KR101521668B1

KR101521668B1 - 항ｅｐｈａ２ 항체

Info

Publication number: KR101521668B1
Application number: KR1020107004260A
Authority: KR
Inventors: 준 하세가와; 도시아키 오츠카; 아츠시 우라노; 준코 야마구치; 도시노리 아가츠마; 가오리 나카하라; 다케시 다키자와
Original assignee: 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
Priority date: 2007-08-30
Filing date: 2008-08-29
Publication date: 2015-05-28
Also published as: IL204211A; WO2009028639A1; PT2199390T; US20100183618A1; HUE032301T2; LT2199390T; KR20150041186A; RU2010111896A; MX2010002248A; EP2199390A4; KR101561416B1; EP2199390B1; KR20100057018A; CO6180469A2; JP5688433B2; CA2698146A1; EP2199390A1; CY1118763T1; CN101848998B; US20140212439A1

Abstract

세포의 암화 및/또는 종양 세포 증식 억제 활성을 갖는 항체 등을 제공하는 것. 하이브리도마 SH348-1 (FERM BP-10836) 또는 하이브리도마 SH357-1 (FERM BP-10837) 이 생성하는 항체에 의해 인식되는 에피토프를 인식하는 항체, 하이브리도마 SH348-1 또는 하이브리도마 SH357-1 이 생성하는 항체, 하이브리도마 SH348-1 또는 하이브리도마 SH357-1 이 생성하는 항체를 인간화한 항체, 그 항체를 유효성분으로서 함유하는 의약 등의 제공.

Description

항ＥＰＨＡ２ 항체 {ANTI-EPHA2 ANTIBODY}

본 발명은 세포의 암화 및/또는 종양 세포 증식 억제 활성을 갖는 항체, 보다 구체적으로는, EPHA2 에 대한 항체, 그 항체를 함유하는 의약 조성물에 관한 것이다.

EPHA2 는 분자량 130 kDa 의 1 회 막 관통 구조를 갖는 리셉터형 티로신키나아제이다 (Molecular and Cellular Biobloy, 1990년, 제10권, p.6316-6324). EPHA2 의 N 말단측의 세포 외 영역에는, 리간드 결합 도메인과 2 지점의 피브로넥틴 타입 3 도메인이 존재하고, C 말단측의 세포 내 영역에는 티로신키나아제 도메인과 sterile-

-motif (SAM) 도메인이 존재하고 있다.

EPHA2 의 리간드로는, GPI 앵커형 세포 막 단백질의 Ephrin-A1 ∼ A5 가 알려져 있다 (Annual Review of Neuroscience, 1998년, 제21권, p.309-345). EPHA2 에 리간드가 결합됨으로써 티로신키나아제 도메인이 활성화되고, EPHA2 의 세포 내 영역에 존재하는 티로신 잔기가 인산화되어 세포 내에 시그널이 전달된다. 또, 리간드와 결합한 EPHA2 는 엔도시토시스에 의해 세포 내에 받아들여져, 최종적으로 프로테아솜으로 분해되는 것이 보고되어 있다 (Molecular Cancer Research, 2002년, 제1권, p.79-87).

EPHA2 는 임상적으로 많은 암, 특히 유방암, 식도암, 전립선암, 위암, 비소 (非小) 세포 폐암, 대장암, 다형 신경 교아종에서의 고발현이 보고되어 있다 (Cancer Research, 2001년, 제61권, p.2301-2306, International Journal of Cancer, 2003년, 제103권, p.657-663, The Prostate, 1999년, 제41권, p.275-280, American Journal of Pathology, 2003년, 제163권, p.2271-2276, Cancer Science, 2005년, 제96권, p.42-47, Clinical Cancer Research, 2003년, 제9권, p.613-618, Oncology Reports, 2004년, 제11권, p.605-611, Molecular Cancer Research, 2005년, 제3권, p.541-551). 또, 식도암에서는, EPHA2 발현 양성인 환자에게서 국소 림프절 전이의 빈도나 림프절 전이의 수, 암의 저분화도가 높은 것, 또, EPHA2 발현 양성인 환자에게서는 5 년 생존율이 낮은 것 (International Journal of Cancer, 2003년, 제103권, p.657-663), 비소 세포 폐암에서는 EPHA2 를 고발현하고 있는 환자에게서 무병 생존율이 낮은 것, 재발, 특히 뇌로의 전이가 일어나기 쉬운 것 (Clinical Cancer Research, 2003년, 제9권, p.613-618), 대장암에 있어서는 EPHA2 발현 양성인 환자에게서 간 전이, 림프관 침윤, 림프절 전이가 일어나기 쉬운 것, 임상 스테이지가 높은 환자에게 EPHA2 발현 양성인 환자가 많은 것이 보고되어 있다 (Oncology Reports, 2004년, 제11권, p.605-611).

또, EPHA2 유전자를 세포에 도입함으로써, 비암 세포가 부착 비의존적 증식능이나 세포 외 기질 상에서의 관 형상 형태 형성능, In vivo 에서의 종양 증식능과 같은 암 형질을 획득하게 되는 것 (Cancer Research, 2001년, 제61권, p.2301-2306), 암 세포의 세포 외 기질에 대한 침윤성이 항진하는 것 (Biochemical and Biophysical Research Communications, 2004년, 제320권, p.1096-1102, Oncogene, 2004년, 제23권, p.1448-1456) 이 보고되어 있다. 반대로 EPHA2 의 발현을 siRNA 로 억제하면 암 세포의 침윤성이나 부착 비의존적 증식, in vivo 에서의 종양 증식이 억제되는 것 (Oncogene, 2004년, 제23권, p.1448-1456, Cancer Research, 2002년, 제62권, p.2840-2847) 및, 리간드인 Ephrin-A1 과 인간 IgG 의 Fc 영역과의 융합 단백질을 사용하여 EPHA2 를 활성화시키고, 엔도시토시스에 의한 EPHA2 의 분해를 유도함으로써 암 세포의 침윤성이나 부착 비의존적 증식, 관 형상 형태 형성능이 억제되는 것 (Cancer Research, 2001년, 제61권, p2301-2306, Molecular Cancer Research, 2005년, 제3권, p.541-551, Biochemical and Biophysical Research Communications, 2004년, 제320권, p.1096-1102) 이 보고되어 있다.

한편으로 EPHA2 는 암 세포 뿐만 아니라 종양 내 또는 주위의 혈관에도 발현하고 있는 것이 보고되어 있다 (Oncogene, 2000년, 제19권, p.6043-6052). 마우스에 있어서는 Ephrin-A1 에 의해 유도되는 혈관 신생에 EPHA2 시그널이 관여하고 있는 것, 특히 혈관 내피 세포에 발현하는 EPHA2 가 혈관 내피 세포의 관공 (管空) 형성이나 생존에 필요시 되는 것이 보고되어 있고 (Journal of Cell Science, 2004년, 제117권, p.2037-2049), EPHA2 의 세포 외 영역과 인간 IgG 의 Fc 영역의 융합 단백질이 in vivo 에서 혈관 신생을 억제하고, 항종양 효과를 나타내는 것도 보고되어 있다 (Oncogene, 2002년, 제21권, p.7011-7026).

모노클로날 항체는 진단약으로서 뿐만 아니라 치료약으로서도 유용하고, 특히 암 치료 분야에서 모노클로날 항체의 이용이 적극적으로 행해지고 있어, HER2 나 EGFR 등의 리셉터형 티로신키나아제나 CD20 의 세포 외 영역에 대한 모노클로날 항체가 암 치료에 사용되어 우수한 효과를 발휘하고 있다 (The New England Journal of Medicine, 2007년, 제357권, p.39-51, Oncogene, 2007년, 제26권, p.3661-3678, Oncogene, 2007년, 제26권, p.3603-3613). 암 치료에 사용되는 모노클로날 항체의 작용 기구로는, 아포토시스의 유도나 증식 시그널의 저해 외에, ADCC나 CDC 등의 면역 반응을 통한 작용도 매우 중요한 역할을 하고 있는 것으로 생각된다. 실제로, 항 HER2 항체 (trastuzumab) 나 항 CD20 항체 (rituximab) 를, ADCC 의 유도에 필요한 FcγR 을 결손시킨 누드 마우스 xenograft 에 투여하면, FcγR 을 결손하지 않은 누드 마우스에 투여한 경우와 비교하여 이들 항체의 항종양 효과가 현저하여 감약 (減弱) 해지는 것이 보고되어 있고 (Nature Medicine, 2000년, 제6권, p.443-446), 또, 코브라 독소를 투여하여 보체 (補體) 를 고갈시킨 마우스에 항CD20 항체 (rituximab) 를 투여하면, 보체를 고갈시키지 않은 마우스에 투여한 경우와 비교하여 항종양 효과가 감약하는 것이 보고되어 있다 (Blood, 2004년, 제103권, p.2738-2743).

EPHA2 에 관해서는, 리간드와 동일하게 EPHA2 티로신 잔기의 인산화 유도 활성과 EPHA2 의 분해 유도 활성을 갖는 아고니스트 항EPHA2 모노클로날 항체가 유방암 세포주의 부착 비의존적 증식이나 세포 외 기질 상에서의 관 형상 형태 형성을 저해하는 것이 보고되어 있다 (Cancer Research, 2002년, 제62권, p.2840-2847). 또, 비(非)암 세포에 비해 암 세포에서 노출되고 있는 EPHA2 상의 에피토프를 인식하고, EPHA2 티로신 잔기의 인산화 유도 활성과 EPHA2 의 분해 유도 활성을 갖는 아고니스트 항EPHA2 모노클로날 항체가 In vivo 에서 항종양 효과를 나타내는 것이 보고되어 있다 (Cancer Research, 2003년, 제63권, p.7907-7912, 국제 공개공보 제WO03/094859호 팜플렛). 한편으로, Kiewlich 들의 항EPHA2 모노클로날 항체는 EPHA2 티로신 잔기의 인산화 유도 활성과 EPHA2 의 분해 유도 활성을 갖는 것의 in vivo 에서 항종양 효과를 나타내지 않은 것이 보고되어 있다 (Neoplasia, 2006년, 제8권, p.18-30).

또, 국제 공개공보 WO2006/084226호 팜플렛에는, 암 세포를 마우스에 면역하여 취득한 항EPHA2 모노클로날 항체인 LUCA19, SG5, LUCA40, SPL1 이 기재되어 있고, 이들 항체에 대해서는, LUCA19 와 SG5 가 EPHA2 티로신 잔기의 인산화에 영향을 미지치 않는 것, LUCA40 이 in vitro 에서 암 세포의 증식을 저해하는 것, LUCA19, SG5 및 LUCA40 이 독소 (saporin) 표지된 항마우스 항체 존재하에서 암 세포 내에 인터널라이즈되는 것이 기재되어 있다. 또, LUCA40 과 SPL1 에 대해서는, in vivo 에서 항종양 효과를 나타내는 것이 보고되어 있지만, 아고니스트 활성을 갖는지의 여부에 대해서는 분명하지 않다.

이들의 연구에도 불구하고, 현재까지 in vivo 에서 항종양 효과를 나타내는 항EPHA2 항체의 에피토프에 대해서는 명확하지 않고, EPHA2 의 세포 외 영역 중의 특정 아미노산 배열이 암 치료를 목적으로 한 모노클로날 항체의 에피토프로서 유용하다는 보고는 없다.

동일한 항원에 대한 항체이어도, 에피토프나 항체의 배열이 상이함으로써, 항체의 성질은 상이하다. 그리고, 이들 성질이 상이함으로써, 임상에서 인간에게 투여한 경우에 약제의 유효성이나 치료 응답성의 빈도, 부작용이나 약제 내성의 발생 빈도 등의 점에서 상이한 반응을 나타내게 된다.

따라서, 어떠한 성질을 갖는 약제가 임상상 최선인지는 환자에 따라서도 상이하고, 실제로 약제를 투여해 보지 않으면 모르는 경우도 많아, 신규 작용 기작 (機作) 을 갖는 약제의 창출이 강하게 요망되고 있다. EPHA2 에 대한 항체에 대해서도, 종래와는 상이한 성질을 갖는 항체의 창출이 강하게 요구되고 있었다.

본 발명의 하나의 과제는 EPHA2 에 대한 항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 과제는 암에 대해 치료 효과를 갖는 항EPHA2 항체를 함유하는 의약 조성물 등을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 과제는 그 항체의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 과제는 그 항체를 사용한 종양의 증식 억제 방법 등을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토를 실시한 결과, EPHA2 의 티로신 잔기의 인산화 유도 활성을 갖지 않고 EPHA2 발현 암 세포에 대해 ADCC, CDC 활성을 갖는 신규의 항EPHA2 모노클로날 항체를 취득하는 것에 성공하였다. 그리고, 이 항체의 에피토프를 조사함으로써 EPHA2 중에 2 개 존재하는 피브로넥틴 타입 3 도메인의 C 말단측 도메인을 포함하는 영역에 결합하는 항체가 in vivo 에서 우수한 항종양 활성을 가지는 것을 처음으로 알아내어, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은,

(1) 하이브리도마 SH348-1 (FERM BP-10836) 이 생성하는 항체에 의해 인식되는 에피토프를 인식하는 항체,

(2) 이하의 a) 내지 d) 에 나타내는 성질을 갖는, (1) 에 기재된 항체 :

a) EPHA2 티로신 잔기의 인산화능을 갖지 않고 ;

b) EPHA2 발현 세포에 대해 ADCC 활성을 갖고 ;

c) EPHA2 발현 세포에 대해 CDC 활성을 갖고 ;

d) In vivo 에서 항종양 활성을 갖는,

(3) 이하의 a) 내지 e) 에 나타내는 성질을 갖는, (1) 에 기재된 항체 :

a) EPHA2 티로신 잔기의 인산화능을 갖지 않고 ;

b) EPHA2 단백질 양의 감소 작용을 나타내고 ;

c) EPHA2 발현 세포에 대해 ADCC 활성을 갖고 ;

d) EPHA2 발현 세포에 대해 CDC 활성을 갖고 ;

e) In vivo 에서 항종양 활성을 갖는,

(4) 배열표의 배열 번호 8 의 아미노산 번호 426 내지 534 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체,

(5) 배열표의 배열 번호 8 의 아미노산 번호 426 내지 534 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고, 이하의 a) 내지 d) 에 나타내는 성질을 갖는 항체 :

a) EPHA2 티로신 잔기의 인산화능을 갖지 않고 ;

b) EPHA2 발현 세포에 대해 ADCC 활성을 갖고 ;

c) EPHA2 발현 세포에 대해 CDC 활성을 갖고 ;

d) In vivo 에서 항종양 활성을 갖는,

(6) 배열표의 배열 번호 8 의 아미노산 번호 426 내지 534 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드에 특이적으로 결합하고, 이하의 a) 내지 e) 에 나타내는 성질을 갖는 항체 :

a) EPHA2 티로신 잔기의 인산화능을 갖지 않고 ;

b) EPHA2 단백질 양의 감소 작용을 나타내고 ;

c) EPHA2 발현 세포에 대해 ADCC 활성을 갖고 ;

d) EPHA2 발현 세포에 대해 CDC 활성을 갖고 ;

e) In vivo 에서 항종양 활성을 갖는,

(7) 배열표의 배열 번호 8 의 아미노산 번호 439 내지 534 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드에 특이적으로 결합하는, (1) 내지 (6) 에서 선택되는 어느 하나에 기재된 항체,

(8) EPHA2 리간드에 의해 유도되는 EPHA2 티로신 잔기의 인산화를 억제하는, (1) 내지 (7) 에서 선택되는 어느 하나에 기재된 항체,

(9) EPHA2 리간드의 EPHA2 에 대한 결합을 저해하는 것이 아니라, 리간드에 의해 유도되는 EPHA2 티로신 잔기의 인산화를 억제하는, (1) 내지 (7) 에서 선택되는 어느 하나에 기재된 항체,

(10) 중사슬 가변 영역의 상보성 결정 영역으로서, 배열표의 배열 번호 59, 61 및 63 에 나타나는 아미노산 배열 또는 이들 아미노산 배열에 있어서, 1 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 배열을 갖고, 경사슬 가변 영역의 상보성 결정 영역으로서, 배열표의 배열 번호 65, 67 및 69 에 나타나는 아미노산 배열 또는 이들 아미노산 배열에 있어서, 1 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 배열을 갖는, 배열표의 배열 번호 8 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체,

(11) 이하의 1) 및 2) 의 특징을 갖는, 배열표의 배열 번호 8 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 :

1) 일반식 (I) 로 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 중사슬 펩티드를 갖고 ;

-FRH₁-CDRH₁-FRH₂-CDRH₂-FRH₃-CDRH₃-FRH₄-(I)

(식 중, FRH₁ 은 18 내지 30 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRH₁ 은 배열표의 배열 번호 59 로 나타나는 아미노산 배열 또는 1 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 배열을 나타내고, FRH₂ 는 14 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRH₂ 는 배열표의 배열 번호 61 로 나타나는 아미노산 배열 또는 1 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 배열을 나타내고, FRH₃ 은 32 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRH₃ 은 배열표의 배열 번호 63 으로 나타나는 아미노산 배열 또는 1 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 배열을 나타내고, FRH₄ 는 11 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, 각 아미노산은 각각 펩티드 결합으로 연결되어 있다.) ;

2) 일반식 (Ⅱ) 로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 것으로 이루어지는 경사슬 폴리펩티드를 갖고 ;

-FRL₁-CDRL₁-FRL₂-CDRL₂-FRL₃-CDRL₃-FRL₄-(Ⅱ)

(식 중, FRL₁ 은 23 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRL₁ 은 배열표의 배열 번호 65 로 나타나는 아미노산 배열 또는 1 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 배열을 나타내고, FRL₂ 는 15 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRL₂ 는 배열표의 배열 번호 67 로 나타나는 아미노산 배열을 나타내고, FRL₃ 은 32 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRL₃ 은 배열표의 배열 번호 69 로 나타나는 아미노산 배열 또는 1 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가되는 아미노산 배열을 나타내고, FRL₄ 는 10 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, 각 아미노산은 각각 펩티드 결합으로 연결되어 있다),

(12) 하이브리도마 SH357-1 (FERM BP-10837) 이 생성하는 항체에 의해 인식되는 에피토프를 인식하는 항체,

(13) 이하의 a) 내지 d) 에 나타내는 성질을 갖는, (12) 에 기재된 항체 :

a) EPHA2 티로신 잔기의 인산화능을 갖지 않고 ;

b) EPHA2 발현 세포에 대해 ADCC 활성을 갖고 ;

c) EPHA2 발현 세포에 대해 CDC 활성을 갖고 ;

d) In vivo 에서 항종양 활성을 갖는,

(14) 배열표의 배열 번호 8 의 아미노산 번호 426 내지 534 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드에 특이적으로 결합하고, 이하의 a) 내지 e) 에 나타내는 성질을 갖는 항체 :

a) EPHA2 티로신 잔기의 인산화능을 갖지 않고 ;

b) EPHA2 단백질 양의 감소 작용을 나타내지 않고 ;

c) EPHA2 발현 세포에 대해 ADCC 활성을 갖고 ;

d) EPHA2 발현 세포에 대해 CDC 활성을 갖고 ;

e) In vivo 에서 항종양 활성을 갖는,

(15) 배열표의 배열 번호 8 의 아미노산 번호 439 내지 534 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드에 특이적으로 결합하는, (12) 내지 (14) 에서 선택되는 어느 하나에 기재된 항체,

(16) EPHA2 리간드에 의해 유도되는 EPHA2 티로신 잔기의 인산화를 억제하는, (12) 내지 (15) 에서 선택되는 어느 하나에 기재된 항체,

(17) EPHA2 리간드의 EPHA2 에 대한 결합을 저해하는 것이 아니라, 리간드에 의해 유도되는 EPHA2 티로신 잔기의 인산화를 억제하는, (12) 내지 (15) 에서 선택되는 어느 하나에 기재된 항체,

(18) 중사슬 가변 영역의 상보성 결정 영역으로서, 배열표의 배열 번호 71, 73 및 75 에 나타나는 아미노산 배열 또는 이들 아미노산 배열에 있어서, 1 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 배열을 갖고, 경사슬 가변 영역의 상보성 결정 영역으로서, 배열표의 배열 번호 77, 79 및 81 에 나타나는 아미노산 배열 또는 이들 아미노산 배열에 있어서, 1 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 배열을 갖는, 배열표의 배열 번호 8 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체,

(19) 이하의 1) 및 2) 에 나타내는 특징을 갖는, 배열표의 배열 번호 8 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 :

-FRH₁-CDRH₁-FRH₂-CDRH₂-FRH₃-CDRH₃-FRH₄-(I)

(식 중, FRH₁ 은 18 내지 30 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRH₁ 은 배열표의 배열 번호 71 로 나타나는 아미노산 배열 또는 1 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 배열을 나타내고, FRH₂ 는 14 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRH₂ 는 배열표의 배열 번호 73 으로 나타나는 아미노산 배열 또는 1 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 배열을 나타내고, FRH₃ 은 32 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRH₃ 은 배열표의 배열 번호 75 로 나타나는 아미노산 배열 또는 1 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 배열을 나타내고, FRH₄ 는 11 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, 각 아미노산은 각각 펩티드 결합으로 연결되어 있다.) ;

2) 일반식 (Ⅱ) 로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 것으로 이루어지는 경사슬 폴리펩티드를 갖는다 ;

-FRL₁-CDRL₁-FRL₂-CDRL₂-FRL₃-CDRL₃-FRL₄-(Ⅱ)

(식 중, FRL₁ 은 23 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRL₁ 은 배열표의 배열 번호 77 로 나타나는 아미노산 배열 또는 1 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 배열을 나타내고, FRL₂ 는 15 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRL₂ 는 배열표의 배열 번호 79 로 나타나는 아미노산 배열 또는 1 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 배열을 나타내고, FRL₃ 은 32 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRL₃ 은 배열표의 배열 번호 81 로 나타나는 아미노산 배열 또는 1 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 배열을 나타내고, FRL₄ 는 10 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, 각 아미노산은 각각 펩티드 결합으로 연결되어 있다),

(20) 인간화 항체인 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (19) 에서 선택되는 어느 하나에 기재된 항체,

(21) 인간 항체인 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (19) 에서 선택되는 어느 하나에 기재된 항체,

(22) IgG 항체인 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (19) 에서 선택되는 어느 하나에 기재된 항체,

(23) Fab, F(ab')2, Fv, scFV, 디아보디, 선 형상 항체 및 다(多)특이적 항체에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (9) 및, (12) 내지 (17) 에서 선택되는 어느 하나에 기재된 항체,

(24) 하이브리도마 SH348-1 (FERM BP-10836) 이 생성하는 항체,

(25) 하이브리도마 SH357-1 (FERM BP-10837) 이 생성하는 항체,

(26) 이하의 1) 및 2) 로 이루어지는 항체 :

1) 배열표의 배열 번호 35 의 아미노산 번호 1 내지 119 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 중사슬 폴리펩티드 또는 배열표의 배열 번호 39 의 아미노산 번호 1 내지 119 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 중사슬 폴리펩티드 ;

2) 배열표의 배열 번호 37 의 아미노산 번호 1 내지 112 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 경사슬 폴리펩티드 또는 배열표의 배열 번호 41 의 아미노산 번호 1 내지 112 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 경사슬 폴리펩티드,

(27) 이하의 1) 또는 2) 로 이루어지는 항체 :

1) 배열표의 배열 번호 35 의 아미노산 번호 1 내지 119 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 중사슬 폴리펩티드 및, 배열표의 배열 번호 37 의 아미노산 번호 1 내지 112 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 경사슬 폴리펩티드 ;

2) 배열표의 배열 번호 39 의 아미노산 번호 1 내지 119 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 중사슬 폴리펩티드 및, 배열표의 배열 번호 41 의 아미노산 번호 1 내지 112 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 경사슬 폴리펩티드,

(28) 이하의 1) 및 2) 로 이루어지는 항체 :

1) 배열표의 배열 번호 35 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 중사슬 폴리펩티드 또는 배열표의 배열 번호 39 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 중사슬 폴리펩티드 ;

2) 배열표의 배열 번호 37 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 경사슬 폴리펩티드 또는 배열표의 배열 번호 41 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 경사슬 폴리펩티드,

(29) 이하의 1) 또는 2) 로 이루어지는 항체 :

1) 배열표의 배열 번호 35 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 중사슬 폴리펩티드 및, 배열표의 배열 번호 37 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 경사슬 폴리펩티드 ;

2) 배열표의 배열 번호 39 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 중사슬 폴리펩티드 및, 배열표의 배열 번호 41 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 경사슬 폴리펩티드,

(30) (24) 내지 (29) 에서 선택되는 어느 하나에 기재된 항체를 인간화한 항체,

(31) 이하의 1) 및 2) 로 이루어지는 항체 :

1) 배열표의 배열 번호 107 의 아미노산 번호 20 내지 468 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 중사슬 폴리펩티드 또는 배열표의 배열 번호 115 의 아미노산 번호 20 내지 468 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 중사슬 폴리펩티드 ;

2) 배열표의 배열 번호 91 의 아미노산 번호 21 내지 239 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 경사슬 폴리펩티드 또는 배열표의 배열 번호 99 의 아미노산 번호 21 내지 239 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 경사슬 폴리펩티드,

(32) 이하의 1) 또는 2) 로 이루어지는 항체 :

1) 배열표의 배열 번호 107 의 아미노산 번호 20 내지 468 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 중사슬 폴리펩티드 및, 배열표의 배열 번호 91 의 아미노산 번호 21 내지 239 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 경사슬 폴리펩티드 ;

2) 배열표의 배열 번호 115 의 아미노산 번호 20 내지 468 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 중사슬 폴리펩티드 및, 배열표의 배열 번호 99 의 아미노산 번호 21 내지 239 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 경사슬 폴리펩티드,

(33) 이하의 1) 및 2) 로 이루어지는 항체 :

1) 배열표의 배열 번호 139 의 아미노산 번호 20 내지 468 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 중사슬 폴리펩티드 또는 배열표의 배열 번호 147 의 아미노산 번호 20 내지 468 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 중사슬 폴리펩티드 ;

2) 배열표의 배열 번호 123 의 아미노산 번호 21 내지 239 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 경사슬 폴리펩티드 또는 배열표의 배열 번호 131 의 아미노산 번호 21 내지 239 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 경사슬 폴리펩티드,

(34) 이하의 1) 또는 2) 로 이루어지는 항체 :

1) 배열표의 배열 번호 139 의 아미노산 번호 20 내지 468 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 중사슬 폴리펩티드 및, 배열표의 배열 번호 123 의 아미노산 번호 21 내지 239 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 경사슬 폴리펩티드 ;

2) 배열표의 배열 번호 147 의 아미노산 번호 20 내지 468 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 중사슬 폴리펩티드 및, 배열표의 배열 번호 131 의 아미노산 번호 21 내지 239 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 경사슬 폴리펩티드,

(35) (24) 내지 (34) 에서 선택되는 어느 하나에 기재된 항체의, Fab, F(ab')2, Fv, scFV, 디아보디, 선 형상 항체 및 다특이적 항체에서 선택되는 어느 하나,

(36) 이하의 1) 내지 20) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드 :

1) 배열표의 배열 번호 35 의 아미노산 번호 1 내지 119 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드 ;

2) 배열표의 배열 번호 39 의 아미노산 번호 1 내지 119 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드 ;

3) 배열표의 배열 번호 37 의 아미노산 번호 1 내지 112 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드 ;

4) 배열표의 배열 번호 41 의 아미노산 번호 1 내지 112 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드 ;

5) 배열표의 배열 번호 107 의 아미노산 번호 20 내지 468 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드 ;

6) 배열표의 배열 번호 115 의 아미노산 번호 20 내지 468 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드 ;

7) 배열표의 배열 번호 107 의 아미노산 번호 20 내지 138 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드 ;

8) 배열표의 배열 번호 115 의 아미노산 번호 20 내지 138 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드 ;

9) 배열표의 배열 번호 91 의 아미노산 번호 21 내지 239 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드 ;

10) 배열표의 배열 번호 99 의 아미노산 번호 21 내지 239 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드 ;

11) 배열표의 배열표의 배열 번호 91 의 아미노산 번호 21 내지 134 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드 ;

12) 배열표의 배열 번호 99 의 아미노산 번호 21 내지 134 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드 ;

13) 배열표의 배열 번호 139 의 아미노산 번호 20 내지 468 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드 ;

14) 배열표의 배열 번호 147 의 아미노산 번호 20 내지 468 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드 ;

15) 배열표의 배열 번호 139 의 아미노산 번호 20 내지 138 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드 ;

16) 배열표의 배열 번호 147 의 아미노산 번호 20 내지 138 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드 ;

17) 배열표의 배열 번호 123 의 아미노산 번호 21 내지 239 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드 ;

18) 배열표의 배열 번호 131 의 아미노산 번호 21 내지 239 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드 ;

19) 배열표의 배열 번호 123 의 아미노산 번호 21 내지 134 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드 ;

20) 배열표의 배열 번호 131 의 아미노산 번호 21 내지 134 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드 ;

(37) 마우스 하이브리도마 SH348-1 (FERM BP-10836),

(38) 마우스 하이브리도마 SH357-1 (FERM BP-10837)

(39) (1) 내지 (35) 에서 선택되는 항체의 적어도 어느 하나를 함유하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물,

(40) (1) 내지 (35) 에서 선택되는 항체의 적어도 어느 하나를 함유하는 것을 특징으로 하는 암의 치료용 의약 조성물,

(41) (1) 내지 (35) 및, (39), (40) 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나를 투여하는 것에 의한 포유 동물이 갖는 종양의 증식 억제 방법,

(42) 종양이 EPHA2 를 발현하고 있는 종양인 것을 특징으로 하는 (41) 에 기재된 종양 증식의 억제 방법,

(43) (1) 내지 (36) 에서 선택되는 어느 하나에 기재된 항체 또는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드,

(44) (43) 에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 형질 전환된 숙주 세포,

(45) (44) 에 기재된 숙주 세포를 사용한 항체의 제조 방법

으로 이루어진다.

본 발명에 의해, EPHA2 의 티로신 잔기의 인산화 유도 활성을 갖지 않고 EPHA2 발현 암 세포에 대해 ADCC, CDC 활성을 갖는 신규의 항EPHA2 모노클로날 항체를 취득하는 것에 성공하였다. 그리고, 그 항체가 in vivo 에서 우수한 항종양 활성을 갖는 것을 알아내었다.

그리고, 그 항체를 함유하는 암 치료용 의약 조성물이 제공되었다.

도 1 은 항EPHA2 항체에 의한 EPHA2 티로신 잔기의 인산화 유도 활성의 유무를 나타내는 웨스턴 블로팅의 결과를 나타내는 도면. A) : 가교 항체 비존재하의 결과를 나타내는 도면, 상단은 4G10 항체의 결과를 나타내고, 하단은 항EPHA2 항체 (D7) 의 결과를 나타낸다. B) : 가교 항체 존재하의 결과를 나타내는 도면, 상단은 4G10 항체에서의 결과를 나타내고, 하단은 항EPHA2 항체 (D7) 에서의 결과를 나타낸다.
도 2 는 항EPHA2 항체에 의한 EPHA2 단백질 양의 저하를 유도하는 활성의 유무를 나타내는 웨스턴 블로팅의 결과를 나타내는 도면. A) : 가교 항체 비존재하의 결과를 나타내는 도면, 상단은 항EPHA2 항체 (D7) 에서의 결과를 나타내고, 하단은 항β-actin 항체에서의 결과를 나타낸다. B) : 가교 항체 존재하의 결과를 나타내는 도면, 상단은 항EPHA2 항체 (D7) 에서의 결과를 나타내고, 하단은 항β-actin 항체에서의 결과를 나타낸다.
도 3 은 항EPHA2 항체의 각종 세포에 대한 ADCC 활성의 유무를 나타내는 도면. 도면 중의 「**」은 P ＜ 0.01 을 나타내고, 「***」은 P ＜ 0.001 을 나타낸다. A) : MDA-MB-231 세포에 대한 ADCC 활성을 나타내는 도면. B) : A549 세포에 대한 ADCC 활성을 나타내는 도면. C) : PC-3 세포에 대한 ADCC 활성을 나타내는 도면.
도 4 는 항EPHA2 항체의 각종 세포에 대한 CDC 활성의 유무를 나타내는 도면. 도면 중의 「***」은 P ＜ 0.001 을 나타낸다. A) : SH348-1 의 MDA-MB-231 세포에 대한 CDC 활성을 나타내는 도면. B) : SH348-1 의 A549 세포에 대한 CDC 활성을 나타내는 도면. C) : SH348-1 의 PC-3 세포에 대한 CDC 활성을 나타내는 도면. D) : SH357-1 의 MDA-MB-231 세포에 대한 CDC 활성을 나타내는 도면. E) : SH357-1 의 A549 세포에 대한 CDC 활성을 나타내는 도면. F) : SH357-1 의 PC-3 세포에 대한 CDC 활성을 나타내는 도면.
도 5 는 A) EPHA2 의 도메인 구조 예측 및 에피토프 결정용의 펩티드 EPHA2-ECD, FNⅢ-NC, FNⅢ-N, FNⅢ-C 의 EPHA2 중에서의 위치를 나타내는 도면. 도면 중에서 Ligand-BD 는 리간드 결합 도메인, FN3 은 피브로넥틴 타입 3 도메인, TM 은 막 관통 영역, Trk kinase 는 티로신키나제 도메인, SAM 은 SAM 도메인을 나타낸다.
B) EPHA2-ECD, FNⅢ-NC, FNⅢ-N 및 FNⅢ-C 에 대한 항EPHA2 항체 결합성의 유무를 나타내는 도면.
도 6 은 A) MDA-MB-231 세포를 이식한 마우스에 대한 SH348-1 의 항종양 활성을 나타내는 도면.
B) MDA-MB-231 세포를 이식한 마우스에 대한 SH357-1 의 항종양 활성을 나타내는 도면. 도면 중의 에러 바는 표준 오차 (n = 9) 를 나타낸다.
도 7 은 A) SH348-1의 EPHA2 세포 외 영역 폴리펩티드에 대한 결합 활성을 나타내는 도면.
B) SH357-1 의 EPHA2 세포 외 영역 폴리펩티드에 대한 결합 활성을 나타내는 도면.
C) Ab96-1 의 EPHA2 세포 외 영역 폴리펩티드에 대한 결합 활성을 나타내는 도면.
도 8 은 SH348-1, SH357-1 및 Ab96-1 의 리간드 결합 저해 활성을 나타내는 도면.
도 9 는 SH348-1 및 SH357-1 이 Ephrin-A1 의존적 EPHA2 티로신 잔기 인산화를 저해하는 활성을 갖는 것을 나타내는 도면.
도 10 은 에피토프 동정용의 EPHA2 결손 변이체의 개략을 나타내는 도면.
도 11 은 A) SH348-1 의 EPHA2 결손 변이체에 대한 반응성을 나타내는 도면.
B) 도 11 A) 의 PVDF 막 상의 EPHA2 결손 변이체의 검출을 나타내는 도면.
C) SH357-1 의 EPHA2 결손 변이체에 대한 반응성을 나타내는 도면.
D) 도 11C) 의 PVDF 막 상의 EPHA2 결손 변이체의 검출을 나타내는 도면.
도 12 는 A) hSH348-1-T1 의 EPHA2 세포 외 영역 폴리펩티드에 대한 결합 활성을 나타내는 도면.
B) hSH348-1-T3 의 EPHA2 세포 외 영역 폴리펩티드에 대한 결합 활성을 나타내는 도면.
C) hSH357-1-T1 의 EPHA2 세포 외 영역 폴리펩티드에 대한 결합 활성을 나타내는 도면.
D) hSH357-1-T3 의 EPHA2 세포 외 영역 폴리펩티드에 대한 결합 활성을 나타내는 도면.
도 13 은 A) SH348-1 의 항원 결합에 대한 hSH348-1-T1 및 hSH348-1-T3 의 경합 저해 활성을 나타내는 도면.
B) SH357-1 의 항원 결합에 대한 hSH357-1-T1 및 hSH357-1-T3 의 경합 저해 활성을 나타내는 도면.
도 14 는 A) hSH348-1-T1, hSH348-1-T3 이 Ephrin-A1 의존적 EPHA2 티로신 잔기 인산화를 저해하는 활성을 나타내는 도면.
B) hSH357-1-T1, hSH357-1-T3 이 Ephrin-A1 의존적 EPHA2 티로신 잔기 인산화를 저해하는 활성을 나타내는 도면.

1. 정의

본 명세서 중에서는, 「암」과「종양」은 동일한 의미로 사용하고 있다.

본 명세서 중에서, 「유전자」라는 말에는, DNA 뿐만 아니라 그 mRNA, cDNA 및 그 cRNA 도 포함되는 것으로 한다. 따라서, 본 발명에 있어서의 「EPHA2 유전자」에는, EPHA2 의 DNA, mRNA, cDNA 및 cRNA 가 포함된다.

본 명세서 중에서, 「폴리뉴클레오티드」라는 용어는 핵산과 동일한 의미로 사용하고 있고, DNA, RNA, 프로브, 올리고 뉴클레오티드 및 프라이머도 포함되어 있다.

본 명세서 중에서는, 「폴리펩티드」와「단백질」은 구별하지 않고 사용하고 있다.

본 명세서 중에서 「세포」에는, 동물 개체 중의 세포, 배양 세포도 포함하고 있다.

본 명세서 중에서 「세포의 암화」란, 세포가 접촉 저지 현상에 대한 감수성을 상실하는 것이나, 베이스 비의존성 증식을 나타내는 것 등, 세포가 비정상인 증식을 나타내는 것을 말하고, 이와 같은 비정상인 증식을 나타내는 세포를 「암 세포」라고 한다.

본 명세서 중에 있어서는, EPHA2 가 갖는 세포의 암화 활성 및/또는 세포 증식 활성 등과 동등한 기능을 갖는 단백질도 EPHA2 라고 한다.

본 명세서 중에서의 「티로신 잔기의 인산화」란, 펩티드의 아미노산 배열에 포함되는 티로신 잔기가 인산화되는 것을 말하고, 티로신 잔기가 인산화되어 있는지의 여부는 예를 들어 펩티드와 항인산화 티로신 항체 (예를 들어, Anti-Phosphotyrosine, recombinant 4G10 HRP-conjugate (Millipore (Upsate) 사 제조 #16-184) 의 결합성을 조사하고, 그 항체와 결합할 때에는, 티로신 잔기가 인산화되어 있는 것으로 판정할 수 있다. 본 명세서 중에서의 「EPHA2 티로신 잔기의 인산화능」이란, EPHA2 의 아미노산 배열 중의 티로신 잔기를 인산화하는 능력을 말하고, 항체가 EPHA2 의 티로신 잔기의 인산화능을 갖는지의 여부는 예를 들어 항체와 EPHA2 를 인큐베이션한 후에, EPHA2 와 항인산화 티로신 항체의 결합성이 있는지의 여부에 의해 판정할 수 있다.

본 명세서 중에 있어서, 「EPHA2 단백질의 발현량이 감소한다」란, EPHA2 단백질의 양이 감소하는 것을 말하고, 항체가 EPHA2 단백질의 양을 감소시키는 작용을 갖는지의 여부는 예를 들어 항체와 EPHA2 를 인큐베이션한 후에, EPHA2 의 양을 정량함으로써 조사할 수 있다.

본 명세서 중에서, 「EPHA2 리간드」란, EPHA2 의 리간드로 될 수 있는 물질을 나타내고, 그 구체예로는, GPI 앵커형 세포 막 단백질의 Ephrin-A1 ∼ A5 를 들 수 있다 (Annual Review of Neuroscience, 1998년, 제21권, p.309-345).

본 명세서 중에 있어서의 「세포 상해」란, 어떠한 형태로 세포에 병리적인 변화를 가져오는 것을 말하고, 직접적인 외상에 그치지 않고, DNA 의 절단이나 염기 2 량체의 형성, 염색체의 절단, 세포 분열 장치의 손상, 각종 효소 활성의 저하 등 모든 세포의 구조나 기능 상의 손상을 말한다. 본 명세서 중에서의 「세포 장해 활성」이란 상기 세포 상해를 일으키는 것을 말한다.

본 명세서 중에서의, ADCC 란, 항체 의존성 세포 장해 (Antibody-dependent cellular cytotoxicity) 와 동일한 의미이고, Fcγ 리셉터 보유 세포가 표적 세포의 표면 항원에 결합한 항체의 Fc 부분에 Fcγ 리셉터를 통하여 부착시키고, 표적 세포를 죽이는 반응을 말하고, ADCC 활성이란, 항체 의존성 세포 장해 활성이라고도 하며, 상기 반응의 활성을 말한다. ADCC 활성은 당업자가 통상적으로 실시하는 방법으로 측정할 수 있는데, 예를 들어, 본 명세서 중의 실시예 3 의 3)-2 의 항목에 기재된 방법에 의해 측정할 수 있다.

본 명세서 중에서의,「CDC」란, 보체 의존성 세포 장해 (complement-dependent cytotoxicity) 와 동일한 의미이고, CDC 활성이란 보체 의존성 세포 장해를 일으키는 활성을 말한다. CDC 활성은 당업자가 통상적으로 실시하는 방법에 의해 측정할 수 있는데, 예를 들어, 본 명세서 중의 실시예 3 의 3)-3 에 기재된 방법에 의해 측정할 수 있다.

본 명세서 중에서, 「In vivo 에서 항종양 활성을 갖는다.」란, 종양을 갖는 동물 개체의 종양의 증식을 억제 또는 감소시키는 활성을 갖는 것을 의미한다. 항EPHA2 항체가 「In vivo 에서 항종양 활성을 갖는」지의 여부는 당업자가 통상적으로 실시하는 방법에 의해 조사할 수 있지만, 예를 들어 이하의 방법에 의해서도 조사할 수 있다. 즉, 종양 세포 (예를 들어, MDA-MB-231 세포) 가 피하 이식되어 있는 누드 마우스 (예를 들어, BALB/cAJc1-nu/nu ; 닛폰 쿠레아사로부터 입수) 에 피험 물질로서 항EPHA2 항체를 복강 내에 적당량 투여하고, 종양 체적의 경시 변화를 항EPHA2 항체를 투여하지 않은 컨트롤과 비교하여, 컨트롤에 비해 종양의 체적이 유의하게 작은 경우에는, 피험 물질인 그 항EPHA2 항체는 「In vivo 에서 항종양 활성을 갖는」것으로 판단할 수 있다.

항체 분자의 중사슬 및 경사슬에는 각각 3 지점의 상보성 결정 영역 (CDR : Complementarity deterring region) 이 있는 것이 알려져 있다. 본 명세서 중에서는, 항체의 상보성 결정 영역에 대해, 중사슬의 상보성 결정 영역을 CDRH₁, CDRH₂, CDRH₃ 으로 표기하고, 경사슬의 상보성 결정 영역을 CDRL₁, CDRL₂, CDRL₃ 으로 표기한다.

본 명세서에 있어서의, 「에피토프」란, 동물, 바람직하게는, 포유 동물, 보다 바람직하게는, 마우스 또는 인간의 체내에 있어서, 항원성 및/또는 면역원성을 갖는 EPHA2 의 부분 펩티드를 의미한다. 항원성을 갖는 EPHA2 의 부분 펩티드인 에피토프는 면역 어세이법 등 당업자에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 결정할 수 있는데, 예를 들어 이하의 방법에 의해 실시할 수 있다. EPHA2 의 다양한 부분 구조를 제조한다. 부분 구조를 제조할 때에는, 공지된 올리고 펩티드 합성 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, EPHA2 의 C 말단 혹은 N 말단에서부터 적당한 길이로 순차적으로 짧게 한 일련의 폴리펩티드를 당업자에게 주지된 유전자 조합 기술을 사용하여 제조한 후, 그것들에 대한 항체의 반응성을 검토하여, 대략적인 인식 부위를 결정한 후에, 추가로 짧은 펩티드를 합성하여 그들의 펩티드와의 반응성을 검토함으로써, 에피토프를 결정할 수 있다.

1. EPHA2 에 대해

(1) EPHA2 유전자

EPHA2 유전자의 뉴클레오티드 배열 및 아미노산 배열은 GenBank 에 EPH recept 또는 A2 (액세션 번호는 각각 NM_004431, NP_004422) 로서 등록되어 있다. 또, EPHA2 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF) 의 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 1 에 기재되어 있고, 그 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 2 에 기재되어 있다.

또한, EPHA2 의 아미노산 배열에 있어서, 1 혹은 몇 개의 아미노산이 치환, 결실, 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 이들 효소와 동등한 생물 활성을 갖는 단백질도 EPHA2 에 포함된다.

(2) EPHA2 유전자의 암부 특이적 발현

EPHA2 유전자는 많은 암, 특히 유방암, 식도암, 전립선암, 위암, 비소 세포 폐암, 대장암, 다형 신경 교아종에서의 고발현이 보고되고 있다.

즉, EPHA2 의 각 세포 및/또는 각 조직에 있어서의 발현량을 측정함으로써, 피험자의 EPHA2 의 과잉 발현에서 기인하여 발생하는 암화 및/또는 암 세포의 증식 상태를 판정할 수 있다.

또, EPHA2 의 발현량 및/또는 활성을 억제하는 물질은 EPHA2 에서 기인하는 세포의 암화의 억제 및/또는 암 세포의 증식을 억제하는 활성을 갖는다.

따라서, EPHA2 를 발현하고 있는 세포에, 피험 물질을 접촉시켜, EPHA2 의 발현량 및/또는 활성을 억제하는 물질을 선택함으로써, 항종양 물질을 스크리닝할 수 있게 된다.

또한, EPHA2 에 대한 siRNA 는 EPHA2 의 발현을 억제하여, 항종양제가 될 수 있다. EPHA2 에 대한 siRNA 는 EPHA2 mRNA 의 부분 배열로 이루어지는 RNA (센스 RNA) 와 그 RNA 의 염기 배열에 상보적인 염기 배열로 이루어지는 RNA (안티센스 RNA) 를, EPHA2 mRNA 의 염기 배열에 기초하여 설계하고, 자체 공지된 화학 합성법에 의해 합성하여, 얻어진 양 RNA 를 하이브리다이제이션시킴으로써 제조할 수 있다. siRNA 를 구성하는 센스 RNA 및 안티센스 RNA 는 각각 그 3' 말단에, 오버행 배열로 불리는 1 개 내지 몇 개의 염기 배열로 이루어지는 뉴클레오티드를 결합시키는 것이 바람직하다. 오버행 배열은 그 RNA 를 뉴클레아제로부터 보호되는 한 특별히 제한되지 않고, 바람직하게는 1 개 내지 10 개, 보다 바람직하게는 1 개 내지 4 개, 더욱 바람직하게는 2 개의 뉴클레오티드로 이루어지는 것을 모두 사용할 수 있다.

2. EPHA2 에 대한 항체

(1) 항원의 조제

본 발명의 EPHA2 에 대한 항체를 얻기 위한 항원으로는, EPHA2 의 전체 길이 폴리펩티드 또는 그 부분 폴리펩티드를 들 수 있고, 보다 구체적으로는, EPHA2 의 전체 길이 폴리펩티드 또는, 바람직하게는 EPHA2 의 세포 외 영역 폴리펩티드 (배열표의 배열 번호 8 의 아미노산 번호 1 내지 534 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어진다), 더욱 바람직하게는 배열표의 배열 번호 8 의 아미노산 번호 426 내지 534 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 EPHA2 의 세포 외 영역 폴리펩티드의 부분 폴리펩티드, 더욱 보다 바람직하게는, 배열표의 배열 번호 8 의 아미노산 번호 439 내지 534 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 EPHA2 의 세포 외 영역 폴리펩티드의 부분 펩티드, 혹은 이것들에 임의의 아미노산 배열이나 담체가 부가된 유도체를 들 수 있다. 또, 상기 각 폴리펩티드의 적어도 6 개가 연속한 부분 아미노산 배열로 이루어지는 폴리펩티드, 혹은 이것들에 임의의 아미노산 배열이나 담체가 부가된 유도체를 들 수 있다.

또한, 항원이 되는, EPHA2 전체 길이 폴리펩티드 또는 그 부분 폴리펩티드는 EPHA2 유전자 또는 그 부분 폴리펩티드의 유전자를 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 생성시킴으로써 얻을 수 있다.

EPHA2 는 인간의 종양 조직 혹은 종양 세포로부터 직접 정제하여 사용할 수 있고, 또, EPHA2 전체 길이 폴리펩티드 또는 그 부분 폴리펩티드는 in vitro 에서 합성하거나, 혹은 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 생성시킴으로써 얻을 수 있다.

유전자 조작에서는, 구체적으로는, EPHA2 또는 그 부분 폴리펩티드를 발현할 수 있는 벡터에 삽입한 후, 전사와 번역에 필요한 효소, 기질 및 에너지 물질을 함유하는 용액 중에서 합성하거나, 혹은 다른 원핵 생물, 또는 진핵 생물의 숙주 세포를 형질 전환시킴으로써 EPHA2 또는 그 부분 폴리펩티드를 발현시킴으로써, 그 단백질을 얻을 수 있다.

EPHA2 의 그 부분 폴리펩티드의 cDNA 는 예를 들어, EPHA2 를 발현하고 있는 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여, EPHA2 cDNA 또는 그 부분 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 특이적으로 증폭시키는 프라이머를 사용하여 폴리메라아제 연쇄 반응 (이하 「PCR」라고 한다) (Saiki, R.K., et al. Science (1988) 239, p.487-489 참조) 을 실시하는, 이른바 PCR 법에 의해 취득할 수 있다.

폴리펩티드의 인·비트로 (in vitro) 합성으로는, 예를 들어 로슈·다이아그노스틱사 제조의 라피드 트랜스레이션 시스템 (RTS) 을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.

원핵 세포의 숙주로는, 예를 들어, 대장균 (Escherichia coil) 이나 고초균 (Bacillus subtilis) 등을 들 수 있다. 목적하는 유전자를 이들 숙주 세포 내에서 형질 전환시키기 위해서는, 숙주와 적합할 수 있는 종 유래의 레플리콘 즉 복제 기점과, 조절 배열을 포함하고 있는 플라스미드 벡터로 숙주 세포를 형질 전환시킨다. 또, 벡터로는, 형질 전환 세포에 표현 형질 (표현형) 의 선택성을 부여할 수 있는 배열을 갖는 것이 바람직하다.

진핵 세포의 숙주 세포에는, 척추 동물, 곤충, 효모 등의 세포가 포함되고, 척추 동물 세포로는, 예를 들어, 원숭이의 세포인 COS 세포 (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p.175-182, ATCC CRL-1650), 마우스 섬유 아세포 NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658) 나 차이니즈·햄스터 난소 세포 (CHO 세포, ATCC CCL-61) 의 디히드로엽산 환원 효소 결손주 (Urlaub, G. and Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, p.4126-4220) 등이 자주 사용되고 있는데, 이들에 한정되지 않는다.

상기와 같이 하여 얻어지는 형질 전환체는 통상적인 방법에 따라 배양할 수 있고, 그 배양에 의해 세포 내, 또는 세포 외에 목적하는 폴리펩티드가 생성된다.

그 배양에 사용되는 배지로는, 채용한 숙주 세포에 따라 관용되는 각종의 것을 적절히 선택할 수 있고, 대장균이면, 예를 들어, LB 배지에 필요에 따라, 암피실린 등의 항생 물질이나 IPTG 를 첨가하여 사용할 수 있다.

상기 배양에 의해, 형질 전환체의 세포 내 또는 세포 외에 생성되는 재조합 단백질은 그 단백질의 물리적 성질이나 화학적 성질 등을 사용한 각종 공지된 분리 조작법에 의해 분리·정제할 수 있다.

그 방법으로는, 구체적으로는 예를 들어, 통상적인 단백질 침전제에 의한 처리, 한외 여과, 분자 체 크로마토그래피 (겔 여과), 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 등의 각종 액체 크로마토그래피, 투석법, 이들의 조합 등을 예시할 수 있다.

또, 발현시키는 재조합 단백질에 6 잔기로 이루어지는 히스티딘을 연결함으로써, 니켈 어피니티 컬럼으로 효율적으로 정제할 수 있다.

상기 방법을 조합함으로써 용이하게 고수율, 고순도로 목적으로 하는 폴리펩티드를 대량으로 제조할 수 있다.

본 발명의 항체는 통상적인 방법을 사용하여 상기의 항원을 동물에 면역하고, 생체 내에 생성되는 항체를 채취, 정제함으로써 얻을 수 있다.

또, 공지된 방법 (예를 들어, Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p.495-497, Kennet, R. ed., Monoclonal Antibody, p.365-367, Prenum Press, N.Y. (1980)) 에 따라, EPHA2 에 대한 항체를 생성하는 항체 생성 세포와 미에로마 세포를 융합시킴으로써 하이브리도마를 수립하여, 모노클로날 항체를 얻을 수도 있다.

(2) 항EPHA2 모노클로날 항체의 제조

EPHA2 와 특이적으로 결합하는 항체의 예로서, EPHA2 와 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 들 수 있지만, 그 취득 방법은, 이하에 기재하는 바와 같다.

모노클로날 항체의 제조시에는, 일반적으로 하기와 같은 작업 공정이 필요하다.

즉,

(a) 항원으로서 사용하는 생체 고분자의 정제,

(b) 항원을 동물에게 주사함으로써 면역한 후, 혈액을 채취하고 그 항체값을 검정하여 비장 적출 시기를 결정하고 나서, 항체 생성 세포를 조제하는 공정,

(c) 골수종 세포 (이하, 「미에로마」라고 한다) 의 조제,

(d) 항체 생성 세포와 미에로마의 세포 융합,

(e) 목적으로 하는 항체를 생성하는 하이브리도마군의 선별,

(f) 단일 세포 클론에 대한 분할 (클로닝),

(g) 경우에 따라서는, 모노클로날 항체를 대량으로 제조하기 위한 하이브리도마의 배양, 또는 하이브리도마를 이식한 동물의 사육,

(h) 이와 같이 하여 제조된 모노클로날 항체의 생리 활성, 및 그 결합 특이성의 검토, 혹은 표지 시약으로서의 특성의 검정 등이다.

이하, 모노클로날 항체의 제조법을 상기 공정을 따라 상세히 서술하지만, 그 항체의 제조법은 이것에 제한되지 않고, 예를 들어 비세포 이외의 항체 생성 세포 및 미에로마를 사용할 수도 있다.

(a) 항원의 정제

항원으로는, 상기한 바와 같은 방법으로 조제한 EPHA2 또는 그 부분 폴리펩티드를 사용할 수 있다.

또, EPHA2 발현 재조합체 세포로부터 조제한 막 획분, 또는 EPHA2 발현 재조합체 세포 자체, 또한 당업자에게 주지된 방법을 사용하여, 화학 합성한 본 발명의 단백질의 부분 펩티드를 항원으로서 사용할 수도 있다.

(b) 항체 생성 세포의 조제

공정 (a) 에서 얻어진 항원과, 당업자에게 주지된 애쥬번트, 예를 들어, 프로인드의 완전 또는 불완전 아쥬반트, 또는 칼리명반과 같은 보조제를 혼합하여, 면역원으로서 실험 동물에게 면역한다. 실험 동물은 공지된 하이브리도마 제조법에서 사용되는 동물을 지장 없이 사용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 마우스, 래트, 염소, 양, 소, 말 등을 사용할 수 있다. 단, 적출한 항체 생성 세포와 융합시키는 미에로마 세포의 입수 용이성 등의 관점에서, 마우스 또는 래트를 피면역 동물로 하는 것이 바람직하다.

또, 실제로 사용하는 마우스 및 래트의 계통은 특별히 제한은 없고, 마우스인 경우에는, 예를 들어 각 계통 A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BR, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R Ⅲ, SJL, SWR, WB, 129 등이, 또 래트인 경우에는, 예를 들어 Low, Lewis, Sprague-Dawley, ACI, BN, Fischer 등을 사용할 수 있다.

이들 마우스 및 래트는 예를 들어 닛폰 쿠레아, 닛폰 찰스리버 등 실험 동물 사육 판매업자로부터 입수할 수 있다.

이 중, 후술하는 미에로마 세포와의 융합 적합성을 감안하면, 마우스에서는 BALB/c 계통이, 래트에서는 low 계통이 피면역 동물로서 특히 바람직하다.

또, 항원의 인간과 마우스에서의 상동성을 고려하여, 자기 항체를 제거하는 생체 기구를 저하시킨 마우스, 즉 자기 면역 질환 마우스를 사용하는 것도 바람직하다.

또한, 이들 마우스 또는 래트 면역시의 주령은 바람직하게는 5 ∼ 12 주령, 더욱 바람직하게는 6 ∼ 8 주령이다.

EPHA2 또는 이 재조합체에 의해 동물을 면역하기 위해서는, 예를 들어, Weir, D.M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. Ⅱ. Ⅲ., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E.A. and Mayer, M.M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Spigfield, Illinois (1964) 등에 상세하게 기재되어 있는 공지된 방법을 사용할 수 있다.

이들의 면역법 중, 본 발명에 있어서 바람직한 방법을 구체적으로 나타내면, 예를 들어 이하와 같다.

즉, 먼저, 항원인 막 단백 획분, 혹은 항원을 발현시킨 세포를 동물의 피내 또는 복강 내에 투여한다.

단, 면역 효율을 높이기 위해서는 양자의 병용이 바람직하고, 전반은 피내 투여를 실시하고, 후반 또는 최종회만 복강 내 투여를 실시하면, 특히 면역 효율을 높일 수 있다.

항원의 투여 스케줄은 피면역 동물의 종류, 개체 차 등에 따라 상이한데, 일반적으로는, 항원 투여 횟수 3 ∼ 6 회, 투여 간격 2 ∼ 6 주일이 바람직하고, 투여 횟수 3 ∼ 4 회, 투여 간격 2 ∼ 4 주일이 더욱 바람직하다.

또, 항원의 투여량은 동물의 종류, 개체 차 등에 따라 상이한데, 일반적으로는, 0.05 ∼ 5 ㎎, 바람직하게는 0.1 ∼ 0.5 ㎎ 정도로 한다.

추가 면역은 이상과 같은 항원 투여의 1 ∼ 6 주일 후, 바람직하게는 2 ∼ 4 주일 후, 더욱 바람직하게는 2 ∼ 3 주일 후에 실시한다.

또한, 추가 면역을 실시할 때의 항원 투여량은 동물의 종류, 크기 등에 따라 상이한데, 일반적으로, 예를 들어 마우스의 경우에는, 0.05 ∼ 5 ㎎, 바람직하게는 0.1 ∼ 0.5 ㎎, 더욱 바람직하게는 0.1 ∼ 0.2 ㎎ 정도로 한다.

상기 추가 면역으로부터 1 ∼ 10 일 후, 바람직하게는 2 ∼ 5 일 후, 더욱 바람직하게는 2 ∼ 3 일 후에 피면역 동물로부터 항체 생성 세포를 포함하는 비장 세포 또는 림프구를 무균적으로 추출한다.

또한, 그 때에 항체값을 측정하고, 항체값이 충분히 높아진 동물을 항체 생성 세포의 공급원으로서 사용하면, 이후의 조작 효율을 높일 수 있다.

여기에서 사용되는 항체값의 측정법으로는, 예를 들어, RIA 법 또는 ELISA 법을 들 수 있는데, 이들의 방법에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서의 항체값의 측정은 예를 들어 ELISA 법에 의하면, 이하에 기재하는 바와 같은 순서에 의해 실시할 수 있다.

먼저, 정제 또는 부분 정제한 항원을 ELISA 용 96 구멍 플레이트 등의 고상 표면에 흡착시키고, 추가로 항원이 흡착되어 있은 고상 표면을 항원과 관계가 없는 단백질, 예를 들어 소혈청 알부민 (이하 「BSA」라고 한다) 에 의해 덮고, 그 표면을 세정 후, 제 1 항체로서 단계 희석시킨 시료 (예를 들어 마우스 혈청) 에 접촉시켜, 상기 항원에 시료 중의 항체를 결합시킨다.

추가로 제 2 항체로서, 효소 표지된 마우스 항체에 대한 항체를 추가하여 마우스 항체에 결합시키고, 세정 후 그 효소의 기질을 추가하여 기질 분해에 기초하는 발색에 의한 흡광도의 변화 등을 측정함으로써, 항체값을 산출한다.

이들 비장 세포 또는 림프구로부터의 항체 생성 세포의 분리는 공지된 방법 (예를 들어, Kohler et al., Nature (1975) 256, p.495, ; Kohler et al., Eur. J. Immnol. (1977)6, p.511, ; Milstein et al., Nature (1977), 266, p.550, ; Walsh, Nature, (1977)266, p.495,) 에 따라 실시할 수 있다.

예를 들어, 비장 세포인 경우에는, 세포를 얇게 잘라 스테인리스 메시로 여과한 후, 이글 최소 필수 배지 (EMEM) 에 부유시켜 항체 생성 세포를 분리하는 일반적 방법을 채용할 수 있다.

(c) 골수종 세포 (이하, 「미에로마」라고 한다) 의 조제

세포 융합에 사용하는 미에로마 세포에는 특별한 제한은 없고, 공지된 세포주에서 적절하게 선택하여 사용할 수 있다. 단, 융합 세포로부터 하이브리도마를 선택할 때의 편리성을 고려하여, 그 선택 수속이 확립되어 있는 HGPRT (Hipoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase) 결손주를 사용하는 것이 바람직하다.

즉, 마우스 유래의 X63-Ag8 (X63), NS1-ANS/1 (NS1), P3X63-Ag8.U1 (P3U1), X63-Ag8.653 (X63.653), SP2/0-Ag14 (SP2/0), MPC11-45.6TG1.7 (45.6TG), FO, S149/5XXO, BU.1 등, 래트 유래의 210.RSY3.Ag.1.2.3 (Y3) 등, 인간 유래의 U266AR (SKO-007), GMI500·GTG-A12 (GMI500), UC729-6, LICR-LON-HMy2 (HMy2), 8226AR/NIP4-1 (NP41) 등이다.

이들 HGPRr 결손주는 예를 들어, American Type Culture Collection (ATCC) 등으로부터 입수할 수 있다.

이들 세포주는 적당한 배지, 예를 들어, 8-아자구아닌 배지 [RPMI-1640 배지에 글루타민, 2-메르캅토에탄올, 겐타마이신, 및 소 태아 혈청 (이하 「FBS」라고 한다) 을 첨가한 배지에 8-아자구아닌을 첨가한 배지], 이스코브 개변 둘베코 배지 (Iscove's Modified Dulbecco's Medium ; 이하 「IMDM」이라고 한다), 또는 둘베코 개변 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium ; 이하 「DMEM」이라고 한다) 로 계대 배양하는데, 세포 융합의 3 내지 4 일 전에 정상 배지 [예를 들어, 10 % FBS 를 함유하는 ASF104 배지 (아지노모토 (주) 사 제조)] 에서 계대 배양하여, 융합 당일에 2 × 10⁷ 이상의 세포 수를 확보해 둔다.

(d) 세포 융합

항체 생성 세포와 미에로마 세포의 융합은 공지된 방법 (Weir, D.M., Handbook of Experimental Immunology Vol.I.Ⅱ.Ⅲ., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E.A. and Mayer, M.M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Spigfield, Illinois (1964) 등) 에 따라, 세포의 생존율을 극도로 저하시키지 않을 정도의 조건 하에서 적절히 실시할 수 있다.

그러한 방법은 예를 들어 폴리에틸렌글리콜 등의 고농도 폴리머 용액 중에서 항체 생성 세포와 미에로마 세포를 혼합하는 화학적 방법, 전기적 자극을 사용하는 물리적 방법 등을 사용할 수 있다.

이 중, 상기 화학적 방법의 구체예를 나타내면 이하와 같다.

즉, 고농도 폴리머 용액으로서 폴리에틸렌글리콜을 사용하는 경우에는, 분자량 1500 ∼ 6000, 바람직하게는 2000 ∼ 4000 의 폴리에틸렌글리콜 용액 중에서, 30 ∼ 40 ℃, 바람직하게는 35 ∼ 38 ℃ 의 온도에서 항체 생성 세포와 미에로마 세포를 1 ∼ 10 분간, 바람직하게는 5 ∼ 8 분간 혼합한다.

(e) 하이브리도마군의 선택

상기 세포 융합에 의해 얻어지는 하이브리도마의 선택 방법은 특별히 제한은 없지만, 통상 HAT (하이포크산틴·아미노프테린·티미딘) 선택법 (Kohler et al., Nature (1975) 256, p.495 ; Milstein et al., Nature (1977)266, p.550) 이 사용된다.

이 방법은 아미노프테린에서 생존할 수 없는 HGPRT 결손주의 미에로마 세포를 사용하여 하이브리도마를 얻는 경우에 유효하다.

즉, 미융합 세포 및 하이브리도마를 HAT 배지에서 배양함으로써, 아미노프테린에 대한 내성을 가진 하이브리도마만을 선택적으로 잔존시키고, 또한 증식시킬 수 있다.

(f) 단일 세포 클론에 대한 분할 (클로닝)

하이브리도마의 클로닝법으로는, 예를 들어 메틸셀룰로오스법, 연 (軟) 아가로오스법, 한계 희석법 등의 공지된 방법을 사용할 수 있다 (예를 들어 Barbara, B.M. and Stanley, M.S. : Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980) 참조). 이들 방법 중, 특히 한계 희석법이 바람직하다.

이 방법에서는, 마이크로 플레이트에 래트 태아 유래 섬유 아세포주, 혹은 정상 마우스 비장 세포, 흉선 세포, 복수 세포 등의 피더 (feeder) 를 접종시켜 둔다.

한편, 미리 하이브리도마를 0.2 ∼ 0.5 개/0.2 ㎖ 가 되도록 배지 중에서 희석시키고, 이 희석된 하이브리도마의 부유액을 각 웰에 0.1 ㎖ 씩 넣고, 일정 기간 마다 (예를 들어 3 일마다) 약 1/3 의 배지를 새로운 것으로 교환하면서 2 주일 정도 배양을 계속함으로써 하이브리도마의 클론을 증식시킬 수 있다.

항체값이 확인된 웰에 대해, 예를 들어 한계 희석법에 의한 클로닝을 2 ∼ 4회 반복하여, 안정적으로 항체값이 확인된 것을 항EPHA2 모노클로날 항체 생성 하이브리도마주로서 선택할 수 있다.

이와 같이 하여 클로닝된 하이브리도마주의 예로는, 하이브리도마 SH348-1및 하이브리도마 SH357-1 을 들 수 있다. 하이브리도마 SH348-1 및 하이브리도마 SH357-1 은 일본독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허생물 기탁센터 (주소 : 일본국 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1-1-1 츄오우 제 6) 에 2007년 6월 8일부로 기탁되어, 하이브리도마 SH348-1 은 SH348-1 의 명칭으로 기탁 번호 FERM BP-10836 이 부여되고, 하이브리도마 SH357-1 은 SH357-1 의 명칭으로 기탁 번호 FERM BP-10837 이 부여되어 있다.

또한, 본 명세서 중에 있어서는, 하이브리도마 SH348-1 이 생성하는 항체를, 「SH348-1」이라고 하고, 하이브리도마 SH357-1 이 생성하는 항체를, 「SH357-1」로 기재한다.

(g) 하이브리도마 배양에 의한 모노클로날 항체의 조제

이와 같이 하여 선택된 하이브리도마는, 이것을 배양함으로써, 모노클로날 항체를 효율적으로 얻을 수 있는데, 배양에 앞서, 목적으로 하는 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마를 스크리닝하는 것이 바람직하다.

이 스크리닝에는 그 자체 기지의 방법을 채용할 수 있다.

본 발명에 있어서의 항체값의 측정은 예를 들어 상기 (b) 의 항목에서 설명한 ELISA 법에 의해 실시할 수 있다.

이상과 같은 방법에 의해 얻어진 하이브리도마는 액체 질소 중 또는 -80 ℃ 이하의 냉동고 중에 동결 상태로 보존할 수 있다.

또, 클로닝을 완료한 하이브리도마는 HAT 배지로부터 아미노프테린을 제외한 HT 배지에서 몇 회를 계대한 후, 정상 배지로 바꾸어 배양할 수 있다.

대량 배양은 대형 배양병을 사용한 회전 배양, 혹은 스피너 배양에 의해 실시된다.

이 대량 배양에 있어서의 상청을, 겔 여과 등, 당업자에게 주지된 방법을 사용하여 정제함으로써, 본 발명의 단백질에 특이적으로 결합되는 모노클로날 항체를 얻을 수 있다.

또, 동일 계통의 마우스 (예를 들어, 상기의 BALB/c), 혹은 Nu/Nu 마우스의 복강 내에 하이브리도마를 주사하고, 그 하이브리도마를 증식시킴으로써, 본 발명의 모노클로날 항체를 대량으로 포함하는 복수를 얻을 수 있다.

복강 내에 투여하는 경우에는, 사전 (3 ∼ 7 일 전) 에 2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸(2,6,10,14-tetramethyl pentadecane) (프리스턴) 등의 광물유를 투여하면, 보다 다량의 복수가 얻어진다.

예를 들어, 하이브리도마와 동일 계통의 마우스의 복강 내에 미리 면역 억제제를 주사하고, T 세포를 불활성화한 후, 20 일 후에 10⁶ ∼ 10⁷ 개의 하이브리도마·클론 세포를 혈청을 함유하지 않는 배지 중에 부유 (0.5 ㎖) 시켜 복강 내에 투여하고, 통상 복부가 팽만하여, 복수가 찬 지점에서 마우스로부터 복수를 채취한다.

이 방법에 의해, 배양액 중에 비해 약 100 배 이상의 농도의 모노클로날 항체가 얻어진다.

상기 방법에 의해 얻은 모노클로날 항체는 예를 들어 Weir, D.M. : Handbook of Experimental Immunology, Vol. I, Ⅱ, Ⅲ, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978) 에 기재되어 있는 방법에 의해 정제할 수 있다.

즉, 황산암모늄 염석법, 겔 여과법, 이온 교환 크로마토그래피법, 어피니티 크로마토그래피법 등이다.

정제의 간편한 방법으로는, 시판되는 모노클로날 항체 정제 키트 (예를 들어, MAb Trap GⅡ 키트 ; 팔마시아사 제조) 등을 사용할 수도 있다.

이렇게 하여 얻어지는 모노클로날 항체는 EPHA2 에 대해 높은 항원 특이성을 갖는다.

(h) 모노클로날 항체의 검정

이렇게 하여 얻어진 모노클로날 항체의 아이소 타입 및 서브 클래스의 결정은 이하와 같이 실시할 수 있다.

먼저, 동정 (同定) 법으로는 옥터로니 (Ouchterlony) 법, ELISA 법, 또는 RIA 법을 들 수 있다.

옥터로니법은 간편하지만, 모노클로날 항체의 농도가 낮은 경우에는 농축 조작이 필요하다.

한편, ELISA 법 또는 RIA 법을 사용한 경우에는, 배양 상청을 그대로 항원 흡착 고상과 반응시키고, 추가로 제 ２ 차 항체로서 각종 임뮤노글로블린 아이소 타입, 서브 클래스에 대응하는 항체를 사용함으로써, 모노클로날 항체의 아이소 타입, 서브 클래스를 동정할 수 있다.

또, 더욱 간편한 방법으로서, 시판되는 동정용의 키트 (예를 들어, 마우스 타이퍼 키트 ; 바이오 래드사 제조) 등을 이용할 수도 있다.

또한, 단백질의 정량은 포린로우리법, 및 280 ㎚ 에 있어서의 흡광도 [1.4(OD280) = 임뮤노글로블린 1 ㎎/㎖] 로부터 산출하는 방법에 의해 실시할 수 있다.

(3) 그 밖의 항체

본 발명의 항체에는, 상기 EPHA2 에 대한 모노클로날 항체에 추가하여, 인간에 대한 이종 (異種) 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체, 예를 들어, 키메라 (Chimeric) 항체, 인간화 (Humanized) 항체, 인간 항체 등도 포함된다. 이들 항체는 이미 알려진 방법을 사용하여 제조할 수 있다.

키메라 항체로는, 항체의 가변 영역과 정상 영역이 서로 이종인 항체를 들 수 있고, 예를 들어, 마우스 유래 항체의 가변 영역을 인간 유래의 정상 영역에 접합시킨 키메라 항체를 들 수 있다 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851-6855, (1984) 참조).

인간화 항체로는, 상보성 결정 영역 (CDR ; complementarity determining region) 만을 인간 유래의 항체에 삽입한 항체 (Nature (1986) 321, p.522-525 참조), CDR 이식법에 의해, CDR 의 배열에 추가하여 일부의 프레임 워크의 아미노산잔기도 인간 항체에 이식한 항체 (WO90/07861호, US6972323 호 참조) 를 들 수 있다.

또한, 항인간 항체를 들 수 있다. 항EPHA2 인간 항체란, 인간 염색체 유래의 항체의 유전자 배열만을 갖는 인간 항체를 의미한다. 항EPHA2 인간 항체는 인간 항체의 H 사슬과 L 사슬의 유전자를 포함하는 인간 염색체 단편을 갖는 인간 항체 생성 마우스를 사용한 방법 (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p.133-143, ; Kuroiwa, Y. et al., Nuc. Acids Res. (1998) 26, p.3447-3448 ; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology : Basic and Applied Aspects vol.10, p.69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. and Iijima, S.eds), Kluwer Academic Publishers, 1999. ; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, p.722-727 등을 참조.) 에 의해 취득할 수 있다.

이와 같은 트랜스제닉 동물은 구체적으로는 비인간 포유 동물의 내재성 면역 글로불린 중사슬 및 경사슬의 유전자좌가 파괴되고, 대신에 효모 인공 염색체 (Yeast artificial chromosome, YAC) 벡터 등을 개재하여 인간 면역 글로불린 중사슬 및 경사슬의 유전자좌가 도입된 유전자 재조합 동물을, 녹아웃 동물 및 트랜스제닉 동물의 제작, 및 이들의 동물끼리를 교배함으로서 만들어 낼 수 있다.

또, 유전자 재조합 기술에 의해, 그러한 인간 항체의 중사슬 및 경사슬 각각을 코드하는 cDNA, 바람직하게는 그 cDNA 를 함유하는 벡터에 의해 진핵 세포를 형질 전환시키고, 유전자 재조합 인간 모노클로날 항체를 생성하는 형질 전환 세포를 배양함으로써, 이 항체를 배양 상청 중에서 얻을 수도 있다.

여기에서, 숙주로는 예를 들어 진핵 세포, 바람직하게는 CHO 세포, 림프구나 미에로마 등의 포유 동물 세포를 사용할 수 있다.

또, 인간 항체 라이브러리로부터 선별한 파지 디스플레이 유래의 인간 항체를 취득하는 방법 (Wormstone, I.M. et al, Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43(7), p.2301-2308 ; Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1(2), p.189-203 ; Siriwardena, D. et al., Opthalmology (2002) 109(3), p.427-431 등 참조.) 도 알려져 있다.

예를 들어, 인간 항체의 가변 영역을 단사슬 항체 (scFv) 로서 파지 표면에 발현시켜, 항원에 결합하는 파지를 선택하는 파지 디스플레이법 (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p.1105-1116) 을 사용할 수 있다.

또, 동일하게 인간 항체의 Fab (항원 결합 단편 ; Antigen-binding Fragment) 를 파지 표면에 발현시켜, 항원에 결합하는 파지를 선택하는 파지 디스플레이법 (국제 공개공보 WO97/08320호, WO01/05950호) 을 사용할 수도 있다.

항원에 결합함으로써 선택된 파지의 유전자를 해석함으로써, 항원에 결합하는 인간 항체의 가변 영역을 코드하는 DNA 배열을 결정할 수 있다.

항원에 결합하는 scFv 나 Fab 의 DNA 배열이 분명해지면, 그곳에서 CDR 의 배열을 추출하여 당해 배열을 갖는 발현 벡터를 제조하고, 적당한 숙주에 도입하여 발현시킴으로써 인간 항체를 취득할 수 있다 (WO92/01047호, WO92/20791호, WO93/06213호, WO93/11236호, WO93/19172호, WO95/01438호, WO95/15388호, Annu. Rev. lmmunol (1994) 12, p.433-455, Nature Biotechnology (2005) 23(9), p.1105-1116).

항체 유전자를 일단 단리한 후, 적당한 숙주에 도입하여 항체를 제조하는 경우에는, 적당한 숙주와 발현 벡터의 조합을 사용할 수 있다.

진핵 세포를 숙주로서 사용하는 경우, 동물 세포, 식물 세포, 진핵 미생물을 사용할 수 있다.

동물 세포로는, (1) 포유류 세포, 예를 들어, 원숭이의 세포인 COS 세포 (Gluzman, Y.Cell (1981) 23, p.175-182, ATCC CRL-1650), 마우스 섬유 아세포 NIH3T3 (ATCC N0.CRL-1658) 또는 차이니즈·햄스터 난소 세포 (CHO 세포, ATCC CCL-61) 의 디히드로엽산 환원 효소 결손주 (Urlaub, G. and Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1980) 77, p.4126-4220) 를 들 수 있다.

또, 이들의 숙주로는, 당사슬 구조가 개변되어, 항체의 ADCC 활성 (항체 의존성 세포 장해 활성) 이나 CDC 활성이 높아진 항체를 발현하도록 개편된 숙주를 사용할 수도 있고, 그러한 숙주로는, 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 중, 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되어 있지 않은 당사슬의 비율이 20 % 이상인 항체 조성물을 생성하는 항체 분자를 코드하는 유전자가 도입된 CHO 세포를 들 수 있다 (WO02/31140호 참조.).

원핵 세포를 사용하는 경우에는, 예를 들어, 대장균, 고초균을 들 수 있다.

이들 세포에, 목적으로 하는 항체 유전자를 형질 전환에 의해 도입하고, 형질 전환된 세포를 in vitro 에서 배양함으로써 항체가 얻어진다.

본 발명의 항체의 아이소 타입에는 제한은 없고, 예를 들어 IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (IgA1, IgA2), IgD 혹은 IgE 등을 들 수 있는데, 바람직하게는 IgG 또는 IgM 를 들 수 있다.

또 본 발명의 항체는 항체의 항원 결합부를 갖는 항체의 단편 또는 그 수식물이어도 된다.

예를 들어, 항체의 단편으로는, Fab, F(ab')2, Fv, 또는 중사슬 및 경사슬의 Fv 를 적당한 링커로 연결시킨 싱글 체인 Fv (scFv), 디아보디 (diabody (diabodies)), 선 형상 항체 및 항체 단편으로 형성된 다특이성 항체 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 항체는 적어도 2 종류의 상이한 항원에 대해 특이성을 갖는 다특이성 항체이어도 된다.

통상적으로 이와 같은 분자는 2 개의 항원을 결합하는 것인데 (즉, 이중 특이성 항체 (bispecific antibody)), 본 발명에 있어서의 「다특이성 항체」는 그 이상 (예를 들어, 3 종류) 의 항원에 대해 특이성을 갖는 항체를 함유하는 것이다.

본 발명의 항체는, 다특이성 항체는 전체 길이로 이루어지는 항체, 또는 그러한 항체의 단편 (예를 들어, F(ab')2 2 중 특이성 항체) 이어도 된다. 2 중 특이성 항체는 2 종류 항체의 중사슬와 경사슬 (HL 쌍) 를 결합시켜 제조할 수도 있고, 상이한 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마를 융합시켜, 이중 특이성 항체 생성 융합 세포를 제조함으로써도 제조할 수 있다 (Millstein et al., Nature (1983) 305, p.537-539).

본 발명의 항체는 단사슬 항체 (scFv 라고도 기재한다) 이어도 된다. 단사슬 항체는 항체의 중사슬 V 영역과 경사슬 V 영역을 폴리펩티드의 링커로 연결함으로써 얻어지는 (Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113 (Rosenburg 및 Moore 편, Springer Verlag, NewYork, p.269-315 (1994), Nature Biotechnology (2005), 23, p.1126-1136).

단사슬 항체를 제조하는 방법은 당기술 분야에 있어서 주지인 (예를 들어, 미국 특허공보 제4,946,778호, 미국 특허공보 제5,260,203호, 미국 특허공보 제5,091,513호, 미국 특허공보 제5,455,O30호 등을 참조). 이 scFv 에 있어서, 중사슬 V 영역과 경사슬 V 영역은, 콘쥬게이트를 만들지 않는 링커, 바람직하게는 폴리펩티드 링커를 통하여 연결된다 (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988), 85, p.5879-5883) scFv 에 있어서의 중사슬 V 영역 및 경사슬 V 영역은 동일한 항체에서 유래해도 되고, 다른 항체에서 유래해도 된다.

V 영역을 연결하는 펩티드 링커로는, 예를 들어 12 ∼ 19 잔기로 이루어지는 임의의 단사슬의 사슬 펩티드가 사용된다.

scFv 를 코드하는 DNA 는 상기 항체의 중사슬 또는 중사슬 V 영역을 코드하는 DNA, 및 경사슬 또는 경사슬 V 영역을 코드하는 DNA 중, 그들 배열 중 전부 또는 원하는 아미노산 배열을 코드하는 DNA 부분을 주형으로 하고, 그 양단을 규정하는 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 법에 의해 증폭시키고, 이어서, 추가로 펩티드 링커 부분을 코드하는 DNA, 및 그 양단이 각각 중사슬, 경사슬와 연결되도록 규정하는 프라이머 쌍을 조합하여 증폭시킴으로써 얻어진다.

또, 일단 scFv 를 코드하는 DNA 가 제조되면, 그것들을 함유하는 발현 벡터, 및 그 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주를 통상적인 방법에 따라 얻을 수 있고, 또, 그 숙주를 사용함으로써, 통상적인 방법에 따라 scFv 를 얻을 수 있다.

이들의 항체 단편은 상기와 동일하게 하여 유전자를 취득하여 발현시키고, 숙주에 의해 생성시킬 수 있다.

본 발명의 항체는 아미노산 배열이 상이한 복수 종류의 항EPHA2 항체의 혼합물인 폴리클로날 항체이어도 된다. 폴리클로날 항체의 일례로는, CDR 이 상이한 복수 종류의 항체의 혼합물을 들 수 있다. 그러한 폴리클로날 항체로는, 상이한 항체를 생성하는 세포의 혼합물을 배양하고, 그 배양물로부터 정제된 항체를 사용할 수 있다 (WO2004/061104호 참조).

항체의 수식물로서, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 등의 각종 분자와 결합한 항체를 사용할 수도 있다.

본 발명의 항체는 또한 이들의 항체와 다른 약제와 콘쥬게이트를 형성하고 있는 것 (Immunoconjugate) 이어도 된다. 이와 같은 항체의 예로는, 그 항체가 방사성 물질이나 약리 작용을 갖는 화합물과 결합되어 있는 것을 들 수 있다 (Nature Biotechnology (2005) 23, p.1137-1146).

얻어진 항체는 균일하게까지 정제할 수 있다. 항체의 분리, 정제는 통상적인 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법을 사용하면 된다.

예를 들어 크로마토그래피 칼럼, 필터, 한외 여과, 염석, 투석, 조제용 폴리아크릴아미드겔 전기 영동, 등전점 전기 영동 등을 적절히 선택, 조합하면, 항체를 분리, 정제할 수 있는데 (Strategies for Protein Purification and Characterization : A Laboratory Course Manual, Daniel R.Marshak et al.eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996) ; Antibodies : A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), 이들에 한정되는 것은 아니다.

크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다.

이들 크로마토그래피는 HPLC 나 FPLC 등의 액상 크로마토그래피를 사용하여 실시할 수 있다.

어피니티 크로마토그래피에 사용하는 칼럼으로는, 프로테인 A 칼럼, 프로테인 G 칼럼을 들 수 있다.

예를 들어 프로테인 A 칼럼을 사용한 칼럼으로서, Hyper D, POROS, Sepharose F.F. (Pharmacia) 등을 들 수 있다.

또 항원을 고정화시킨 담체를 사용하여, 항원에 대한 결합성을 이용하여 항체를 정제할 수도 있다.

3. 본 발명의 항체의 성질

상기 방법에 의해 취득되는 본 발명의 항EPHA2 항체는 이하의 성질을 갖는다.

(1) 본 발명의 하나의 항체는 하기의 a) 내지 e) 에 나타내는 성질을 갖는다.

a) EPHA2 티로신 잔기의 인산화능을 갖는다. :

b) EPHA2 발현 세포에 대해 ADCC 활성을 갖는다. :

c) EPHA2 발현 세포에 대해 CDC 활성을 갖는다. :

d) In vivo 에서 항종양 활성을 갖는다. :

e) 배열표의 배열 번호 8 의 아미노산 번호 426 내지 534 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다.

이와 같은 성질을 갖는 항체의 예로는, 이하의 1) 내지 8) 로 이루어지는 군 에서 선택되는 어느 하나의 항체를 들 수 있다.

1) SH348-1,

2) 하이브리도마 SH348-1 (FERM BP-10836) 이 생성하는 항체에 의해 인식되는 에피토프를 인식하는 항체,

3) 중사슬 가변 영역의 상보성 결정 영역으로서, 배열표의 배열 번호 59, 61 및 63 에 나타나는 아미노산 배열을 갖고, 경사슬 가변 영역의 상보성 결정 영역으로서, 배열표의 배열 번호 65, 67 및 69 에 나타나는 아미노산 배열을 갖는 항체,

4) 이하의 i) 및 ⅱ) 의 특징을 갖는 항체 :

i) 일반식 (Ⅰ) 로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 중사슬 펩티드를 갖는다 :

-FRH₁-CDRH₁-FRH₂-CDRH₂-FRH₃-CDRH₃-FRH₄-(I)

(식 중, FRH₁ 은 18 내지 30 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRH₁ 은 배열표의 배열 번호 59 로 나타나는 아미노산 배열을 나타내고, FRH₂ 는 14 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRH₂ 는 배열표의 배열 번호 61 로 나타나는 아미노산 배열을 나타내고, FRH₃ 은 32 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRH₃ 은 배열표의 배열 번호 63 으로 나타나는 아미노산 배열을 나타내고, FRH₄ 는 11 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, 각 아미노산은 각각 펩티드 결합으로 연결되어 있다) ;

ⅱ) 일반식 (Ⅱ) 로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 것으로 이루어지는 경사슬 폴리펩티드를 갖는다 :

-FRL₁-CDRL₁-FRL₂-CDRL₂-FRL₃-CDRL₃-FRL₄-(Ⅱ)

(식 중, FRL₁ 은 23 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRL₁ 은 배열표의 배열 번호 65 로 나타나는 아미노산 배열을 나타내고, FRL₂ 는 15 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRL₂ 는 배열표의 배열 번호 67 로 나타나는 아미노산 배열을 나타내고, FRL₃ 은 32 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRL₃ 은 배열표의 배열 번호 69 로 나타나는 아미노산 배열을 나타내고, FRL₄ 는 10 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, 각 아미노산은 각각 펩티드 결합으로 연결되어 있다),

5) SH357-1,

6) 하이브리도마 SH357-1 (FERM BP-10837) 이 생성하는 항체에 의해 인식되는 에피토프를 인식하는 항체,

7) 중사슬 가변 영역의 상보성 결정 영역으로서, 배열표의 배열 번호 71, 73 및 75 에 나타나는 아미노산 배열을 갖고, 경사슬 가변 영역의 상보성 결정 영역으로서, 배열표의 배열 번호 77, 79 및 81 에 나타나는 아미노산 배열을 갖는 항체,

8) 이하의 i) 및 ⅱ) 에 나타내는 특징을 갖는, 5) 내지 7) 에서 선택되는 어느 하나에 기재된 항체 :

-FRH₁-CDRH₁-FRH₂-CDRH₂-FRH₃-CDRH₃-FRH₄-(I)

(식 중, FRH₁ 은 18 내지 30 개의 아미노산 배열로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRH₁ 은 배열표의 배열 번호 71 로 나타나는 아미노산 배열을 나타내고, FRH₂ 는 14 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRH₂ 는 배열표의 배열 번호 73 으로 나타나는 아미노산 배열을 나타내고, FRH₃ 은 32 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRH₄ 는 배열표의 배열 번호 75 로 나타나는 아미노산 배열을 나타내고, FRH₄ 는 11 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, 각 아미노산은 각각 펩티드 결합으로 연결되어 있다.) ;

-FRL₁-CDRL₁-FRL₂-CDRL₂-FRL₃-CDRL₃-FRL₄-(Ⅱ)

(식 중, FRH₁ 은 23 개의 아미노산 배열로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRL₁ 은 배열표의 배열 번호 77 로 나타나는 아미노산 배열을 나타내고, FRL₂ 는 15 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRL₂ 는 배열표의 배열 번호 79 로 나타나는 아미노산 배열을 나타내고, FRL₃ 은 32 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRL₃ 은 배열표의 배열 번호 81 로 나타나는 아미노산 배열을 나타내고, FRL₄ 는 10 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, 각 아미노산은 각각 펩티드 결합으로 연결되어 있다).

(2) 본 발명의 다른 하나의 항체는 하기의 a) 내지 f) 에 나타내는 성질을 갖는다.

a) EPHA2 티로신 잔기의 인산화능을 갖지 않는다. :

b) EPHA2 단백질 양의 감소 작용을 나타낸다. :

c) EPHA2 발현 세포에 대해 ADCC 활성을 갖는다. :

d) EPHA2 발현 세포에 대해 CDC 활성을 갖는다. :

e) In vivo 에서 항종양 활성을 갖는다. :

f) 배열표의 배열 번호 8 의 아미노산 번호 426 내지 534 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다.

이와 같은 성질을 갖는 항체의 예로는, 이하의 1) 내지 4) 로 이루어지는 군 에서 선택되는 어느 하나의 항체를 들 수 있다.

1) SH348-1,

4) 이하의 i) 및 ⅱ) 의 특징을 갖는 항체 :

i) 일반식 Ⅰ) 로 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 중사슬 펩티드를 갖는다 :

-FRH₁-CDRH₁-FRH₂-CDRH₂-FRH₃-CDRH₃-FRH₄-(I)

(식 중, FRH₁ 은 18 내지 30 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRH₁은 배열표의 배열 번호 59 로 나타나는 아미노산 배열을 나타내고, FRH₂ 는 14 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRH₂ 는 배열표의 배열 번호 61 로 나타나는 아미노산 배열을 나타내고, FRH₃ 은 32 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRH₃ 은 배열표의 배열 번호 63 으로 나타나는 아미노산 배열을 나타내고, FRH₄ 는 11 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, 각 아미노산은 각각 펩티드 결합으로 연결되어 있다) ;

-FRL₁-CDRL₁-FRL₂-CDRL₂-FRL₃-CDRL₃-FRL₄-(Ⅱ)

(식 중, FRL₁ 은 23 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRL₁ 은 배열표의 배열 번호 65 로 나타나는 아미노산 배열을 나타내고, FRL₂ 는 15 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRL₂ 는 배열표의 배열 번호 67 로 나타나는 아미노산 배열을 나타내고, FRL₃ 은 32 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRL₃ 은 배열표의 배열 번호 69 로 나타나는 아미노산 배열을 나타내고, FRL₄ 는 10 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, 각 아미노산은 각각 펩티드 결합으로 연결되어 있다).

(3) 본 발명의 다른 하나의 항체는 하기의 a) 내지 e) 에 나타내는 성질을 갖는다.

a) EPHA2 티로신 잔기의 인산화능을 갖지 않는다.

b) EPHA2 단백질 양의 감소 작용을 나타내지 않는다.

c) ADCC 활성을 갖는다.

d) CDC 활성을 갖는다.

e) In vivo 에서 항종양 활성을 갖는다.

이와 같은 성질을 갖는 항체의 예로는, 이하의 1) 내지 4) 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 항체를 들 수 있다.

1) SH357-1,

2) 하이브리도마 SH357-1 (FERM BP-10837) 이 생성하는 항체에 의해 인식되는 에피토프를 인식하는 항체,

3) 중사슬 가변 영역의 상보성 결정 영역으로서, 배열표의 배열 번호 71, 73 및 75 에 나타나는 아미노산 배열을 갖고, 경사슬 가변 영역의 상보성 결정 영역으로서, 배열표의 배열 번호 77, 79 및 81 에 나타나는 아미노산 배열을 갖는 항체,

4) 이하의 i) 및 ⅱ) 에 나타내는 성질을 갖는 항체 :

-FRH₁-CDRH₁-FRH₂-CDRH₂-FRH₃-CDRH₃-FRH₄-(I)

(식 중, FRH₁ 은 18 내지 30 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRH₁ 은 배열표의 배열 번호 71 로 나타나는 아미노산 배열을 나타내고, FRH₂ 는 14 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRH₂ 는 배열표의 배열 번호 73 으로 나타나는 아미노산 배열을 나타내고, FRH₃ 은 32 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRH₃ 은 배열표의 배열 번호 75 로 나타나는 아미노산 배열을 나타내고, FRH₄ 는 11개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, 각 아미노산은 각각 펩티드 결합으로 연결되어 있다) ;

-FRL₁-CDRL₁-FRL₂-CDRL₂-FRL₃-CDRL₃-FRL₄-(Ⅱ)

(식 중, FRL₁ 은 23 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRL₁ 은 배열표의 배열 번호 77 로 나타나는 아미노산 배열을 나타내고, FRL₂ 는 15 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRL₂ 는 배열표의 배열 번호 79 로 나타나는 아미노산 배열을 나타내고, FRL₃ 은 32 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, CDRL₃ 은 배열표의 배열 번호 81 로 나타나는 아미노산 배열을 나타내고, FRL₄ 는 10 개의 아미노산으로 이루어지는 임의의 아미노산 배열을 나타내고, 각 아미노산은 각각 펩티드 결합으로 연결되어 있다).

4. 항EPHA2 항체를 함유하는 의약

본 발명의 항EPHA2 항체는 의약으로서 특히 암의 치료를 목적으로 한 의약 조성물로서, 혹은 이와 같은 질환의 면역학적 진단을 위한 항체로서 유용하다.

암의 종류로는, 유방암, 식도암, 전립선암, 위암, 비소 세포 폐암, 대장암 및 다형 신경 교아종을 바람직하게 들 수 있는데, 이들에 한정되지 않는다.

본 발명은 치료에 유효한 양의 항EPHA2 항체와 약학상 허용되는 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 보조제를 포함하는 의약 조성물도 제공한다.

본 발명의 의약 조성물에 있어서 허용되는 제제에 사용하는 물질로는 바람직하게는 투여량이나 투여 농도에 있어서, 의약 조성물이 투여되는 인간에 대해 비독성인 것이 바람직하다.

본 발명의 의약 조성물은 pH, 침투압, 점도, 투명도, 색, 등장 (等張) 성, 무균성, 안정성, 용해율, 서방률, 흡수율, 침투율을 바꾸거나, 유지하거나, 보전하거나 하기 위한 제제용 물질을 함유할 수 있다.

제제용 물질로서 이하의 것을 들 수 있는데, 이들에 제한되지 않는다 ; 글리신, 알라닌, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신 등의 아미노산류, 항균제, 아스코르브산, 황산나트륨 또는 아황산수소나트륨 등의 항산화제, 인산, 시트르산, 붕산 버퍼, 탄산수소, 트리스-염산 (Tris-HCl) 용액 등의 완충제, 만니톨이나 글리신 등의 충전제, 에틸렌디아민 4 아세트산 (EDTA) 등의 킬레이트제, 카페인, 폴리비닐피롤리딘, β-시클로덱스트린이나 히드록시프로필-β-시클로덱스트린 등의 착화제, 글루코오스, 만노오스 또 덱스트린 등의 증량제, 단당류, 이당류나 글루코오스, 만노오스나 덱스트린 등의 다른 탄수화물, 착색제, 향미제, 희석제, 유화제나 폴리비닐피롤리딘 등의 친수 폴리머, 저분자량 폴리펩티드, 염 형성 카운터 이온, 염화벤즈알코늄, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로렉시딘, 소르브산 또는 과산화수소 등의 방부제, 글리세린, 프로필렌·글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜 등의 용매, 만니톨 또는 소르비톨 등의 당 알코올, 현탁제, PEG, 소르비탄 에스테르, 폴리소르비테이트 20 이나 폴리소르비테이트 80 등 폴리소르비테이트, 트리톤 (triton), 트로메타민 (tromethamine), 레시틴 또는 콜레스테롤 등의 계면 활성제, 수크로오스나 소르비톨 등의 안정화 증강제, 염화나트륨, 염화칼륨이나 만니톨·소르비톨 등의 탄성 증강제, 수송제, 희석제, 부형제, 및/또는 약학상의 보조제.

이들 제제용 물질의 첨가량은 항EPHA2 항체의 중량에 대해 0.01 ∼ 100배, 특히 0.1 ∼ 10 배 첨가하는 것이 바람직하다.

또한, 항EPHA2 항체를 리포솜 중에 함유하도록 한 임뮤노리포솜이나 항EPHA2 항체와 리포솜을 결합한 항체 (미국 특허공보 제6214388호) 를 함유하는 의약 조성물도 본 발명에 포함된다.

제제 중의 바람직한 의약 조성물의 조성은 당업자에 의해, 적용 질환, 적용 투여 경로 등에 따라 적절히 결정할 수 있다.

의약 조성물 중의 부형제나 담체는 액체이어도 되고 고체이어도 된다.

적당한 부형제나 담체는 주사용의 물이나 생리 식염수, 인공 뇌척수액이나 비경구 투여에 통상 사용되고 있는 다른 물질이어도 된다.

중성의 생리 식염수나 혈청 알부민을 함유하는 생리 식염수를 담체에 사용할 수도 있다.

의약 조성물에는 pH 7.0-8.5 의 Tris 버퍼나 pH 4.0-5.5 의 아세트산 버퍼나 그것들에 소르비톨이나 다른 화합물을 포함할 수도 있다.

본 발명의 의약 조성물은 선택된 조성에서 필요한 순도로 적당한 약제로서, 동결 건조물 혹은 액체로서 준비된다.

항EPHA2 항체를 함유하는 의약 조성물은 수크로오스와 같은 적당한 부형제를 사용한 동결 건조물로서 성형될 수도 있다.

본 발명의 의약 조성물은 비경구 투여용으로 조제할 수 있고, 경구에 의한 소화관 흡수용으로 조제할 수도 있다.

제제의 조성 및 농도는 투여 방법에 따라 결정할 수 있고, 본 발명의 의약 조성물에 함유되는, 항EPHA2 항체의 EPHA2 에 대한 친화성, 즉, EPHA2 에 대한 해리 정수 (Kd 값) 에 대해, 친화성이 높을 (Kd 값이 낮을) 수록, 인간에 대한 투여량을 적게 약효를 발휘할 수 있기 때문에, 이 결과에 기초하여 본 발명의 의약 조성물의 인간에 대한 투여량을 결정할 수도 있다.

투여량은 항EPHA2 항체를 인간에 대해 투여하기 위해서는, 통상 약 0.1 ∼ 100 ㎎/kg 를 1 ∼ 180 일간에 1 회 투여하면 된다.

본 발명의 의약 조성물의 형태로는, 링겔을 포함하는 주사제, 좌제, 경비제, 설하제, 경피 흡수제 등을 들 수 있다.

본 발명의 의약 조성물을 투여함으로써 EPHA2 를 발현하고 있는 종양의 증식을 억제할 수 있게 된다.

실시예

이하, 실시예에 있어서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하는데, 본 발명은 이들에 한정되지 않는다.

또한, 하기 실시예에 있어서 유전자 조작에 관한 각 조작은 특별히 명시가 없는 한, 「몰레큘러 클로닝 (Molecular Cloning)」(Sambrook, J., Fritsch, E.F 및 Maniatis, T.저, Cold Spring Harbor Laboratory Press 로부터 1989년 발간) 에 기재된 방법 및 그 밖의 당업자가 사용하는 실험서에 기재된 방법에 의해 실시하거나, 또는, 시판되는 시약이나 키트를 사용하는 경우에는 시판품의 지시서에 따라 실시하였다.

(실시예 1) 플라스미드 제작

1)-1 인간 EPHA2 발현 벡터의 제조

1)-1-1 전체 길이 인간 EPHA2 발현 벡터의 제조

SK-OV-3 세포 total RNA 로부터 합성한 cDNA 를 주형으로 프라이머 세트 :

프라이머 1 :

5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcggggatcggaccgagagcgagaag-3' (배열표의 배열 번호 3) 및,

프라이머 2 :

5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcctagatggggatccccacagtgttcacctggtcctt-3' (배열표의 배열 번호 4)

를 사용하여 PCR 반응을 실시하고, 인간 EPHA2 를 코드하는 cDNA 를 증폭시켰다. PCR 산물을 BP Clonase (Invitrogen 사 제조) 를 사용하여 pDONR221 (In vitrogen 사 제조) 에 삽입하여 엔트리 벡터를 제조하였다. GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen 사 제조) 와 프라이머 세트 :

프라이머 3 : 5'-ctgtggggatccccatcgacccagctttc-3' (배열표의 배열 번호 5) 및,

프라이머 4 : 5'-gatggggatccccacagtgttcacctggtc-3' (배열표의 배열 번호 6)를 사용하여, 엔트리 벡터 중의 EPHA2 유전자로부터 스톱 코돈을 제거하였다. 얻어진 엔트리 벡터로부터 pcDNA-DEST40 Gateway Vector (Invitrogen 사 제조) 에 LR Clonase (Invitrogen 사 제조) 를 사용하여 재조합 반응을 실시하고, pcDNA-DEST40-EPHA2 를 제조하였다 (본 벡터는 attB1 과 attB2 배열의 사이에 배열표의 배열 번호 7 에 나타나는 뉴클레오티드 배열을 갖는다). 또 본 벡터에 클로닝된 EPHA2 유전자의 ORF 부분의 배열은 배열표의 배열 번호 7 의 뉴클레오티드 번호 33 내지 2960 에 나타내고 있다. 또 EPHA2 의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 8 에 나타내고 있다.

1)-1-2 EPHA2 세포 외 영역 발현 벡터의 제조

인간 EPHA2 세포 외 영역 폴리펩티드 (배열표의 배열 번호 8 의 아미노산 번호 1 내지 534 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어진다. 이하 「EPHA2-ECD」로 약기한다) 를 코드하는 cDNA 를 프라이머 세트 :

프라이머 5 : 5'-aaaaagcttatggagctccaggcagcccgc-3' (배열표의 배열 번호 9) 및,

프라이머 6 : 5'-aaagggccctcagttgccagatccctccgg-3' (배열표의 배열 번호 10)

를 사용하여 PCR 반응으로 증폭시켰다. 얻어진 PCR 산물을 HindⅢ 및 ApaI 로 절단하고, pcDNA 3.1 의 HindⅢ/ApaI 사이트에 클로닝하였다 (이하 「pcDNA3.1-EPHA2-ECD」로 약기한다. 또, 이하 및 도면 중에서 「pcDNA3.1-EPHA2-ECD」에 의해 발현되는 재조합 단백질을 「rEPHA2-ECD」라고 기재한다).

1)-1-3 EPHA2 부분 단백질 발현 벡터의 제조

EPHA2 의 배열표의 배열 번호 8 의 아미노산 번호 315-540 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 영역 (이하 「FnⅢ-NC」라고 기재한다), 아미노산 번호315-430 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 영역 (이하 「FnⅢ-N」으로 기재한다), 아미노산 번호 426-540 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 영역 (이하 「FnⅢ-C」라고 기재한다.) 을 발현하는 벡터를 구축하기 위해, FnⅢ-NC 증폭용 프라이머 세트 :

프라이머 7 : 5'-gcaggcttcatcgaaggtcgtgggcgggcacctcaggacccag-3' (배열표의 배열 번호 11) 및,

프라이머 8 : 5'-gtacaagaaagctgggtgctagccgccaatcaccgccaag-3' (배열표의 배열 번호 12),

FnⅢ-N 증폭용 프라이머 세트 :

프라이머 7 및,

프라이머 9 : 5'-gtacaagaaagctgggtgctaggcagtacggaagctgcgg-3' (배열표의 배열 번호 13),

FnⅢ-C 증폭용 프라이머 세트 :

프라이머 10 : 5'-gcaggcttcatcgaaggtcgtgggagcttccgtactgccagtg-3' (배열표의 배열 번호 14) 및,

프라이머 8,

의 각각의 프라이머 세트를 사용하여 pcDNA-DEST40-EPHA2 를 주형으로 하여 PCR 반응을 실시하였다. 얻어진 PCR 산물의 양 말단에 attB1, attB2 사이트를 부가하기 위해, 각 PCR 산물을 주형에 프라이머 세트 :

프라이머 11 : 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcatcgaaggtcgtggg-3' (배열표의 배열 번호 15) 및,

프라이머 12 : 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggt-3' (배열표의 배열 번호 16),

를 사용하여 PCR 반응을 실시하고, 여기에서 얻어진 PCR 산물을 BP Clonase를 사용하여 pDONR221 에 삽입하여 엔트리 벡터를 제조하였다. 각 엔트리 벡터로부터 pET15b (Novagen 사 제조) 의 NdeI 와 BamHI 사이트를 제한 효소로 절단 후 평활화한 사이트에 Gateway Vector Conversion System (Invitrogen 사 제조) 의 Reading Frame Cassette C.1 을 삽입하여 제작한 데스티네이션 벡터 사이에서, LR Clonase 를 사용한 재조합 반응을 실시하여 발현 벡터를 제조하였다 (이하, FnⅢ-NC, FnⅢ-N, FnⅢ-C 를 삽입한 발현 벡터에 의해 발현하는 재조합 단백질을 각각 rFnⅢ-NC, rFnⅢ-N, rFnⅢ-C 라고 기재한다).

1)-2 인간 EPHB2 세포 외 영역 발현 벡터의 제조

HCC70 세포 total RNA 로부터 합성한 cDNA 를 주형에 프라이머 세트 :

프라이머 13 : 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcgccccgggaagcgcagcc-3' (배열표의 배열 번호 17) 및,

프라이머 14 : 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcctaaacctccacagactgaatctg gttcatctg-3' (배열표의 배열 번호 18)

를 사용하여 PCR 반응을 실시하고, 인간 EPHB2 를 코드하는 cDNA 를 취득하였다. 인간 EPHB2 의 cDNA 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 19 에, 아미노산 배열을 배열표의 배열 번호 20 에 나타내었다. 인간 EPHB2 세포 외 영역 (배열표의 배열 번호 20 의 아미노산 번호 1-542 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 영역) (이하 「EPHB2-ECD」로 약기한다) 를 코드하는 cDNA 를 증폭시키기 위해 프라이머 세트 :

프라이머 15 : 5'-aaaaagcttatggctctgcggaggctgggg-3' (배열표의 배열 번호 21) 및,

프라이머 16 : 5'-aaagatatctcatggcaacttctcctggat-3' (배열표의 배열 번호 22)

를 사용하여 PCR 반응을 실시하였다. 얻어진 PCR 산물을 HindⅢ 및 EcoRV 로 절단하고, pcDNA3.1 의 HindⅢ/EcoRV 사이트에 클로닝하였다 (이하 「pcDNA3.1-EPHB2-ECD」로 약기한다. 또, 이하 및 도면 중에서 「pcDNA3.1-EPHB2-ECD」에 의해 발현하는 재조합 단백질을 rEPHB2-ECD 라고 기재한다).

1)-3 인간 ERBB2 발현 벡터의 제조

Human clone collection (STRATAGENE 사 제조 #C33830) 를 주형에 프라이머 세트 :

프라이머 17 : 5'-caccatggagctggcggccttg-3' (배열표의 배열 번호 23) 및,

프라이머 18 : 5'-tcccactggcacgtccagacc-3' (배열표의 배열 번호 24)

를 사용하여 PCR 반응을 실시하였다. 얻어진 PCR 산물을 pENTR Directional TOPO cloning kit (Invitrogen 사 제조) 를 사용하여 pENTR/D-TOPO (Invitrogen 사 제조) 에 삽입하여 엔트리 벡터를 제조하였다. 아미노산 치환을 수반하는 변이를 수복하기 위해, 엔트리 벡터를 EcoRI 처리하여 얻어진 단편 중, pENTR/D-TOPO 유래 배열을 포함하는 쪽의 단편과 Human clone collection (STRATAGENE 사 제조 #C14640) 을 EcoRI 처리하여 얻어진 단편 중, 2 번째로 큰 단편 (약 1.6 kbp) 를 라이게이션하였다. 얻어진 엔트리 벡터로부터 pcDNA-DEST40 Gateway vector 에 LR Clonase 를 사용하여 재조합 반응을 실시하고, pcDNA-DEST40-ERBB2 를 제조하였다 (attB1 와 attB2 배열의 사이에 배열표의 배열 번호 25 에 나타나는 뉴클레오티드 배열을 갖는다).

(실시예 2) 모노클로날 항체 제조

2)-1 항원 단백질의 조제

EPHA2-ECD 를 발현시키기 위해, FreeStyle 293-F 세포 (Invitorogen 사 제조) 에 pcDNA3.1-EPHA2-ECD 를 293 fectin (Invitorogen 사 제조) 를 사용하여 트랜스펙션하고, 37 ℃, 8% CO₂ 에서 5 일간 배양하였다. 배양 후, 원심 분리에 의해 배양액을 회수하여, rEPHA2-ECD 의 정제 원료로 하였다. 얻어진 배양 상청을 분자량 분획 15000 의 투석 튜브를 사용하여 20 mM Tris-HCl pH 7.5 에 대해 투석하고, 필터 여과 (0.45 ㎛, PES) 한 후, 20 mM Tris-HCl pH 7.5 에서 평형화된 HiPrep 16/10 Q XL (GE Healthcare Bio-Sciences 사 제조) 에 첨가하였다. 용출은 NaCl 의 직선 농도 구배 (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 0-1M NaCl) 에서 실시하였다. 용출 획분의 일부를 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기 영동 (이하 「SDS-PAGE」로 약기한다.) 에 의해 분리 후, 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루 염색 (이하 「CBB 염색」으로 약기한다) 하고, rEPHA2-ECD 의 함유되는 획분을 확인하였다. 다음으로 rEPHA2-ECD 를 함유하는 획분을 모아, PBS 에 의해 평형화된 HiLoad 26/60 Superdex 200pg (GE Healthcare Bio-Sciences 사 제조) 에 첨가하였다. PBS 로 용출시키고, 용출 분획의 일부를 SDS-PAGE 에 의해 분리 후, 겔을 CBB 염색하고, rEPHA2-ECD 가 함유되는 획분을 확인하였다. rEPHA2-ECD 를 함유하는 획분을 모아, 면역용 항원, 에피토프 결정시의 항원으로서 사용하였다. 단백질 농도는 BCA Protein Assay Reagent (PIERCE 사 제조) 를 사용하여 측정하였다.

2)-2 면역

4 ∼ 6 주령의 BALB/cAnNCrlCrlj 마우스 (닛폰 찰스·리버 회사) 를 사용하였다. 0 일째에 50 μg 의 rEPHA2-ECD 와 Adjuvant Complete Freund H37 Rv (와코 순약사 제조) 를 혼합 (체적비로 1:1) 한 것을 마우스 등부 피하에 투여하였다. 동일하게 다른 개체에 50 μg 의 rEPHA2-ECD 와 TiterMax Gold Adjuvant (SIGMA 사 제조) 를 혼합 (체적비로 1:1) 한 것을 등부 피하에 투여하였다. 22 일째와 36 일째에 50 μg 의 rEPHA2-ECD 와 Adjuvant Incomplete Freund (와코 순약사 제조) 를 혼합 (체적비로 1:1) 한 것을 각 마우스의 등부 피하에 투여하였다. 53 일째에 50 μg 의 rEPHA2-ECD 를 각 마우스의 복강 내에 투여하고, 56 일째에 마우스 비장을 채취하여 하이브리도마 제조에 사용하였다.

2)-3 하이브리도마 제조

비장 세포와 마우스 미에로마 P3X63Ag8U.1 세포를 PEG4000 (IBL 사 제조) 를 사용하여 세포 융합시켜 하이브리도마를 제작하였다. 얻어진 하이브리도마 배양 상청 사용하여 항EPHA2 항체 생성 하이브리도마의 스크리닝을 실시하였다.

2)-4 항체 스크리닝

2)-4-1 항원 유전자 발현 세포의 조제

293T 세포를 5×10⁴ 세포/㎠ 가 되도록 collagen typc I 코트 플라스크 (IWAKI 사 제조) 에 파종하고 10 % FBS 함유 DMEM 중에서 37 ℃, 5 % CO₂ 의 조건하에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, pcDNA-DEST40-EPHA2 와 컨트롤로서 pcDNA-DEST40-ERBB2 를 각각 293T 세포에 Lipofectamine 2000 (Invitrogen 사 제조) 을 사용하여 트랜스펙션하고, 37 ℃, 5 % CO₂ 의 조건하에서 추가로 하룻밤 배양하였다. 다음날, 트랜스펙션된 293 T 세포를 트립신 처리하고, 10 % FBS 함유 DMEM 으로 세포를 세정한 후, 5 % FBS 함유 PBS 에 현탁시켰다. 얻어진 세포 현탁액을 Cell-ELISA, 플로우 사이트메트리 해석에 사용하였다.

2)-4-2 Cell-ELISA

2)-4-1 에서 조제한 세포 현탁액을 원심하여 상청을 제거한 후, EPHA2 발현 293T 세포와 ERBB2 발현 293T 세포의 각각에 대해 하이브리도마 배양 상청을 추가하여 현탁시키고, 4 ℃ 에서 1 시간 정치 (靜置) 하였다. 웰 중의 세포를 5 % FBS 함유 PBS 로 2 회 세정 후, 5 % FBS 함유 PBS 로 500 배로 희석시킨 Goat anti-Mouse IgG, Peroxidase Conjugated (Millipore (Chemicon) 사 제조 #AP181P) 를 첨가하고 현탁시켜, 4 ℃ 에서 1 시간 정치하였다. 웰 중의 세포를 5 % FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, OPD 발색액 (OPD 용해액 (0.05 M 시트르산 3 나트륨, 0.1 M 인산 수소 2 나트륨·12 물 pH 4.5) 에 o-페닐렌디아민 2 염산염 (와코 순약사 제조), H₂O₂ 를 각각 0.4 ㎎/㎖, 0.6 % (v/v) 가 되도록 용해) 를 100 μℓ/웰로 첨가하였다. 교반하면서 발색 반응을 실시하고, 1 M HCl 를 100 μℓ/웰로 첨가하여 발색 반응을 정지시켰다. 원심하여 세포를 침전시킨 후, 상청을 새로운 96 구멍 평평하고 낮은 마이크로 플레이트로 옮겨, 플레이트 리더 (ARVO : PerkinElmer 사) 로 490 ㎚ 의 흡광도를 측정하였다. 세포막 표면 상에 발현하는 EPHA2 에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는 하이브리도마를 선택하기 위해, ERBB2 발현 293T 세포 (컨트롤) 와 비교하여, EPHA2 발현 293T 세포 쪽에서 보다 높은 흡광도를 나타내는 배양 상청을 생성하는 하이브리도마를 항EPHA2 항체 생성 양성으로서 선택하였다.

2)-4-3 플로우 사이트메트리 해석

Cell-ELlSA 에서의 의양성 (擬陽性) 을 제거하기 위해, Cell-ELISA 에서 양성으로 판정된 하이브리도마가 생성하는 항체의 EPHA2 에 대한 결합 특이성을 플로우사이트메트리법에 의해 추가로 확인하였다. 2)-4-1 에서 조제한 세포 현탁액을 원심하여 상청을 제거한 후, EPHA2 발현 293T 세포와 ERBB2 발현 293T 세포의 각각에 대해 하이브리도마 배양 상청을 첨가하고 현탁하여, 4 ℃ 에서 1 시간 정치하였다. 5 % FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 5 % FBS 함유 PBS 로 1000 배로 희석시킨 Fluorescein-conjugated goat IgG fraction to mouse IgG (Whole Molecule) (ICN Pharmaceuticals 사 제조 #55493) 를 첨가하고 현탁하여, 4 ℃ 에서 1 시간 정치하였다. 5 % FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 2 μg/㎖ 7-aminoactinomycin D (Invitrogen (Molecular Probes) 사 제조) 를 함유하는 5 % FBS 함유 PBS 에 재현탁시켜, 플로우 사이트미터 (FC500 : Beckman Coulter 사) 에 의해 검출하였다. 데이터 해석은 Flowjo (TreeStar 사) 로 실시하였다. 7-aminoactinomycin D 양성의 사 (死) 세포를 게이트로 제거한 후, 생 세포의 FITC 형광 강도의 히스토그램을 작성하였다. 컨트롤인 ERBB2 발현 293T 세포의 형광 강도 히스토그램에 대해 EPHA2 발현 293 T 세포의 히스토그램이 강형광 강도측에 시프트되어 있는 샘플을 생성하는 하이브리도마를 항EPHA2 항체 생성 하이브리도마로서 취득하였다.

2)-5 하이브리도마의 모노클론화

항EPHA2 항체를 생성하는 하이브리도마는 ClonaCell-HY Selection Medium D (StemCell Technologies 사 제조 #03804) 에 희석시켜 배양되고, 출현한 콜로니를 회수함으로써 모노클론화되었다. 회수된 각 콜로니를 배양하고, 그 배양 상청을 사용하여 EPHA2 에 대한 결합성을 2)-4-3 과 동일한 방법으로 확인하고, 모노클로날 항EPHA2 항체 (SH348-1, SH357-1, Ab57-1, Ab65-1, Ab96-1, Ab100-1, Ab105-1, Ab106-13, Ab136-1, Ab148-1, Ab151-4, Ab230-1, Ab373-1, Ab382-1) 를 생성하는 하이브리도마를 수립하였다.

2)-6 모노클로날 항체의 암 세포주에 대한 결합성의 확인

2)-5 에서 취득된 모노클로날 항체가 EPHA2 를 고발현하는 암 세포에 결합하는지의 여부를 2)-4-3 과 동일한 플로우 사이트메트리법으로 검토하였다. 트랜스펙션한 293T 세포 대신에 인간 암 세포주 (MDA-MB-231), 인간 폐암 세포주 (A549), 인간 전립선암 세포주 (PC-3) 가 사용되었다. 그 결과, 수립된 모노클로날 항체는 모두 이들 암 세포주에 결합하는 것이 확인되었다.

2)-7 모노클로날 항체의 아이소 타입 결정

모노클로날 항체의 아이소 타입은 Mouse monoclonal isotyping kit (Serotec 사 제조) 에 의해 결정되었다. 그 결과, IgG1 (Ab57-1, Ab230-1), IgG2a (SH348-1, SH357-1, Ab65-1, Ab96-1, Ab100-1, Ab136-1, Ab148-1, Ab151-4), IgG2b (Ab105-1, Ab106-13, Ab373-1, Ab382-1) 였다.

2)-8 모노클로날 항체의 조제

모노클로날 항체는 하이브리도마 이식 마우스의 복수 또는 하이브리도마 배양 상청 (이하 「항체 정제 원료」라고 한다.) 으로부터 정제하였다.

마우스 복수는 이하와 같이 조제하였다. 먼저, 7-8 주령의 BALB/cAJcl-nu/nu (닛폰 쿠레아) 를 프리스탄 (Sigma 사 제조) 처리하고, 약 3 주일 후에 생리 식염수로 세정한 하이브리도마를 마우스 1 마리당 1 × 10⁷ 세포로 복강 내에 이식하였다. 1-2 주일 후에 복강 내에 저류(貯留)한 복수를 채취하여 0.22 ㎛ 의 필터를 통과시켜 멸균하여 항체 정제 원료로서 사용하였다.

하이브리도마 배양 상청은 CELLine (BD Biosciences 사 제조) 을 사용하여 조제하였다. 배지에 ClonaCell-HY Growth Medium E (StemCell Technologies 사 제조 #03805) 를 사용하는 것 이외에는 메이커의 지시서에 따라 배양하였다. 회수된 배양 상청은 0.45 ㎛ 필터로 여과하여, 항체 정제 원료로서 사용하였다.

항체는 Recombinat Protein A rPA50 (RepliGen 사 제조) 를 포르밀-셀룰로파인 (생화학 공업사 제조) 에 고정화시킨 어피니티 칼럼 (이하 「포르밀 셀룰로파인 Protein A」로 약기한다) 혹은 Hitrap MabSelect SuRe (GE Healthcare Bio-Sciences 사 제조) 로 정제되었다. 포르밀 셀룰로파인 Protein A 에서는, 항체 정제 원료를 결합 버퍼 (3 M NaCl, 1.5 M Glycine pH 8.9) 로 3 배 희석시킨 것을 칼럼에 첨가하고, 결합 버퍼로 세정 후, 0.1 M 시트르산 pH 4.0 으로 용출하였다. 한편, Hitrap MabSelect SuRe 에서는, 항체 정제 원료를 칼럼에 첨가하여 PBS 로 세정 후, 2 M Arginine-HCl pH 4.0 로 용출하였다. 용출된 항체 용액은 중화 후, PBS 에 버퍼 치환되었다.

항체의 농도는 POROS G 20 ㎛ Column, PEEK, 4.6 mm × 100 mm, 1.7 ㎖ (Applicd Biosystems) 에 결합시킨 항체를 용출시키고, 용출액의 흡광도 (0.D.280 ㎚) 를 측정함으로써 구하였다. 구체적으로는, 평형화 버퍼 (30.6 mM 인산 2 수소 나트륨·12 물, 19.5 mM 인산 1 칼륨, 0.15 M NaCl, pH 7.0) 에 의해 평형화된 POROS G 20 ㎛ 에 PBS 로 희석시킨 항체 샘플을 첨가하고, 평형화 버퍼로 칼럼을 세정 후, 칼럼에 결합한 항체를 용리액 (0.1 % (v/v) HCl, 0.15 M NaCl) 로 용출한 용출액 흡광도 (O.D.280 ㎚) 의 피크 면적을 측정하여, 다음 식으로 농도를 산출하였다.

항체 샘플 농도 (㎎/㎖) = (항체 샘플의 피크 면적)/(표준품 (인간 IgG1) 의 피크 면적) × 표준품의 농도 (㎎/㎖) × 샘플의 희석 배율

또, 얻어진 항체에 함유되는 엔도톡신 농도를 엔드스페시 ES-50 M 세트 (생화학 공업 #020150) 와 엔도톡신 표준품 CSE-L 세트 (생화학 공업 #020055) 를 사용하여 측정하고, 1 EU/㎎ 이하인 것을 확인하여 이하의 실험에 사용하였다.

(실시예 3) SH348-1, SH357-1 의 성질

3)-1 항EPHA2 항체에 의한 EPHA2 티로신 잔기의 인산화 유도 활성 및 EPHA2 단백질 양의 저하를 유도하는 활성의 검토

3)-1-1 항체 자극 세포 용해액의 조제

10 % FBS, 50 단위/㎖ 페니실린, 50 μg /㎖ 스트렙토마이신 함유 RPMI1640 (이하 「10 % FBS 함유 RPMI1640 (항생 물질 함유)」로 약기한다.) 에 현탁시킨 MDA-MB-231 세포를 6 × 10⁵ 세포/웰이 되도록 6 웰 디쉬에 파종하고, 37 ℃, 5 % CO₂ 의 조건하에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, 배지를 버리고 RPMI1640 를 첨가하여, 37 ℃, 5 % CO₂ 의 조건하에서 추가로 하룻밤 배양하였다. 그 다음날, SH348-1, SH357-1, 아이소 타입 컨트롤 항체로서 Mouse IgG_2A Isotype Control (이하 2A 및 도면 중에서 「mIgG2a」로 약기한다 ; R&D Systems 사 제조 : #MAB003c), EPHA2 의 가용성 리간드로서 Recombinant Mouse Ephrin-A1/Fc Chimera (이하 및 도면 중에서 「Ephrin-A1/Fc」로 약기한다 ; R&D Systems 사 제조 : #602-A1-200), 가용성 리간드의 컨트롤 단백질로서 Recombinant Human IgG₁Fc (이하 및 도면 중에서 「hG₁Fc」로 약기한다 ; R&D Systems 사 제조 : #110-HG-100.) 를 도 1, 도 2 에 나타난 농도 (SH348-1, SH357-1, mIgG2a 는 도 1A 에서는 10 μg /㎖ 또는 50 μg /㎖, 도 2A 에서는 50 μg /㎖, Ephrin-A1/Fc 와 hG₁Fc 는 도 1, 도 2 에서 1 μg/㎖) 가 되도록 RPMI1640 으로 희석시킨 용액을, 배지를 버린 MDA-MB-231 세포에 첨가하고, 37 ℃, 5 % CO₂ 의 조건하에서 지정 시간 인큐베이션하였다. 또, 가교 항체 존재하의 실험에서는, SH348-1, SH357-1, mIgG2a 의 각각과 가교 항체로서 Goat anti-mouse IgG, Fcγ fragment specific (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot) (Jackson ImmunoResearch Laboratories 사 제조 #115-005-071) 을 각각 10 μg /㎖ 또는 50 μg /㎖ (도 1B), 50 μg /㎖ (도 2B) 의 농도가 되도록 RPMI1640 중에서 혼합한 용액을, 배지를 버린 MDA-MB-231 세포에 첨가하고, 37 ℃, 5 % CO₂ 의 조건하에서 지정 시간 인큐베이션하였다. 지정 시간이 되었을 때 상청을 제거하고, 1 mM PMSF (SIGMA 사 제조) 함유 1 × Cell Lysis Buffer (Cell Signaling technology 사 제조) 를 첨가하고 세포를 용해하여, 15000 rpm 로 5 분간 원심한 세포 용해액 상청을 면역 침강, 웨스턴 블로팅의 샘플로서 사용하였다. 샘플의 단백질 농도는 BCA Protein Assay Reagent (PIERCE 사 제조) 에 의해 측정하였다.

3)-1-2 EPHA2 티로신 잔기의 인산화 유도 활성의 검증

EPHA2 를 면역 침강하기 위해, 먼저 1 샘플당 25 μℓ 의 Protein G magnetic beads 현탁액 (NEW ENGLAND Bio-Labs 사 제조) 에 8 μg 의 anti-Eck/EphA2, clone D7 (이하 및 도면 중에서 「항EPHA2 항체 (D7)」로 약기한다 : Millipore (Upstate) 사 제조 #05-480) 를 첨가하여 4 ℃ 에서 2 시간 전도 혼화하였다.

그 후, 최종농도로 10 % 가 되도록 FBS 를 첨가하고, 추가로 4 ℃ 에서 30 분간 전도 혼화하였다. 비즈를 1 mM PMSF 함유 1 × Cell Lysis Buffer 로 3 회 세정한 후, 3)-1-1 에서 조제한 세포 용해액 상청을 200 μg 첨가하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 전도 혼화하였다. 다음날, 비즈를 1 mM PMSF 함유 1 × Cell Lysis Buffer 로 3 회 세정한 후, 비즈에 SDS-sample buffer (56.3 mM Tris-HCl pH 6.8, 1.8 % (w/v) SDS, 9 % glycerol, 0.72 M 2-메르캅토에탄올, 0.045 ㎎/㎖ 브로모페놀블루) 를 첨가하여 98 ℃ 에서 5 분간 과열하여, 비즈로부터 해리된 단백질을 SDS-PAGE 로 분리하였다.

웨스턴 브로팅을 실시하기 위해, 분리 후의 겔로부터 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오리드막 (이하 「PVDF 막」으로 약기한다 ; 포어 사이즈 0.45 ㎛ : Millipore 사 제조) 에 전사하였다. 전사 후의 PVDF 막을 블로킹 액 (블록 에이스 분말 (다이닛폰 스미토모 제약 (유키지루시 유업) 사 제조) 1 봉을 100 ㎖ 의 초순수에 용해 후, Tween 20, 아지화나트륨을 각각 최종농도로 0.1 % (v/v), 0.02 % (w/v) 가 되도록 첨가) 중에서 진탕하고, 블로킹하였다. 먼저, 면역 침강된 EPHA2 를 검출하기 위해, 블로킹 후의 PVDF 막을 블로킹 액으로 0.25 μg/㎖ 에 희석시킨 항EPHA2 항체 (D7) 용액에 담그어, 실온에서 1 시간 진탕하였다. PVDF 막을 TBST (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1.38 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.1 % (v/v) Tween 20) 으로 10 분간, 3 회 세정한 후, TBST 로 3000 배로 희석시킨 Anti-Mouse Ig, HRP-Linked Whole Ab Sheep (GE Healthcare Bio-Sciences 사 제조) 용액에 담그어 실온에서 30 분간 진탕하였다. 추가로 PVDF 막을 TBST 로 10 분간, 3 회 세정한 후, ECL Plus (GE Healthcare Bio-Sciences 사 제조) 를 사용하여 화학 발광용 필름으로 시그널을 검출하였다.

다음으로, 이 PVDF 막 상으로부터 항체를 제거하기 위해, PVDF 막을 Strip 액 (50 mM Tris-HCl pH 6.8, 2 % (w/v) SDS, 100 mM 2-메르캅토에탄올) 에 담그어 55 ℃ 에서 30 분간 진탕한 후, Quench 액 (1 % (v/v) H₂O₂, 0.1 % (w/v) NaN₃ 함유 TBST) 에 담그어 실온에서 20 분간 진탕 처리를 실시하고, 추가로 TBST 로 10 분간, 3 회 세정하였다. EPHA2 티로신 잔기의 인산화 상태를 검출하기 위해, 이 PVDF 막을 아지화나트륨 불함유 블로킹액 (블록 에이스 분말 1 봉을 100 ㎖ 의 초순수에 용해 후, Tween 20 을 최종농도로 0.1 % (v/v) 가 되도록 첨가) 중에서 진탕하고 블로킹한 후, 아지화나트륨 불함유 블로킹액으로 10000 배로 희석시킨 Anti-Phosphotyrosine, recombinant 4G10 HRP-conjugate (도면 중에서 「4G10 항체」로 약기한다 ; Millipore (Upsate) 사 제조 #16-184) 용액에 담그어 실온에서 1 시간 진탕하였다. PVDF 막을 TBST 로 10 분간, 3 회 세정 후, 추가로 H₂O 로 5 분간, 3 회 세정하여, ECL Plus 를 사용하여 화학 발광용 필름으로 시그널을 검출하였다.

그 결과, 가용성 리간드인 Ephrin-A1/Fc 의 첨가에 의해 인큐베이션 후 10 분으로 EPHA2 티로신 잔기의 인산화가 검출되는 데 반해, SH348-1, SH357-1 에서는, 10 μg /㎖, 50 μg /㎖ 의 농도로 10 분 후, 30 분 후, 60 분 후 중 어느 것에 있어서도 리간드와 같은 EPHA2 티로신 잔기의 인산화를 유도하는 작용은 확인되지 않았다 (도 1A). 또, 가교 항체 존재하에 있어서도 동일하게 SH348-1, SH357-1 에는 리간드와 같은 EPHA2 티로신 잔기의 인산화를 유도하는 작용은 확인되지 않았다 (도 1B).

3)-1-3 EPHA2 단백질 양의 저하를 유도하는 활성의 검증

3)-1-1 에서 조제한 세포 용해액 상청 10 μg 를 SDS-PAGE 로 분리 후, 겔 중의 단백질을 PVDF 막에 전사하고, 항EPHA2 항체 (D7) 와 샘플 단백량의 컨트롤로서 Monoclonal Anti-β-Actin clone AC-15 (이하 및 도면 중에서는 「항β-actin 항체」로 약기한다 : SIGMA 사 제조 #A-5441) 로 웨스턴 블로팅을 실시하였다. 구체적으로는, 전사된 PVDF 막을 블로킹 액 중에서 진탕하여 블로킹한 후, PVDF 막을 분자량 70 kDa 부근을 중심으로 면도칼로 절단하였다. 70kDa 이상의 PVDF 막을 블로킹 액으로 0.25μg/㎖ 에 희석시킨 항EPHA2 항체 (D7) 용액에, 70 kDa 이하의 PVDF 막을 블로킹 액으로 1000 배 희석시킨 항β-actin 항체 용액에 담그어 실온에서 1 시간 진탕하였다. 각 PVDF 막을 TBST 로 10 분간, 3 회 세정 후, TBST 로 3000 배로 희석시킨 Anti-Mouse Ig, HRP-Linked Whole Ab Sheep 용액에 담그어 실온에서 30 분간 진탕하였다. 각 PVDF 막을 TBST 로 10 분간, 3 회 세정한 후, ECL Plus 를 사용하여 NightOWL LB983 (Berthold Technologies 사) 에 의해 검출하였다. 밴드의 시그널 강도의 정량은 Gel-Pro Analyzer Version 4.5 for Windows (등록 상표 ; Media Cybernetics 사) 에 의해 실시하였다.

그 결과, 가용성 리간드인 Ephrin-A1/Fc 의 첨가에 의해 현저한 EPHA2 단백질의 감소가 관찰되었다 (도 2A, B). 이 효과와 비교하면, 활성은 약하기는 하지만 가교 항체 비존재하, 존재하에서 모두 SH348-1 의 첨가에 의해 EPHA2 단백질의 감소가 관찰되었다 (도 2A, B). 한편, SH357-1 에서는, 가교 항체의 유무에 관계없이 EPHA2 단백질의 양에 변화는 거의 관찰되지 않았다 (도 2A, B).

SH348-1 첨가 24 시간 후에 있어서의 EPHA2 단백질의 양을 해석하기 위해, 리간드·항체 무첨가 샘플에서 보정한 3 회의 실험 결과로부터 「EPHA2 밴드의 시그널 강도/β-Actin 밴드의 시그널 강도」의 평균값을 산출했는데, 가교 항체 비존재하에서는 mIgG2a 첨가 24 시간 후의 값을 100 % 로 했을 때, SH348-1 첨가 24 시간 후의 값은 70 % 이고, 가교 항체 존재하에서는 mIgG2a 첨가 24 시간 후의 값을100 % 로 했을 때, SH348-1 첨가 24 시간 후의 값은 69 % 였다.

3)-2 ADCC 활성

3)-2-1 이펙터 세포의 조제

누드 마우스인 CAnN.Cg-Foxn1^nu/CrlCrlj (닛폰 찰스·리버 회사) 로부터 무균적으로 비장을 채취하였다. 채취한 비장을 2 장의 슬라이드 글래스로 호모지나이즈하고, BD Pharm lyse (BD Biosciences 사 제조 #555899) 를 사용하여 용혈 처리를 실시하였다. 얻어진 비장 세포를 Fetal Bovine Serum, Ultra-low IgG (Invitrogen 사 제조) 를 10 % 함유하는 페놀 레드 불함유 RPMI1640 (Invitrogen 사 제조) (이하 「ADCC 용 배지」로 약기한다.) 에 현탁시키고, 셀 스트레이너 (포어 사이즈 40 ㎛ : BD Biosciences 사 제조) 를 통과시킨 후, 생 세포수를 트리판 블루 색소 배제 시험으로 계측하였다. 비장 세포 현탁액을 원심 후, 배지를 제거하고, 생 세포 밀도로 1.5 × 10⁷ 세포/㎖ 가 되도록 ADCC 용 배지로 재현탁시켜 이펙터 세포로 하였다.

3)-2-2 표적 세포의 조제

MDA-MB-231, A549, PC-3 세포를 트립신 처리하고, 10 % FBS 함유 RPMI1640 으로 세포를 세정 후, 10 % FBS 함유 RPMI1640 에 재현탁시키고, 각 세포 4 × 10⁶ 개를 0.22 ㎛ 필터로 멸균한 Chromium-51 (5550 kBq) 과 혼합하고, 37 ℃, 5 % CO₂ 의 조건하에서 1 시간 라벨하였다. 라벨된 세포를 ADCC 용 배지에서 3 회 세정하고, ADCC 용 배지에서 2 × 10⁵ 세포/㎖ 가 되도록 재현탁시켜 표적 세포로 하였다.

3)-2-3 ⁵¹Cr 릴리스 어세이

2 × 10⁵ 세포/㎖ 의 표적 세포를 50 μℓ/웰로 96 구멍 U 낮은 마이크로 플레이트에 분주하였다. 그곳에 이펙터 세포 첨가 후의 최종농도로 2.5μg/㎖ 가 되도록 ADCC 용 배지에서 희석시킨 SH348-1, SH357-1, 아이소 타입 컨트롤 항체 (mIgG2a) 를 50 μℓ 첨가하고, 4 ℃ 에서 1 시간 정치하였다. 거기에 5×10⁷ 세포/㎖ 의 이펙터 세포를 100 μℓ 첨가하고, 37 ℃, 5 % CO₂ 의 조건하에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, 상청을 LumaPlate (PerkinElmer 사 제조) 에 회수하여, 감마 카운터에서 방출된 감마선 양을 측정하였다. ADCC 활성에 의한 세포 용해율은 다음 식으로 산출하였다.

세포 용해율 (%) = (A-B)/(C-B) × 100

A : 샘플 웰의 카운트

B : 자연 방출 (항체·이펙터 세포 비첨가 웰) 카운트의 평균값 (n = 3). 항체 첨가시와 이펙터 세포 첨가시에 각각 ADCC용 배지를 50 μℓ, 100 μℓ 첨가하였다. 그 이외는 샘플 웰과 동일한 조작을 실시하였다.

C : 최대 방출 (표적 세포를 계면 활성제로 용해시킨 웰) 카운트의 평균값 (n = 3). 항체 첨가시에 ADCC 용 배지를 50 μℓ, 이펙터 세포 첨가시에 Triton-X100 을 2 % (v/v) 함유하는 ADCC 용 배지를 100 μℓ 를 첨가하였다. 그 이외에는 샘플 웰과 동일한 조작을 실시하였다.

도 3 은, 3 회의 실험의 평균값으로, 에러 바는 표준 편차를 나타내고, P 값은 Student's t-test 에 의해 산출하였다. 그 결과, SH348-1 은 MDA-MB-231 세포 (도 3A), A549 세포 (도 3B), PC-3 세포 (도 3C) 에 대해 각각 8.2 %, 9.1 %, 4.7 % 의 세포 용해 활성을 나타내고, SH357-1 은 MDA-MB-231 세포 (도 3A), A549 세포 (도 3B), PC-3 세포 (도 3C) 에 대해 각각 8.8 %, 13.0 %, 9.0 % 의 세포 용해 활성을 나타내는 점에서, 어느 항체도 MDA-MB-231 세포, A549 세포, PC-3 세포에 대해 ADCC 활성을 갖는 것으로 나타났다.

3)-3 CDC 활성

10 % FBS 함유 RPMI1640 (항생 물질 함유) 에 현탁시킨 MDA-MB-231, A549, PC-3 세포를 96 구멍 마이크로 플레이트에 각 5000 세포/웰로 파종하고, 37 ℃, 5 % CO₂ 의 조건하에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, 보체 첨가 후의 최종농도로 25μg/㎖ 가 되도록 10 % FBS 함유 RPMI1640 (항생 물질 함유) 으로 희석시킨 SH348-1, SH357-1, 아이소 타입 컨트롤 항체 (mIgG2a) 를 첨가하여, 4 ℃ 에서 1 시간 정치하였다. 그곳에 RPMI1640 으로 30 % 로 희석시킨 토끼 보체 (補體) (CEDARLANE 사 제조 #CL3051) 를 최종농도로 5 % 가 되도록 첨가하여 37 ℃, 5 % CO₂ 의 조건하에서 1 시간 인큐베이트하고, 추가로 실온에서 30 분간 정치하였다. 세포 생존율을 측정하기 위해, 배양액과 등량의 Cell Titer-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega 사 제조) 를 첨가하고, 실온에서 10 분간 교반한 후, 브레이트 리더로 발광량을 계측하였다. 세포 생존율은 다음 식으로 산출하였다.

세포 생존율 (%) = (a-b)/(c-b) × 100

a : 샘플 웰의 발광량

b : 백그라운드 (세포·항체 비첨가 웰) 발광량의 평균값 (n = 8). 세포 파종시에 세포 현탁액 대신에 등량의 10 % FBS 함유 RPMI1640 (항생 물질 함유) 을 첨가하고, 항체 첨가시에 항체 희석액과 등량의 10 % FBS 함유 RPMI1640 (항생 물질 함유) 를 첨가하였다. 그 이외에는 샘플 웰과 동일한 조작을 실시하였다.

c : 항체 비첨가 웰의 발광량의 평균값 (n = 3). 항체 첨가시에 항체 희석액과 등량의 10 % FBS 함유 RPMI1640 (항생 물질 함유) 을 첨가하였다. 그 이외에는 샘플 웰과 동일한 조작을 실시하였다.

도 4 는 3 회의 실험의 평균값으로, 에러 바는 표준 편차를 나타내고, P 값은 Student's t-test 에 의해 산출하였다. 그 결과, SH348-1 은 보체 존재하에서 MDA-MB-231 세포 (도 4A), A549 세포 (도 4B), PC-3 세포 (도 4C) 에 대해 각각 44 %, 31 %, 41 % 의 세포 생존율의 저하를 유도하고, SH357-1 도 보체 존재하에서 MDA-MB-231 세포 (도 4D), A549 세포 (도 4E), PC-3 세포 (도 4F) 에 대해 각각 65 %, 60 %, 65 % 의 세포 생존율의 저하를 유도한 점에서, 어느 항체도 MDA-MB-231 세포, A549 세포, PC-3 세포에 대해 CDC 활성을 갖는 것으로 나타났다.

3)-4 에피토프 결정

3)-4-1 EPHA2 부분 폴리펩티드 (rFnⅢ-NC, rFnⅢ-N, rFnⅢ-C) 의 제조

1)-1-3 에서 제조한 발현 플라스미드로 대장균 BL21 및 대장균 Origami (DE3) (Novagen 사 제조) 를 형질 전환하고, 50 μg /㎖ 의 암피실린 (Sigma 사 제조) 을 첨가한 LB 배지에서 배양을 실시하고, BL21 은 Autoinduction System (Novagen 사 제조), Origami (DE3) 는 0.5 mM IPTG 첨가로 EPHA2 부분 폴리펩티드의 발현 유도를 실시하였다. 6000 rpm, 20 분간 원심하여 집균하고, 파쇄 버퍼 (50 mM Tris HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1 % (v/v) Triton-X100, 10 % (v/v) Glycerol) 에 현탁시킨 후, 빙상에서 초음파 파쇄를 실시하였다. 14000 rpm, 15 분간 원심하고, 상청을 회수하여, Ni-NTA (Invitrogen 사 제조) 0.5 ㎖ 에 공여하였다. 세정 버퍼 (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 50 mM Imidazole, 10 % (v/v) Glycerol) 로 세정한 후에, 용출 버퍼 (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 400 mM Imidazole, 10 % (v/v) Glycerol) 에 의해 용출하였다. 용출 샘플은 PBS 를 용매로 한 겔 여과 컬럼 크로마토그래피 (Superdex 75 10/300 : GE Healthcare Bio-Sciences 사 제조) 에 의해 추가로 정제되었다. 얻어진 재조합 단백질의 농도는 Protein Assay (Bio-Rad 사 제조) 로 측정하였다.

3)-4-2 EPHB2 세포 외 영역 폴리펩티드 (rEPHB2-ECD) 의 조제

EPHB2-ECD 를 발현시키기 위해, FreeStyle 293-F 세포에 293 fectin 를 사용하여 pcDNA3.1-EphA2-ECD 를 트랜스펙션하고, 37 ℃, 8 % CO₂ 에서 72 시간 배양하였다. 배양 후, 원심 분리에 의해 배양액을 회수하고, rEPHB2-ECD 정제의 원료로 하였다. 얻어진 배양 상청을 분자량 분획 15000 의 투석 튜브를 사용하여 20 mM Tris-HCl pH 7.5 에 대해 투석하여 필터 여과 (0.45 ㎛, PES) 한 후, 20 mM Tris-HCl pH 7.5 에서 평형화된 HiPrep 16/10 Q XL 에 첨가하였다. 용출은 NaCl 의 직선 농도 구배 (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 0-1M NaCl) 로 실시하였다. 용출 획분의 일부를 SDS-PAGE 로 분리 후, 겔을 CBB 염색하고, rEPHB2-ECD 가 함유되는 획분을 확인하였다. 다음으로 rEPHB2-ECD 를 함유하는 획분을 모아 PBS 에 의해 평형화된 HiLoad 26/60 Superdex 200pg 에 첨가하였다. PBS 로 용출시키고, 용출 분획의 일부를 SDS-PAGE 에 의해 분리 후, 겔을 CBB 염색하고, rEPHB2-ECD 가 함유되는 획분을 확인하였다. crEPHB2-ECD 를 함유하는 획분을 모아 에피토프 결정시의 항원으로서 사용하였다. 단백질 농도는 BCA Protein Assay Reagent 에 의해 결정하였다.

3)-4-3 ELISA 법에 의한 항원 결합 부위의 결정

rEPHA2-ECD, rFnⅢ-NC, rFnⅢ-N, rFnⅢ-C 와 컨트롤 단백질의 rEPHB2-ECD 를 PBS 로 1μg/㎖ 로 희석시키고, 임뮤노플레이트 (Nunc 사 제조 #442404) 에 각각 100 μℓ/웰로 분주하여, 4 ℃ 에서 하룻밤 정치함으로써 플레이트에 단백질을 흡착시켰다. 다음날, 웰 중의 액을 제거하고, 블록 에이스 용액 (블록 에이스 분말 1 봉을 100 ㎖ 의 초순수로 용해) 을 PBS 로 4 배 희석시킨 용액을 200 μℓ/웰로 분주하여, 실온에서 1 시간 정치하였다. 웰 중의 액을 제거 후, SH348-1, SH357-1, 아이소 타입 컨트롤 항체 (mIgG2a) 를 희석 완충액 (PBS, 0.05 % (v/v) Tween 20) 으로 5μg/㎖ 로 희석시킨 것을 50μℓ/웰로 첨가하였다. 실온에서 1 시간 정치 후, 웰 중의 액을 제거하고, 희석 완충액으로 2 회 웰을 세정하였다. 희석 완충액으로 3000 배로 희석시킨 Goat anti-Mouse IgG, Peroxidase Conjugated 를 50μℓ/웰로 첨가하고, 실온에서 1 시간 정치하였다. 웰 중의 액을 제거하고, 희석 완충액으로 2 회 웰을 세정한 후, OPD 발색액을 100μℓ/웰로 첨가하여 교반하면서 발색 반응을 실시하였다. 발색 후, 1 M HCl 를 100μℓ/웰로 첨가하여 발색 반응을 멈추고, 플레이트 리더로 490 ㎚ 의 흡광도를 측정하였다.

EPHA2 의 도메인 구조 예측 (NCBI CDD version 2.11, CBS TMHMM Server v.2.0) 및 EPHA2-ECD, FnⅢ-NC, FnⅢ-N, FnⅢ-C 의 EPHA2 중에서의 위치를 도 5A 에 나타낸다. Ligand-BD 는 리간드 결합 도메인, FN3 는 피브로넥틴 타입 3 도메인, TM 는 막 관통 영역, Trk kinase 는 티로신키나아제 도메인, SAM 는 SAM 도메인을 나타낸다.

EPHA2 세포 외 영역 (EPHA2-ECD), 2 개의 피브로넥틴 타입 3 도메인을 포함하는 영역 (FnⅢ-NC), N 말단측의 피브로넥틴 타입 3 도메인을 포함하는 영역 (FnⅢ-N), C 말단측의 피브로넥틴 타입 3 도메인을 포함하는 영역 (FnⅢ-C) 의 재조합 단백질을 제조하고, SH348-1, SH357-1 의 결합성을 검토한 결과, SH348-1, SH357-1 은, rEPHA2-ECD, rFnⅢ-NC, rFnⅢ-C 에 결합성을 나타내었다 (도 5B). 따라서 SH348-1, SH357-1 은 C 말단측의 피브로넥틴 타입 3 도메인을 포함하는 426 번째 ∼ 534 번째의 아미노산 (배열표의 배열 번호 8 의 아미노산 번호 426 내지 534 에 나타나는 아미노산 배열) 의 영역에 결합하는 것으로 나타났다.

(실시예 4) In vivo 항종양 효과

MDA-MB-231 세포를 트립신 처리하여 배양 플라스크로부터 박리한 후, 10 % FBS 함유 RPMI1640 (항생 물질 함유) 에 현탁 후 원심하여, 상청을 제거하였다. 세포를 동 배지에서 2 회 세정한 후, BD 마트리겔 기저막 매트릭스 (BD Biosciences 사 제조) 에 현탁시키고, 6 주령의 BALB/cAJcl-nu/nu ((닛폰 쿠레아사) 에 5 × 10⁶ 세포/마우스로 등부 피하에 이식하였다. 이식 날을 0 일째로 하여 9, 16, 23, 30 일째에 SH348-1, SH357-1 을 500 μg /마우스로 복강 내 투여하였다. 컨트롤에는 항체와 동 체적 (500μℓ) 의 PBS 를 복강 내 투여하였다. 종양 체적을 9, 13, 16, 20, 23, 28, 30, 34, 37 일째에 측정하여, 항체 투여에 의한 항종양 효과를 검토하였다. 그 결과, SH348-1, SH357-1 투여군에서는 PBS 투여군에 비해, 유의하게 종양 증식이 억제되었다 (37 일째 시점의 종양 체적에 대해 PBS 투여군과의 비교에 의해 SH348-1, SH357-1 의 P 값은 모두 P ＜ 0.001 였다. P 값은 Student'st-test 에 의해 산출). 또, 37 일째 시점에서의 종양 증식 저해율 (= 100 - (항체 투여군의 종양 체적의 평균값)/(PBS 투여군의 종양 체적의 평균값) × 100) 는 SH348-1 에서 89.5 %, SH357-1 에서 84.1 % 이고, In vivo 에서 매우 강한 항종양 효과가 관찰되었다 (도 6A, B).

MDA-MB-231 세포 이식 마우스로 항종양 효과를 검토한 14 의 모노클로날 항EPHA2 항체 중, 효과를 나타낸 것은 FnⅢ-C 에 결합하는 SH348-1, SH357-1 뿐이었다 (표 1).

이상의 결과로부터, SH348-1, SH357-1 이 종래 보고가 없는 에피토프 (배열표의 배열 번호 8 의 아미노산 번호 426 내지 534 에 나타나는 아미노산 배열) 를 인식하여 항종양 효과를 나타내는 항체인 것이 분명해졌다. 또 SH348-1, SH357-1 의 결합 영역이 EPHA2 를 표적으로 한 항종양 모노클로날 항체의 유망한 표적이 되는 것으로 나타났다.

(실시예 5) SH348-1, SH357-1 의 항체 유전자의 동정

마우스 항인간 EPHA2 항체인 SH348-1, SH357-1 의 중사슬 및 경사슬의 N 말단 아미노산 배열을 결정하기 위해서, 2)-8 에서 정제한 SH348-1, SH357-1 을 함유하는 용액의 일부를 SDS-PAGE 로 분리하였다. 분리 후의 겔로부터 PVDF 막 (포어 사이즈 0.45 ㎛ ; Invitrogen 사 제조) 에 겔 중의 단백질을 전사하고, 세정 버퍼 (25 mM NaCl, 10 mM 붕산나트륨 버퍼 pH 8.0) 로 세정한 후, 염색액 (50 % 메탄올, 20 % 아세트산, 0.05 % 쿠마시 브릴리언트 블루) 에 5 분간 담그어 염색하고 나서, 90 % 메탄올로 탈색하였다. PVDF 막 상에서 가시화된 중사슬 (이동도가 작은 쪽의 밴드) 및 경사슬 (이동도가 큰 쪽의 밴드) 에 상당하는 밴드 부분을 잘라내어, Procise (등록 상표) cLC 프로테인 시퀀서 Model 492cLC (Applied Biosystems) 를 사용하여, 자동 에드먼법 (Edman, P., et al. (1967) Eur. J. Biochem. 1, 80 참조) 에 의해 각각의 N 말단 아미노산 배열의 동정을 시험하였다. SH348-1 의 중사슬에 대해서는, 상기 서술한 방법에서는 아미노산 배열이 동정할 수 없었기 때문에, Pfu Pyroglutamate Aminopeptidase (TAKARA 사 제조) 를 사용하여 N 말단 피로글루탐산을 제거 후에 동일한 조작을 실시하여 N 말단으로부터 2 번째 이후의 아미노산 배열을 동정하였다.

그 결과, SH348-1 의 중사슬에 상당하는 밴드의 N 말단으로부터 2 번째 이후의 아미노산 배열은,

I-Q-L-V-Q-S-G-P (배열표의 배열 번호 26) 이고, 경사슬에 상당하는 밴드의 N 말단 아미노산 배열은,

D-V-L-M-T-Q-S-P-L-S-L (배열표의 배열 번호 27)

이고, SH357-1 의 중사슬에 상당하는 밴드의 N 말단 아미노산 배열은,

Q-I-Q-L-V-Q-S-G-P (배열표의 배열 번호 28)

이고, 경사슬에 상당하는 밴드의 N 말단 아미노산 배열은,

D-V-L-M-T-Q-T-P-L-S-L-P-V-S-L-G-D-Q-A (배열표의 배열 번호 29) 였다. 이들 아미노산 배열을, 카바트 등에 의해 작성된 항체의 아미노산 배열 데이터 베이스 (Kabat, E.A. et al.,(1991) in Sequences of Proteins of Immunological Interest Vol.I 및 Ⅱ, U.S. Department of Health and Human Services 참조) 와 비교한 결과, SH348-1 의 중사슬 (γ2a 사슬) 의 서브 타입은 miscellaneous 이고, 경사슬의 서브타입은 kappa light Ⅱ 였다. 또, SH357-1 의 중사슬 (γ2a 사슬) 의 서브타입은 miscellaneous 이고, 경사슬의 서브타입은 kappa light Ⅱ 인 것으로 판명되었다.

그래서 이들 마우스 서브 타입에 속하는 항체 유전자 번역 영역의 5' 말단측과 종지 코돈을 포함하는 3' 말단 부분에 각각 하이브리다이즈하는 하기의 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 합성한 (앞서 나온 카바트 등의 문헌, Matti Kartinen et al. (1988) 25, 859-865 및 Heinrich, G. et al. (1984) J. Exp. Med. 159, p.417-435 참조) :

5'-cagatccagttggtgcagtctggacct-3' (DB3F1 : 배열표의 배열 번호 30)

5'-aagatatctcatttacccggagtccgggagaa-3' (MIG2AEVR1 : 배열표의 배열 번호 31)

5'-aagaattcatgaagttgcctgttagg-3' (MK19EIF1 : 배열표의 배열 번호 32)

5'-aagatatcttaacactcattcctgttgaagct-3' (KEVR1 : 배열표의 배열 번호 33)

SH348-1, SH357-1 의 중사슬 및 경사슬을 코드하는 cDNA 를 클로닝하기 위해, SH348-1, SH357-1 생성 하이브리도마로부터 Quick Prep mRNA Purification Kit (GE Healthcare Bio-Sciences 사 제조 #27-9254-01) 를 사용하여 mRNA 를 조제하였다. 이와 같이 하여 얻어진 각각의 mRNA 로부터 TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV) (타카라 바이오사 제조 #RR024A) 와 중사슬용 프라이머 세트 (DB3F1 및 MIG2AEVR1 의 조합) 또는 경사슬용 프라이머 세트 (MK19EIF1 및 KEVR1 의 조합) 를 사용하고, 각 항체의 중사슬, 경사슬을 코드하는 cDNA 를 증폭시켰다. 이들 PCR 로 증폭된 cDNA 를 Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen 사 제조) 를 사용하여 클로닝하고, 클로닝된 중사슬, 경사슬의 각 뉴클레오티드 배열을 유전자 배열 해석 장치 (「ABI PRISM 3700 DNA Analyzer ; Applied Biosystems」혹은 「Applied Biosystems 3730xl Analyzer ; Applied Biosystems」) 을 사용하여 결정하였다. 시퀀스의 반응은 GeneAmp 9700 (Applied Biosystems) 를 사용하였다.

결정된 SH348-1 의 중사슬을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 34 에 나타내고, 아미노산 배열을 배열 번호 35 에 나타내었다. SH348-1 의 경사슬을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 36 에 나타내고, 아미노산 배열을 배열표의 배열 번호 37 에 나타내었다. SH357-1 의 중사슬을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 38 에 나타내고, 아미노산 배열을 배열 번호 39 에 나타내었다. SH357-1 의 경사슬을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 40 에 나타내고, 아미노산 배열을 배열 번호 41 에 나타내었다. 배열 번호 34 의 뉴클레오티드 번호 1 ∼ 27 및 1327 ∼ 1350 의 배열, 배열 번호 36 의 뉴클레오티드 번호 637 ∼ 660 의 배열, 배열 번호 38 의 뉴클레오티드 번호 1 ∼ 27 및 1327 ∼ 1350 의 배열, 배열 번호 40 의 뉴클레오티드 번호 637 ∼ 660 의 배열은 프라이머 부분의 배열이다.

또, 각 중사슬 및 경사슬의 아미노산 배열을, 카바트 등에 의한 항체의 아미노산 배열의 데이터 베이스 (Kabat, E. A., et al. (1991) in“Sequence of Proteins of Immunological Interest Vol.Ⅰ 및 Ⅱ" : U.S. Department of Health and Human Services 참조) 와 비교 검토한 결과, SH348-1 의 중사슬에 대해서는, 배열표의 배열 번호 35 의 아미노산 번호 1 내지 119 에 나타나는 아미노산 배열이 가변 영역이고, 아미노산 번호 120 내지 449 에 나타나는 아미노산 배열이 정상 영역인 것이 분명해졌다. 또 SH348-1 의 경사슬에 대해서는, 배열표의 배열 번호 37 의 아미노산 번호 1 내지 112 에 나타나는 아미노산 배열이 가변 영역이고, 아미노산 번호 113 내지 219 에 나타나는 아미노산 배열이 정상 영역인 것이 분명해졌다.

SH357-1 의 중사슬에 대해서는, 배열표의 배열 번호 39 의 아미노산 번호 1 내지 119 에 나타나는 아미노산 배열이 가변 영역이고, 아미노산 번호 120 내지 449 에 나타나는 아미노산 배열이 정상 영역인 것이 분명하였다. 또 SH357-1 의 경사슬에 대해서는, 배열표의 배열 번호 41 의 아미노산 번호 1 내지 112 에 나타나는 아미노산 배열이 가변 영역이고, 아미노산 번호 113 내지 219 에 나타나는 아미노산 배열이 정상 영역인 것이 분명해졌다.

SH348-1 의 중사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 42 에, 아미노산 배열을 배열 번호 43 에, 중사슬 정상 영역의 뉴클레오티드 배열을 배열 번호 44 에, 아미노산 배열을 배열 번호 45 에 나타내었다. SH348-1 의 경사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 46 에, 아미노산 배열을 배열 번호 47 에, 경사슬 정상 영역의 뉴클레오티드 배열을 배열 번호 48 에, 아미노산 배열을 배열 번호 49 에 나타내었다. 배열 번호 42 의 뉴클레오티드 번호 1 ∼ 27 의 배열, 배열 번호 44 의 뉴클레오티드 번호 970 ∼ 993 의 배열, 배열 번호 48 의 뉴클레오티드 번호 301 ∼ 324 의 배열은 프라이머 부분의 배열이다.

또 SH357-1 의 중사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 50 에, 아미노산 배열을 배열 번호 51 에, 중사슬 정상 영역의 뉴클레오티드 배열을 배열 번호 52 에, 아미노산 배열을 배열 번호 53 에 나타내었다. SH357-1 의 경사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 배열을 배열 번호 54 에, 아미노산 배열을 배열 번호 55 에, 경사슬 정상 영역의 뉴클레오티드 배열을 배열 번호 56 에, 아미노산 배열을 배열 번호 57 에 나타내었다. 배열 번호 50 의 뉴클레오티드 번호 1 ∼ 27 의 배열, 배열 번호 52 의 뉴클레오티드 번호 970 ∼ 993 의 배열, 배열 번호 56 의 뉴클레오티드 번호 301 ∼ 324 의 배열은 프라이머 부분의 배열이다.

또한, 중사슬 및 경사슬의 가변 영역의 아미노산 배열에 있어서의, 각각의 CDR 의 위치 및 배열은 카바트 등의 문헌 (상기 Kabat, E. A., et al. (1991) 참조.) 에 의한 항체의 아미노산 배열의 데이터 베이스와의 상동성을 비교 검토함으로써 결정되었다. 그 문헌에 의하면, 상이한 항체 사이에서도 서브 타입이 동일하면 가변 영역 중의 프레임 워크 영역의 사슬 길이는 거의 일정하고, 또 그 아미노산 배열에는 공통성이 인정된다. 한편, CDR 은 그들의 프레임 워크 영역에 끼워져 존재하는 고유의 배열이다. 그래서, 중사슬 및 경사슬의 아미노산 배열을 동일한 서브 타입인 것과 비교 검토한 결과, SH348-1 의 중사슬의 CDR 은 배열표의 배열 번호 35 의 아미노산 번호 26 ∼ 35 (CDRH₁), 동 아미노산 번호 50 ∼ 66 (CDRH₂) 및 동 아미노산 번호 99 ∼ 108 (CDRH₃) 으로 나타나는 아미노산 배열로 결정되었다. SH348-1 의 경사슬의 CDR 은 배열표의 배열 번호 37 의 아미노산 번호 24 ∼ 39 (CDRL₁), 동 아미노산 번호 55 ∼ 61 (CDRL₂) 및 동일 아미노산 번호 94 ∼ 102 (CDRL₃) 으로 나타나는 아미노산 배열로 결정되었다. SH357-1 중사슬의 CDR 은 배열표의 배열 번호 39 의 아미노산 번호 26 ∼ 35 (CDRH₁), 동 아미노산 번호 50 ∼ 66 (CDRH₂) 및 동 아미노산 번호 99 ∼ 108 (CDRH₃) 으로 나타나는 아미노산 배열로 결정되었다. SH357-1 의 경사슬 CDR 은 배열표의 배열 번호 41 의 아미노산 번호 24 ∼ 39 (CDRL₁), 동 아미노산 번호 55 ∼ 61 (CDRL₂) 및 동 아미노산 번호 94 ∼ 102 (CDRL₃) 으로 나타나는 아미노산 배열로 결정되었다.

SH348-1 의 CDRH₁ 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 58 에, 아미노산 배열을 배열 번호 59 에, CDRH₂ 의 뉴클레오티드 배열을 배열 번호 60 에, 아미노산 배열을 배열 번호 61 에, CDRH₃ 의 뉴클레오티드 배열을 배열 번호 62 에, 아미노산 배열을 배열 번호 63 에, CDRL₁ 의 뉴클레오티드 배열을 배열 번호 64 에, 아미노산 배열을 배열 번호 65 에, CDRL₂ 의 뉴클레오티드 배열을 배열 번호 66 에, 아미노산 배열을 배열 번호 67 에, CDRL₃ 의 뉴클레오티드 배열을 배열 번호 68 에, 아미노산 배열을 배열 번호 69 에 나타내었다. 또, SH357-1 의 CDRH₁ 의 뉴클레오티드 배열을 배열 번호 70 에, 아미노산 배열을 배열 번호 71 에, CDRH₂ 의 뉴클레오티드 배열을 배열 번호 72 에, 아미노산 배열을 배열 번호 73 에, CDRH₃ 의 뉴클레오티드 배열을 배열 번호 74 에, 아미노산 배열을 배열 번호 75 에, CDRL₁ 의 뉴클레오티드 배열을 배열 번호 76 에, 아미노산 배열을 배열 번호 77 에, CDRL₂ 의 뉴클레오티드 배열을 배열 번호 78 에, 아미노산 배열을 배열 번호 79 에, CDRL₃ 의 뉴클레오티드 배열을 배열 번호 80 에, 아미노산 배열을 배열 번호 81 에 나타내었다.

(실시예 6) 항EPHA2 항체의 EPHA2 세포 외 영역에 대한 결합성

EPHA2 세포 외 영역 폴리펩티드 (R&D Systems 사 제조. #3035-A2-100) 또는 컨트롤로서 Bovine Serum Albmin (이하, 본문 및 도면 중에서 「BSA」로 약기한다.) 을 PBS 로 1μg/㎖ 에 희석시킨 용액을, 임뮤노플레이트 (Nunc 사 제조 #442404) 에 100 μℓ/웰로 분주하여, 4 ℃ 에서 하룻밤 정치함으로써 플레이트에 흡착시켰다.

다음날, 웰 중의 액을 제거하고, 블록 에이스 용액 (블록 에이스 분말 (다이닛폰 스미토모 제약 (유키지루시 유업) 사 제조) 1 봉을 100 ㎖ 의 초순수로 용해) 을 PBS 로 4 배 희석시킨 용액을 200 μℓ/웰로 분주하여, 실온에서 1 시간 정치하였다. 웰을 희석 완충액 (PBS, 0.05 % (v/v) Tween 20) 으로 2 회 세정 후, SH348-1, SH357-1, Ab96-1 을 각각 1.25 × 10^-4 μg/㎖, 1.25 × 10^-3 μg/㎖, 1.25 × 10^-2 μg/㎖, 1.25×10^-1 μg/㎖, 1.25 μg/㎖, 12.5 μg/㎖, 125 μg/㎖ 의 농도가 되도록 PBS 로 희석시킨 용액 (최종 농도로 0.05 % (v/v) 의 Tween 20 함유) 을 100 μℓ/웰로 첨가하였다.

실온에서 1 시간 정치 후 웰 중의 액을 제거하고, 희석 완충액으로 2 회 웰을 세정하였다. 희석 완충액으로 1000 배로 희석시킨 Goat anti-Mouse IgG, Peroxidase Conjugated (Millipore (Chemicon) 사 제조 #AP181P) 를 100μℓ/웰로 첨가하고, 실온에서 1 시간 정치하였다. 웰 중의 액을 제거하고, 희석 완충액으로 2 회 웰을 세정한 후, OPD 발색액을 100 μℓ/웰로 첨가하여 교반하면서 발색 반응을 실시하였다. 발색 후, 1 M HCl 를 100 μℓ/웰로 첨가하여 발색 반응을 멈추고, 플레이트 리더로 490 ㎚ 의 흡광도를 측정하였다 (도 7).

도 7A) 는 SH348-1, 도 7B) 는 SH357-1, 도 7C) 는 Ab96-1 의 결과를 나타낸다. 각 그래프 중의 흡광도는 평균값 ± 표준 편차 (n = 3) 로 나타내고, 흡광도가 강할수록, 결합 활성이 강한 것을 나타내고 있다. 그래프에 나타내는 바와 같이, SH348-1, SH357-1, Ab96-1 은 모두 BSA 에 대한 결합성을 나타내지 않고, EPHA2 세포 외 영역에 특이적으로 결합하는 것이 확인되었다.

(실시예 7) 항EPHA2 항체의 리간드 결합에 대한 영향

실시예 6 에 기재된 방법에 준하여 EPHA2 세포 외 영역 폴리펩티드 (R&D Systems 사 제조 : #3035-A2-100) 가 고정된 임뮤노플레이트를 제조하였다. 임뮤노프레이트의 웰을 희석 완충액으로 2 회 세정한 후, SH348-1, SH357-1, Ab96-1, 아이소 타입 컨트롤 항체로서 Mouse IgG_2A Isotype Control (이하 및 도면 중 2A 에서 「mIgC2a」로 약기한다 ; R&D Systems 사 제조 : #MAB003) 를 희석 완충액으로 10 μg /㎖, 50 μg /㎖ 에 희석시킨 것을 각각 100 μℓ/웰로 첨가하였다. 실온에서 1 시간 정치 후, 최종농도로 1 μg/㎖ 가 되도록, 가용성 리간드인 Recombinant Mouse Ephrin-A1/Fc Chimera (이하 및 도면 중에서 「Ephrin-A1/Fc」로 약기한다 ; R&D Systems 사 제조 : #602-A1-200.) 또는 가용성 리간드에 대한 음성 컨트롤 단백질로서 Recombinant Human IgG₁ Fc (이하 및 도면 중에서 「hGFc」로 약기한다 ; R&D Systems 사 제조 : #110-HG-100) 를 첨가하여 실온에서 1 시간 정치하였다.

다음으로 실시예 6 에 기재된 방법에 준하여 웰 중의 액을 제거하고, 희석 완충액으로 세정하여, Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Human IgG Fcγ Fragment Specific (Jackson ImmunoResearch 사 제조 #109-035-098) 을 첨가하고, OPD 발색액에 의한 발색 반응을 실시하고, 플레이트 리더로 490 ㎚ 의 흡광도를 측정하였다 (도 8).

도 8 중의 흡광도는 평균값 ± 표준 편차 (n = 3) 로 나타내었다. Ab96-1 은 10 μg /㎖ 의 농도에서도 EPHA2 의 리간드인 Ephrin-A1 의 EPHA2 에 대한 결합을 강하게 저해한 것에 반해, SH348-1 및 SH357-1 은 Ab96-1 의 5 배의 농도인 50 μg/㎖ 로 첨가한 경우에도 Ephrin-A1/Fc 의 EPHA2 에 대한 결합을 저해하지 않았다. 이 결과로부터, SH348-1 및 SH357-1 은 Ephrin-A1/Fc 의 EPHA2 에 대한 결합을 저해하지 않는 것이 확인되었다.

(실시예 8) 항EPHA2 항체의 Ephrin-A1 의존적 EPHA2 티로신 잔기 인산화 억제 활성의 검증

8)-1 세포 용해액의 조제

10 % FBS, 50 단위/㎖ 페니실린, 50 μg /㎖ 스트렙토마이신 함유 RPMI1640 (이하, 「10 % FBS 함유 RPMI1640 (항생 물질 함유)」로 약기한다.) 에 현탁시킨 MDA-MB-231 세포를 2.5 × 10⁵ 세포/웰이 되도록 12 웰 디쉬에 파종하고, 37 ℃, 5 % C0₂ 의 조건하에서 하룻밤 배양하였다. 다음으로 웰 중의 배지를 버리고 새롭게 RPMI1640 를 첨가하고, 37 ℃, 5 % CO₂ 의 조건하에서 추가로 하룻밤 배양하였다. 다음으로 웰 중의 배지를 제거하고, 각 웰에 RPMI1640 만, 또는 10 μg /㎖ 또는 50 μg /㎖ 농도의 항체 (mIgG2a, SH348-1 또는 SH357-1) 를 함유하는 RPMI1640 을 각 웰에 첨가하고, 37 ℃, 5 % CO₂ 의 조건하에서 1 시간 프리인큐베이션하였다.

프리인큐베이션 후, RPMI1640 만을 첨가한 웰에는 50 분의 1 용량의 Ephrin-A1/Fc, hG₁Fc (각각 최종 농도로 1μg/㎖) 또는 이들과 동일 체적의 RPMI1640 (도 9 에서 (-) 로 표기) 를 첨가하였다. 또 mIgG2a, SH348-1 또는 SH357-1 을 첨가한 웰에는, 50 분의 1 용량의 Ephrin-A1/Fc (최종 농도로 1 μg/㎖) 를 첨가하였다.

디쉬를 37 ℃, 5 % CO₂ 의 조건하에서 추가로 15 분간 인큐베이션하고, 상청을 제거한 후, 1 mM PMSF (SIGMA 사 제조) 와 프로테아제 인히비터 칵테일 (SIGMA 사 제조 #P8340) 을 함유하는 1 × Cell Lysis Buffer (Cell Signaling technology 사 제조) (이하, PPCLB 로 약기한다) 를 첨가하여 세포를 용해하였다. 용해액을 15000 rpm 으로 5 분간 원심하여, 얻어진 상청을 면역 침강의 샘플로 하였다. 샘플의 단백질 농도는 BCA Protein Assay Reagent (PIERCE 사 제조) 에 의해 측정하였다.

8)-2 면역 침강에 의한 EPHA2 인산화 상태의 검출

1 샘플당, 25 μℓ 의 Protein G magnetic beads 현탁액 (NEW ENGLAND Bio-Labs 사 제조) 및 4 μg 의 anti-EphA2 Antibody (Santa Cruz Biotechnology 사 제조 #sc-924) 를 첨가하고 4 ℃ 에서 2 시간 전도 혼화하였다. 다음으로, 최종농도로 10 % 가 되도록 FBS 를 첨가하고, 다시 4 ℃ 에서 30 분간 전도 혼화하였다. 다음으로 비즈 (beads) 을 PPCLB 로 세정하고, 8)-1 에서 조제한 세포 용해액 상청을 200 μg 첨가하여, 4 ℃ 에서 하룻밤 전도 혼화하였다.

다음날, 비즈를 PPCLB 로 3 회 세정한 후, 비즈에 SDS-sample buffer (56.3 mM Tris-HCl pH 6.8, 1.8 % (w/v) SDS, 9 % glycerol, 0.72 M 2-메르캅토에탄올, 0.045 ㎎/㎖ 브로모페놀블루) 를 첨가하고 98 ℃ 에서 5 분간 과열하여, 비즈로부터 해리한 단백질을 SDS-PAGE 로 분리하였다.

분리 후의 겔로부터 단백질을 PVDF 막 (포어 사이즈 0.45 ㎛ : Millipore 사 제조) 에 전사하고, PVDF 막을 아지화나트륨 불함유 블로킹액 (블록 에이스 분말 1 봉을 100 ㎖ 의 초순수에 용해 후, Tween 20 을 최종 농도로 0.1 % (v/v) 첨가) 중에서 진탕하여 블로킹하였다.

EPHA2 티로신 잔기의 인산화 상태를 검출하기 위해, Anti-Phosphotyrosine, recombinant 4G10 HRP-conjugate (Upstate 사 제조 #16-184) 를 아지화나트륨 불함유 블로킹액으로 10000 배로 희석시킨 용액에 PVDF 막을 담그어, 실온에서 1 시간 반응시켰다. PVDF 막을 TBST (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.1 % (v/v) Tween 20) 으로 10 분간, 3 회 세정 후, 추가로 H₂O 로 5 분간, 3 회 세정하여, ECL Plus (GE Healthcare Bio-Science 사 제조) 를 사용하여 화학 발광용 필름 상에 시그널을 검출하였다.

다음으로, 이 PVDF 막 상에 존재하는 면역 침강된 EPHA2 를 검출하기 위해, EPHA2 티로신 잔기의 인산화 상태를 검출한 후의 PVDF 막을 Strip 액 (50 mM Tris-HCl pH 6.8, 2 % (w/v) SDS, 100 mM 2-메르캅토에탄올) 에 담그어 55 ℃ 에서 30 분간 진탕한 후, Quench 액 (1 % (v/v) H₂O₂, 0.1 % (w/v) NaN₃ 함유 TBST) 에 담그고 실온에서 20 분간 진탕하여, PVDF 막 상의 항체를 제거하였다. TBST 로 10 분간, 3 회 세정하고, 블로킹액 (블록에스 분말 1 봉을 100 ㎖ 의 초순수에 용해 후, Tween 20, 아지화나트륨을 각각 최종농도로 0.1 % (v/v), 0.02 % (w/v) 가 되도록 첨가) 중에서 블로킹한 후, anti-EphA2 Antibody (Santa Cruz Biotechnology 사 제조 #sc-924) 를 블로킹 용액으로 4000 배로 희석시킨 용액에 PVDF 막을 담그고, 실온에서 1 시간 반응시켰다. PVDF 막을 TBST 로 10 분간, 3 회 세정한 후, Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (Cell Signaling Technology 사 제조 #7074) 를 TBST 로 10000 배로 희석시킨 용액에 담그어 실온에서 30 분간 반응시켰다. 그 후 이 PVDF 막을 TBST 로 10 분간, 3 회 세정한 후, ECL Plus 를 사용하여 화학 발광용 필름 상에 시그널을 검출하였다.

가용성 리간드인 Ephrin-A1/Fc 에 의해 유도되는 EPHA2 티로신 잔기의 인산화는 아이소 타입 컨트롤 항체인 mIgG2a 에서는 저해되지 않는 데 반해, SH348-1, SH357-1 의 첨가에 의해 용량 의존적으로 억제되어 있다 (도 9).

이상의 결과로부터, SH348-1, SH357-1 은 리간드인 Ephrin-A1 의 EPHA2 에 대한 결합을 저해하는 것이 아니라, 리간드에 의해 유도되는 EPHA2 티로신 잔기의 인산화를 억제하는 것으로 나타났다.

(실시예 9) 항EPHA2 항체의 에피토프 동정

도 10 에 나타내는 영역으로 이루어지는 EPHA2 의 결손 변이체를 제작하고, SH348-1, SH357-1 결합 영역을 결정하였다.

9)-1 EPHA2 결손 변이체의 제조

EPHA2 결손 변이체를 N 말단에 GST-Tag 와 His-Tag, C 말단에 S-Tag 를 부가 한 형태로 단백질을 발현시키기 위해, 하기의 프라이머를 합성하고, 이하의 방법으로 증폭시킨 유전자 단편을 pET-49b(+) (Novagen 사 제조) 에 클로닝하였다.

5'-attaggatccgagcttccgtactgccagtgtc-3' (프라이머 N1 : 배열 번호 82)

5'-attaggatccgccccccaaggtgaggct-3' (프라이머 N2 : 배열 번호 83)

5'-attaggatccggtcacttaccgcaagaagggaga-3' (프라이머 N3 : 배열 번호 84)

5'-attaggatccggtccaggtgcaggcactgacg-3' (프라이머 N4 : 배열 번호 85)

5'-aattaagcttgccgccaatcaccgccaagtt-3' (프라이머 C1 : 배열 번호 86)

5'-aattaagcttgttgccagatccctccggggac-3' (프라이머 C2 : 배열 번호 87)

5'-aattaagcttcaggtaggtggtgtctggg-3' (프라이머 C3 : 배열 번호 88)

5'-aattaagcttctcgtacttccacactcggc-3' (프라이머 C4 : 배열 번호 89)

배열표의 배열 번호 8 의, 아미노산 번호 426 내지 540 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 영역 (이하, 「m1」이라고 한다.) 을 프라이머 N1 과 C1 을 사용하여, 아미노산 번호 426 내지 534 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 영역 (이하, 「m2」라고 한다) 을 프라이머 N1 과 C2 를 사용하여, 아미노산 번호 426 내지 504 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 영역 (이하, 「m3」이라고 한다.) 을 프라이머 N1 과 C3 을 사용하여, 아미노산 번호 426 내지 470 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 영역 (이하, 「m4」라고 한다.) 을 프라이머 N1 과 C4 를 사용하여, 아미노산 번호 439 내지 534 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 영역 (이하, 「m5」라고 한다) 을 프라이머 N2 와 C2 를 사용하여, 아미노산 번호 471 내지 534 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 영역 (이하, 「m6」이라고 한다.) 을 프라이머 N3 과 C2 를 사용하여, 아미노산 번호 505 내지 534 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 영역 (이하, 「m7」이라고 한다.) 을 프라이머 N4 와 C2 를 사용하여, 아미노산 번호 439 내지 504 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 영역 (이하, 「m8」이라고 한다) 을 프라이머 N2 와 C3 을 사용하여, 아미노산 번호 439 내지 470 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 영역 (이하, 「m9」라고 한다) 을 프라이머 N2 와 C4 를 사용하여, 각각 pcDNA-DEST40-EPHA2 를 주형에 PCR 반응에 의해 증폭시켰다. 얻어진 PCR 산물을 BamHI 및 HindⅢ으로 절단하고, pET-49b(+) 의 BamHI/HindⅢ 사이트에 서브 클로닝하였다.

9)-2 EPHA2 결손 변이체의 발현

상기 9)-1 에서 구축한 플라스미드 DNA 및 음성 컨트롤로서 pET-49b(+) 를 사용하여, 대장균 BL21(DE3) 를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환체를 30 μg/㎖ 의 카나마이신 (Invitrogen 사 제조) 을 첨가한 LB 배지에서 배양하고, Autoinduction System (Novagen 사 제조) 에 의해 EPHA2 결손 변이체의 발현 유도를 실시하였다. 균체를 원심에 의해 회수하고, PBS 로 세정 후, 균체를 1 mM PMSF 와 프로테아제 인히비터 칵테일 (SIGMA 사 제조 : P8340) 를 함유하는 2 % SDS 용액으로 용해하였다. 원심하여 상청을 회수하고, 에피토프 동정에 사용하였다.

pET-49b(+) 로 형질 전환한 대장균의 균체 용해액 중에서 발현한 pET-49b(+) 유래의 GST-Tag, His-Tag, S-Tag 와 그것들을 연결하는 링커 부분으로 이루어지는 단백질 (이하 및 도면 중에서, 「Vec」라고 한다.) 의 발현량은 이하의 방법으로 계산하였다. Vec 발현 균체 용해액의 희석액 계열과 6x His Protein Ladder (QIAGEN 사 제조) 의 희석 계열을 SDS-sample buffer 에 용해하여 98 ℃ 에서 5 분간 과열한 후, SDS-PAGE 로 분리하고, 겔 중의 단백질을 PVDF 막에 전사하였다. 5 % BSA 를 함유하는 TBST 중에서 블로킹한 후, 5 % BSA 를 포함하는 TBST 로 Penta-His HRP Conjugate (QIAGEN 사 제조) 를 1000 배 희석시킨 용액에 PVDF 막을 담그어, 실온에서 1 시간 반응시켰다. 이 PVDF 막을 TBST 로 10 분간, 3 회 세정한 후, ECL Plus 를 사용하여 시그널을 검출하였다. Vec 발현 균체 용해액의 희석액 계열과 6x His Protein Ladder 의 희석 계열의 시그널 강도를 비교함으로써 6x His Protein Ladder 에 함유되는 1 밴드 주변의 단백량으로부터 Vec 발현 균체 용해액에 함유되는 Vec 의 단백질 농도를 추정하였다. S-Tag Monoclonal Antibody (Novagen) 를 사용한 웨스턴 블롯으로 20 ng 의 Vec 와 동일한 정도의 반응성을 나타내는 양의 EPHA2 결손 변이체를 이하의 에피토프 동정 실험에 사용하였다.

9)-3) 에피토프의 동정

상기 9)-2 에서 조제한 EPHA2 결손 변이체를 함유하는 용해액을 SDS-sample buffer 에 용해하여 98 ℃ 에서 5 분간 과열한 샘플을 SDS-PAGE 로 분리하고, 겔 중의 단백질을 PVDF 막에 전사하였다. 전사 후의 PVDF 막을, 블로킹 액 (블록에스 분말 1 봉을 100 ㎖ 의 초순수에 용해 후, Tween 20, 아지화나트륨을 각각 최종농도로 0.1 % (v/v), 0.02 % (w/v) 가 되도록 첨가) 중에서 진탕하여 블로킹한 후, 이 PVDF 막을 2μg/㎖ 의 SH348-1 또는 SH357-1 을 함유하는 블로킹액 중에서 4 ℃ 에서 하룻밤 반응시켰다. 이 PVDF 막을 TBST 로 10 분간, 3 회 세정하고, Anti-Mouse Ig, HRP-Linked Whole Ab Sheep 을 TBST 로 5000 배 희석시킨 용액 중에서 추가로 실온에서 30 분간 반응시켰다. 계속해서 TBST 로 10 분간, 3 회 세정한 후, ECL Plus 를 사용하여 화학 발광용 필름 상에 시그널을 검출하였다.

다음으로, PVDF 막을 Strip 액 (50 mM Tris-HCl pH 6.8, 2 % (w/v) SDS, 100 mM 2-메르캅토에탄올) 에 담그어 55 ℃ 에서 30 분간 진탕한 후, TBST 로 10 분간, 3 회 세정하였다. 이 PVDF 막을 블로킹액 중에서 블로킹한 후, TBST 로 10 분간, 3 회 세정하고, S-Tag Monoclonal Antibody 를 TBST 로 10000 배로 희석시킨 용액에 담그어 실온에서 30 분간 반응시켰다. PVDF 막을 TBST 로 10 분간, 3 회 세정 후, Anti-Mouse Ig, HRP-Linkcd Whole Ab Sheep 를 TBST 로 5000 배로 희석시킨 용액에 담그어 실온에서 30 분간 반응시켰다. 다음으로 TBST 로 10 분간, 3 회 세정한 후, ECL Plus 를 사용하여 화학 발광용 필름 상에 시그널을 검출하였다.

그 결과, SH348-1 (도 11A), SH357-1 (도 11C) 은 모두 m1, m2, m5 에만 결합성을 나타내었다. 또, 그 때의 PVDF 막 상에 존재하는 EPHA2 결손 변이체의 양은 거의 일정하였다 (SH348-1 : 도 11B, SH357-1 : 도 11D). 이상의 결과로부터 SH348-1, SH357-1 은 EPHA2 의 아미노산 배열 중에서, 배열표의 배열 번호 8 의 아미노산 번호 439 내지 534 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 영역에 결합하는 것으로 나타났다.

(실시예 10) 인간화 항체의 설계

10)-1 SH348-1 의 인간화 항체의 설계

10)-1-1 SH348-1 의 가변 영역의 분자 모델링

SH348-1 의 가변 영역의 분자 모델링을 상동성 모델링 (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)) 에 의해 실시하였다. Protein Data Bank (Nuc. Acid Res.35, D301-D303 (2007)) 에 등록되는 인간 면역 글로블린의 가변 영역의 1 차 배열 (X 선 결정 구조로부터 유도되는 3 차원 구조를 입수할 수 있다) 을, 실시예 5 에서 결정된 SH348-1 의 가변 영역과 비교하였다. 결과적으로, 2 JEL 및 1 A4J 가 각각 SH348-1 의 경사슬 및 중사슬의 가변 영역에 대해 가장 높은 배열 상동성을 갖는 배열로서 선택되었다. 프레임 워크 영역의 3 차원 구조는 SH348-1 의 경사슬 및 중사슬에 대응하는 2JEL 및 1A4J 의 좌표를 조합하여, 「프레임 워크 모델」을 얻음으로써 제작하였다. SH348-1 의 CDR 은 Thornton et al.(J.Mol.Biol., 263, 800-815, (1996)) 의 분류에 따라, CDRL₁, CDRL₂, CDRL₃, CDRH₁ 및 CDRH₂ 는 각각 클러스터 16A, 7A, 9A, 10A, 10A 에 분배되었다. CDRH₃ 은 H3 룰 (FEBS letter 399, 1-8 (1996)) 을 사용하여, e(9)D 로 분류되었다. 이어서, 각각의 CDR 에 대한 대표적인 구조를 프레임 워크 모델에 삽입하였다.

마지막으로, 에너지 면에서 SH348-1 의 가변 영역의 가능성이 있는 분자 모델을 얻기 위해서, 불리한 원자 간 접촉을 제거하기 위한 에너지 계산을 실시하였다. 상기 순서를, 시판되는 단백질 입체 구조 예측 프로그램 Prime 및 배좌 탐색 프로그램 MacroModel (Schrodinger, LLC) 을 사용하여 실시하였다.

10)-1-2 인간화 SH348-1 에 대한 아미노산 배열의 설계

인간화 SH348-1 항체의 구축은 CDR 그래프팅 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86, 10029-10033 (1989)) 에 의해 실시하였다. 억셉터 항체는 프레임 워크 영역 내의 아미노산 상동성에 기초하여 선택되었다. SH348-1 의 프레임 워크 영역의 배열을, 항체의 아미노산 배열의 Kabat 데이터 베이스 (Nuc. Acid Res. 29, 205-206 (2001)) 의 모든 인간 프레임 워크와 비교하여, GSD2B5B10'CL 항체가 프레임 워크 영역에 대한 72 % 의 가장 높은 배열 상동성에서 기인하여, 억셉터로서 선택되었다. GSD2B5B10'CL 에 대한 프레임 워크 영역의 아미노산 잔기를, SH348-1 에 대한 아미노산 잔기와 정렬시켜, 상이한 아미노산이 사용되는 위치를 동정하였다. 이들 잔기의 위치는 상기에서 구축된 SH348-1 의 3 차원 모델을 사용하여 분석되고, 억셉터 상에 그래프팅되어야 할 도너 잔기가 Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)) 에 의해 부여되는 기준에 의해 선택되었다. 선택된 몇 개의 도너 잔기를 억셉터 항체 GSD2B5B10'CL 에 이입함으로써, 인간화 SH348-1 배열을 결정하였다. 그 결과, 이하에 나타내는 바와 같이, 경사슬에 대해 2 타입, 중사슬에 대해 2 타입의 인간화 배열을 취득하였다. 이하, 가변 영역, 정상 영역, CDR 에 대해서는 카바트 등에 의해 작성된 항체의 아미노산 배열 데이터 베이스를 바탕으로 분류되었다.

10-1-3) SH348-1 경사슬의 인간화

10-1-3-1) hSH348-T1L 타입 경사슬 :

배열표의 배열 번호 37 에 나타내는 SH348-1 의 경사슬 가변 영역의 아미노산 번호 2 (발린), 3 (류신), 14 (세린), 15 (류신), 17 (아스파르트산), 18 (글루타민), 50 (리신), 79 (아르기닌), 88 (류신), 105 (글리신), 109 (류신), 114 (알라닌) 를 각각 이소류신, 발린, 트레오닌, 프롤린, 글루탐산, 프롤린, 글루타민, 리신, 발린, 글루타민, 발린, 트레오닌으로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 SH348-1 경사슬을 설계하고, 「hSH348-T1L 타입 경사슬」이라고 명명하였다.

hSH348-1-T1L 타입 경사슬의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 90 에 나타내고, 아미노산 배열을 배열 번호 91 에 나타내었다. 배열 번호 90 의 뉴클레오티드 번호 1 내지 60 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 분비 시그널 배열, 뉴클레오티드 번호 61 내지 402 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 가변 영역, 뉴클레오티드 번호 403 내지 717 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 정상 영역, 뉴클레오티드 번호 130 내지 177 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 CDRL₁, 뉴클레오티드 번호 223 내지 243 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 CDRL₂, 뉴클레오티드 번호 340 내지 363 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 CDRL₃ 의 각 뉴클레오티드 배열이다.

배열표의 배열 번호 91 의 아미노산 번호 1 내지 20 에 나타나는 아미노산 배열이 분비 시그널 배열이고, 아미노산 번호 21 내지 134 에 나타나는 아미노산 배열이 가변 영역, 아미노산 번호 135 내지 239 에 나타나는 아미노산 배열이 정상 영역, 아미노산 번호 44 내지 59 에 나타나는 아미노산 배열이 CDRL₁, 아미노산 번호 75 내지 81 에 나타나는 아미노산 배열이 CDRL₂, 아미노산 번호 114 내지 121 에 나타나는 아미노산 배열이 CDRL₃ 의 각 아미노산 배열이다.

또, hSH348-1-T1L 타입 경사슬의 CDRL₁ 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 92 에, 아미노산 배열을 배열 번호 93 에, CDRL₂ 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 94 에, 아미노산 배열을 배열 번호 95 에, CDRL₃ 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 96 에, 아미노산 배열을 배열 번호 97 에 나타내었다.

10-1-3-2) hSH348-T3L 타입 경사슬 :

배열표의 배열 번호 37 에 나타내는 SH348-1 의 경사슬 가변 영역의 아미노산 번호 14 (세린), 15 (류신), 17 (아스파르트산), 18 (글루타민), 50 (리신), 79 (아르기닌), 88 (류신), 105 (글리신), 109 (류신), 114 (알라닌) 를 각각 트레오닌, 프롤린, 글루탐산, 프롤린, 글루타민, 리신, 발린, 글루타민, 발린, 트레오닌으로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 SH348-1 경사슬을 설계하고, 「hSH348-1-T3L 타입 경사슬」이라고 명명하였다.

hSH348-1-T3L 타입 경사슬의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 98 에 나타내고, 아미노산 배열을 배열 번호 99 에 나타내었다. 배열 번호 98 의 뉴클레오티드 번호 1 내지 60 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 분비 시그널 배열, 뉴클레오티드 번호 61 내지 402 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 가변 영역, 뉴클레오티드 번호 403 내지 717 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 정상 영역, 뉴클레오티드 번호 130 내지 177 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 CDRL₁, 뉴클레오티드 번호 223 내지 243 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 CDRL₂, 뉴클레오티드 번호 340 내지 363 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 CDRL₃ 의 각 뉴클레오티드 배열이다.

배열표의 배열 번호 99 의 아미노산 번호 1 내지 20 에 나타나는 아미노산 배열이 분비 시그널 배열이고, 아미노산 번호 21 내지 134 에 나타나는 아미노산 배열이 가변 영역, 아미노산 번호 135 내지 239 에 나타나는 아미노산 배열이 정상 영역, 아미노산 번호 44 내지 59 에 나타나는 아미노산 배열이 CDRL₁, 아미노산 번호 75 내지 81 에 나타나는 아미노산 배열이 CDRL₂, 아미노산 번호 114 내지 121 에 나타나는 아미노산 배열이 CDRL₃ 의 각 아미노산 배열이다.

또, hSH348-1-T3L 타입 경사슬의 CDRL₁ 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 100 에, 아미노산 배열을 배열 번호 101 에, CDRL₂ 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 102 에, 아미노산 배열을 배열 번호 103 에, CDRL₃ 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 104 에, 아미노산 배열을 배열 번호 105 에 나타내었다.

10-1-4) SH348-1 중사슬의 인간화

10-1-4-1) hSH348-1-T1H 타입 중사슬 :

배열표의 배열 번호 43 에 나타내는 SH348-1 의 중사슬 가변 영역의 아미노산 번호 2 (이소류신), 9 (플로린), 11 (류신), 16 (글루탐산), 17 (트레오닌), 20 (이소류신), 38 (리신), 43 (리신), 46 (리신), 68 (페닐알라닌), 69 (알라닌), 70 (페닐알라닌), 71 (세린), 72 (류신), 73 (글루탐산), 76 (알라닌), 80 (페닐알라닌), 82 (글루타민), 83 (이소류신), 84 (아스파라긴), 85 (아스파라긴), 87 (리신), 88 (아스파라긴), 93 (트레오닌), 95 (페닐알라닌), 114 (트레오닌), 115 (류신) 를 각각 발린, 알라닌, 발린, 세린, 세린, 발린, 아르기닌, 글루타민, 글루탐산, 발린, 트레오닌, 이소류신, 트레오닌, 알라닌, 아스파르트산, 트레오닌, 티로신, 글루탐산, 류신, 세린, 세린, 아르기닌, 세린, 발린, 티로신, 류신, 발린으로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 SH348-1 중사슬을 설계하고, 「hSH348-1-T1H 타입 중사슬」이라고 명명하였다.

hSH348-1-T1H 타입 중사슬의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 106에 나타내고, 아미노산 배열을 배열 번호 107 에 나타내었다. 배열 번호 106 의 뉴클레오티드 번호 1 내지 57 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 분비 시그널 배열, 뉴클레오티드 번호 58 내지 414 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 가변 영역, 뉴클레오티드 번호 415 내지 1404 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 정상 영역, 뉴클레오티드 번호 148 내지 162 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 CDRH₁, 뉴클레오티드 번호 205 내지 255 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 CDRH₂, 뉴클레오티드 번호 352 내지 381 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 CDRL₃ 의 각 뉴클레오티드 배열이다.

배열표의 배열 번호 107 의 아미노산 번호 1 내지 19 에 나타나는 아미노산 배열이 분비 시그널 배열이고, 아미노산 번호 20 내지 138 에 나타나는 아미노산 배열이 가변 영역, 아미노산 번호 139 내지 468 에 나타나는 아미노산 배열이 정상 영역, 아미노산 번호 50 내지 54 에 나타나는 아미노산 배열이 CDRH₁, 아미노산 번호 69 내지 85 에 나타나는 아미노산 배열이 CDRH₂, 아미노산 번호 118 내지 127 에 나타나는 아미노산 배열이 CDRH₃ 의 각 아미노산 배열이다.

또, hSH348-1-T1H 타입 중사슬의 CDRH₁ 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 108 에, 아미노산 배열을 배열 번호 109 에, CDRH₂ 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 110 에, 아미노산 배열을 배열 번호 111 에 CDRH₃ 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 112 에, 아미노산 배열을 배열 번호 113 에 나타내었다.

10-1-4-2) hSH348-1-T3H 타입 중사슬 :

배열표의 배열 번호 43 에 나타내는 SH348-1 의 중사슬 가변 영역의 아미노산 번호 9 (플로린), 11 (류신), 16 (글루탐산), 17 (트레오닌), 20 (이소류신), 38 (리신), 43 (리신), 73 (글루탐산), 76 (알라닌), 80 (페닐알라닌), 82 (글루타민), 83 (이소류신), 84 (아스파라긴), 85 (아스파라긴), 87 (리신), 88 (아스파라긴), 93 (트레오닌), 95 (페닐알라닌), 114 (트레오닌), 115 (류신) 를 각각 알라닌, 발린, 세린, 세린, 발린, 아르기닌, 글루타민, 아스파르트산, 트레오닌, 티로신, 글루탐산, 류신, 세린, 세린, 아르기닌, 세린, 발린, 티로신, 로이신, 발린으로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 SH348-1 중사슬을 설계하고, 「hSH348-1-T3H 타입 중사슬」이라고 명명하였다.

hSH348-1-T3H 타입 중사슬의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 114 에 나타내고, 아미노산 배열을 배열 번호 115 에 나타내었다. 배열 번호 114 의 뉴클레오티드 번호 1 내지 57 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 분비 시그널 배열, 뉴클레오티드 58 내지 414 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 가변 영역, 뉴클레오티드 번호 415 내지 1404 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 정상 영역, 뉴클레오티드 번호 148 내지 162 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 CDRH₁, 뉴클레오티드 번호 205 내지 255 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 CDRH₂, 뉴클레오티드 번호 352 내지 381 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 CDRL₃ 의 각 뉴클레오티드 배열이다.

배열표의 배열 번호 115 의 아미노산 번호 1 내지 19 에 나타나는 아미노산 배열이 분비 시그널 배열이고, 아미노산 번호 20 내지 138 에 나타나는 아미노산 배열이 가변 영역, 아미노산 번호 139 내지 468 에 나타나는 아미노산 배열이 정상 영역, 아미노산 번호 50 내지 54 에 나타나는 아미노산 배열이 CDRH₁, 아미노산 번호 69 내지 85 에 나타나는 아미노산 배열이 CDRH₂, 아미노산 번호 118 내지 127 에 나타나는 아미노산 배열이 CDRH₃ 의 각 아미노산 배열이다.

또, hSH348-1-T3H 타입 중사슬의 CDRH₁ 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 116 에, 아미노산 배열을 배열 번호 117 에, CDRH₂ 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 118 에, 아미노산 배열을 배열 번호 119 에, CDRH₃ 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 120 에, 아미노산 배열을 배열 번호 121 에 나타내었다.

10)-2 SH357-1 의 인간화 항체의 설계

10)-2-1 SH357-1 의 가변 영역의 분자 모델링

상기 10)-1-1 과 동일한 방법으로, 2JEL 및 1A4J 가 각각 SH357-1 의 경사슬 및 중사슬의 가변 영역에 대해 가장 높은 배열 상동성을 갖는 배열로서 선택되고, CDRL₁, CDRL₂, CDRL₃, CDRH₁ 및 CDRH₂ 는 각각 클러스터 16A, 7A, 9A, 10A, 10A에 분재되었다. CDRH₃ 은 e(9)D 로 분류되었다.

10)-2-2 인간화 SH357-1 에 대한 아미노산 배열의 설계

10)-1-2 와 동일한 방법에 의해, GSD2B5B10‘CL 항체가 억셉터로서 선택되어, 인간화 SH357-1 의 배열을 결정하였다. 그 결과, 이하에 나타내는 바와 같이, 경사슬에 대해 2 타입, 중사슬에 대해 2 타입의 인간화 배열을 취득하였다.

10-2-3) SH357-1 경사슬의 인간화

10-2-3-1) hSH357-1-T1L 타입 경사슬 :

배열표의 배열 번호 41 에 나타내는 SH357-1 의 경사슬의 아미노산 번호 2 (발린), 3 (류신), 7 (트레오닌), 14 (세린), 15 (류신), 17 (아스파르트산), 18 (글루타민), 50 (리신), 88 (류신), 105 (글리신), 109 (류신), 114 (알라닌) 를 각각 이소류신, 발린, 세린, 트레오닌, 프롤린, 글루탐산, 프롤린, 글루타민, 발린, 글루타민, 발린, 트레오닌으로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 SH357-1경사슬을, 「hSH357-1-T1L 타입 경사슬」이라고 명명하였다.

hSH357-1-T1L 타입 경사슬의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 122 에 나타내고, 아미노산 배열을 배열 번호 123 에 나타내었다. 배열 번호 122 의 뉴클레오티드 번호 1 내지 60 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 분비 시그널 배열, 뉴클레오티드 번호 61 내지 402 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 가변 영역, 뉴클레오티드 번호 403 내지 717 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 정상 영역, 뉴클레오티드 번호 130 내지 177 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 CDRL₁, 뉴클레오티드 번호 223 내지 243 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 CDRL₂, 뉴클레오티드 번호 340 내지 363 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 CDRL₃ 의 각 뉴클레오티드 배열이다.

배열표의 배열 번호 123 의 아미노산 번호 1 내지 20 에 나타나는 아미노산 배열이 분비 시그널 배열이고, 아미노산 번호 21 내지 134 에 나타나는 아미노산 배열이 가변 영역, 아미노산 번호 135 내지 239 에 나타나는 아미노산 배열이 정상 영역, 아미노산 번호 44 내지 59 에 나타나는 아미노산 배열이 CDRL₁, 아미노산 번호 75 내지 81 에 나타나는 아미노산 배열이 CDRL₂, 아미노산 번호 114 내지 121 에 나타나는 아미노산 배열이 CDRL₃ 이다.

또, hSH357-1-T1L 타입 경사슬의 CDRL₁ 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 124 에, 아미노산 배열을 배열 번호 125 에, CDRL₂ 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 126 에, 아미노산 배열을 배열 번호 127 에, CDRL₃ 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 128 에, 아미노산 배열을 배열 번호 129 에 나타내었다.

10-2-3-2) hSH357-1-T3L 타입 경사슬 :

배열 번호 41 에 나타내는 SH357-1 경사슬의 아미노산 번호 7 (트레오닌), 14 (세린), 15 (류신), 17 (아스파르트산), 18 (글루타민), 50 (리신), 88 (류신), 105 (글리신), 109 (류신), 114 (알라닌) 를 각각 세린, 트레오닌, 프롤린, 글루탐산, 프롤린, 글루타민, 발린, 글루타민, 발린, 트레오닌으로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 SH357-1 경사슬을, 「hSH357-1-T3L 타입 경사슬」이라고 명명하였다.

hSH357-1-T3L 타입 경사슬의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 130 에 나타내고, 아미노산 배열을 배열 번호 131 에 나타내었다. 배열 번호 130 의 뉴클레오티드 번호 1 내지 60 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 분비 시그널 배열, 뉴클레오티드 번호 61 내지 402 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 가변 영역, 뉴클레오티드 번호 403 내지 717 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 정상 영역, 뉴클레오티드 번호 130 내지 177 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 CDRL₁, 뉴클레오티드 번호 223 내지 243 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 CDRL₂, 뉴클레오티드 번호 340 내지 363 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 CDRL₃ 의 각 뉴클레오티드 배열이다.

배열표의 배열 번호 131 의 아미노산 번호 1 내지 20 에 나타나는 아미노산 배열이 분비 시그널 배열이고, 아미노산 번호 21 내지 134 에 나타나는 아미노산 배열이 가변 영역, 아미노산 번호 135 내지 239 에 나타나는 아미노산 배열이 정상 영역, 아미노산 번호 44 내지 59 에 나타나는 아미노산 배열이 CDRL₁, 아미노산 번호 75 내지 81 에 나타나는 아미노산 배열이 CDRL₂, 아미노산 번호 114 내지 121 에 나타나는 아미노산 배열이 CDRL₃ 의 각 아미노산 배열이다.

또, hSH357-1-T3L 타입 경사슬의 CDRL₁ 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 132 에, 아미노산 배열을 배열 번호 133 에, CDRL₂ 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 134 에, 아미노산 배열을 배열 번호 135 에, CDRL₃ 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 136 에, 아미노산 배열을 배열 번호 137 에 나타내었다.

10-2-4) SH357-1 중사슬의 인간화

10-2-4-1) hSH357-1-T1H 타입 중사슬 :

배열표의 배열 번호 51 에 나타내는 SH357-1 의 중사슬 가변 영역의 아미노산 번호 2 (이소류신), 9 (플로린), 11 (류신), 16 (글루탐산), 17 (트레오닌), 20 (이소류신), 38 (리신), 43 (리신), 46 (리신), 68 (페닐알라닌), 69 (알라닌), 70 (페닐알라닌), 71 (세린), 72 (류신), 73 (글루탐산), 76 (알라닌), 82 (글루타민), 83 (이소류신), 85 (아스파라긴), 87 (리신), 88 (아스파라긴), 93 (세린), 95 (페닐알라닌), 114 (트레오닌), 115 (류신) 를 각각 발린, 알라닌, 발린, 알라닌, 세린, 발린, 아르기닌, 글루타민, 글루탐산, 발린, 트레오닌, 이소류신, 트레오닌, 알라닌, 아스파르트산, 트레오닌, 글루탐산, 류신, 세린, 아르기닌, 세린, 발린, 티로신, 류신, 발린으로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 SH357-1 중사슬을 설계하고, 「hSH357-1-T1H 타입 중사슬」이라고 명명하였다.

hSH357-1-T1H 타입 중사슬의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 138 에 나타내고, 아미노산 배열을 배열 번호 139 에 나타내었다. 배열 번호 138 의 뉴클레오티드 번호 1 내지 57 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 분비 시그널 배열, 뉴클레오티드 번호 58 내지 414 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 가변 영역, 뉴클레오티드 번호 415 내지 1404 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 정상 영역, 뉴클레오티드 번호 145 내지 162 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 CDRH₁, 뉴클레오티드 번호 205 내지 255 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 CDRH₂, 뉴클레오티드 번호 352 내지 381 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 CDRL₃ 의 각 뉴클레오티드 배열이다.

배열표의 배열 번호 139 의 아미노산 번호 1 내지 19 에 나타나는 아미노산 배열이 분비 시그널 배열이고, 아미노산 번호 20 내지 138 에 나타나는 아미노산 배열이 가변 영역, 아미노산 번호 139 내지 468 에 나타나는 아미노산 배열이 정상 영역, 아미노산 번호 49 내지 54 에 나타나는 아미노산 배열이 CDRH₁, 아미노산 번호 69 내지 85 에 나타나는 아미노산 배열이 CDRH₂, 아미노산 번호 118 내지 127 에 나타나는 아미노산 배열이 CDRH₃ 의 각 아미노산 배열이다.

또, hSH357-1-T1H 타입 중사슬의 CDRH₁ 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 140 에, 아미노산 배열을 배열 번호 141 에, CDRH₂ 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 142 에, 아미노산 배열을 배열 번호 143 에, CDRH₃ 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 144 에, 아미노산 배열을 배열 번호 145 에 나타내었다.

10-2-4-2) hSH357-1-T3H 타입 중사슬 :

배열 번호 51 에 나타내는 SH357-1 의 중사슬 가변 영역의 아미노산 번호 9 (플로린), 11 (류신), 16 (글루탐산), 17 (트레오닌), 20 (이소류신), 38 (리신), 43 (리신), 73 (글루탐산), 76 (알라닌), 82 (글루타민), 83 (이소류신), 85 (아스파라긴), 87 (리신), 88 (아스파라긴), 93 (세린), 95 (페닐알라닌), 114 (트레오닌), 115 (류신) 를 각각 알라닌, 발린, 알라닌, 세린, 발린, 아르기닌, 글루타민, 아스파르트산, 트레오닌, 글루탐산, 류신, 세린, 아르기닌, 세린, 발린, 티로신, 류신, 발린으로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 SH357-1 중사슬을 설계하고, 「hSH357-1-T3H 타입 중사슬」이라고 명명하였다.

hSH357-1-T3H 타입 중사슬의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 146에 나타내고, 아미노산 배열을 배열 번호 147 에 나타내었다. 배열 번호 146 의 뉴클레오티드 번호 1 내지 57 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 분비 시그널 배열, 뉴클레오티드 번호 58 내지 414 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 가변 영역, 뉴클레오티드 번호 415 내지 1404 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 정상 영역, 뉴클레오티드 번호 145 내지 162 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 CDRH₁, 뉴클레오티드 번호 205 내지 255 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 CDRH₂, 뉴클레오티드 번호 352 내지 381 에 나타나는 뉴클레오티드 배열이 CDRL₃ 의 각 뉴클레오티드 배열이다.

배열표의 배열 번호 147 의 아미노산 번호 1 내지 19 에 나타나는 아미노산 배열이 분비 시그널 배열이고, 아미노산 번호 20 내지 138 에 나타나는 아미노산 배열이 가변 영역, 아미노산 번호 139 내지 468 에 나타나는 아미노산 배열이 정상 영역, 아미노산 번호 49 내지 54 에 나타나는 아미노산 배열이 CDRH₁, 아미노산 번호 69 내지 85 에 나타나는 아미노산 배열이 CDRH₂, 아미노산 번호 118 내지 127 에 나타나는 아미노산 배열이 CDRH₃ 의 각 아미노산 배열이다.

또, hSH357-1-T3H 타입 중사슬의 CDRH₁ 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 148 에, 아미노산 배열을 배열 번호 149 에, CDRH₂ 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 150 에, 아미노산 배열을 배열 번호 151 에, CDRH₃ 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 152 에, 아미노산 배열을 배열 번호 153 에 나타내었다.

(실시예 11) 인간화 항EPHA2 항체의 제작

인간화 SH348-1 및 인간화 SH357-1 의 활성을 측정하기 위해서, 실시예 10 에서 취득된 인간화 항EPHA2 항체의 중사슬 또는 경사슬을 갖는 플라스미드를 이하와 같이 구축하였다.

11)-1 인간화 항EPHA2 항체 발현 벡터의 구축

11)-1-1 인간화 항체 경사슬 발현 범용 벡터 (pEF6/KCL) 의 제조

배열표의 배열 번호 154 에 기록되는 인간 항체 경사슬 시그널 배열 및 인간 Ig 경사슬 (κ 사슬) 정상 영역을 코드하는 유전자를 합성하고 (인비트로젠사 인공 유전자 합성 서비스), 제한 효소 NheI 및 PmeI 로 잘라낸 DNA 단편을, 벡터 pEF6/V5-HisB (인비트로젠사) 의 NheI/PmeI 사이트에 도입하고, 인간화 항체 경사슬 발현 범용 벡터 (pEF6/KCL) 를 구축하였다.

11)-1-2 인간화 항체 중사슬 발현 범용 벡터 (pEF1/FCCU-1) 의 제조

배열표의 배열 번호 155 에 기록되는 인간 항체 중사슬 시그널 배열 및 인간 IgG1 정상 영역을 코드하는 유전자를 합성하고 (인비트로젠사 인공 유전자 합성 서비스), 제한 효소 NheI 및 PmeI 로 잘라낸 DNA 단편을, 벡터 pEF1/myc-HisB (인비트로젠사) 의 NheI/PmeI 사이트에 도입하고, 인간화 항체 H 사슬 발현 범용 벡터 (pEF1/FCCU-1) 를 구축하였다.

11)-1-3 hSH348-1-T1L, hSH348-1-T3L 타입 경사슬 발현 벡터의 구축

배열표의 배열 번호 156, 157 에 각각 나타나는, 분비 시그널과 융합한 hSH348-1-T1L 또는 hSH348-1-T3L 타입 경사슬 가변 영역을 코드하는 유전자를 포함하는 DNA 를 합성하고 (인비트로젠사 인공 유전자 합성 서비스), 제한 효소 NdeI 및 BsiWI 로 잘라낸 DNA 단편을, 인간화 항체 경사슬 발현 범용 벡터 (pEF6/KCL) 를 제한 효소 NdeI 및 BsiWI 로 절단한 지점에 삽입함으로써, hSH348-1-T1L, hSH348-1-T3L 타입 경사슬 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 각각 「pEF6/KCL/hSH348-1-T1L」, 「pEF6/KCL/hSH348-1-T3L」이라고 명명하였다.

11)-1-4 hSH348-1-T1H, hSH348-1-T3H 타입 중사슬 발현 벡터의 구축

배열표의 배열 번호 158, 159 에 각각 나타나는, hSH348-1-T1H 또는 hSH348-1-T3H 타입 중사슬 가변 영역을 코드하는 하는 유전자를 포함하는 DNA 를 합성하고 (인비트로젠사 인공 유전자 합성 서비스), 제한 효소 BlpI 로 잘라낸 DNA 단편을, 인간화 항체 H 사슬 발현 범용 벡터 (pEF1/FCCU-1) 를 제한 효소 BlpI 로 절단한 지점에 삽입함으로써, hSH348-1-T1H, hSH348-1-T3H 타입 중사슬 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 각각 「pEF1/FCCU/hSH348-1-T1H」, 「pEF1/FCCU/hSH348-1-T3H」라고 명명하였다.

11)-1-5 hSH357-1-T1L, hSH357-1-T3L 타입 경사슬 발현 벡터의 구축

배열표의 배열 번호 160, 161 에 각각 나타나는 분비 시그널과 융합한 hSH357-1-T1L 또는 hSH357-1-T3L 타입 경사슬 가변 영역을 코드하는 유전자를 포함하는 DNA 를 합성하고 (인비트로젠사 인공 유전자 합성 서비스), 제한 효소 NdeI 및 BsiWI 로 잘라낸 DNA 단편을, 인간화 항체 L 사슬 발현 범용 벡터 (pEF6/KCL)를 제한 효소 NdeI 및 BsiWI 로 절단한 지점에 삽입함으로써, hSH357-1-T1L, hSH357-1-T3L 타입 경사슬 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 각각 「pEF6/KCL/hSH357-1-T1L」, 「pEF6/KCL/hSH357-1-T3L」이라고 명명하였다.

11)-1-6 hSH357-1-T1H, hSH357-1-T3H 타입 중사슬 발현 벡터의 구축

배열표의 배열 번호 162, 163 에 각각 나타나는, hSH357-1-T1H 또는 hSH357-1-T3H 타입 중사슬 가변 영역을 코드하는 하는 유전자를 포함하는 DNA 를 합성하고 (인비트로젠사 인공 유전자 합성 서비스), 제한 효소 BlpI 로 잘라낸 DNA 단편을, 인간화 항체 H 사슬 발현 범용 벡터 (pEF1/FCCU-1) 를 제한 효소 BlpI 로 절단한 지점에 삽입함으로써, hSH357-1-T1H, hSH357-1-T3H 타입 중사슬 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 각각 「pEF1/FCCU/hSH357-1-T1H」, 「pEF1/FCCU/hSH357-1-T3H」라고 명명하였다.

11)-2 인간화 항체의 생산

대수 증식기의 293 Free Style 세포 1.2 × 10⁹ 를 신선한 1.2 L 의 Free Style 293 Expression Medium (Invitrogen 사) 에 파종하고, 37 ℃, 8 % CO₂ 인큐베이터로 진탕 배양하였다 (125 rpm). Polyethyleneimine (Polyscience #24765) 12 ㎎ 을 Opti-ProSFM 배지 (Invitrogen 사 제조) 40 ㎖ 에 용해하고, 실온에서 5 분간 방치하였다. PureLink HiPure Plasmid 키트 (Invitrogen 사) 를 사용하여 조제 한 H 사슬 발현 플라스미드 (0.6 ㎎) 및 L 사슬 발현 플라스미드 (1.8 ㎎) 를 40 ㎖ 의 Opti-ProSFM 배지 (Invitrogen 사) 에 현탁시켰다. 실온에서 5 분간 방치한 Polyethyleneimine/OptiProSFM 혼합액 40 ㎖ 에, 발현 플라스미드/OptiProSFM 혼합액 40 ㎖ 를 첨가하고, 추가로 실온에서 5 분간 방치하였다. 다음으로 Polyethyleneimine/발현 플라스미드/OptiProSFM 혼합액 80 ㎖ 를 293 Free Style 세포 현탁액에 첨가하고, 진탕 배양을 계속하였다. 37 ℃, 8 % C0₂ 중에서 7 일간 배양한 후, 배양 상청을 회수하였다.

11)-3 인간화 항체의 정제

상기 11)-2 에서 얻어진 배양 상청을 Disposable Capsule Filter (Advabtec #CCS-045-E1H) 에서 여과한 후, Protein A 어피니티 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. PBS 로 평형화한 MabSelectSuReHiTrap 1 ㎖ (GE Healthcare Bio-science 사 제조) 에 배양 상청을 어플라이하고, PBS 로 세정하였다. 다음으로 2 M 아르기닌 용액 (pH 4.0) 을 어플라이하고, 항체가 함유되는 획분을 모았다. pH 를 7 로 조정하고, 미리 PBS 로 평형화한 HiPrep Desalting 칼럼 (26/10, 50 ㎖) (GE 헬스케어 바이오 사이언스 주식회사) 에 공여하고, PBS 로 치환한 후, 0.2 ㎛ 의 필터를 통해 정제 샘플로 하였다.

항체의 농도는 POROS G 20 ㎛ Column, PEEK, 4.6 mm × 100 mm, 1.7 ㎖ (Applied Biosystems 사 제조) 에 결합시킨 항체를 용출시키고, 용출액의 흡광도 (O.D.280 ㎚) 를 측정하고, 표준품 (인간 IgG1) 의 피크 면적과 비교함으로써 구하였다.

pEF6/KCL/hSH348-1-T1L 과 pEF1/FCCU/hSH348-1-T1H 의 조합에 의해 취득된 SH348-1 의 인간화 항체를 hSH348-1-T1, pEF6/KCL/hSH348-1-T3L 과 pEF1/FCCU/hSH348-1-T3H 의 조합에 의해 취득된 SH348-1 의 인간화 항체를 「hSH348-1-T3」이라고 명명하였다.

또, pEF6/KCL/hSH357-1-T1L 과 pEF1/FCCU/hSH357-1-T1H 과의 조합에 의해 취득된 SH357-1 의 인간화 항체를 hSH357-1-T1, pEF6/KCL/hSH357-1-T3L 과 pEF1/FCCU/hSH357-1-T3H 의 조합에 의해 취득된 SH357-1 의 인간화 항체를 「hSH357-1-T3」라고 명명하였다.

(실시예 12) 인간화 항EPHA2 항체의 항원 결합성의 확인

hSH348-1-T1, hSH348-1-T3, hSH357-1-T1 및 hSH357-1-T3 의 항원 결합능을 2차 항체로서 Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Human IgG Fcγ Fragment Specific (Jackson ImmunoResearch 사 제조 #109-035-098) 을 사용하는 점을 제외하고, 실시예 6 에 기재된 방법에 준하여 실시하였다.

도 12A-D) 의 그래프 중의 흡광도는 평균값 ± 표준 편차 (n = 3) 로 나타내고 있다. 그 결과, 인간화 항EPHA2 항체인 hSH348-1-T1, hSH348-1-T3, hSH357-1-T1, hSH357-1-T3 은 모두 EPHA2 세포 외 영역에 결합성을 갖는 것이 확인되었다.

(실시예 13) SH348-1 또는 SH357-1 의 EPHA2 결합에 대한 경합 저해 활성의 측정

SH348-1 의 EPHA2 에 대한 결합에 대한 hSH348-1-T1, hSH348-1-T3 의 경합 저해 활성 및 SH357-1 의 EPHA2 에 대한 결합에 대한 hSH357-1-T1, hSH357-1-T3 의 경합 저해 활성을 이하의 방법으로 측정하였다.

EZ-Link Sulfo-NHS-LC Biotinylation Kit (Thermo scientific 사 제조 #21435) 를 사용하여 첨부한 프로토콜에 따라, 마우스 모노클로날 항체 SH348-1, SH357-1 을 각각 비오틴화하였다 (이하, 비오틴화 SH348-1, SH357-1 을 각각, 「bSH348-1」, 「bSH357-1」로 표기한다). bSH348-1, bSH357-1 및 경합 저해 실험에 사용하는 비표지 항체 (SH348-1, SH357-1, hSH348-1-T1, hSH348-1-T3, hSH357-1-T1, hSH357-1-T3 및 Ab96-1) 의 농도는 BCA Protein Assay Reagent (PIERCE 사 제조) 에 의해 측정하였다.

EPHA2 의 세포 외 영역 폴리펩티드 (R&D Systems 사 제조 : #3035-A2-100) 를 PBS 로 0.5μg/㎖ 에 희석시켜 임뮤노플레이트 (Nunc 사 제조 #442404) 에 100μℓ/웰로 분주하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 정치함으로써 플레이트에 단백질을 흡착시켰다. 다음날, 웰을 희석 완충액 (PBS, 0.05 % (v/v) Tween 20) 으로 1 회 세정한 후, 블록 에이스 용액 (블록 에이스 분말 1 봉을 100 ㎖ 의 초순수로 용해) 을 PBS 로 4 배 희석시킨 용액을 200 μℓ/웰로 분주하여, 실온에서 4 시간 정치하였다. 웰 중의 액을 제거 후, 5 μg/㎖ 의 비오틴화 항체와 각종 농도 (0 μg /㎖, 1 μg/㎖, 5 μg/㎖, 25 μg/㎖, 50 μg /㎖, 125 μg/㎖) 의 비표지 항체의 혼합 용액 (용매는 PBS. 최종 농도로 0.05 % (v/v) 의 Tween 20 함유) 를 각각 100 μℓ/웰로 분주하여, 1 시간 실온에서 정치하였다. 희석 완충액 (PBS, 0.05 % (v/v) Tween 20) 으로 2 회 웰을 세정한 후, 희석 완충액으로 500 배로 희석시킨 Streptavidin-horseradish Peroxidase Conjugate (GE Healthcare Bio-Sciences 사 제조 #RPN1231V) 를 100 μℓ/웰로 첨가하고, 실온에서 1 시간 정치하였다. 웰 중의 액을 제거하고, 희석 완충액으로 2 회 웰을 세정한 후, OPD 발색액을 100 μℓ/웰로 첨가하여 교반하면서 발색 반응을 실시하였다. 발색 후, 1 M HCl 를 100 μℓ/웰로 첨가하여 발색 반응을 멈추고, 플레이트 리더로 490 ㎚ 의 흡광도를 측정하였다.

그 결과, bSH348-1, 또는 bSH357-1 만을 첨가한 웰의 흡광도는 각각 0.780 ± 0.016, 0.978 ± 0.007 (평균값 ± 표준 편차 (n = 3)) 이었다.

도 13A), B) 의 그래프 중의 흡광도는 각각 평균값 ± 표준 편차 (n = 3) 로 나타내고 있다. 에피토프의 상이한 Ab96-1 은 SH348-1 또는 SH357-1 의 EPHA2 에 대한 결합을 저해하지 않았다. 한편, SH348-1 의 EPHA2 에 대한 결합은 SH348-1 자체 또는 그 인간화 항체인 hSH348-1-T1, hSH348-1-T3 에 의해 저해되는 것으로 나타났다 (도 13A). 동일하게 SH357-1 의 EPHA2 에 대한 결합은 SH357-1 자체 또는 그 인간화 항체인 hSH357-1-T1, hSH357-1-T3 에 의해 저해되는 것으로 나타났다 (도 13B).

(실시예 14) Ephrin-A1 의존적 EPHA2 티로신 잔기 인산화의 인간화 항EPHA2 항체에 의한 억제 작용

실시예 8 에 기재된 방법에 준하여 인간화 항EPHA2 항체의 Ephrin-A1 의존적 EPHA2 티로신 잔기 인산화 억제능을 조사하였다. 그 결과, hSH348-1-T1, hSH348-1-T3, hSH357-1-T1, hSH357-1-T3 모두 Ephrin-A1/Fc 에 의해 유도되는 EPHA2 티로신 잔기 인산화를 억제하는 활성을 유지하고 있는 것으로 나타났다 (도 14).

[산업상의 이용가능성]

본 발명의 항EPHA2 항체는 항종양 활성을 갖고, 그 항EPHA2 항체를 함유하는 의약 조성물은 항암제가 될 수 있다.

InternationalPatentOrganismDepositoryNationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnology

FERMBP-10836

20070608

FERMBP-10837

20070608

<110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED <120> Anti EPHA2 antibodies <130> DSPCT-FP0831 <150> JP 2007-224007 <151> 2007-08-30 <160> 163 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 2931 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(2928) <400> 1 atg gag ctc cag gca gcc cgc gcc tgc ttc gcc ctg ctg tgg ggc tgt 48 Met Glu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Cys Phe Ala Leu Leu Trp Gly Cys 1 5 10 15 gcg ctg gcc gcg gcc gcg gcg gcg cag ggc aag gaa gtg gta ctg ctg 96 Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln Gly Lys Glu Val Val Leu Leu 20 25 30 gac ttt gct gca gct gga ggg gag ctc ggc tgg ctc aca cac ccg tat 144 Asp Phe Ala Ala Ala Gly Gly Glu Leu Gly Trp Leu Thr His Pro Tyr 35 40 45 ggc aaa ggg tgg gac ctg atg cag aac atc atg aat gac atg ccg atc 192 Gly Lys Gly Trp Asp Leu Met Gln Asn Ile Met Asn Asp Met Pro Ile 50 55 60 tac atg tac tcc gtg tgc aac gtg atg tct ggc gac cag gac aac tgg 240 Tyr Met Tyr Ser Val Cys Asn Val Met Ser Gly Asp Gln Asp Asn Trp 65 70 75 80 ctc cgc acc aac tgg gtg tac cga gga gag gct gag cgt atc ttc att 288 Leu Arg Thr Asn Trp Val Tyr Arg Gly Glu Ala Glu Arg Ile Phe Ile 85 90 95 gag ctc aag ttt act gta cgt gac tgc aac agc ttc cct ggt ggc gcc 336 Glu Leu Lys Phe Thr Val Arg Asp Cys Asn Ser Phe Pro Gly Gly Ala 100 105 110 agc tcc tgc aag gag act ttc aac ctc tac tat gcc gag tcg gac ctg 384 Ser Ser Cys Lys Glu Thr Phe Asn Leu Tyr Tyr Ala Glu Ser Asp Leu 115 120 125 gac tac ggc acc aac ttc cag aag cgc ctg ttc acc aag att gac acc 432 Asp Tyr Gly Thr Asn Phe Gln Lys Arg Leu Phe Thr Lys Ile Asp Thr 130 135 140 att gcg ccc gat gag atc acc gtc agc agc gac ttc gag gca cgc cac 480 Ile Ala Pro Asp Glu Ile Thr Val Ser Ser Asp Phe Glu Ala Arg His 145 150 155 160 gtg aag ctg aac gtg gag gag cgc tcc gtg ggg ccg ctc acc cgc aaa 528 Val Lys Leu Asn Val Glu Glu Arg Ser Val Gly Pro Leu Thr Arg Lys 165 170 175 ggc ttc tac ctg gcc ttc cag gat atc ggt gcc tgt gtg gcg ctg ctc 576 Gly Phe Tyr Leu Ala Phe Gln Asp Ile Gly Ala Cys Val Ala Leu Leu 180 185 190 tcc gtc cgt gtc tac tac aag aag tgc ccc gag ctg ctg cag ggc ctg 624 Ser Val Arg Val Tyr Tyr Lys Lys Cys Pro Glu Leu Leu Gln Gly Leu 195 200 205 gcc cac ttc cct gag acc atc gcc ggc tct gat gca cct tcc ctg gcc 672 Ala His Phe Pro Glu Thr Ile Ala Gly Ser Asp Ala Pro Ser Leu Ala 210 215 220 act gtg gcc ggc acc tgt gtg gac cat gcc gtg gtg cca ccg ggg ggt 720 Thr Val Ala Gly Thr Cys Val Asp His Ala Val Val Pro Pro Gly Gly 225 230 235 240 gaa gag ccc cgt atg cac tgt gca gtg gat ggc gag tgg ctg gtg ccc 768 Glu Glu Pro Arg Met His Cys Ala Val Asp Gly Glu Trp Leu Val Pro 245 250 255 att ggg cag tgc ctg tgc cag gca ggc tac gag aag gtg gag gat gcc 816 Ile Gly Gln Cys Leu Cys Gln Ala Gly Tyr Glu Lys Val Glu Asp Ala 260 265 270 tgc cag gcc tgc tcg cct gga ttt ttt aag ttt gag gca tct gag agc 864 Cys Gln Ala Cys Ser Pro Gly Phe Phe Lys Phe Glu Ala Ser Glu Ser 275 280 285 ccc tgc ttg gag tgc cct gag cac acg ctg cca tcc cct gag ggt gcc 912 Pro Cys Leu Glu Cys Pro Glu His Thr Leu Pro Ser Pro Glu Gly Ala 290 295 300 acc tcc tgc gag tgt gag gaa ggc ttc ttc cgg gca cct cag gac cca 960 Thr Ser Cys Glu Cys Glu Glu Gly Phe Phe Arg Ala Pro Gln Asp Pro 305 310 315 320 gcg tcg atg cct tgc aca cga ccc ccc tcc gcc cca cac tac ctc aca 1008 Ala Ser Met Pro Cys Thr Arg Pro Pro Ser Ala Pro His Tyr Leu Thr 325 330 335 gcc gtg ggc atg ggt gcc aag gtg gag ctg cgc tgg acg ccc cct cag 1056 Ala Val Gly Met Gly Ala Lys Val Glu Leu Arg Trp Thr Pro Pro Gln 340 345 350 gac agc ggg ggc cgc gag gac att gtc tac agc gtc acc tgc gaa cag 1104 Asp Ser Gly Gly Arg Glu Asp Ile Val Tyr Ser Val Thr Cys Glu Gln 355 360 365 tgc tgg ccc gag tct ggg gaa tgc ggg ccg tgt gag gcc agt gtg cgc 1152 Cys Trp Pro Glu Ser Gly Glu Cys Gly Pro Cys Glu Ala Ser Val Arg 370 375 380 tac tcg gag cct cct cac gga ctg acc cgc acc agt gtg aca gtg agc 1200 Tyr Ser Glu Pro Pro His Gly Leu Thr Arg Thr Ser Val Thr Val Ser 385 390 395 400 gac ctg gag ccc cac atg aac tac acc ttc acc gtg gag gcc cgc aat 1248 Asp Leu Glu Pro His Met Asn Tyr Thr Phe Thr Val Glu Ala Arg Asn 405 410 415 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Gly Lys Gly Trp Asp 40 45 50 ctg atg cag aac atc atg aat gac atg ccg atc tac atg tac tcc gtg 239 Leu Met Gln Asn Ile Met Asn Asp Met Pro Ile Tyr Met Tyr Ser Val 55 60 65 tgc aac gtg atg tct ggc gac cag gac aac tgg ctc cgc acc aac tgg 287 Cys Asn Val Met Ser Gly Asp Gln Asp Asn Trp Leu Arg Thr Asn Trp 70 75 80 85 gtg tac cga gga gag gct gag cgt atc ttc att gag ctc aag ttt act 335 Val Tyr Arg Gly Glu Ala Glu Arg Ile Phe Ile Glu Leu Lys Phe Thr 90 95 100 gta cgt gac tgc aac agc ttc cct ggt ggc gcc agc tcc tgc aag gag 383 Val Arg Asp Cys Asn Ser Phe Pro Gly Gly Ala Ser Ser Cys Lys Glu 105 110 115 act ttc aac ctc tac tat gcc gag tcg gac ctg gac tac ggc acc aac 431 Thr Phe Asn Leu Tyr Tyr Ala Glu Ser Asp Leu Asp Tyr Gly Thr Asn 120 125 130 ttc cag aag cgc ctg ttc acc aag att gac acc att gcg ccc gat gag 479 Phe Gln Lys Arg Leu Phe Thr Lys Ile Asp Thr Ile Ala Pro Asp Glu 135 140 145 atc acc gtc agc agc gac ttc gag gca cgc cac gtg aag ctg aac gtg 527 Ile Thr Val Ser Ser Asp Phe Glu Ala Arg His Val Lys Leu Asn Val 150 155 160 165 gag gag cgc tcc gtg ggg ccg ctc acc cgc aaa ggc ttc tac ctg gcc 575 Glu Glu Arg Ser Val Gly Pro Leu Thr Arg Lys Gly Phe Tyr Leu Ala 170 175 180 ttc cag gat atc ggt gcc tgt gtg gca cta ctc tcc gtc cgt gtc tac 623 Phe Gln Asp Ile Gly Ala Cys Val Ala Leu Leu Ser Val Arg Val Tyr 185 190 195 tac aag aag tgc ccc gag ctg ctg cag ggc ctg gcc cac ttc cct gag 671 Tyr Lys Lys Cys Pro Glu Leu Leu Gln Gly Leu Ala His Phe Pro Glu 200 205 210 acc atc gcc ggc tct gat gca cct tcc ctg gcc act gtg gcc ggc acc 719 Thr Ile Ala Gly Ser Asp Ala Pro Ser Leu Ala Thr Val Ala Gly Thr 215 220 225 tgt gtg gac cat gcc gtg gtg cca ccg ggg ggt gaa gag ccc cgt atg 767 Cys Val Asp His Ala Val Val Pro Pro Gly Gly Glu Glu Pro Arg Met 230 235 240 245 cac tgt gca gtg gat ggc gag tgg ctg gtg ccc att ggg cag tgc ctg 815 His Cys Ala Val Asp Gly Glu Trp Leu Val Pro Ile Gly Gln Cys Leu 250 255 260 tgc cag gca ggc tac gag aag gtg gag gat gcc tgc cag gcc tgc tcg 863 Cys Gln Ala Gly Tyr Glu Lys Val Glu Asp Ala Cys Gln Ala Cys Ser 265 270 275 cct gga ttt ttt aag ttt gag gca tct gag agc ccc tgc ttg gag tgc 911 Pro Gly Phe Phe Lys Phe Glu Ala Ser Glu Ser Pro Cys Leu Glu Cys 280 285 290 cct gag cac acg ctg cca tcc cct gag ggt gcc acc tcc tgc gag tgt 959 Pro Glu His Thr Leu Pro Ser Pro Glu Gly Ala Thr Ser Cys Glu Cys 295 300 305 gag gaa ggc ttc ttc cgg gca cct cag gac cca gcg tcg atg cct tgc 1007 Glu Glu Gly Phe Phe Arg Ala Pro Gln Asp Pro Ala Ser Met Pro Cys 310 315 320 325 aca cga ccc cct tcc gcc cca cac tac ctc aca gcc gtg ggc atg ggt 1055 Thr Arg Pro Pro Ser Ala Pro His Tyr Leu Thr Ala Val Gly Met Gly 330 335 340 gcc aag gtg gag ctg cgc tgg acg ccc cct cag gac agc ggg ggc cgc 1103 Ala Lys Val Glu Leu Arg Trp Thr Pro Pro Gln Asp Ser Gly Gly Arg 345 350 355 gag gac att gtc tac agc gtc acc tgc gaa cag tgc tgg ccc gag tct 1151 Glu Asp Ile Val Tyr Ser Val Thr Cys Glu Gln Cys Trp Pro Glu Ser 360 365 370 ggg gaa tgc ggg ccg tgt gag gcc agt gtg cgc tac tcg gag cct cct 1199 Gly Glu Cys 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gac acc 1535 Arg Thr Glu Gly Phe Ser Val Thr Leu Asp Asp Leu Ala Pro Asp Thr 490 495 500 acc tac ctg gtc cag gtg cag gca ctg acg cag gag ggc cag ggg gcc 1583 Thr Tyr Leu Val Gln Val Gln Ala Leu Thr Gln Glu Gly Gln Gly Ala 505 510 515 ggc agc aag gtg cac gaa ttc cag acg ctg tcc ccg gag gga tct ggc 1631 Gly Ser Lys Val His Glu Phe Gln Thr Leu Ser Pro Glu Gly Ser Gly 520 525 530 aac ttg gcg gtg att ggc ggc gtg gct gtc ggt gtg gtc ctg ctt ctg 1679 Asn Leu Ala Val Ile Gly Gly Val Ala Val Gly Val Val Leu Leu Leu 535 540 545 gtg ctg gca gga gtt ggc ttc ttt atc cac cgc agg agg aag aac cag 1727 Val Leu Ala Gly Val Gly Phe Phe Ile His Arg Arg Arg Lys Asn Gln 550 555 560 565 cgt gcc cgc cag tcc ccg gag gac gtt tac ttc tcc aag tca gaa caa 1775 Arg Ala Arg Gln Ser Pro Glu Asp Val Tyr Phe Ser Lys Ser Glu Gln 570 575 580 ctg aag ccc ctg aag aca tac gtg gac ccc cac aca tat gag gac ccc 1823 Leu Lys Pro Leu Lys Thr Tyr Val Asp Pro His Thr Tyr Glu Asp Pro 585 590 595 aac cag gct gtg ttg aag ttc act acc gag atc cat cca tcc tgt gtc 1871 Asn Gln Ala Val Leu Lys Phe Thr Thr Glu Ile His Pro Ser Cys Val 600 605 610 act cgg cag aag gtg atc gga gca gga gag ttt ggg gag gtg tac aag 1919 Thr Arg Gln Lys Val Ile Gly Ala Gly Glu Phe Gly Glu Val Tyr Lys 615 620 625 ggc atg ctg aag aca tcc tcg ggg aag aag gag gtg ccg gtg gcc atc 1967 Gly Met Leu Lys Thr Ser Ser Gly Lys Lys Glu Val Pro Val Ala Ile 630 635 640 645 aag acg ctg aaa gcc ggc tac aca gag aag cag cga gtg gac ttc ctc 2015 Lys Thr Leu Lys Ala Gly Tyr Thr Glu Lys Gln Arg Val Asp Phe Leu 650 655 660 ggc gag gcc ggc atc atg ggc cag ttc agc cac cac aac atc atc cgc 2063 Gly Glu Ala Gly Ile Met Gly Gln Phe Ser His His Asn Ile Ile Arg 665 670 675 cta gag ggc gtc atc tcc aaa tac aag ccc atg atg atc atc act gag 2111 Leu Glu Gly Val Ile Ser Lys Tyr Lys Pro Met Met Ile Ile Thr Glu 680 685 690 tac atg gag aat ggg gcc ctg gac aag ttc ctt cgg gag aag gat ggc 2159 Tyr Met Glu Asn Gly Ala Leu Asp Lys Phe Leu Arg Glu Lys Asp Gly 695 700 705 gag ttc agc gtg ctg cag ctg gtg ggc atg ctg cgg ggc atc gca gct 2207 Glu Phe Ser Val Leu Gln Leu Val Gly Met Leu Arg Gly Ile Ala Ala 710 715 720 725 ggc atg aag tac ctg gcc aac atg aac tat gtg cac cgt gac ctg gct 2255 Gly Met Lys Tyr Leu Ala Asn Met Asn Tyr Val His Arg Asp Leu Ala 730 735 740 gcc cgc aac atc ctc gtc aac agc aac ctg gtc tgc aag gtg tct gac 2303 Ala Arg Asn Ile Leu Val Asn Ser Asn Leu Val Cys Lys Val Ser Asp 745 750 755 ttt ggc ctg tcc cgc gtg ctg gag gac gac ccc gag gcc acc tac acc 2351 Phe Gly Leu Ser Arg Val Leu Glu Asp Asp Pro Glu Ala Thr Tyr Thr 760 765 770 acc agt ggc ggc aag atc ccc atc cgc tgg acc gcc ccg gag gcc att 2399 Thr Ser Gly Gly Lys Ile Pro Ile Arg Trp Thr Ala Pro Glu Ala Ile 775 780 785 tcc tac cgg aag ttc acc tct gcc agc gac gtg tgg agc ttt ggc att 2447 Ser Tyr Arg Lys Phe Thr Ser Ala Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Ile 790 795 800 805 gtc atg tgg gag gtg atg acc tat ggc gag cgg ccc tac tgg gag ttg 2495 Val Met Trp Glu Val Met Thr Tyr Gly Glu Arg Pro Tyr Trp Glu Leu 810 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<220> <223> PCR primer 11 <400> 15 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt catcgaaggt cgtggg 46 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 12 <400> 16 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29 <210> 17 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 13 <400> 17 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgccccggga agcgcagcc 49 <210> 18 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 14 <400> 18 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ctaaacctcc acagactgaa tctggttcat 60 ctg 63 <210> 19 <211> 2961 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(2958) <400> 19 atg gct ctg cgg agg ctg ggg gcc gcg ctg ctg ctg ctg ccg ctg ctc 48 Met Ala Leu Arg Arg Leu Gly Ala Ala Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu 1 5 10 15 gcc gcc gtg gaa gaa acg cta atg gac tcc act aca gcg act gct gag 96 Ala Ala Val Glu Glu Thr Leu Met Asp Ser Thr Thr Ala Thr Ala Glu 20 25 30 ctg ggc tgg atg gtg cat cct cca tca ggg tgg gaa gag gtg agt ggc 144 Leu Gly Trp Met Val His Pro Pro Ser Gly Trp Glu Glu Val Ser Gly 35 40 45 tac gat gag aac atg aac acg atc cgc acg tac cag gtg tgc aac gtg 192 Tyr Asp Glu Asn Met Asn Thr Ile Arg Thr Tyr Gln Val Cys Asn Val 50 55 60 ttt gag tca agc cag aac aac tgg cta cgg acc aag ttt atc cgg cgc 240 Phe Glu Ser Ser Gln Asn Asn Trp Leu Arg Thr Lys Phe Ile Arg Arg 65 70 75 80 cgt ggc gcc cac cgc atc cac gtg gag atg aag ttt tcg gtg cgt gac 288 Arg Gly Ala His Arg Ile His Val Glu Met Lys Phe Ser Val Arg Asp 85 90 95 tgc agc agc atc ccc agc gtg cct ggc tcc tgc aag gag acc ttc aac 336 Cys Ser Ser Ile Pro Ser Val Pro Gly Ser Cys Lys Glu Thr Phe Asn 100 105 110 ctc tat tac tat gag gct gac ttt gac tcg gcc acc aag acc ttc ccc 384 Leu Tyr Tyr Tyr Glu Ala Asp Phe Asp Ser Ala Thr Lys Thr Phe Pro 115 120 125 aac tgg atg gag aat cca tgg gtg aag gtg gat acc att gca gcc gac 432 Asn Trp Met Glu Asn Pro Trp Val Lys Val Asp Thr Ile Ala Ala Asp 130 135 140 gag agc ttc tcc cag gtg gac ctg ggt ggc cgc gtc atg aaa atc aac 480 Glu Ser Phe Ser Gln Val Asp Leu Gly Gly Arg Val Met Lys Ile Asn 145 150 155 160 acc gag gtg cgg agc ttc gga cct gtg tcc cgc agc ggc ttc tac ctg 528 Thr Glu Val Arg Ser Phe Gly Pro Val Ser Arg Ser Gly Phe Tyr Leu 165 170 175 gcc ttc cag gac tat ggc ggc tgc atg tcc ctc atc gcc gtg cgt gtc 576 Ala Phe Gln Asp Tyr Gly Gly Cys Met Ser Leu Ile Ala Val Arg Val 180 185 190 ttc tac cgc aag tgc ccc cgc atc atc cag aat ggc gcc atc ttc cag 624 Phe Tyr Arg Lys Cys Pro Arg Ile Ile Gln Asn Gly Ala Ile Phe Gln 195 200 205 gaa acc ctg tcg ggg gct gag agc aca tcg ctg gtg gct gcc cgg ggc 672 Glu Thr Leu Ser Gly Ala Glu Ser Thr Ser Leu Val Ala Ala Arg Gly 210 215 220 agc tgc atc gcc aat gcg gaa gag gtg gat gta ccc atc aag ctc tac 720 Ser Cys Ile Ala Asn Ala Glu Glu Val Asp Val Pro Ile Lys Leu Tyr 225 230 235 240 tgt aac ggg gac ggc gag tgg ctg gtg ccc atc ggg cgc tgc atg tgc 768 Cys Asn Gly Asp Gly Glu Trp Leu Val Pro Ile Gly Arg Cys Met Cys 245 250 255 aaa gca ggc ttc gag gcc gtt gag aat ggc acc gtc tgc cga ggt tgt 816 Lys Ala Gly Phe Glu 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Gly Ala Cys Thr Arg Cys Gly Asp Asn Val Gln Tyr Ala Pro Arg 370 375 380 cag cta ggc ctg acc gag cca cgc att tac atc agt gac ctg ctg gcc 1200 Gln Leu Gly Leu Thr Glu Pro Arg Ile Tyr Ile Ser Asp Leu Leu Ala 385 390 395 400 cac acc cag tac acc ttc gag atc cag gct gtg aac ggc gtt act gac 1248 His Thr Gln Tyr Thr Phe Glu Ile Gln Ala Val Asn Gly Val Thr Asp 405 410 415 cag agc ccc ttc tcg cct cag ttc gcc tct gtg aac atc acc acc aac 1296 Gln Ser Pro Phe Ser Pro Gln Phe Ala Ser Val Asn Ile Thr Thr Asn 420 425 430 cag gca gct cca tcg gca gtg tcc atc atg cat cag gtg agc cgc acc 1344 Gln Ala Ala Pro Ser Ala Val Ser Ile Met His Gln Val Ser Arg Thr 435 440 445 gtg gac agc att acc ctg tcg tgg tcc cag ccg gac cag ccc aat ggc 1392 Val Asp Ser Ile Thr Leu Ser Trp Ser Gln Pro Asp Gln Pro Asn Gly 450 455 460 gtg atc ctg gac tat gag ctg cag tac tat gag aag gag ctc agt gag 1440 Val Ile Leu Asp Tyr Glu Leu Gln Tyr Tyr Glu Lys Glu Leu Ser Glu 465 470 475 480 tac aac gcc aca gcc ata aaa agc ccc acc aac acg gtc acc gtg cag 1488 Tyr Asn Ala Thr Ala Ile Lys Ser Pro Thr Asn Thr Val Thr Val Gln 485 490 495 ggc ctc aaa gcc ggc gcc atc tat gtc ttc cag gtg cgg gca cgc acc 1536 Gly Leu Lys Ala Gly Ala Ile Tyr Val Phe Gln Val Arg Ala Arg Thr 500 505 510 gtg gca ggc tac ggg cgc tac agc ggc aag atg tac ttc cag acc atg 1584 Val Ala Gly Tyr Gly Arg Tyr Ser Gly Lys Met Tyr Phe Gln Thr Met 515 520 525 aca gaa gcc gag tac cag aca agc atc cag gag aag ttg cca ctc atc 1632 Thr Glu Ala Glu Tyr Gln Thr Ser Ile Gln Glu Lys Leu Pro Leu Ile 530 535 540 atc ggc tcc tcg gcc gct ggc ctg gtc ttc ctc att gct gtg gtt gtc 1680 Ile Gly Ser Ser Ala Ala Gly Leu Val Phe Leu Ile Ala Val Val Val 545 550 555 560 atc gcc atc gtg tgt aac aga cgg ggg ttt gag cgt gct gac tcg gag 1728 Ile Ala Ile Val Cys Asn Arg Arg Gly Phe Glu Arg Ala Asp Ser Glu 565 570 575 tac acg gac aag ctg caa cac tac acc agt ggc cac atg acc cca ggc 1776 Tyr Thr Asp Lys Leu Gln His Tyr Thr Ser Gly His Met Thr Pro Gly 580 585 590 atg aag atc tac atc gat cct 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gacattgacg 2640 agacagagta ccatgcagat gggggcaagg tgcccatcaa gtggatggcg ctggagtcca 2700 ttctccgccg gcggttcacc caccagagtg atgtgtggag ttatggtgtg actgtgtggg 2760 agctgatgac ttttggggcc aaaccttacg atgggatccc agcccgggag atccctgacc 2820 tgctggaaaa gggggagcgg ctgccccagc cccccatctg caccattgat gtctacatga 2880 tcatggtcaa atgttggatg attgactctg aatgtcggcc aagattccgg gagttggtgt 2940 ctgaattctc ccgcatggcc agggaccccc agcgctttgt ggtcatccag aatgaggact 3000 tgggcccagc cagtcccttg gacagcacct tctaccgctc actgctggag gacgatgaca 3060 tgggggacct ggtggatgct gaggagtatc tggtacccca gcagggcttc ttctgtccag 3120 accctgcccc gggcgctggg ggcatggtcc accacaggca ccgcagctca tctaccagga 3180 gtggcggtgg ggacctgaca ctagggctgg agccctctga agaggaggcc cccaggtctc 3240 cactggcacc ctccgaaggg gctggctccg atgtatttga tggtgacctg ggaatggggg 3300 cagccaaggg gctgcaaagc ctccccacac atgaccccag ccctctacag cggtacagtg 3360 aggaccccac agtacccctg ccctctgaga ctgatggcta cgttgccccc ctgacctgca 3420 gcccccagcc tgaatatgtg aaccagccag atgttcggcc ccagccccct tcgccccgag 3480 agggccctct gcctgctgcc cgacctgctg gtgccactct ggaaagggcc aagactctct 3540 ccccagggaa gaatggggtc gtcaaagacg tttttgcctt tgggggtgcc gtggagaacc 3600 ccgagtactt gacaccccag ggaggagctg cccctcagcc ccaccctcct cctgccttca 3660 gcccagcctt cgacaacctc tattactggg accaggaccc accagagcgg ggggctccac 3720 ccagcacctt caaagggaca cctacggcag agaacccaga gtacctgggt ctggacgtgc 3780 cagtgggaaa gggtgggcgc gccg 3804 <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26 Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro 1 5 <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 27 Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu 1 5 10 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro 1 5 <210> 29 <211> 19 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 29 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala <210> 30 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer DB3F1 <400> 30 cagatccagt tggtgcagtc tggacct 27 <210> 31 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer MIG2AEVR1 <400> 31 aagatatctc atttacccgg agtccgggag aa 32 <210> 32 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer MK19EIF1 <400> 32 aagaattcat gaagttgcct gttagg 26 <210> 33 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer KEVR1 <400> 33 aagatatctt aacactcatt cctgttgaag ct 32 <210> 34 <211> 1350 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(1347) <400> 34 cag atc cag ttg gtg cag tct gga cct gag ctg aag aag cct gga gag 48 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 aca gtc aag atc tcc tgc aag gct tct ggg tat acc ttc aca cac tat 96 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 tca atg cac tgg gtg aag cag gct cca gga aag ggt tta aag tgg atg 144 Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 ggc tgg ata aac acc tac act gga gag cca aca tat gct gat gac ttc 192 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 aag gga cgg ttt gcc ttc tct ttg gaa acc tct gcc agc act gcc ttt 240 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 ttg cag atc aac aac ctc aaa aat gag gac acg gct aca tat ttc tgt 288 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 gca acc tac tat agg tac gaa aga gac ttt gac tac tgg ggc caa ggc 336 Ala Thr Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 acc act ctc aca gtc tcc tca gcc aaa aca aca gcc cca tcg gtc tat 384 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr 115 120 125 cca ctg gcc cct gtg tgt gga gat aca act ggc tcc tcg gtg act cta 432 Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu 130 135 140 gga tgc ctg gtc aag ggt tat ttc cct gag cca gtg acc ttg acc tgg 480 Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp 145 150 155 160 aac tct gga tcc ctg tcc agt ggt gtg cac acc ttc cca gct gtc ctg 528 Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 cag tct gac ctc tac acc ctc agc agc tca gtg act gta acc tcg agc 576 Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser 180 185 190 acc tgg ccc agc cag tcc atc acc tgc aat gtg gcc cac ccg gca agc 624 Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser 195 200 205 agc acc aag gta gac aag aaa att gag ccc aga ggg ccc aca atc aag 672 Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys 210 215 220 ccc tgt cct cca tgc aaa tgc cca gca cct aac ctc ttg ggt gga cca 720 Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 tcc gtc ttc atc ttc cct cca aag atc aag gat gta ctc atg atc tcc 768 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser 245 250 255 ctg agc ccc ata gtc aca tgt gtg gtg gtg gat gtg agc gag gat gac 816 Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp 260 265 270 cca gat gtc cag atc agc tgg ttt gtg aac aac gtg gaa gta cac aca 864 Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn 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Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu 385 390 395 400 gac tct gat ggt tct tac ttc atg tac agc aag ctg aga gtg gaa aag 1248 Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys 405 410 415 aag aac tgg gtg gaa aga aat agc tac tcc tgt tca gtg gtc cac gag 1296 Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu 420 425 430 ggt ctg cac aat cac cac acg act aag agc ttc tcc cgg act ccg ggt 1344 Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly 435 440 445 aaa tga 1350 Lys <210> 35 <211> 449 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 35 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 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Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 aat gga aac acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aaa cca ggc cag tct 144 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca 192 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca ctc agg atc 240 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat tac tgc ttt caa ggt 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 tca cat gtt ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa 336 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 cgg gct gat gct gca cca act gta tcc atc ttc cca cca tcc agt gag 384 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 cag tta aca tct gga ggt gcc tca gtc gtg tgc ttc ttg aac aac ttc 432 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 130 135 140 tac ccc aaa gac atc aat gtc aag tgg aag att gat ggc agt gaa cga 480 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 145 150 155 160 caa aat ggc gtc ctg aac agt tgg act gat cag gac agc aaa gac agc 528 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 acc tac agc atg agc agc acc ctc acg ttg acc aag gac gag tat gaa 576 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 180 185 190 cga cat aac agc tat acc tgt gag gcc act cac aag aca tca act tca 624 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 195 200 205 ccc att gtc aag agc ttc aac agg aat gag tgt taa 660 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215 <210> 37 <211> 219 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 37 Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 145 150 155 160 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 180 185 190 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 195 200 205 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215 <210> 38 <211> 1350 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(1347) <400> 38 cag atc cag ttg gtg cag tct gga cct gag ctg aag aag cct gga gag 48 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 aca gtc aag atc tcc tgc aag gct tct ggg tat acc ttc ata gac tat 96 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr 20 25 30 tca atg cac tgg gtg aag cag gct cca gga aag ggt tta aag tgg atg 144 Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 ggc tgg ata aac acc tac act gga gag cca aca tat tct gat gac ttc 192 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ser Asp Asp Phe 50 55 60 aag gga cgg ttt gcc ttc tct ttg gaa acc tct gcc agc act gcc tat 240 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ttg cag atc agc aac ctc aaa aat gag gac acg gct tca tat ttc tgt 288 Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys 85 90 95 gca acc tac tat agg tac gaa aga gac ttt gac tac tgg ggc caa ggc 336 Ala Thr Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 acc act ctc aca gtc tcc tca gcc aaa aca aca gcc cca tcg gtc tat 384 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr 115 120 125 cca ctg gcc cct gtg tgt gga gat aca act ggc tcc tcg gtg act cta 432 Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu 130 135 140 gga tgc ctg gtc aag ggt tat ttc cct gag cca gtg acc ttg acc tgg 480 Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp 145 150 155 160 aac tct gga tcc ctg tcc agt ggt gtg cac acc ttc cca gct gtc ctg 528 Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 cag tct gac ctc tac acc ctc agc agc tca gtg act gta acc tcg agc 576 Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser 180 185 190 acc tgg ccc agc cag tcc atc acc tgc aat gtg gcc cac ccg gca agc 624 Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser 195 200 205 agc acc aag gtg gac aag aaa att gag ccc aga ggg ccc aca atc aag 672 Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys 210 215 220 ccc tgt cct cca tgc aaa tgc cca gca cct aac ctc ttg ggt gga cca 720 Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 tcc gtc ttc atc ttc cct cca aag atc aag gat gta ctc atg atc tcc 768 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser 245 250 255 ctg agc ccc ata gtc aca tgt gtg gtg gtg gac gtg agc gag gat gac 816 Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp 260 265 270 cca gat gtc cag atc agc tgg ttt gtg aac aac gtg gaa gta cac aca 864 Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr 275 280 285 gct cag aca caa acc cat aga gag gat tac aac agt act ctc cgg gtg 912 Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val 290 295 300 gtc agt gcc ctc ccc atc cag cac cag gac tgg atg agt ggc aag gag 960 Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu 305 310 315 320 ttc aaa tgc aag gtc aac aac aaa gac ctc cca gcg ccc atc gag aga 1008 Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg 325 330 335 acc atc tca aaa ccc aaa ggg tca gta aga gct cca cag gta tat gtc 1056 Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val 340 345 350 ttg cct cca cca gaa gaa gag atg act aag aaa cag gtc act ctg acc 1104 Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr 355 360 365 tgc atg gtc aca gac ttc atg cct gaa gac att tac gtg gag tgg acc 1152 Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr 370 375 380 aac aac ggg aaa aca gag cta aac tac aag aac act gaa cca gtc ctg 1200 Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu 385 390 395 400 gac tct gat ggt tct tac ttc atg tac agc aag ctg aga gtg gaa aag 1248 Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys 405 410 415 aag aac tgg gtg gaa aga aat agc tac tcc tgt tca gtg gtc cac gag 1296 Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu 420 425 430 ggt ctg cac aat cac cac acg act aag agc ttc tcc cgg act ccg ggt 1344 Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly 435 440 445 aaa tga 1350 Lys <210> 39 <211> 449 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 39 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ser Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Thr Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser 180 185 190 Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser 195 200 205 Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser 245 250 255 Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp 260 265 270 Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr 275 280 285 Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val 290 295 300 Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu 305 310 315 320 Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val 340 345 350 Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr 355 360 365 Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr 370 375 380 Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys 405 410 415 Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu 420 425 430 Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 40 <211> 660 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(657) <400> 40 gat gtt ttg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga 48 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc att gta cat agt 96 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 agt gga atc acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aaa cca ggc cag tct 144 Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca 192 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca ctc aag atc 240 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat tac tgc ttt caa ggt 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 tca cat gtt ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa 336 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 cgg gct gat gct gca cca act gta tcc atc ttc cca cca tcc agt gag 384 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 cag tta aca tct gga ggt gcc tca gtc gtg tgc ttc ttg aac aac ttc 432 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 130 135 140 tac ccc aaa gac atc aat gtc aag tgg aag att gat ggc agt gaa cga 480 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 145 150 155 160 caa aat ggc gtc ctg aac agt tgg act gat cag gac agc aaa gac agc 528 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 acc tac agc atg agc agc acc ctc acg ttg acc aag gac gag tat gaa 576 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 180 185 190 cga cat aac agc tat acc tgt gag gcc act cac aag aca tca act tca 624 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 195 200 205 ccc att gtc aag agc ttc aac agg aat gag tgt taa 660 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215 <210> 41 <211> 219 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 41 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 145 150 155 160 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 180 185 190 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 195 200 205 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215 <210> 42 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <400> 42 cag atc cag ttg gtg cag tct gga cct gag ctg aag aag cct gga gag 48 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 aca gtc aag atc tcc tgc aag gct tct ggg tat acc ttc aca cac tat 96 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 tca atg cac tgg gtg aag cag gct cca gga aag ggt tta aag tgg atg 144 Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 ggc tgg ata aac acc tac act gga gag cca aca tat gct gat gac ttc 192 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 aag gga cgg ttt gcc ttc tct ttg gaa acc tct gcc agc act gcc ttt 240 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 ttg cag atc aac aac ctc aaa aat gag gac acg gct aca tat ttc tgt 288 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 gca acc tac tat agg tac gaa aga gac ttt gac tac tgg ggc caa ggc 336 Ala Thr Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 acc act ctc aca gtc tcc tca 357 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 43 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 43 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Thr Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 44 <211> 993 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(990) <400> 44 gcc aaa aca aca gcc cca tcg gtc tat cca ctg gcc cct gtg tgt gga 48 Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly 1 5 10 15 gat aca act ggc tcc tcg gtg act cta gga tgc ctg gtc aag ggt tat 96 Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 ttc cct gag cca gtg acc ttg acc tgg aac tct gga tcc ctg tcc agt 144 Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser 35 40 45 ggt gtg cac acc ttc cca gct gtc ctg cag tct gac ctc tac acc ctc 192 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu 50 55 60 agc agc tca gtg act gta acc tcg agc acc tgg ccc agc cag tcc atc 240 Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 acc tgc aat gtg gcc cac ccg gca agc agc acc aag gta gac aag aaa 288 Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys 85 90 95 att gag ccc aga ggg ccc aca atc aag ccc tgt cct cca tgc aaa tgc 336 Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys 100 105 110 cca gca cct aac ctc ttg ggt gga cca tcc gtc ttc atc ttc cct cca 384 Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 115 120 125 aag atc aag gat gta ctc atg atc tcc ctg agc ccc ata gtc aca tgt 432 Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys 130 135 140 gtg gtg gtg gat gtg agc gag gat gac cca gat gtc cag atc agc tgg 480 Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp 145 150 155 160 ttt gtg aac aac gtg gaa gta cac aca gct cag aca caa acc cat aga 528 Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg 165 170 175 gag gat tac aac agt act ctc cgg gtg gtc agt gcc ctc ccc atc cag 576 Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln 180 185 190 cac cag gac tgg atg agt ggc aag gag ttc aaa tgc aag gtc aac aac 624 His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn 195 200 205 aaa gac ctc cca gcg ccc atc gag aga acc atc tca aaa ccc aaa ggg 672 Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly 210 215 220 tca gta aga gct cca cag gta tat gtc ttg cct cca cca gaa gaa gag 720 Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu 225 230 235 240 atg act aag aaa cag gtc act ctg acc tgc atg gtc aca gac ttc atg 768 Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met 245 250 255 cct gaa gac att tac gtg gag tgg acc aac aac ggg aaa aca gag cta 816 Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu 260 265 270 aac tac aag aac act gaa cca gtc ctg gac tct gat ggt tct tac ttc 864 Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe 275 280 285 atg tac agc aag ctg aga gtg gaa aag aag aac tgg gtg gaa aga aat 912 Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn 290 295 300 agc tac tcc tgt tca gtg gtc cac gag ggt ctg cac aat cac cac acg 960 Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr 305 310 315 320 act aag agc ttc tcc cgg act ccg ggt aaa tga 993 Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 325 330 <210> 45 <211> 330 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 45 Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu 50 55 60 Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys 85 90 95 Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp 145 150 155 160 Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg 165 170 175 Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln 180 185 190 His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn 195 200 205 Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly 210 215 220 Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met 245 250 255 Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu 260 265 270 Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe 275 280 285 Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn 290 295 300 Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr 305 310 315 320 Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 325 330 <210> 46 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <400> 46 gat gtt ttg atg acc caa agt cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga 48 Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc att gta cat agt 96 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 aat gga aac acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aaa cca ggc cag tct 144 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca 192 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca ctc agg atc 240 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat tac tgc ttt caa ggt 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 tca cat gtt ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa 336 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 47 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 47 Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 48 <211> 324 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 48 cgg gct gat gct gca cca act gta tcc atc ttc cca cca tcc agt gag 48 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 cag tta aca tct gga ggt gcc tca gtc gtg tgc ttc ttg aac aac ttc 96 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 20 25 30 tac ccc aaa gac atc aat gtc aag tgg aag att gat ggc agt gaa cga 144 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 35 40 45 caa aat ggc gtc ctg aac agt tgg act gat cag gac agc aaa gac agc 192 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 acc tac agc atg agc agc acc ctc acg ttg acc aag gac gag tat gaa 240 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 65 70 75 80 cga cat aac agc tat acc tgt gag gcc act cac aag aca tca act tca 288 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 85 90 95 ccc att gtc aag agc ttc aac agg aat gag tgt taa 324 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 100 105 <210> 49 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 49 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 35 40 45 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 65 70 75 80 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu 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tgg ggc caa ggc 336 Ala Thr Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 acc act ctc aca gtc tcc tca 357 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 51 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 51 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ser Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Thr Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 52 <211> 993 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(990) <400> 52 gcc aaa aca aca gcc cca tcg gtc tat cca ctg gcc cct gtg tgt gga 48 Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly 1 5 10 15 gat aca act ggc tcc tcg gtg act cta gga tgc ctg gtc aag ggt tat 96 Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 ttc cct gag cca gtg acc ttg acc tgg aac tct gga tcc ctg tcc agt 144 Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser 35 40 45 ggt gtg cac acc ttc cca gct gtc ctg cag tct gac ctc tac acc ctc 192 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu 50 55 60 agc agc tca gtg act gta acc tcg agc acc tgg ccc agc cag tcc atc 240 Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 acc tgc aat gtg gcc cac ccg gca agc agc acc aag gtg gac aag aaa 288 Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys 85 90 95 att gag ccc aga ggg ccc aca atc aag ccc tgt cct cca tgc aaa tgc 336 Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys 100 105 110 cca gca cct aac ctc ttg ggt gga cca tcc gtc ttc atc ttc cct cca 384 Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 115 120 125 aag 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230 235 240 atg act aag aaa cag gtc act ctg acc tgc atg gtc aca gac ttc atg 768 Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met 245 250 255 cct gaa gac att tac gtg gag tgg acc aac aac ggg aaa aca gag cta 816 Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu 260 265 270 aac tac aag aac act gaa cca gtc ctg gac tct gat ggt tct tac ttc 864 Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe 275 280 285 atg tac agc aag ctg aga gtg gaa aag aag aac tgg gtg gaa aga aat 912 Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn 290 295 300 agc tac tcc tgt tca gtg gtc cac gag ggt ctg cac aat cac cac acg 960 Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr 305 310 315 320 act aag agc ttc tcc cgg act ccg ggt aaa tga 993 Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 325 330 <210> 53 <211> 330 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 53 Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu 50 55 60 Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys 85 90 95 Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp 145 150 155 160 Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg 165 170 175 Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln 180 185 190 His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn 195 200 205 Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly 210 215 220 Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met 245 250 255 Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu 260 265 270 Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe 275 280 285 Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn 290 295 300 Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr 305 310 315 320 Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 325 330 <210> 54 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <400> 54 gat gtt ttg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga 48 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc att gta cat agt 96 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 agt gga atc acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aaa cca ggc cag tct 144 Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca 192 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca ctc aag atc 240 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat tac tgc ttt caa ggt 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 tca cat gtt ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa 336 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 55 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 55 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 56 <211> 324 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 56 cgg gct gat gct gca cca act gta tcc atc ttc cca cca tcc agt gag 48 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 cag tta aca tct gga ggt gcc tca gtc gtg tgc ttc ttg aac aac ttc 96 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 20 25 30 tac ccc aaa gac atc aat gtc aag tgg aag att gat ggc agt gaa cga 144 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 35 40 45 caa aat ggc gtc ctg aac agt tgg act gat cag gac agc aaa gac agc 192 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 acc tac agc atg agc agc acc ctc acg ttg acc aag gac gag tat gaa 240 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 65 70 75 80 cga cat aac agc tat acc tgt gag gcc act cac aag aca tca act tca 288 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 85 90 95 ccc att gtc aag agc ttc aac agg aat gag tgt taa 324 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 100 105 <210> 57 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 57 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 35 40 45 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 65 70 75 80 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 100 105 <210> 58 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(30) <400> 58 ggg tat acc ttc aca cac tat tca atg cac 30 Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr Ser Met His 1 5 10 <210> 59 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 59 Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr Ser Met His 1 5 10 <210> 60 <211> 51 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(51) <400> 60 tgg ata aac acc tac act gga gag cca aca tat gct gat gac ttc aag 48 Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys 1 5 10 15 gga 51 Gly <210> 61 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 61 Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 62 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(30) <400> 62 tac tat agg tac gaa aga gac ttt gac tac 30 Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 63 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 63 Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 64 <211> 48 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(48) <400> 64 aga tct agt cag agc att gta cat agt aat gga aac acc tat tta gaa 48 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 65 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 65 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 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Phe Lys 1 5 10 15 gga 51 Gly <210> 73 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 73 Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ser Asp Asp Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 74 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(30) <400> 74 tac tat agg tac gaa aga gac ttt gac tac 30 Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 75 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 75 Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 76 <211> 48 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(48) <400> 76 aga tct agt cag agc att gta cat agt agt gga atc acc tat tta gaa 48 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 77 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 77 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 78 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(21) <400> 78 aaa gtt tcc aac cga ttt tct 21 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 79 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 79 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 80 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(27) <400> 80 ttt caa ggt tca cat gtt ccg tac acg 27 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr 1 5 <210> 81 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 81 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr 1 5 <210> 82 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer N1 <400> 82 attaggatcc gagcttccgt actgccagtg tc 32 <210> 83 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer N2 <400> 83 attaggatcc gccccccaag gtgaggct 28 <210> 84 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer N3 <400> 84 attaggatcc ggtcacttac cgcaagaagg gaga 34 <210> 85 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer N4 <400> 85 attaggatcc ggtccaggtg caggcactga cg 32 <210> 86 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer C1 <400> 86 aattaagctt gccgccaatc accgccaagt t 31 <210> 87 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer C2 <400> 87 aattaagctt gttgccagat ccctccgggg ac 32 <210> 88 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer C3 <400> 88 aattaagctt caggtaggtg gtgtctggg 29 <210> 89 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer C4 <400> 89 aattaagctt ctcgtacttc cacactcggc 30 <210> 90 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSH-348-T1L <220> <221> CDS <222> (1)..(717) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(60) <400> 90 atg gtg ctg cag acc cag gtg ttc atc tcc ctg ctg ctg tgg atc tcc 48 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 ggc gca tat ggc gac ata gtg atg acc cag agc ccc ctg agc ctg ccc 96 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 gtg acc ccc ggc gag ccc gcc tcc atc agc tgc cgg agc agc cag agc 144 Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 atc gtg cac agc aac ggc aac acc tac ctg gag tgg tac ctg cag aag 192 Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 ccc ggc cag agc ccc cag ctg ctg atc tac aag gtg agc aac cgg ttc 240 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75 80 agc ggc gtg ccc gac cgg ttc agc ggc agc ggc agc ggc acc gac ttc 288 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 acc ctg aag atc agc cgg gtg gag gcc gag gac gtg ggc gtg tac tac 336 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 tgc ttc cag ggc tcc cac gtg ccc tac acc ttc ggc cag ggc acc aag 384 Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 115 120 125 gtg gag atc aag cgt acg gtg gcc gcc ccc tcc gtg ttc atc ttc ccc 432 Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 ccc tcc gac gag cag ctg aag tcc ggc acc gcc tcc gtg gtg tgc ctg 480 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 ctg aat aac ttc tac ccc aga gag gcc aag gtg cag tgg aag gtg gac 528 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 aac gcc ctg cag tcc ggg aac tcc cag gag agc gtg acc gag cag gac 576 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 agc aag gac agc acc tac agc ctg agc agc acc ctg acc ctg agc aaa 624 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 gcc gac tac gag aag cac aag gtg tac gcc tgc gag gtg acc cac cag 672 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 ggc ctg agc tcc ccc gtc acc aag agc ttc aac agg ggg gag tgt tag 717 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 tag 720 <210> 91 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 91 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 115 120 125 Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 92 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSH348-1-T1L CDRL1 <220> <221> CDS <222> (1)..(48) <400> 92 cgg agc agc cag agc atc gtg cac agc aac ggc aac acc tac ctg gag 48 Arg Ser Ser Gln Ser 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Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 ggc gca tat ggc gac gtg ctg atg acc cag agc ccc ctg agc ctg ccc 96 Gly Ala Tyr Gly Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 gtg acc ccc ggc gag ccc gcc tcc atc agc tgc cgg agc agc cag agc 144 Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 atc gtg cac agc aac ggc aac acc tac ctg gag tgg tac ctg cag aag 192 Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 ccc ggc cag agc ccc cag ctg ctg atc tac aag gtg agc aac cgg ttc 240 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75 80 agc ggc gtg ccc gac cgg ttc agc ggc agc ggc agc ggc acc gac ttc 288 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 acc ctg aag atc agc cgg gtg gag gcc gag gac gtg ggc gtg tac tac 336 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 tgc ttc cag ggc tcc cac gtg ccc tac acc ttc ggc cag ggc acc aag 384 Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 115 120 125 gtg gag atc aag cgt acg gtg gcc gcc ccc tcc gtg ttc atc ttc ccc 432 Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 ccc tcc gac gag cag ctg aag tcc ggc acc gcc tcc gtg gtg tgc ctg 480 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 ctg aat aac ttc tac ccc aga gag gcc aag gtg cag tgg aag gtg gac 528 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 aac gcc ctg cag tcc ggg aac tcc cag gag agc gtg acc gag cag gac 576 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 agc aag gac agc acc tac agc ctg agc agc acc ctg acc ctg agc aaa 624 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 gcc gac tac gag aag cac aag gtg tac gcc tgc gag gtg acc cac cag 672 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 ggc ctg agc tcc ccc gtc acc aag agc ttc aac agg ggg gag tgt tag 717 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 tag 720 <210> 99 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 99 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 115 120 125 Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 Asn Ala Leu Gln Ser Gly 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Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 180 185 190 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 210 215 220 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser 225 230 235 240 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 245 250 255 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 260 265 270 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 275 280 285 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 290 295 300 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 305 310 315 320 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 325 330 335 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 340 345 350 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 355 360 365 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 370 375 380 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 385 390 395 400 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 405 410 415 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 420 425 430 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 435 440 445 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 450 455 460 Ser Pro Gly Lys 465 <210> 140 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSH357-1-T1H CDRH1 <220> <221> CDS <222> (1)..(18) <400> 140 atc gac tac tcc atg cac 18 Ile Asp Tyr Ser Met His 1 5 <210> 141 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 141 Ile Asp Tyr Ser Met His 1 5 <210> 142 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSH357-1-T1H CDRH2 <220> <221> CDS <222> (1)..(51) <400> 142 tgg atc aac acc tac acc ggc gag ccc acc tac tcc gac gac ttc aag 48 Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ser Asp Asp Phe Lys 1 5 10 15 ggc 51 Gly <210> 143 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 143 Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ser Asp Asp Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 144 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSH357-1-T1H CDRH3 <220> <221> CDS <222> (1)..(30) <400> 144 tac tac agg tac gag agg gac ttc gac tac 30 Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 145 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 145 Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 146 <211> 1407 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSH357-1-T3H <220> <221> CDS <222> (1)..(1404) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(57) <400> 146 atg aaa cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gca gct ccc aga tgg 48 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 gtg ctg agc cag atc cag ctg gtg cag tcc ggc gcc gag gtg aag aag 96 Val Leu Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 ccc ggc gcc tcc gtg aag gtg tcc tgt aag gcc tcc ggc tac acc ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 atc gac tac tcc atg cac tgg gtg agg cag gcc ccc ggc cag ggc ctg 192 Ile Asp Tyr Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 aag tgg atg ggc tgg atc aac acc tac acc ggc gag ccc acc tac tcc 240 Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ser 65 70 75 80 gac gac ttc aag ggc agg ttc gcc ttc tcc ctg gac acc tcc acc agc 288 Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 acc gcc tac ctg gag ctg tcc tcc ctg agg tcc gag gac acc gcc gtg 336 Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 tac tac tgt gcc acc tac tac agg tac gag agg gac ttc gac tac tgg 384 Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr Trp 115 120 125 ggc cag ggc acc ctg gtg acg gtg agc tca gcc tcc acc aag ggc cca 432 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 130 135 140 agc gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggc ggc aca 480 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 145 150 155 160 gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccc gtg acc 528 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175 gtg agc tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccc 576 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 180 185 190 gct gtc ctg cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc 624 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 195 200 205 gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat 672 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 210 215 220 cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aga gtt gag ccc aaa tct 720 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser 225 230 235 240 tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccc tgc cca gca cct gaa ctc ctg 768 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 245 250 255 ggg gga ccc tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc 816 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 260 265 270 atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc 864 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 275 280 285 cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag 912 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 290 295 300 gtg cat aat gcc aag aca aag ccc cgg gag gag cag tac aac agc acg 960 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 305 310 315 320 tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat 1008 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 325 330 335 ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc 1056 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 340 345 350 atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggc cag ccc cgg gaa cca cag 1104 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 355 360 365 gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc 1152 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 370 375 380 agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg 1200 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 385 390 395 400 gag tgg gag agc aat ggc cag ccc gag aac aac tac aag acc acc cct 1248 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 405 410 415 ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc 1296 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 420 425 430 gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggc aac gtc ttc tca tgc tcc gtg 1344 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 435 440 445 atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acc cag aag agc ctc tcc ctg 1392 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 450 455 460 tct ccc ggc aaa tga 1407 Ser Pro Gly Lys 465 <210> 147 <211> 468 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 147 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Ile Asp Tyr Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ser 65 70 75 80 Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 130 135 140 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 145 150 155 160 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 180 185 190 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 210 215 220 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser 225 230 235 240 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 245 250 255 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 260 265 270 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 275 280 285 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 290 295 300 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 305 310 315 320 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 325 330 335 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 340 345 350 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 355 360 365 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 370 375 380 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 385 390 395 400 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 405 410 415 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 420 425 430 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 435 440 445 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 450 455 460 Ser Pro Gly Lys 465 <210> 148 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSH357-1-T3H CDRH1 <220> <221> CDS <222> (1)..(18) <400> 148 atc gac tac tcc atg cac 18 Ile Asp Tyr Ser Met His 1 5 <210> 149 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 149 Ile Asp Tyr Ser Met His 1 5 <210> 150 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSH357-1-T3H CDRH2 <220> <221> CDS <222> (1)..(51) <400> 150 tgg atc aac acc tac acc ggc gag ccc acc tac tcc gac gac ttc aag 48 Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ser Asp Asp Phe Lys 1 5 10 15 ggc 51 Gly <210> 151 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 151 Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ser Asp Asp Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 152 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSH357-1-T3H CDRH3 <220> <221> CDS <222> (1)..(30) <400> 152 tac tac agg tac gag agg gac ttc gac tac 30 Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 153 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 153 Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 154 <211> 520 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgGL constant+signal <400> 154 ctaggtaagc ttggtaccac ccaagctggc taggtaagct tgctagcgcc accatggtgc 60 tgcagaccca ggtgttcatc tccctgctgc tgtggatctc cggcgcatat ggcgatatcg 120 tgatgattaa acgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc tccgacgagc 180 agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac cccagagagg 240 ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag gagagcgtga 300 ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc ctgagcaaag 360 ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc ctgagctccc 420 ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gttaggggcc cgtttaaacg ggtggcatcc 480 ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt 520 <210> 155 <211> 1140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgGH constant+signal <400> 155 ttggtaccac ccaagctggc taggtaagct tgctagcgcc accatgaaac acctgtggtt 60 cttcctcctg ctggtggcag ctcccagatg ggtgctgagc caggtgcaat tgtgcaggcg 120 gttagctcag cctccaccaa gggcccaagc gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 180 acctctggcg gcacagccgc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaacccgtg 240 accgtgagct ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc cgctgtcctg 300 cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 360 acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga 420 gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cctgcccagc acctgaactc 480 ctggggggac cctcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 540 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 600 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc ccgggaggag 660 cagtacaaca gcacgtaccg ggtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 720 aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 780 accatctcca aagccaaagg ccagccccgg gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 840 cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 900 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat ggccagcccg agaacaacta caagaccacc 960 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1020 agcaggtggc agcagggcaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1080 cactacaccc agaagagcct ctccctgtct cccggcaaat gagatatcgg gcccgtttaa 1140 1140 <210> 156 <211> 442 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSH348-1-T1L+signal <400> 156 aggtaagctt gctagcgcca ccatggtgct gcagacccag gtgttcatct ccctgctgct 60 gtggatctcc ggcgcatatg gcgacatagt gatgacccag agccccctga gcctgcccgt 120 gacccccggc gagcccgcct ccatcagctg ccggagcagc cagagcatcg tgcacagcaa 180 cggcaacacc tacctggagt ggtacctgca gaagcccggc cagagccccc agctgctgat 240 ctacaaggtg agcaaccggt tcagcggcgt gcccgaccgg ttcagcggca gcggcagcgg 300 caccgacttc accctgaaga tcagccgggt ggaggccgag gacgtgggcg tgtactactg 360 cttccagggc tcccacgtgc cctacacctt cggccagggc accaaggtgg agatcaagcg 420 tacggtggcc gccccctccg tg 442 <210> 157 <211> 442 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSH348-1-T3L+signal <400> 157 aggtaagctt gctagcgcca ccatggtgct gcagacccag gtgttcatct ccctgctgct 60 gtggatctcc ggcgcatatg gcgacgtgct gatgacccag agccccctga gcctgcccgt 120 gacccccggc gagcccgcct ccatcagctg ccggagcagc cagagcatcg tgcacagcaa 180 cggcaacacc tacctggagt ggtacctgca gaagcccggc cagagccccc agctgctgat 240 ctacaaggtg agcaaccggt tcagcggcgt gcccgaccgg ttcagcggca gcggcagcgg 300 caccgacttc accctgaaga tcagccgggt ggaggccgag gacgtgggcg tgtactactg 360 cttccagggc tcccacgtgc cctacacctt cggccagggc accaaggtgg agatcaagcg 420 tacggtggcc gccccctccg tg 442 <210> 158 <211> 460 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSH348-1-T1H+signal <400> 158 gtaagcttgc tagcgcacca tgaagcacct gtggttcttc ctgctgctgg tggccgcccc 60 cagatgggtg ctgagccagg tgcagctggt gcagagcggc gccgaggtga agaagcccgg 120 cagcagcgtg aaggtgagct gcaaggccag cggctacacc ttcacccact acagcatgca 180 ctgggtgcgg caggcccccg gccagggcct ggagtggatg ggctggatca acacctacac 240 cggcgagccc acctacgccg acgacttcaa gggccgggtg accatcaccg ccgacacctc 300 cacctccacc gcctacctgg aactgagcag cctgcggagc gaggacaccg ccgtgtacta 360 ctgcgccacc tactaccggt acgagcggga cttcgactac tggggccagc gcaccctggt 420 gaccgtgagc tcagcctcct ccaccaaggg cccctccgtg 460 <210> 159 <211> 460 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSH348-1-T3H+signal <400> 159 gtaagcttgc tagcgcacca tgaagcacct gtggttcttc ctgctgctgg tggccgcccc 60 cagatgggtg ctgagccaga tccagctggt gcagagcggc gccgaggtga agaagcccgg 120 cagcagcgtg aaggtgagct gcaaggccag cggctacacc ttcacccact acagcatgca 180 ctgggtgcgg caggcccccg gccagggcct gaagtggatg ggctggatca acacctacac 240 cggcgagccc acctacgccg acgacttcaa gggccggttc gccttcagcc tggacacctc 300 cacctccacc gcctacctgg aactgagcag cctgcggagc gaggacaccg ccgtgtacta 360 ctgcgccacc tactaccggt acgagcggga cttcgactac tggggccagc gcaccctggt 420 gaccgtgagc tcagcctcct ccaccaaggg cccctccgtg 460 <210> 160 <211> 442 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSH357-1-T1L+signal <400> 160 aggtaagctt gctagcgcca ccatggtgct gcagacccag gtgttcatct ccctgctgct 60 gtggatctcc ggcgcatatg gcgacatagt gatgacccag agccccctga gcctgcccgt 120 gacccccggc gagcccgcca gcatcagctg ccggagcagc cagagcatcg tgcacagcag 180 cggcatcacc tacctggagt ggtacctgca gaagcccggc cagagccccc agctgctgat 240 ctacaaggtg agcaaccggt tcagcggcgt gcccgaccgg ttcagcggca gcggcagcgg 300 caccgacttc accctgaaga tcagccgggt ggaggccgag gacgtgggcg tgtactactg 360 cttccagggc agccacgtgc cctacacctt cggccagggc accaaggtgg agatcaagcg 420 tacggtggcc gccccctccg tg 442 <210> 161 <211> 442 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSH357-1-T3L+signal <400> 161 aggtaagctt gctagcgcca ccatggtgct gcagacccag gtgttcatct ccctgctgct 60 gtggatctcc ggcgcatatg gcgacgtgct gatgacccag agccccctga gcctgcccgt 120 gacccccggc gagcccgcca gcatcagctg ccggagcagc cagagcatcg tgcacagcag 180 cggcatcacc tacctggagt ggtacctgca gaagcccggc cagagccccc agctgctgat 240 ctacaaggtg agcaaccggt tcagcggcgt gcccgaccgg ttcagcggca gcggcagcgg 300 caccgacttc accctgaaga tcagccgggt ggaggccgag gacgtgggcg tgtactactg 360 cttccagggc agccacgtgc cctacacctt cggccagggc accaaggtgg agatcaagcg 420 tacggtggcc gccccctccg tg 442 <210> 162 <211> 460 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSH357-1-T1H+signal <400> 162 gtaagcttgc tagcgcacca tgaagcacct gtggttcttc ctgctgctgg tggccgcccc 60 cagatgggtg ctgagccagg tgcagctggt gcagtccggc gccgaggtga agaagcccgg 120 cgcctccgtg aaggtgtcct gtaaggcctc cggctacacc ttcatcgact actccatgca 180 ctgggtgagg caggcccccg gccagggcct ggagtggatg ggctggatca acacctacac 240 cggcgagccc acctactccg acgacttcaa gggcagggtg accatcaccg ccgacacctc 300 caccagcacc gcctacctgg agctgtcctc cctgaggtcc gaggacaccg ccgtgtacta 360 ctgtgccacc tactacaggt acgagaggga cttcgactac tggggccagg gcaccctggt 420 gacggtgagc tcagcctcct ccaccaaggg cccctccgtg 460 <210> 163 <211> 460 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSH357-1-T3H+signal <400> 163 gtaagcttgc tagcgcacca tgaagcacct gtggttcttc ctgctgctgg tggccgcccc 60 cagatgggtg ctgagccaga tccagctggt gcagtccggc gccgaggtga agaagcccgg 120 cgcctccgtg aaggtgtcct gtaaggcctc cggctacacc ttcatcgact actccatgca 180 ctgggtgagg caggcccccg gccagggcct gaagtggatg ggctggatca acacctacac 240 cggcgagccc acctactccg acgacttcaa gggcaggttc gccttctccc tggacacctc 300 caccagcacc gcctacctgg agctgtcctc cctgaggtcc gaggacaccg ccgtgtacta 360 ctgtgccacc tactacaggt acgagaggga cttcgactac tggggccagg gcaccctggt 420 gacggtgagc tcagcctcct ccaccaaggg cccctccgtg 460

Claims

하이브리도마 SH357-1 (FERM BP-10837) 에 의해 생성하는 항체.
제 1 항에 따른 항체를 인간화하여 수득된 항체.
하기 1) 및 2) 로 이루어지는, EPHA2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 :
1) 배열표의 배열 번호 139 의 아미노산 번호 20 내지 468 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 중사슬 폴리펩티드 또는 배열표의 배열 번호 147 의 아미노산 번호 20 내지 468 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 중사슬 폴리펩티드 ;
2) 배열표의 배열 번호 123 의 아미노산 번호 21 내지 239 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 경사슬 폴리펩티드 또는 배열표의 배열 번호 131 의 아미노산 번호 21 내지 239 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 경사슬 폴리펩티드.
배열표의 배열 번호 139 의 아미노산 번호 20 내지 468 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 중사슬 폴리펩티드 및 배열표의 배열 번호 123 의 아미노산 번호 21 내지 239 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 경사슬 폴리펩티드로 이루어지는, EPHA2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
제 1 항, 제 2 항 및 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 항체의, Fab, F(ab')2, Fv, scFv, 디아보디 또는 선 형상 항체.
마우스 하이브리도마 SH357-1 (FERM BP-10837).
배열표의 배열 번호 39 의 아미노산 번호 1 내지 119 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 중사슬 폴리펩티드 및 배열표의 배열 번호 41 의 아미노산 번호 1 내지 112 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 경사슬 폴리펩티드로 이루어지고, EPHA2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
배열표의 배열 번호 39 의 아미노산 배열을 포함하는 중사슬 폴리펩티드 및 배열표의 배열 번호 41 의 아미노산 배열을 포함하는 경사슬 폴리펩티드로 이루어지고, EPHA2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
배열표의 배열 번호 147 의 아미노산 번호 20 내지 468 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 중사슬 폴리펩티드 및 배열표의 배열 번호 131 의 아미노산 번호 21 내지 239 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 경사슬 폴리펩티드로 이루어지고, EPHA2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
배열표의 배열 번호 8 의 아미노산 배열로 이루어지고 EPHA2 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 상기 항체는 배열표에서 CDRH1으로서 배열 번호 141, CDRH2로서 배열 번호 143, CDRH3으로서 배열 번호 145에 나타나는 아미노산 서열을 갖고, 배열표에서 CDRL1으로서 배열 번호 125, CDRL2로서 배열 번호 127 및 CDRL3으로서 배열 번호 129에 나타나는 아미노산 서열을 갖는 단리된 항체.
하기 1) 및 2) 로 이루어지는, EPHA2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 :
1) 배열표의 배열 번호 139 의 아미노산 번호 20 내지 138 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 중사슬 폴리펩티드 또는 배열표의 배열 번호 147 의 아미노산 번호 20 내지 138 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 중사슬 폴리펩티드 ;
2) 배열표의 배열 번호 123 의 아미노산 번호 21 내지 134 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 경사슬 폴리펩티드 또는 배열표의 배열 번호 131 의 아미노산 번호 21 내지 134 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 경사슬 폴리펩티드.
배열표의 배열 번호 139 의 아미노산 번호 20 내지 138 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 중사슬 폴리펩티드 및 배열표의 배열 번호 123 의 아미노산 번호 21 내지 134 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 경사슬 폴리펩티드로 이루어지는, EPHA2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
배열표의 배열 번호 147 의 아미노산 번호 20 내지 138 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 중사슬 폴리펩티드 및 배열표의 배열 번호 131 의 아미노산 번호 21 내지 134 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 경사슬 폴리펩티드로 이루어지는, EPHA2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
제 1 항 내지 제 4 항 및 제 7 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 항체로부터 선택되는 치료학적 유효량의 하나 이상의 항체 및 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제 및 보조제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는, 암 치료용 약제학적 조성물.
제 5 항에 따른 항체로부터 선택되는 치료학적 유효량의 하나 이상의 항체 및 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제 및 보조제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는, 암 치료용 약제학적 조성물.
제 14 항에 있어서, 상기 암이 유방암, 식도암, 전립선암, 위암, 비소 세포 폐암, 대장암 및 다형 신경 교아종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약제학적 조성물.
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