CN1166988A - 抗人肝癌单克隆抗体HAb18放射免疫诊断剂 - Google Patents
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Abstract
抗人肝癌单抗HAb18放射免疫诊断剂，涉及生物技术及细胞工程领域，其主要技术特征为以外科手术切除的新鲜人体肝癌细胞为免疫原，免疫小鼠，融合后获得HAb18杂交瘤，其分泌高特异性抗人肝癌单抗HAb18，用酶切法将HAb18分割为F(ab′)2和Fab，并采用放射性核素131I或99mTc标记HAb18及其片断F(ab′)2和Fab上，组成抗人肝癌单抗交联物，可对肝癌进行早期诊断，具有定位准确、敏感性强和特异性高的优点。
Description
本发明涉及生物技术及细胞工程。
肝癌是我国及东南亚常见的恶性肿瘤，尤其在中国每年有11.2万肝癌患者死亡，占全世界肝癌死亡人数的43％，九十年代以来肝癌已上升为第二癌症杀手。肝癌发病凶险，进展迅速，影响极大，加上肝癌与乙肝病毒(HBV)和丙肝病毒(HCV)感染关系密切，因此进行肝癌的二级预防(早诊、早治)具有重要意义。以往肝癌的手术切除率较低，其主要原因是肝癌的诊断，尤其是早期诊断比较困难，甲胎蛋白(AFP)临床应用后，虽然检出率有所提高，但在我国还有30％左右的AFP阴性的肝癌病例漏检。80年代以来，由于医学影像学的发展，肝癌的诊断方法日臻完善。国内范桢等报导用131I标记抗人肝癌铁蛋白抗体对16例肝细胞癌作放射免疫显像，阳性率达81.3％，其中经肝动脉导管注射的8例全部获得阳性显像。国外有关放免显像的研究也有报道：Dunk等用抗肝癌细胞PLC/PRF/5单克隆抗体标记125I进行荷瘤裸鼠体内定位获得成功，瘤/肝比值为4.4±0.05(1987，J Hepatol 4：52)，Markham等用结肠癌单克隆抗体(因与肝细胞癌有交叉反应)在人体无肝硬化的肝癌中部分显像，阳性率为50％(8/16)。美国FDA自1992年以来已陆续批准了10多项由单克隆抗体标记放射性核素的体内放免显像剂，如ImmuRAID-IL2用于淋巴瘤诊断的II期临床等，而国内外尚未有肝癌特异性的定性诊断试剂形成产品。
本发明的目的是研制准确性和敏感性高的肝癌体内导向诊断剂，以提高肝癌早诊水平。
为达到此目的，本发明实施的技术方案为：以外科手术切除的新鲜人体肝癌细胞为免疫原，免疫小鼠，融合获得高分泌杂交瘤细胞株HAb18，其染色体在81-106间，众数为93-99，其分泌高亲和性抗人肝癌单克隆的抗体亚型为小鼠IgG1，其相应抗原为61KD的单位膜蛋白抗原，与甲胎蛋白、铁蛋白元竞争抑制，亲和常数为8.17×109L/mol，其抗原谱较为特异，主要针对肝癌，和部分胃癌、肠癌有交叉，但和正常组织无交叉反应。
用酶切法将HAb18 IgG分割为F(ab′)2和Fab，分子量减小，更易穿透到达肿瘤部位。
本发明中采用的放射性核素为131I或99mTc。131I半衰期为8.04天，主要发射β-及γ射线，用溴代琥珀酰亚胺法，将131I标记到HAb18单抗及其F(ab′)2上，组成抗人肝癌单抗介导的放免显像剂131I-HAb18和131I-HAb18 F(ab′)2。 99mTc半衰期为6小时，可从钼锝发生器中淋洗制备，其主要带电粒子为γ射线，采用还原抗体法或修饰抗体法可将99mTc标记于肝癌单抗HAb18 F(ab′)2和Fab上，组成肝癌放免显像剂99mTc-HAb18 F(ab′)2和99mTc-HAb18 Fab。
临床应用方式
静脉给药：患者服用卢戈氏碘液2-3天，3滴，每日3次，先静脉注射地塞米松5mg，然后缓慢注入碘标记抗体92.5-111MBq/1.8-2.0ml。
临床前及临床研究
1.体外免疫活性检测：标记抗体与肝癌细胞的免疫结合率，131I-HAb18 IgG为70％，131I-HAb18 F(ab′)2为55％，131I-C4IgG(无关抗体)为4.5％。
2.体内放免显像及生物学分布
注入碘标记抗体后，裸鼠左臀部位肿瘤区明确显像。肿瘤直径在0.5cm以上即能定位，显像率100％。最佳显像时间，全抗体120-168小时，F(ab′)248-72小时，无关对照抗体C4在肿瘤部位无放射性聚集。
HAb18及其F(ab′)2片断在48小时时每克肿瘤组织的摄取，分别占其注入总剂量的2.56％和2.03％，两者均高于对照抗体的1.2％。在不同时间点上处死荷瘤鼠，取全身各组织器官称重，测cpm/mg组织，观察T/NT比值，结果见表1。表1内3种抗体最佳显像时间点上T/NT比值，其中最重要的为瘤/肝、瘤/血比值。注入标记单抗后，在不同时间点上分别取样、测试、计算。瘤/肝比值：全抗体在48、120、168小时分别为1.53、3.95、5.15。而F(ab′)2在48小时达14.47，远高于全抗体；瘤/血比值，全抗体在以上时间点上分别为0.42、0.58、1.35。而F(ab′)2在48小时即为4.55比值也明显大于全抗体。无关抗体C4T/NT比值均较小，无集中趋势。
表1 标记抗体注入后在荷人肝癌裸鼠体内分布(T/NT比值X±S)标记物131I-HAb18 F(ab′)2 131I-HAb18 IgG 131I-C4 IgG
48h 168h 168h血 4.55±0.07 1.35±0.21 0.44±0.17心 18.60±2.05 4.79±1.31 1.62±0.45肺 8.05±0.46 2.30±0.41 0.97±0.12肝 14.47±2.35 5.15±0.64 0.93±0.16脾 10.88±2.70 5.90±0.59 1.72±0.40胰 18.40±1.08 9.58±1.12 1.48±0.23肾 4.46±0.86 3.84±0.62 2.75±0.37胃 2.51±0.69 4.87±1.14 0.92±0.08肠 15.83±1.24 7.08±1.10 2.20±0.26肌肉 13.82±3.52 9.51±2.53 3.31±1.42脑 81.91±12.13 31.63±1.02 11.27±0.73
表2 碘标抗体注入人体内的分布(T/NT比值X±S)标记物131I-HAb18 IgG 131I-HAb18 F(ab′)2血 2.01±0.16 2.45±0.22脑 4.70±0.30 5.95±0.32心 3.13±0.18 3.0±0.25肝 2.15±0.15 2.63±0.21脾 2.82±0.21 3.22±0.34肺 3.02±0.34 3.55±0.28腹腔 4.46±0.55 5.20±0.47注：n＝15(IgG 12例，F(ab′)2 3例)。器官比值为ECT感兴趣区(ROI)单位面积外测量的数据。131I-HAb18对正常人体的器官辐射吸收剂量
根据医学内照射剂量委员会纲要(Medical Internal Radiation Dose CommitteSchema，MIRD)，131I-HAb18对正常人体的器官辐射吸收剂量如下：
①各器官放射性药物有效半衰期[T1]eff
在相同显像条件下，从全身显像图像上用感兴趣区(ROI)技术计算出各器官不同时间的计数，拟合时间-放射性曲线，求出[T1]eff(h)：
肝 肺 心 甲状腺 肠 肾 脾 睾丸 全身
48 72 88 120 68 24 120 96 48
②各器官累积放射性强度
肝 肺 心 肾 脾 肠 睾丸 全身 骨皮质 骨髓
8338 6822 12583 4370 8895 2202 2308 2885 19440 19440
全身
343917
③各器官辐射吸收剂量(mGy/MBq)，如下：
肝 肺 心 肾 脾 肠 睾丸 甲状腺 骨皮质 骨髓
0.36 0.26 0.022 0.396 1.46 0.164 1.81 3.57 0.252 0.252
全身
0.184
有效剂量当量(effective dose equivalent，EDE)为各器官吸收剂量与器官权重因子乘积代数和，经计数为0.958mSv/MBq，按每次显像给药185MBq计算，EDE为177.23mSv/每次检查，乘以现行的危险度系数1.65×10-5/mSv，每次检查因癌致死危险度为2.92×10-3。
本发明有敏感性强，组织特异性高的优点。以“肝占位性病变待查”定位20例，其中13例经CT、B型超声和血清AFP诊断为肝癌。经本发明显像剂诊断阳性显像11例，其中2例小肝癌，最小肿瘤直径仅为0.5cm，血清AFP＜20ng/ml，B型超声诊断为“血管瘤”，但本诊断剂定位发现阳性显像区，手术后病理诊断证实为肝细胞癌。因此，本抗体对血清低值AFP的早期小肝癌的诊断也具有一定的可靠性。而5例肝占位病变，4例术前诊断为肝癌，1例疑为血管瘤，经本诊断剂检查全部为阴性，最后由手术探查或胃镜病理诊断证实3例是血管瘤，2例为来源于胃和贲门的肝转移癌，阴性诊断符合率为100％。
Claims (5)
1、抗人肝癌单抗HAb18放射免疫诊断剂。其特征在于：以外科手术的新鲜人体肝癌细胞为免疫原，免疫小鼠，融合后获得HAb18杂交瘤，其分泌高特异性抗人肝癌单克隆抗体HAb18，用放射性核素131I或99mTc标记HAb18单抗，组成抗人肝癌单抗HAb18交联物。
2、根据权利要求1所述的抗人肝癌单抗HAb18放射免疫诊断剂，其特征在于HAb18杂交瘤细胞株染色体在81-106间，众数为93-99，其分泌特异性抗人肝癌单抗HAb18。
3、根据权利要求1或2所述的抗人肝癌单抗HAb18放射免疫诊断剂，其特征在于HAb18单抗的亚型为小鼠IgG1，其相应抗原为61KD的单位膜蛋白抗原，与甲胎蛋白，铁蛋白无竞争抑制，亲和常数为8.17×109L/mol，其抗原谱较为特异，主要针对肝癌，和部分胃癌、肠癌有交叉，但和正常组织无交叉反应。
4、根据权利要求3所述的抗人肝癌单抗HAb18放射免疫诊断剂，其持征在于：还可用酶切法将HAb18 IgG分割为F(ab′)2和Fab片断，使抗体分子量减小，而更易穿透到达肿瘤部位。
5、根据权利要求4所述的抗人肝癌单抗HAb18放射免疫诊断剂，其特征在于所述的抗人肝癌单抗HAb18交联物具体为以下四种制剂：
[131I]-HAb18 IgG； [131I]-HAb18 F(ab′)2；
[99mTc]-HAb18 F(ab′)2； [99mTc]-HAb18 Fab。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1491555A1 (en) * | 2002-03-15 | 2004-12-29 | Zhinan Chen | Anti-human hepatoma monoclonal antibody hab18 light/heavy chain variable region gene, and use thereof |
| CN103893786A (zh) * | 2012-12-26 | 2014-07-02 | 上海海抗中医药科技发展有限公司 | 一种放射核素131i-单克隆抗体标记物的制备方法 |
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1997
- 1997-07-11 CN CN 97108618 patent/CN1166988A/zh active Pending
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| EP1491555A4 (en) * | 2002-03-15 | 2006-03-15 | Zhinan Chen | THE GENE FOR THE LIGHT / HEAVY CHAIN OF THE VARIABLE REGION OF THE MONOCLONAL ANTI-HUMAN HEPATOMAN TONOR HAB18 |
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