CN115536747A - 一种结合trop2的抗体及靶向trop2和cd3的双特异性抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程抗体技术领域，具体涉及一种结合TROP2的抗体及靶向TROP2和CD3的双特异性抗体及其制备方法与应用。本发明提供的TROP2抗体具有良好的结合TROP2的能力，亲和力高；结合TROP2和CD3的双特异性抗体同时具有优异的抗TROP2和抗CD3抗体的生物学功能，能够在肿瘤细胞和免疫效应细胞之间搭建桥梁，有效激活免疫效应细胞和导向性免疫反应，显著增强了免疫细胞杀伤肿瘤细胞的功效，同时最大程度地降低了ADCC效应，具有较高的安全性，在肿瘤的免疫治疗中具有较好的应用前景。

Description

一种结合TROP2的抗体及靶向TROP2和CD3的双特异性抗体及 其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及基因工程抗体技术领域，具体涉及一种结合TROP2的抗体、靶向TROP2和CD3的双特异性抗体及其制备方法与应用。
背景技术
抗体药物是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的生物大分子药物，具有特异性高、性质均一、可针对特定靶点定向制备等优点。单克隆抗体在临床上主要应用于以下三个方面：肿瘤治疗、免疫性疾病治疗以及抗感染治疗。其中，肿瘤治疗是目前单克隆抗体应用最为广泛的领域，目前已经进入临床试验和上市的单克隆抗体产品中，用于肿瘤治疗的产品数量占比大概为50％。单克隆抗体治疗肿瘤是一种针对病变细胞特异靶点刺激免疫系统杀伤靶细胞的免疫疗法，为了增强抗体的效应功能，特别是提高杀伤肿瘤细胞的效果，人们尝试多种方法改造抗体分子。
获取特异性抗体的方法有多种。传统的杂交瘤技术通过免疫小鼠或大鼠，将其脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，然后进行稀释(至一个细胞每孔)培养，用酶联免疫法(ELISA)检测杂交瘤细胞上清与免疫抗原的结合，进而筛选可分泌与抗原特异性结合抗体的单克隆细胞株。这种鼠源抗体如果应用于临床药物研发，则需要通过杂合抗体技术(chimerization)、人源化技术(humanization)等基因工程手段进行去免疫原性改造。为了从起始阶段就消除未来临床必须解决的免疫原性问题，转基因鼠技术(transgenic mouse)通过替换鼠源抗体可变区为人源抗体可变区，使得获得的单克隆抗体的可变区序列主体上就是人源的，然后再进一步替换恒定区就可以获得全人源单克隆抗体。另外一个技术就是噬菌体表面呈现(phage display)技术。噬菌体表面呈现技术是在试管中构建工程抗体，一般是单链抗体或Fab形式。但是组成工程抗体的基因片段来源于人免疫细胞的基因库，所以获得的抗体是全人源的。已有多个噬菌体技术获得的抗体进入临床研究或获得批准，用于各个方面的疾病治疗。
在单克隆抗体的基础上，为了进一步提高药效和减少毒副作用，以单克隆抗体为基础的新抗体药物，包括药物偶联抗体(Antibody drug conjugate,ADC),双特异性抗体(bispecific antibody，bsAb)以及CAR-T(chimeric antigen receptor T cells)等新型蛋白和细胞药物的发展极为迅速。其中，基于双特异性构建的细胞桥(cell-bridging)双抗，由于具有连接免疫T细胞和癌靶细胞的能力，显著提高了杀伤活性和特异性，具有突破性的临床价值，受到了较多的关注。
双特异性抗体可通过多种途径获得，其制备方法主要有：化学偶联法、杂交-杂交瘤法和基因工程抗体制备法。化学偶联法是将2个不同的单克隆抗体用化学偶联的方式连接在一起，制备的双特异性单克隆抗体，这是最早的双特异性单克隆抗体。杂交-杂交瘤法是通过细胞杂交法或者三元杂交瘤的方式产生双特异性单克隆抗体，这些细胞杂交瘤或者三元杂交瘤是通过建成的杂交瘤融合，或者建立的杂交瘤和从小鼠的淋巴细胞融合而得到的，只能用于生产鼠源的双特异性抗体，因此，其应用受到了极大的限制。而随着分子生物学技术的迅速发展，出现了基因工程人源化或全人源的双特异性抗体的多种构建模式，主要包括双特异性微抗体、双链抗体、单链双价抗体、多价双特异性抗体四类。目前，国际上已有数种基因工程双特异性抗体药物进入临床试验阶段，并显示有较好的应用前景。
滋养层细胞表面抗原2(TROP2)是由TACSTD2基因编码表达的细胞表面糖蛋白，又名肿瘤相关钙离子信号转导子2(TACSTD2)、表皮糖蛋白1(EGP-1)、胃肠肿瘤相关抗原(GA733-1)、表面标志物1(M1S1)，最早于人胎盘滋养层鉴定到的细胞表面糖蛋白，后来被发现高度表达于大部分人的实体肿瘤癌细胞中，且仅受限或有限地表达于正常人组织。TROP2属于GA733蛋白家族，与上皮细胞黏附分子(EpCAM，又称TROP1、TACSTD1)有较高结构序列相似性，同源性达49％。TROP2由323个氨基酸构成，其中信号肽含26个氨基酸，胞外区248个氨基酸，跨膜区23个氨基酸，胞质区26个氨基酸，其结构示意图如图1的A所示。TROP2主要通过调节钙离子信号通路、细胞周期蛋白表达及降低纤黏蛋白黏附作用促进肿瘤细胞生长、增殖和转移。TROP2也可以与Wnt信号级联中的β-连环蛋白相互作用，因而对细胞核癌基因的转录及细胞的增殖起作用。大量临床研究和文献报道表明，TROP2在乳腺癌、胰腺癌、胆囊癌、结肠癌、胃癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、子宫癌和口腔鳞癌等上皮癌中过表达，而在成年人正常组织中很少表达或不表达；TROP2在肿瘤组织中的过表达与患者的预后不良和癌细胞的转移密切相关，同时影响患者的总生存率。因此，TROP2已成为肿瘤分子靶向治疗中引人注目的靶标。
TROP2是一种跨膜蛋白，其细胞外结构域在多种肿瘤细胞上分布广泛，因此成为了靶向治疗的天然候选。TROP2的组织表达局限性使得治疗的毒性降低，这也是靶向TROP2治疗的优势所在。以TROP2为靶点的抗体、抗体偶联物以及联合用药等多种形式的药物正处于研发中。抗TROP2抗体与其他化疗药物偶联的效用已在各种临床前研究中得到证实。用于治疗TROP2过表达的上皮恶性肿瘤的抗体偶联药物(ADC)IMMU-132已获FDA批准上市(2020年4月)。新型抗体偶联药物Sacituzumab govitecan(IMMU-132)是以TROP2为靶点，利用人源化抗体hRS7作为靶向载体与伊立替康活性代谢产物SN38偶联而成，可用于治疗多种上皮恶性肿瘤如乳腺癌(三阴乳腺癌)、卵巢癌、小细胞肺癌等。此外，其他人源化的抗TROP2 IgG-SN-38偶联物，如抗TROP2 hRS7-CL2A-SN-38抗体偶联药物，已被证明在多种肿瘤细胞系(Calu-3、Capan-1、BxPC-3和COLO-205)的异种移植模型中具有显著的特异性抗癌作用。综上所述，开发一种抗TROP2的特异抗体，尤其是具备良好的TROP2抗原结合性的完全人源化抗TROP2抗体具有重要意义。
T细胞表面的CD3分子由4个亚基δ、ε、γ、ζ组成，其分子质量分别为18.9k Da，23.1kDa，20.5kDa和18.7kDa，其长度分别为171、207、182、164个氨基酸残基，其共同组成6条肽链，常与T细胞受体(T cell receptor，TCR)紧密结合形成含有8条肽链的TCR-CD3复合体，其结构示意图见图1的B。该复合体具有T细胞活化、信号转导以及稳定TCR结构的功能。CD3胞质段含有免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activationmotif，ITAM)，TCR识别并结合由MHC(major histo-compatibility complex)分子提呈的抗原肽，导致CD3的ITAM的保守序列中的酪氨酸残基被T细胞内的酪氨酸蛋白激酶p56lck磷酸化，然后募集其它含有SH2(Scr homology 2)结构域的酪氨酸蛋白激酶(如ZAP-70)。ITAM的磷酸化以及与ZAP-70的结合是T细胞活化信号传导过程早期阶段的重要生化反应之一。因此，CD3分子的功能是转导TCR识别抗原所产生的活化信号。基于CD3的功能，开发一种可用于免疫治疗的、同时结合TROP2和CD3的双特异性抗体具有重要意义。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种结合TROP2的抗体及其活性片段。
本发明的第二目的在于提供结合TROP2和CD3的双特异性抗体及其活性片段。
本发明的第三目的在于提供编码TROP2抗体、结合TROP2和CD3的双特异性抗体的核酸。
本发明的第四目的在于提供上述TROP2抗体、结合TROP2和CD3的双特异性抗体或其活性片段的用途。
具体地，本发明提供以下技术方案：
首先，本发明提供一种TROP2抗体，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别具有SEQ ID NO.1-3所示的氨基酸序列，或者，其分别具有以SEQ ID NO.1-3所示的氨基酸序列为参考序列、含有如下突变中的一种或多种突变的组合的氨基酸序列：
(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第1位S突变为N；
(2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第4位P突变为R、K或G；
(3)SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的第1位P突变为H、A；
(4)SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的第2位N突变为E；
所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别具有SEQ ID NO.4-6所示的氨基酸序列，或者，其分别具有以SEQ ID NO.4-6所示的氨基酸序列为参考序列，含有如下突变中的一种或多种突变的组合的氨基酸序列：
(1)SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的第5位G突变为N或E；
(2)SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的第7位S突变为R或K
(3)SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的第1位A突变为R；
(4)SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的第3位S突变为G、H或R；
(5)SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的第4位S突变为K。
本发明从全合成单链人抗体库中筛选出抗TROP2的基因工程单链抗体，并获得其抗体的可变区序列，通过点突变试剂盒构建突变文库，获得亲和力高的克隆，将这些克隆的DNA混合，以重组方式组装单链抗体组合文库，筛选后获得与人TROP2结合的亲和力高的TROP2抗体。
本发明提供的抗体可变区氨基酸序列模式为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。在本申请中，FR和CDR的区域划分基于Kabat命名系统。在此，FR1～4代表4个框架区域，CDR1～3代表3个高变区。FR1～4可以是从恒定区序列分离而来(比如人免疫球蛋白轻重链类、亚类或亚家族最常用的氨基酸)，也可以是从单独的人抗体框架区分离而来或从不同的框架区基因组合而来。
进一步地，本发明提供一种TROP2抗体，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的CDR1具有SEQ ID NO.1、7任一所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.2、8、9任一所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.3、10任一所示的氨基酸序列；
轻链可变区的CDR1具有SEQ ID NO.4、11、12任一所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQID NO.5、13、14任一所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.6、15任一所示的氨基酸序列。
经进一步筛选，本发明提供以下具有更高的TROP2结合亲和力的TROP2抗体，其重链可变区的CDR为如下任一种：
(1)CDR1具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；
(2)CDR1具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；
(3)CDR1具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；
(4)CDR1具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列；
轻链可变区的CDR为如下任一种：
(1)CDR1具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；
(2)CDR1具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列；
(3)CDR1具有SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列；
(4)CDR1具有SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列；
(5)CDR1具有SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列；
(6)CDR1具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列；
在上述抗体中，以下抗体具有更高的TROP2结合亲和力，其重链可变区的CDR和轻链可变区的CDR为如下任一种：
(1)重链可变区的CDR1具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；轻链可变区的CDR1具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQID NO.6所示的氨基酸序列；
(2)重链可变区的CDR1具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ IDNO.8所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；轻链可变区的CDR1具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQID NO.15所示的氨基酸序列；
(3)重链可变区的CDR1具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ IDNO.8所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；轻链可变区的CDR1具有SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQID NO.15所示的氨基酸序列；
(4)重链可变区的CDR1具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ IDNO.8所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；轻链可变区的CDR1具有SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQID NO.15所示的氨基酸序列。
在上述重链和轻链可变区的CDR区的基础上，本发明提供这些TROP2抗体的重链和轻链可变区的序列：
重链可变区具有SEQ ID NO.16、18-20任一所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO.17、21-25任一所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区、轻链可变区与前述序列相比具有满足以下二者中至少一个：a)结合相同抗原表位；b)序列同一性大于70％、80％、85％、90％、97％、98％或99％的氨基酸序列。
进一步地，具有如下可变区序列的抗体表现出更为优异的TROP2结合亲和力：重链可变区具有SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区具有SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQID NO.21所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区具有SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQID NO.23所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区具有SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQID NO.24所示的氨基酸序列。
可选的，以上所述的TROP2抗体的重链的Fc片段为人或人源化抗体的Fc片段，所述人或人源化抗体为IgG1、IgG2、IgA、IgE、IgM、IgG4或IgD。
优选地，TROP2抗体的重链具有SEQ ID NO.27、29任一所示的氨基酸序列，轻链具有SEQ ID NO.28、30任一所示的氨基酸序列；或者，所述重链、轻链与前述序列相比具有满足以下二者中至少一个：a)结合相同抗原表位；b)序列同一性大于70％、80％、85％、90％、97％、98％或99％的氨基酸序列。
本发明提供具有如下重链和轻链全长序列的TROP2抗体：重链具有SEQ ID NO.27所示的氨基酸序列，轻链具有SEQ ID NO.28所示的氨基酸序列；或者，重链具有SEQ IDNO.29所示的氨基酸序列，轻链具有SEQ ID NO.30所示的氨基酸序列。
本发明提供的人源抗人TROP2抗体以4.35nM-7.5nM的亲和力结合于人TROP2。该抗体结合于表达TROP2的细胞，所述的细胞可以为人上皮恶性肿瘤(胃癌、宫颈癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、食道癌、胰癌、头颈癌、卵巢癌、子宫内粘膜浆液性乳头癌等肿瘤)细胞。
本发明还提供含有以上所述的TROP2抗体的单链抗体、Fab抗体、微型抗体、嵌合抗体、全抗体免疫球蛋白IgG1、IgG2、IgA、IgE、IgM、IgG4或IgD、双特异性抗体、多特异性抗体。
进一步地，本发明提供结合TROP2和CD3的双特异性抗体，其包括：第一结构域，结合滋养层细胞表面抗原2，以及，第二结构域，结合T细胞表面抗原CD3，其中，第一结构域包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区和轻链可变区为如以上所述的TROP2抗体的重链可变区和轻链可变区。
优选地，所述双特异性抗体的第一结构域为2个通过二硫键连接的完整的轻链-重链对，其重链和轻链的氨基酸序列为以上所述的TROP2抗体的重链和轻链的氨基酸序列。
对于结合CD3抗原的第二结构域，其重链可变区优选具有SEQ ID NO.31所示的氨基酸序列，轻链可变区优选具有SEQ ID NO.32所示的氨基酸序列；
优选地，所述第二结构域的轻链可变区和重链可变区通过连接肽连接为单链抗体，所述单链抗体具有SEQ ID NO.33所示的氨基酸序列。
本发明的双特异性抗体优选设计为以下结构：第一结构域包含2个完整的轻链-重链对，第二结构域包含2个单链抗体，通过如下任意一种方式连接而成的对称结构：
(1)所述第二结构域的2个单链抗体的C端分别通过连接肽与所述第一结构域的2条重链的N端连接；
(2)所述第二结构域的2个单链抗体的N端分别通过连接肽与所述第一结构域的2条重链的C端连接；
本发明发现，针对上述第一结构域和第二结构域的序列，具有上述对称结构的双特异性抗体与其它结构的双特异性抗体相比，能够更好地保留第一结构域和第二结构域的原抗体的特异性抗原结合能力，同时具有优异的结合TROP2和CD3的生物学功能，在生产工艺和药用性能等方面具有明显优势。本发明开发了具有上述抗体分子结构的结合TROP2和CD3的双特异性抗体，该双特异性抗体具有特异性的靶向作用，并能够高效激发具有导向性的免疫反应，杀伤肿瘤细胞。
优选地，用于第一结构域和第二结构域连接的连接肽的氨基酸序列为(GGGGX)n，其中，X为Gly或Ser，n为1-4的自然数。
作为本发明的一种优选实施方式，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示。
作为具有上述结构的双特异性抗体的示例，在上述TROP2抗体和CD3抗体的基础上，本发明构建了同时结合TROP2和CD3的双特异性抗体，其结构和序列如下：
所述第一结构域的重链与所述第二结构域经连接肽连接后具有SEQ ID NO.35或36所示的氨基酸序列，轻链具有SEQ ID NO.28或30所示的氨基酸序列。
优选地，所述第一结构域的重链与所述第二结构域经连接肽连接后具有SEQ IDNO.35所示的氨基酸序列，轻链具有SEQ ID NO.28所示的氨基酸序列，或者，所述第一结构域的重链与所述第二结构域经连接肽连接后具有SEQ ID NO.36所示的氨基酸序列，轻链具有SEQ ID NO.30所示的氨基酸序列。
以上所公开和要求保护的SEQ ID NO.1-36所示序列包括“保守序列修饰”，即不明显影响和改变所述抗体或含有所述氨基酸序列抗体的结合特征的核苷酸和氨基酸序列修饰。所述保守序列修饰包括核苷酸或氨基酸替换、添加或缺失。可以通过本领域的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变等将修饰导入SEQ ID NO.1-36中，保守氨基酸替换包括氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基或其他氨基酸残基代替。本领域中，已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电的极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β分支侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，优选用来自于同一侧链家族的另一种氨基酸残基代替人抗TROP2抗体中的非必须氨基酸残基。
因此，以上公开的具有所述氨基酸序列的抗体和/或含有以上公开的氨基酸序列的抗体包括基本上由经保守序列修饰的相似序列编码的，或含有经保守序列修饰的相似序列的抗体，均应视为本发明的范畴。
本发明还提供编码所述TROP2抗体的核酸分子以及编码所述结合TROP2和CD3的双特异性抗体的核酸分子。
考虑到密码子的简并性，编码本发明所述抗体的基因可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，对编码上述抗体的基因序列进行修改，获得编码相同抗体的基因。本领域技术人员可以根据表达抗体宿主的密码子偏爱性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。
本发明还提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括重组DNA、表达盒、载体、宿主细胞、工程菌或细胞系。
其中，所述载体包括但不限于克隆载体、表达载体，可为质粒载体、病毒载体、转座子等载体。
所述宿主细胞或细胞系可以为来源于微生物或动物的细胞或细胞系。
本发明还提供所述TROP2抗体或所述结合TROP2和CD3的双特异性抗体的制备方法，其包括：将编码所述抗体的核酸导入宿主细胞中，获得稳定表达所述双特异性抗体的宿主细胞；培养宿主细胞，经分离纯化获得所述抗体。
在制备所述TROP2抗体或所述结合TROP2和CD3的双特异性抗体时，本领域技术人员可根据需要选择本领域常规的宿主细胞、表达载体、将表达载体导入宿主细胞的方法以及抗体的分离纯化方法。
基于本发明提供的TROP2抗体以及结合TROP2和CD3的双特异性抗体的功能，本发明提供TROP2抗体、结合TROP2和CD3的双特异性抗体、编码所述抗体的核酸分子、含有所述核酸分子的生物材料的如下任一种应用：
(1)在制备用于诊断、预防或治疗TROP2表达的相关疾病的药物中的应用；
(2)在制备用于诊断、预防或治疗以TROP2为靶标的疾病的药物中的应用；
(3)在制备用于杀伤TROP2表达的细胞的药物中的应用；
(4)在制备TROP2和/或CD3的检测试剂中的应用；
(5)在制备适用于CAR-T疗法的相关试剂中的应用；
(6)在制备免疫毒素或标记抗体中的应用。
以上所述的TROP2表达的相关疾病优选为高表达/过度表达TROP2的肿瘤，特别是表达TROP2的上皮恶性肿瘤(包括但不限于胃癌、宫颈癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、食道癌、胰癌、头颈癌、卵巢癌、子宫内粘膜浆液性乳头癌等肿瘤)。
优选地，所述药物为抗肿瘤药物。
以上所述的标记抗体可为放射性同位素标记抗体。
本发明提供的双特异性抗体本身可用于治疗和诊断。抗体可以被标记、交联或偶联及与其他蛋白或多肽分子融合表达形成复合物(如细胞毒性物质、放射性毒素和/或化学分子等)用于诊断和治疗。
本发明提供包含所述TROP2抗体或所述结合TROP2和CD3的双特异性抗体的多特异性抗体、融合蛋白、免疫毒素、药物或检测试剂。
以上所述的免疫毒素包含以各种形式连接于细胞毒性剂的TROP2抗体或双特异性抗体。
所述的各种连接形式为抗体被标记、体外交联或分子偶联。所述细胞毒性剂包括化学分子、放射性同位素、多肽、毒素及其他对细胞具有杀伤或诱导细胞死亡特性的物质。
以上所述的融合蛋白，包含本发明提供的上述TROP2抗体或双特异性抗体以及具有某种功能的其他蛋白或多肽分子的复合物。
具体地，所述的融合蛋白可为将抗体基因与免疫毒素或细胞因子基因连接构建重组表达载体，通过哺乳动物细胞或其他表达系统获得重组融合蛋白分子。
以上所述的所述药物、检测试剂还可包含药学领域和检测试剂领域允许的其它有效成分或辅料(例如：抗体的组分和药理学上可接受的递送分子或溶液。其中，治疗用组分为无菌，可低温冻干)。
本发明提供的抗TROP2的抗体及其双特异性抗体，能够抑制TROP2所诱导的一种或多种生物学活性。这些抗体通过与TROP2结合后复合物被内化从而消耗细胞表面的TROP2而发挥作用。TROP2拮抗剂所具有的所有干扰功能均应平等地视为本发明的目的。
本发明的有益效果在于：
本发明通过基因工程和噬菌体表面展示文库技术，从天然全人序列的单链抗体库中筛选出抗TROP2的特异性抗体，本发明提供的TROP2抗体具有良好的结合TROP2的能力，这些抗体抗体经ELISA检测及流式细胞仪检测，可与MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF7等细胞表面的TROP2特异性结合，表明靶标特异性良好，结合于人TROP2的亲和力为4.35nM-7.5nM，具有良好的治疗应用前景。
在此基础上，本发明利用基因工程和抗体工程方法构建包含单链抗体和完整单克隆抗体结构的结合TROP2和CD3的双特异性抗体，该双特异性抗体融合蛋白保留了完整的单克隆抗体结构，而且具有高度稳定的对称结构，更好地保留了抗CD3单链抗体和抗TROP2单克隆抗体的生物学功能，实现了一个双特异性抗体分子同时具有优异的抗TROP2和抗CD3两个单克隆抗体的生物学功能，能够在肿瘤细胞和免疫效应细胞之间搭建桥梁，有效激活免疫效应细胞和导向性免疫反应，显著增强了免疫细胞杀伤肿瘤细胞的功效，同时最大程度地降低了ADCC效应，具有较高的安全性。此外，本发明提供的双特异性抗体由于具有结构完全对称的特点，在进行宿主表达时，不会产生其它结构的蛋白异构体，从而大大降低了提取和纯化工艺的难度，具有制备简单、产量高的优势，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。
本发明为研发针对TROP2靶标的抗肿瘤抗体药物、CAR-T试剂开发、预防和治疗提供了人TROP2特异性抗体候选分子。本发明的双特异性抗体能够同时结合免疫细胞和肿瘤细胞，导向T免疫反应，特异性有效杀伤肿瘤细胞，可研发为上皮恶性肿瘤的抗体药物。
附图说明
图1为本发明背景技术中TROP2的蛋白结构及TCR结构示意图，其中，A为TROP2抗原的结构，来源：Goldenberg DM,Stein R,Sharkey RM.The emergence of trophoblastcell-surface antigen 2(TROP-2)as a novel cancer target.Oncotarget.2018Jun 22；9(48):28989-29006.doi:10.18632/oncotarget.25615.PMID:29989029；PMCID:PMC6034748；B为T细胞受体(TCR)复合体结构及其中CD3的组成。来源：https://www.researchgate.net/publication/299549376。
图2为本发明实施例2中流式细胞仪(FACS)分析TROP2与先导克隆1F7的结合，其中，A:阴性对照；B：阳性对照；C：候选克隆IF7。
图3为本发明实施例3中等离子共振(SPR)技术分析1F7及其亲和力成熟突变体F7A与人及食蟹猴TROP2的亲和力，其中纵坐标为结合反应单位(RU)。
图4为本发明实施例4中基于FIST平台构建的抗TROP2×CD3双特异性抗体结构示意图，其中，A:以N端融合(nFIST)构建的双抗：抗-CD3单链抗体融合于抗TROP2抗体VH的N端；B:以C端融合(cFIST)构建的双抗：抗-CD3单链抗体融合于抗TROP2抗体Fc的C端。
图5为本发明实施例4中SPR分析单链抗体K3与CD3的亲和力。
图6为本发明实施例5中双特异抗体F7AK3和1F7K3的SDS-PAGE电泳图，其中，A和C为还原SDS-PAGE电泳；B和D为非还原SDS-PAGE电泳；A和B为1F7 K3双特异抗体SDS-PAGE电泳结果；C和D为F7AK3双特异抗体SDS-PAGE电泳结果；泳道M代表蛋白分子量标准，泳道1为目的蛋白。
图7为本发明实施例5中纯化的双特异抗体F7AK3和K3F7A的HPLC-SEC纯度分析峰形，其中，A为双特异抗体F7AK3；B为双特异抗体1F7 K3。
图8为本发明实施例6中流式细胞仪分析F7AK3与TROP2的结合以及F7AK3与T细胞的结合，其中，A:流式细胞术分析F7AK3对TROP2细胞系的结合；B-G：梯度分析F7AK3对TROP2各细胞系的结合能力；
图9为本发明实施例6中F7AK3对TROP2阳性细胞及T细胞的桥接作用。
图10为本发明实施例7中F7AK3双抗对TROP2抗原的结合介导T细胞对人乳腺癌细胞(MCF、MDA-MB-231、MDA-MB-468、HCC1395)的杀伤能力检测，其中，A、B、C、D分别为MCF、MDA-MB-231、MDA-MB-468、HCC1395细胞。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1从天然人抗体噬菌体表面呈现文库中筛选抗人TROP2抗体
抗体库技术是一种将某种动物(包括人)的所有抗体可变区基因克隆到质粒或噬菌体中，后者感染大肠杆菌后，抗体片段表达于噬菌体颗粒表面，或者大肠杆菌周质、胞浆中。然后用靶标抗原从抗体库中筛选出携带特异抗体基因的克隆，从而获得相应的特异性抗体的技术。从抗体库中已经筛选多种基础研究和临床研发中需要的的抗体，如肿瘤相关的膜蛋白抗原、与自身免疫病相关的自身抗原、抵抗病毒性疾病的病毒抗原的抗体。这些显示出抗体库技术在基础研究和抗体药物研发中的巨大应用潜力。特别的，从人的抗体库中得到全人源的单克隆抗体，克服了难以用鼠杂交瘤技术获得人源单抗的障碍；由于人抗体序列的高度保守性，这些抗体对人体自身免疫系统的免疫原性远低于来源于动物的抗体，因此更安全。
非免疫的人天然抗体库以健康人为抗体基因来源，这些人称之为供体。由于使用全天然人抗体序列，获得的抗体对人体免疫系统具有极低的免疫原性。采用分子生物学和DNA操作技术，用RNA抽提试剂盒(例如QIAGEN的RNeasy Mini Kit，目录号74104)，把总RNA从供体的外周血单核细胞(PBMC)中提取出来以后，从每一份RNA样品中取等量后合并，用反转录试剂盒(例如ThermoFisher Scientific的cDNA合成试剂盒(SuperScriptTMIV ReverseTranscriptase)进行轻重链基因cDNA的合成。以这些抗体cDNA为模板，在第一轮扩增中，在以各个亚组特异性的上游引物和恒定区引物配合下进行PCR扩增，获得各个亚组的全部成员基因。在第二轮PCR中，带有搭桥的重链可变区(VH)3’-端引物组和带有搭桥的轻链可变区(VL)5’-端引物组分别与各自的另一端引物(包含有特异性的限制性内切酶位点)配合，使得获得的VH和VL能够搭头链接，形成单链抗体(scFv)基因。利用这些单链抗体的基因在5’-端和3’-端的特异性酶切位点，将这些scFv基因克隆至溶源性的噬菌粒(phagemid，如M13 phagemid)载体中，构建抗体文库。该文库的大小达到了50亿个集落形成单位(cfu)。
生物淘选指的是用特异性靶标从抗体库中筛选获得特异性单克隆抗体的过程。为了获得人TROP2抗原特异性的人抗体，用液相筛选法进行淘选。液相淘选法的一般步骤是：首先把商品化的TROP2抗原(TROP2-Fc融合蛋白，Acrobiosystems，目录号TR2-H5253)经生物素修饰，让每个分子交联上3-5个生物素分子。将合适量的生物素标记的TROP2抗原结合到链亲和素偶联的磁珠上(例如DynabeadsTMM-280Streptavidin,ThermoFisherScientific，目录号11205D)。解冻一份人抗体库，其中包含100亿个表达有不同抗体的噬菌体颗粒。磁珠和抗体库都以4％的脱脂奶粉溶液(4％MPBS)封闭，以消除非特异性作用位点。由于磁珠上可能还有未被亲和素结合的链亲和素，同时由于TROP2抗原分子是由人Fc构成的融合蛋白，因此需要在解冻的抗体库中同时添加足量(50-100倍过量于所用的靶标蛋白的量)的链亲和素和人抗体Fc，以去除结合它们的抗体克隆。封闭好的抗体库溶液与磁珠一起(总体积<1ml)加到1.5ml的Eppendorf管中，在室温旋转混合孵育2小时，以便让TROP2和特异性的噬菌体抗体结合。孵育完成后把Eppendorf管置于磁力架上静置1分钟，分离磁珠和溶液。用移液枪尽量完全去除溶液部分，换上新的枪头(tip)，加入1ml洗涤液PBST(磷酸缓冲液(PBS)溶液中加入终浓度为0.05％的Tween 20)至Eppendorf管中，远离磁力架，以移液枪轻轻悬浮磁珠，重新置于磁力架上分离磁珠和溶液。去除溶液，如此重复三次。然后把洗涤液改成PBS，洗涤磁珠3次。经过洗涤，非特异性和低亲和力的噬菌体抗体被大部分去除，特异性的噬菌体抗体就留在磁珠上。向磁珠中加入洗脱液(10mM Glycine，pH2.0)，重悬磁珠，室温静置10分钟，以磁力架分离磁珠和溶液，吸取溶液至一个干净的Eppendorf管中，加入1/10 1M Tris溶液(pH8.0)以中和溶液，这就是洗脱液，其中包含了成千上万个，具有不同结合TROP2抗原亲和力的噬菌体抗体，如此就完成了第一轮淘选。
为了进一步收获亲和力比较高的特异性抗体克隆，需要进行更多轮淘选。为此，以第一轮淘选洗脱的噬菌体抗体溶液感染对数期的、能被M13噬菌体侵染的大肠杆菌(如TG1菌株)，得到感染液。取少量感染液进行一系列10倍梯度稀释(通常稀释至原液的百万分之一，并取最后三个梯度进行涂布)以测定第一轮产出洗脱液(output)的滴度(titer)，该titer又称为第一轮最大多样性，通常第一轮淘选后的产出滴度在10E6个cfu以下。把其余感染液全部涂布于含有相应抗生素的细菌培养板上过夜培养，以获取菌落；刮下菌落层并以液体培养基重悬，取足量包含第一轮output多样性的重悬液至含足量液体培养基(2YT-CG，2YT培养基中加入Carbenicillin和葡萄糖，终浓度分别是100μg/ml和2％)的摇瓶中，使重悬液稀释至0.1OD600以下并开始培养，直到对数期，即OD600达到0.5左右。为使第一轮淘选获取的这些抗体再次呈现于噬菌体颗粒表面，取10ml菌液，加入辅助噬菌体M13K07，使感染复数为20:1，静置于37℃,保持30分钟(这个阶段称之为噬菌体拯救)。离心，以50ml表达培养基(2YT-AK，2YT培基中加入Carbenicillin和Kanamycin，终浓度分别是100μg/ml和30μg/ml)重悬菌体，置于30℃，200转/分，培养过夜。次日离心收获培养上清，加入1/5体积的PEG8000/NaCl(PEG-8000 20％,NaCl 2.5M)，充分混匀，置于冰上孵育1小时。高速离心(11500×g)30分钟以收获噬菌体抗体颗粒。以1ml PBS溶液重悬沉淀，再次置于高速离心以去除细菌碎片。上清液即为第一轮淘选后的扩增液，其中包含的每个抗体克隆都被扩增了上万倍以上。这个扩增液即可用于第二轮的淘选实验。第二轮淘选的操作除了在PBST/PBS时，增加至各做6次(6/6)之外，其余和第一轮操作方法完全相同。在第三轮中，可以进一步增加洗涤次数至10/10。多轮淘选通常会有效地富集特异性的克隆，虽然多样明显减少,但它们的亲和力都比较高，便于后续的单克隆筛选。
为了获取特异性的单克隆抗体，需要进行单克隆噬菌体酶联免疫实验(MonophageELISA)。为此，把在第二轮和/或第三轮的梯度稀释中分离良好的单菌落，单独地接种至含2YT-AG的96-孔培养板中(每板接种93个菌落，留下三个孔作为阴性对照)，过夜培养，这就是母板(master plate)。将母板中每孔的菌液接种至新的培养板中生长至对数期，进行上述的噬菌体拯救，使每个克隆的抗体表达于噬菌体表面。在普通的96-孔酶联板上包被TROP2抗原(1μg/ml)。每个单独表达的单克隆噬菌体抗体菌液分别加入到TROP2板，后接合适的二抗(鼠抗M13单抗)及辣根过氧化物酶(HRP)偶联的三抗(兔抗鼠多抗)，加HRP底物显色，读取吸光值(450nM)。TROP2阳性克隆的判断方法是：高于阴性对照孔信号3倍以上。经过分析，多个孔对应的克隆显示对TROP2抗原阳性，这些克隆统称为hit。
从母板对应孔上将这些hit菌液分别接种至3ml 2YT-CG，置于37℃，200转/分，培养过夜。次日抽提噬菌粒DNA，以特异性引物测定包含每个hit的单链抗体区的序列。取编码区DNA序列翻译成氨基酸序列，对它们进行多重序列比较(CLUSTALW，网站链接https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)以判断克隆特异性。经过分析，这些hit在序列上属于两个不同的克隆，其中一个命名为1F7，由此获得了抗人TROP2抗原的全人抗体可变区序列。1F7的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-3所示，轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4-6所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。由1F7的轻链和重链可变区构成的单链抗体氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示。
实施例2抗体结合及功能验证
为了验证获得的TROP2抗体克隆是否结合纯化的TROP2抗原以及细胞膜表面表达的TROP2，1F7单链抗体的基因被克隆至真核表达载体pFH(益科思特公司制备)，得到质粒pFH-1F7。在该载体中，scFv基因和人IgG4的Fc基因融合，表达出scFv-Fc形式的蛋白，它可以用Potein-A进行亲和纯化，也可以用(HRP或荧光素)标记抗人Fc抗体进行检测。
获得了1F7的scFv-Fc蛋白后，以流式细胞仪检测了1F7对表达TROP2的CHO细胞系(益科思特公司制备)的结合，证实了1F7特异性结合细胞膜表面的TROP2抗原(见图2)。图中角百分数(阳性百分数)代表了抗体对细胞表面抗原的结合强弱。克隆1F7的阳性百分数为89.33％，由此验证了该抗体与人细胞表面抗原TROP2的结合能力。
实施例3抗体亲和力成熟
体外亲和力成熟是一种快速的定向分子进化操作：在DNA水平上引入突变，在蛋白结合的水平上进行筛选。对于1F7抗体而言，为了避免引入可能增强免疫原性的突变或者明显改变抗体的结构，突变位点局限于CDR区的序列，而且每个位置都分别进行饱和突变，每一种突变分别表达，分别检测。
亲和力成熟的操作过程是：首先把由1F7的轻重链可变区基因分别克隆至pUFL载体上(pUFL是一种可以在大肠杆菌中表达抗体Fab的质粒，由益科思特公司制备)，得到1F7的Fab形式。设计全套CDR区单点随机突变引物，以点突变试剂盒(QuikChange LightningMulti Site-Directed Mutagenesis Kit，Agilent目录号210515)分别对每个CDR位置进行PCR突变，分别转化BL21(DE3)感受态细菌，分别制备单克隆菌落平板，这些突变体统称为单点突变文库。同时把亲本1F7的Fab载体也进行转化。挑取>30个菌落制备DNA对突变区进行序列分析以评估突变效率。当突变效率合适时(大于80％)按每个CDR位置的突变挑取92个菌落至含有相应培基(2YT中含100μg/ml Carbenicillin+0.1％葡萄糖)的96-孔培养板中，另外挑取3个亲本菌落，留下三个孔为空白对照。平板置于37℃中，300转/分培养6小时，加入IPTG至终浓度1mM，转入30℃中，300转/分，培养过夜，Fab片段表达并分泌至培养基中。
通过预实验，优化酶联反应条件，使得1F7亲本抗体Fab对抗原TROP2的结合A450吸收值略高于本底信号的3倍左右。提前一天在酶联板上按0.25μg/ml包被TROP2抗原，次日按孔加入分泌表达的突变Fab，以HRP偶联的抗人Fab作为二抗，底物显色，读取A450，获得信号高于亲本孔最高值1.5倍的孔对应的克隆，这些克隆称之为hit。收集轻可变区所有的hit，重新进行诱导表达以及酶联实验以验证它们确实具有高于亲本抗体的亲和力。对重复阳性的克隆的质粒进行突变区序列分析，获取CDR氨基酸的突变信息，这个过程称之为初级筛选(primary screening)。由此获取了CDR区所有有益于亲和力提高的突变信息：重链可变区CDR中对亲和力有提供的突变位点见表1，轻链可变区CDR中对亲和力有提供的突变位点见表2。
表1 1F7重链可变区CDR中对亲和力提高有益的突变
CDR区位置 亲本氨基酸 有益的突变氨基酸
H31 S N
H53 N R，K，G
H99 G H，A
H100 D E
表2 1F7轻链可变区CDR中对亲和力提高有益的突变
CDR区位置 亲本氨基酸 有益的突变氨基酸
L28 G N,E
L30 S R,K
L50 A R
L52 S G,H,R
L53 S K
从初级文库中通过酶联实验筛选获得了整个CDR区有益于亲和力提高的所有单个突变信息后，重新设计新的多点突变引物，使其包含主要的有益突变，再次以点突变试剂盒构建突变文库，这个文库称为组合文库。为了尽可能筛选轻重链可变区中所有的突变组合，分别构建及筛选包含各自多个突变的轻、重链可变区的组合文库。以亲本重链可变区的轻链变区组合文库中，筛选到亲和力最高的前10个克隆，它们的轻链可变区氨基酸序列包含5种突变序列，序列如SEQ ID NO.21-25所示，其轻链可变区的CDR1具有SEQ ID NO.4、11、12任一所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.2、13、14任一所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.3、15任一所示的氨基酸序列。
以亲本轻链可变区的重链变区组合文库中，筛选获得了亲和力最高的10个克隆的氨基酸序列，它们的重链可变区的氨基酸序列包含了3种突变序列，分别如SEQ ID NO.18-20所示，其重链可变区的CDR1具有SEQ ID NO.1、7任一所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ IDNO.2、8、9任一所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.3、10任一所示的氨基酸序列。
同时，混合上述筛选所获得的阳性全部重链可变区混合克隆及全部阳性轻链可变区克隆，分别制备它们的DNA混合质粒，以酶切、链接的重组方式组装成最终的Fab抗体组合文库。对这个文库进行筛选，挑取信号最高的前10位，分析其DNA序列，得到3株不同的Fab克隆，它们具有相同的重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示；它们的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.21-24所示。
采用流式细胞仪(FACS)对以上筛选得到的TROP2抗体与不同细胞株的TROP2结合能力进行检测，结果表明，相对于亲本抗体1F7而言；亲和力提高的多株抗体(F7A，F7B，F7C)在流式细胞分析中表现出显著提高的表观亲和力。ELISA检测表明，亲本抗体1F7的内在亲和力约7.5nM，而突变体F7A的内在亲和力是4.35nM。
为了检验获得的突变体的亲和力是否得到了提高，分别制备、表达并纯化IgG形式的其中的一个突变体F7A以及1F7亲本抗体。1F7的重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQID NO.1所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.16所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；轻链全长序列如SEQ ID NO.30所示，重链全长序列如SEQ ID NO.29所示。其中F7A的重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示；轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，CDR2的氨基酸序列如SEQID NO.13所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.19所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示；轻链全长序列如SEQ IDNO.28所示，重链全长序列如SEQ ID NO.27所示。表达、纯化的抗体产物经表面等离子共振技术(SPR)检测，它们与人及食蟹猴的TROP2蛋白的结合曲线如图3所示。亲和力分析数据如表3所示。结果表明，突变体F7A对人TROP2的结合相比于1F7均有1.74倍的提高；对猴TROP2的亲和力有3.18倍的提高。人、猴交叉倍数从5.38倍缩小到2.94倍(表3)。
表3 SPR分析1F7及F7A对人、猴TROP2的亲和力
抗体 抗原 ka(1/Ms) kd(1/s) 亲和力KD(M)
1F7 Human TROP-2 1.18E+05 8.92E-04 7.57E-09
1F7 Rhesus TROP-2 2.31E+04 9.42E-04 4.07E-08
F7A Human TROP-2 1.92E+05 8.34E-04 4.35E-09
F7A Rhesus TROP-2 1.28E+05 1.65E-03 1.28E-08
实施例4 TROP2×CD3双特异性抗体设计
本实施例以肿瘤细胞表面抗原TROP2和免疫细胞表面抗原CD3作为靶点，设计双特异性抗体。
结合蛋白质结构设计软件和大量的人工实验筛选，本发明在多种结合TROP2和CD3的双特异性抗体结构中筛选确定了包括单链抗体单元和单克隆抗体单元的具有对称结构的双特异性抗体结构。本发明将这种技术平台称之为FIST(fusion of IgG and scFvtechnology)。例如，抗TROP2单克隆抗体单元可以作为IgG抗体，包括2个完整的轻链-重链对(即含有完整的Fab和Fc结构域，重链和轻链之间通过二硫键连接)，抗CD3可以作为单链抗体单元，包括2个单链抗体(ScFv)。单链抗体和单克隆抗体之间采用连接肽连接，对于单链抗体和单克隆抗体的连接方式，可以设计下述连接方式，由此获得对称结构的双特异性抗体，其结构示意图如图4所示。
将单链抗体的C端与单克隆抗体的重链可变区(VH)N端通过连接，得到nFIST(图4的A)。单链抗体也可与IgG-Fc的C端通过连接肽融合，得到cFIST(图4的B)。抗CD3单链抗体UCHT1的可变区序列来自文献(Beverley,P.C.&Callard,R.E.Distinctive functionalcharacteristics ofhuman"T"lymphocytes defined by Erosetting or a monoclonalanti-T cell antibody(1981)Eur.J.Immunol.11,329-334)并经人源化改造(Shalabyet.al.,Development of humanized bispecific antibodies reactive with cytotoxiclymphocytes and tumor cells overexpressing the HER2 protooncogene.(1992)J ExpMed.Jan 1；175(1):217-25)。由此构建的单链抗体命名为K3(SEQ ID NO.33)，包含了分别安插在重链可变区和轻链可变区里面的两个半胱氨酸(Cys)，在折叠之后形成一对链间二硫键,其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.32所示。。利用表面等离子共振技术，对单链抗体形式K3与人CD3的结合力进行了检测，结果如图5所示。
实施例5 TROP2×CD3双特异性抗体的制备
根据实施例4中设计中cFIST形式的双特异性抗体编码基因并克隆至表达载体pG4HK，得到的2个双特异性抗体F7AK3和1F7K3，它们的重链氨基酸序列分别如SEQ IDNO.35、36所示；轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO.28、30所示。将1F7K3和F7AK3各自对应的表达质粒分别稳定转染CHO-K1，表达制备双抗蛋白。
为获得高纯度的双特异性抗体，按照以下步骤进行纯化。(1)料液预处理：发酵培养的上清液通过2000rpm离心，10min，然后用0.22μM滤膜过滤处理。(2)亲和层析：用Mabselect SuRe亲和层析柱(购自GE公司，货号18-5438-02)捕获经过预处理的发酵液中的抗体，用平衡缓冲液(10mM PB，0.1M NaCl，pH7.0)充分平衡层析柱后，过亲和层析柱，用洗脱缓冲液(0.1M柠檬酸酸，pH 3.0)洗脱。(3)阳离子交换层析：经亲和层析制备的样品，进一步通过分子筛交换层析纯化，缓冲液(50mM PBS，0.2Man Na2SO4，pH 6.7)。
将1F7K3和F7AK3进行SDS-PAGE和HPLC-SEC检测，SDS-PAGE的结果如图6所示，HPLC-SEC检测结果如图7所示。检测结果表明，经表达和纯化成功制备得到了双特异性抗体1F7K3和F7AK3，经纯化后的双特异性抗体的单体纯度在95％以上。
实施例6流式分析法检测双特异性抗体F7AK3与TROP2细胞及T细胞的结合活性
为验证F7AK3对TROP2细胞系及T细胞的结合，以cFIST形式，构建F7A与单链抗体K3的双特异性抗体。
取乳腺癌细胞系MCF、MDA-MB-231、MDA-MB-468、HCC1395、CD3+T细胞，按1×106细胞/反应管重悬于PBS中，以1ml结合缓冲液(含有0.5％w/v BSA+2mM EDTA的PBS)漂洗细胞一次，离心(350×g，4℃，5min)，后用200μl结合缓冲液重悬细胞。加入双特异抗体和F7AK3至5μg/ml，冰上孵育45min。如上漂洗细胞一次后用100μl结合缓冲液重悬细胞。样品管加入5μl荧光标记二抗抗体(PE anti-human IgG Fc Antibody,Biolegend,409304)。如上漂洗细胞一次。用200μl PBS重悬细胞后，上机(Beckman)检测。对各细胞系的流式分析图如图8的A。结合梯度分析见图8的B-E，其中，对人T细胞的CD3的结合见图8的F。EC50分析数据如表4和图8的G所示。结果表明，F7AK3能够浓度依赖性的结合不同TROP2表达水平的TNBC细胞系，同时也能有效地结合人T细胞的CD3，其EC50相差2倍～10倍(表4)。同时，如图9所示，F7AK3能交联T细胞和TNBC癌细胞(如MDA-MB-468)，形成胞簇体(synapse)。
表4流式细胞术检测F7AK3对TROP2+细胞系及CD3+T细胞的结合
MCF MDA-MB-231 MDA-MB-468 HCC1395 CD3<sup>+</sup>T细胞
EC50(ng/ml) 204.8 89.06 66.77 53.24 568.3
实施例7双特异性抗体介导的体外细胞杀伤效率检测
本实施例分别以MCF、MDA-MB-231、MDA-MB-468、HCC1395及鼠源细胞4T1为靶细胞，以PBMC为免疫效应细胞，检测双特异性抗体F7AK3介导的靶细胞的杀伤作用。具体实验步骤如下：
1)靶细胞准备：培养靶细胞，吹匀后计数，1000rpm，离心5min，PBS洗涤一次。靶细胞离心洗涤后用GT-T551培养基调整密度为0.2×106/ml,每孔加入50μl，则每孔中细胞为10000个。
2)PBMC准备：以PBMC为效应细胞。将冻存在液氮罐中的PBMC取出(参考细胞冻存与复苏)解冻，加入含有PBS或GT-T551培养基的15ml离心管中，1000rpm，离心5min，用PBS或GT-T551培养基洗涤两次，计细胞数、活度与密度，并调整活细胞密度为2×106/ml，每孔加入50μl，则每孔中细胞为100000个。
3)抗体稀释：采用GT-T551培养基稀释双特异性F7AK3，将抗体起始浓度调整到10nM。依次以1：5的比例稀释。将稀释好的抗体取100μl加入上述准备的细胞中，混匀，将96孔板放回培养箱，24小时后检测杀伤效果。
4)检测：通过PMA染色区分死活细胞，然后通过细胞计数计算出杀伤效率。
5)数据处理：靶细胞杀伤比例的计算公式如下：
靶细胞杀伤比例(百分数)＝100×(仅有靶细胞孔读值-检测孔读值)/仅有检测孔读值。
将所有检测孔的靶细胞杀伤比例对应的抗体浓度转变为log10，以此作为横坐标、以杀伤比例作为纵坐标制作曲线。F7AK3对敏感细胞株MCF、MDA-MB-231、MDA-MB-468、HCC1395的杀伤浓度-梯度曲线如图10所示；不同细胞杀伤百分数如表5所示。F7AK3对不同的TROP2+细胞，表现出不同的杀伤能力。
表5双特异性抗体介导的靶细胞杀伤效果
MCF MDA-MB-231 MDA-MB-468 HCC1395
杀伤效率(％) 25 50 75 82
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 益科思特（北京）医药科技发展有限公司
<120> 一种结合TROP2的抗体及靶向TROP2和CD3的双特异性抗体及其制备方法与应用
<130> KHP211116562.5
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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Ser Tyr Gly Ile Asn
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Gly
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Gly
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Trp Met Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
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Gly
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Pro Gly Thr Gly Gly Asp Gly Ala Phe Asp Ile
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Arg Ala Ser Gln Gly Ile Lys Ser Trp Leu Ala
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Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Val Thr
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
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Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Pro Asn Thr Gly Gly Asp Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
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Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Ile
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<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Pro Asn Thr Gly Gly Asp Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
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Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Arg Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
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Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
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Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Trp Met Asn Pro Arg Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Arg Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Val
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Lys Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Arg Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Val
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Lys Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Arg Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Val
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Lys Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala His Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Val
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 107
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala His Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Val
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 26
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Asn Thr Gly Gly Asp Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ser
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln
130 135 140
Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
145 150 155 160
Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Arg Gln
165 170 175
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu
180 185 190
Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
195 200 205
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
210 215 220
Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Arg Leu Glu Ile Lys
245
<210> 27
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Arg Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Asn Thr Gly Gly Asp Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 28
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Arg Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Val
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 29
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Asn Thr Gly Gly Asp Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 30
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 31
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 32
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 33
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr
165 170 175
Lys Gly Val Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
195 200 205
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr
210 215 220
Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 35
<211> 701
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Arg Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Asn Thr Gly Gly Asp Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly
435 440 445
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
450 455 460
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
465 470 475 480
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys
485 490 495
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu
500 505 510
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr
515 520 525
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
530 535 540
Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys
545 550 555 560
Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
565 570 575
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
580 585 590
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
595 600 605
Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu
610 615 620
Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Thr Thr Tyr Ala
625 630 635 640
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn
645 650 655
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
660 665 670
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe
675 680 685
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
690 695 700
<210> 36
<211> 701
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Asn Thr Gly Gly Asp Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly
435 440 445
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
450 455 460
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
465 470 475 480
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys
485 490 495
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu
500 505 510
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr
515 520 525
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
530 535 540
Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys
545 550 555 560
Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
565 570 575
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
580 585 590
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
595 600 605
Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu
610 615 620
Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Thr Thr Tyr Ala
625 630 635 640
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn
645 650 655
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
660 665 670
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe
675 680 685
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
690 695 700

Claims (16)

1.一种TROP2抗体，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别具有SEQ ID NO.1-3所示的氨基酸序列，或者，其分别具有以SEQ IDNO.1-3所示的氨基酸序列为参考序列、含有如下突变中的一种或多种突变的组合的氨基酸序列：
(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第1位S突变为N；
(2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第4位P突变为R、K或G；
(3)SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的第1位P突变为H、A；
(4)SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的第2位N突变为E；
所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别具有SEQ ID NO.4-6所示的氨基酸序列，或者，其分别具有以SEQ ID NO.4-6所示的氨基酸序列为参考序列，含有如下突变中的一种或多种突变的组合的氨基酸序列：
(1)SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的第5位G突变为N或E；
(2)SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的第7位S突变为R或K；
(3)SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的第1位A突变为R；
(4)SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的第3位S突变为G、H或R；
(5)SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的第4位S突变为K。
2.一种TROP2抗体，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的CDR1具有SEQ ID NO.1、7任一所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.2、8、9任一所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.3、10任一所示的氨基酸序列；
轻链可变区的CDR1具有SEQ ID NO.4、11、12任一所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ IDNO.5、13、14任一所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.6、15任一所示的氨基酸序列；
优选地，所述重链可变区的CDR为如下任一种：
(1)CDR1具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；
(2)CDR1具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；
(3)CDR1具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；
(4)CDR1具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列；
轻链可变区的CDR为如下任一种：
(1)CDR1具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；
(2)CDR1具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列；
(3)CDR1具有SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列；
(4)CDR1具有SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列；
(5)CDR1具有SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列；
(6)CDR1具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列；
更优选地，所述重链可变区的CDR和轻链可变区的CDR为如下任一种：
(1)重链可变区的CDR1具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；轻链可变区的CDR1具有SEQ IDNO.4所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；
(2)重链可变区的CDR1具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；轻链可变区的CDR1具有SEQ IDNO.4所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ IDNO.15所示的氨基酸序列；
(3)重链可变区的CDR1具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；轻链可变区的CDR1具有SEQ IDNO.12所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ IDNO.15所示的氨基酸序列；
(4)重链可变区的CDR1具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；轻链可变区的CDR1具有SEQ IDNO.12所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ IDNO.15所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的TROP2抗体，其特征在于，所述重链可变区具有SEQ ID NO.16、18-20任一所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO.17、21-25任一所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区、轻链可变区与前述序列相比具有满足以下二者中至少一个：a)结合相同抗原表位；b)序列同一性大于70％、80％、85％、90％、97％、98％或99％的氨基酸序列；
优选地，所述重链可变区具有SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQID NO.17所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区具有SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ IDNO.21所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区具有SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ IDNO.23所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区具有SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ IDNO.24所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1～3任一项所述的TROP2抗体，其特征在于，所述重链的Fc片段为人或人源化抗体的Fc片段，所述人或人源化抗体为IgG1、IgG2、IgA、IgE、IgM、IgG4或IgD。
5.根据权利要求1～4任一项所述的TROP2抗体，其特征在于，所述抗体的重链具有SEQID NO.27、29任一所示的氨基酸序列，轻链具有SEQ ID NO.28、30任一所示的氨基酸序列；
或者，所述重链、轻链与前述序列相比具有满足以下二者中至少一个：a)结合相同抗原表位；b)序列同一性大于70％、80％、85％、90％、97％、98％或99％的氨基酸序列；
优选地，所述抗体的重链具有SEQ ID NO.27所示的氨基酸序列，轻链具有SEQ IDNO.28所示的氨基酸序列；或者，所述抗体的重链具有SEQ ID NO.29所示的氨基酸序列，轻链具有SEQ ID NO.30所示的氨基酸序列。
6.含有权利要求1～5任一项所述的TROP2抗体的单链抗体、Fab抗体、微型抗体、嵌合抗体、全抗体免疫球蛋白IgG1、IgG2、IgA、IgE、IgM、IgG4或IgD、双特异性抗体、多特异性抗体。
7.结合TROP2和CD3的双特异性抗体，其特征在于，包括：
第一结构域，结合滋养层细胞表面抗原2，
以及，第二结构域，结合T细胞表面抗原CD3，
所述第一结构域包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区为如权利要求1～3任一项所述的TROP2抗体的重链可变区和轻链可变区。
8.根据权利要求7所述的结合TROP2和CD3的双特异性抗体，其特征在于，所述第一结构域为2个通过二硫键连接的完整的轻链-重链对，其重链和轻链的氨基酸序列为如权利要求5所述的TROP2抗体的重链和轻链的氨基酸序列。
9.根据权利要求7或8所述的结合TROP2和CD3的双特异性抗体，其特征在于，所述第二结构域的重链可变区具有SEQ ID NO.31所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO.32所示的氨基酸序列；
优选地，所述第二结构域的轻链可变区和重链可变区通过连接肽连接为单链抗体，所述单链抗体具有SEQ ID NO.33所示的氨基酸序列。
10.根据权利要求7～9任一项所述的结合TROP2和CD3的双特异性抗体，其特征在于，所述第二结构域包含2个单链抗体，所述双特异性抗体为通过如下任意一种方式连接而成的对称结构：
(1)所述第二结构域的2个单链抗体的C端分别通过连接肽与所述第一结构域的2条重链的N端连接；
(2)所述第二结构域的2个单链抗体的N端分别通过连接肽与所述第一结构域的2条重链的C端连接；
优选地，所述连接肽的氨基酸序列为(GGGGX)n，其中，X为Gly或Ser，n为1-4的自然数；
更优选地，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示。
11.根据权利要求7～10任一项所述的结合TROP2和CD3的双特异性抗体，其特征在于，所述第一结构域的重链与所述第二结构域经连接肽连接后具有SEQ ID NO.35或36所示的氨基酸序列，轻链具有SEQ ID NO.28或30所示的氨基酸序列；
优选地，所述第一结构域的重链与所述第二结构域经连接肽连接后具有SEQ ID NO.35所示的氨基酸序列，轻链具有SEQ ID NO.28所示的氨基酸序列，或者，所述第一结构域的重链与所述第二结构域经连接肽连接后具有SEQ ID NO.36所示的氨基酸序列，轻链具有SEQID NO.30所示的氨基酸序列。
12.一种核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1～5任一项所述的TROP2抗体，或者，其编码权利要求7～11任一项所述的结合TROP2和CD3的双特异性抗体。
13.含有权利要求12所述的核酸分子的生物材料，所述生物材料包括重组DNA、表达盒、载体、宿主细胞、工程菌或细胞系。
14.权利要求1～5任一项所述的TROP2抗体或权利要求7～11任一项所述的结合TROP2和CD3的双特异性抗体的制备方法，其特征在于，包括：将编码所述抗体的核酸导入宿主细胞中，获得稳定表达所述双特异性抗体的宿主细胞；培养宿主细胞，经分离纯化获得所述抗体。
15.权利要求1～5任一项所述的TROP2抗体或权利要求7～11任一项所述的结合TROP2和CD3的双特异性抗体或权利要求12所述的核酸分子或权利要求13所述的生物材料的如下任一种应用：
(1)在制备用于诊断、预防或治疗TROP2表达的相关疾病的药物中的应用；
(2)在制备用于诊断、预防或治疗以TROP2为靶标的疾病的药物中的应用；
(3)在制备用于杀伤TROP2表达的细胞的药物中的应用；
(4)在制备TROP2和/或CD3的检测试剂中的应用；
(5)在制备适用于CAR-T疗法的相关试剂中的应用；
(6)在制备免疫毒素或标记抗体中的应用。
16.包含权利要求1～5任一项所述的TROP2抗体或权利要求7～11任一项所述的结合TROP2和CD3的双特异性抗体的多特异性抗体、融合蛋白、免疫毒素、药物或检测试剂。
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