CN109879964A

CN109879964A - 抗egfr单链抗体、抗pd1单链抗体及融合蛋白

Info

Publication number: CN109879964A
Application number: CN201711276666.XA
Authority: CN
Inventors: 李峥; 郝中禾
Original assignee: Refitter (beijing) Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Keli Thinking Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-12-06
Filing date: 2017-12-06
Publication date: 2019-06-14
Anticipated expiration: 2037-12-06
Also published as: CN109879964B

Abstract

本发明公开了一种抗表皮生长因子受体单链抗体、抗PD1单链抗体及融合蛋白及其应用，所述双特异单链抗体具有高度特异性的抗原识别能力，既具有抗体的特异性识别作用，同时又具有优异的抗肿瘤效果，而且该抗体融合蛋白的分子量小，可以在原核细胞表达系统中表达，大大降低了抗体药物的生产成本，具有良好的临床应用前景。

Description

抗EGFR单链抗体、抗PD1单链抗体及融合蛋白

技术领域

本发明公开了一种抗EGFR单链抗体及抗PD1单链抗体的双特异抗体，属于免疫学和分子生物学领域。

背景技术

肿瘤是威胁人类生存最大的疾病。世界卫生组织研究显示，2012年中国癌症发病人数为306.5万，约占全球发病的五分之一；癌症死亡人数为220.5万，约占全球癌症死亡人数的四分之一。

肿瘤的形成和发展具有非常复杂的调节机制，有非常多的生物效应分子参与其中。明晰这些生物效应分子的作用机制，对于肿瘤疾病的预防和治疗具有重要的意义。

表皮生长因子受体是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体，普遍表达于人体的表皮细胞和基质细胞，并在多种人类恶性肿瘤中存在高表达，与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。EGFR的高表达可以促进肿瘤细胞的增殖、血管生成、粘附、侵袭和转移。EGFR信号传导关乎细胞的凋亡、增殖、分化、迁移和细胞周期循环，与肿瘤的形成和恶化息息相关。通过阻断EGFR与其配体的结合可以抑制EGFR向胞内的信号传导，从而起到抑制肿瘤细胞生长、迁移的效果。

运用免疫检测点抑制剂治疗肿瘤是一次革命性的肿瘤治疗。其中抗体阻断肿瘤细胞和T细胞之间PD-L1和PD1相互作用的治疗方式被认为是最有效和最安全的方式。PD1是I型跨膜蛋白，通常表达在T,B和NK细胞表面。它的配体PD-L1是抗原递呈共刺激分子B7家族的成员，表达在多种细胞表面，包括肿瘤细胞。当配体PD-L1与PD1结合后，PD1与TCR相互作用向细胞内传递抑制性信号。导致T细胞对肿瘤细胞无应答。如果抗体阻断了PD-L1与PD1之间的结合，则大大提高了T细胞的细胞免疫应答效率，提高了T细胞杀伤肿瘤的效率。

传统的治疗肿瘤的方法是手术或者放、化疗。随着近年生物制药技术的发展，一批优质的抗肿瘤抗体药物的问世，使得一些难治性肿瘤的生存率大大提高。抗体药物已作为肿瘤患者常规的治疗药物之一，预计2020年，单抗药物的销售额将达到2000亿美元。自从1984年第一个基因工程抗体人－鼠嵌合抗体诞生以来，新型基因工程抗体不断出现，如人源化抗体、单价小分子抗体(Fab、单链抗体、单域抗体、超变区多肽等)、多价小分子抗体(双链抗体，三链抗体，微型抗体)、某些特殊类型抗体(双特异抗体、抗原化抗体、细胞内抗体、催化抗体、免疫脂质体)及抗体融合蛋白(免疫毒素、免疫粘连素)等等。另外，用于制备新型抗体的噬菌体抗体库技术成为继杂交瘤技术之后生命科学研究中又一突破性进展。

对于血液性肿瘤，全分子抗体药物具有优势，它们可以激活补体和免疫细胞将血液中游走的肿瘤细胞杀死，但是对于实体肿瘤，由于全分子抗体药物分子量大，进入不到实体瘤内部，它们的抗肿瘤效果不理想。而小分子抗体却可以轻松进入实体瘤内部发挥抗肿瘤作用。未来的抗体药物将以小分子抗体药物为主。小分子抗体药物尤其对中国来说更为必须，因为在中国多发的肺癌、肝癌和消化道系统肿瘤中绝大多数都是实体性肿瘤。中国男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。而在肺癌中也有些是死亡率非常高的转移性肿瘤，如肺癌的脑转移发生率可以达到35％～50％，多个部位的骨转移发生率可以达到50％。对于脑和骨转移的癌症治疗，小分子抗体药物就可以发挥其无法替代的抑制转移作用。

目前小分子抗体开发成药物主要以两种形式为主，一种是抗体偶联复合物(Antibody conjugate complex，ADC)，另一种是双特异抗体。抗体-药物偶联物是一种新型的靶向治疗，比如抗肿瘤治疗中，ADCs由一个抗体或一个抗体片段ScFv连接着一个有效载荷的药物(通常是毒素)形成一个免疫复合物。抗体使这个免疫复合物结合到特定的肿瘤细胞上，通常这个免疫复合物会内化到肿瘤细胞内部，然后药物释放到细胞内引起肿瘤细胞损伤和死亡。抗体偶联复合物虽然具有很好的肿瘤识别能力和抗瘤效应，但是其制备过程中需要与另外的化学基团偶联，不仅增加了制备成本，还难以保证产物的均一性，偶联的化学基团与抗体的抗原识别区往往还容易产生空间位阻效应，有时对机体还具有毒副作用，这些因素都影响抗体偶联复合物实际的抗瘤效果。

小分子抗体片段的另外一个应用方面是双特异抗体。双特异性抗体(BsAbs)就是可以识别两个不同表位的抗体。相比正常抗体，BsAbs在癌症治疗中有一些无法比拟的优势：1.BsAbs可增强特异性免疫细胞对肿瘤细胞杀伤作用。2.BsAbs可以同时作用于两种不同的通路，发挥独特或加倍的抗肿瘤作用。3.BsAbs可识别靶细胞表面两个抗原表位，增强结合能力。

发明内容

基于现有技术存在的问题，本发明的目的是研发出一种具有双重识别功能的特异性单链抗体，进而提供一种介于上述两种新型抗体药物之间的具有增强了的抗肿瘤作用的双特异抗体。

基于上述发明目的，本发明首先提供了一种抗表皮生长因子受体的单链抗体，所述抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2和3所示，所述抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、6和7所示。

在一个优选的技术方案中，所述抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4和8所示。

在一个更为优选的技术方案中，所述抗体的轻链可变区和重链可变区通过连接多肽相连，作为优选，所述连接多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

其次，本发明还提供了另一种抗PD1的单链抗体。所述抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10、11和12所示，所述抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.14、15和16所示。

在一个优选的技术方案中，所述抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13和17所示。

在一个更为优选的技术方案中，所述抗体的轻链可变区和重链可变区通过连接多肽相连，作为优选，所述连接多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。

在一个最为优选的技术方案中，所述双特异单链抗体的连接顺序为抗表皮生长因子受体单链抗体的重链可变区和轻链可变区连接抗PD1单链抗体的轻链可变区和重链可变区。在本发明的具体实施方式中，所述融合蛋白(双特异单链抗体)的氨基酸序列如SEQ IDNO.19所示。

本发明选取具有确定性肿瘤组织表面标记表皮生长因子受体蛋白EGFR和具有确定性T淋巴细胞抑制作用的PD1入手，利用噬菌体抗体库方法筛选高亲和力抗EGFR和PD1的ScFv，然后利用连接短肽linker将两种单链抗体串联起来，构建成双特异抗体。

本发明将两种特异性的单链抗体用分子生物学技术串联在一起，利用其抗表皮生长因子受体一端识别肿瘤细胞，另一端利用抗PD1单链抗体识别并激活T淋巴细胞，从而达到清除肿瘤细胞的作用。

本发明独特的发明构思在于将两种单链抗体串联成双特异抗体，不仅能拓宽了抗肿瘤方式，而且还增强了的抗肿瘤作用。在结合试验中，两种单链抗体均与各自的蛋白具有较高水平的亲和力，而且单链抗体与靶蛋白的结合均可以被它们相应的配体阻断。另外，双特异抗体也可以增强外周血T淋巴细胞对肿瘤细胞的非特异性杀伤。而且由于本发明选用的是抗体小分子片段，该双特异性抗体的分子量小，可以在原核细胞表达系统中表达，大大降低了抗体药物的生产成本。

附图说明

图1.VH和VL PCR产物鉴定图，其中泳道1VL，泳道2VH，泳道3VH+VL串联体；

图2.载体图谱和重组载体鉴定图，其中1为重组体片段pComb3XSS载体酶切图谱，2为分子量标记；

图3.EGFR-PD1双特异抗体聚丙烯酰氨凝胶电泳鉴定图

图4.筛选出的抗EGFR ScFv与EGFR蛋白的结合试验

图5.EGF对EGFR ScFv和EGFR蛋白结合的阻断试验

图6.筛选出的抗PD1ScFv与PD1蛋白的结合试验

图7.PD-L1对PD1ScFv和PD1蛋白结合的阻断试验

图8.EGFR-PD1双特异抗体促进T细胞的增殖

具体实施方式

本发明公开了一种抗EGFR单链抗体及抗PD1单链抗体的双特异抗体，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1抗EGFR和抗PD1双特异抗体的制备

1.1高库容量天然抗体库的建立。

分离人外周血单个核淋巴细胞：随机选取100个健康成年人，抽取每人外周血10ml。用含10％肝素的RPMI-1640培养液1:1稀释，加到装有淋巴细胞分离液的离心管(稀释静脉血与淋巴细胞分离液的体积比为2:1)中，2,000×g，离心17分钟。吸取淋巴细胞分离液界面乳白色单个核细胞层，PBS缓冲液洗两次。

1.2细胞总RNA的提取

按每5×10⁶cells/ml的比例加入Trizol试剂，吹打细胞使之裂解。室温孵育5min，移入经DEPC处理的EP管中，加入1/5体积的氯仿，剧烈振荡15sec，室温孵育3min。4℃，10,000×g离心15min，吸取上层水相至一个新的离心管中，加入1/2体积的异丙醇，冰浴10min。4℃，12,000×g离心10min，弃上清，加入1ml 75％乙醇清洗沉淀。4℃，7,500×g离心5min，弃上清，室温干燥沉淀，溶于无RNase的水或沉淀于无水乙醇内，-80℃保存备用。

1.3逆转录合成cDNA第一链

先用无RNase的DNaseⅠ处理总RNA以消除残存的基因组DNA。取处理过的RNA样品2μg和Oligo(dT)15(500μg/ml)1μl，补加DEPC水至12μl，70℃，加热10min。取出后马上置于冰浴中，依次加入5×Buffer 5μl；dNTP(10mmol/L)5μl；RNA酶抑制剂1μl,MMLV逆转录酶1μl,补加DEPC水至25μl，42℃，保温60min进行逆转录反应，70℃，15min灭活酶活性。

1.4PCR扩增VH和VL基因

以逆转录合成cDNA第一链为模板，采用人ScFv抗体库引物扩增所表达的VH和VL基因。反应体系如下：

加去离子水至终体积为50μl。

PCR参数：94℃变性3min后，再以94℃30sec；61℃30sec；72℃1min，进行PCR，共30个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后取5μl反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析。

PCR产物回收

(1)PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，从琼脂糖凝胶上切下目的DNA片段，放入1.5ml离心管中。

(2)加入400μl溶胶液A，70℃溶解5分钟，至凝胶全部溶解。

(3)加入200μl溶胶液B，混均后将全部液体吸入回收柱中。

(4)12,000×g离心1分钟，弃废液。

(5)加入500μl中和液，12,000×g离心1分钟，弃废液。

(6)加入700μl洗涤液，12,000×g离心1分钟，弃废液。

重复步骤6)1次。

(7)12,000×g离心2分钟，弃废液，将回收柱移入新的接收管上，室温干燥5分钟。

(8)加入30μl去离子水，12,000×g离心1分钟，洗脱DNA片段，于-20℃保存备用。

1.5搭桥PCR法进行VH和VL的拼接

将制备的VH和VL片段作为模板，进行VH和VL片段的串联。

PCR反应体系：

10×PCR反应缓冲液	5μl
		dNTP(2.5mM)	2μl
VH PCR产物	1μl
		VL PCR产物	1μl
RSC-F	1μl
		RSC-B	1μl
Pfu DNA聚合酶	1μl
		ddH<sub>2</sub>O	39μl
Total	50μl

PCR反应条件为94℃预变性5分钟，然后按如下参数进行30个循环：94℃变性30秒，60℃退火45秒，72℃延伸1分钟半，最后72℃延伸10分钟。重复胶回收步骤，PCR产物溶于30μl ddH2O中。图1为VH和VL PCR产物鉴定图，其中泳道1VL，泳道2VH，泳道3VH+VL串联体。

1.6连接到噬菌体载体上，

Sfi1酶切载体和PCR产物

10×酶切反应缓冲液	6μl
		PCR产物(或载体)	15μl
Sfi I	6μl
		ddH<sub>2</sub>O	33μl
合计	60μl

37℃酶切2小时，用相同的方法回收酶切片段。

连接反应

10×连接反应缓冲液	1μl
		酶切后PCR产物	7μl
酶切后的载体	1μl
		T4DNA连接酶	1μl
合计	10μl

上述反应物充分混匀并离心使其沉于管底后，4℃连接过夜。酶切后的片段与pComb3XSS载体片段连接，构建成重组质粒。图2为重组载体电泳鉴定图。其中，1为重组体片段pComb3XSS载体酶切图谱，2为分子量标记。

1.7转化和表达

将构建好的载体(质粒)转化(电转)到大肠杆菌内(特定的大肠杆菌)，扩增大肠杆菌并加辅助噬菌体，收集重组后的噬菌体就是噬菌体抗体库。

经检测百人天然ScFv抗体库的库容量为2*10¹⁰，完全满足抗体筛选的需要。

1.8EGFR和PD1抗体的筛选

从抗体库中取出10ul在大肠杆菌中扩增，收集扩增后的抗体库，EGFR和PD1蛋白分别包被ELISA板后加入抗体库，孵育后冲洗非特异噬菌体，消化特异结合噬菌体，富集后将消化的噬菌体感染大肠杆菌涂板，挑取单克隆菌团并小量诱导，小量诱导后的单克隆菌上清做ELISA筛选阳性克隆，经过多次验证，选取亲和力和特异性都高(亲和力达到10^-8-10^- ⁹KD)的阳性克隆进行抗体表达。图4为筛选出的EGFR ScFv与EGFR蛋白的结合试验。图6为筛选出的PD1ScFv与PD1蛋白的结合试验。其中OD值最高的抗EGFR ScFv 7号克隆和抗PD1ScFv5号克隆是本发明要保护的序列。图5为EGF阻断抗EGFR ScFv与EGFR结合试验。图7为PD-L1阻断抗PD1ScFv与PD1结合试验。由图可见EGF和PD-L1均能有效阻断单链抗体与相应蛋白的结合，而且随着浓度的增加阻断效果也增强。说明我们专利保护的抗体序列能有效阻断EGFR和PD1与其配体的结合。

将阳性克隆中的质粒提取并转化到其他表达菌，或将抗体基因连接到其他载体再转化到相应表达菌中，筛选最佳表达条件进行大量诱导表达，最后选择最佳的纯化方法及缓冲液，获得抗体蛋白。图3为表达的抗EGFR ScFv、抗PD1ScFv、EGFR-PD1双特异ScFv的聚丙烯酰氨凝胶电泳鉴定图。泳道1为抗EGFR ScFv，泳道2为抗PD1 ScFv，泳道3为空白孔，泳道4为纯化后EGFR-PD1双特异ScFv(10ug/ml)，泳道5为EGFR-PD1双特异ScFv。EGFR-PD1双特异ScFv分子量为50KD左右，而抗EGFR ScFv和抗PD1ScFv分子量均为30KD。

大肠杆菌DH5α为本室保存，基因型为：supE44ΔlacU169()hsdR17recA1end1gyr96thi-1relA1,用于质粒的扩增与转化。

大肠杆菌BL21(DE3),基因型为hsdS gal(λcIts857ind1Sam7nin5lacUV5-T7),用于重组蛋白质的表达。

pGEM-T Easy：用于PCR产物的克隆，购自Promega公司。

原核表达质粒载体pET30，pET42，pGEX-4t-1均为本室保存。

实施例2.双特异抗体的纯化

将两种ScFv的序列进行重新基因合成，使其按照抗表皮生长因子受体单链抗体的重链可变区和轻链可变区连接抗CD3E单链抗体的轻链可变区和重链可变区的顺序重新组成新的双特异抗体。抗表皮生长因子受体单链抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2和3所示，重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQID NO.5、6和7所示。轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4和8所示。连接多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

抗PD1的单链抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.10、11和12所示，重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.14、15和16所示；轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13和17所示。连接多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。

融合蛋白(双特异单链抗体)的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示。

以上由北京诺赛生物科技有限公司合成。

挑单菌落接种于5ml LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜。

将上述菌液按1:100的比例接种到一个含有400ml LB(抗生素)的锥形瓶中，37℃剧烈振荡培养2h。

加入终浓度为1mmol/L IPTG，于37℃诱导表达3-4h。

收集培养液，5,000rpm离心10min，弃上清。PBS洗菌体沉淀。

用PBS按照5ml/g重悬，冰浴下以工作10sec/300W/30次，每次间隔15sec的参数，超声破碎细胞。12,000rpm离心20min，收集上清。

重组蛋白质的纯化

将含有六个组氨酸标记的融合蛋白VEGF ScFv-GH-His6以0.45μm滤膜过滤，准备过柱。

HisTrap kit亲和柱用Binding Buffer 10ml平衡后，加入已经准备好的待纯化样品。调节流速约为8-10滴/min。

使用Binding Buffer洗柱。

使用6ml Elution Buffer洗脱柱子。分管收集洗脱液。取少量进行SDS-PAGE鉴定，富含目的蛋白的各管于-70℃保存。

实施例3.抗EGFR-PD1双特异抗体对T细胞的增殖作用

CCK8检测T细胞的增殖

收集悬浮的T细胞，1200rpm离心3min，弃上清；

加入3ml生理盐水，1200rpm离心3min，弃上清，加入4ml AIM-V培液，

计数；

取出4块96孔板，分别加入4×10⁴/孔的PIK-PD1T细胞和空白T细胞，总体积为100ul，设置3个复孔；

放入37℃，5％C0₂的培养箱培养，分别在0h，24h，48h，72h加入10ul的CCK8试剂37℃培养箱培养6h后(培养时间因细胞而异，但同一次实验培养的时间应相同)，待培液变成棕红色后，酶标仪上450nm测OD值；

分析实验结果。

结果如图8所示，加入EGFR-PD1双特异抗体的细胞孔中的T细胞随时间延长而增殖明显。说明该双特异抗体中的PD1ScFv能够明显地促进T细胞的增殖。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 瑞菲特（北京）生物科技有限公司

<120> 抗EGFR单链抗体、抗PD1单链抗体及融合蛋白

<130> PT171111

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

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<400> 1

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1

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1 5

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<213> Artifial

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20 25 30

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20 25 30

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Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

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<213> Artifial

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Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Asn Tyr Leu Ala

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35 40 45

Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp

65 70 75 80

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<210> 14

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1 5 10 15

Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly His Tyr

20 25 30

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35 40 45

Ile Ile Asn Pro Asn Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

50 55 60

Gly Arg Val Thr Val Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met

65 70 75 80

Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

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<212> PRT

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<400> 19

Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

His Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Ser Ser Arg

100 105 110

Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro

115 120 125

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser

130 135 140

Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

145 150 155 160

Trp Val Ser Phe Ile Ser Gly Arg Gly Ser Ser Ile His Tyr Ala Asp

165 170 175

Ser Val Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser

180 185 190

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr

195 200 205

Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Ser Ser Gly Tyr Leu Gly Ala Phe Asp Ile

210 215 220

Trp Gly His Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Gln Ser

225 230 235 240

Pro Ser Val Thr Ser Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly Gly

245 250 255

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Leu Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser

260 265 270

Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala

275 280 285

Ser Gln Gly Ile Asp Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

290 295 300

Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly

305 310 315 320

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

325 330 335

Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

340 345 350

Glu Tyr Lys Ile Ala Pro Gln Thr Leu Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

355 360 365

Ile Lys Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser

370 375 380

Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys

385 390 395 400

Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly His Tyr Met His Trp Val Arg Gln

405 410 415

Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Asn Gly

420 425 430

Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Val Thr

435 440 445

Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg

450 455 460

Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Gly His Gly

465 470 475 480

Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Pro Ala

485 490 495

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Thr Ser

500 505

Claims

1.一种抗表皮生长因子受体的单链抗体，其特征在于，所述抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2和3所示。

2.根据权利要求1所述的单链抗体，其特在在于，所述抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、6和7所示。

3.根据权利要求1或2所述的单链抗体，其特在在于，所述抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4和8所示。

4.根据权利要求3所述的单链抗体，其特在在于，所述抗体的轻链可变区和重链可变区通过连接多肽相连，作为优选，所述连接多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

5.一种抗PD1的单链抗体，其特征在于，所述抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10、11和12所示。

6.根据权利要求5所述的单链抗体，其特在在于，所述抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.14、15和16所示。

7.根据权利要求5或6所述的单链抗体，其特在在于，所述抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13和17所示。

8.根据权利要求7所述的单链抗体，其特在在于，所述抗体的轻链可变区和重链可变区通过连接多肽相连，作为优选，所述连接多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。

9.一种含有权利要求1和5所述单链抗体的融合蛋白。

10.根据权利要求9所述的融合蛋白，其特在在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示。