CN1905899B - EphA2激动性单克隆抗体及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及设计来治疗、控制或预防癌症,特别是转移性癌的方法和组合物。本发明的方法包括给予有效量的一种或多种结合并激发EphA2的抗体,从而提高细胞中EphA2的磷酸化和降低已激发的EphA2的水平。本发明也包括能优先结合在癌细胞而不是非癌细胞上暴露的EphA2表位的抗体。本发明还提供了只含有本发明的一种或多种EphA2抗体,或该抗体与一种或多种用于治疗癌症的其它药物组合的药物组合物。
Description
1.发明领域
本申请要求2003年11月20日提交的美国专利临时申请No.60/524,177的优先权,后者是2003年5月12日提交的美国专利非临时申请No.10/436,783的部分继续申请,此非临时申请要求2002年5月10日提交的美国专利临时申请No.60/379,368和2002年10月14日提交的60/418,204和2003年4月3日提交的60/460,358的优先权,这些专利申请的全部内容均纳入本文作参考。
本发明涉及用于治疗、控制或预防癌症的方法和组合物。本发明的方法包括给予有效量的一种或多种EphA2的特异性抗体,优选单克隆抗体,这些抗体是EphA2的激动剂,和/或能优先选择性结合在癌细胞而不是非癌细胞上暴露或数量增加的EphA2表位。本发明也提供了只含有本发明的一种或多种单克隆抗体,或该抗体与一种或多种用于癌症治疗的其它药物相组合的药物组合物。还提供了有治疗作用的抗EphA2抗体的检测方法和筛选方法。
2.发明背景
癌症
癌或肿瘤是由于细胞生长异常和失控所产生的赘生肿块,可以是良性或恶性。良性肿瘤通常维持在局部区域。恶性肿瘤统称为癌。术语“恶性”一般指肿瘤可能入侵和破坏相邻的机体结构和扩散到远处部位引起死亡(综述见Robbins和Angell,1976,Basic Pathology,第二版,W.B.Saunders Co,Philadelphia,68-122页)。癌可发生在机体的许多部位,根据其起源有不同的表现。癌细胞能破坏其起源的机体组织部分,然后扩散到机体的其它部分,在那儿开始新的增殖而引起更大的破坏。
每年有1,200万以上的美国人发生癌症。癌症是美国第二主要死亡原因,如果此倾向持续下去,到2010年预计癌症将成为主要的死亡原因。肺癌和前列腺癌是美国男性的顶级癌症杀手。肺癌和乳腺癌则是美国妇女的顶级癌症杀手。美国男性两人中在其生命期间的某时候有一人会诊断患有癌症。美国妇女三人中在其生命期间的某时候会有一人诊断患有癌症。
尚没发现可治愈的癌症。目前可选择的治疗方法,包括手术、化疗和放射治疗常常要么无效,要么有严重的副作用。
转移癌
当肿瘤细胞群落获得在体内转移至远距离和外部位点的能力时,就产生了大多数威胁生命的癌。这些转移性细胞通过克服通常限制细胞转移到不同组织的限制条件而存活。例如,如果将一般的乳腺上皮细胞移植到肺部,那么它一般不能生长或存活,然而肺转移瘤是乳腺癌发病率和死亡率的主要原因。近来有证据表明,在原发性肿瘤在临床上有表现之前的很长时间,转移性细胞就可扩散到了全身。在检测到并除去原发性肿瘤之后,这些微转移性细胞可以保持休眠几个月或几年。因此,更好地了解转移性细胞在外部微环境中的生长和存活机理对于改进治疗非常重要,这样可以对抗转移性癌症,并可较早地诊断和定位转移。
癌细胞信号
癌症是一种异常信号转导疾病。异常细胞信号克服对细胞生长和存活的锚定依赖性限制(Rhim等人,Critical Reviews in Oncogenesis 8:305,1997;Patarca,Critical Reviews in Oncogenesis 7:343,1996;Malik等人,Biochimicaet Biophysica Acta 1287:73,1996;Cance等人,Breast Cancer Res Treat 35:105,1995)。酪氨酸激酶活性是由ECM锚定诱导的,而且确实地,酪氨酸激酶的表达或功能通常在恶性细胞中增大(Rhim等人,Critical Reviews inOncogenesis 8:305,1997;Cance等人,Breast Cancer Res Treat 35:105,1995;Hunter,Cell 88:333,1997)。基于恶性细胞生长需要酪氨酸激酶活性的事实,酪氨酸激酶成为新治疗方法的标靶(Levitzki等人,Science 267:1782,1995;Kondapaka等人,Molecular&Cell Endocrinology 117:53,1996;Fry等人,Current Opinion in BioTechnology 6:662,1995)。不幸地是,与肿瘤细胞特异性有关的障碍经常限制这些药物的应用。具体而言,酪氨酸激酶活性通常对于良性组织的功能和存活是至关重要的(Levitzki等人,Science 267:1782,1995)。为了使间接毒性最小化,识别在肿瘤细胞中选择性过表达的酪氨酸激酶,然后以其为标靶非常重要。
EphA2
EphA2是成熟上皮中表达的一种130Kd的受体酪氨酸激酶,发现其在上皮中含量低但在细胞-细胞粘附部位含量丰富(Zantek等,.Cell Growth&Differetiation.10:629,1999;Londberg等.,Molecular&Cellular Biology.10:6316,1990)。其亚细胞定位很重要,因为EphA2结合的配体(称为EphrinsA1-A5)锚定在细胞膜上(Eph Nomenclature Committee,1997,Cell.90:403;Gale等.,1997,Cell&Tissue Research.290:227)。配体结合的主要结果是EphA2自身磷酸化(Lindberg等,1990,同上)。然而,与其它受体酪氨酸激酶不同,EphA2在缺少配体结合或磷酸酪氨酸成分时仍能保持酶活性(Zantek等,1999,同上)。大多数侵袭性癌细胞上的EphA2表达上调。
癌症治疗
发展抗转移试剂的一个障碍是用于设计和评估这些药物的分析系统。大多数常规癌症治疗是以快速生长的细胞为靶。然而,癌细胞并不一定必需地快速生长,而是可以在不允许正常细胞存活的条件下存活或生长(Lawrence和Steeg,1996,World J.Urol.14:124-130)。正常细胞与恶性细胞行为上的这些基本差异为治疗靶提供了机会。扩散到全身的微转移肿瘤的实例强调了在外部和三维微环境中需要评估可能的化学治疗药物。在常用细胞培养条件下可用多种标准癌药物分析法来测量肿瘤细胞的生长或存活(即单层生长)。然而,细胞行为在二维分析中通常不能可靠地预测体内的肿瘤细胞行为。
如今,癌症治疗可以包括外科治疗、化学治疗、激素治疗和/或放射治疗,以根除患者的肿瘤细胞(参见,例如,Stockdale,1998,″Principles of CancerPatient Management″,Scientific American Medicine,卷3,Rubenstein和Federman,第12章,第IV部分)。近来,癌症治疗也可以包括生物治疗或免疫治疗。所有这些方法对患者而言都有明显的缺点。例如,外科治疗可能由于患者的健康情况而不适宜,或者患者不能接受。此外,外科治疗不可能完全除去肿瘤组织。放射治疗只有在新生组织比正常组织表现出更高的放射敏感性时才有效,同时放射治疗还会产生严重的副作用。激素治疗虽然是有效的,但是其很少以单一试剂给予,其经常在使用其它治疗除去大部分癌细胞后,用于预防或延缓癌症复发。生物治疗/免疫治疗受到次数限制,并且每种治疗通常只对极特定类型的癌症有效。
关于化学治疗,有多种化学治疗性试剂可用于治疗癌症。大部分癌症化学治疗是直接抑制DNA合成或间接抑制脱氧(核糖)核苷三磷酸前体的生物合成以预防DNA复制和伴随的细胞分裂(参见,例如,Gilman等人,Goodman和Gilman′s:The Pharmacological Basis of Therapeutics,第八版(Pergamom Press,New York,1990))。这些试剂包括烷基化试剂,如亚硝基脲,抗代谢物,如甲氨蝶呤和羟基脲,及其它试剂,如依托泊苷(etoposide),campathecins,博来霉素,多柔比星,柔红霉素等,尽管它们具有必需的细胞周期特异性,但是由于它们对DNA复制起作用,因此可以在S期杀死细胞。其它试剂,具体而言是秋水仙碱和长春花生物碱,如长春碱和长春新碱,可以干扰微管组装,从而使有丝分裂停滞。化学治疗方法通常包括给予化学治疗性试剂的组合来提高治疗效果。
尽管可以使用多种化学治疗性试剂,但是化学治疗具有很多缺点(参见,例如,Stockdale,1998,″Principles of Cancer Patient Management″,ScientificAmerican Medicine,卷3,Rubenstein和Federman,第12章,第10部分)。几乎所有的化学治疗性试剂都有毒性,而且化学治疗会引发明显的并经常是很危险的副作用,包括严重恶心,骨髓抑制,免疫抑制等。此外,即使给予化学治疗性试剂的组合,很多肿瘤细胞仍对化学治疗性试剂具有抵抗性或会发展成具有抵抗性。事实上,对治疗方法中使用的特定化学治疗性试剂有抵抗性的那些细胞经常被证实对其它药物也有抵抗性,即使那些试剂的作用机理不同于特异性治疗中所用药物的作用机理;这种现象称为多向耐药性或多药耐药性。因此,由于耐药性,多种癌症难于进行标准化学治疗。
这样就明显需要可选择的癌症治疗方法,尤其是用于治疗难于用标准癌症治疗法(如外科治疗,放射治疗,化学治疗,及激素治疗)治疗的癌症的治疗方法。此外,仅通过一种方法来治疗癌症非常少见。因此,需要研发治疗癌症的新治疗性试剂和治疗癌症的新的更有效的治疗组合。
3.发明概述
在许多恶性癌症中,EphA2都过度表达并发生功能变化。EphA2是一种癌蛋白并且能充分赋予癌细胞转移的能力。恶性细胞上EphA2的过度表达表现出其激酶活性不依赖于与配体的结合。本发明人发现EphA2水平降低可导致细胞转移行为减少。具体来说,本发明人惊奇地发现,能激发EphA2,即诱导EphA2信号转导的抗体,确实能降低EphA2的表达和抑制肿瘤细胞的增殖和/或转移。虽然不想受到任何作用机制的束缚,但认为激动性抗体可通过诱导EphA2自身磷酸化,从而导致随后的EphA2降解而下调其表达,从而抑制肿瘤细胞的行为。因此本发明的抗体可促进EphA2的信号转导并增强EphA2的磷酸化(“EphA2激动性抗体”)。
根据亚细胞位置,配体结合属性或蛋白组织(例如,结构,在细胞膜中的方向)的差异可以进一步区分癌细胞上的EphA2和非癌细胞上的EphA2。在非癌细胞中,EphA2以低水平表达并定位在细胞-细胞接触位点,在该处它与其膜锚定配体结合。然而,癌细胞通常表现出较低的细胞间接触,这可以降低EphA2-配体的结合。此外,EphA2的过表达可能使EphA2相对于配体过量,这会提高非配体结合的EphA2的量。因此,改变EphA2的亚细胞分布或膜定向可以使EphA2定位到癌细胞中配体不能接近的位置。此外,在癌细胞中EphA2可以具有变化的配体结合属性(例如,由于变化构型的原因),这使得其不能与其配体稳定地相互作用,而不论其是否被定位到细胞间的连接处。在每种情况下,这些变化都能在癌细胞的EphA2上暴露出在非癌细胞中不会暴露出的某些抗原表位。因此,本发明也提供如下抗体:其可特异性结合EphA2,但优选结合在癌细胞而不是非癌细胞上暴露的EphA2抗原表位(“暴露的EphA2表位抗体”)。使癌细胞暴露于这种EphA2抗体(其优选结合在癌细胞而不是非癌细胞上选择性暴露或增加的EphA2表位)可以使治疗/预防抗体以癌细胞为靶,并具有防止或降低细胞增生的能力,同时不伤害非癌细胞。
本发明提供筛选和鉴定能结合和激发EphA2,和/或优先选择性结合在癌细胞而不是非癌细胞上暴露或数量增加的EphA2表位的抗体,优选是单克隆抗体。具体来说,本发明的抗体能结合EphA2的胞外结构域,优先诱导EphA2信号转导和EphA2自身磷酸化。另一具体实施方案中,本发明的抗体能结合EphA2的胞外结构域和优先结合在癌细胞而不是非癌细胞上暴露的EphA2表位。在一实施方案中,本发明的抗体是EA2、EA3、EA4和EA5。在一优选实施方案中,本发明的抗体是人的、人源化的或嵌合抗体。
在一实施方案中,要鉴定优先结合暴露在癌细胞而不是非癌细胞上的EphA2表位的抗体,可筛选能优先结合未与配体(如EphrinA1)结合的且不位于细胞-细胞接触部位的EphA2的抗体。本领域中用于测定细胞上抗体结合/定位的任何公知方法都可用于筛选具有所需结合属性的候选抗体。在特定实施方案中,免疫荧光显微镜或流式细胞仪被用于测定抗体的结合属性。在此实施方案中,当EphA2与配体结合并定位至细胞-细胞接触处时与EphA2的结合较差而与细胞上的自由EphA2很好结合的抗体也包括在本发明中。在另一个特定实施方案中,使用基于细胞的分析或ELISA分析,来选择具有与配体(例如,细胞锚定的或纯化的配体)竞争结合EphA2能力的EphA2抗体。
在一实施方案中,本发明的抗体是EA2、EA3、EA4和EA5。在更优选的实施方案中,本发明的抗体是人或人源化抗体。在最优选的实施方案中,本发明的抗体是人源化EA2、EA3、EA4或EA5。在一具体实施方案中,本发明的抗体不是EA2或EA5。
因此,本发明涉及用于预防、治疗或控制患者癌症,特别是转移性癌症的药物组合物和预防及治疗方案,该方案包括给予能特异性结合和激发EphA2,和/或能优先选择性结合在癌细胞而不是非癌细胞上暴露或数量增加的EphA2表位的一种或多种抗体。在一实施方案中,所述癌症是上皮细胞来源的癌症。在另一实施方案中,所述癌症是皮肤、肺、结肠、乳腺、前列腺、肾或胰腺癌。在另一实施方案中,被预防、治疗或控制的癌中的癌细胞过度表达EphA2。在优选实施方案中,由于细胞间接触减少、亚细胞水平的定位变化,或EphA2的量相对于配体增加,因而某些EphA2未与配体结合。在优选实施方案中,采用本发明的方法来预防、治疗或控制肿瘤的转移。可将本发明的抗体与一种或多种其它癌症治疗药物联合给予。具体来说,本发明提供了预防、治疗或控制患者中癌症的方法,包括给予所述患者治疗或预防有效量的本发明的一种或多种EphA2抗体,并组合给予EphA2抗体以外的治疗或预防有效量的一种或多种化疗、激素治疗、生物学治疗/免疫治疗和/或放射治疗药物,或与手术组合。
本发明的方法和组合物不仅可用于未治疗的患者,还可以用于治疗部分或完全难以用现有的标准和实验癌症疗法治疗的患者并提高治疗功效,现有的治疗方法包括但不限于化学治疗、激素治疗、生物治疗、放射治疗和/或外科治疗。因此,在优选实施方案中,本发明提供了治疗和预防方法,用于治疗或预防表现出是或可能是用除了给予本发明的EphA2抗体的治疗方法外的其它治疗方法难于治疗或不反应的癌症。在具体实施方案中,向难于治疗的或对非基于EphA2的治疗不反应的患者给予本发明的一种或多种抗体,使该患者可以治疗或产生反应。因此,该治疗对于以前难于治疗或不反应的患者可以产生治疗效果。
此外,本发明提供筛选本发明EphA2抗体的方法。具体来说,可采用常规的免疫学技术来筛选能结合EphA2,特别是EphA2胞外结构域的抗体。在一实施方案中,为鉴定激动性EphA2抗体,可筛选能诱导EphA2信号转导,如增强EphA2的磷酸化和/或降解EphA2的EphA2抗体。
在另一个实施方案中,为识别优选结合在癌细胞而不是非癌细胞上暴露的EphA2表位的抗体,可以筛选具有优选结合EphA2的能力的抗体,该EphA2未与配体(例如,Ephrin A1)结合且不是定位在细胞-细胞接触处。本领域中用于测定细胞上抗体结合/定位的任何公知方法都可用于筛选具有所需结合属性的候选抗体。在特定实施方案中,免疫荧光显微镜或流式细胞仪被用于测定抗体的结合属性。在此实施方案中,当EphA2与配体结合并定位至细胞-细胞接触处时与EphA2的结合较差而与细胞上的自由EphA2很好结合的抗体也包括在本发明中。在另一个特定实施方案中,使用基于细胞的分析或ELISA分析,来选择具有与配体(例如,细胞锚定的或纯化的配体)竞争结合EphA2能力的EphA2抗体。
本发明还提供了使用本发明的EphA2抗体来评估癌症治疗功效的基于EphA2或基于非EphA2的诊断方法。通常,EphA2表达的增加与侵入性和转移性癌的增加有关。因此,用特定治疗使EphA2表达降低表明,该治疗降低了癌侵入和/或转移的可能性。在特定的实施方案中,本发明的诊断方法提供了使用远离原发性肿瘤位点的组织和流体,例如全血、唾液、尿、血清、细针吸出物(即活组织检查)的转移成像和定位方法,以及诊断和预后的方法(及使用原发肿瘤的组织和流体的方法)。在其它实施方案中,本发明的诊断方法提供了体内转移成像和定位方法及诊断和预后的方法。在这些实施方案中,使用本发明的抗体,优选是暴露的EphA2表位抗体检测原发性转移肿瘤。本发明的抗体也可用于冷冻或固定细胞的免疫组织化学分析或组织分析。
在另一个实施方案中,提供了包含本发明的药物组合物或诊断试剂的试剂盒。
3.1定义
术语″激动剂″本文用于指能提高其它分子活性或功能的化合物,包括蛋白质、多肽、肽、抗体、抗体片段、大分子或小分子(小于10kD)。EphA2激动剂可增强EphA2蛋白的磷酸化和降解。能激发EphA2的EphA2抗体可以优选结合或可以不结合在癌细胞而不是在非癌细胞上暴露的EphA2表位。
术语″免疫特异性结合EphA2的抗体及其片段″本文用于指能特异性结合EphA2多肽或EphA2多肽的片段但不能特异性结合其它非EphA2多肽的抗体及其片段。这些抗体或其片段宜免疫特异性结合EphA2多肽或其片段,但与其它抗原无非特异性交叉反应(如在相应的免疫试验中不与非EphA2蛋白如BSA竞争结合)。例如可通过本领域技术人员知道的免疫试验或其它技术来鉴定能免疫特异性结合EphA2多肽的抗体及其片段。本发明的抗体包括但不限于合成抗体、单克隆抗体、重组生成的抗体、内抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、合成抗体、单链Fv(scFv)、Fab片段、F(ab′)片段、二硫化物连接的Fv(sdFv)(包括双特异性sdFvs)、及抗独特型(抗Id)抗体,以及上述任何抗体的表位结合片段。具体来说,本发明的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分,即含有能免疫特异性结合EphA2抗原的抗原结合部位(如抗EphA2抗体的一种或多种互补决定区(CDR))的分子。能免疫特异性结合EphA2多肽或其片段的激动性抗体或片段优选激发EphA2而不明显激发其它活性。
本文中,术语″癌″指涉及到具有转移至远端位置并表现出不同于非癌细胞的表型特性的细胞疾病,该表型特性例如,在三维基板如软琼脂中的集落形成或三维基膜或细胞外基质制剂如MATRIGELTM中的管状网络或网状基质形成。非癌细胞在软琼脂中不形成集落,而在三维基膜或细胞外基质制剂中形成明显的球状结构。虽然有各种机理,但是癌细胞在发展中获得独特的功能能力。这种能力包括回避细胞凋亡、生长信号自足、对抗生长信号不敏感、组织侵入/转移、无限的复制能力及持续的血管生成。术语″癌细胞″包括恶化前的癌细胞和恶性癌细胞。
术语″衍生物″本文用于指包括EphA2多肽、EphA2多肽片段、免疫特异性结合EphA2多肽的抗体或免疫特异性结合EphA2多肽的抗体片段的氨基酸序列的多肽,它们通过氨基酸残基的取代、缺失或添加而改变。在某些实施方案中,抗体衍生物及其片段在一个或多个CDR中具有氨基酸残基的取代、缺失或添加。该抗体衍生物与非衍生抗体相比,可具有基本上相同、更好或较差的结合能力。在具体实施方案中,CDR中有1、2、3、4或5个氨基酸残基被取代、缺失或添加(即突变)。术语″衍生物″本文还用于指EphA2多肽、EphA2多肽片段、免疫特异性结合EphA2多肽的抗体或免疫特异性结合EphA2多肽的抗体片段,它们经过修饰,如通过使其与任何类型的分子共价结合来修饰。例如但不限于:可以通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、用公知的保护/阻挡基团衍生、蛋白断裂、细胞配体或其它蛋白融合等来修饰EphA2多肽、EphA2多肽片段、抗体或抗体片段。可用本领域技术人员已知的技术,包括但不限于:化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等化学修饰方法,来修饰EphA2多肽、EphA2多肽片段、抗体或抗体片段的衍生物。此外,EphA2多肽、EphA2多肽片段、抗体或抗体片段的衍生物可含有一种或多种非经典氨基酸。在一实施方案中,多肽衍生物具有与上述EphA2多肽、EphA2多肽片段、抗体或抗体片段相似或相同的功能。在另一实施方案中,与未改变的多肽相比,EphA2多肽、EphA2多肽片段、抗体或抗体片段的衍生物的活性发生改变。例如,衍生物抗体或其片段可以更紧地结合表位或更耐蛋白水解。
术语″表位″本文用于指在动物,优选哺乳动物,更优选小鼠或人中中的EphA2多肽具有抗原或免疫原活性的一部分。具有免疫原活性的表位是在动物中产生抗体反应的EphA2多肽的一部分。具有抗原活性的表位是可通过本领域公知的方法(例如,通过免疫测定)测定的抗体免疫特异性结合的EphA2多肽的一部分。抗原性表位不一定是免疫原性表位。
本文所述的″片段″包括含有EphA2多肽或免疫特异性结合EphA2多肽的抗体的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸残基,至少10个连续氨基酸残基,至少15个连续氨基酸残基,至少20个连续氨基酸残基,至少25个连续氨基酸残基,至少40个连续氨基酸残基,至少50个连续氨基酸残基,至少60个连续氨基酸残基,至少70个连续氨基酸残基,至少连续80个氨基酸残基,至少连续90个氨基酸残基,至少连续100个氨基酸残基,至少连续125个氨基酸残基,至少150个连续氨基酸残基,至少连续175个氨基酸残基,至少连续200个氨基酸残基,或至少连续250个氨基酸残基的肽或多肽。优选地,抗体片段是表位结合片段。
术语″人源化抗体″本文用于指非人(例如,鼠类)抗体形式,它们包括来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。对于大部分,人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体),其中该受体的高度可变区域残基被非人物种(供者抗体)的高度可变区域残基代替,该非人物种如小鼠、大鼠、野兔或具有所需特异性、亲合性和能力的非人灵长类。在一些情况下,人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基代替。此外,人源化抗体可以包括在受者抗体或供者抗体未被发现的残基。进行的这些修饰进一步改变抗体的性能。通常,人源化抗体包括基本上所有的至少一个、通常至少两个可变区域,其中所有或基本上所有的高度可变区域与非人免疫球蛋白的那些相应,且所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体可选择地还包括至少一部分免疫球蛋白不变区(Fc),通常是与EphA2多肽免疫特异性结合的人免疫球蛋白的不变区,其通过导入氨基酸残基的取代、缺失或添加(即突变)而发生改变。在一些实施方案中,人源化抗体是衍生物。这种人源化抗体包括在一个或多个非人CDR中取代、缺失或添加的氨基酸残基。与非衍生物人源化抗体相比,人源化抗体衍生物具有基本上相同的结合,更好的结合,或更差的结合。在特定实施方案中,CDR的1个、2个、3个、4个、或5个氨基酸残基被取代、缺失或添加(即突变)。关于人源化抗体的进一步的细节,请参考欧洲专利EP 239,400、EP 592,106及EP519,596;国际公布WO 91/09967和WO 93/17105;美国专利5,225,539、5,530,101、5,565,332、5,585,089、5,766,886及6,407,213;和Padlan,1991,Molecular Immunology 28(4/5):489-498;Studnicka等人,1994,ProteinEngineering7(6):805-814;Roguska等人,1994,PNAS 91:969-973;Tan等人,2002,J.Immunol.169:1119-25;Caldas等人,2000,Protein Eng.13:353-60;Morea等人,2000,Methods 20:267-79;Baca等人,1997,J.Biol.Chem.272:10678-84;Roguska等人,1996,Protein Eng.9:895-904;Couto等人,1995,Cancer Res.55(23 Supp):5973s-5977s;Couto等人,1995,Cancer Res.55:1717-22;Sandhu,1994,Gene 150:409-10;Pedersen等人,1994,J.Mol.Biol.235:959-73;Jones等人,1986,Nature 321:522-525;Reichmann等人,1988,Nature 332:323-329;和Presta,1992,Curr.Op.Struct.Biol 2:593-596。
本文中,术语″高度可变区″指抗体中负责结合抗原的氨基酸残基。高度可变区域包括源于″互补决定区″或″CDR″的氨基酸残基(即轻链可变区域中的残基24-34(L1),50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变区域中的31-35(H1),50-65(H2)和95-102(H3);Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))和/或源于″高度可变环″的那些氨基酸残基(即轻链可变区域中的残基26-32(L1),50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变区域中的26-32(H1),53-55(H2)和96-101(H3);Chotbia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-917)。EA2和EA5的CDR残基列于表1中。″框架区″或″FR″残基是除了所定义的高度可变区域残基之外的那些可变区域残基。
本文中,术语″组合″指使用多于一种的预防和/或治疗性试剂。使用术语″组合″并不限制将预防和/或治疗性试剂给予患有高增生性细胞病症(尤其是癌症)的个体的顺序。在将第二种预防或治疗性试剂给予患有或易患高增生性细胞病症(尤其是癌症)的个体之前(例如,1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周前)、同时、或在此之后(例如、1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周后),可以给予第一种预防或治疗性试剂。预防或治疗性试剂以一定顺序和时间间隔给予个体,使得本发明的试剂可以与其它试剂一起发挥作用,从而比以其它方式给予提供更大的益处。任何额外的预防或治疗性试剂可以与其它额外的预防或治疗性试剂以任何顺序给予。
本文中,术语″低耐受性″指一种状态,在该状态下患者出现治疗副作用,从而使患者不适于治疗和/或不能继续治疗,因为副作用的不利影响和/或危害超过治疗效果。
本文中,术语″控制″指个体从预防或治疗性试剂的给药中得到有益效果,但该有益效果不会使疾病治愈。在某些实施方案中,个体被给予一种或多种预防或治疗性试剂以″控制″疾病,从而预防疾病的进展或恶化。
本文中,术语″不反应/难于治疗″用于描述用一种或多种现有的治疗方法(例如癌症治疗方法),如化学治疗、放射治疗、外科治疗、激素治疗和/或生物治疗/免疫治疗,尤其是对特定癌症的标准治疗方案治疗的患者,所述治疗方法在临床上不足以治愈患者,例如,保持对治疗不敏感,因而这些患者需要额外的有效治疗。此术语也可用于描述对治疗有反应,但产生副作用、复发、产生抵抗性等的患者。在各种实施方案中,“不反应/难于治疗”意思是指至少有一些明显部分的癌细胞未被杀死,或它们的细胞分裂未得到抑制。通常本领域公知的用于分析癌细胞治疗有效性的任何方法,可以用来在体内或体处对癌细胞是否是“不反应/难于治疗”进行测定,在本文中使用本领域已接受的″难于治疗″的含义。在各种实施方案中,如果癌细胞数量没有明显降低,或都在治疗中有所增加,那么癌症为″不反应/难于治疗″的。
本文中,术语″增强″指提高治疗性试剂在通用或核准剂量下的效力。
本文中,术语″预防″指通过给予个体预防或治疗性试剂而防止疾病发作、复发或扩散。
术语″预防性试剂″本文用于指可用于防止EphA2过度表达相关疾病,特别是癌症的发生、复发或扩散的任何试剂。某些实施方案中,术语“预防性试剂”指EphA2的激动性抗体或暴露的EphA2表位抗体(如EA2、EA3、EA4或EA5)。在某些实施方案中,术语“预防性试剂”指癌症的化疗、放射治疗、激素治疗、生物学治疗(如免疫治疗)和/或本发明的EphA2抗体治疗。在其它实施方案中,可组合给予一种以上的预防性试剂。
″预防有效量″本文用于指足以防止癌症复发或扩散的预防性试剂的量。预防有效量可以指预防性试剂的量足以防止患者,包括但不限于易患癌症或以前接触过致癌物质的患者中癌的复发或扩散,或癌的发生。预防有效量也可以指可以在癌症预防中提供预防效果的预防性试剂的量。另外,本发明预防性试剂的预防有效量是指预防性试剂单独的量,或与其它试剂组合的量,它们能够在癌症预防中提供预防效果。关于本发明的EphA2抗体的量,该术语包括可以提高整个预防作用或增强预防效果或与另一种预防性试剂的协同作用的量。
本文中,″方案″包括给药时间和给药方法。
本文中,术语″副作用″包括预防或治疗性试剂的不需要和不利的作用。不利作用总是不想要的,但是不想要的作用不必然是不利的。预防或治疗性试剂的不利作用可能是有害的或令人不舒适的或有危险的。化学治疗的副作用包括但不限于胃肠毒性,如但不限于,早期或晚期痢疾和肠胃气胀、恶心、呕吐、厌食、白血球减少症、贫血症、嗜中性白血球减少症、虚弱、腹痉挛、发烧、疼痛、体重下降、脱水、秃头症、呼吸困难、失眠症、头昏眼花、粘膜病、口腔干燥、及肾衰竭、及便秘、神经和肌肉影响、对肾和膀胱的临时或永久性损害、流感类症状、体液滞留、及临时或永久性不孕。放射治疗的副作用包括但不限于疲劳、口干、及食欲下降。生物治疗/免疫治疗的副作用包括但不限于在给予位置皮疹或肿胀,流感类症状,如发烧,发冷和疲劳,消化道问题和过敏反应。激素治疗的副作用包括但不限于恶心、受精力问题、消沉、食欲下降、眼睛问题、头痛、及体重波动。患者出现的其它不需要作用还有多种并且在本领域中是公知的。许多作用公开于Physicians’Desk Reference(第58版,2002)中。
本文中,术语″单链Fv″和″scFv″指包括抗体的VH和VL区域的抗体片段,其中这些区域存在于单个多肽链中。通常,Fv多肽还含有在VH和VL区域间的多肽连接,其可以使scFv形成抗原结合所需的结构。对于scFv,请参见Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore编.Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。在特定实施方案中,scFv包括双特异性scFv和人源化scFv。
本文中,术语″个体″和″患者″可交换使用。本文中,个体优选是哺乳动物,如非灵长类(例如牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)和灵长类(例如猴子和人),最优选是人。
本文中,术语″治疗″指根除、减少或缓解疾病或病症的症状,尤其是通过给予一种或多种治疗性试剂根除、减少或缓解或控制原发性、区域性或转移性癌组织。在某些实施方案中,这些术语指通过将一种或多种治疗性试剂给予患有这种疾病的个体来最小化或延缓癌症扩散。
本文中,术语″治疗性试剂″指可用于预防、治疗或控制EphA2过度表达相关性疾病,特别是癌症的任何试剂。在某些实施方案中,术语″治疗性试剂″指EphA2激动性抗体或暴露的EphA2表位抗体,如EA2、EA3、EA4或EA5。在某些其它实施方案中,术语″治疗性试剂″指癌症化学治疗、放射治疗、激素治疗、生物治疗/免疫治疗、和/或本发明的EphA2抗体。在其它实施方案中,可以组合给予多种的预防性试剂。
本文中,″治疗有效量″指足以破坏、修饰、控制或去除原发性、局部性或转移性癌组织的治疗性试剂的量。治疗有效量可以指足以延缓或最大程度地减少癌扩散的治疗性试剂的量。治疗有效量可以指在治疗或控制癌症中提供治疗效果的治疗性试剂的量。此外,本发明治疗性试剂的治疗有效量指治疗性试剂单独的量,或与其它治疗组合的量,它们能够在癌症的治疗或控制中提供治疗效果。关于本发明中EphA2抗体的量,该术语包括可以提高整个治疗作用、或降低或避免不想要的效果、或增强治疗效果或与另一种治疗性试剂的协同作用的量。
4.附图说明
图1A-1C:EphA2抗体促进MDA-MB-231细胞的酪氨酸磷酸化和EphA2降解。(A、B)在存在EA5或EA2或对照时37℃培育MDA-MB-231细胞单层8分钟。然后用EphA2特异性抗体免疫沉淀细胞裂解物,用SDS-PAGE溶解,用磷酰酪氨酸特异性抗体作western印染分析(A)。剪下膜条用免疫沉淀中用的EphA2特异性抗体再检测作为负载对照(B)。用抗体培育后EphA2磷酸化水平提高(C)。在存在30μg/ml EA5或EA2或对照时37℃培育MDA-MB-231细胞单层24小时。然后用SDS-PAGE溶解细胞裂解物,用EphA2特异性抗体作westerb印染分析。用抗体培育后EphA2蛋白水平降低。分子量标准品的相对迁移率见左侧各印染条。(A)中标出了抗体的重链(IgH)和轻链(IgL)。
图2A-2D:EphA2抗体促进了A549细胞的酪氨酸磷酸化和EphA2降解。在存在EA5或EA2或对照(PBS)时37℃培育A549细胞单层(A、B)10分钟或(C、D)5小时。然后用EphA2特异性抗体D7免疫沉淀细胞裂解物,用SDS-PAGE溶解,用磷酰酪氨酸特异性抗体作western印染分析(A,C)。剪下膜条用免疫沉淀中所用的EphA2特异性抗体再检测作为负载对照(B、D)。
图3A-3B:EphA2抗体在体外抑制了恶性肿瘤细胞的增殖。在软琼脂中37℃培育纯化的EphA2抗体与恶性或良性肿瘤细胞7天。(A)A549恶性肺癌细胞与10μg/ml或2.5μg/ml EA5或EA2单克隆抗体或对照(PBS)一起培育。所用的各种剂量抗体均抑制了软琼脂中细胞的生长。(B)通过过度表达EphA2(MCF-7EphA2)使良性MCF-7乳腺上皮细胞转化为恶性细胞。将两种肿瘤细胞与EA5单克隆抗体或对照(PBS)一起培育。EA5抑制了MCF-7EphA2细胞在软琼脂中生长的能力。结果报告为每个高倍视野下所观察到的细胞集落数(HPF)。
图4A-4D:EphA2抗体EA5体外抑制肿瘤细胞生长。给无胸腺小鼠同位(A)或皮下(B)植入MDA-MB-231乳腺癌细胞。(C)给无胸腺小鼠皮下植入A549肺癌细胞。当肿瘤生长到平均体积100mm3后腹膜内给予小鼠6mg/kg所示抗体或阴性对照(PBS或1A7抗体),每周两次,持续3周。评估肿瘤生长并表示为肿瘤体积除以最初的肿瘤体积(100mm3)的比率。(D)给无胸腺小鼠皮下植入MDA-MB-231乳腺癌细胞。当肿瘤生长到平均体积100mm3后腹腔内给予小鼠6mg/kg所示抗体或阴性对照,每周二次其三周。处死小鼠测定肿瘤体积。阴性对照为黑色,EA5为白色。
图5A-5B:EphA2过度表达选择性促进恶性细胞生长。(A)将1×105个对照细胞(白条)或MCF-7EphA2细胞(黑条)在存在1mg/ml的17β雌二醇的软琼脂中悬浮培养14天,然后进行显微镜观察评价。EphA2转染细胞形成了更多的集落(47个/高倍视野HPF),而匹配的对照少(1个集落/HPF;P<0.01)。(B)单层生长试验不能区分对照(白圈)与MCF-7EphA2细胞(黑方块)的生长。
图6A-6B:EphA2过度表达促进了肿瘤化能力。(A)将1×106个对照细胞(白圈)或MCF-7EphA2细胞(黑方块)植入无胸腺小鼠(每组20只,n=20)的乳房脂肪垫中并提供雌激素(1mg/ml的17β雌二醇)。MCF-7EphA2细胞形成的肿瘤显著大于匹配对照形成的肿瘤(P=0.027)。(B)用EphA2抗体(D7)作western印染评价分离自植入细胞或切除肿瘤(T)的等量蛋白裂解液。将膜切成条带用β-连环蛋白特异性抗体作为负载对照再检测。
图7A-7C:EphA2过度表达减少了对雌激素的依赖性。(A)用不存在外源性雌激素的软琼脂悬浮培养1×105个对照细胞(白条)或MCF-7EphA2细胞(黑条),14天后显微镜观察评价集落形成。与匹配的对照(白圈)相比,在不存在雌激素时MCF-7EphA2细胞(黑方块)的单层生长(B)和形成肿瘤能力增强(分别是P<0.01和P<0.004)。
图8A-8B:EphA2过度表达降低了对三苯氧胺的敏感性。(A)用存在1μM三苯氧胺(TAM)和/或1μM 17β雌二醇的软琼脂悬浮培养1×105个MCF-7或MCF-7EphA2细胞,14天后显微镜观察评价集落形成。(B)将MCF-7(园圈)或MCF-7EphA2细胞(方块)植入到乳房脂肪垫中(n=15,每组15只小鼠)并提供雌激素。植入后17天开始三苯氧胺治疗。在标出的时间测定三苯氧胺处理(黑圈和方块)和盐水处理(白圈和方块)动物的肿瘤体积。注意到与对照相比,三苯氧胺对MCF-7EphA2的抑制作用较差(P=0.01)。
图9A-9F:雌激素受体在MCF-7EphA2细胞中得到表达,但是功能发生了改变。用EphA2特异性抗体(D7)作western印染分析评估MCF-7EphA2对照细胞和MCF-7EphA2细胞中的(A)ERα和(B)ERβ水平。(C、D)将膜切成条带用β-连环蛋白特异性抗体作为负载对照再检测。(E、F)用CAT报告系统测定雌激素受体活性,显示对照和MCF-7EphA2细胞的雌激素受体活性相当。图(F)显示三次实验得到的平均结果。E2表示雌激素处理;TAM表示三苯氧胺处理,%转化表示CAT酶将非乙酰化底物(非-AC)转变成乙酰化底物(AC)的底物量。
图10A-10C:EphA2激动性抗体EA5降低了恶性细胞的生长。在存在3μg/ml的EA5的条件下培养MCF-7EphA2细胞所示时间,然后抽提将样品,用EphA2特异性抗体(D7)作western印染分析。(B)将膜切成条带用β-连环蛋白特异性抗体作为负载对照再检测。(C)用存在或不存在三苯氧胺(TAM,1Mm)和EphA2激动性抗体(EA5,10μg/ml)的软琼脂悬浮培养1×105个对照细胞或MCF-7EphA2细胞。观察到EA5提高了MCF-7EphA2细胞对三苯氧胺的敏感性。
图11A-11D:EA5和EA2选择性结合恶性细胞。免疫荧光染色显示,抗EphA2单克隆抗体EA5(A、C)和EA2(B、D)与恶性MDA-MB-231乳腺上皮肿瘤细胞的结合(A、B)强于良性乳腺上皮肿瘤细胞(C、D)。
图12:EA5与恶性前列腺癌细胞发生免疫反应。抗EphA2单克隆抗体EA5在福尔马林固定的石蜡包埋的临床标本中鉴定到恶性前列腺癌细胞。
图13A-13D:EphA2 EA5抗体优选结合癌细胞。4℃用10μg/mlEph099B-233.152(A、B)或EA5(C、D)培养非转化的MCF-10A细胞(A、C)或转化的MDA-MB-231细胞(B、D),然后固定并用偶联荧光素的抗小鼠IgG进行免疫标记。
图14A-14D:EphA2 EA5抗体通过减少细胞-细胞接触优选结合暴露的EphA2表位。(A、B)在用EGTA处理前(A)或处理后(B),4℃下用EA5标记非转化的MCF-10A细胞,然后固定并用偶联荧光素的抗小鼠IgG进行免疫标记。(C、D)在用EGTA处理前(中间)或处理后(上图),用EA5标记非转化的MCF-10A细胞(C)或转化的MDA-MB-231细胞(D)。对照细胞仅与次级抗体一起培育(底图)。用流式细胞仪测定EA5-EphA2结合的量。
图15A-15B:EphA2 EA5表位与配体结合位点相区别。(A)将固定的Ephrin A1-Fc与EphA2-Fc一起培育并与之结合。将标记的Ephrin A1-Fc(黑色)或EA5(白色)与EphA2-Ephrin A1-Fc复合物一起培育,测定结合量。(B)将固定的Ephrin A1-Fc与EphA2-Fc一起培育并与之结合。然后将标记的EA5与EphA2-Ephrin A1复合物一起培育。以所示量将未标记的竞争物与EphA2-Ephrin A1-EA5复合物一起培育。竞争物是Ephrin A1-Fc(黑色)或EA5(白色)。
图16:EA2的VL和VH序列。显示了EA2(A)VL(分别为SEQ IDNo:1和9)和(B)VH(分别为SEQ ID No:5和13)的氨基酸和核酸序列。用黑体和下划线表示CDR的序列。
图17:EA5的VL和VH序列。用黑体和下划线表示CDR的序列。(A)显示EA5 VL的氨基酸和核酸序列(分别为SEQ ID NO:17和25)。用根据轻链蛋白质序列的氨基末端设计的简并引物(即第三位碱基虽变动但所有的密码子仍编码相同的对应氨基酸的寡核苷酸)鉴定到含有EA5轻链可变区的多核苷酸序列的三个克隆。鉴定到的这三个克隆含有可变轻链EA5的多核苷酸序列,6位和9位碱基是用粗体字母‘k’命名的鸟嘌呤(G)或酪氨酸(T),15位碱基是用粗体字母命名的G、T或胞嘧啶(C)。(B)显示EA5 VH的氨基酸和核酸序列(分别为SEQ ID NO:21和29)。
5.发明详述
本发明部分地基于发明人的如下发现:EphA2单克隆抗体可抑制癌细胞的表型。降低EphA2的活性能选择性地抑制恶性癌细胞的生长。可用EphA2激动性单克隆抗体来降低EphA2活性。虽然不想受任何作用机理的限制,但通过刺激(即激发)EphA2信号传导以引起EphA2磷酸化而使其降解可实现对癌细胞生长的这种抑制。癌细胞生长降低是由于EphA2水平降低和不依赖于配体的EphA2信号传导。
因此,本发明涉及用来治疗、抑制和控制癌症,特别是转移性癌的方法和组合物。本发明的具体方面涉及含有能抑制癌细胞,特别是过度表达EphA2的那些癌细胞的增殖和入侵的化合物的方法和组合物。本发明还涉及治疗、抑制或控制上皮细胞起源的转移性癌症,特别是人的乳腺、肺、皮肤和前列腺、膀胱、肾与胰腺癌的方法和组合物。本发明的其它组合物和方法包括其它类型的活性成分与本发明的EphA2抗体的组合。
本发明也涉及治疗、抑制和控制用当前或标准的癌症治疗方法,如化疗、放疗、激素治疗和生物学治疗部分或完全地难于治疗的癌症的方法。
本发明还提供了采用本发明的EphA2抗体,特别是暴露的EphA2表位抗体来评估癌症治疗功效的基于EphA2的或非基于EphA2的诊断方法。本发明的诊断方法也可用于预测癌症进程。在特定的实施方案中,本发明的诊断方法提供了使用远离原发性肿瘤位点的组织和流体的转移成像和转移定位的方法及诊断和预后的方法(及使用原发性肿瘤的组织和流体的方法)。在其它实施方案中,本发明的诊断方法提供了转移成像和转移定位的方法及体内诊断和预后的方法。
5.1抗体
如上所述,本发明包括给予抗体(优选是单克隆抗体)或其片段,该抗体或其片断可免疫特异性结合及激发EphA2信号传导(EphA2激动性抗体),和/或可优先结合在癌细胞而不是非癌细胞上选择性暴露或数量增加的EphA2表位(“暴露的EphA2表位抗体”)。在一实施方案中,该抗体能结合EphA2的胞外结构域,优选也能激发EphA2,如增强EphA2的磷酸化。在另一实施方案中,该抗体能结合EphA2的胞外结构域,优选地还结合在癌细胞而不是非癌细胞上选择性暴露或数量增加的EphA2表位。在更优选的实施方案中,该抗体是EA2、EA3、EA4或EA5。另一实施方案中,该抗体能结合EA2、EA3、EA4或EA5所结合的表位,和/或如ELISA检测的那样,能与EA2、EA3、EA4或EA5竞争结合EphA2。其它实施方案中,本发明的抗体能免疫特异性结合及激发EphA2信号传导,和/或优先结合在癌细胞而不是非癌细胞上选择性暴露或数量增加的EphA2表位,能或不能与EphA2的配体如Ephrin A1竞争结合。
产生本发明的抗体EA2(品系EA2.31)和EA5(品系EA5.12)的杂交瘤已按专利微生物保存的国际布达佩斯条约于2002年5月22日保存在美国典型培养物收集中心(ATCC,PO,Box,1549,Manassas,VA 20108),其登记号分别为PTA-4380和PTA-4381,本文作为参考。EA2和EA5抗体的VL和VH区的氨基酸序列分别见图16A-16B和图17A-17B。表1列出了EA2和EA5 CDR序列。在最优选实施方案中,该抗体是人或人源化抗体。
本发明的方法所用的抗体包括但不限于:单克隆抗体、合成的抗体、多重特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFv)(包括双特异性scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab’)片段、二硫键连接的Fv(sdFv)和上述任一抗体的表位结合片段。具体来说,本发明方法所用的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分,即含有能特异性结合EphA2的抗原结合位点的分子,其是EphA2的激动剂和/或优先结合在癌细胞而不是非癌细胞上暴露的EphA2表位。本发明的免疫球蛋白分子可以是任何类(如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY),型(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或免疫球蛋白分子的亚类。
本发明的方法所用的抗体可源于任何动物,包括鸟和哺乳类动物(例如,人类、鼠科、驴、羊、兔、山羊、豚鼠、猪、骆驼、马或鸡)。优选地,该抗体为人或人源化单克隆抗体。在本文中,″人″抗体包括具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗体,还包括从人免疫球蛋白库或表达人基因抗体的小鼠或其它动物分离出的抗体。
本发明方法所用的抗体可具有单特异性、双特异性、三特异性或多特异性。多特异性抗体可免疫特异性结合EphA2多肽的不同表位,或免疫特异性结合EphA2多肽及异种表位,如异种多肽或固体载体材料。参见,例如,国际公开WO 93/17715、WO 92/08802、WO 91/00360及WO 92/05793;Tutt等人,1991,J.Immunoll.147:60-69;美国专利4,474,893,4,714,681,4,925,648,5,573,920及5,601,819;和Kostelny等人,1992,J.Immunoll.148:1547-1553。
在特定实施方案中,本发明的方法所用的抗体是EA2、EA3、EA4或EA5,或其抗原结合片段(如上述本发明抗体的一个或多个互补决定区(CDR),见表1)。在另一实施方案中,本发明的方法所用的激动性抗体能结合与EA2、EA3、EA4或EA5之一相同的表位,或在ELISA检测等中能与EA2、EA3、EA4或EA5竞争结合EphA2。
本发明还包括免疫特异性结合EphA2并激发EphA2,和/或优先结合在癌细胞上暴露的EphA2表位的抗体或其片段,所述抗体包含的VH CDR具有EA2、EA3、EA4或EA5的VH CDR之一的氨基酸序列。本发明还包括免疫特异性结合EphA2并激发EphA2,和/或优先结合在癌细胞上暴露的EphA2表位的抗体的用途,所述抗体包含的VH CDR具有EA2、EA3、EA4或EA5的VH CDR之一的氨基酸序列。本发明还包括免疫特异性结合EphA2并激发EphA2,和/或优先结合在癌细胞上暴露的EphA2表位的抗体的用途,所述抗体包含有EA2、EA3、EA4或EA5的一个或多个VH CDR和一个或多个VL CDR。具体来说,本发明包括免疫特异性结合EphA2并激发EphA2,和/或优先结合在癌细胞上暴露的EphA2表位的抗体的用途,所述抗体包含EA2、EA3、EA4或EA5的VH CDR和VL CDR的VH CDR1和VL CDR1;VH CDR1和VL CDR2;VH CDR1和VL CDR3;VH CDR2和VL CDR1;VH CDR2和VL CDR2;VH CDR2和VL CDR3;VH CDR3和VL CDR1;VH CDR3和VL CDR2;VH CDR3和VL CDR3;VH1 CDR1,VHCDR2和VL CDR1;VH CDR1,VH CDR2和VL CDR2;VH CDR1,VH CDR2和VL CDR3;VH CDR2,VH CDR3和VL CDR1;VH CDR2,VH CDR3和VL CDR2;VH CDR2,VH CDR3和VL CDR3;VH CDR1,VH CDR3和VLCDR1;VH CDR1,VH CDR3和VL CDR2;VH CDR1,VH CDR3和VL CDR3;VH CDR1,VL CDR1和VL CDR2;VH CDR1,VL CDR1和VL CDR3;VHCDR1,VL CDR2和VL CDR3;VH CDR2,VL CDR1和VL CDR2;VHCDR2,VL CDR1和VL CDR3;VH CDR2,VL CDR2和VLCDR3;VHCDR3,VL CDR1和VL CDR2;VH CDR3,VL CDR1和VL CDR3;VHCDR3,VL CDR2和VL CDR3;VH CDR1,VH CDR2,VH CDR3和VL CDR1;VH CDR1,VH CDR2,VH CDR3和VL CDR2;VH CDR1,VH CDR2,VH CDR3和VL CDR3;VH CDR1,VL CDR1,VL CDR2和VL CDR3;VH CDR2,VLCDR1,VL CDR2和VL CDR3;VH CDR3,VL CDR1,VL CDR2和VL CDR3;VH CDR1,VH CDR2,VL CDR1和VL CDR2;VH CDR1,VH CDR2,VL CDR1和VL CDR3;VH CDR1,VH CDR2,VL CDR2和VL CDR3;VH CDR1,VHCDR3,VL CDR1和VL CDR2;VH CDR1,VH CDR3,VL CDR1和VL CDR3;VH CDR1,VH CDR3,VL CDR2和VL CDR3;VH CDR2,VH CDR3,VL CDR1和VL CDR2;VH CDR2,VH CDR3,VL CDR1和VL CDR3;VH CDR2,VHCDR3,VL CDR2和VL CDR3;VH CDR1,VH CDR2,VH CDR3,VL CDR1和VL CDR2;VH CDR1,VH CDR2,VH CDR3,VL CDR1和VL CDR3;VHCDR1,VH CDR2,VL CDR3,VL CDR2和VL CDR3;VH CDR1,VH CDR2,VLCDR1,VL CDR2和VL CDR3;VH CDR1,VH CDR3,VL CDR1,VL CDR2和VL CDR3;VH CDR2,VH CDR3,VL CDR1,VL CDR2和VL CDR3;VHCDR1,VH CDR2,VH CDR3,VL CDR1,VL CDR2和VL CDR3;或它们的任何组合。在具体实施方案中,VH CDR1是SEQ ID NO:6;VH CDR2是SEQ ID NO:7;VH CDR3是SEQ ID NO:8;VL CDR1是SEQ ID NO:2;VL CDR2是SEQ ID NO:3;VL CDR3是SEQ ID NO:4。在其它具体实施方案中,VH CDR1是SEQ ID NO:22;VH CDR2是SEQ ID NO:23;VH CDR3是SEQ ID NO:24;VL CDR1是SEQ ID NO:18;VL CDR2是SEQ ID NO:19;VL CDR3是SEQ ID NO:20(见表1)。本发明还包括含有1、2、3、4或5个氨基酸的取代、添加或缺失的结合EphA2的任何上述序列。
在一实施方案中,免疫特异性结合EphA2并激发EphA2,和/或优先结合在癌细胞上暴露的EphA2表位的抗体包含具有SEQ ID NO:6氨基酸序列的VH CDR1和具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的VL CDR1。在另一实施方案中,免疫特异性结合EphA2并激发EphA2,和/或优先结合在癌细胞上暴露的EphA2表位的抗体包含具有SEQ ID NO:6氨基酸序列的VHCDR1和具有SEQ ID NO:3氨基酸序列的VL CDR2。在另一实施方案中,免疫特异性结合EphA2并激发EphA2,和/或优先结合在癌细胞上暴露的EphA2表位的抗体包含具有SEQ ID NO:6氨基酸序列的VH CDR1和具有SEQ ID NO:4氨基酸序列的VL CDR3。
在另一实施方案中,免疫特异性结合EphA2并激发EphA2,和/或优先结合在癌细胞上暴露的EphA2表位的抗体包含具有SEQ ID NO:22氨基酸序列的VH CDR1和具有SEQ ID NO:18氨基酸序列的VL CDR1。在另一实施方案中,免疫特异性结合EphA2并激发EphA2,和/或优先结合在癌细胞上暴露的EphA2表位的抗体包含具有SEQ ID NO:22氨基酸序列的VHCDR1和具有SEQ ID NO:19氨基酸序列的VL CDR2。在另一实施方案中,免疫特异性结合EphA2并激发EphA2,和/或优先结合在癌细胞上暴露的EphA2表位的抗体包含具有SEQ ID NO:22氨基酸序列的VH CDR1和具有SEQ ID NO:20氨基酸序列的VL CDR3。
在另一实施方案中,免疫特异性结合EphA2并激发EphA2,和/或优先结合在癌细胞上暴露的EphA2表位的抗体包含具有SEQ ID NO:7氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的VL CDR1。在另一实施方案中,免疫特异性结合EphA2并激发EphA2,和/或优先结合在癌细胞上暴露的EphA2表位的抗体包含具有SEQ ID NO:7氨基酸序列的VHCDR2和具有SEQ ID NO:3氨基酸序列的VL CDR2。在另一实施方案中,免疫特异性结合EphA2并激发EphA2,和/或优先结合在癌细胞上暴露的EphA2表位的抗体包含具有SEQ ID NO:7氨基酸序列的VHCDR2和具有SEQ ID NO:4氨基酸序列的VL CDR3。
在另一实施方案中,免疫特异性结合EphA2并激发EphA2,和/或优先结合在癌细胞上暴露的EphA2表位的抗体包含具有SEQ ID NO:23氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:18氨基酸序列的VL CDR1。在另一实施方案中,免疫特异性结合EphA2并激发EphA2,和/或优先结合在癌细胞上暴露的EphA2表位的抗体包含具有SEQ ID NO:23氨基酸序列的VHCDR2和具有SEQ ID NO:19氨基酸序列的VL CDR2。在另一实施方案中,免疫特异性结合EphA2并激发EphA2,和/或优先结合在癌细胞上暴露的EphA2表位的抗体包含具有SEQ ID NO:23氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:20氨基酸序列的VL CDR3。
在另一实施方案中,免疫特异性结合EphA2并激发EphA2,和/或优先结合在癌细胞上暴露的EphA2表位的抗体包含具有SEQ ID NO:8氨基酸序列的VH CDR3和具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的VL CDR1。在另一实施方案中,免疫特异性结合EphA2并激发EphA2,和/或优先结合在癌细胞上暴露的EphA2表位的抗体包含具有SEQ ID NO:8氨基酸序列的VHCDR3和具有SEQ ID NO:3氨基酸序列的VL CDR2。在另一实施方案中,免疫特异性结合EphA2并激发EphA2,和/或优先结合在癌细胞上暴露的EphA2表位的抗体包含具有SEQ ID NO:8氨基酸序列的VH CDR3和具有SEQ ID NO:4氨基酸序列的VL CDR3。
在另一实施方案中,免疫特异性结合EphA2并激发EphA2,和/或优先结合在癌细胞上暴露的EphA2表位的抗体包含具有SEQ ID NO:24氨基酸序列的VH CDR3和具有SEQ ID NO:18氨基酸序列的VL CDR1。在另一实施方案中,免疫特异性结合EphA2并激发EphA2,和/或优先结合在癌细胞上暴露的EphA2表位的抗体包含具有SEQ ID NO:24氨基酸序列的VHCDR3和具有SEQ ID NO:19氨基酸序列的VL CDR2。在另一实施方案中,免疫特异性结合EphA2并激发EphA2,和/或优先结合在癌细胞上暴露的EphA2表位的抗体包含具有SEQ ID NO:24氨基酸序列的VH CDR3和具有SEQ ID NO:20氨基酸序列的VL CDR3。
本发明方法所用的抗体包括经修饰的衍生物,即通过使任何类型的分子与抗体共价连接来修饰的衍生物。例如但不限于,所述的抗体衍生物包括修饰的抗体,例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、用公知的保护/阻挡基团衍生、蛋白裂解、细胞配体或其它蛋白融合等来修饰抗体。众多化学修饰可用已知的技术进行,包括但不限于,特定化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外,该衍生物可含有一种或多种非典型氨基酸。
本发明还提供了本发明的抗体或含有本领域技术人员公知的框架区的其片段。在一具体实施方案中,本发明的抗体或其片段含有人的框架区。本发明的抗体或其片段优选是人的或人源化的。在一具体实施方案中,本发明的抗体或其片段含有EA2、EA3、EA4或EA5之一(或任何其它EphA2激动性抗体,或能优先结合在癌细胞而不是非癌细胞上暴露的EphA2表位的抗体)的一个或多个CDR。它们能结合EphA2和优选地激发EphA2,和/或优先结合在癌细胞而不是非癌细胞上暴露的EphA2表位。
本发明包括单结构域抗体,包括骆驼化(camelized)的单结构域抗体(见例如Muyldermans等.,2001,Trend Biochem Sci.26:230;Nuttall等.,2000,Cur Pham Biotech.1:253;Reichmann和Muyldermans,1999,JImmunol Meth.231:25;国际专利WO 94/04678;WO 94/25591;美国专利No.6,005,079;它们的内容纳入本文作参考)。在一实施方案中,本发明提供的单结构域抗体包含有二个VH结构域,该VH结构域具有EA2、EA3、EA4或EA5的任一VH结构域(或任何其它EphA2激动性抗体,或能优先结合在癌细胞上但不是在非癌细胞上暴露的EphA2表位的抗体)的氨基酸序列,其经过修饰而形成该单结构域抗体。在本发明的另一实施方案中,本发明提供的单结构域抗体也包含有二个VH结构域,该VH结构域含有EA2、EA3、EA4或EA5的任一VH结构域(或任何其它EphA2激动性抗体,或能优先结合在癌细胞而不是非癌细胞上暴露的EphA2表位的抗体)的一个或多个VHCDR。
本发明的方法还包括使用抗体或其片段,其在哺乳动物(优选人)中的半衰期(例如,血清半衰期)为15天以上,优选是20天以上、25天以上、30天以上、35天以上、40天以上、45天以上、2个月以上、3个月以上、4个月以上或5个月以上。本发明的抗体或片段在哺乳动物(优选人)中半衰期增大,使得所述抗体或抗体片段在哺乳动物中的血清滴度升高,从而降低了给予所述抗体或抗体片段的频率和/或降低了给予的所述抗体或抗体片段的浓度。可通过本领域所属技术人员所公知的技术提高抗体或其片段的体内半衰期。例如,通过修饰(例如取代、缺失或添加)参与Fc区域与FcRn受体间的相互反应的氨基酸残基,可以提高抗体或其片段的体内半衰期(参见,例如,国际公开WO 97/34631和WO 02/060919,这里引用其全部内容作为参考)。通过使所述抗体或抗体片段与聚合物分子,如高分子量的聚乙二醇(PEG)连接,可以提高抗体或其片段的体内半衰期。PEG可与所述抗体或抗体片段连接,使用或不使用多功能连接子,或者通过PEG与所述抗体或抗体片段的N-或C-端的位点特异性结合,或通过赖氨酸残基上的ε-氨基。可以使用使生物活性损失最小的线性或带分支的聚合体衍生物。通过SDS-PAGE和质谱密切监测结合的程度,来确保PEG分子与抗体的适当结合。未反应的PEG可通过例如尺寸排除法或离子交换色谱而与抗体-PEG偶联物分离。
本发明还包括抗体或其片段的用途,该抗体或其片段在框架或可变区中含有带突变(一个或多个氨基酸取代)的EA2、EA3、EA4或EA5的一个或二个可变区的氨基酸序列。这些抗体中的突变优选能维持或提高该抗体与其免疫特异性结合的特定抗原的亲合力和/或亲和力。可采用本领域技术人员已知的标准技术来测定抗体对特定抗原的亲和力。
本领域所属技术人员所知的标准技术可用于诱导编码抗体或其片段的核苷酸序列发生突变,包括例如,定点突变和PCR介导的突变,从而使氨基酸取代。优选地,相对于原抗体或其片段而言,该衍生物包括小于15个氨基酸的取代、小于10个氨基酸的取代、小于5个氨基酸的取代、小于4个氨基酸的取代、小于3个氨基酸的取代、或小于2个氨基酸的取代。在优选实施方案中,该衍生物含有保守氨基酸取代,该取代发生在一个或多个预计的非必须氨基酸残基处。
本发明还包括能免疫特异性结合EphA2并激发EphA2,和/或优先结合在癌细胞上暴露的EphA2表位的抗体或及片段,所述抗体或其片段含有的轻链可变区和/或重链可变区的氨基酸序列与EA2、EA3、EA4或EA5的轻链可变区和/或重链可变区的氨基酸序列具有至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%的一致性。在某些实施方案中,本发明的免疫特异性结合EphA2的抗体或其片段含有的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID No:17具有至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%的一致性。在其它实施方案中,本发明的免疫特异性结合EphA2的抗体或其片段含有的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:5或SEQ ID No:21具有至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%的一致性。在其它实施方案中,本发明能免疫特异性结合EphA2的抗体或其片段含有的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID No:17具有至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%的一致性,重链可变区的氨基酸序列与SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:21具有至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%的一致性。
本发明还包括免疫特异性结合EphA2并激发EphA2,和/或优先结合在癌细胞上暴露的EphA2表位的抗体或其片段,所述抗体或抗体片段包含的一个或多个CDR的氨基酸序列与EA2、EA3、EA4或EA5的一个或多个CDR的氨基酸序列至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%相同。在一实施方案中,本发明的免疫特异性结合EphA2的抗体或其片段含有的CDR的氨基酸序列与SEQ ID NO:1、2、3、4、18、19或20至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%相同。在另一实施方案中,本发明的免疫特异性结合EphA2的抗体或其片段含有的CDR的氨基酸序列与SEQ ID NO:6、7、8、22、23或24至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%相同。
可用本领域技术人员已知的方法,包括但不限于BLAST蛋白检索法,来测定两个氨基酸序列的相同百分比。
本发明还包括能免疫特异性结合EphA2并激发EphA2,和/或优先结合在癌细胞上暴露的EphA2表位的抗体或其片段,所述抗体或其片段包含的一个或多个CDR的氨基酸序列与SEQ ID NO:2、3、4、6、7、8、18、19、20、22、23或24相比,含有氨基酸残基取代、缺失或添加。含有氨基酸残基取代、缺失或添加的一个或多个CDR的该抗体,与不含有氨基酸残基取代、缺失或添加的一个或多个CDR的抗体相比,可具有基本上相同的、更好的或较差的结合能力。在具体实施方案中,CDR的1、2、3、4或5个氨基酸残基被取代、缺失或添加(即突变)。
本发明还包括免疫特异性结合EphA2并激发EphA2,和/或优先结合在癌细胞而不是非癌细胞上选择性暴露或数量增加的EphA2表位的抗体或其片段的用途,其中,所述抗体或其片段由能在严谨条件下与EA2、EA3、EA4或EA5的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码。在一实施方案中,本发明提供了免疫特异性结合EphA2并激发EphA2,和/或优先结合在癌细胞而不是非癌细胞上选择性暴露或数量增加的EphA2表位的抗体或其片段,所述抗体或其片段含有能在严谨条件下与EA2、EA3、EA4或EA5轻链可变区的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码的轻链可变区。在一优选的实施方案中,本发明提供了免疫特异性结合EphA2的抗体或其片段,该抗体或片断含有能在严谨条件下与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:25的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码的轻链可变区。在另一实施方案中,本发明提供了免疫特异性结合EphA2并激发EphA2,和/或优先结合在癌细胞而不是非癌细胞上选择性暴露或数量增加的EphA2表位的抗体或其片段,所述抗体或其片段含有能在严谨条件下与EA2、EA3、EA4或EA5重链可变区的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码的重链可变区。在一优选的实施方案中,本发明提供了免疫特异性结合EphA2的抗体或其片段,该抗体或其片段含有能在严谨条件下与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:29的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码的重链可变区。在其它实施方案中,本发明的免疫特异性结合EphA2的抗体或其片段含有能在严谨条件下与SEQ ID NO:9或SEQID NO:25的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码的轻链可变区,和能在严谨条件下与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:29的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码的重链可变区。
在另一实施方案中,本发明提供免疫特异性结合EphA2并激发EphA2,和/或优先结合在癌细胞而不是非癌细胞上暴露的EphA2表位的抗体或其片段,所述抗体或其片段含有能在严谨条件下与EA2、EA3、EA4或EA5的一个或多个CDR的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码的一个或多个CDR。在一优选的实施方案中,本发明的免疫特异性结合EphA2的抗体或其片段含有能在严谨条件下与SEQ ID NO:10、11、12、26、27或28的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码的CDR。在另一实施方案中,本发明的免疫特异性结合EphA2的抗体或其片段含有能在严谨条件下与SEQ ID NO:14、15、16、30、31或32的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码的CDR。
严谨杂交条件包括但不限于:在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中约45℃与结合在滤膜上的DNA杂交,然后在50-65℃用0.2×SSC/0.1%SDS洗涤一次或多次,高严谨条件是在6×SSC中约45℃与结合在滤膜上的DNA杂交,约60℃用0.1×SSC/0.2%SDS洗涤一次或多次,其它严谨杂交条件是该领域技术人员已知的(见例如,Ausubel,F M等编,1989 Current Protocols inMolecular Biology,第1卷,Green Publishing Associates,Inc.和Jong Wileyand Sons,Inc.NY,6.3.1-6.3.6和2.10.3页)。
本发明还包括能免疫特异性结合EphA2并激发EphA2,和/或优先结合在癌细胞上暴露的EphA2表位的抗体或其片段,所述抗体或其片段包含的由一个或多个CDR核苷酸序列编码的一个或多个CDR中,与SEQ ID NO:10、11、12、14、15、16、26、27、28、30、31或32相比,含有氨基酸残基的取代、缺失或添加。含有氨基酸残基的取代、缺失或添加的一个或多个CDR的抗体与含有无氨基酸残基的取代、缺失或添加一个或多个CDR的抗体相比,具有基本上相同、更强或较差的结合能力。在一具体实施方案中,所述CDR中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核酸残基被取代、缺失或添加(即突变)。氨基酸的取代可能会或不会改变该突变CDR的氨基酸序列。
表1
抗体 | V链 | CDR | SEQ ID NO:(氨基酸) | SEQ ID NO:(核酸) | ATCC保藏号 |
EA2 | PTA-4380 |
VL | 1 | 9 | |||
VL1 | 2 | 10 | |||
VL2 | 3 | 11 | |||
VL3 | 4 | 12 | |||
VH | 5 | 13 | |||
VH1 | 6 | 14 | |||
VH2 | 7 | 15 | |||
VH3 | 8 | 16 | |||
EA5 | PTA-4381 | ||||
VL | 17 | 25 | |||
VL1 | 18 | 26 | |||
VL2 | 19 | 27 |
VL3 | 20 | 28 | |||
VH | 21 | 29 | |||
VH1 | 22 | 30 | |||
VH2 | 23 | 31 | |||
VH3 | 24 | 32 |
5.1.1抗体偶联物
本发明包括与异源多肽(或其一部分,优选至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100个氨基酸的多肽)重组融合或化学结合(包括其价和非共价结合)成融合蛋白的抗体或其片段的用途。该融合不必是直接的,可通过连接子序列来融合。例如,通过将抗体与对特定靶细胞表面受体具有特异性的抗体偶联,使用该抗体可以体内或体外地将异源多肽靶定到特定细胞型上。使用本领域公知的方法,与异源多肽融合或偶联的抗体可用于体内免疫检测和纯化方法。参考,例如,国际公开WO 93/21232;EP 439,095;Naramura等人,1994年,Immunol.Lett.39:91-99;美国专利5,474,981;Gillies等人,1992年,PNAS 89:1428-1432;和Fell等人,1991年,J.Immunol.146:2446-2452,在此引用其全部内容作为参考。在一些实施方案中,待检测、治疗、控制或监控的病征是过度表达EphA2的恶性癌。在其它实施方案中,待检测、治疗、控制或监控的病征是过度表达EphA2的恶化前的癌。在特定实施方案中,恶化前的癌是高级前列腺上皮内肿瘤(PIN)、乳腺纤维腺瘤、纤维囊肿疾病或复合痣。
本发明还包括组合物,该组合物包括与抗体片段融合或偶联的异源多肽。例如,所述异源多肽可以与Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段或它们的一部分融合或偶联。使多肽与抗体部分融合或偶联的方法在本领域是已知的。参见,例如,美国专利5,336,603,5,622,929,5,359,046,5,349,053,5,447,851及5,112,946;EP 307,434;EP 367,166;国际公开WO96/04388和WO 91/06570;Ashkenazi等人,1991年,PNAS 88:10535-10539;Zheng等人,1995年,J.Immunol.154:5590-5600;和Vil等人,1992年,PNAS 89:11337-11341(所述参考文献的内容纳入本文作参考)
通过基因改组、基序改组(motif-shuffling)、外显子改组和/或密码子改组技术(总体称作″DNA改组″)可以产生其它融合蛋白,如EA2、EA3、EA4或EA5之一(或其它能免疫特异性结合在癌细胞而不是非癌细胞上暴露的EphA2表位的EphA2激动性抗体或EphA2抗体)的融合蛋白。可利用DNA改组来改变本发明的抗体及其片段的活性(如具有较高亲和力和较低解离速率的抗体或片段)。通常参考,美国专利5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252、和5,837,458;及Patten等人,1997,Curr.Opinion Biotechnol.8:724-33;Harayama,1998,Trends Biotechnol.16:76;Hansson等人,1999,J.Mol.Biol.287:265;Lorenzo和Blasco,1998,BioTechniques 24:308(在此引入这里每个专利和出版物的全部内容作为参考)。抗体或其片段,或其编码的抗体或其片段可以在重组之前,通过易错PCR、随机核苷酸插入或其它方法进行随机突变来进行改变。编码抗体或抗体片段的,免疫特异性结合EphA2的多核苷酸的一个或多个部分可以与一种或多种异源分子的一种或多种成分、基序、段、部分、区域、片段等重组。
另外,还可以将抗体或其片段与标记序列(如肽)融合以利于其纯化。在优选实施方案中,标记的氨基酸序列是六组氨酸肽,如pQE载体中的标签(QIAGEN,Inc.,9259 Eton Avenue,Chatsworth,CA,91311),其中许多是商业上可提供的。例如,如Gentz等人,1989,PNAS 86:821中所描述的,六组氨酸可以为纯化融合蛋白提供便利。用于纯化的其它肽标签包括但不限于,红血球凝聚素″HA″标签,其相应于源自流感红血球凝聚素蛋白的表位(Wilson等人,1984,Cell 37:767)和″Flag″标签。
在其它实施方案中,将本发明的抗体或其片段或变体与诊断或检测试剂偶联。作为临床检测的一部分,这种抗体可用于监控或预测癌症的发展和进程,如测定特定治疗的功效。此外,这种抗体可用于监控或预测与过度表达EphA2的细胞有关的前癌疾病(如高级前列腺上皮内肿瘤(PIN)、乳腺纤维腺瘤、纤维囊肿疾病或复合痣)发展或进程。在一实施方案中,将暴露的EphA2表位抗体与诊断或检测试剂偶联。在一更具体的实施方案中,所述抗体是EA2。在另一具体实施方案中,所述抗体是EA5。
这种诊断和检测可通过使抗体与可检测物质配合来实现,该可检测物质包括但不限于各种酶,如但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶;辅基,如但不限于链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素;荧光材料,如但不限于,伞形酮,荧光素,荧光素异硫代氰酸酯,若丹明,二氯三嗪基胺荧光素,丹磺酰氯或藻红蛋白;发光材料,如但不限于,发光氨;生物发光材料,如但不限于,荧光素酶,昆虫萤光素,及发光蛋白质;放射性材料,如但不限于,铋(213Bi),碳(14C),铬(51Cr),钴(57Co),氟(18F),钆(153Gd,159Gd),镓(68Ga,67Ga),锗(68Ge),钬(166Ho),铟(115In,113In,112In,111In),碘(131I,125I,123I,121I),镧(140La),镥(177Lu),锰(54Mn),钼(99Mo),钯(103Pd),磷(32P),镨(142Pr),钷(149Pm),铼(186Re,188Re),铑(105Rh),钌(97Ru),钐(153Sm),钪(47Sc),硒(75Se),锶(85Sr),硫(35S),锝(99Tc),铊(201Ti),锡(113Sn,117Sn),氚(3H),氙(133Xe),镱(169Yb,175Yb),钇(90Y),锌(65Zn);使用各种正子断层造影的正电子发射金属,以及非放射性的顺磁金属离子。
本发明还包括与治疗性试剂偶联的抗体或其片段的用途。
可以将抗体或其片段与治疗性部分偶联,如细胞毒素,例如,抑制细胞生长或杀死细胞的试剂,治疗性试剂或放射性金属离子,例如,α-发射体。细胞毒素或细胞毒性试剂包括对细胞有害的任何试剂。例子包括紫杉醇(paclitaxel),细胞松弛素B,短杆菌肽D,溴乙非啶,依米丁,丝裂霉素,依托泊苷,鬼臼噻吩甙,长春新碱,长春碱,秋水仙碱,多柔比星,柔红霉素,二羟基炭疽菌素二酮,米托蒽醌,光神霉素,放射菌素D,1-去氢睾酮,糖皮质激素,普鲁卡因,丁卡因,利多卡因,心得安,嘌呤霉素,表柔比星,及环磷酰胺和其类似物或同系物。治疗性试剂包括但不限于,抗代谢物(例如甲氨蝶呤,6-巯嘌呤,6-硫鸟嘌呤,阿糖胞苷,5-氟尿嘧啶脱焦炭),烷化试剂(例如氮芥,thioepa,苯丁酸氮芥,苯丙酸氮芥,双氯乙基亚硝脲(BCNU)和洛莫司汀(CCNU),环硫代磷酰胺,白消安,二溴甘露醇,链脲霉素,丝裂霉素C,及顺式二氯二氨铂(II)(DDP)顺铂),蒽环霉素(例如,柔红霉素(前柔红霉素)和多柔比星),抗生素(例如,放线菌素D(前放射菌素),博来霉素,光神霉素及安曲霉素(AMC)),及抗有丝分裂试剂(例如长春新碱和长春碱)。
另外,可将抗体或其片段与能修饰给定生物学反应的治疗性试剂或药物部分偶联。不应将治疗性试剂或药物部分理解为仅限于典型的化学治疗性试剂。例如,所述药物部分可以是具有所需生物学活性的蛋白质或多肽。这类蛋白质包括例如:毒素如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞杆菌外毒素、霍乱毒素、或白喉毒素;蛋白质如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板生长因子、组织纤溶酶原激活剂、凋亡试剂如TNT-α、TNF-β、AIM I(见国际公开WO 97/33899)、AIM II(见国际公开WO 97/34911)、Fas配体(见国际公开专利WO 99/23105);溶血栓试剂或抗新生血管试剂,如血管生长抑素或内皮生长抑素;或生物应答修饰剂如淋巴因子(如白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)和粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)、或生长因子(如生长激素(“GH”)。
另外,可将抗体与用于偶联放射金属离子的治疗性部分如放射活性物质或大环螯合剂偶联(参见以上放射活性物质的例子)。在某些实施方案中,所述大环螯合剂是1,4,7,10-四氮杂环十二烷基-N,N’,N”,N”-四乙酸(DOTA),其可通过接头分子与抗体连接。这类接头分子是本领域常见的,见Denardo等.,1998,Clin Cancer Res.4:2483-90;Peterson等.,1999,BioconjugChem.10:553;和Zimmerman等.,1999,Nucl Med Biol.26:943-50,其各自内容纳入本文作参考。
在一具体实施方案中,所述偶联的抗体是能优先结合在癌细胞而不是非癌细胞上暴露的EphA2表位的EphA2抗体(即暴露的EphA2表位抗体)。在更具体的实施方案中,所述偶联的抗体是EA2。在另一具体实施方案中,所述偶联的抗体是EA5。
将治疗性部分与抗体偶联的技术是公知的。可用已知方法,包括但不限于醛/希弗氏碱连接键、酸不稳定连接键、顺式乌头酸连接键、肼连接键、酶可降解连接键来将许多部分偶联到抗体上(见综述Garnett,2002,AdvDrug Deliv Rev.53:171-216)。将治疗性部分与抗体偶联的其它技术是公知的,见例如,Armon等“Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs inCancer Therapy”,in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Reisfeld等编,243-56页(Alan R,Liss,Inc 1985);Hellstrom等,“Antibodies for DrugDelivery”,in Controlled Drug Delivery(第二版),Robinson等编,625-53页(Marcel Dekker,Inc.1987);Thorpe,“Antibody Carriers of Cytotoxic Agentsin Cancer Therapy:A Review,”in Monoclonal Antibody 84:Biological andClinical Applications,Pinchera等编,475-506页(1985);“Analysis,Results,and Future Prospective of the Therapeutic use of Radiolabeled Antibody inCancer Therapy”,in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy,Baldwin等编,303-16页(Academic Press 1985)和Thorpe等,1982,ImmunolRev,62:119-58。融合或偶联抗体与多肽部分的方法是本领域公知的。见例如,美国专利5,336,603;5,622,929;5,359,046;5,349,053;5,447,851和5,112,946;EP307,434;EP367,166;国际公开专利WO 96/04388和WO91/06570;Ashkenazi等.,1991,PNAS.88:10535-10539;Zheng等.,1995,JImmunol.154:5590-5600;和Vil等.,1992,PNAS.89:11337-11341。抗体与所述部分的融合不一定是直接融合,也可通过接头序列融合。这类接头分是本领域公知的,见Denardo等.,1998,Clin Cancer Res.4:2483-90;Peterson等.,1999,Bioconjug Chem.10:553;Zimmerman等.,1999,Nucl MedBiol.26:943-50;Garnett,2002,Adv Drug Deliv Rev.53:171-216,其各自内容纳入本文作参考。
可选择地,可将抗体与第二抗体偶联形成如Segal在美国专利4,676,980中所述的抗体异质性偶联物,此专利内容纳入本文作参考。
也可将抗体与固体支持物结合,其在靶抗原的免疫试验或纯化中特别有用。这类固相支持物包括但不限于:玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
5.1.2产生抗体的方法
所述抗体或其片段可用本领域已知的抗体合成方法来合成,具体地,通过化学合成,或优选地通过重组表达技术合成。
可用本领域已知的各种技术来制备单克隆抗体,包括用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或它们的组合。例如,单克隆抗体可用本领域技术人员已知的杂交瘤技术来制备,例如Harlow等.,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988);Hammerling等.,in:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas.563-681(Elsevier,N Y,1981)(所述参考文献内容纳入本文作参考)。术语“单克隆抗体”在此不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指衍生自一个克隆,包括真核、原核或噬菌体克隆的抗体,不论其用何种方法产生。
用杂交瘤技术产生和筛选特异性抗体的方法是本领域熟知的常规方法。简而言之,用EphA2(全长蛋白或其结构域,如胞外或配体结合结构域)免疫小鼠,一旦在小鼠血清中检测到免疫应答,如EphA2的特异性抗体,即收获该小鼠脾脏,分离脾细胞。然后用熟知的技术将该脾细胞与合适的骨髓瘤细胞,如得自ATCC的SP20细胞系细胞融合。选择杂交瘤,进行有限稀释克隆。用本领域已知的方法测试杂交瘤克隆的细胞是否分泌能结合本发明多肽的抗体。可用杂交瘤阳性克隆免疫小鼠产生含高水平抗体的腹水。
因此,可通过培养分泌本发明的抗体的杂交瘤细胞来产生单克隆抗体,其中,优选地该杂交瘤通过将EpgA2或其片段免疫小鼠中分离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合,然后筛选该融合得到的杂交瘤,从而得到分泌能与EphA2结合的抗体的杂交瘤克隆。
可用本领域技术人员已知的技术来产生能识别特异性EphA2表位的抗体片段。例如,可用酶如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab’)2片段)蛋白水解剪切免疫球蛋白分子,来生产本发明的Fab和F(ab’)2片段。F(ab’)2片段含有可变区、轻链恒定区和重链CH1区。另外,本发明的抗体也可用本领域已知的各种噬菌体展示方法来产生。
在噬菌体展示方法中,抗体的功能性区域展示在噬菌体颗粒表面,该噬菌体颗粒携带有编码这些抗体的多聚核苷酸序列。具体地说,从动物cDNA文库(如人或小鼠淋巴组织的cDNA文库)中扩增编码VH和VL区的DNA序列。通过PCR将scFv接头与编码VH和VL区的DNA重组在一起,并克隆到噬菌粒载体(如pCANTAB6或pComb3 HSS)中。将该载体经电穿孔进大肠杆菌内并用辅助噬菌体感染该大肠杆菌。这些方法中所用的噬菌体通常是丝状噬菌体,包括fd和M13,VH和VL区常与噬菌体基因III或基因VIII重组融合。可用抗原,如标记的抗原,或结合在或被捕获在固相表面或小珠上的抗原,来选择或鉴定表达能结合感兴趣EphA2表位的抗原结合域的噬菌体。可用于制备本发明抗体的噬菌体展示方法的例子见以下文献所述的那些:Brinkman等.,1995,J Immunol Methods.182:41-50;Ames等.,1995,J Immunol Methods.184:177;Kettleborough等.,1994,Eur JImmunol.24:952-58;Persic等.,1997,Gene.187:9;Burton等.,1994,Advancesin Immunology.57:191-280;国际专利申请PCT/GB91/01134;国际公开专利WO 90/02809,WO 91/10737,WO 92/01047,WO 92/18619,WO 93/11236,WO 95/15982,WO 95/20401和WO 97/13844;和美国专利5,698,426;5,223,409;5,403,484;5,580,717;5,427,908;5,750,753;5,821,047;5,571,698;5,427,908;5,516,637;5,780,225;5,658,727;5,733,743和5,969,108,其各自内容纳入本文作参考。
选择能结合EphA2,特别是EphA2胞外结构域的噬菌体。也可筛选能激发EphA2活性(如增强EphA2磷酸化,降低EphA2水平)的抗体。
如以上参考文献所述,挑选出噬菌体后,分离该噬菌体的抗体编码区,用于产生全抗体,包括人抗体或其它所需的抗原结合片段,并在所需宿主中,包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母菌和细菌中表达,见以下所述。也可用本领域已知的方法通过重组技术来产生Fab、Fab’、F(ab’)2片段,见以下文献中所述:国际公开专利WO 92/22324;Mullinax等.,1992,BioTechniques.12:864;Sawai等.,1995,AJRI.34:26和Better等.,1988,Science.240:1041(所述文献内容纳入本文作参考)。
为产生全抗体,可采用含有VH或VL核苷酸序列、限制性位点和保护限制性位点的侧翼序列的PCR引物来扩增scFv克隆中的VH或VL序列。采用本领域技术人员已知的克隆技术,可将PCR扩增的VH区克隆到表达VH恒定区如人γ4恒定区的载体中,和将PCR扩增的VL区克隆到表达VL恒定区如人κ和δ恒定区的载体中。优选地,表达VH或VL区的载体含有EF-1α启动子、分泌信号肽、可变区恒定区的克隆位点和选择性标记如新霉素抗性基因。也可将VH和VL区克隆到一个表达必需恒定区的载体中。然后用本领域技术人员已知的技术,将该重链载体和轻链载体共转染到细胞系中产生可表达全长抗体如IgG的稳定或临时的细胞系。
对于抗体的某些应用,包括在人体内的应用和体外检测试验中的应用,优选采用人或嵌合抗体。完全的人抗体特别适合治疗患者。可用本领域已知的各种方法制备人抗体,包括上述采用人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。也参见美国专利4,444,887和4,716,111;和国际公开专利WO 98/46645;WO 98/50433;WO 98/24893;WO 98/16654;WO 96/34096;WO 96/33735和WO 91/10741,其各自内容纳入本文作参考。
也可用不能表达功能性内源免疫球蛋白,但可表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生人抗体。例如,可随机地或通过同源重组将人的免疫球蛋白的重链和轻链基因复合体导入到小鼠胚胎干细胞中。可选择地,除人的重链和轻链基因外还可将的人免疫球蛋白的可变区、恒定区和多态性区域导入到小鼠胚胎干细胞中。可分别或同时利用同源重组导入的人免疫球蛋白基因座使小鼠免疫球蛋白的重链和轻链基因失去功能。具体来说,JH区的纯合缺失使内源抗体不能产生。扩增经修饰的胚胎干细胞,并将其显微注射到胚泡中产生嵌合小鼠。繁殖该嵌合小鼠产生能表达人抗体的纯合后代。用正常形式的所选抗原,如本发明的整个多肽或其一部分免疫该转基因小鼠。可用常规杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠中获得针对该抗原的单克隆抗体。B细胞分化时转基因小鼠中的人免疫球蛋白转基因经历重排,然后经历类型转换和体细胞突变。因此,采用此技术可产生有治疗作用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。产生人抗体的此技术综述可参见Lonberg和Huszar(1995,Int Rev Immunol.13:65-93)。产生人抗体和人单克隆抗体的此技术及产生这类抗体的程序的详细论述可见例如,国际分开专利WO98/24893;WO 96/34096和WO 96/33735;美国专利5,413,923;5,625,126;5,633,425;5,569,825;5,661,016;5,545,806;5,814,318和5,939,598,它们的内容纳入本文作参考。此外一些公司如Abgenix,Inc.(Fremont,CA)和Medarex(Princeton,NJ)采用与上述类似的技术产生所选抗原的人抗体。
嵌合抗体分子的不同部分衍生自不同的免疫球蛋白分子,如抗体可具有衍生自非人抗体的可变区和人免疫球蛋白的恒定区。产生嵌合抗体的方法本领域是已知的。参见例如,Morrison,1985,Science.229:1202;Oi等.,1986,BioTechniques 4:214;Gillies等.,1989,J Immunol Methods.125:191-202和美国专利6,311,415;5,807,715;4,816,567和4,816,397,其内容纳入本文作参考。含有非人物种的一个或多个CDR和人免疫球蛋白分子框架区的嵌合抗体可用本领域已知的各种方法制备,包括例如,CDR-移植(EP239,400;国际公开专利WO 91/09967;和美国专利5,225,539;5,530,101;5,585,089),镶嵌或重塑(EP592,106;EP519,596;Padlan,1991,Molecular Immunology.28(4/5):489-98;Studnicka等,1994,Protein Engineering.7:805;和Roguska等,1994,PNAS 91:969),和链改组(美国专利5,565,332)。在一实施方案中,本发明免疫特异性结合EphA2的嵌合抗体在人框架区内含有的1、2或3个VL CDR具有EA2、EA3、EA4或EA5之一的氨基酸序列。在一具体实施方案中,本发明免疫特异性结合EphA2的嵌合抗体含有的VLCDR具有SEQ ID NO:2、3、4、18、19或20的氨基酸序列。在另一实施方案中,本发明免疫特异性结合EphA2的嵌合抗体在人框架区内含有的1、2或3个VHCDR具有EA2、EA3、EA4或EA5的VHCDR之一的氨基酸序列。在一具体实施方案中,本发明免疫特异性结合EphA2的嵌合抗体含有的VHCDR具有SEQ ID NO:6、7、8、22、23或24的氨基酸序列。在一优选实施方案中,本发明免疫特异性结合EphA2的嵌合抗体在人框架区内含有的1、2或3个VL CDR具有EA2、EA3、EA4或EA5的VL CDR之一的氨基酸序列,和含有的1、2或3个VH CDR具有EA2、EA3、EA4或EA5的VH CDR之一的氨基酸序列。在一特别优选实施方案中,本发明免疫特异性结合EphA2的嵌合抗体在人框架区内含有的VL CDR具有SEQ ID NO:2、3、4、18、19或20的氨基酸序列,和含有的VH CDR具有SEQ ID NO:6、7、8、22、23或24的氨基酸序列。在一更优选的实施方案中,本发明免疫特异性结合EphA2的嵌合抗体在人框架区内含有的3个VL CDR具有EA2、EA3、EA4或EA5的VL CDR之一的氨基酸序列,和含有的3个VHCDR具有EA2、EA3、EA4或EA5的VH CDR之一的氨基酸序列。在一甚至更优选的实施方案中,本发明免疫特异性结合EphA2的嵌合抗体含有的VL CDR具有选自SEQ ID NO:2、3、4、18、19或20的氨基酸序列,和含有的VH CDR具有选自SEQ ID NO:6、7、8、22、23或24的氨基酸序列。
通常,框架区里的框架残基会被CDR供体抗体相应的残基取代,从而改变了,优选是改进了抗原结合。这些框架取代可用本领域公知的方法来识别,例如,通过模拟CDR与框架残基间的相互作用来鉴别框架残基对抗原结合的重要性来识别,和进行序列比较来识别在特定位置上的不寻常框架残基来识别。(参见,例如,美国专利5,585,089;和Riechmann等人,1988,Nature 332:323,在此引入其全部内容作为参考)。
人源化抗体是抗体或其变体或其片段,其能结合预定抗原,且含有框架区和CDR,该框架区基本上具有人免疫球蛋白的氨基酸序列,CDR基本上具有非人免疫球蛋白的氨基酸序列。人源化抗体基本上包括至少一个、通常是两个可变区域,其中所有或基本上所有的CDR区域与非人免疫球蛋白(即供体抗体)的CDR区域相应,且所有或基本上所有框架区是人免疫球蛋白共有序列的框架区。优选地,人源化抗体还包括至少一部分免疫球蛋白不变区(Fc),通常是人免疫球蛋白的不变区。通常,该抗体包括轻链及至少重链的可变区域。该抗体还包括重链的CH1、铰链区、CH2、CH3及CH4区域。人源化抗体可选自任何种类的免疫球蛋白,包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE,及任何异型,包括IgG、IgG2、IgG3和IgG4。通常地,如果需要人源化抗体表现出细胞毒性,那么该不变区是互补结合的不变区,且是典型的IgG种类。如果不需要这种细胞毒性,那么该不变区可以是IgG2种类。该人源化抗体可包括来源于多种种类或异型的序列,选择特定的不变区以优化所需的效果是本领域技术公知的。人源化抗体的框架区域和CDR区域不需要与双亲序列精确一致,例如,可通过取代、添加或缺失至少一个残基而使供体CDR或共有框架发生突变,从而使在该位点的CDR或构架残基不与共有或产生的抗体相应。然而,这种突变不会很多。通常,至少75%的人源化抗体残基与双亲的框架区(FR)和CDR序列一致,更通常为90%,且最优选的是大于95%。人源化抗体可通过使用本领域所知的各种技术而制得,包括但不限于,CDR接枝(欧洲专利EP 239,400、国际公开WO 91/09967和美国专利5,225,539、5,530,101及5,585,089),镶嵌或重构建(欧洲专利EP 592,106和EP 519,596;Padlan,1991,Molecular Immuology28(4/5):489-498;Studnicka等人,1994,Protein Engineering 7(6):805-814;和Roguska等人,1994,PNAS 91:969-973),链改组(美国专利5,565,332),及下列文献中公开的技术,例如,美国专利6,407,213,5,766,886,5,585,089,国际公开WO 9317105,Tan等人,2002,J.Immunol.169:1119-25,Caldas等人,2000,Protein Eng.13:353-60,Morea等人,2000,Methods 20:267-79,Baca等人,1997,J.Biol.Chem.272:10678-84,Roguska等人,1996,ProteinEng.9:895-904,Couto等人,1995,Cancer Res.55(23 Supp):5973s-5977s,Couto等人,1995,Cancer Res.55:1717-22,Sandhu,1994,Gene 150:409-10,Pedersen等人,1994,J.Mol.Biol.235:959-73,Jones等人,1986,Nature 321:522-525,Riechmann等人,1988,Nature 332:323,及Presta,1992,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596。通常,框架区里的框架残基会被CDR供体抗体的相应残基取代,以改变并优选是改进抗原结合。这些框架取代可用本领域公知的方法来识别,例如,通过模拟CDR与框架残基间的相互作用来鉴别框架残基对抗原结合的重要性来识别,和进行序列比较来识别在特定位置上的不寻常框架残基来识别。(参见,例如,美国专利5,585,089;和Riechmann等人,1988,Nature 332:323,在此引入其全部内容作为参考)。
此外,本领域所属技术人员使用公知的技术可用本发明的抗体来制备抗特异基因型抗体。(参见,例如,Greenspan&Bona,1989,FASEB J.7:437-444;和Nissinoff,1991,J.Immunol.147:2429-2438)。本发明提供了使用多核苷酸的方法,该多核苷酸含有编码本发明的抗体或其片段的核苷酸序列。
5.1.3编码抗体的多聚核苷酸
本发明的方法也包括能在如上文所述的高严谨、中或低严谨杂交条件下与编码本发明抗体的多聚核苷酸杂交的多聚核苷酸。在一具体实施方案中,本发明提供了分离的核酸,其含有编码本发明的抗体(如EA2、EA3、EA4或EA5)的重链可变区或轻链可变区的核苷酸序列。在另一具体实施方案中,本发明提供了分离核酸,其含有编码本发明的人源化或嵌合抗体(如EA2、EA3、EA4或EA5)的重链可变区或轻链可变区的核苷酸序列。
上述多核苷酸可以用本领域所公知的任何方法来获得,且该多核苷酸的核苷酸序列可使用本领域所公知的任何方法来测定。因为抗体的氨基酸序列是已知的,所以编码这些抗体的核苷酸序列可使用本领域所公知的方法测定,即,将已知编码特定氨基酸的核苷酸密码子组装起来从而得到编码本发明抗体或其片段的核酸。这种编码该抗体的多核苷酸可用化学合成的寡核苷酸来组装(例如,Kutmeier等人,1994,BioTechniques 17:242),该组装简而言之,包括合成交叠的寡核苷酸,该寡核苷酸含有该抗体的一部分编码序列;退火并连接这些寡核苷酸;然后用PCR扩增该连接的寡核苷酸。例如但不限于,可采用根据所述轻链蛋白序列的氨基末端设计的简并引物(如第三位碱基虽变动但所有的密码子仍编码相同的对应氨基酸的寡核苷酸)来鉴定含有EA5轻链可变区的多聚核苷酸序列的克隆。在鉴定的含有EA5轻链可变区多聚核苷酸序列的三个克隆中,6位和9位碱基是鸟嘌呤(G)或酪氨酸(T);15位碱基是G、T或胞嘧啶(C)。所有三个克隆编码EA5 VL区的氨基酸序列为SEQ ID NO:17。
可选择地,编码抗体的多核苷酸可由适当来源的核酸产生。如果含有编码特定抗体的核酸的克隆不能从商业上得到,但抗体分子的序列是已知的(参见例如图16),那么编码该免疫球蛋白的核酸可以通过化学合成得到或从适合来源(例如,从任何表达抗体的组织或细胞产生的抗体cDNA库或cDNA库,或从任何表达抗体的组织或细胞分离的核酸,优选是聚A+RNA,该组织或细胞如选择来表达本发明抗体的杂交瘤,如在ATCC保藏为PTA-4380的克隆)得到,其方法是通过使用可与序列的3′端和5′端杂交的合成引物进行PCR扩增,或通过使用对特定基因序列具有特异性的寡核苷酸探针进行克隆,以例如从编码该抗体的cDNA库中识别cDNA克隆。然后,使用本领域公知的任何方法将通过PCR产生的扩增核酸克隆成到可复制的克隆载体中。
一旦上述抗体的核苷酸序列得到确定,那么就使用核苷酸序列操作领域公知的方法,来操作该抗体的核苷酸序列,该方法如,重组DNA技术,定点变异,PCR等。(参见,例如,下面文献中所述的技术,Sambrook等人,1990,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,NY和Ausubel等人,编,1998,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY,在此引入其全部内容作为参考),以产生具有不同氨基酸序列的抗体,例如产生氨基酸取代、缺失和/或添加。
在特定实施方案中,使用常规的重组DNA技术,将一个或多个CDR插入到框架区中。该框架区可以是天然的或共有的框架区,优选是人框架区(关于人框架区列表,参见,例如,Chothia等人,1998,J.Mol.Biol.278:457-479)。优选地,通过组合框架区和CDR产生的多核苷酸编码特异性结合EphA2的抗体。优选地,如上文所述,在框架区内可以有一个或多个氨基酸取代,并且优选地,氨基酸取代提高了抗体与其抗原的结合。此外,这种方法可用于产生一个或多个参与链内二硫键的可变区半胱氨酸残基的氨基酸取代或缺失,从而产生缺少一个或多个链内二硫键的抗体分子。本发明也包括多核苷酸的其它变体,这些变体是本领域公知的。
5.1.4抗体的重组表达
本发明的抗体、衍生物、类似物或其片段(例如,本发明抗体的重链或轻链,或其一部分,或本发明的单链抗体)的重组表达,需要构建含有编码该抗体的多核苷酸的表达载体。一旦得到编码本发明的抗体分子或抗体的重链或轻链或其一部分(优选但不必须包括重链或轻链可变区域)的多核苷酸,使用本领域公知的技术通过重组DNA技术就可制得用于制备该抗体分子的载体。因此,本文中描述了通过表达含有编码抗体的核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白的方法。可以使用本领域所属技术人员公知的方法来构建含有抗体编码序列和合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括,例如,体外重组DNA技术、合成技术及体内基因重组。因此,本发明提供了可复制的载体,其含有编码本发明抗体分子、抗体的重链或轻链、抗体的重链或轻链可变区域或其一部分或重链或轻链CDR,且与启动子操作性连接的核苷酸序列。这种载体可以包括编码抗体分子不变区的核苷酸序列(参见,例如,国际公开WO 86/05807和WO 89/01036和美国专利5,122,464),且该抗体的可变区域可以克隆进这种载体中,以表达全部重链、全部轻链或全部重链和轻链。
可以通过常规技术将表达载体转化到宿主细胞中,然后通过常规技术培养该转化的细胞,以制备本发明的抗体。因此,本发明包括宿主细胞,其含有编码本发明的抗体或其片段,或其重链或轻链,或其一部分,或本发明的单链抗体,并与异源启动子可操作性连接的多核苷酸。在表达双链抗体的优选实施方案中,如下所述,编码重链和轻链的载体可以在宿主细胞中共表达以表达整个免疫球蛋白分子。
可以使用各种宿主表达载体系统来表达本发明的抗体分子(参见,例如,美国专利5,807,715)。代表性的这种宿主表达系统是载体,通过该载体,可制备目的编码序列并随后纯化;和细胞,当用适合的核苷酸编码序列转录或转染时,该细胞原位表达本发明的抗体分子。这些包括但不限于用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物,如细菌(例如,E.coli和B.subtilis);用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如,Saccharomyces pichia);用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如,杆状病毒)感染的昆虫细胞系统;用重组病毒表达载体(例如,花椰菜花叶病毒,CaMV;烟草花叶病毒病毒,TMV)感染的或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如,Ti质粒)转化的植物细胞系统;或含有重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如,COS、CHO、BHK、293、NSO及3T3细胞),它们含有源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如,金属硫蛋白启动子)或源于哺乳动物病毒的启动子(例如,腺病毒晚期启动子;牛痘病毒7.5K启动子)。优选地,用细菌细胞如Escherichia coli,更优选真核细胞,特别是表达整个重组抗体分子的细菌细胞或优选的真核细胞来表达重组抗体分子。例如,结合有载体(如从人细胞巨化病毒中得到的主要中早其基因启动子元件)的哺乳动物细胞(如中国卵巢细胞(CHO))是抗体的有效表达系统(Foecking等人,1986,Gene 45:101;和Cockett等人,1990,BioTechnology 8:2)。在特定实施方案中,通过组成型启动子,诱导型启动子或组织特异性启动子来调节编码抗体或其片段的核苷酸序列的表达,其中该抗体免疫特异性结合并激发EphA2。
在细菌系统中,可以根据待表达的抗体分子的用途来有利地选择表达载体的数量。例如,当制备大量这种蛋白时,为了生产抗体分子的药物组合物,指导高水平表达融合蛋白产物且使该蛋白产物容易纯化的载体是理想的。这种载体包括但不限于E.coli表达载体pUR278(Ruther等人,1983,EMBO 12:1791),其中该抗体编码序列可以分别连接到该载体的带有lac Z编码区域的框架中,从而制得融合蛋白;pIN载体(Inouye&Inouye,1985,Nucleic Acids Res.13:3101-3109;Van Heeke&Schuster,1989,J.Biol.Chem.24:5503-5509)等。pGEX载体也可用于表达外源多肽,如含有谷胱甘肽5-转移酶(GST)的融合蛋白。通常,这种融合蛋白是可溶解的,并易于从溶解的细胞中通过吸附、结合基质谷胱甘肽-琼脂糖珠,然后在游离谷胱甘肽存在下进行洗脱来纯化。该pGEX载体设计成含有凝血酶或因子Xa蛋白酶剪切位点,从而可以从GST部分释放出克隆的目标基因产物。
在昆虫系统中,将Autographa californica核型多角体病毒(AcNPV)用作载体来表达外源基因。病毒在Spodoptera frugiperda细胞中生长。上述抗体的编码序列可以分别克隆到病毒的非必需区域(例如多角体蛋白基因)并置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。
在哺乳动物宿主细胞中,可以使用多个基于病毒的表达系统。在使用腺病毒作为表达载体的情况下,目标抗体编码序列可以连接到腺病毒转录/翻译控制复合物中,例如,连接到晚期启动子和三联体引导序列中。然后可以通过体外或体内重组,将这种嵌合基因插入到腺病毒基因组中。在病毒基因组的非必需区域(例如,区域E1或E3)中插入会产生可繁殖的且能够在感染的宿主中表达抗体分子的重组病毒(例如,参见Logan&Shenk,1984,PNAS 81:355-359)。对于插入的抗体编码序列的有效翻译,可能还需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。此外,该起始密码子必须与所需编码序列的阅读框协调一致,以确保整个插入物得到翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以是各种来源的,包括天然和合成来源的。通过加入适合的转录增强子元件,转录终结子等,可以增强表达效率(参见,例如,Bittner等人,1987,Methods in Enzymol.153:516-544)。
此外,选择宿主细胞株,该细胞株调节嵌入序列的表达,或以特定的理想方式修饰和处理基因产物。蛋白产物的这种修饰(例如,糖基化)和处理(例如,断裂)对于蛋白的功能是重要的。对于蛋白或基因产物的翻译后处理和修饰,不同的宿主细胞具有特征性和特定机制。选择适合的细胞系或宿主系统以确保正确修饰和处理表达的外源蛋白。因此,可以使用具有所述基因产物的初级转录、糖基化及磷酸化合适处理细胞机制的真核宿主细胞。这种哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20、NS1和T47D、NSO(鼠类骨髓瘤细胞系,不会内源产生任何免疫球蛋白链),CRL7030和HsS78Bst细胞。
为了长期高产率地生产重组蛋白,稳定表达是优选的。例如,可以建立稳定地表达抗体分子的细胞系。如果不使用含有病毒复制起点的表达载体,可以使用受合适表达控制元件(例如,启动子、增强子、序列、转录终结子、多聚腺苷酸位点等)控制的DNA和可选择性标记转录宿主细胞。在引入外源DNA后,可以将构建的细胞在富集培养基中生长1-2天,然后转移至选择培养基中。重组质粒中的可选择性标记对选择具有抗性,从而使细胞稳定地与质粒染色体结合,并生长形成集落,该集落随后克隆并扩展成细胞系。这种方法可用于构建表达抗体分子的细胞系。这种构建的细胞系尤其适用于筛选和分析直接或间接与抗体分子相互作用的组合物。
可以使用多种选择系统,包括但不限于,可分别用于tk-,hgprt-或aprt-细胞的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人,1977,Cell 11:223),次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska&Szybalski,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:202),腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等人,1980,Cell 22:8-17)基因。此外,抗代谢物抗性可用作选择下列基因的基础:dhfr,对甲氨蝶呤具有抗性(Wigler等人,1980,PNAS77:357;O′Hare等人,1981,PNAS78:1527);gpt,对麦考酚酸具有抗性(Mulligan&Berg,1981,PNAS 78:2072);neo,对氨基糖苷G-418具有抗性(Wu和Wu,1991,Biotherapy 3:87;Tolstoshev,1993,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573;Mulligan,1993,Science 260:926;和Morgan和Anderson,1993,Ann.Rev.Biochem.62:191;May,1993,TIB TECH 11:155-)和hygro,对潮霉素具有抗性(Santerre等人,1984,Gene 30:147)。重组DNA技术领域中公知的方法通常可用于选择所需的重组克隆,并且这种方法公开于下述文献中,例如,Ausubel等人(编),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY(1993);Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990);第12和13章,Dracopoli等人(eds),CurrentProtocols in Human Genetics,John Wiley&Sons,NY(1994);Colberre-Garapin等人,1981,J.Mol.Biol.150:1,在此引入这些文献的全部内容作为参考。
可通过载体扩增来提高抗体分子的表达水平(参见,Bebbington和Hentschel,The use of vectors based on gene amplification for the expression ofcloned genes in mammalian cells in DNA cloning,Vol.3.(Academic Press,NewYork,1987))。当表达抗体的载体系统中的标记是可扩增的时,提高宿主细胞培养基中存在的抑制剂水平会增大标记基因复制的数量。由于扩增区域与抗体基因相关,因此抗体的产量也增大(Crouse等人,1983,Mol.Cell.Biol.3:257)。
宿主细胞可以用本发明的两个表达载体共转染,第一载体编码重链衍生的多肽,第二载体编码轻链衍生的多肽。这两种载体可以包括相同的可选择性标记,该标记能使重链和轻链多肽同等表达。可选择地,可以使用编码并能够同时表达重链和轻链多肽的单个载体。在这种情况下,轻链应置于重链之前,以避免有毒的自由重链过量(Proudfoot,1986,Nature 322:52;和Kohler,1980,PNAS 77:2197)。重链和轻链的编码序列可以包括cDNA或基因组DNA。
一旦通过重组表达制得本发明的抗体分子,那么就可以通过纯化免疫球蛋白分子领域内公知的任何方法进行纯化,例如,通过色谱法(例如,离子交换、亲和色谱,尤其是蛋白A之后的特异性抗原亲和色谱、及大小筛份(sizing)柱色谱),离心,不同的溶解度纯化或通过纯化蛋白的任何其它标准技术进行纯化。此外,本发明的抗体或其片段可以与本文所述或本领域中公知的其它异种多肽序列融合,以利于纯化。
5.2预防性/治疗方法
本发明包括治疗、预防或控制患者中与EphA2过度表达有关的疾病,优选癌症的方法,该方法包括给予一种或多种EphA2激动性抗体和/或暴露的EphA2表位抗体,优选一种或多种单克隆(从其它单一抗体物种来源得到的抗体)EphA2激动性抗体和/或暴露的EphA2表位抗体。在一具体实施方案中,待治疗、预防或控制的疾病是恶性癌症。在另一具体实施方案中,待治疗、预防或控制的疾病是与细胞过度表达EphA2有关的癌前状态。在更具体的实施方案中,所述癌前状态是高级前列腺内皮癌(PIN)、乳腺纤维腺瘤、纤维囊肿疾病或复合痣。
在一实施方案中,本发明的抗体可以与一种或多种其它用于治疗、预防或控制癌症的治疗试剂组合给予。在某些实施方案中,可将本发明的一种或多种EphA2抗体给予哺乳动物、优选人,同时给予用于癌治疗的一种或多种其它治疗试剂。术语″同时″不限于将预防或治疗性试剂在准确的相同时间给予,还指,将本发明的EphA2抗体和其它试剂按顺序在一定时间间隔内给予至个体,使得本发明的抗体能够与其它试剂一起起作用,从而比以其它方式给药产生更大的优点。例如,每种预防或治疗性试剂可以同时给予,或以任何顺序在不同时间点相继给予;然而,如果没有同时给予,它们应该及时充分地给予,从而提供所需的治疗或预防效果。每种治疗性试剂可以以任何适合的形式并通过任何适合的方案分别给予。在其它实施方案中,本发明的EphA2抗体在外科治疗之前、过程中或之后给予。优选地,外科治疗完全除去局部肿瘤或降低了大肿瘤的尺寸。外科治疗也可以作为预防性措施或用于减轻疼痛。
在优选实施方案中,本发明的一种或多种EphA2抗体是EA2、EA3、EA4或EA5。在更优选实施方案中,所述抗体包括但不限于人源化的EA2、EA3、EA4或EA5。在其它实施方案中,提供含有一个或多个氨基酸取代的,特别是在可变区有氨基酸取代的EA2、EA3、EA4或EA5变体,它们的活性、结合能力与EA2、EA3、EA4或EA5相比有所提高。
在各种实施方案中,预防或治疗性试剂给药的间隔时间小于1小时,为约1小时,为约1小时~约2小时,为约2小时~约3小时,为约3小时~约4小时,为约4小时~约5小时,为约5小时~约6小时,为约6小时~约7小时,为约7小时~约8小时,为约8小时~约9小时,为约9小时~约10小时,为约10小时~约11小时,为约11小时~约12小时,不超过24小时或不超过48小时。在优选实施方案中,在患者同一次访问时给予一种或多种组分。
术语治疗有效的和预防有效的表示了给药的剂量和频率。该剂量和频率通常还根据每个患者的特定因素而变化,这取决于用于给药的特异性治疗性或预防性试剂,癌症的严重程度和类型,给药方案,及患者的年龄、体重、反应和过往病史。本领域所属技术人员可以考虑上述因素并根据例如文献报道和Physcian′s Desk Reference(第56版,2002)中推荐的剂量选择适合的方案。
5.2.1患者群
本发明提供了治疗、预防和控制癌症的方法,包括给予个体治疗或预防有效量的一种或多种本发明EphA2抗体。在另一实施方案中,本发明的EphA2抗体可与一种或多种其它治疗性试剂组合使用。该个体优选为哺乳动物如非灵长动物(如牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)和灵长动物(如猴、如非洲绿猴(cynomolgous monkey)和人)。在优选实施方案中所述个体是人。
本发明方法治疗的特定癌症包括但不限于过度表达EphA2的癌症。在另一个实施方案中,该癌是上皮起源的。这种癌的例子是肺、结肠、前列腺、乳腺及皮肤癌。其它癌举例列出,并不限于部分5.2.1.1。在特定实施方案中,本发明的方法可用于治疗和/或预防原发肿瘤的转移。
本发明的方法和组合物包括将一种或多种本发明的EphA2抗体给予患有或可能患有癌症的个体/患者,例如,对特定型癌症具有易患病的遗传体质,接触过致癌物质或从特定癌症中康复的个体/患者。本文中,″癌″指原发性或转移性癌。这种患者在之前可能进行过或未进行过癌治疗。本发明的方法和组合物可以用作第一线或第二线癌治疗。本发明也包括治疗进行过其它癌治疗的患者,本发明的方法和组合物可在任何不利作用出现之前使用,或在经受这些其它癌症治疗的过程中使用。本发明也包括给予一种或多种本发明的EphA2抗体以治疗或改善难于治疗的患者的症状的方法。在某些实施方案中,难于治疗的癌指,至少癌细胞的一些明显部分未被杀死或它们的细胞分裂未受抑制。对癌细胞是否难于治疗的测定可通过本领域的任何公知方法在体内或体外分析癌细胞的治疗效果来进行,在本文中对″难于治疗″使用本领域可接受的含义。在各种实施方案中,如果癌细胞的数量没有显著降低或有所增加,那么癌症是难于治疗的。本发明也包括给予一种或多种EphA2激动性抗体以预防癌症在易患癌症的患者中开始和复发的方法。单克隆抗体优选为EA2、EA3、EA4或EA5。
在特定实施方案中,将本发明的EphA2抗体或降低EphA2表达的其它治疗给予对某些激素、放射和化学治疗性试剂具有不利耐药性或敏感性降低的癌细胞中,从而使癌细胞对这些试剂中的一种或多种再敏感,然后给予(或继续给予)以治疗或控制癌症,包括预防转移。
在可选的实施方案中,本发明提供了治疗患者癌症的方法,包括给予该患者一种或多种本发明的EphA2抗体和任何其它治疗性试剂,而该患者已被证实难于用其它治疗方法治疗且不再使用这些治疗方法。优选地,EphA2抗体是EA2、EA3、EA4或EA5。在某些实施方案中,用本发明方法治疗的患者是已经用化学治疗、放射治疗、激素治疗或生物治疗/免疫治疗来处理过的患者。其中,这些患者是难于治疗的患者和难于用现有癌症治疗方法治疗的患者。在其它实施方案中,该患者已经过治疗且不再有疾病活性,给予一种或多种本发明的激动性抗体来预防癌症复发。
在优选实施方案中,现有治疗是化学治疗。在特定实施方案中,现有治疗包括给予化学治疗试剂,包括但不限于,甲氨蝶呤,泰素,巯嘌呤,硫鸟嘌呤,羟基脲,阿糖胞苷,环磷酰胺,异环磷酰胺,亚硝基脲,顺铂,卡铂,丝裂霉素,达卡巴嗪(dacarbazine),procarbizine,依托泊苷,campathecins,博来霉素,多柔比星,伊达比星(idarubicin),柔红霉素,放线菌素D,普卡霉素,米托蒽醌,天冬酰胺酶,长春碱,长春新碱,长春瑞宾(vinorelbine),紫杉醇,多西他赛(docetaxel)等。这些患者是经过放射治疗、激素治疗和/或生物治疗/免疫治疗过的患者。这些患者是经过外科手术治疗过的患者。
可选择地,本发明也包括治疗正在进行或进行过放射治疗的患者的方法。这些患者正在用化学治疗,激素治疗和/或生物治疗/免疫治疗治疗,或已前用过它们来治疗。另外,这些患者是经过外科手术治疗过的患者。
在其它实施方案中,本发明包括治疗正在进行或进行过激素治疗和/或生物治疗/免疫治疗的患者的方法。这些患者正在用化学治疗和/或放射治疗进行治疗,或已前用过它们来治疗。这些患者是经过外科手术治疗过的患者。
此外,本发明也提供了作为代替化学治疗、放射治疗、激素治疗和/或生物治疗/免疫治疗来治疗癌症的方法,其中上述各种治疗已被证实或可能被证实毒性过高,即对正在治疗的受试者产生不可接受或无法忍受的副作用。用本发明方法治疗的受试者可选择地同时用其它癌症治疗一起治疗,如外科手术治疗、化学治疗、放射治疗、激素治疗或生物治疗,这取决于哪种治疗被认为是不可接受或无法忍受的。
在其它实施方案中,本发明提供了给予一种或多种本发明的激动性单克隆抗体,而不需要其它任何癌症治疗方法来治疗癌症,该癌症证实难以用该治疗方法治疗。在特定实施方案中,难以用其它癌症治疗方法治疗的患者在没有进行癌症治疗的情况下给予一种或多种激动性单克隆抗体。
在其它实施方案中,患有与过度表达EphA2的细胞有关的癌前状态的患者可给予本发明的抗体,以治疗疾病和降低发展成恶性癌症的可能性。在特定实施方案中,癌前状态是高级前列腺上皮内肿瘤(PIN)、乳腺纤维腺瘤、纤维囊肿疾病或复合痣。
5.2.1.1癌症
可以用本发明的方法和组合物治疗、预防或控制的癌症和相关病症包括但不限于上皮细胞起源的癌症。这种癌的例子包括但不限于:白血病,如但不限于急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病,如骨髓细胞、早幼粒细胞、骨髓单核细胞、单核细胞性及红细胞白血病和骨髓增生异常综合症;慢性白血病,如但不限于,慢性骨髓性(粒细胞)白血病,慢性淋巴细胞白血病,发状细胞性白血病;真性红血球增多症;淋巴瘤如但不限于何杰金氏病,非何杰金氏病;多发性骨髓瘤,如但不限于郁积多发性骨髓瘤,非分泌型骨髓瘤,骨硬化性骨髓瘤,浆细胞白血病,单一质浆细胞瘤和髓外质浆细胞瘤;Waldenstrom巨球蛋白血症;意义未明的单克隆丙种球蛋白血症;良性单克隆丙种球蛋白血症;重链疾病;骨和结缔组织肉瘤,如但不限于骨质肉瘤,骨肉瘤,软骨肉瘤,尤文氏肉瘤,恶性巨细胞肿瘤,骨纤维肉瘤,脊索瘤,骨膜肉瘤,软组织肉瘤,血管肉瘤,纤维肉瘤,卡波氏肉瘤,平滑肌纤维肉瘤,脂肪肉瘤,淋巴管内皮细胞肉瘤,经鞘瘤,横纹肌肉瘤,滑液肉瘤;大脑肿瘤,如但不限于,神经胶质瘤,星细胞瘤,大脑干神经胶质瘤,室鼓膜瘤,寡树突胶质瘤,脑瘤,听神经瘤,颅咽管瘤,成神经管细胞瘤,脑膜瘤,松果瘤,松果母细胞瘤,原发性大脑淋巴瘤;乳腺癌包括但不限于腺癌,小叶性(小细胞)肺癌,导管内癌,髓质乳腺癌,粘液性乳腺癌,管状乳腺癌,乳头状乳腺癌,帕杰病,及炎症乳腺癌;肾上腺癌,如但不限于嗜铬细胞和肾上腺皮质癌;甲状腺癌,如但不限于乳头状或滤泡性甲状腺癌,髓质甲状腺癌和未分化甲状腺癌;胰腺癌,如但不限于,胰岛瘤,促胃液素瘤,胰升糖素瘤,舒血管肠肽瘤,生长激素抑制素分泌肿瘤,及良性肿瘤或胰岛细胞瘤;垂体癌,如但不限于库欣氏病(Cushing’s disease),泌乳刺激素分泌肿瘤,肢端肥大症,及尿崩症;眼癌,如但不限于眼黑素瘤,如虹膜黑素瘤,脉络膜骨黑素瘤,及睫状体黑素瘤,及成视网膜细胞瘤;阴道癌,如鳞状上皮细胞癌,腺癌,及黑素瘤;阴门癌,如鳞状上皮细胞癌,黑素瘤,腺癌,基细胞癌癌,肉瘤,及帕杰病;子宫颈癌,如但不限于,鳞状上皮细胞癌,及腺癌;子宫癌,如但不限于子宫内膜癌和子宫肉瘤;卵巢癌,如但不限于,卵巢上皮癌,边界瘤,生殖细胞肿瘤,及胃肠道间质肿瘤;食道癌,如但不限于,鳞状上皮细胞癌,腺癌,淋巴组织癌,粘液表皮样癌,腺鳞状癌,肉瘤,黑素瘤,质浆细胞瘤,疣状癌,及燕麦细胞(小细胞)癌;胃癌,如但不限于,腺癌,蕈伞型(息肉型)的、溃疡性的、表面扩散的、分布扩散的,恶性淋巴瘤,脂肪肉瘤,纤维肉瘤,及癌肉瘤;结肠癌;直肠癌;肝癌,如但不限于肝细胞癌和肝母细胞瘤;胆囊癌,如腺癌;胆管癌,如但不限于乳头状,结节状,及扩散状;肺癌,如非小细胞肺癌症,鳞状上皮细胞癌(表皮癌),空肠腺癌,大细胞癌和小细胞肺癌;睾丸癌,如但不限于生殖细胞瘤,精原细胞瘤,间变型,一般型(普通型),精母细胞型,非精原细胞瘤,胚胎癌,畸胎癌,绒毛膜癌(卵黄囊肿瘤),前列腺癌,如但不限于,腺癌,平滑肌肉瘤,及横纹肌肉瘤;penal癌;口腔癌,如但不限于鳞状上皮细胞癌;基底癌;唾腺癌,如但不限于腺癌,粘膜表皮癌,及增殖腺癌;咽癌,如但不限于鳞状上皮细胞癌症,及疣状癌;皮肤癌症,如但不限于,基底细胞癌,鳞状上皮细胞癌和黑素瘤,表面扩散黑素瘤,结节状黑素瘤,斑点恶性黑素瘤,肢端雀斑样黑素瘤;肾癌,如但不限于肾脏细胞癌,腺癌,肾上腺样瘤,纤维肉瘤,移行细胞癌(肾脏骨盆和/或子宫);魏氏肿瘤;膀胱癌,如但不限于移行细胞癌,鳞状上皮细胞癌症,腺癌,癌肉瘤。此外,癌包括粘液肉瘤,骨源性肉瘤,内皮瘤,淋巴管内皮瘤,间皮瘤,滑膜瘤,成血管细胞瘤,上皮癌,乳头状囊腺癌,支气管肺癌,汗腺癌,皮脂腺癌,乳头状癌和乳头状腺癌(对于这种紊乱,请参见,Fishman等人,1985,Medicine,2d Ed.,J.B.Lippincott Co.,Philadelphia和Murphy等人,1997,Informed Decisions:The Complete Book of Cancer Diagnosis,Treatment,andRecovery,Viking Penguin,Penguin Books U.S.A.,Inc.,美国)。
因此,本发明的方法和组合物也适用于治疗或预防各种癌症或其它异常性增生疾病,包括(但不限于)下述疾病:癌,包括膀胱、乳腺、结肠、肾、肝、肺、卵巢、胰腺、胃、子宫颈、甲状腺和皮肤的癌;包括鳞状上皮细胞癌;淋巴系统的造血细胞肿瘤,包括白血病,急性淋巴细胞白血病,急性成淋巴细胞白血病,B细胞淋巴瘤,T细胞淋巴瘤,伯基特淋巴瘤;骨髓系统的造血细胞肿瘤,包括急性和慢性髓性白血病和前髓细胞白血病;间叶细胞样起源的肿瘤,包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤;其它肿瘤,包括黑素瘤,精原细胞瘤,tetratocarcinoma,神经母细胞瘤和神经胶质瘤;中枢和外周神经系统的肿瘤,包括星细胞瘤,神经母细胞瘤,神经胶质瘤,及神经鞘膜瘤;间叶细胞样起源的肿瘤,包括纤维肉瘤,横纹肌肉瘤,及骨肉瘤;和其它肿瘤,包括黑素瘤,着色性干皮病,keratoactanthoma,精原细胞瘤,甲状腺卵泡癌症和teratocarcinoma。可以预期到,因细胞凋亡异常引起的癌症也可用本发明的方法和组合物治疗。这种癌症包括但不限于卵泡淋巴瘤,具有p53突变的癌,乳腺、前列腺和卵巢的激素相关的肿瘤,及癌症前期损害,如家族性大肠息肉症,及骨髓增生异常综合症。在特定实施方案中,治疗或预防皮肤、肺、结肠、乳腺、前列腺、膀胱、肾、胰腺、卵巢或子宫中的恶性或病态增生变化(如组织转化和发育异常),或高增生性病症。在其它特定实施方案中,治疗或预防肉瘤、黑素瘤、或白血病。
在一些实施方案中,所述癌症是恶性的并过度表达EphA2。在其它实施方案中,待治疗的疾病是与过度表达EphA2的细胞有关的癌前状态。在具体实施方案中,所述癌前状态是高级前列腺上皮内肿瘤(PIN)、乳腺纤维腺瘤、纤维囊肿疾病或复合痣。
在优选实施方案中,本发明的方法和组合物用于治疗和/或预防乳腺、结肠、卵巢、肺、及前列腺癌和黑素瘤,并在下文中以举例的方式进行说明,但不起限制作用。
5.2.1.2乳腺癌的治疗
在特定实施方案中,患乳腺癌的患者被给予有效量的一种或多种本发明的单克隆抗体。在另一个实施方案中,本发明的抗体与有效量的一种或多种用于乳腺癌治疗的其它试剂组合给予,这些试剂包括但不限于:多柔比星,表柔比星,多柔比星和环磷酰胺(AC)的组合,环磷酰胺、多柔比星和5-氟尿嘧啶(CAF)的组合,环磷酰胺、表柔比星和5-氟尿嘧啶(CEF)的组合,赫赛汀(herceptin),它莫西芬,它莫西芬和细胞毒性化学治疗的组合,紫杉烷类(如多西他赛和紫杉醇)。在另一个实施方案中,本发明的抗体可与紫杉烷类及标准多柔比星和环磷酰胺组合给予,来辅助治疗淋巴结阳性局部乳腺癌。
在特定实施方案中,患有乳腺癌前纤维腺瘤的患者被给予本发明的EphA2抗体,来治疗疾病并减少其发展成为恶性乳腺癌的可能性。
5.2.1.3结肠癌治疗
在特定实施方案中,患有结肠癌的患者被给予有效量的一种或多种本发明的单克隆抗体。在另一个实施方案中,本发明的抗体可与有效量的一种或多种用于治疗结肠癌的其它试剂组合给予,这些试剂包括但不限于:5-FU和亚叶酸的组合,5-FU和左咪唑的组合,依立替康(CPT-11)或依立替康(irinotecan)、5-FU和亚叶酸(IFL)的组合。
5.2.1.4前列腺癌治疗
在特定实施方案中,患有前列腺癌的患者被给予有效量的一种或多种本发明的单克隆抗体。在另一个实施方案中,本发明的抗体可与有效量的一种或多种用于前列腺癌治疗的其它试剂组合给予,这些试剂包括但不限于:体外放射治疗,放射性同位元素(即,I125、钯、铱)间质移植,亮丙瑞林或其它LHRH激动剂,非类固醇抗雄激素(氟他胺,里奴内酰胺,必卡他胺),类固醇抗雄激素(醋酸环丙氯地酮醋),亮丙瑞林和氟他胺的组合,雌激素如DES,三对甲氧苯氯乙烯,乙炔基雌二醇,U.S.P.共轭雌激素,DES二磷酸,放射性同位元素如锶-89,体外放射治疗和锶-89的组合,二线激素治疗剂如氨鲁米特,氢化可的松,氟他胺戒断药,孕酮及酮康唑,低剂量强的松,或可使个体的症状有所改善且降低PSA水平的其它化学治疗方案,包括多西他赛,紫杉醇,雌莫司汀/多西他赛,雌莫司汀/依托泊苷(etoposide),雌莫司汀/长春碱,及雌莫司汀/紫杉醇。
在一具体实施方案中,向患有癌前高级前列腺上皮内肿瘤(PIN)的患者给予本发明的EphA2抗体来治疗该疾病并降低发展成恶性前列腺癌症的可能性。
5.2.1.5黑色素瘤治疗
在特定实施方案中,患有黑素瘤的患者被给予有效量的一种或多种本发明的单克隆抗体。在另一个实施方案中,本发明的抗体可与有效量的一种或多种用于黑素瘤癌症治疗的其它试剂组合给予,这些试剂包括但不限于:达卡巴嗪(DTIC),亚硝基脲如双氯乙基亚硝脲(BCNU)和洛莫司汀(CCNU),中度单试剂活性的试剂,包括长春花生物碱,铂化合物,及紫杉烷类,Dartmouth方案(顺铂,BCNU及DTIC),干扰素α(IFN-A)及白细胞介素-2(IL-2)。在特定实施方案中,有效量的一种或多种本发明的激动性单克隆抗体在有或没有肿瘤坏死因素-α(TNF-α)存在下,可与高温隔离肢体灌注化疗(ILP)及苯丙酸氮芥(L-PAM)组合给予至患有多重大脑转移瘤、骨转移瘤及脊髓压迫症的患者,以减轻症状和使放射治疗引起的肿瘤缩小。
在特定实施方案中,像患有癌前复合痣的患者给予本发明的EphA2抗体治疗该疾病并降低发展成恶性黑素瘤的可能性。
5.2.1.6卵巢癌治疗
在特定实施方案中,患有卵巢癌的患者被给予有效量的一种或多种本发明的单克隆抗体。在另一个实施方案中,本发明的抗体可与有效量的一种或多种用于卵巢癌症治疗的其它试剂组合给予,这些试剂包括但不限于:腹膜内的放射治疗,如p32治疗,整个腹部和骨盆的放射治疗,顺铂,紫杉醇或多西他赛(Taxotere)和顺铂或卡铂的组合,环磷酰胺和顺铂的组合,环磷酰胺和卡铂组合,5-FU和亚叶酸的组合,依托泊苷,脂质体多柔比星,吉西他滨(gemcitabine)或拓扑替康(topotecan)。可预期的是,有效量的一种或多种本发明的激动性单克隆抗体与紫杉醇组合给予至患有难于用铂治疗疾病的患者。治疗患有难治卵巢癌的患者包括:向患有难于用铂治疗的疾病的患者给予异环磷酰胺,在基于顺铂组合的治疗方案失败后用六甲基三聚氰胺(HMM)作为抢救性化学治疗,及向其肿瘤上含有可检测水平的细胞质雌激素受体的患者给它莫西芬予。
5.2.1.7肺癌治疗
在特定实施方案中,患有小肺细胞癌症的患者被给予有效量的一种或多种本发明的单克隆抗体。在另一个实施方案中,本发明的抗体可与有效量的一种或多种用于肺癌症治疗的其它试剂组合给予,该试剂包括但不限于:胸部放射治疗,顺铂,长春新碱,多柔比星,及依托泊苷,单独或组合的;环磷酰胺,多柔比星,长春新碱/依托泊苷及顺铂(CAV/EP)的组合,用支气管内激光治疗、支气管内支架和/或近接治疗的局部缓解。
在其它特定实施方案中,患有非小肺细胞癌症的患者被给予有效量的一种或多种本发明的单克隆抗体及有效量的一种或多种用于肺癌症治疗的其它试剂,其包括但不限于:减轻放射治疗,顺铂、长春碱和丝裂霉素的组合,顺铂和长春瑞宾、紫杉醇、多西他赛或吉西他滨的组合,卡铂和紫杉醇的组合,支气管内病变的间质放射治疗或立体定向外科治疗。
5.2.2其它预防性/治疗性制剂
在一些实施方案中,通过给予一种或多种单克隆抗体的治疗与一种或多种治疗,如但不限于,化学治疗、放射治疗、激素治疗、和/或生物治疗/免疫治疗组合使用。预防/治疗性试剂包括但不限于蛋白性分子,包括但不限于肽、多肽、蛋白,包括翻译后经修饰的蛋白,抗体等;或小分子(小于1,000道尔顿),无机或有机化合物;或核酸分子,包括但不限于,双链或单链DNA,或双链或单链RNA,及三螺旋核酸分子。预防/治疗性试剂可源自于任何已知的有机体(包括但不限于,动物、植物、细菌、真菌及原生生物,或病毒)或合成的分子文库。
在特定实施方案中,本发明的方法包括组合给予本发明的抗体与一种或多种是激酶抑制剂的预防/治疗性试剂,该激酶例如但不限于:ABL、ACK、AFK、AKT(如AKT-1、AKY-2和AKT-3)、ALK、AMP-PK、ATM、Auroral、Auroral2、bARK1、bARK2、BLK、BMX、BTK、CAK、CaM激酶、CDC2、CDK、CK、COT、CTD、DNA-PK、EGF-R、ErbB-1、ErbB-2、ErbB-3、ErbB-4、ERK(如ERK1、ERK2、ERK3、ERK4、ERK5、ERK6、ERK7)、ERT-PK、FAK、FGR(如FGF1R、FGF2R)、FLT(如FLT-1、FLT-2、FLT-3、FLT-4)、FRK、FYN、GSK(如GSK1、GSK2、GSK3-α、GSK3-β、GSK4、GSK5)、G蛋白偶联受体激酶(GRK)、HCK、HER2、HKII、JAK(如JAK1、JAK2、JAK3、JAK4)、JNK(如JNK1、JNK2、JNK3、KDR、KIT、IGF-1受体、IKK-1、IKK-2、INSR(胰岛素受体)、IRAK1、IRAK2、IRK、ITK、LCK、LOK、LYN、MAPK、MAPKAPK-1、MAPKAPK-2、MEK、MET、MFPK、MHCK、MLCK、MLK3、NEU、NIK、PIDGF受体α、PDGF受体β、PHK、PI-3激酶、PKA、PKC、PKG、PRK1、PRK2、P38激酶、P135tyk2、p34cdc2、p42cdc2、p42mapk、p44mpk、RAF、RET、RIP、EIP-2、PK、RON、RS激酶、SRC、SYK、S6K、TAK1、TEC、TIE1、TIE2、TRKA、TXK、TYK2、UL13、VEGFR1、VEGFR2、YES、YRK、ZAP-70和所有这些激酶的亚型(见例如,Hardie和Hanks(1995)The Protein Kinase FactsBook;I和II,Academic Press,San Diego,Calif)。在优选实施方案中,本发明的抗体与一种或多种是Eph受体激酶(如EphA2、EphA4)抑制剂的预防/治疗性试剂一起组合给予。在最优选实施方案中,本发明的抗体与一种或多种是EphA2抑制剂的预防/治疗性试剂一起组合给予。
在另一特定实施方案中,本发明的方法包括组合给予本发明的治疗性抗体与一种或多种预防/治疗性试剂,这些试剂是血管生成抑制剂,如但不限于:血管抑素(血浆酶原片段);抗血管增生抗凝血酶III;Angiozyme;ABT-627;Bay 12-9566;倍尼芬;Bevacizumab;BMS-275291;源自软骨的抑制剂(CDI);CAI;CD59补充片段;CEP-7055;Col 3;康布瑞塔卡汀A-4;血管内皮抑制素(胶原质XVIII片段);纤维连结蛋白片段;Gro-β;卤夫酮;肝脓肿;肝磷脂六糖片段;HMV833;人绒毛促性腺激素(hCG);IM-862;干扰素α/β/γ;干扰素诱导蛋白(IP-10);白细胞介素-12;Kringle 5(血浆酶原片段);马立马司他;金属蛋白酶抑制剂(TIMPs);2-甲氧基雌二醇;MMI 270(CGS 27023A);MoAb IMC-1C11;Neovastat;NM-3;Panzem;PI-88;胎盘核糖核酸酶抑制剂;血浆酶原催化剂抑制剂;血小板因子-4(PF4);Prinomastat;泌乳刺激素16kD片段;多育曲菌素-关联蛋白(PRP);PTK 787/ZK 222594;类维生素A;Solimastat;角鲨胺;SS 3304;SU 5416;SU6668;SU11248;四氢可的索-S;四巯基钼酸盐;萨利多胺;Thrombospondin-1(TSP-1);TNP-470;转换生长因子-β(TGF-β);血管抑制素;血管抑制因子(钙网蛋白片段);ZD6126;ZD6474;法尼基转移酶抑制剂(FTI);和二磷酸盐。
在另一特定实施方案中,本发明的方法包括组合给予本发明的抗体和一种或多种是抗癌试剂的预防/治疗性试剂,例如但不限于:阿西维辛,阿克拉霉素,盐酸阿考达唑,阿克罗宁,阿多来新,阿地白介素,六甲蜜胺,二霉素,阿美蒽醌醋酸盐,氨基导眠能,安吖啶,阿那曲唑,安曲霉素,天冬酰胺酶,曲林菌素,阿扎胞苷,阿扎替派,含氮霉素,巴马司他,苯佐替派,必卡他胺,盐酸比生群,二甲磺酸双奈法德,比折来新,硫酸博来霉素,布喹那钠,溴匹立明,白消安,放线菌素C,卡普睾酮,卡醋胺,卡贝替姆,卡铂,卡氯芥,盐酸卡柔比星,卡折来新,西地芬戈,苯丁酸氮芥,西罗霉素,顺铂,克拉屈滨,crisnatol mesylate,环磷酰胺,阿糖胞苷,达卡巴嗪,放线菌素D,盐酸柔红霉素,decarbazine,地西他滨,右奥马铂,地扎胍宁,甲磺酸地扎胍宁,地吖醌,多西他赛,多柔比星,盐酸多柔比星,屈洛昔芬,柠檬酸屈洛昔芬,丙酸屈他雄酮,偶氮霉素,依达曲沙,盐酸依氟鸟氨酸,依沙芦星,恩洛铂,恩普氨酯,依匹哌啶,盐酸表柔比星,厄布洛唑,盐酸依索比星,雌莫司汀,磷酸盐雌莫司汀,依他硝唑,依托泊苷,磷酸依托泊苷,etoprine,盐酸法倔唑,法扎拉滨,芬维A胺,氟尿苷,磷酸氟达拉滨,氟尿嘧啶,氟西他滨,磷喹酮,福司曲星钠,吉西他滨,盐酸吉西他滨,羟基脲,盐酸伊达比星,异环磷酰胺,伊莫福新,白细胞介素2(包括重组白细胞介素2,或rIL2),干扰素α-2a,干扰素α-2b,干扰素α-nl,干扰素α-n3,干扰素β-Ia,干扰素γ-Ib,异丙铂,盐酸依立替康,醋酸兰瑞肽,来曲唑,醋酸亮丙瑞林,盐酸利阿唑,洛美曲索钠,洛莫司汀,盐酸洛索蒽醌,马索罗酚,美登素,盐酸氮芥,醋酸甲地孕酮,醋酸甲烯雌醇,苯丙酸氮芥,美诺立尔,巯嘌呤,甲氨蝶呤,甲氨蝶呤钠,metoprine,美妥替哌,米丁度胺,mitocarcin,mitocromin,米托洁林,丝裂马菌素,丝裂霉素,米托司培,米托坦,盐酸米托蒽醌,麦考酚酸,亚硝基脲,诺考达唑,诺加霉素,奥沙利铂,奥昔舒仑,紫杉醇,培门冬酶,佩里霉素,奈莫司汀,硫酸派来霉素,培磷酰胺,哌泊溴烷,哌泊舒凡,盐酸吡罗蒽醌,普卡霉素,普洛美坦,卟非姆钠,紫菜霉素,泼尼莫司汀,盐酸丙卡巴肼,嘌呤霉素,盐酸嘌呤霉素,吡唑呋喃菌素,利波腺苷,罗谷亚胺,沙芬戈,盐酸沙芬戈,司莫司汀,辛曲秦,sparfosatesodium,稀疏霉素,盐酸锗螺胺,螺莫司汀,螺铂,链黑菌素,链佐星,磺氯苯脲,他利霉素,tecogalan sodium,替加氟,盐酸替洛蒽醌,替莫泊芬,替尼泊苷,替罗昔隆,睾内酪,thiamiprine,硫鸟嘌呤,塞替派,噻唑呋啉,替拉扎明,柠檬酸托瑞米芬,醋酸曲托龙,磷酸曲西立滨,三甲曲沙,葡糖醛酸三甲曲沙,曲普瑞林,盐酸妥布氯唑,乌拉莫司汀,乌瑞替派,伐普肽,维替泊芬,硫酸长春碱,硫酸长春新碱,长春地辛,硫酸长春地辛,硫酸长春匹定,硫酸长春甘酯,硫酸长春罗新,酒石酸长春瑞宾,硫酸长春罗定,硫酸长春利定,伏氯唑,折尼铂,净司他丁,盐酸佐柔比星氢氯化物。其它抗癌试剂包括但不限于:20-epi-1,25二羟基维生素D3,5-乙炔基尿嘧啶,阿比特龙,阿克拉霉素,酰基富烯,adecypenol,阿多来新,阿地白介素,ALL-TK拮抗剂,六甲蜜胺,阿雌莫司汀,amidox,阿米福汀,氨基乙酰丙酸酸,氨柔比星,安吖啶,阿那格雷,阿那曲唑,穿心莲内酯,血管生成抑制剂,拮抗剂D,拮抗剂G,antarelix,抗背部化形态发生蛋白-1,抗雄激素,抗雌激素,肿瘤,aphidicolin glycinate,细胞凋亡基因调节剂,细胞凋亡调整器,无瞟呤核酸,ara-CDP-DL-PTBA,精氨酸脱氨基酶,asulacrine,阿他美坦,阿莫司汀,axinastatin 1,axinastatin 2,axinastatin 3,阿扎司琼,azatoxin,氮胸腺嘧啶,浆果赤霉素III衍生物,balanol,巴马司他,BCR/ABL拮抗剂,benzochlorins,苯甲酰基staurosporine,β内酰胺衍生物,β-alethine,β-clamycin B,桦木酸,bFGF抑制剂,必卡他胺,比生群,bisaziridinylspermine,双奈法德,bistratene A,比折来新,breflate,溴匹立明,布度钛,丁基硫堇亚胺,钙泊三醇,钙磷酸蛋白C,喜树碱衍生物,金丝雀疹IL-2,卡培他滨,甲酰胺-氨基-三氮杂茂,羧酰胺三唑,CaRest M3,CARN 700,源自软骨的抑制剂,卡折来新,干酪素激酶抑制剂(ICOS),栗树精胺,cecropin B,西曲瑞克,氯喹喔啉磺胺药物,西卡前列素,顺式卟啉,克拉屈滨,克罗米芬类似物,克霉唑,collismycin A,collismycin B,康布瑞塔卡汀A4,康布瑞塔卡汀类似物,conagenin,crambescidin 816,crisnatol,cryptophycin 8,cryptophycin A衍生物,curacinA,环戊蒽醌,cycloplatam,cypemycin,阿糖胞苷ocfosfate,细胞因子,cytostatin,达昔单抗,地西他滨,脱氢膜海鞘素B,地洛瑞林,地塞米松,右异环磷酰胺,右雷佐生,右维拉帕米,地吖醌,didemnin B,didox,二乙基norspermine,二氢-5-氮杂胞啶,二氢紫杉醇,dioxamycin,苯基苯螺莫司汀,多西他赛,二十二烷醇,多拉司琼,去氧氟尿苷,屈洛昔芬,屈大麻酚,duocarmycin SA,依布硒啉,依考莫司汀,依地福新,依决洛单抗,依氟鸟氨酸,榄香烯,乙嘧替氟,表柔比星,爱普列特,雌莫司汀类似物,雌激素激动剂,雌激素拮抗剂,依他硝唑,依托泊苷磷酸盐,依西美坦,法倔唑,法扎拉滨,芬维A胺,非格司亭,非那雄胺,flavopiridol,氟卓斯汀,fluasterone,氟达拉滨,盐酸fluorodaunorunicin,福酚美克,福关斯坦,福司曲星,福莫司汀,德卟啉钆,硝酸镓,加洛他滨,加尼瑞克,白明胶酶抑制剂,吉西他滨,谷胱甘肽抑制剂,hepsulfam,heregulin,环己双乙酰胺,金丝桃素,伊班膦酸,伊达比星,艾多昔芬,伊决孟酮,伊莫福新,伊洛马司他,咪唑并吖啶酮,咪喹莫特,免疫刺激肽,类胰岛素生长因子-1受体抑制剂,干扰素激动剂,干扰素,白细胞介素,碘苄胍,碘代多柔比星,蕃薯宁,伊罗普拉,伊索拉定,isobengazole,isohomohalicondrinB,伊他司琼,jasplakinolide,kahalalide F,层状素-N三醋酸基的,兰瑞肽,leinamycin,来格司亭,硫酸蘑菇多糖,leptolstatin,来曲唑,白血病抑制因素,白细胞α干扰素,亮丙瑞林+雌激素+黄体酮,亮丙瑞林,左咪唑,利阿唑,线性聚胺类似物,亲脂性二糖肽,亲脂性铂化合物,lissoclinamide 7,洛铂,蚯蚓磷脂,洛美曲索,氯尼达明,洛索蒽醌,洛伐他汀,洛索立宾,勒托替康,德卟啉镥,lysofylline,溶解肽,美坦辛,mannostatin A,马立马司他,马索罗酚,maspin,matrilysin抑制剂,基质金属蛋白酶抑制剂,美诺立尔,麦尔巴隆,meterelin,methioninase,灭吐灵,MIF抑制剂,米非司酮,米替福新,米立司亭,不匹配双链RNA,米托胍腙,二溴卫矛醇,丝裂霉素类似物,米托萘胺,mitotoxin纤维原细胞生长因子-saporin,米托蒽醌,莫法罗汀,莫拉司亭,单克隆抗体,人绒毛促性腺激素,单磷酰基油脂A+乳酸分支杆菌细胞壁sk,莫哌达醇,多耐药性基因抑制剂,多肿瘤抑制剂1基治疗,芥子气抗癌试剂,印度洋海绵B,分枝杆菌细胞壁提取物,myriaporone,N-乙酰基地那林,N-替代苯甲脒,那法瑞林,nagrestip,纳洛酮+戊唑辛,napavin,naphterpin,那托司亭,奈达铂,奈莫柔比星,奈立膦酸,中性肽链内切酶,里奴内酰胺,nisamycin,氮氧化物调节剂,硝基氧抗氧化物,nitrullyn,O6-苄基鸟嘌呤,奥曲肽,okicenone,寡核苷酸,奥纳司酮,恩丹西酮,恩丹西酮,oracin,口服细胞因子诱导剂,奥沙利铂,奥沙特隆,奥沙利铂,oxaunomycin,紫杉醇,紫杉醇类似物,紫杉醇衍生物,palauamine,palmitoyl利索新,帕米膦酸,人参三醇,帕诺米芬,parabactin,帕折普汀,培门冬酶,peldesine,戊聚糖聚硫酸钠,喷司他丁,pentrozole,全氟溴烷,培磷酰胺,芥子醇,phenazinomycin,乙酸苯酯,磷酸酶抑制剂,picibanil,盐酸匹鲁卡品,吡柔比星,吡曲克辛,placetin A,placetinB,血浆酶原活化抑制剂,合成铂,铂化合物,合成铂-三胺,卟非姆钠,甲基丝裂霉素,强的松,丙烷基二度-吖啶酮,前列腺素J2,蛋白解体抑制剂,蛋白A基免疫调节剂,蛋白激酶C抑制剂,蛋白激酶C抑制剂,微藻,蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂,嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂,红紫素,吡唑并吖啶,pyridoxylated血色素聚氧化乙烯结合物,raf拮抗剂,雷替曲塞,雷莫司琼,ras法尼基蛋白转移酶抑制剂,ras抑制剂,ras-GAP抑制剂,脱甲基的retelliptine,依替膦酸钠铼Re 186,利索新,核酶,RII视黄酰胺,罗谷亚胺,rohitukine,罗莫肽,罗喹美克,rubiginone B1,ruboxyl,沙芬戈,saintopin,SarCNU,sarcophytol A,sargramostim,Sdi 1模拟药,司莫司汀,衰老源自抑制剂1,正义寡核苷酸,信号转导抑制剂,信号转导调节剂,单链抗原结合蛋白,西佐喃,索布佐生,硼卡钠,苯基乙酸钠,solverol,生长调节素结合蛋白,索纳明,斯帕福斯酸,spicamycin D,螺莫司汀,splenopentin,天然物质海绵素1,角鲨胺,干细胞抑制剂,干细胞分离抑制剂,stipiamide,基质溶解酶抑制剂,sulf次黄苷,超活性血管活性的肠肽拮抗剂,suradista,苏拉明,苦马豆素,合成粘多糖,他莫司汀,它莫西芬甲碘化物,牛磺莫司汀,紫杉醇,tazarotene,tecogalan钠,替加氟,tellurapyrylium,端粒酶抑制剂,替莫泊芬,替莫唑胺,替尼泊苷,四氯癸烷氧化物,tetrazomine,thaliblastine,撒利多胺,thiocoraline,硫鸟嘌呤,血小板生成素,血小板生成素模拟物,胸腺法新,促胸腺生成素受体激动剂,胸腺曲南,甲状腺刺激性激素,初乙基卟啉锡,替拉扎明,二茂钛二氧化物,topsentin,托瑞米芬,全能干细胞因素,转换抑制剂,维A酸,三乙酰基尿苷,曲西立滨,三甲曲沙,曲普瑞林,托烷司琼,妥罗雄脲,酪氨酸激酶抑制剂,tyrphostins,UBC抑制剂,乌苯美司,尿生殖窦性的生长抑制性因子,尿激酶受体拮抗剂,伐普肽,variolin B,载体系统,红血球基因治疗,维拉雷琐,Veramine,verdins,维替泊芬,长春瑞宾,vinxaltine,vitaxin,伏氯唑,扎诺特隆,折尼铂,亚苄维C,及净司他丁斯酯。优选的抗癌症药物为5-氟尿嘧啶和亚叶酸。
在更特定实施方案中,本发明还包括给予一种或多种本发明的单克隆抗体及给予一种或多种治疗剂,如但不限于如表2中所述的抗癌试剂,优选是治疗如前所述的乳腺、卵巢、黑素瘤、前列腺、结肠和肺癌。
表2
治疗性试剂 | 给予 | 剂量 | 用药时间间隔 |
盐酸多柔比星(阿霉素RDF和阿霉素PFS) | 静脉内 | 第1天60-75mg/m2 | 21天间隔 |
盐酸表柔比星(EllenceTM) | 静脉内 | 每个周期的第1天100-120mg/m2或在每个周期的第1-8天分次同量给予 | 3-4周循环 |
氟尿嘧啶 | 静脉内 | 怎样供应:5ml和10ml小瓶(分别含有250和500mg氟尿嘧啶) | |
多西他赛(Taxotere) | 静脉内 | 1小时内60-100mg/m2 | 每3周一次 |
紫杉醇(Taxol) | 静脉内 | 3小时内175mg/m2 | 每3周4次(相继给予含有阿霉素的化学治疗组合) |
它莫西芬柠檬酸盐(Nolvadex) | 口服(片剂) | 20-40mg大于20mg的剂量应分次给予(早上或晚上) | 每日 |
亚叶酸钙,注射 | 静脉内或肌肉内注射 | 怎样供应:350mg小瓶 | 剂量不清楚PDR 3610 |
luprolide醋酸盐(Lupron) | 单次皮下注射 | 1mg(0.2ml或20单位) | 一天一次 |
氟他胺 | 口服(胶囊) | 250mg(每个胶囊包括125 | 一天3次,间隔8小时(总 |
(Eulexin) | mg氟他胺) | 日剂量750mg) | |
里奴内酰胺(Nilandron) | 口服(片剂) | 300mg或150mg(每一片包括50或150mg里奴内酰胺) | 一天一次300mg达30天,然后一天一次150mg |
必卡他胺(Casodex) | 口服(片剂) | 50mg(每一片包括50mg必卡他胺) | 一天一次 |
黄体酮 | 注射 | USP在麻油中,50mg/ml | |
酮康唑(Nizoral | 霜剂 | 根据不同症状日敷2%霜剂一次或二次 | |
强的松 | 口服(片剂) | 根据被治疗的特定疾病实体,每天开始剂量为5mg~60mg | |
雌莫司汀磷酸钠(Emcyt) | 口服(胶囊) | 14mg/kg体重(对10kg或221b体重给予一个140mg胶囊) | 每天给予3或4次分剂量 |
依托泊苷或VP-16 | 静脉内 | 5ml溶液(20mg/ml)(100mg) | |
达卡巴嗪(DTIC-Dome) | 静脉内 | 2-4.5mg/kg | 一天一次达10天。以4周的间隔进行重复 |
带有卡氯芥移植物(BCNU)(亚硝基脲)的聚苯丙生20(Gliadel) | 晶片置于切除腔中 | 如果切除腔的大小和形状允许,那么可以有8个晶片,每个含有7.7mg卡氯芥,总共61.6mg | |
顺铂 | 注射 | 怎样供应:1mg/ml溶液,在50mL和100mL的多剂量小瓶中 | |
丝裂霉素 | 注射 | 在5mg和20mg小瓶中供应(含有5mg和20mg丝裂霉素) |
吉西他滨HCl(Gemzar) | 静脉内 | 对于NSCLC-研究了2个方案,没有找到最佳方案4周方案-静脉内给予1000mg/m2,30分钟内3周方案-静脉内给予Gemzar,1250mg/m2,30分钟内 | 4周方案-每28天周期的第1、8和15天。在灌输Gemzar后的第1天,静脉内给予顺铂100mg/m2。3周方案-每21天周期的第1和8天。在给予Gemzar后的第1天,静脉内给予顺铂100mg/m2。 |
卡铂(Paraplatin) | 静脉内 | 单试剂治疗:在第1天,360mg/m2 I.V.(灌输持续15分钟或更久)其它剂量计算:与环磷酰胺的组合治疗,剂量调整建议,制剂剂量,等 | 每4周 |
异环磷酰胺(Ilex) | 静脉内 | 每天1.2g/m2 | 连续5天,每3周重复,或从血液毒性恢复后 |
本发明还包括给予本发明的EphA2抗体及放射治疗,包括使用x-射线,γ射线和其它破坏癌细胞的放射源。在优选实施方案中,该放射治疗作为外部放射或远距放射治疗给予,其中该放射直接从远程源导入。在其它优选实施方案中,该放射治疗作为内部治疗或近接治疗给予,其中放射源被置于体内部,接近癌细胞或肿瘤部分。
癌症治疗和其剂量,给予方法和推荐的使用方法在本领域是公知的,且在Physician′s Desk ReferFence中有所描述(第56版,2002)。
5.3本发明抗体的鉴定
5.3.1激动性抗体
本发明的抗体优选可以激发(即诱导EphA2磷酸化)并免疫特异性结合EphA2受体。当被激发时,EphA2磷酸化并随后降解。可采用本领域已知的检测EphA2磷酸化、活性或表达的方法来检测候选的EphA2抗体以确定它们的激发活性(见例如下文的第6.2.1节)。
因此本发明提供了检测和筛选本发明的EphA2抗体的方法,包括将特异性结合EphA2,特别是结合EphA2胞外结构域的抗体,与表达EphA2的细胞,特别是癌细胞,优选过度表达EphA2(与相同类型的非癌细胞相比)的转移癌细胞一起培育,然后检测EphA2磷酸化的增加和/或EphA2的降解,从而鉴定本发明的EphA2抗体。
5.3.2优先结合在癌细胞上暴露的EpgA2表位的抗体
本发明的抗体可以优先结合在癌细胞(如过度表达EphA2的细胞和/或具有大量未与配体结合的EphA2的细胞)而不是非癌细胞上暴露的EphA2表位,其中非癌细胞中的EphA2与配体结合。在此实施方案中,本发明的抗体针对的是在非癌细胞上不暴露而在癌细胞上暴露的EphA2表位(见例如6.6章节)。非癌细胞与癌细胞之间EphA2的膜分布不同,癌细胞上暴露的某些表位在非癌细胞上不暴露。例如,正常时EpyhA2与其配体EphrinA1结合定位于细胞-细胞接触处。而癌细胞通常细胞-细胞间接触减少以及EphA2过度表达超过其配体。因此,癌细胞中不定位于细胞-细胞接触处的未结合的EphA2量增多。因此,在一实施方案中,本发明的抗体优选结合未结合、未定位的EphA2的抗体。
本领域公知的用于检测候选EphA2抗体在细胞上的结合/定位的任何方法都可用来筛选候选的具有理想结合属性的抗体。在一个实施方案中,用免疫荧光显微镜来检测抗体的结合属性。可以用标准技术来比较抗体与体外生长的细胞的结合。在特定实施方案中,将与癌细胞结合的抗体与结合于非癌细胞的抗体进行比较。暴露的EphA2表位抗体与非癌细胞结合较差,但与癌细胞结合较好。在另一个特定实施方案中,将与解离的非癌细胞(例如,用钙螯合剂(如EGTA)处理的)结合的抗体与结合于未解离的非癌细胞的抗体进行比较。暴露的EphA2表位抗体与未解离的非癌细胞结合较差,但与解离的非癌细胞结合较好。
另一实施方案中,采用流式细胞计数测定抗体的结合特性。在此实施方案中,在该实施方案,EphA2可与其配体EphrinA1交联或不交联。暴露的EphA2表位抗体与交联的EphA2结合较差,但与未交联的EphA2结合较好。
在另一个实施方案中,用cell-based或免疫测定法来检测抗体的结合特征。在该实施方案中,可以用能与EphA2配体(如EphrinA1)竞争结合EphA2的抗体来替代EphA2的EphrinA1。在这种分析中用到的EphA2配体可以是可溶解的蛋白(例如,重组表达的)或在细胞上表达,从而锚定到该细胞上。
5.4治疗或预防作用的表征和证明
本发明的预防和/或治疗方案的毒性和效果可以通过标准药物学方法在细胞培养物或实验室动物中测定,例如,测定LD50(50%的致死剂量)和ED50(50%的有效治疗剂量)。毒性和治疗效果的剂量比是治疗指数,可以表达成LD50/ED50。表现出较大治疗指数的预防和/或治疗性试剂是优选的。尽管可以使用具有毒性副作用的预防和/或治疗性试剂,但是应该小心设计输送系统,以将这种试剂输送至受影响的组织位点,从而使未受感染的细胞的可能损害达到最小化,因而降低副作用。
细胞培养分析和动物研究中得到的数据可用于配制各种剂量的人用预防和/或治疗性试剂。这种试剂的剂量优选是在循环浓度范围内,具有ED50和较小的或没有毒性。根据所用的剂型和使用的给药方案,剂量可在此范围内变化。对于本发明方法中使用的任何试剂,其治疗有效量可以根据细胞培养分析进行初步估计。配制剂量以在动物模型中达到循环血浆浓度,包括细胞培养检测的IC50(即,达到最大症状抑制的一半时的测试化合物浓度)。这些信息可用于更精确地测定人的有用剂量。例如使用高效液相色谱可以测量血浆中的水平。
本发明所用治疗的抗癌活性可以使用本领域公知的用于研究癌症的各种实验动物模型来测定,如其中的小鼠EphA2用人EphA2替换的SCID小鼠模型或转基因小鼠,带有人异种移植物的裸鼠,如下文第6节所述的动物模型,或本领域已知的和以下文献中描述任何动物模型(包括仓鼠,野兔等):Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development(1999版,Fiebig和Burger);Contributions to Oncology(1999,Karger);Thg NudeMouse in Oncology Research(1991版,Boven和Winograd);和AnticancerDrug Development Guide(1997版,Teicher),在此引入全部内容作为参考。
5.4.1治疗作用的证明
本发明的方案和组合物在使用前优选在人体外、然后在人体内对所需的治疗或预防活性进行测试。例如,体外分析可用于检测是否给予了特定的治疗方案。该分析包括体外细胞培养分析,其中的患者组织样品在培养基中生长,暴露或给予其它方案,并观察这种方案对组织样品的作用,例如,EphA2的磷酸化/降解升高。接触细胞的低水平增生或存活表明,治疗性试剂对于治疗患者是有效的。可选择地,不培养患者细胞,可以使用肿瘤或恶性细胞系的细胞来筛选治疗性试剂和方法。本领域中有多种分析标准可用于分析这种存活和/或生长;例如,可以通过测量3H-胸苷的插入、直接细胞计数、检测已知基因(如原癌基因(例如,fos,myc))的转录活性或细胞循环标记的变化来分析细胞增生;可以通过台盼蓝染色分析细胞生存能力,基于形态变化、EphA4磷酸化或降解的提高等来可见地分析分化。
在人中进行测试之前,治疗用的化合物可在适合的动物模型系统中进行测试,包括但不限于在大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、兔、仓鼠等,例如,上文所述的动物模型。然后在适合的临床试验中使用化合物。
此外,本领域所属技术人员公知的任何分析都可用来评估本文所述的用于治疗或预防癌症的组合治疗的预防和/或治疗作用。
5.5药物组合物
本发明的组合物包括药物组合物制造中用的原料药组合物(例如,不纯的或未消毒的组合物)和可用于制备单位剂型的药物组合物(即,适于给予受试者或患者的组合物)。这些组合物含有预防或治疗有效量的本文所述的预防和/或治疗性试剂或这些试剂与药物可接受的载体的组合。优选地,本发明的组合物含有预防和/或治疗有效量的本发明的一种或多种EphA2抗体和药学上可接受的运载体。在另一实施方案中,本发明的组合物还含有其它抗癌试剂。在特定实施方案中,所述其它抗癌试剂包括但不限于化疗试剂、放疗试剂、激素治疗试剂、生物学治疗和免疫治疗试剂。
在特定实施方案中,术语″药物可接受的″是指联邦或政府管理机构核准的或美国药典或其它通常认可的药典中所列的适于动物,更具体地是人的载体。术语″载体″是指稀释剂、佐剂(例如,Freund佐剂(完全和不完全),更优选地,从Chiron,Emeryville,CA得到的MF59C.1佐剂),赋形剂,或通过其给予治疗剂的载体。这种药物学载体可以是消毒的液体,如水和油,包括石油,动物,植物或合成的,如花生油,大豆油,矿物油,麻油等。当该药物组合物通过静脉内给予时,水是优选的载体。生理盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体,尤其是用于注射用溶液。适合的药物学赋形剂包括淀粉,葡萄糖,乳糖,蔗糖,凝胶,麦芽,水稻,面粉,白垩,硅胶,硬脂酸钠,甘油单硬脂酸酯,滑石,氯化钠,干脱脂奶,甘油,丙烯,乙二醇,水,乙醇等。如果需要,该组合物还可以含有少量润湿剂或乳化剂,或pH缓冲剂。这些组合物可以是溶液,悬浮液,乳状液,片剂,丸药,胶囊,粉末,缓释制剂等形式。
通常,本发明组合物的成分可以分别供应或混合成单位剂型,例如作为在密封容器中(如表明活性试剂量的安瓿或小袋)的冻干粉末或无水浓缩物。如果通过灌输给予该组合物,那么可以用装有消毒药物级水或生理盐水的灌输瓶分散。如果通过注射给予该组合物,那么可以提供注射用消毒水或生理盐水安瓿,以在给予之前混合成分。
本发明组合物可配制成中性或盐形式。药物学上可接受的盐包括用阴离子形成的盐,如衍生于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些盐,还包括用阳离子形成的盐,如衍生于钠、钾、铵、鲺、氢氧化铁、异丙基胺、三乙基胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。
各种运输系统是公知的,并可用于给予本发明的激动性单克隆抗体或本发明的激动性单克隆抗体与用于预防或治疗癌症的预防性或治疗性试剂的组合,例如脂质体胶囊,微粒,微胶囊,能够表达抗体或抗体片段的重组细胞,受体介导的内吞作用(参见,例如,Wu和Wu,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432),作为逆转录病毒或其它载体等一部分的核酸结构。给予本发明预防或治疗性试剂的方法包括但不限于,肠胃外给予(例如,皮层内,肌肉内,腹膜内,静脉内和皮下),脑膜外,及粘膜(例如,鼻内,吸入,及口服路线)。在特定实施方案中,本发明的预防或治疗性试剂通过肌肉内,静脉内,或皮下给予。预防或治疗性试剂可以通过任何常规路线给予,例如通过灌输或丸药注射,通过上皮或粘膜皮肤衬层吸附(例如,口服粘膜,直肠和肠内粘膜等),也可以与其它生物活性试剂组合给予。给予可以是系统性的或局部的。
在特定实施方案中,可能需要将本发明的预防或治疗性试剂局部给予至需要治疗的区域;这可以通过例如但不限于局部灌输、注射、或通过移植物来进行,所述移植物可以是带孔的、非孔的或凝胶状材料,包括膜,如硅橡胶膜,或纤维。
在另一个实施方案中,预防或治疗性试剂可通过控制释放或缓释系统输送。在一个实施方案中,可使用泵进行控制释放或缓释(参见,Langer,见上文;Sefton,1987,CRC Crit Ref Biomed.Eng.14:20;Buchwald等人,1980,Surgery 88:507;Saudek等人,1989,N.Engl.J.Med.321:574)。在另一个实施方案中,聚合物材料可用于对本发明的抗体或其片段进行控制释放或缓释(参见例如,Medical Applications of Controlled Release,Langer和Wise(编),CRC Pres.,Boca Raton,Florida(1974);Controlled DrugBioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen和Ball(eds.),Wiley,New York(1984);Ranger和Peppas,1983,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61;也参见Levy等人,1985,Science 228:190;During等人,1989,Ann.Neurol.25:351;Howard等人,1989,J.Neurosurg.71:105);美国专利5,679,377;5,916,597;5,912,015;5,989,463;5,128,326;国际公开WO 99/15154和WO 99/20253。缓释制剂中所用的聚合物例子包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羟基乙基酯),聚(甲基丙烯酸甲基酯),聚(丙烯酸),聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯),聚(甲基丙烯酸),聚乙醇酸(PLG),聚酸酐,聚(N-乙烯吡咯烷酮),聚(乙烯醇),聚丙烯酰胺,聚(乙烯乙二醇),聚交酯(PLA),聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA),及聚原酸酯。在优选实施方案中,缓释制剂中所用的聚合物是惰性的,不含可滤去杂质,贮存稳定,消毒,及可生物分解的。在另一个实施方案中,控制释放或缓释系统置于接近预防或治疗目标处,因此仅需要系统性剂量的一部分(参见,例如,Goodson,Medical Applications of Controlled Release,见上文,vol.2,pp.115-138(1984))。
控制释放系统公开在Langer(1990,Science 249:1527-1533)的综述中。本领域所属技术人员公知的任何技术可用于制备包含一种或多种本发明治疗性试剂的缓释制剂。参见,例如,美国专利4,526,938;国际公开WO91/05548和WO 96/20698;Ning等人,1996,Radiotherapy&Oncology 39:179-189;Song等人,1995,PDA Journal of Pharmaceutical Science&Technology 50:372-397;Cleek等人,1997,Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854;和Lam等人,1997,Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:759-760,在此引入每一文献的全部内容作为参考。
5.5.1制剂
本发明所用的药物组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载体或赋形剂以常规方式配制。
因此。可将本发明的EphA2抗体和其生理学上可接受的盐和溶剂化物配制成通过吸入或吹入(通过口腔或鼻子)、或口服、肠胃外或粘膜(如口腔,阴道,直肠,舌下)给药。在优选实施方案中,使用局部或系统性肠胃外给药。
对于口服给药而言,上述药物组合物例如可以通过用常规方式与药物学上可接受的赋形剂一起制成片剂或胶囊,该赋形剂如结合剂(例如,预凝固的玉米淀粉,聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素);填充剂(例如,乳糖,微晶纤维素或磷酸氢钙);润滑剂(例如,硬脂酸镁,滑石或氧化硅);崩解剂(例如,土豆淀粉或淀粉乙醇酸钠);或润湿剂(例如,月桂基硫酸钠)。可以用本领域公知的方法包被片剂。口服给药用的液体制剂可以是例如溶液,糖浆或悬浮液,或它们以干产物的形式存在以在使用之前与水或其它适合载体组合。这种液体制剂可以通过用常规方法用药物学上可接受的添加剂制备,该添加剂如悬浮剂(例如,山梨醇糖浆,纤维素衍生物或氢化食用脂肪);乳化剂(例如,卵磷脂或阿拉伯树胶);非水性载体(例如,杏仁油,油状酯,乙醇或分馏的植物油);和防腐剂(例如,甲基或丙基-p-羟基苯甲酸酯或山梨酸)。在需时,该制剂也可以含有缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。
口服给药用的上述制剂可以配制成使活性化合物可控制地释放。
对于口腔给药,上述组合物可以以常规方式配制成片剂或止咳糖的形式。
对于吸入给药,本发明所用的预防或治疗性试剂方便地从压缩包或喷雾器中以气雾喷剂形式输送,该输送需要使用适合的推进剂,例如,二氯二氟甲烷,三氯氟甲烷,二氯四氟乙烷,二氧化碳或其它适合气体。对于压缩的气雾剂,可以使用阀来测定剂量单位以实现定量输送。吸入器或吹入器中所用的凝胶胶囊和药管可配制成含有化合物和合适粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
可以将预防或治疗性试剂配制成通过注射进行肠胃外给药,例如,通过弹丸注射或连续灌输给药。注射用制剂可以是单位剂型,例如,在安瓿中或在多次剂量容器中的单位剂型,其中加入了防腐剂。该组合物在油性或水性载体中可以呈现出悬浮液、溶液或乳状液形式,并可以含有配方试剂,如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可选择地,所述的活性成分可以在使用前与适合载体例如消毒的无热原水配制成粉末形式。
预防或治疗性试剂也可以配制成直肠组合物,如栓剂或灌肠剂,例如,含有常规栓剂基质,如可可油或其它甘油酯的栓剂或灌肠剂。
除了上述制剂外,上述预防或治疗性试剂也可以配制成贮存制剂。这种长时间作用制剂可通过植入(例如皮下或肌肉内)来给予或通过肌肉内注射给予。因此,例如,该预防或治疗性试剂可用合适的聚合或疏水材料配制(例如在可接受油中作为乳状液)或用离子交换树脂配制,或配制成微溶的衍生物,例如,微溶的盐。
本发明也提供包装在密封容器中(如表明活性试剂量的安瓿或小袋)的预防或治疗性试剂。在一个实施方案中,该预防或治疗性试剂可作为密封容器中的干消毒冻干粉末或无水浓缩物提供,并可例如用水或生理盐水重建成适合浓度,以给予个体。
在本发明优选的实施方案中,各种化学治疗、生物治疗/免疫治疗和激素治疗性试剂的配制和给予是本领域公知的,通常公开在Physician′s DeskReference,第56版(2002)中。例如,在本发明的某些特定实施方案中,配制本发明的治疗性试剂,并以表2形式供应。
在本发明其它实施方案中,可以以胶囊中的液体或饮品形式口服给予放射治疗性试剂,如放射性同位素。放射性同位素也可配置成静脉内注射。肿瘤学家可以测定优选的制剂和给药路径。
在某些实施方案中,本发明的激动性单克隆抗体以1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml及25mg/ml配制,以进行静脉内注射,和以5mg/ml、10mg/ml及80mg/ml配制,以进行重复皮下给予和肌肉内注射。
如果需要,可以将上述组合物置于包装或分配装置中,其可包括一种或多种含有活性成分的单元剂型。这种包装例如包括金属或塑料箔,如泡罩包装。该包装或分配装置可以附有给药说明书。
5.5.2剂量
可有效治疗、预防或控制癌症的本发明的组合物的量可以通过标准研究技术来确定。例如,可有效治疗、预防或控制癌症的组合物的剂量可通过将该组合物给予动物模型来确定,例如,用本文所述或本领域所属技术人员公知的动物模型。此外,任选地可以使用体外分析方法来帮助确定最佳的剂量范围。
本领域技术人员可以基于几种因素的考虑,来确定优选有效剂量(例如通过临床试验)。这些因素包括待治疗或预防的疾病、症状、患者体重、患者免疫状态和本领域所属技术人员公知的影响给予的药物组合物的精确度的其它因素。
使用的精确剂量也取决于给药途径及癌症的严重度,并根据每个医生的判断和患者情况来决定。可以根据体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线外推出有效剂量。
对于抗体,给予患者的剂量通常为0.1mg/kg~100mg/kg患者体重。优选地,给予患者的剂量为0.1mg/kg~20mg/kg患者体重,更优选为1mg/kg~10mg/kg患者体重。通常,人和人源化抗体在人体中比从其它物种得到的抗体有更长的半衰期,这是由于对外源多肽有免疫反应。因此,通常可以给予较少剂量的人抗体和给予次数减少。
对于给予患者的其它癌症治疗性试剂而言,本领域公知的各种癌症治疗的通常剂量列于表2中。在本发明中,某些优选实施方案包括在组合治疗中给予的剂量比单一试剂给予的剂量低。
本发明提供了用已知预防或治疗性试剂给药的任何方法,其给予计量比以前认为的预防、治疗、控制或改善癌症有效剂量要低。优选地,将较低剂量的公知抗癌症治疗剂与较低剂量的本发明的激动性单克隆抗体组合给药。
5.6试剂盒
本发明提供药物包或试剂盒,其包括填充有本发明的EphA2抗体的一个或多个容器。此外,一种或多种用于治疗癌症的其它预防或治疗性试剂也可以包含在这种药物包或试剂盒中。本发明还提供一种药物包或试剂盒,其包括填充有本发明的药物组合物的一种或多种组分的一个或多个容器。任选地,这种容器含有一个通知,其以政府机构规定的形式规定药物或生物产品的制造、使用或销售,这种通知反映了允许制造、使用或销售以用于人给药。
本发明提供了可在上述方法中使用的试剂盒。在一个实施方案中,该试剂盒含有一种或多种本发明的EphA2抗体。在另一个实施方案中,该试剂盒还含有在一个或多个容器中的一种或多种用于治疗癌症的其它预防或治疗性试剂。在某些实施方案中,该其它预防或治疗性试剂是化学治疗性的。在其它实施方案中,该预防或治疗性试剂是生物治疗性或激素治疗性的。
6.实施例
6.1单克隆抗体的制备
抗原的制备
用RIPA缓冲液提取Ras-转化的MCF-10A细胞。用固定的PY20抗体部分纯化酪氨酸磷酸化蛋白(Kanner等.,1989,J Immunol Meth.120:115-124)。用25mM苯基磷酸竞争性洗脱结合的蛋白质。用磷酸酪氨酸特异性抗体作western印染分析验证含PY20反应蛋白的组分。
抗体的筛选
作为EphA2免疫反应性的初步筛选,筛检大量培养的杂交瘤上清液对EphA2的免疫反应性。设计免疫策略来鉴定活的肿瘤细胞上的胞外EphA2表位。因此采用荧光ELISA方法(FluorELISA)选择抗体对活细胞的反应性。这种筛选方法适合免疫印染分析,倾向于筛选能识别构型限制性表位的抗体。
用报导的分析方法的改进方法监测抗EphA2抗体与EphA2受体的细胞表面结合(Kilpatrick等.,1998.Hybridoma.17:576)。用0.1M磷酸钠(pH8.0)将氢溴酸聚-L-赖氨酸盐(Sigma,St,Louis,MO)稀释至10μg/ml,取100微升处理96孔平底组织培养板(Costar,Cambridge,MA)1小时。除去孔中的聚-L-赖氨酸盐,然后加入100μl的MDA-MB-231(EphA2阳性)或BT474(阴性对照)细胞悬液,浓度为每孔3×104细胞。37℃,5%CO2培养过夜,轻轻除去培养液,将100μl杂交瘤上清液加到细胞上室温培养1小时。用1×Dulbecco磷酸缓冲盐水(pH7.1)(GIBCO,Grand Island,NY)洗涤样品三次。加入用PBS稀释至2μg/ml的羊抗鼠Alexa Fluor 488抗体(100μl;分子探针,Eugene,OR),室温培育1小时。用PBS洗涤细胞后,各孔加入50μl含2%FCS的PBS,然后用倒置荧光显微镜(Model DM-IRB,Leica,Deerfield,IL)观察。
FluorELISA鉴定出着染的44批杂交瘤,其着染EphA2过度表达的肿瘤细胞(MDA-MB-231),但不着染EphA2缺乏的细胞(BT474)(数据未显示)。用免疫荧光显微镜证实了免疫反应性,显示为弥散性膜染色模式,这与我们先前的EphA2亚细胞定位研究(如Zelinski等.,2001,Cancer Res.61:2301和Zantek等.,1999,Cell Growth Diff.10:629)相一致。基于阳性靶细胞强免疫染色而缺陷性细胞无免疫染色,用流式细胞仪先选出用于亚克隆的多批杂交瘤培养物。然后将多批杂交瘤培养物用流式细胞仪亚克隆,并对亚克隆的杂交瘤上清液重复进行FluorELISA。
6.2EphA2单克隆抗体降低了肿瘤细胞的代谢性能
6.2.1EphA2的磷酸化和降解
EphA2抗体促进了MDA-MB-231细胞的EphA2酪氨酸磷酸化和降解(图1A-1C)。在存在EA5(图1A-1B。泳道2,3)或EA2(图1A-1B,泳道4,5)或对照(图1A-1B,泳道1)时37℃培养细胞单层8分钟。然后用EphA2特异性抗体(D7,购自Upstate Biological,Inc.Lake Placid,NY和予2000年12月8日保存于美国典型培养物保藏中心(American Type TissueCollection),ATCC编号是PTA2755)免疫沉淀细胞裂解液,用SDS-PAGE溶解并用磷酸酪氨酸特异性抗体(4G10,购自Upstate Biological,Inc.LakePlacid,NY)作western印染分析(图1A)。膜切成条,采用免疫沉淀所用的EphA2特异性抗体(D7)作为对照再检测。
如前文所述(Zantek等.,1999,Cell Growth Diff 10:629-38)进行western印染分析和免疫沉淀。简而言之,用含1%Triton X-100(Sigma,St,Louis,MO)的Tris缓冲盐水抽提细胞单层得到洗涤剂提取物。测定蛋白质浓度(BioRad,Hercules,CA)后,免疫沉淀获得1.5mg细胞裂解物,用SDS-PAGE溶解后转移到硝酸纤维素膜(Protran,Schleicher and Schuell,Keene,NH)上。用增强的化学发光(Pierce,Roekford,IL)和放射自显影(KodakX-OMAT,Rochester,NY)检测抗体的结合。
与EphA2拮抗性EA5和EA2抗体培育后发现EphA2的磷酸化提高(图1B)。在存在30ug/ml EA5(图1C,泳道2、3)或EA2(图1C,泳道4、5)或对照(图1C,泳道1)时37℃培养MDA-MB-231细胞单层24小时。然后用SDS-PAGE溶解细胞裂解物并用EphA2特异性(D7)进行western印染分析。与抗体一起培育EphA2蛋白水平提高。
用A549细胞进行相似的试验。在存在EA5或EA2或对照(PBS)时37℃培养A549细胞单层10分钟(图2A-2B)或5小时(图2C-2D)。然后用EpgA2特异性抗体(D7)免疫沉淀细胞裂解液,用SDS-PAGE溶解并用磷酸酪氨酸特异性抗体(4G10,购自Upstate Biological,Inc.Lake Placid,NY)进行western印染分析(图2A,2C)。膜切成条,采用免疫沉淀所用的EphA2特异性抗体(D7)作为对照再检测(图2B,2D)。抗体培育10分钟导致磷酸化提高(图2A)。培育5小时,这些抗体导致EphA2蛋白降解(图2D)。
6.2.2软琼脂培养
将肿瘤细胞悬浮于软琼脂中。按Zelinski等(2001,CancerRes.61:2301-6)所述检测软琼脂中形成的细胞集落。在底部和顶部琼脂液中培育抗体或对照溶液(PBS)。从悬浮时开始计算,在存在纯化抗体或对照溶液(PBS)的软琼脂中37℃悬浮培养细胞7天。用带有40×目镜的Olympus CK-3倒置相差显微镜观察形成的集落并评分。至少含三个细胞的集落评为阳性。标出每个高倍视野的平均集落数。在每次实验中将10个不同的显微镜高倍视野平均化,所显示的结果代表至少三次不同的实验。
用10μg/ml或2.5μg/ml的EA5或EA2单克隆抗体或对照(PBS)培育A549恶性肺癌细胞。所用的所有抗体量均抑制了软琼脂中细胞的生长(图3A)。良性MCF-7乳腺上皮细胞因过度表达EphA2而转变成恶性细胞(MCF-7EphA2)。用EA5单克隆抗体或对照(PBS)培养二种肿瘤细胞。EA5抑制了MCF-7EphA2细胞在软琼脂中的生长。良性MCF-7细胞与或不与此抗体一起培养均不能在软琼脂中形成集落(图3B)。结果报告为每个高倍视野(HPF)下的集落数。对照实验证实,针对EphA2胞内表位的同型-匹配抗体(IgG1)或对照抗体(如抗桩蛋白抗体)均不能减少软琼脂中的集落形成(数据未显示)。
6.2.3MATRIGELTM中管状网络的形成
在三维环境中,如MATRIGELTM中肿瘤细胞的行为可可靠地预测乳腺上皮细胞的分化状态和侵袭性。在存在EphA2抗体(10μg/ml)或对照溶液(PBS)的MATRIGELTM上培养单层良性(MCF-10A)或恶性(MDA-MB-231)乳腺上皮细胞。按Zelinski等(2001,Cancer Res.61:2301-6)所述分析细胞在MATRIGELTM上的行为。简而言之,将组织培养皿37℃用MATRIGELTM(Collaborative Biomedical Products,Bedford,MA)包被,然后加入已在冰上与EphA2拮抗性抗体或对照溶液(PBS)培育了1小时的1×105个MDA-MB-231或MCF-10A细胞。37℃在MATRIGELTM上培育细胞24小时,用Olympus IX-70倒置显微镜评估细胞行为。所有影象记录在35mm胶片(T-Max-400,Kodak,Rochester,NY)上。
24小时内,在MATRIGELTM上没有转化的MCF-10A上皮细胞形成腺泡样小球,而MDA-MB-231细胞迅速装配成管状网络。这些网络高级侵入所有的MATRIGELTM。加入EphA2拮抗性抗体阻止了该管状网络的形成。
6.2.4体内生长
EA5可抑制体内肿瘤细胞的生长。在无胸腺小鼠的同位或皮下植入5×106个MDA-MB-231乳腺癌细胞,并皮下植入5×106个A549肺癌细胞。肿瘤长到平均体积100mm3时给予小鼠6mg/kg的EA5或阴性对照(PBS或1A7抗体),腹腔注射每周二次共三周。最后一次处理后至少二周或肿瘤超过2,000mm3后处死小鼠。评估肿瘤的生长,表示为肿瘤体积除以原先肿瘤(100mm3)之比或肿瘤的总体积。EA5抑制了同位植入的MDA-MB-231细胞的生长(图4A)。皮下植入的A549细胞也受到EA5的抑制(图4C)。
6.3乳腺癌细胞中的雌激素依赖性
用人EphA2(MCF-7EphA2)(T Hunter,Scripps Institute博士提供的pNeoMS-EphA2)转染雌激素敏感性乳腺癌MCF-7细胞并使其稳定地过度表达人EphA2(MCF-7EphA2)。Western印染分析证实与匹配的对照细胞相比,EphA2在转染的细胞中异常过度表达(数据未显示)。
EphA2的过度表达提高了恶性生长(图5A-5B)。如下进行生长分析。将MCF-7neo(对照细胞)或MCF-7EphA2细胞接种在96孔板中。用Alamar兰(Biosouce International,Camarillo,CA)按制造商的建议测定细胞的生长。如前所述(Zelinski等,2001,Cancer Res.61:2301-6)在软琼脂中形成集落,用显微镜评分,将至少三个细胞的组定义为阳性。数据代表了每份样品10个不同高倍视野的平均值,并代表至少三次不同的实验结果。误差条代表至少三次不同实验的平均值的标准差,用Microsoft Excel软件测定。
虽然MCF-7细胞大都不能在软琼脂中形成集落(平均每视野0.1个集落),但MCF-7EphA2细胞形成了更大更多的集落(每视野4.7个集落;P<0.01),并维持至少三周(图5A,数据未显示)。尽管软琼中集落增加,但MCF-7EphA2细胞在单层培养时的生长与匹配的对照不同(图5B),这表明在模仿非锚定依赖性(恶性)细胞生长的试验条件下EphA2的生长促进活性最为显著。
与软琼脂集落增加相一致,同位植入的MCF-7EphA2细胞在体内形成了更大、生长更快的肿瘤。6-8周龄的无胸腺(nu/nu)小鼠购自Harlan SpraqueDawley(Indianapolis,IN)。如所示,在肿瘤植入后24小时通过无菌14号套管针皮下注射控释的雌二醇片(0.72mg 17β-雌二醇,60天配方),药片每隔60天换一次,这些实验持续60天以上。在直视下将1×106个MCF-7neo或MCF-7EphA2细胞注射到乳腺脂肪垫中。通过口饲管每周6天给予所示的它莫西芬(1mg)。
在存在辅助的雌激素(17β-雌二醇,购自Sigma)的情况下,MCF-7EphA2细胞与匹配的对照相比显示出肿瘤体积增加二倍(图6A)。EphA2过度表达肿瘤在表型上与对照肿瘤不同,它们在切除时具有更多的脉管且局部侵入更广(数据未显示)。为了验证这些肿瘤表达的EphA2,对切除肿瘤的全细胞裂解物用EphA2特异性抗体作western印染分析(图6B)。将膜切成条,用β连环蛋白抗体再检测以证实样品的加载量相等。肿瘤样品比输入细胞中的EphA2的相对量要高(植入前),这表明肿瘤产生高水平的EphA2细胞。体外和体内模型的比较研究表明,EphA2的过度表达产生更具侵袭性的表型。
在不存在外源雌激素的情况下进行平行研究。实验性除去雌激素扩大了对照与MCF-7EphA2细胞之间的差异。虽然MCF-7EphA2细胞在软琼脂中比匹配的对照仍然更有效地形成集落,但是这些细胞在没有外源雌激素存在时也生长(图7B)。相反,对照细胞的单层生长要求加入雌激素(图7B)。此外,MCF-7EphA2细胞在不存在辅助的雌激素时保留了产生肿瘤的能力。对照的MCF-7细胞几乎不形成明显的肿瘤,而MCF-7EphA2细胞形成的肿瘤可持续12周以上(图7C,数据未显示)。因此体外和体内试验系统均证实了EphA2的过度表达减少了对外源性雌激素的需求。
检测MCF-7EphA2细胞对它莫西芬的敏感性。它莫西芬(4-羟基它莫西芬,购自Sigma)减少了对照MCF-7细胞在软琼脂上形成的集落的至少60%。它莫西芬对MCF-7EphA2细胞的抑制作用较弱(25%抑制,图8A)。显然,过量的雌二醇消除了它莫西芬的抑制作用,这为本发现的特异性提供了额外的证据。相似地,MCF-7EphA2细胞相对于对照(MCF-7neo细胞)对它莫西芬具有较低的敏感性(图8)。
因为它莫西芬的敏感性常与雌激素受体表达有关,因此检测了MCF-7EphA2细胞中的雌激素受体的表达和活性。Western印染分析表明,在对照和MCF-7EphA2细胞中ERα和ERβ的水平相当(图9A-9B)(ERα和ERβ抗体购自Chemicon Temecula,CA)。而且在对照与MCF-7EphA2细胞中测得的雌激素受体活性相当,并且此酶活性仍对它莫西芬敏感(图9E-9F)。用ERE-TK-CAT载体(其编码单一ERE;为Indiana大学医学院的Nakshatri博士馈赠)测定了在非刺激状态下、雌二醇(10-8M)刺激后和它莫西芬(10-6M)抑制时雌激素受体的活性。在无酚红、木碳剥离了血清的培养基中接种细胞,培养二天,用磷酸钙法以ERE-TK-CAT转染细胞。共转染β-半乳糖苷酶表达载体RSV/β-半乳糖苷酶(2μg,Nakshatri博士馈赠)作为对照。转染后24小时加入新鲜的含有适当选择性药物的培养基。24小时后收集细胞,如(Nakshatri等.,1997,Mol Cell Biol.17;3629-39)所述评价CAT活性。这些结果表明在MCF-7EphA2细胞中的雌激素受体得到表达并保持对它莫西芬的敏感性,因而表明了MCF-7EphA2细胞对雌激素的依赖性降低是因为雌激素的下游信号。
在软琼脂中测试了EphA2表达水平得到降低的MCF-7EphA2细胞。EphA2单克隆抗体EA5诱导了EphA2活化和随后的降解。在EA5处理后二小时内EphA2的表达水平降低,在随后的至少24小时内EphA2保持检测不到(图10A)。对照MCF-7细胞的软琼脂集落形成对它莫西芬敏感(图10C),而EA5不能进一步改变这种应答(因为这些细胞缺乏内源性EphA2)。与匹配的对照(它莫西芬产生75%抑制)相比,MCF-7EphA2细胞对它莫西芬不大敏感(它莫西芬产生25%抑制)。而EA5减少了软琼脂中的集落形成(达19%),EA5和它莫西芬联用使软琼脂中的集落形成大大减少(>80%)。因此,EA5处理恢复表型与对照MCF-7细胞相当。这些发现表明,EphA2的抗体处理可使乳腺肿瘤细胞重新对它莫西芬敏感。
用Microsorft Exel(Seattle,WA)作Student检验进行了所有的统计学分析,P<0.05定义为显著差异。用GraphPad软件(San Diego,CA)进行了体内肿瘤生长的分析。
6.4前列腺上皮内肿瘤中EphA2的表达
EphA2免疫反应可区分瘤性前列腺上皮细胞和其非瘤性细胞。从Indiana大学医学中心外科病历挡案中获得93例根治性前列腺切除术。患者的年龄为44-77岁(平均=63岁)。按照Gleason系统对根治性前列腺切除术样品的原发肿瘤进行分级(Bostwick“Neoplasms of the prostate”,Bostwick和Eble编.,1997,Urologic Surgical Pathology.St Louis:Mosby,343-422页;Gleson和Mellinger,1974,J Urol.111:58-64)。该Gleason级数为4-10级。根据1977 TNM(肿瘤、淋巴节和转移)标准(Fleming等.,1977,AJCC CancerStaging Manul Philadephia:Raven和Lippincott)评估病理学阶段。病理学阶段是T2a(n=9位患者)、T2b(n=43)、T3a(n=27)、T3b(n=14)。手术时有13位患者淋巴节转移。
采用福尔马林固定的根治性前列腺切除样品的一系列5微米厚切片作免疫荧光染色。选出含有最大数目肿瘤和最高Gleason等级的组织段。分析各病例的一张代表性切片。用二甲苯给切片脱蜡二次共5分钟,通过分级乙酸和蒸馏水再水合。在EDTA(pH8.0)中加热切片30分钟回收抗原。用3%H2O2培育15分钟使内源性过氧化物酶失活。用蛋白质封闭剂(DAKO)封闭非特异性位点20分钟。然后用小鼠抗人EphA2单克隆抗体(IgG1,1:100稀释)室温培育组织切片过夜,然后加入生物素化第二抗体(DAKO公司,Carpintera,CA)和过氧化物酶标记的链霉亲和素,并在存在过氧化氢时将3,3-二氨基联苯胺作为生色原。每次试验同时设阳性和阴性对照。
评价了各病倒同一切片的良性上皮、高级前列腺上皮内肿瘤(PIN)和腺癌的着色范围和强度。选择具有最高程度的免疫反应的显微镜视野进行分析。各病倒分析至少1,000个细胞。从0至95%以5%的递增半定量评价各病倒显示着色的细胞百分数。强度评分设为0-3级(0不着色,1弱着色,2中度着色和3强着色)(Jiang等.,Am J Pathol.160:667-71;Cheng等.,1996,Am J Pathol.148:1375-80)。
用Wilcoxon配对秩和检验比较了良性上皮、高级前列腺上皮内肿瘤(PIN)和腺癌中免疫反应细胞的平均百分数。用Cochran-Mantel-Haenszel检验比较了良性上皮、高级前列腺上皮内肿瘤(PIN)和腺癌中EphA2着色的强度获得校正的有序确切数据。如果ANOVA显示有显著差异,则进行配对比较。P值<0.05认为有显著性,所有P值都是双侧性的。
在所有高级前列腺上皮内肿瘤(PIN)和癌肿都观察到EphA2免疫反应,但在良性上皮细胞癌中没有观察到。例如,在高级前列腺上皮内肿瘤(PIN)和癌中,EphA2表达(免疫反应细胞平均百分数和着色强度)相对于良性上皮细胞增加(表3和4)。相似地,与高级PIN相比,前列腺癌中的EphA2免疫反应(免疫反应细胞平均百分数和着色强度)增加(表3和4)。此免疫反应显示位于瘤性上皮细胞的细胞膜和胞浆中(数据未显示)。相反,肿瘤附近的基底细胞中未观察到EphA2免疫反应。在高级PIN组中,22%显示1级着色强度,73%显示2级着色强度,5%显示3级着色强度(表3)。在腺癌组中,13%病例显示1级着色强度,50%显示2级着色强度,37%显示3级着色强度。相反,正常上皮组66%病例显示1级,其余病例未显示有EphA2蛋白免疫反应(0级着色强度)(表3)。正常上皮细胞中EphA2免疫反应细胞的平均百分率为12%,高级PIN中为67%,前列腺腺癌中为85%(表4)。
虽然高水平的EphA2不能区分瘤性和良性前列腺上皮细胞,但是EphA2与疾病严重程度的其它组织学和病理学参数的确无关。例如,在大多数前列腺癌中都观察到高水平的EphA2,且高水平的EphA2与Gleason等级、病理阶段、淋巴节转移、前列腺外延伸、手术边界、血管入侵、外周神经入侵或前列腺其它区域中是否存在高级PIN无关(表5)。
表3
细胞类型 | 着色强度等级 | |||
0 | 1 | 2 | 3 | |
良性上皮 | 31(33%0 | 61(66%) | 1(1%) | 0(0%) |
高级PINa | 0(0%) | 20(22%) | 68(73%) | 5(5%) |
腺癌a,b | 0(0%) | 12(13%) | 47(50%) | 34(37%) |
a表示用Wilcoxon配对秩和检验,着色强度百分率在统计学上低于正常细胞,P值=0.0001。b着色强度显著高于高级PIN(P<0.01,Cochran-Mantel-Henszel检验。)
表4
细胞类型 | 细胞着色平均值±SD | 范围 |
正常细胞 | 12±17 | 0-90 |
高级PIN | 67±18a | 5-95 |
腺癌 | 85±12a,b | 30-95 |
a表示用Wilcoxon配对秩和检验,着色百分率在统计学上低于正常细胞,P值=0.0001。
b着色百分率在统计学上高于高级PIN(p<0.01,ANOVA)。
表5
患者特征 | 患者总数的百分比%(n=93) | w/EpbA2抗体细胞着色的平均值(SD) | EphA2抗体着色强度的平均值(±SD) |
Gleason一级 | 2 | 12 | 83±2 | 2.0±0.6 |
3 | 43 | 86±10 | 2.3±0.7 | |
4 | 23 | 84±16 | 2.3±0.7 | |
5 | 15 | 86±11 | 2.3±0.6 | |
Gleason二级 | 2 | 15 | 82±16 | 2.3±0.5 |
3 | 29 | 85±15 | 2.1±0.6 | |
4 | 35 | 85±9 | 2.3±0.7 | |
5 | 14 | 88±8 | 2.4±0.8 | |
Gleason总数 | <7 | 28 | 83±12 | 2.2±0.6 |
7 | 35 | 85±14 | 2.2±0.7 | |
>7 | 30 | 87±10 | 2.4±0.7 | |
T分类 | T2a | 9 | 89±6 | 2.3±0.5 |
T2b | 43 | 84±12 | 2.2±0.7 | |
T3a | 27 | 84±15 | 2.2±0.7 | |
T3b | 14 | 63±10 | 2.4±0.6 | |
淋巴节转移 | 阳性 | 13 | 88±9 | 2.3±0.6 |
阴性 | 80 | 84±13 | 2.2±0.7 | |
前列腺外延伸 | 阳性 | 53 | 86±11 | 2.3±0.7 |
阴性 | 40 | 84±14 | 2.2±0.7 | |
手术边界 | 阳性 | 50 | 86±11 | 2.1±0.6 |
阴性 | 43 | 84±13 | 2.4±0.7 | |
血管入侵 | 阳性 | 30 | 85±11 | 2.1±0.8 |
阴性 | 63 | 86±13 | 2.3±0.6 |
外周神经入侵 | 阳性 | 82 | 82±15 | 2.4±0.5 |
阴性 | 11 | 85±12 | 2.2±0.7 | |
高级PIN | 阳性 | 89 | 85±12 | 2.3±0.7 |
阴性 | 4 | 85±9 | 2.0±0.8 |
6.5转移癌患者的治疗
设计了一项研究来评估本发明的激动性单克隆抗体在转移性乳腺癌患者中的药物动力学性能和安全性。癌患者目前接受紫彬醇或Taxotere治疗。患者目前接受的治疗允许继续采用这些药物。
给予患者单一静脉注射剂量的本发明的单克隆抗体,在开始4周后每周重复给予相同剂量的静脉剂量,持续12周,然后分析。评估用本发明的激动性单克隆抗体静脉注射26周治疗的安全性和该疾病活动的可能变化。不同组患者接受1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg或8mg/kg剂量治疗并作类似评价。
为静脉内注射将本发明的抗体配成5mg/ml和10mg/ml。为了进行该研究,本发明抗体也要配成100mg/ml给药。
按肿瘤生长的进展测定或确定变化。
6.6EphA2抗体的表位分析
表征了EphA2抗体的表位。EA5和EA2选择性结合恶性细胞。如免疫荧光染色所示,抗EphA2单克隆抗体EA5和EA2结合恶性MDA-MB-231乳腺上皮肿瘤细胞(图11A-11B)强于结合良性MCF-10A乳腺上皮肿瘤细胞(图11C-11D)。此外EA5对恶性前列腺细胞有免疫反应性。抗EphA2单克隆抗体EA5鉴定出了福尔马林固定、石蜡包埋的临床标本中的恶性前列腺癌细胞。
EA5优先结合在癌细胞而不是非癌细胞上暴露的表位。用3%福尔马林液固定并用偶联有荧光的抗小鼠IgG免疫标记后,4℃将未转化的MCF-10A细胞或转化的MDA-MB-231细胞与10μg/ml EA2培育30分钟。EA5优先结合转化细胞上的EphA2(图13D)。相反,另一种EphA2抗体Eph099B-233.152(ATCC登记号PTA-5194;见2003年5月12日提交的题为“EphA2 Monoclonal Antibodies amd Methods of Use Thereof”的未决美国专利申请10/436,782,此抗体结合在转化和未转化细胞上表达的EphA2(图13A-13B)。用4mM EGTA处理未转化MCF-10A细胞20分钟,使该细胞解离。EA5结合EGTA解离细胞而不是未处理细胞上的EphA2(图14A-14B)。
用MCF-10A或MDA-MB-231细胞进行同样实验。用流式细胞仪测定结合EphA2的EA5的量(图14C-14D)。细胞在冰上在4mM EGTA中培育处理10-15分钟(上图),或在不用EGTA处理(中图),接着与10μg/ml EA5一起培育。然后用3%福尔马林固定,并用荧光标记的驴抗小鼠IgG标记。对照细胞仅在不存在第一抗体(EA5)的情况下与第二抗体(荧光标记的驴抗小鼠IgG)一起培育(下图)。然后用流式细胞仪(Becto Dikinson FACSStarPlus)评价样品。EGTA处理不影响EA5与转化细胞的结合(图14D,上、中图)相反,在EGTA中培育不提高EA5与未转化细胞的结合(图14C,上、中图)。
EA5不结合与EphA2配体EphrinA1相同的表位。4℃用10mg/ml EphrinA1-Fc包被微量滴定板过夜。将含有与人IgG1恒定区相连接的EphA2胞外结构域的融合蛋白(EphA2-Fc)与固定的Ephrin A1-Fc一起培育并结合。将生物素化的Ephrin A1-Fc与EphA2-Ephrin A1-Fc复合物一起培育并测定结合的量。只有非常少的EphrinA1-Fc与EphA2-EphrinA1-Fc复合物结合,而相反,相当水平的EA5与该EphA2-EphrinA1-Fc复合物结合(图15A)。
如上所述制备EphA2-EphrinA1-Fc复合物。将生物素化EA5(10μg/ml)与该复合物一起培育30分钟。以所示量将非标记的竞争物与EphA2-EphrinA1-Fc-EA5复合物一起培育。未标记的EA5替换了浓度为10ng/ml或更高的标记的EA5。未标记的EphrinA1-Fc明显不能替换标记的EA5(图15B)。
7等价物
无需经过更多的常规实验,本领域技术人员知道或能够确定,有许多本文所述的本发明的具体实施方案的等同物。这些等同物都包括在以下权利要求的范围内。本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均纳入本文作为参考,如同各出版物、专利或专利申请特定或个别地纳入作为参考一样。
Claims (20)
1.一种分离的抗体,所述抗体特异性结合EphA2并诱导EphA2的磷酸化,其中所述抗体由保存在ATCC登记号为PTA-4381的杂交瘤产生。
2.一种分离的抗体,所述抗体特异性结合EphA2并诱导EphA2的磷酸化,其中所述抗体包含氨基酸序列为SEQ ID NO:21的VH链,和氨基酸序列为SEQ ID NO:17的VL链。
3.一种分离的抗体,所述抗体特异性结合EphA2并诱导EphA2的磷酸化,其中所述抗体包含氨基酸序列为SEQ ID NO:18的VL CDR 1、氨基酸序列为SEQ ID NO:19的VL CDR2、氨基酸序列为SEQ ID NO:20的VL CDR3、氨基酸序列为SEQ ID NO:22的VH CDR1、氨基酸序列为SEQ ID NO:23的VHCDR2、以及氨基酸序列为SEQ ID NO:24的VH CDR3。
4.如权利要求2或3所述的抗体,其中所述抗体是单克隆抗体、人源化抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、F(ab′)片段、或嵌合抗体。
5.如权利要求1、2或3所述的抗体,其中所述抗体与异源多肽偶联或融合。
6.如权利要求1、2或3所述的抗体,其中所述抗体与诊断性或检测性试剂偶联或融合。
7.如权利要求1、2或3所述的抗体,其中所述抗体与治疗性试剂偶联或融合。
8.如权利要求7所述的抗体,其中所述治疗性试剂是细胞毒素。
9.如权利要求8所述的抗体,其中所述细胞毒素是紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴乙非啶、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、鬼臼噻吩甙、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放射菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、心得安、嘌呤霉素、表柔比星、或环磷酰胺。
10.如权利要求7所述的抗体,其中所述治疗性试剂是相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞杆菌外毒素、霍乱毒素、白喉毒素、TNFα、TNFβ、α-干扰素、β-干扰素、或血小板生长因子。
11.如权利要求7所述的抗体,其中所述治疗性试剂是放射活性物质或大环螯合剂。
12.分离的核酸,其编码权利要求1、2或3所述抗体。
13.含有如权利要求12所述核酸的载体。
14.如权利要求13所述的载体,其还含有转录和翻译控制信号。
15.基因工程构建的宿主细胞,其含有或表达如权利要求12所述的核酸。
16.基因工程构建的宿主细胞,其含有如权利要求13或14所述的载体。
17.一种药物组合物,其含有如权利要求1-3任一项所述的抗体以及药学上可接受的载体。
18.权利要求1-3任一项所述抗体在制备治疗与EphA2过度表达有关的癌症患者的药物中的应用,其中所述癌症是肺癌或乳腺癌。
19.如权利要求18所述的应用,其中所述患者是人。
20.如权利要求19所述的应用,其中所述人难以被之前的治疗方法治疗。
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