CN1381461A - 抗人肝癌单克隆抗体HAb18轻、重链可变区基因及其应用 - Google Patents

抗人肝癌单克隆抗体HAb18轻、重链可变区基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗人肝癌单克隆抗体HAb18重链和轻链可变区基因和由所述基因编码的多肽,以及所述基因和多肽在制备用于诊断和治疗肿瘤或炎症药物中的应用。本发明人应用一套设计的引物成功地从培养的肝癌特异性单抗HAb18杂交瘤细胞中克隆了抗体轻、重链可变区基因。所得重链和轻链可变区基因可编码正确的小鼠抗体可变区。基于上述已克隆到的抗人肝癌单抗HAb18轻、重链可变区基因,可以采用基因工程方法,构建和表达多种小分子基因工程抗体,如单链抗体、嵌合抗体、Fab抗体等,以便用于肝癌的诊断和治疗目的。

Description

抗人肝癌单克隆抗体HAb18轻、重链可变区基因及其应用
技术领域
本发明涉及抗人肝癌单克隆抗体HAb18重链和轻链可变区基因和由所述基因编码的多肽，以及所述基因和多肽在制备用于诊断和治疗肿瘤或炎症药物中的应用。
背景技术
肝癌是我国和东南亚地区的多发病和常见病。尤其在我国，每年死亡人数高达11万人。约占全世界肝癌总死亡人数的43％，因此研究肝癌的诊断和治疗具有重要的意义。自1975年Kohler和Milstein创建B淋巴细胞杂交瘤技术以来，各种单克隆抗体(McAb)相继出现，它们在疾病诊治的基础研究和临床应用方面发挥了积极的作用，其中肝癌单抗的研制更是为这种难治性肿瘤带来了新的希望。近二十年，关于肝癌单抗的研究大多为甲胎蛋白和铁蛋白单抗。在肝癌单抗的制备方面，多采用传统免疫方法，即以可溶性物质或肝癌培养细胞为免疫原，由于肿瘤抗原的变异或部分丢失，因而该方法难以获得高亲和性、高特异性的肝癌单抗。
用肿瘤新鲜组织制备细胞悬液免疫动物制备单抗已有成功报道。该法虽然筛选麻烦，但能较好地保持抗原性，不失为免疫动物制备单抗的好方法。本发明人用该免疫方法获得特异性肝癌单抗7株，该细胞株的建立见《单克隆抗体通讯》，1989；2：33-36，陈志南，刘彦仿，杨继震等。其中特异性较好的HAb18肝癌单抗，免疫组化染色阳性率为75％，已通过了中国药品生物制品检定所的《人用鼠源性单克隆抗体制备及质量控制要点》的要求。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种抗肝癌相关抗原HAb18G的单克隆抗体HAb18重链和轻链可变区基因，以便两者重组后可表达出特异性识别和结合肝癌相关抗原HAb18G的抗体活性片段。
本发明的另一目的在于所述基因和多肽在制备用于诊断和治疗肿瘤或炎症药物中的应用。
根据本发明的一个方面，本发明涉及一种抗肝癌相关抗原HAb18G的单克隆抗体HAb18重链和轻链可变区基因。本发明的抗肝癌单抗HAb18重链和轻链可变区基因是从能够分泌较高活性的鼠源性抗HAb18G单抗的杂交瘤细胞株HAb18中克隆的。其中所述的重链可变区基因全长为445bp，其核苷酸序列如序列表中<400>1所示，其编码的氨基酸序列如序列表中<400>3所示。所述的轻链可变区基因全长为421bp，其核苷酸序列如序列表中<400>2所示，其编码的氨基酸序列如序列表中<400>4所示，两个基因重组后可用于表达特异性识别和结合肝癌相关抗原HAb18G的抗体活性片段。
根据本发明的另一个方面，本发明还涉及所述基因和多肽在制备用于诊断和治疗肿瘤或炎症药物中的应用。
本发明人应用一套设计的引物成功地从培养的肝癌特异性单抗HAb18杂交瘤细胞中克隆了抗体轻、重链可变区基因。序列分析表明，VH基因与Kasturi，K.N等发表的抗胸腺细胞和红细胞自身抗体的重链可变区基因同源性最高。VL基因与O′Connor，K.C.等发表的抗DNA抗体6E6的轻链可变区基因的同源性最高，属于小鼠免疫球蛋白重排的κ链V-J区基因。所得VH与VL基因可编码正确的小鼠抗体可变区。基于上述已克隆到的抗人肝癌单抗HAb18轻、重链可变区基因，可以采用基因工程方法，构建和表达多种小分子基因工程抗体，如单链抗体、嵌合抗体、Fab抗体等，以便用于肝癌的诊断和治疗目的。
附图说明
图1为RT-PCR扩增的抗人肝癌单抗HAb18轻、重链可变区基因的琼脂糖凝胶电泳图，图中A为DL-2000Marker，B为HAb18重链可变区基因，C为HAb18轻链可变区基因。
图2为抗人肝癌单抗HAb18轻链可变区基因的测序图谱。
图3为抗人肝癌单抗HAb18重链可变区基因的测序图谱。
具体实施方式
抗人肝癌单抗HAb18轻、重链可变区基因的克隆。
所用细胞株为第四军医大学细胞工程研究中心采用传统的融合方法获得的一株高亲和力、高特异性的鼠源性抗人肝细胞癌单抗HAb18杂交瘤细胞株，其抗原为HAb18G分子，其分泌的抗体分子亚型为IgG1
抗HAb18G的单抗可变区基因的克隆
取处于对数生长期的HAb18杂交瘤细胞(5×106)，采用异硫氰酸胍一步法提取总RNA，取少量进行紫外分光光度计定量及1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测。随后以Oligo(dT)15(Promega公司)为随机引物，反转录合成cDNA第一链。然后，利用设计的一套通用引物成功扩增出肝癌单抗HAb18的轻、重链可变区基因(VH，VL)。扩增产物VH(约450bp)和VL(约420bp)经低溶点琼脂糖凝胶(1.5％)电泳后，切胶分离靶片段。通过凝胶纯化试剂盒(promega Inc)回收纯化后，凝胶电泳鉴定(见附图1)。之后将目的片段克隆至T载体，测序分析(见附图2，3)。
Oligo(dT)15(Promega公司)为随机引物的反转录方案如下：20μL反应体系中依次加入1μg总RNA(2μL)，0.5ug随机引物Oligo(dT)15(1μL)，4ulMgCL2(25mM)2μL5×dNTPs，2μL10×缓冲液，0.5μLRNase抑制剂，加入反转录酶AMV 15U(0.75μL)，用水补至20μL，混匀，42℃水浴1h，煮沸3min，反应产物置于-20℃备用。
PCR扩增反映按常规方法进行：以上述产物为模板，分别用3对重链引物和5对轻链引物扩增抗体轻、重链可变区基因。反应体系为：模板cDNA2.5ul，dNTP(各0.4mM)，10×Buffer 5ul，Ex Taq DNA聚合酶1.25u，5’端和3’端引物各5ul(约30pmol)，加水至50ul，混匀，瞬时离心后，加入1-2滴液体石蜡，置PCR仪上反应。反应条件：94℃1min，54℃1min，72℃1min，35个循环，最后72℃延伸10min。
目的片段T载体克隆测序方案如下：将PCR产物凝胶电泳分离后回收，连入pMD18-T载体。连接反应体系为：pMD18-T载体1ul，PCR产物凝胶纯化重链(或轻链)3ul，去离子水1ul，连接缓冲液5ul，混匀后4℃过夜，转化大肠杆菌JM109，筛选重组克隆，然后采用通用测序引物测序。
设计的HAb18单抗可变区基因PCR扩增引物序列如下：
小鼠重链V区5’端引物(1)5’-GG GATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT-3’(2)5’-GGG GATATCCACCATG(AG)ACTTCGGG(TC)TGAGCT(TG)GGTTTT-3’(3)5’-GGG GATATCCACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT-3’
小鼠重链V区3’端引物5’-GAC(ACT)CATGGGG(CG)TGT(TC)GT GCTAGCTG(AC)(AG)GAGAC(AGT)GTGA-3’
小鼠轻链V区5’端引物(1)5’-GGG GATATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3’(2)5’-GGG GATATCCACCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG-3’(3)5’-GGG GATATCCACCATGGAG(AT)CACA(GT)(AT)CTCGGGTCTTT(GA)TA-3’(4)5’-G GATATCCACCATG(GT)CCCC(AT)(AG)CTCAG(CT)TC(CT)CT(TG)GT-3’(5)5’-GGG GATATCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG-3’
小鼠轻链V区3’端引物5’-GGATACAGTTGGTGGTGCA GTCGACTTACGTTT(GT)GTTTCA(AG)CTT-3’
其中：划线处为限制性酶切位点
抗人肝癌单抗HAb18轻、重链可变区基因在制备用于诊断和治疗肿瘤或炎症药物中的应用。
肝癌单抗应用方面的研究主要集中在(1)肝癌单抗在肝癌相关抗原研究中的应用：单克隆抗体的发展提供了一个发现新肿瘤相关抗原或肿瘤抗原新位点的有效手段。这些抗原可用于临床血清学检查，具有一定的诊断和评价治疗效果的意义。(2)肝癌单抗导向药物研究：以单抗为载体的放免显像诊断、导向化疗和导向放疗近年取得了实质性进展。主要有：①化学药物—单抗交联物；②细胞毒素—单抗交联物；③放射性核素—单抗交联物等。
以本发明所述的轻、重链可变区基因重构成一定形式的蛋白药物，可直接用于有关疾病特别是肿瘤、炎症的诊断及导向治疗。另外，以本发明所述的轻、重链可变区基因编码的多肽及其衍生物作为载体，交联上细胞毒性药物、毒素、放射性核素、酶和生物反应调节剂等作为导向药物，可用于有关疾病特别是肿瘤的诊断及治疗。
从本发明所述的轻、重链可变区基因编码的多肽出发，可重组成的新型抗体主要有下列几种形式：(1)嵌合抗体。是用鼠MAb的V区与人Ig的C区连接而成为人-鼠嵌合抗体。由于其完整地保留了鼠MAb的特异性和亲和力，同时降低了HAMA等不良反应，故在肿瘤等疾病的治疗中显示出良好的效果。(2)人源化抗体。针对可变区基因结构的人源化改造，包括CDR移植、表面氨基酸残基镶饰、骨架区交换、定位保留和表位导向选择等，从而不但降低了可变区的鼠源性同时又保持了鼠MAb的特异性和亲和力。(3)小分子抗体。主要有由VH-CH1和VL-Cl组成Fab抗体、用一多肽(GLy4Ser)3接头连接VH基因和VL基因而成的单链抗体、由VH和VL以非共价键结合而成Fv片段抗体、由VH或VL一个功能结构域组成的单域抗体、由单个CDR构成的最小识别单位等。(4)多价微型抗体。主要有双链抗体、(ScFv)2、Flex微型抗体、LD微型抗体、F(ab’)2、F(ab’)3、(ScFv)4等。由于有多价抗原结合位点，亲和力高，分子大小适中，既能穿透肿瘤组织，亦在肾脏中的清除率较慢的特点而具有较高的临床应用价值。(5)双特异性抗体。是一类具有双重特异性和双重功能的抗体，又称双功能抗体。(6)重组抗体融合蛋白。把Fab或Fv等基因片段，与非抗体的毒素或酶等其它蛋白基因连接形成的具有把特定的生物活性导向靶部位的一种重组蛋白。(7)重组免疫毒素。将编码抗体和毒素的基因重组而产生，特点是高效，非特异毒性低，体内稳定性好，易穿透肿瘤及体内使用较安全。(8)噬菌体抗体。把Ig的V区基因与丝状噬菌体DNA上基因III或基因VIII连接经转染宿主菌后，使其在膜表面外壳蛋白表达Fab或ScFv的融合蛋白产物。通过对此产物多轮相关抗原的亲和吸附，从中淘筛出所需的特异性抗体。
以上述由轻、重链可变区基因编码的多肽重组或衍生的抗体分子为载体，交联上各种抗癌或抗炎症的效应物质而形成的免疫偶联物或导向药物主要有下列几种形式：(1)抗体-核素偶联物。该偶联物可将核素有效地导向肿瘤组织局部，从而减少了因放疗外照射引起的正常组织损伤及有关的不良反应，并可对肿瘤进行定位诊断和导向治疗。这种方法即为放射免疫显像和放射免疫治疗。与单抗偶联的常用核素有125I，131I，111In，90Y，99Tcm，188Re和186Re等。(2)抗体-化疗药物偶联物。该偶联物能特异地导向肿瘤，可减低对正常组织的损伤，减少化疗药物的毒副作用。常偶联的化疗药物如：烷化剂中的磷酸酰胺；抗代谢中的氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶；抗生素类阿霉素、表阿霉素、柔红霉素；植物类长春新碱、丝裂霉素等。(3)抗体-毒素偶联物。该偶联物又称免疫毒素。其杀伤细胞作用强且不依赖于生物辅助机制。其杀伤肿瘤机制与放疗，化疗不同，所以一般放疗、化疗效果差的肿瘤可用，应用前景广阔。常用的毒素有篦麻毒素、白喉毒素、红豆毒素、肥皂草毒素、假单孢菌外毒素、链球菌溶血素、穿孔素等。(4)抗体-生物反应调节剂(BRM)偶联物。BRM单独调节机体的免疫能力和杀伤肿瘤细胞已取得较好的疗效。但由于其输入体内后仅有部分到达肿瘤靶部位，其杀伤作用得不到充分发挥且有毒副作用。将BRM与单抗偶联，通过单抗携带其到达靶部位而发挥杀伤肿瘤的作用，使这些因子的作用更强，且更加专一。常用的BRM有INF和IL-2等。(5)抗体导向酶解前药。将抗体与药物专一性活化酶的偶联物注入体内，间隔一定时间后注入前药，使其在肿瘤部位转化成高浓度抗癌活性药以杀伤肿瘤细胞。目前，可作为前药的有苯甲酸氢芥的谷氨酰胺衍生物、磷酸鬼臼乙叉戒、磷酸丝裂霉素、葡糖苷酸柔红霉素、阿霉素、5-氟胞嘧啶和头孢菌素氮芥等。活化酶有羧肽酶G2、碱性磷酸酶、青霉素酰胺酶、β-内酰胺酶、胞嘧啶脱氨酶、β-葡糖苷酶和氨基肽酶等。(6)免疫脂质体。将MAb偶联到脂质体的表面能充分将MAb与抗原特异性结合的导向性及脂质体能包裹大量药物的特性融为一体，再包埋上有关药物，则可提高药物靶向性和疗效。
                     序列表<110>陈志南<120>抗人肝癌单克隆抗体HAb18轻、重链可变区基因及其应用<160>4<210>1<211>445<212>DNA<213>小鼠<220><221>V_region<222>(14)...(445)<400>1ggggatatcc acc atg aac ttc ggg ctg agc tgg gtt ttc ata gtt att  49ctc tta aaa ggt gtc cag agt gaa gtg aag ctt gag gag tct gga gga 97ggc ttg gtg caa cct gga gga tcc atg aaa ctg tct tgt gtt gcc tct 145gga ttc act ttt agt gac gcc tgg atg gac tgg gtc cgc cag tct cca 193gag aag gga ctt gag tgg gtt gct gaa att aga agc aaa gct aat aat 241cat gca cca tac tat act gag tct gtg aaa ggg agg ttc acc atc tca 289cga gat gat tcc aaa agt att atc tac ctg caa atg aac aac tta aga 337gct gaa gac act ggc att tat tac tgt acc agg gat agc acg gct acc 385cac tgg ggc caa ggg act ctg gtc act gtc tct tca gct agc acg aca 433gcc cca tca gtc 445<210>2<211>421<212>DNA<213>小鼠<220><221>V_region<222>(14)...(408)<400>2ggggatatcc acc atg gac tca cat act cag gtc ttt ata ttt cta ctg  49ctc tgt gtg tct ggt gcc cat ggg agt att gtg atg acc cag act ccc 97aca ttc ctg gtt gta tca gca gga gac agg gtt acc ata acc tgc aag 145gcc agt cag agt gtg att aat gat gta gct tgg tac caa cag aag cca 193ggg cag tct cct aaa ctg ctg ata ttc tat gca tcc aat cgc aac act 241gga gtt cct gat cgc ttc act ggc agt gga tat ggg acg gat ttc act 289ttc acc atc agc act gtg cag gct gaa gac ctg gca gtt tat ttc tgt 337cag cag gat tat agt cct cca ttc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ctg 385gaa atc aaa cgc aag tcg act gca cca act gta tcc 421  <210>3<211>144<212>PRT<213>小鼠<220><221>V_segment<400>3Met Asn Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Ile Val Ile Leu Leu Lys Gly Val1               5                  10                 15Gln Ser Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
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  70                 75                  80                 85Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala Glu Asp
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    105                110                115Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Lys Ser Thr Ala Pro Thr Val Ser120                125                 130                135

Claims (5)

1、一种抗肝癌单克隆抗体HAb18的重链可变区基因，其具有序列表<400>1的序列。
2、由权利要求1基因编码的多肽产物，其具有序列表<400>3的序列。
3、一种抗肝癌单克隆抗体HAb18的轻链可变区基因，其具有序列表<400>2的序列。
4、由权利要求3基因编码的多肽产物，其具有序列表<400>4的序列。
5、权利要求1或3所述的基因在制备用于诊断和治疗肿瘤或炎症药物中的应用。
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