類された。次いで、それぞれのCDRについての代表的なコンホメーションがフレームワークモデルに組み込んだ。
ヒト化SH348−1抗体の構築は、CDRグラフティング(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029−10033(1989))によって行った。アクセプター抗体は、フレームワーク領域内のアミノ酸相同性に基づいて選択された。SH348−1のフレームワーク領域の配列を、抗体のアミノ酸配列のKabatデータベース(Nuc.Acid Res.29,205−206(2001))の全てのヒトフレームワークと比較し、GSD2B5B10‘CL抗体がフレームワーク領域についての72%の最も高い配列相同性に起因して、アクセプターとして選択された。GSD2B5B10‘CLについてのフレームワーク領域のアミノ酸残基を、SH348−1についてのアミノ酸残基と整列させ、異なるアミノ酸が使用される位置を同定した。これらの残基の位置は、上で構築されたSH348−1の三次元モデルを使用して分析され、そしてアクセプター上にグラフティングされるべきドナー残基が、Queen et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029−10033(1989))によって与えられる基準によって選択された。選択されたいくつかのドナー残基をアクセプター抗体GSD2B5B10‘CLに移入することによって、ヒト化SH348−1配列を決定した。その結果、以下に示すように、軽鎖について2タイプ、重鎖について2タイプのヒト化配列を取得した。以下、可変領域、定常領域、CDRについてはカバトらにより作成された抗体のアミノ酸配列データベースを元に分類された。
10−1−3−1)hSH−348−T1Lタイプ軽鎖:
配列表の配列番号37に示されるSH348−1の軽鎖可変領域のアミノ酸番号2(バリン)、3(ロイシン)、14(セリン)、15(ロイシン)、17(アスパラギン酸)、18(グルタミン)、50(リジン)、79(アルギニン)、88(ロイシン)、105(グリシン)、109(ロイシン)、114(アラニン)をそれぞれイソロイシン、バリン、トレオニン、プロリン、グルタミン酸、プロリン、グルタミン、リジン、バリン、グルタミン、バリン、トレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化SH348−1軽鎖を設計し、「hSH−348−T1Lタイプ軽鎖」と命名した。
配列表の配列番号37に示されるSH348−1の軽鎖可変領域のアミノ酸番号14(セリン)、15(ロイシン)、17(アスパラギン酸)、18(グルタミン)、50(リジン)、79(アルギニン)、88(ロイシン)、105(グリシン)、109(ロイシン)、114(アラニン)、をそれぞれトレオニン、プロリン、グルタミン酸、プロリン、グルタミン、リジン、バリン、グルタミン、バリン、トレオニンにることを伴い設計されたヒト化SH348−1軽鎖を設計し、「hSH348−1−T3Lタイプ軽鎖」と命名した。
10−1−4−1)hSH348−1−T1Hタイプ重鎖:
配列表の配列番号43に示されるSH348−1の重鎖可変領域のアミノ酸番号2(イソロイシン)、9(プロリン)、11(ロイシン)、16(グルタミン酸)、17(トレオニン)、20(イソロイシン)、38(リジン)、43(リジン)、46(リジン)、68(フェニルアラニン)、69(アラニン)、70(フェニルアラニン)、71(セリン)、72(ロイシン)、73(グルタミン酸)、76(アラニン)、80(フェニルアラニン)、82(グルタミン)、83(イソロイシン)、84(アスパラギン)、85(アスパラギン)、87(リジン)、88(アスパラギン)、93(トレオニン)、95(フェニルアラニン)、114(トレオニン)、115(ロイシン)、をそれぞれバリン、アラニン、バリン、セリンセリン、バリン、アルギニン、グルタミン、グルタミン酸、バリン、トレオニン、イソロイシン、トレオニン、アラニン、アスパラギン酸、トレオニン、チロシン、グルタミン酸、ロイシン、セリン、セリンアルギニン、セリン、バリン、チロシン、ロイシン、バリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化SH348−1重鎖を設計し、「hSH348−1−T1Hタイプ重鎖」と命名した。
配列表の配列番号43に示されるSH348−1の重鎖可変領域のアミノ酸番号9(プロリン)、11(ロイシン)、16(グルタミン酸)、17(トレオニン)、20(イソロイシン)、38(リジン)、43(リジン)、73(グルタミン酸)、76(アラニン)、80(フェニルアラニン)、82(グルタミン)、83(イソロイシン)、84(アスパラギン)、85(アスパラギン)、87(リジン)、88(アスパラギン)、93(トレオニン)、95(フェニルアラニン)、114(トレオニン)、115(ロイシン)をそれぞれアラニン、バリン、セリン、セリン、バリン、アルギニン、グルタミン、アスパラギン酸、トレオニン、チロシン、グルタミン酸、ロイシン、セリン、セリン、アルギニン、セリン、バリン、チロシン、ロイシン、バリン、に置き換えることを伴い設計されたヒト化SH348−1重鎖を設計し、「hSH348−1−T3Hタイプ重鎖」と命名した。
10)−2−1 SH357−1の可変領域の分子モデリング
上記10)−1−1と同様の方法で、2JELおよび1A4Jが、それぞれ、SH357−1の軽鎖および重鎖の可変領域に対して最も高い配列相同性を有する配列として選択され、CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1及びCDRH2は、それぞれクラスター16A、7A、9A、10A、10Aに割り当てられた。CDRH3は、e(9)Dに分類された。
10)−1−2と同様の方法によって、GSD2B5B10‘CL抗体がアクセプターとして選択され、ヒト化SH357−1の配列を決定した。その結果、以下に示すように、軽鎖について2タイプ、重鎖について2タイプのヒト化配列を取得した。
10−2−3−1)hSH357−1−T1Lタイプ軽鎖:
配列表の配列番号41に示されるSH357−1の軽鎖のアミノ酸番号2(バリン)、3(ロイシン)、7(トレオニン)、14(セリン)、15(ロイシン)、17(アスパラギン酸)、18(グルタミン)、50(リジン)、88(ロイシン)、105(グリシン)、109(ロイシン)、114(アラニン)をそれぞれイソロイシン、バリン、セリン、トレオニン、プロリン、グルタミン酸、プロリン、グルタミン、バリン、グルタミン、バリン、トレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化SH357−1軽鎖を、「hSH357−1−T1Lタイプ軽鎖」と命名した。
配列番号41に示されるSH357−1軽鎖のアミノ酸番号7(トレオニン)、14(セリン)、15(ロイシン)、17(アスパラギン酸)、18(グルタミン)、50(リジン)、88(ロイシン)、105(グリシン)、109(ロイシン)、114(アラニン)をそれぞれセリン、トレオニン、プロリン、グルタミン酸、プロリン、グルタミン、バリン、グルタミン、バリン、トレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化SH357−1軽鎖を、「hSH357−1−T3Lタイプ軽鎖」と命名した。
10−2−4−1)hSH357−1−T1Hタイプ重鎖:
配列表の配列番号51に示されるSH357−1の重鎖可変領域のアミノ酸番号2(イソロイシン)、9(プロリン)、11(ロイシン)、16(グルタミン酸)、17(トレオニン)、20(イソロイシン)、38(リジン)、43(リジン)、46(リジン)、68(フェニルアラニン)、69(アラニン)、70(フェニルアラニン)、71(セリン)、72(ロイシン)、73(グルタミン酸)、76(アラニン)、82(グルタミン)、83(イソロイシン)、85(アスパラギン)、87(リジン)、88(アスパラギン)、93(セリン)、95(フェニルアラニン)、114(トレオニン)、115(ロイシン)をそれぞれバリン、アラニン、バリン、アラニン、セリン、バリン、アルギニン、グルタミン、グルタミン酸、バリン、トレオニン、イソロイシン、トレオニン、アラニン、アスパラギン酸、トレオニン、グルタミン酸、ロイシン、セリン、アルギニン、セリン、バリン、チロシン、ロイシン、バリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化SH357−1重鎖を設計し、「hSH357−1−T1Hタイプ重鎖」と命名した。
配列番号51に示されるSH357−1の重鎖可変領域のアミノ酸番号9(プロリン)、11(ロイシン)、16(グルタミン酸)、17(トレオニン)、20(イソロイシン)、38(リジン)、43(リジン)、73(グルタミン酸)、76(アラニン)、82(グルタミン)、83(イソロイシン)、85(アスパラギン)、87(リジン)、88(アスパラギン)、93(セリン)、95(フェニルアラニン)、114(トレオニン)、115(ロイシン)をそれぞれアラニン、バリン、アラニン、セリン、バリン、アルギニン、グルタミン、アスパラギン酸、トレオニン、グルタミン酸、ロイシン、セリン、アルギニン、セリン、バリン、チロシン、ロイシン、バリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化SH357−1重鎖を設計し、「hSH357−1−T3Hタイプ重鎖」と命名した。
ヒト化SH348−1及びヒト化SH357−1の活性を測定するために、実施例10で取得されたヒト化抗EPHA2抗体の重鎖又は軽鎖を有するプラスミドを以下のように構築した。
11)−1−1 ヒト化抗体軽鎖発現汎用ベクター(pEF6/KCL)の作製
配列表の配列番号154に記されるヒト抗体軽鎖シグナル配列およびヒトIg軽鎖(κ鎖)定常領域をコードする遺伝子を合成し(インビトロジェン社 人工遺伝子合成サービス)、制限酵素NheIおよびPmeIで切り出されるDNA断片を、ベクターpEF6/V5−HisB(インビトロジェン社)のNheI/PmeIサイトに導入し、ヒト化抗体軽鎖発現汎用ベクター(pEF6/KCL)を構築した。
11)−1−2 ヒト化抗体重鎖発現汎用ベクター(pEF1/FCCU−1)の作製
配列表の配列番号155に記されるヒト抗体重鎖シグナル配列およびヒトIgG1定常領域をコードする遺伝子を合成し(インビトロジェン社 人工遺伝子合成サービス)、制限酵素NheIおよびPmeIで切り出されるDNA断片を、ベクターpEF1/myc−HisB(インビトロジェン社)のNheI/PmeIサイトに導入し、ヒト化抗体H鎖発現汎用ベクター(pEF1/FCCU−1)を構築した。
配列表の配列番号156、157にそれぞれ示される、分泌シグナルと融合したhSH348−1−T1L又はhSH348−1−T3Lタイプ軽鎖可変領域をコードする遺伝子を含むDNAを合成し(インビトロジェン社 人工遺伝子合成サービス)、制限酵素NdeIおよびBsiWIで切り出されたDNA断片を、ヒト化抗体軽鎖発現汎用ベクター(pEF6/KCL)を制限酵素NdeIおよびBsiWIで切断した箇所に挿入することにより、hSH348−1−T1L、hSH348−1−T3Lタイプ軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターをそれぞれ「pEF6/KCL/hSH348−1−T1L」、「pEF6/KCL/hSH348−1−T3L」と命名した。
配列表の配列番号158、159にそれぞれ示される、hSH348−1−T1H又はhSH348−1−T3Hタイプ重鎖可変領域をコードするする遺伝子を含むDNAを合成し(インビトロジェン社 人工遺伝子合成サービス)、制限酵素BlpIで切り出されるDNA断片を、ヒト化抗体H鎖発現汎用ベクター(pEF1/FCCU−1)を制限酵素BlpIで切断した箇所に挿入することにより、hSH348−1−T1H、hSH348−1−T3Hタイプ重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターをそれぞれ「pEF1/FCCU/hSH348−1−T1H」、「pEF1/FCCU/hSH348−1−T3H」と命名した。
配列表の配列番号160、161にそれぞれ示される分泌シグナルと融合したhSH357−1−T1LまたはhSH357−1−T3Lタイプ軽鎖可変領域をコードする遺伝子を含むDNAを合成し(インビトロジェン社 人工遺伝子合成サービス)、制限酵素NdeIおよびBsiWIで切り出されたDNA断片を、ヒト化抗体L鎖発現汎用ベクター(pEF6/KCL)を制限酵素NdeIおよびBsiWIで切断した箇所に挿入することにより、hSH357−1−T1L、hSH357−1−T3Lタイプ軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターをそれぞれ「pEF6/KCL/hSH357−1−T1L」、「pEF6/KCL/hSH357−1−T3L」と命名した。
配列表の配列番号162、163にそれぞれ示される、hSH357−1−T1HまたはhSH357−1−T3Hタイプ重鎖可変領域をコードするする遺伝子を含むDNAを合成し(インビトロジェン社 人工遺伝子合成サービス)、制限酵素BlpIで切り出されたDNA断片を、ヒト化抗体H鎖発現汎用ベクター(pEF1/FCCU−1)を制限酵素BlpIで切断した箇所に挿入することにより、hSH357−1−T1H、hSH357−1−T3Hタイプ重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターをそれぞれ「pEF1/FCCU/hSH357−1−T1H」、「pEF1/FCCU/hSH357−1−T3H」と命名した。
対数増殖期の293FreeStyle細胞 1.2×109 を新鮮な1.2LのFreeStyle293 Expression Medium(Invitrogen社)に播種し、37℃、8%CO2インキュベータで振とう培養した(125rpm)。Polyethyleneimine(Polyscience #24765)12mgをOpti−ProSFM培地(Invitrogen社製)40mLに溶解し、室温で5分間放置した。PureLink HiPure Plasmid キット(Invitrogen社)を用いて調製したH鎖発現プラスミド(0.6mg)およびL鎖発現プラスミド(1.8mg)を40mLのOpti−ProSFM培地(Invitrogen社)に懸濁した。室温で5分間放置したPolyethyleneimine/OptiProSFM混合液40mLに、発現プラスミド/OptiProSFM混合液40mLを加え、さらに室温5分間放置した。次にPolyethyleneimine/発現プラスミド/OptiProSFM混合液80mLを293FreeStyle細胞懸濁液に添加し、振とう培養を続けた。37℃、8%CO2中で7日間培養したのち、培養上清を回収した。
上記11)−3で得られた培養上清をDisposable Capsu2le Filter (Advabtec #CCS−045−E1H)でろ過したのち、ProteinAアフィニティカラムクロマトグラフィーで精製した。PBSで平衡化したMabSelectSuReHiTrap 1mL (GE Healthcare Bio−science社製)に培養上清をアプライし、PBSで洗浄した。次に2Mアルギニン溶液(pH4.0)をアプライし、抗体の含まれる画分を集めた。pHを7に調整し、あらかじめPBSで平衡化したHiPrep Desalting カラム(26/10, 50mL)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社)に供与し、PBSに置換したのち、0.2μmのフィルターを通して精製サンプルとした。
また、pEF6/KCL/hSH357−1−T1LとpEF1/FCCU/hSH357−1−T1Hとの組合せによって取得されたSH357−1のヒト化抗体をhSH357−1−T1、pEF6/KCL/hSH357−1−T3LとpEF1/FCCU/hSH357−1−T3Hとの組合せによって取得されたSH357−1のヒト化抗体を「hSH357−1−T3」と命名した。
hSH348−1−T1、hSH348−1−T3、hSH357−1−T1及びhSH357−1−T3の抗原結合能を2次抗体としてPeroxidase AffiniPure Goat Anti−Human IgG Fcγ Fragment Specific(Jackson ImmunoResearch社製 #109−035−098)を用いる点を除き、実施例6に記載の方法に準じて行った。
SH348−1のEPHA2への結合に対するhSH348−1−T1、hSH348−1−T3の競合阻害活性およびSH357−1のEPHA2への結合に対するhSH357−1−T1、hSH357−1−T3の競合阻害活性を以下の方法で測定した。
実施例8に記載の方法に準じてヒト化抗EPHA2抗体のEphrin−A1依存的EPHA2チロシン残基リン酸化能を調べた。その結果、hSH348−1−T1、hSH348−1−T3、hSH357−1−T1、hSH357−1−T3のいずれもEphrin−A1/Fcにより誘導されるEPHA2チロシン残基リン酸化を抑制する活性を維持していることが示された(図14)。
Claims (45)
- ハイブリドーマSH348−1(FERM BP−10836)が産生する抗体によって認識されるエピトープを認識する抗体。
- 以下のa)乃至d)に示される性質を有する、請求項1に記載の抗体:
a)EPHA2チロシン残基のリン酸化能を有さない;
b)EPHA2発現細胞に対してADCC活性を有する;
c)EPHA2発現細胞に対してCDC活性を有する;
d)In vivoで抗腫瘍活性を有する。 - 以下のa)乃至e)に示される性質を有する、請求項1に記載の抗体:
a)EPHA2チロシン残基のリン酸化能を有さない;
b)EPHA2蛋白質量の減少作用を示す;
c)EPHA2発現細胞に対してADCC活性を有する;
d)EPHA2発現細胞に対してCDC活性を有する;
e)In vivoで抗腫瘍活性を有する。 - 配列表の配列番号8のアミノ酸番号426乃至534に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体。
- 配列表の配列番号8のアミノ酸番号426乃至534に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合し、以下のa)乃至d)に示される性質を有する抗体:
a)EPHA2チロシン残基のリン酸化能を有さない;
b)EPHA2発現細胞に対してADCC活性を有する;
c)EPHA2発現細胞に対してCDC活性を有する;
d)In vivoで抗腫瘍活性を有する。 - 配列表の配列番号8のアミノ酸番号426乃至534に示されるアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合し、以下のa)乃至e)に示される性質を有する抗体:
a)EPHA2チロシン残基のリン酸化能を有さない;
b)EPHA2蛋白質量の減少作用を示す;
c)EPHA2発現細胞に対してADCC活性を有する;
d)EPHA2発現細胞に対してCDC活性を有する;
e)In vivoで抗腫瘍活性を有する。 - 配列表の配列番号8のアミノ酸番号439乃至534に示されるアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する、請求項1乃至6から選択されるいずれか一つに記載の抗体。
- EPHA2リガンドにより誘導されるEPHA2チロシン残基のリン酸化を抑制する、請求項1乃至7から選択されるいずれか一つに記載の抗体。
- EPHA2リガンドのEPHA2に対する結合を阻害するのではなく、リガンドにより誘導されるEPHA2チロシン残基のリン酸化を抑制する、請求項1乃至7から選択されるいずれか一つに記載の抗体。
- 重鎖可変領域の相補性決定領域として、配列表の配列番号59、61及び63に示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域の相補性決定領域として、配列表の配列番号65、67及び69に示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する、配列表の配列番号8に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体。
- 以下の1)及び2)の特徴を有する、配列表の配列番号8に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体:
1)一般式(I)で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ペプチドを有する;
−FRH1−CDRH1−FRH2−CDRH2−FRH3−CDRH3−FRH4−(I)
(式中、FRH1は18乃至30個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、CDRH1は配列表の配列番号59で示されるアミノ酸配列又は1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、FRH2は14個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、CDRH2は配列表の配列番号61で示されるアミノ酸配列又は1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、FRH3は32個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、CDRH3は配列表の配列番号63で示されるアミノ酸配列又は1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、FRH4は11個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。);
2)一般式(II)で示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖ポリペプチドを有する;
−FRL1−CDRL1−FRL2−CDRL2−FRL3−CDRL3−FRL4−(II)
(式中、FRL1は23個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、CDRL1は配列表の配列番号65で示されるアミノ酸配列又は1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、FRL2は15個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、CDRL2は配列表の配列番号67で示されるアミノ酸配列を示し、FRL3は32個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、CDRL3は配列表の配列番号69で示されるアミノ酸配列又は1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、FRL4は10個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。)。 - ハイブリドーマSH357−1(FERM BP−10837)が産生する抗体によって認識されるエピトープを認識する抗体。
- 以下のa)乃至d)に示される性質を有する、請求項12に記載の抗体:
a)EPHA2チロシン残基のリン酸化能を有さない;
b)EPHA2発現細胞に対してADCC活性を有する;
c)EPHA2発現細胞に対してCDC活性を有する;
d)In vivoで抗腫瘍活性を有する。 - 配列表の配列番号8のアミノ酸番号426乃至534に示されるアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合し、以下のa)乃至e)に示される性質を有する抗体:
a)EPHA2チロシン残基のリン酸化能を有さない;
b)EPHA2蛋白質量の減少作用を示さない;
c)EPHA2発現細胞に対してADCC活性を有する;
d)EPHA2発現細胞に対してCDC活性を有する;
e)In vivoで抗腫瘍活性を有する。 - 配列表の配列番号8のアミノ酸番号439乃至534に示されるアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する、請求項12乃至14から選択されるいずれか一つに記載の抗体。
- EPHA2リガンドにより誘導されるEPHA2チロシン残基のリン酸化を抑制する、請求項12乃至15から選択されるいずれか一つに記載の抗体。
- EPHA2リガンドのEPHA2に対する結合を阻害するのではなく、リガンドにより誘導されるEPHA2チロシン残基のリン酸化を抑制する、請求項12乃至15から選択されるいずれか一つに記載の抗体。
- 重鎖可変領域の相補性決定領域として、配列表の配列番号71、73及び75に示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域の相補性決定領域として、配列表の配列番号77、79及び81に示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する、配列表の配列番号8に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体。
- 以下の1)及び2)に示される特徴を有する、配列表の配列番号8に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体:
1)一般式(I)で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ペプチドを有する;
−FRH1−CDRH1−FRH2−CDRH2−FRH3−CDRH3−FRH4−(I)
(式中、FRH1は18乃至30個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、CDRH1は配列表の配列番号71で示されるアミノ酸配列又は1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、FRH2は14個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、CDRH2は配列表の配列番号73で示されるアミノ酸配列又は1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、FRH3は32個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、CDRH3は配列表の配列番号75で示されるアミノ酸配列又は1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、FRH4は11個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。);
2)一般式(II)で示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖ポリペプチドを有する;
−FRL1−CDRL1−FRL2−CDRL2−FRL3−CDRL3−FRL4−(II)
(式中、FRL1は23個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、CDRL1は配列表の配列番号77で示されるアミノ酸配列又は1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、FRL2は15個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、CDRL2は配列表の配列番号79で示されるアミノ酸配列又は1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、FRL3は32個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を表し、CDRL3は配列表の配列番号81で示されるアミノ酸配列又は1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、FRL4は10個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸はそれぞれペプチド結合で連結している。)。 - ヒト化抗体であることを特徴とする、請求項1乃至19から選択されるいずれか1つに記載の抗体。
- ヒト抗体であることを特徴とする、請求項1乃至19から選択されるいずれか1つに記載の抗体。
- IgG抗体であることを特徴とする、請求項1乃至19から選択されるいずれか1つに記載の抗体。
- Fab、F(ab’)2、Fv、scFV、ディアボディー、線状抗体及び多特異的抗体から選択されるいずれかであることを特徴とする、請求項1乃至9及び、12乃至17から選択されるいずれか1つに記載の抗体。
- ハイブリドーマSH348−1(FERM BP−10836)が産生する抗体。
- ハイブリドーマSH357−1(FERM BP−10837)が産生する抗体。
- 以下の1)及び2)からなる抗体:
1)配列表の配列番号35のアミノ酸番号1乃至119に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド又は配列表の配列番号39のアミノ酸番号1乃至119に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド;
2)配列表の配列番号37のアミノ酸番号1乃至112に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド又は配列表の配列番号41のアミノ酸番号1乃至112に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド。 - 以下の1)又は2)からなる抗体:
1)配列表の配列番号35のアミノ酸番号1乃至119に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド及び、配列表の配列番号37のアミノ酸番号1乃至112に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド;
2)配列表の配列番号39のアミノ酸番号1乃至119に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド及び、配列表の配列番号41のアミノ酸番号1乃至112に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド。 - 以下の1)及び2)からなる抗体:
1)配列表の配列番号35に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド又は配列表の配列番号39に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド;
2)配列表の配列番号37に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド又は配列表の配列番号41に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド。 - 以下の1)又は2)からなる抗体:
1)配列表の配列番号35に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド及び、配列表の配列番号37に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド;
2)配列表の配列番号39に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド及び、配列表の配列番号41に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド。 - 請求項24乃至29から選択されるいずれか1つに記載の抗体をヒト化した抗体。
- 以下の1)及び2)からなる抗体:
1)配列表の配列番号107のアミノ酸番号20乃至468に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド又は配列表の配列番号115のアミノ酸番号20乃至468に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド;
2)配列表の配列番号91のアミノ酸番号21乃至239に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド又は配列表の配列番号99のアミノ酸番号21乃至239に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド。 - 以下の1)又は2)からなる抗体:
1)配列表の配列番号107のアミノ酸番号20乃至468に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド及び、配列表の配列番号91のアミノ酸番号21乃至239に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド;
2)配列表の配列番号115のアミノ酸番号20乃至468に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド及び、配列表の配列番号99のアミノ酸番号21乃至239に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド。 - 以下の1)及び2)からなる抗体:
1)配列表の配列番号139のアミノ酸番号20乃至468に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド又は配列表の配列番号147のアミノ酸番号20乃至468に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド;
2)配列表の配列番号123のアミノ酸番号21乃至239に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド又は配列表の配列番号131のアミノ酸番号21乃至239に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド。 - 以下の1)又は2)からなる抗体:
1)配列表の配列番号139のアミノ酸番号20乃至468に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド及び、配列表の配列番号123のアミノ酸番号21乃至239に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド;
2)配列表の配列番号147のアミノ酸番号20乃至468に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド及び、配列表の配列番号131のアミノ酸番号21乃至239に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド。 - 請求項24乃至34から選択されるいずれかに記載の抗体の、Fab、F(ab’)2、Fv、scFV、ディアボディー、線状抗体及び多特異的抗体から選択されるいずれか一つ。
- 以下の1)乃至20)からなる群から選択されるいずれか一つのポリペプチド:
1)配列表の配列番号35のアミノ酸番号1乃至119に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
2)配列表の配列番号39のアミノ酸番号1乃至119に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
3)配列表の配列番号37のアミノ酸番号1乃至112に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
4)配列表の配列番号41のアミノ酸番号1乃至112に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
5)配列表の配列番号107のアミノ酸番号20乃至468に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
6)配列表の配列番号115のアミノ酸番号20乃至468に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
7)配列表の配列番号107のアミノ酸番号20乃至138に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
8)配列表の配列番号115のアミノ酸番号20乃至138に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
9)配列表の配列番号91のアミノ酸番号21乃至239に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
10)配列表の配列番号99のアミノ酸番号21乃至239に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
11)配列表の配列表の配列番号91のアミノ酸番号21乃至134に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
12)配列表の配列番号99のアミノ酸番号21乃至134に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
13)配列表の配列番号139のアミノ酸番号20乃至468に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
14)配列表の配列番号147のアミノ酸番号20乃至468に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
15)配列表の配列番号139のアミノ酸番号20乃至138に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
16)配列表の配列番号147のアミノ酸番号20乃至138に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
17)配列表の配列番号123のアミノ酸番号21乃至239に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
18)配列表の配列番号131のアミノ酸番号21乃至239に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
19)配列表の配列番号123のアミノ酸番号21乃至134に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
20)配列表の配列番号131のアミノ酸番号21乃至134に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。 - マウスハイブリドーマSH−348−1(FERM BP−10836)。
- マウスハイブリドーマSH−357−1(FERM BP−10837)。
- 請求項1乃至36から選択される抗体の少なくともいずれか1つを含有することを特徴とする、医薬組成物。
- 請求項1乃至36から選択される抗体の少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、癌の治療用医薬組成物。
- 請求項1乃至36、及び、請求項39、40からなる群から選択されるいずれかを投与することによる、哺乳動物の有する腫瘍の増殖の抑制方法。
- 腫瘍が、EPHA2を発現している腫瘍であることを特徴とする、請求項41に記載の腫瘍の増殖の抑制方法。
- 請求項1乃至36から選択されるいずれか一つに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項43に記載のポリヌクレオチドによって形質転換された宿主細胞。
- 請求項44に記載の宿主細胞を用いた抗体の製造方法。
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