CN117881702A - 一种cd16抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

涉及CD16抗体及其应用。具体而言，涉及一种特异性结合CD16的抗体或抗原结合片段，其编码核酸、表达载体和表达细胞、制备方法、药物组合物、以及它们用于治疗疾病的用途，例如治疗肿瘤中的用途。对于CD16抗体治疗药物和检测试剂的开发具有重要意义。

Description

一种CD16抗体及其应用
本申请要求2021年8月3日向中国国家知识产权局提交的，专利申请号为202110887797.1，发明名称为《一种CD16抗体及其应用》的中国专利申请的优先权。上述在先申请的全文通过引用的方式结合于本申请中。
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及CD16抗体及其应用。
背景技术
自然杀伤细胞(Natural killer cell,NK cell)是先天性免疫系统的组成部分，占循环淋巴细胞的大约5-15％。与B细胞和T细胞不同，NK细胞不表达体细胞重排的抗原受体，而是表达一系列激活型和抑制型受体，来自配体和不同受体相互作用的激活和抑制信号的整合以及平衡决定了NK细胞激活的状态。激活的NK细胞通过与细胞毒性T细胞相似的手段杀伤靶细胞，即通过含有穿孔素和颗粒酶的细胞溶解颗粒以及通过死亡受体途径。激活的NK细胞还分泌炎性细胞因子例如IFN-γ和促进其他炎性细胞向靶组织招募的趋化因子。与T细胞不同，NK细胞不需要抗原启动，并通过在没有MHC识别的情况下激活受体来识别目标。
肿瘤细胞表面的I类HLA(MHC I)分子通过结合NK细胞表面的抑制性受体来抑制NK细胞的激活。然而，许多肿瘤细胞通过下调MHC I分子的表达来逃避细胞毒性CD8 +T细胞的监测；因此，在肿瘤微环境中，当T细胞无法识别肿瘤细胞时，NK细胞由于缺乏MHC I诱导的抑制信号，可以通过“丢失自我”机制来杀死肿瘤细胞。
人IgG Fc受体CD16(FcγRIII)由两种亚型(CD16a/FcγRIIIa和CD16b/FcγRIIIb)组成，由两个高度同源的基因编码。CD16b(FcγRIIIb)主要在中性粒细胞上表达，是一种GPI锚定糖蛋白，缺失胞内信号转导结构域。CD16b存在基因多态性，可以产生三种同种异型体，分别为NA1、NA2和SH。CD16a是人IgG Fc的低亲和力受体，单次跨膜蛋白，参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)并触发自然杀伤(NK)细胞对靶细胞的特异裂解。ADCC是由表达FcγR的效应细胞清除肿瘤细胞的细胞毒性主导机制之一。CD16a基因的cDNA在核苷酸序列位置的559处从G到T的单核苷酸取代(SNP)产生两种不同的FcγRIIIa同种异型：在氨基酸序列的第158位，一种编码为缬氨酸(V)，另一种编码为苯丙氨酸(F)。与纯合苯丙氨酸基因型(F/F)相比，缬氨酸(V/V或V/F)的存在可增强NK细胞对IgG1或IgG3抗体的结合亲和力，从而导致更高的NK细胞介导ADCC的水平。在基于抗体的免疫治疗中，NK细胞介导的ADCC是利妥昔单抗、曲妥珠单抗和西妥昔单抗等常用抗体抗癌作用的机制之一。针对几项临床研究的分析，证明了在非霍奇金淋巴瘤、HER-2/neu阳性转移性乳腺癌、转移性结直肠癌或头颈癌中，具有V/V多态性的患者与具有F/F的患者相比，具有改善的无进展生存期。
发明内容
NK细胞的ADCC功能在抗体免疫疗法中受到高度关注。同时具有募集ADCC受体CD16a和识别靶抗原的双特异性抗体已经在开发中。开发靶向CD16的治疗性抗体，具有广阔的前景。而鉴于CD16a和CD16b虽然在胞外结构域上高度相似，但二者的功能存在较大差异，提高抗体对CD16a的亲和力，和/或降低其对CD16b的亲和力具有重要意义。同时，考虑到 免疫球蛋白的存在影响抗体对CD16的结合活性，因此，同样有必要筛选在免疫球蛋白存在的情况下，仍较好保持CD16结合活性的抗体。有鉴于此，特提出本发明。
本公开提供一种特异性结合CD16的抗体或抗原结合片段、多特异性抗原结合分子、核酸片段、载体(vector)、宿主细胞、免疫效应细胞、制备方法、药物组合物、制药用途以及癌症或肿瘤、感染性疾病或自身免疫性疾病的治疗方法。
第一方面，本公开提供一种特异性结合CD16的抗体或抗原结合片段，包含轻链CDRs组合和重链CDRs组合：
(1)所述轻链CDRs组合包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1、LCDR2、LCDR3选自下表所示序列：
编号 CDR1 CDR2 CDR3
VL1 SEQ ID NO：40 SEQ ID NO：41 SEQ ID NO：42
VL2 SEQ ID NO：46 SEQ ID NO：41 SEQ ID NO：42
VL3 SEQ ID NO：47 SEQ ID NO：41 SEQ ID NO：42
VL4 SEQ ID NO：40 SEQ ID NO：41 SEQ ID NO：48
VL5 SEQ ID NO：40 SEQ ID NO：41 SEQ ID NO：49
VL6 SEQ ID NO：40 SEQ ID NO：41 SEQ ID NO：50
VL7 SEQ ID NO：40 SEQ ID NO：41 SEQ ID NO：51
VL8 SEQ ID NO：52 SEQ ID NO：41 SEQ ID NO：42
VL9 SEQ ID NO：53 SEQ ID NO：41 SEQ ID NO：42
VL10 SEQ ID NO：54 SEQ ID NO：41 SEQ ID NO：42
VL11 SEQ ID NO：40 SEQ ID NO：55 SEQ ID NO：42
VL12 SEQ ID NO：40 SEQ ID NO：41 SEQ ID NO：56
VL13 SEQ ID NO：40 SEQ ID NO：41 SEQ ID NO：57
VL14 SEQ ID NO：40 SEQ ID NO：41 SEQ ID NO：58
VL15 SEQ ID NO：40 SEQ ID NO：41 SEQ ID NO：59
VL16 SEQ ID NO：52 SEQ ID NO：55 SEQ ID NO：58
VL17 SEQ ID NO：52 SEQ ID NO：55 SEQ ID NO：59
VL18 SEQ ID NO：53 SEQ ID NO：55 SEQ ID NO：58
VL19 SEQ ID NO：53 SEQ ID NO：55 SEQ ID NO：59
和，
(2)所述重链CDRs组合包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3选自下表所示序列：
编号 CDR1 CDR2 CDR3
VH1 SEQ ID NO：43 SEQ ID NO：44 SEQ ID NO：45
VH2 SEQ ID NO：60 SEQ ID NO：44 SEQ ID NO：45
VH3 SEQ ID NO：43 SEQ ID NO：44 SEQ ID NO：61
VH4 SEQ ID NO：62 SEQ ID NO：44 SEQ ID NO：45
VH5 SEQ ID NO：63 SEQ ID NO：44 SEQ ID NO：45
VH6 SEQ ID NO：64 SEQ ID NO：44 SEQ ID NO：45
VH7 SEQ ID NO：43 SEQ ID NO：65 SEQ ID NO：45
VH8 SEQ ID NO：43 SEQ ID NO：44 SEQ ID NO：66
VH9 SEQ ID NO：43 SEQ ID NO：44 SEQ ID NO：67
VH10 SEQ ID NO：62 SEQ ID NO：44 SEQ ID NO：66
优选地，例如本发明的抗体或抗原结合片段包含选自以下的轻链CDRs和重链CDRs组合：VL2+VH1、VL3+VH1、VL4+VH1、VL5+VH1、VL6+VH1、VL7+VH1、VL8+VH1、VL9+VH1、VL10+VH1、VL11+VH1、VL12+VH1、VL13+VH1、VL14+VH1、VL15+VH1、VL1+VH2、VL1+VH3、VL1+VH4、VL1+VH5、VL1+VH6、VL1+VH7、VL1+VH8、VL1+VH9、VL16+VH10、VL17+VH10、VL18+VH10、VL19+VH10、VL16+VH4、VL17+VH4、VL18+VH4和VL19+VH4。
在一些具体的实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含：
(1)SEQ ID NO：12、14～27、68～71任一项的轻链可变区，或与前述序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高一致性的序列；和，
(2)SEQ ID NO：13、28～35、72任一项的重链可变区，或与前述序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高一致性的序列；
优选地，所述抗体或抗原结合片段包含：
1)SEQ ID NO：14～27任一项所示轻链可变区序列，和SEQ ID NO：13所示重链可变区序列；
2)SEQ ID NO：12所示轻链可变区序列，和SEQ ID NO：28～35任一项所示重链可变区序列；
3)SEQ ID NO：68～71任一项所示轻链可变区序列，和SEQ ID NO：72所示重链可变区序列；
4)SEQ ID NO：68～71任一项所示轻链可变区序列，和SEQ ID NO：30所示重链可变区序列；或，
5)与第1)-4)组所示序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高一致性的序列。
在一些具体的实施方案中，所述抗体或抗原结合片段还偶联有治疗剂或示踪剂；优选地，所述治疗剂选自放射性同位素、化疗药或免疫调节剂，所述示踪剂选自放射学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂和光敏剂。
在一些具体的实施方案中，所述抗体或抗原结合片段选自F(ab) 2、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异性抗体和纳米抗体的一种或多种；优选地，所述抗体或抗原结合片段为scFv，更优选地，由N端到C端，所述scFv包括轻链可变区-Linker-重链可变区，所述linker优选为(G2S) 7。
在一些具体的实施方案中，所述抗体或抗原结合片段还连接有其他功能性分子，优选地，所述其他功能性分子可选自以下的一种或多种：信号肽、蛋白标签、细胞因子、血管生成抑制剂或免疫检查点抑制剂。
在一些具体的实施方式中，所述细胞因子可为IL2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-21、IFN或TNFα；所述血管生成抑制剂可为内皮抑制素；所述免疫检查点抑制剂可为SIRPα。
在第二方面，本公开还提供一种多特异性抗原结合分子，所述多特异性抗原结合分子包含前述的抗体或抗原结合片段，以及结合CD16以外其他抗原的抗原结合分子，或结合与前述抗体或抗原结合片段不同的CD16表位；可选地，所述CD16以外的其他抗原可选自：CD137、CD258、PD-1、PD-L1、4-1BB、CD40、CD64、EGFR、VEGF、CD3(优选为CD3ε)、HER2、HER1、HER3、IGF-1R、磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)、C-Met、BCMA、HSA、GPRC5D、MSLN或血脑屏障受体；
优选地，所述其他抗原结合分子为抗体或抗原结合片段；
优选地，所述多特异性抗原结合分子可为双特异性、三特异性或四特异性；
优选地，所述多特异性抗原结合分子可为二价、四价或六价。
在第三方面，本公开还提供一种分离的核酸片段，所述核酸片段编码前述抗体或抗原结合片段或多特异性抗原结合分子。
在第四方面，本公开还提供一种载体(vector)，所述载体包含前述的核酸片段。
在第五方面，本公开还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含前述的载体；优选地，所述细胞为原核细胞或真核细胞，例如细菌(大肠杆菌)、真菌(酵母)、昆虫细胞或哺乳动物细胞(CHO细胞系或293T细胞系)。
在第六方面，本公开还提供一种制备前述抗体或抗原结合片段或多特异性抗原结合分子的方法，所述方法包括培养前述细胞，以及分离所述细胞表达的抗体、抗原结合片段或多特异性抗原结合分子。
在第七方面，本公开还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含前述的抗体或抗原结合片段、多特异性抗原结合分子、核酸片段、载体或根据前述方法制备获得的产品；可选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的运载体(carrier)、稀释剂或助剂；可选地，所述药物组合物还包含额外的抗肿瘤剂。
在第八方面，本公开还提供一种治疗肿瘤或癌症、炎性疾病或过敏症疾病的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的前述的抗体或抗原结合片段、多特异性抗原结合分子、核酸片段、载体、根据前述方法制备获得的产品或药物组合物；优选地，肿瘤或癌症选自非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、霍奇金氏病、微小残留病、转移瘤。
在第九方面，本公开还提供前述抗体或抗原结合片段、多特异性抗原结合分子、核酸片段、载体、根据前述方法制备获得的产品或药物组合物在制备治疗肿瘤或癌症、炎性疾病或过敏症药物中的用途；优选地，肿瘤或癌症选自非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、霍奇金氏病、微小残留病、转移瘤。
有益效果：本公开提供的CD16抗体，对于CD16a与CD16b的特异性不同，所述抗体至少具有以下之一的优势：(1)在免疫球蛋白存在或不存在的情况下，与CD16a(158F)和/或CD16a(158V)的亲和力上升；(2)在免疫球蛋白存在或不存在的情况下，与CD16b(NA1)和/或CD16b(NA2)的亲和力下降。因此，本公开提供的抗体能较好的区分CD16的这两种亚型，进而提供一种较好的针对CD16靶点的肿瘤免疫治疗方法。
术语定义和说明
除非本文另外定义，与本公开相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员所理解的含义。
此外，除非本文另有说明，本文单数形式的术语应包括复数形式，复数形式的术语应包括单数形式。更具体地，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非另外明确指出，否则单数形式“一种”和“这种”包括复数指示物。
本文术语“包括”、“包含”和“具有”之间可互换使用，旨在表示方案的包含性，意味着所述方案可存在除所列出的元素之外的其他元素。同时应当理解，在本文中使用“包括”、“包含”和“具有”描述，也提供“由……组成”方案。
术语“和/或”在本文使用时，包括“和”、“或”和“由所属术语链接的要素的全部或任何其他组合”的含义。
本文术语“CD16”是指免疫球蛋白G Fc部分的受体Ⅲ型(FcγRⅢ)，是一组在自然杀伤细胞、中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞表面发现的分化分子。CD16已被鉴定为Fc受体FcγRⅢa(CD16a)和FcγRⅢb(CD16b)，参与信号转导。人FcγRIIIA(CD16a)是在人CD56低表达自然杀伤(NK)细胞、单核细胞亚群、树突状细胞和稀有T细胞表达的可以与IgG Fc结合的低亲和力受体。人FcγRIIIB(CD16b)由不同的基因编码，主要在中性粒细胞表达，是一种GPI锚定糖蛋白，缺失胞内信号转导结构域。CD16a是I型膜糖蛋白，具有单个跨膜(TM)结构域和短胞质尾，其在细胞表面的表达取决于与信号转导分子CD247(TCRζ)和/或Fc-εRI-γ的结合，它们一旦发生相互作用则诱导一系列信号转导，导致细胞因子释放和细胞杀伤活性。
本文术语“特异性结合”是指抗原结合分子(例如抗体)通常以高亲和力特异性结合抗原和实质上相同的抗原，但不以高亲和力结合不相关抗原。亲和力通常以平衡解离常数(equilibrium dissociation constant，KD)来反映，其中较低KD表示较高亲和力。以抗体为例，高亲和力通常指具有约10 -6M或更低、10 -7M或更低、约10 -8M或更低、约10 -9M或更低或约10- 10M或更低的KD。KD计算方式如下：KD＝Kd/Ka，其中Kd表示解离速率，Ka表示结合速率。可采用本领域周知的方法测量平衡解离常数KD，如表面等离子共振(例如Biacore)或平衡透析法测定。
本文术语“抗原结合分子”按最广义使用，是指特异性结合抗原的分子。示例性地，抗原结合分子包括但不限于抗体或抗体模拟物。“抗体模拟物”是指能够与抗原特异性结合，但与抗体结构无关的有机化合物或结合域，示例性地，抗体模拟物包括但不限于affibody、affitin、affilin、经设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、核酸适体或Kunitz型结构域肽。
本文术语“抗体”按最广义使用，是指包含来自免疫球蛋白重链可变区的足够序列和/或来自免疫球蛋白轻链可变区的足够序列，从而能够特异性结合至抗原的多肽或多肽组合。本文“抗体”涵盖各种形式和各种结构，只要它们展现出期望的抗原结合活性。本文“抗体”包括具有移植的互补决定区(CDR)或CDR衍生物的替代蛋白质支架或人工支架。此类支架包括抗体衍生的支架(其包含引入以例如稳定化抗体三维结构的突变)以及包含例如生物相容性聚合物的全合成支架。参见，例如Korndorfer et al.,2003,Proteins:Structure,Function,and Bioi nformatics,53(1):121-129(2003)；Roque et al.,Biotechnol.Prog.20:639-654(2004)。此类支架还可 以包括非抗体衍生的支架，例如本领域已知可用于移植CDR的支架蛋白，包括但不限于肌腱蛋白、纤连蛋白、肽适体等。
术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。“抗体”是指包含通过二硫键互相连接在一起的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(在此缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(在此缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可进一步再分为高变区，称为互补决定区(CDR)，CDR散布在被称为构架区(FR)的更加保守的区域中。每个VH和VL，均由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基端向羧基端以如下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有可与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，该宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一成分(C1q)。由于免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将本文“免疫球蛋白”分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，IgA可分为IgA1和IgA2。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。
本文“抗体”还包括不包含轻链的抗体，例如，由单峰驼(Camelus dromedarius)、双峰驼(Camelus bactrianus)、大羊驼(Lama glama)、原驼(Lama guanicoe)和羊驼(Vicugna pacos)等骆驼科动物产生的重链抗体(heavy-chain antibodies,HCAbs)以及在鲨等软骨鱼纲中发现的免疫球蛋白新抗原受体(Ig new antigen receptor,IgNAR)。
本文术语“抗体”可以来源于任何动物，包括但不限于人和非人动物，所述非人动物可选自灵长类动物、哺乳动物、啮齿动物和脊椎动物，例如骆驼科动物、大羊驼、原鸵、羊驼、羊、兔、小鼠、大鼠或软骨鱼纲(例如鲨)。
本文术语“重链抗体”是指缺乏常规抗体的轻链的抗体。该术语具体包括但不限于在不存在CH1结构域的情况下包含VH抗原结合结构域以及CH2和CH3恒定结构域的同型二聚体抗体。
本文术语“纳米抗体”是指骆驼等体内存在天然的缺失轻链的重链抗体，克隆其可变区可以得到只有重链可变区组成的单域抗体，也称为VHH(Variable domain of heavy chain of heavy chain antibody)，它是最小的功能性抗原结合片段。
本文术语“VHH结构域”和“纳米抗体(nanobody)”、“单域抗体”(single domain antibody,sdAb)具有相同的含义并可互换使用，是指克隆重链抗体的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的重链抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体。
关于“重链抗体”和“单域抗体”、“VHH结构域”和“纳米抗体”的进一步描述可参见：Hamers-Casterman等，Nature.363,446-8(1993).Naturally occurring antibodies devoid o f light chains.；Muyldermans的综述文章(J Biotechnol.2001Jun；74(4):277-302.Single doma in camel antibodies:current status)；以及以下专利申请，其被作为一般背景技术提及：WO 94/04678，WO 95/04079和WO 96/34103；WO 94/25591，WO 99/37681，WO 00/40968，WO 00/43507，WO 00/65057，WO 01/40310，WO 01/44301，EP 1134231和WO 02/48193；WO97/49805，WO 01/21817，WO 03/035694，WO 03/054016和WO 03/055527；WO 03/050531；WO 01/90190；WO03/025020；以及WO 04/041867，WO 04/041862，WO 04/041865，WO 04/041863，WO 04/062551，WO 05/044858，WO 06/40153，WO 06/079372，WO 06/122786，WO 06/122787和WO 06/122825以及这些申请中提到的其他现有技术。
本文术语“多特异性”是指抗体或抗原结合片段结合例如不同抗原或同一抗原上的至少两种不同表位的能力。因此，诸如“双特异性”、“三特异性”、“四特异性”等术语是指抗体可以结合的不同表位的数目。例如，常规的单特异性IgG型抗体具有两个相同的抗原结合位点(互补位)，因此仅可以结合相同的表位(而不是结合不同的表位)。相比之下，多特异性抗体具有至少两种不同类型的互补位/结合位点，因此可以结合至少两种不同的表位。如本文所述，“互补决定区”是指抗体的抗原结合位点。此外，单个“特异性”可以指单个抗体中的一个、两个、三个或多于三个相同的互补决定区(一个单个抗体分子中的互补决定区/结合位点的实际数量称为“价”)。例如，单个天然IgG抗体是单特异性和二价的，因为它具有两个相同的互补位。相应地，多特异性抗体包含至少两种(不同的)互补决定区/结合位点。因此，术语“多特异性抗体”是指具有多于一个互补位并具有结合两种或多于两种不同表位的能力的抗体。术语“多特异性抗体”特别地包括如上文所定义的双特异性抗体，但是通常还包括蛋白质，例如特别结合三种或多于三种不同的表位的抗体、支架，即具有三种或多于三种互补位/结合位点的抗体。
本文术语“价”表示抗体/抗原结合分子中规定数目的结合位点的存在。因此,术语“单价”、“二价”、“四价”和“六价”分别表示抗体/抗原结合分子中一个结合位点、两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点的存在。
本文“全长抗体”、“完好抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，是指具有基本上与天然抗体结构相似的结构。
本文“抗原结合片段”和“抗体片段”在本文中可互换使用，其不具备完整抗体的全部结构，仅包含完整抗体的局部或局部的变体，所述局部或局部的变体具备结合抗原的能力。示例性地，本文“抗原结合片段”或“抗体片段”包括但不限于Fab、F(ab’)2、Fab’、Fab’-SH、Fd、Fv、scFv、双抗体(diabody)和单域抗体。
本文术语“嵌合抗体”是指以下抗体，其具有源自一种来源生物(如大鼠、小鼠、兔或羊驼)的免疫球蛋白的可变序列以及源自不同生物体(例如人)的免疫球蛋白的恒定区。用于生产嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如，Morrison,1985,Science 229(4719):1202-1207.Transfectomas Provide Novel Chimeric Antibodies；Gillies等人，J Immunol Methods.1989 Dec 20；125(1-2):191-202；以上通过援引加入并入本文。亦可参见专利US5807715A。
本文术语“人源化抗体”是指经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗 体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留或部分保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力或增强免疫应答的能力等。
本文术语“全人抗体”是指具有其中FR和CDR二者都源自人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，则恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本文全人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，本文“全人抗体”不包括其中来源于另一个哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。
本文术语“可变区”是指抗体重链或轻链中牵涉使抗体结合抗原的区域，“重链可变区”与“VH”、“HCVR”可互换使用，“轻链可变区”与“VL”、“LCVR”可互换使用。天然抗体的重链和轻链的可变域一般具有相似的结构,每个域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如Kindt et al.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,p.91(2007)。单个VH或VL域可足以赋予抗原结合特异性。
本文术语“互补决定区”与“CDR”可互换使用，通常指在轻链和重链可变结构域中均发现的高变区(HVR)。可变结构域中更高保守性的部分称为框架区(FR)。如本领域所理解的，表示抗体的高变区的氨基酸位置可以根据上下文和本领域已知的各种定义而变化。可变结构域内的一些位置可以被视为杂合高变位置，因为这些位置可以被认为是在一组标准(如IMGT或KABAT)下的高变区之内，而被认为在不同组的标准(如KABAT或IMGT)下的高变区之外。这些位置中的一个或更多个也可以在延伸的高变区中找到。本发明包括在这些杂合高变的位置中包含修饰的抗体。重链可变区CDR可缩写为HCDR，轻链可变区可缩写为LCDR。天然重链和轻链的可变结构域各自包含主要采用片层构型的四个框架区，其通过三个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)连接，这三个CDR形成连接片层结构的环，并且在一些情况下形成片层结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区按顺序FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4紧密保持在一起，并且与来自其他抗体链的CDR促成了抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人，Sequences of Protein sofImmunological Interest,National Institute of Health,Bethesda,Md.1987；其通过援引加入并入本文)。
对于CDR的进一步描述，参考Kabat等人,J.Biol.Chem.,252:6609-6616(1977)；Kabat等人,美国卫生与公共服务部，“Sequences of proteins of immunological interest”(1991)；Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Al-Lazikani B.等人,J.Mol.Biol.,273:927-948(1997)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)；Abhinandan和Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Lefranc M.P.等人,Dev.Comp.Immunol.,27:55-77(2003)；以及Honegger和Plückthun,J.Mol.Biol.,309:657-670(2001)。本文“CDR”可由本领域公知的方式加以标注和定义，包括但不限于Kabat编号系统、Chothia编号系统或IMGT编号系统，使用的工具网站包括但不限于AbRSA网站(http://cao.labshare.cn/AbRSA/cdrs.php)、abYsis网站(www.abysis.org/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi)和IMGT网站(http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi#results)。本文CDR包括不同定义方式的氨基酸残基的重叠(overlap)和子集。
本文术语“Kabat编号系统”通常是指由Elvin A.Kabat提出的免疫球蛋白比对及编号 系统(参见，例如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。
本文术语“Chothia编号系统”通常是指由Chothia等人提出的免疫球蛋白编号系统，其是基于结构环区的位置鉴定CDR区边界的经典规则(参见，例如Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)。
本文术语“IMGT编号系统”通常是指基于由Lefranc等人发起的国际免疫遗传学信息系统(The international ImMunoGeneTics information system(IMGT))的编号系统，可参阅Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003。
本文术语“重链恒定区”是指抗体重链的羧基端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出效应子功能，诸如与Fc受体的相互作用，其相对于抗体的可变结构域具有更保守的氨基酸序列。“重链恒定区”可选自CH1结构域，铰链区，CH2结构域，CH3结构域，或其变体或片段。“重链恒定区”包括“全长重链恒定区”和“重链恒定区片段”，前者具有基本上与天然抗体恒定区基本相似的结构，而后者仅包括“全长重链恒定区的一部分”。示例性地，典型的“全长抗体重链恒定区”由CH1结构域-铰链区-CH2结构域-CH3结构域组成；当抗体为IgE时，其还包括CH4结构域；当抗体为重链抗体时，则其不包括CH1结构域。示例性地，典型的“重链恒定区片段”可选自Fc或CH3结构域。
本文术语“轻链恒定区”是指抗体轻链的羧基端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，所述轻链恒定区可选自恒定κ结构域或恒定λ结构域。
本文中的术语“Fc区”用于定义抗体重链中含有恒定区的至少一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。示例性地，人IgG重链Fc区可自Cys226或Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，由宿主细胞生成的抗体可经历翻译后切割，自重链的C端切除一个或多个，特别是一个或两个氨基酸。因此，通过编码全长重链的特定核酸分子的表达由宿主细胞生成的抗体可包括全长重链，或者它可包括全长重链的切割变体。当重链的最终两个C端氨基酸是甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447，编号方式依照Kabat EU索引)时可能就是这种情况。因此，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)，或C端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。典型地，IgG Fc区包含IgG CH2和IgG CH3域，可选地，在此基础上还可包含完整或部分铰链区，但不包含CH1域。人IgG Fc区的“CH2域”通常自约位置231处的氨基酸残基延伸至约位置340处的氨基酸残基。在一个实施方案中，碳水化合物链附着于CH2域。本文中的CH2域可以是天然序列CH2域或变体CH2域。“CH3域”包含Fc区中在CH2域C端的那段残基(即自IgG的约位置341处的氨基酸残基至约位置447处的氨基酸残基)。本文中的CH3区可以是天然序列CH3域或变体CH3域(例如具有在其一条链中引入的“隆起”“节”，(knob)和在其另一条链中相应引入的“空腔”“穴”，(hole)的CH3域；参见美国专利No.5,821,333，通过援引明确收入本文)。如本文中描述的，此类变体CH3域可用于促进两条不相同抗体重链的异二聚化。
除非本文中另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号依照EU编号系统，也称作EU索引，如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5 th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中描述的。
本文术语“Fc变体”是指，通过在Fc上合适的位点处存在一个或者多个氨基酸替换、插入或缺失突变引起Fc结构或功能的变化。“Fc变体间作用”指的是经突变设计的Fc变体之间，可以形成空间填充效应、静电导引、氢键作用、疏水作用等。Fc变体间相互作用有助于形成稳定的异源二聚体蛋白。优选的突变设计为“Knob-into-Hole”形式的突变设计。
Fc变体的突变设计技术在本领域内已经较为广泛的应用于制备双特异性抗体或者异源二聚的Fc融合蛋白形式。代表性的有Cater等人(Protein Engineering vol.9 no.7 pp.617-621，1996)提出的“Knob-into-Hole”形式；Amgen公司技术人员利用静电导引(Electrostatic Steerin g)形成含Fc的异源二聚体形式(US 20100286374 A1)；Jonathan H.Davis等人(Protein Engine ering，Design&Selection pp.1-8，2010)提出的通过IgG/Ig链交换形成的异源二聚体形式(SEE Dbodies)；Genmab公司DuoBody(Science，2007.317(5844))平台技术形成的双特异性分子；Xencor公司的技术人员综合结构计算及Fc氨基酸突变，综合不同作用方式形成异源二聚体蛋白形式(mAbs 3:6，546-557；November/December 2011)；苏州康宁杰瑞公司的基于电荷网络的Fc改造方法(CN201110459100.7)得到异源二聚体蛋白形式；以及其它基于Fc氨基酸变化或者功能改造手段，达到形成异源二聚体功能蛋白的基因工程方法。本发明所述的Fc变体片段上的Knob/Hole结构指两条Fc片段各自突变，突变后可以通过“Knob-into-Hole”形式进行结合。优选用Cater等人的“knob-into-hole”模型在Fc区上进行位点突变的改造，以使得到的第一Fc变体和第二Fc变体能以“knob-into-hole”的形式结合在一起形成异源二聚体。从特定的免疫球蛋白类别和亚类中选择特定的免疫球蛋白Fc区在本领域技术人员所掌握的范围之内。优选人类抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc区，更优选人抗体IgG1的Fc区。随机任选第一Fc变体或第二Fc变体中一个做knob的突变，另一个做hole的突变。
本文术语“同一性”可通过以下方式计算获得：为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的“同一性”百分数，将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。考虑到为最佳比对这两个序列而需要引入的空位的数目和每个空位的长度，两个序列之间的同一性百分数随所述序列共有的相同位置变化而变化。
可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。例如，使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch算法(在www.gcg.com可获得)，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。又例如，使用GCG软件包中的GAP程序(在www.gcg.com可获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum62评分矩阵。还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12，空位罚分4，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法,((1989)CABIOS,4:11-17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。
额外地或备选地，可以进一步使用本发明所述的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列” 以针对公共数据库执行检索，以例如鉴定其他家族成员序列或相关序列。例如，可以使用Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST及XBLAST程序(版本2.0)执行此类检索。BLAST核苷酸检索可以用NBLAST程序，评分＝100、字长度＝12执行，以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可以用XBLAST程序、评分＝50、字长度＝3执行，以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了出于比较目的获得带空位的比对结果，可以如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中所述那样使用空位BLAST。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。
本文术语“核酸”包括包含核苷酸的聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸基团组成。通常，核酸分子由碱基的序列描述，由此所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基的序列通常表示为5’至3’。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)，包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA、核糖核酸(RNA)，特别是信使RNA(mRNA)、DNA或RNA的合成形式，以及包含两种或更多种这些分子的混合的聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链二者，以及单链和双链形式。而且，本文所述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的例子包括具有衍生的糖或磷酸骨架键合或化学修饰的残基的修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖DNA和RNA分子，其适合作为载体用于在体外和/或体内，例如在宿主或患者中，直接表达本发明的抗体。此类DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或修饰的。例如，可以对mRNA进行化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或被编码分子的表达，从而可以将mRNA注入到受试者内以在体内产生抗体(参见例如Stadler等人，Nature Medicine 2017，published online 2017年6月12日，doi：10.1038/nm.4356或EP2101823B1)。
本文“分离的”核酸指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括在下述细胞中含有的核酸分子，所述细胞通常含有该核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置处。
本文术语“载体”是指能够扩增与其连接的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的载体以及整合入已引入该载体的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们可操作连接的核酸的表达。这样的载体在本文中称为“表达载体”。
本文术语“宿主细胞”是指细胞中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括具有与在初始转化的细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。
本文术语“药物组合物”是指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不含有对施用所述药物组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。可选的，所述药物组合物还包含额外的抗肿瘤剂，例如化疗剂，免疫检查点抑制等。
本文术语“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣材料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、 药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料等及其组合，其为本领域技术人员所知(参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版.MackPrinting Company,1990,第1289-1329页)。除了与活性成分不相容的情况之外，考虑任一常规载体在治疗或药物组合物中的应用。
本文术语“治疗”是指外科手术或药物处理(surgical or therapeutic treatment)，其目的是预防、减缓(减少)治疗对象中不希望的生理变化或病变，如癌症和肿瘤。有益的或所希望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度减弱、疾病状态稳定(即，未恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和、以及缓解(无论是部分缓解或完全缓解)，无论是可检测的或不可检测的。需要治疗的对象包括已患有病症或疾病的对象以及易于患上病症或疾病的对象或打算预防病症或疾病的对象。当提到减缓、减轻、减弱、缓和、缓解等术语时，其含义也包括消除、消失、不发生等情况。
本文术语“受试者”是指接受对如本文所述的特定疾病或病症的治疗的生物体。示例性地，“受试者”包括接受疾病或病症治疗的哺乳动物，如人、灵长类动物(例如，猴)或非灵长类哺乳动物。
本文术语“有效量”指单独给予或与另一治疗剂组合给予细胞、组织或对象时能有效防止或缓解疾病病症或该疾病进展的治疗剂用量。“有效量”还指足以缓解症状，例如治疗、治愈、防止或缓解相关医学病症，或治疗、治愈、防止或缓解这些病症的速度增加的化合物用量。当将活性成分单独给予个体时，治疗有效剂量单指该成分。当应用某一组合时，治疗有效剂量指产生治疗作用的活性成分的组合用量，而无论是组合、连续或同时给予。
本文术语“癌症”指向或描述哺乳动物中典型地以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。此定义中包括良性和恶性癌症。本文术语“肿瘤”或“瘤”是指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖,无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
本文术语“EC50”是指半最大有效浓度，其包括在指定暴露时间之后诱导基线与最大值之间的半途响应的抗体浓度。EC50本质上代表其中观察到其最大作用的50％的抗体浓度，可通过本领域已知方法测量。
附图说明
图1为人CD16a(158F)-Fc、人CD16a(158V)-Fc、人CD16b(NA1)-Fc、人CD16b(NA2)-Fc、人CD16b(SH)-Fc和食蟹猴CD16-Fc蛋白样品SDS-PAGE还原胶和非还原胶检测结果。泳道1和2分别为还原和非还原条件下人CD16a(158F)-Fc的蛋白条带，泳道3和4分别为还原和非还原条件下人CD16a(158V)-Fc的蛋白条带，泳道5和6分别为还原和非还原条件下人CD16b(NA1)-Fc的蛋白条带，泳道7和8分别为还原和非还原条件下人CD16b(NA2)-Fc的蛋白条带，泳道9和10分别为还原和非还原条件下人CD16b(SH)-Fc的蛋白条带，泳道11和12分别为还原和非还原条件下食蟹猴CD16-Fc的蛋白条带，泳道M为蛋白maker条带。
图2A人CD16a(158F)蛋白转染的FlpinCHO细胞FACS检测结果；图2B人CD16a(158V)蛋白转染的FlpinCHO细胞FACS检测结果；图2C人CD16b(NA1)蛋白转染的FlpinCHO细 胞FACS检测结果；图2D人CD16b(NA2)蛋白转染的FlpinCHO细胞FACS检测结果；图2E食蟹猴CD16蛋白转染的FlpinCHO细胞FACS检测结果。
图3A为CD16scFv-his抗体与FlpinCHO-人CD16a(158F)细胞的结合；图3B为CD16scFv-his抗体与FlpinCHO-人CD16a(158V)细胞的结合。
图4A为10mg/mL人免疫球蛋白存在下，CD16scFv-his抗体与FlpinCHO-人CD16a(158F)细胞的结合；图4B为10mg/mL人免疫球蛋白存在下，CD16scFv-his抗体与FlpinCHO-人CD16a(158V)细胞的结合。
图5A为FACS检测抗体与FlpinCHO-人CD16b(NA1)细胞的结合反应；图5B为FACS检测抗体与FlpinCHO-人CD16b(NA2)细胞的结合反应。
图6为荧光素酶报告系统检测抗体对Jurkat-NFAT细胞的激活
图7A为10mg/mL人免疫球蛋白存在下，CD16scFv-his抗体与人NK细胞的结合；图7B为10mg/mL人免疫球蛋白存在下，CD16scFv-his抗体与人NK细胞的结合。
图8A为CD16scFv-his组合突变抗体与FlpinCHO-人CD16a(158F)细胞的结合；图8B为CD16scFv-his组合突变抗体与FlpinCHO-人CD16a(158V)细胞的结合。
图9A为人免疫球蛋白存在下，CD16scFv-his组合突变抗体与FlpinCHO-人CD16a(158F)细胞的结合；图9B为人免疫球蛋白存在下，CD16scFv-his组合突变抗体与FlpinCHO-人CD16a(158V)细胞的结合。
图10A为FACS检测组合突变抗体与FlpinCHO-人CD16b(NA1)细胞的结合反应；图10B为FACS检测组合突变抗体与FlpinCHO-人CD16b(NA2)细胞的结合反应。
图11为荧光素酶报告系统检测抗体对Jurkat-NFAT细胞的激活。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 CD16相关抗原和抗体的制备以及稳转细胞株的构建
1.1人和食蟹猴CD16-Fc标签抗原的制备
按照从N端到C端的顺序，将人和食蟹猴CD16蛋白的胞外区(ECD，extra-cellular domain)依次与人IgG1Fc、(G 3S) 2linker以及AVI标签相连(各元件的氨基酸序列和标签抗原的组成如表1所示)设计标签抗原。委托通用生物系统(安徽)有限公司将标签抗原氨基酸序列所对应的核苷酸序列进行基因合成并分别克隆到含信号肽的pTT5载体，并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒，具体方法参见Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(Plainview,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)。对HEK293E细胞(购自苏州益研生物科技有限公司)进行瞬时转 染(PEI，Polysciences，货号：24765-1)，并使用FreeStyle TM 293(Thermofisher scientific，货号：12338018)在37℃下进行扩大培养。6天后收集细胞培养液，离心去除细胞成分，获得含抗原蛋白胞外区的培养上清液。将培养上清液上样到蛋白A层析柱(蛋白A填料AT Protein A Diamond和层析柱BXK16/26均购自博格隆，货号分别为：AA0273和B-1620)，使用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.4)清洗后再用20mM PB,1M NaCl(pH7.2)进行清洗，最后使用pH3.4的柠檬酸缓冲液进行洗脱，收集从蛋白A层析柱上洗脱下来的带Fc标签的抗体，用1/10体积的pH8.0的1M Tris中和，用PBS在4℃条件透析过夜，透析后的蛋白经0.22微米滤膜无菌过滤后分装于-80℃保存，即获得纯化的CD16-Fc标签蛋白，SDS-PAGE还原胶和非还原胶检测样品目的条带如图1所示。
表1 CD16-Fc标签抗原各元件序列及标签抗原的组成
1.2 CD16检测抗体的制备
识别人CD16的小鼠抗体3G8是用PMN免疫小鼠获得的(Fleit H.B.et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.1982 May)，能够能识别人CD16a(158F和158V)和CD16b(NA1，NA2和SH)，且与食蟹猴CD16具有交叉结合活性。3G8的重链可变区和轻链可变区序列根据专利WO2007009065A2获得，由泰州市百英生物科技有限公司将3G8克隆的重链可变区序列克隆到包含信号肽和鼠源抗体IgG1的重链恒定区的表达载体pcDNA3.4-B1MH1(泰州市百英生物科技有限公司)中，轻链可变区序列克隆到包含信号肽和鼠源抗体IgG1的轻链恒定区的表达载体pcDNA3.4-B1MLK(泰州市百英生物科技有限公司)中，获得3G8-mIgG1的序列，序列信息如表2所示。并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒，具体方法参见Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(Plainview,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press。将表达载体按照PEI(购自Polysciences，货号：24765-1)说明书瞬时转染HEK293E细胞(购自苏州益研生物科技有限公司)，并使用FreeStyle TM 293(Thermofisher scientific，货号：12338018)在37℃下连续培养5天，离心去除细胞成分，获得含抗体的培养上清液。将培养上清液上样到蛋白A层析柱(蛋白A填料AT Protein A Diamond和层析柱BXK16/26均购自博格隆，货号分别为：AA0273和B-1620)，使用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.4)清洗后再用20mM PB,1M NaCl(pH7.2)进行清洗，最后使用pH3.4的柠檬酸缓冲液进行洗脱，收集从蛋白A层析柱上洗脱下来的带Fc标签的抗体，用1/10体积的pH8.0的1M Tris中和，用PBS在4℃条件透析过夜，透析后的蛋白经0.22微米滤膜无菌过滤后分装于-80℃保存。
表2抗人CD16的抗体3G8的序列信息
1.3 CD16稳转Flipin CHO细胞株的构建
分别将编码人CD16a(158F)全长氨基酸序列(Uniprot ID：P08637)、人CD16a(158V) 全长氨基酸序列(NCBI ID：AAH17865.1)、人CD16b(NA1)全长氨基酸序列(NCBI ID：AAA35881.1)、人CD16b(NA2)全长氨基酸序列(Uniprot ID：O75015)以及食蟹猴CD16全长氨基酸序列(NCBI ID：NP_001270121.1)的核苷酸序列克隆到pcDNA5-FRT载体(Thermofisher scientific,货号：V601020)并制备质粒(由生工生物工程(上海)股份有限公司完成)，制备完成的质粒分别和POG44酶载体(Thermofisher scientific,货号：V600520)一起共转染FlpinCHO细胞系(Thermofisher scientific,货号：R75807)，转染方法按照转染试剂( 3000Transfection Kit，Invitrogen，货号：L3000-015)的操作说明进行，将转染后的FlipinCHO细胞置于37℃，5％(v/v)CO 2培养箱中，并在含800μg/ml hygromycin以及10％(v/v)胎牛血清的F12培养基中选择性培养，大约2周后取部分细胞采用流式细胞术检测细胞表面抗原表达情况，并对恢复生长的细胞系继续扩大培养并液氮冻存。
检测结果如表3和图2A-2E所示，3G8抗体能与Flpin CHO-人CD16a(158F)、Flpin CHO-人CD16a(158V)、Flpin CHO-人CD16b(NA1)、Flpin CHO-人CD16b(NA2)和Flpin CHO-猴CD16细胞株结合，这些细胞株已经能稳定表达对应的CD16抗原，可以用于后续的抗体筛选鉴定。表3和图2中的IgG亚型对照为鼠IgG1对照。
表3 CD16全长蛋白的Flpin CHO稳转细胞株FACS检测结果
实施例2人CD16抗体的制备
BDD20-00抗体序列来自专利WO2019175368A1，是利用人CD16-Fc蛋白对全人噬菌体展示文库进行筛选获得的识别人CD16的抗体，其VL和VH的氨基酸序列如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13所示。使用MOE预测BDD20-00抗体的三维结构，基于结构预测设计了22个抗体。上述23个人CD16抗体、阳性对照3G8和阴性对照NC(Anti-Hel)从N端到C端，按照VL-(G 2S) 7-VH-his(his×6)的形式由泰州市百英生物科技有限公司在HEK293F细胞系中进行表达纯化。将培养上清液上样到镍离子亲和层析柱HisTrap TM Excel(GE Healthcare，货号：GE17-3712-06)，同时用紫外(UV)检测仪监测紫外吸收值(A280nm)的变化。上样后用20mM PB，0.5M NaCl(pH7.4)清洗镍离子亲和层析柱直到紫外吸收值回到基线，然后用buffer A：20mM PB，0.5M NaCl(pH7.4)和buffer B：20mM PB，0.5M NaCl，500mM咪唑进行梯度洗脱(2％,4％,8％,16％,50％,100％)，收集从镍离子亲和层析柱上洗脱下来的带His标签的scFv抗体，用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.4)在4℃冰箱透析过夜。透析后的蛋白经0.22微米滤膜无菌过滤后分装于-80℃保存。抗体VL、VH序列如表4所示；scFv-His抗体的设计如表5所示；按Kabat编号系统定义的CD16抗体CDRs，如表6所示。
表4抗体VL、VH氨基酸序列
注：下划线加粗字体为设计突变位点。
表5 CD16 scFv-His抗体设计
抗体名称 抗体设计
BDD20-00 BDD20-00_VL-(G 2S) 7-BDD20-00_VH-His标签
BDD20-01 BDD20-00_VL01-(G 2S) 7-BDD20-00_VH-His标签
BDD20-02 BDD20-00_VL02-(G 2S) 7-BDD20-00_VH-His标签
BDD20-03 BDD20-00_VL03-(G 2S) 7-BDD20-00_VH-His标签
BDD20-04 BDD20-00_VL04-(G 2S) 7-BDD20-00_VH-His标签
BDD20-05 BDD20-00_VL05-(G 2S) 7-BDD20-00_VH-His标签
BDD20-06 BDD20-00_VL06-(G 2S) 7-BDD20-00_VH-His标签
BDD20-07 BDD20-00_VL07-(G 2S) 7-BDD20-00_VH-His标签
BDD20-08 BDD20-00_VL08-(G 2S) 7-BDD20-00_VH-His标签
BDD20-09 BDD20-00_VL09-(G 2S) 7-BDD20-00_VH-His标签
BDD20-10 BDD20-00_VL10-(G 2S) 7-BDD20-00_VH-His标签
BDD20-11 BDD20-00_VL11-(G 2S) 7-BDD20-00_VH-His标签
BDD20-12 BDD20-00_VL12-(G 2S) 7-BDD20-00_VH-His标签
BDD20-13 BDD20-00_VL13-(G 2S) 7-BDD20-00_VH-His标签
BDD20-14 BDD20-00_VL14-(G 2S) 7-BDD20-00_VH-His标签
BDD20-15 BDD20-00_VL-(G 2S) 7-BDD20-00_VH01-His标签
BDD20-16 BDD20-00_VL-(G 2S) 7-BDD20-00_VH02-His标签
BDD20-17 BDD20-00_VL-(G 2S) 7-BDD20-00_VH03-His标签
BDD20-18 BDD20-00_VL-(G 2S) 7-BDD20-00_VH04-His标签
BDD20-19 BDD20-00_VL-(G 2S) 7-BDD20-00_VH05-His标签
BDD20-20 BDD20-00_VL-(G 2S) 7-BDD20-00_VH06-His标签
BDD20-21 BDD20-00_VL-(G 2S) 7-BDD20-00_VH07-His标签
BDD20-22 BDD20-00_VL-(G 2S) 7-BDD20-00_VH08-His标签
表6 CD16抗体的CDR序列
实施例3 CD16抗体的结合活性检测
3.1流式细胞实验(FACS)检测人CD16抗体与CD16a不同突变体表达细胞的结合
将所需细胞在T-75细胞培养瓶中扩大培养至对数生长期，吸除培养基，用PBS缓冲液洗涤2次，然后用胰酶消化细胞，终止消化后用PBS缓冲液洗涤细胞2次，进行细胞计数后将细胞沉淀用[PBS+2％(w/v)BSA]封闭液重悬至2×10 6个细胞/毫升，按50μl/孔加入到96孔FACS反应板中，待测抗体起始浓度100nM，用PBS按照1:5的比例进行梯度稀释，加入不同浓度的待测抗体50μl/孔，冰上孵育1小时。用PBS缓冲液离心洗涤3次，加入50μl/孔iFluor647标记的抗his标签的二抗(购自金斯瑞，货号：A01802)，冰上孵育1小时。用PBS缓冲液离心洗涤5次，用FACS(FACS Canto II，购自BD公司)检测和分析结果。通过软件(CellQuest)进行数据分析，得到细胞的平均荧光密度(MFI)。再通过软件(GraphPad Prism8)分析，进行数据拟合，计算EC50值。
结果如图3A-3B所示，CD16 scFv-his抗体，除了BDD20-02、BDD20-05、BDD20-06、BDD20-11、BDD20-12、BDD20-16、BDD20-20和BDD20-22以外，均能与FlpinCHO-人CD16a细胞结合，表7展示了FACS检测scFv抗体与FlpinCHO-CD16a细胞最大平均荧光强度和EC50。
表7 FACS检测scFv抗体与FlpinCHO-CD16a细胞的结合反应
抗体名称 FlpinCHO-人CD16a(158F) FlpinCHO-人CD16a(158V)
最大平均荧光强度 EC50(nM) 最大平均荧光强度 EC50(nM)
BDD20-00 1259 4.72 1401 1.91
BDD20-01 1080 9.79 1110 3.91
BDD20-02 245 阴性 433 阴性
BDD20-03 1088 6.23 1265 1.51
BDD20-04 1074 7.05 1247 3.33
BDD20-05 142 阴性 238 阴性
BDD20-06 167 阴性 184 阴性
BDD20-07 1351 2.05 1467 1.11
BDD20-08 1498 2.05 1633 1.25
BDD20-09 1317 6.28 1492 1.38
BDD20-10 1352 4.20 1368 2.21
BDD20-11 227 阴性 223 阴性
BDD20-12 216 阴性 174 阴性
BDD20-13 1606 1.87 1520 1.00
BDD20-14 1582 0.92 1630 0.78
BDD20-15 1494 2.04 1578 1.15
BDD20-16 432 阴性 597 阴性
BDD20-17 1202 0.76 1392 1.24
BDD20-18 1374 2.53 1365 1.17
BDD20-19 1236 6.13 1313 1.89
BDD20-20 334 阴性 388 阴性
BDD20-21 1336 5.81 1360 1.39
BDD20-22 360 阴性 428 阴性
NC 137 阴性 122 阴性
3.2流式细胞实验(FACS)检测人免疫球蛋白对CD16抗体与细胞结合的影响
收集细胞后，将10mg/mL人免疫球蛋白(上海生物制品研究所)与细胞预孵育后加入梯度稀释的待测抗体，并按照实施例3.1的方法进行检测。结果如图4A所示，在人免疫球蛋白存在下，BDD20-13和BDD20-14抗体的曲线位于BDD20-00左侧，说明其与FlpinCHO-人CD16a(158F)的结合活性强于BDD20-00，其他抗体的结合而活性与BDD20-00类似。同理，如图4B所示在人免疫球蛋白存在下，BDD20-13和BDD20-14抗体与FlpinCHO-人CD16a(158V)的结合活性强于BDD20-00，其他抗体的结合而活性与BDD20-00类似。表8展示了与FlpinCHO-CD16a细胞的结合的最大平均荧光强度。
表8 FACS检测在人免疫球蛋白存在下，scFv抗体与FlpinCHO-CD16a细胞的结合反应
3.3流式细胞实验(FACS)检测人CD16抗体与CD16b不同突变体表达细胞的结合
按照实施例3.1的方法检测待测抗体与FlpinCHO-人CD16b细胞的结合。如图5A-5B所示，3G8抗体是结合CD16b的阳性抗体，所有待测抗体与FlpinCHO-人CD16b(NA1)和FlpinCHO-人CD16b(NA2)的结合活性都弱于3G8抗体。
实施例4人CD16抗体的功能鉴定
4.1荧光素酶报告基因(report assay)检测人CD16抗体的功能
利用稳定表达人CD16a(158V)的Jurkat-NFAT荧光素酶报告细胞系(购自BPS Bioscience，货号60541)检测CD16抗体激活荧光素酶报告细胞系内的信号通路，荧光素酶的信号检测按照Bright-Glo TM Luciferase Assay System试剂盒(Promega，货号：E2620)操作说明进行。实验方法如下：将2μg/mL抗his标签的抗体(金斯瑞，货号：A00186)于4℃包被过夜，用于捕获scFv-his形式的待测抗体，次日将待检测的抗体用含5％FBS的RIPM 1640培养基稀释，抗体起始浓度100nM，1:5梯度稀释，然后以50μl/孔加到96孔平底细胞培养板，37℃预孵育15分钟后，将收集的处于对数生长期的荧光素酶报告细胞系，用含2％FBS的培养基(RPMI 1640，采购于Gibco，货号12633012)调节细胞浓度至8×10 5/mL，将细胞加入培养板，50μl/孔。在37℃的培养箱中孵育6小时后400g离心5分钟，取上清20μL至黑色不透明96孔检测板(Greiner，货号：655090)中，加入50μL检测试剂，通过PerkiElmer Ensight-HH3400酶标仪读取响应值，再通过软件(GraphPad Prism8)分析，进行数据拟合，计算EC50值。图6显示，在report assay中，所有抗体能激活Jurkat细胞的下游信号通路，且激活活性与BDD20-00抗体相当。表9展示了CD16抗体的激活活性的最大荧光值和EC50。
表9荧光素酶报告基因检测CD16抗体的激活活性
BDD20-18 494375 0.39
BDD20-19 483285 0.37
BDD20-21 468690 0.45
BDD20-00 487860 0.26
NC 4555 阴性
实施例5 CD16抗体与人原代NK细胞的结合活性检测
5.1流式细胞实验(FACS)检测人CD16抗体与静息NK细胞的结合
按照实施例3.1的方法检测待测抗体与新鲜制备的人NK细胞(妙顺(上海)生物科技有限公司，货号：PB56-N-Custom)的结合。如图7A和表10所示，所有检测抗体均与NK细胞有很好的结合活性，EC50最低1.10nM。
表10 FACS检测scFv抗体与NK细胞的结合反应
当NK细胞预孵育人免疫球蛋白后，如图7B和表11所示，所有检测抗体与NK细胞的结合活性与BDD20-00相当或更强。
表11人免疫球蛋白存在下，FACS检测scFv抗体与NK细胞的结合反应
实施例6 CD16组合突变改造抗体制备
将BDD20-07、BDD20-08、BDD20-10、BDD20-13、BDD20-14和BDD20-17抗体的突变位点进行组合突变后，获得BDD20-23到BDD20-30共8个抗体，这8个抗体按照实施例2 的方法制备，抗体序列如表12所示，scFv设计如表13所示，CDR序列如表14所示：
表12抗体VH、VL序列
注：下划线加粗为组合突变位点。
表13 CD16 scFv-His抗体设计
序列名称 抗体设计
BDD20-23 BDD20-00_VL15-(G 2S) 7-BDD20-00_VH09-His标签
BDD20-24 BDD20-00_VL16-(G 2S) 7-BDD20-00_VH09-His标签
BDD20-25 BDD20-00_VL17-(G 2S) 7-BDD20-00_VH09-His标签
BDD20-26 BDD20-00_VL18-(G 2S) 7-BDD20-00_VH09-His标签
BDD20-27 BDD20-00_VL15-(G 2S) 7-BDD20-00_VH03-His标签
BDD20-28 BDD20-00_VL16-(G 2S) 7-BDD20-00_VH03-His标签
BDD20-29 BDD20-00_VL17-(G 2S) 7-BDD20-00_VH03-His标签
BDD20-30 BDD20-00_VL18-(G 2S) 7-BDD20-00_VH03-His标签
表14组合突变CDR序列
实施例7 CD16组合突变抗体的结合活性检测
7.1流式细胞实验(FACS)检测人CD16抗体与CD16a不同突变体表达细胞的结合
按照实施例3.1的方法检测组合突变抗体与FlpinCHO-人CD16a(158F)以及FlpinCHO-人CD16a(158V)的结合，结果如表15以及图8A-8B所示，所有组合抗体均能与FlpinCHO-人CD16a细胞结合，BDD20-23、BDD20-24、BDD20-27、BDD20-28、BDD20-29和BDD20-30与不同CD16a突变体的结合EC50值均小于BDD20-00，BDD20-25、BDD20-26、BDD20-30与CD16a突变体结合的EC50值与BD20-00相当。
表15 FACS检测scFv抗体与FlpinCHO-CD16a细胞的结合反应
7.2流式细胞实验(FACS)检测人免疫球蛋白对CD16抗体与细胞结合的影响
按照实施例3.2的方法检测人免疫球蛋白对CD16抗体结合活性的影响，结果如表16和图9A-9B所示，所有待测抗体在人免疫球蛋白存在下与FlpinCHO-人CD16a(158F)和FlpinCHO-人CD16a(158V)细胞的结合活性与BDD20-00相当或更高。
表16人免疫球蛋白存在下，FACS检测scFv抗体与FlpinCHO-CD16a细胞的结合反应
7.3流式细胞实验(FACS)检测人CD16抗体与CD16b不同突变体表达细胞的结合
按照实施例3.2的方法检测待测抗体与FlpinCHO-人CD16b细胞的结合。如图10A-图10B和表17所示，在100nM和20nM抗体浓度下所有检测抗体与FlpinCHO-人CD16b(NA1)FlpinCHO-人CD16b(NA2)的最大结合荧光强度都弱于BDD20-00抗体。
表17 FACS检测scFv抗体与FlpinCHO-CD16b细胞的结合反应
实施例8人CD16组合突变抗体的功能鉴定
8.1荧光素酶报告基因(report assay)检测人CD16组合突变抗体的功能
按照实施例4.1的方法检测CD16组合突变抗体对稳定表达人CD16a(158V)的Jurkat-NFAT荧光素酶报告细胞系的激活活性。结果如表18及图11所示，在report assay中，所有抗体均能激活Jurkat细胞的下游信号通路。
表18荧光素酶报告基因检测CD16组合突变抗体的激活活性
实施例9 CD16抗体亲和力测定
9.1 CD16抗体与人CD16-ECD-hFc蛋白亲和力测定
使用Protein A芯片(GE Helthcare；29-127-558)捕获人CD16-ECD-hFc蛋白。样品和运行缓冲液是HBS-EP+(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05％surfactant P20)(GE Healthcare；BR-1006-69)。流经池设置为25℃。样品块设置为16℃。两者都用运行缓冲液预 处理。在每一个循环中，首先用Protein A芯片捕获待测抗体，然后注入单一浓度的抗人CD16的scFv-his形式抗体，记录抗体和抗原蛋白的结合和解离过程，最后用Glycine pH1.5(Cytiva:BR-1003-54)完成芯片再生，其中流动相为HBS-EP+pH7.4(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05％surfactant P20)(Cytiva:BR100669)，流速30μL/min，结合时间240秒，解离时间600秒，再生时间30秒，检测温度25℃。最后，根据1:1 binding模型，对数据进行分析，拟合抗体抗原结合动力学参数，包括结合速率常数ka、解离速率常数kd、平衡解离常数KD、最大结合信号Rmax。待测抗体与人CD16-ECD hFc蛋白的结合速率(ka)、解离速率(kd)及结合亲和力(KD)如表19所示。
表19 Biacore检测CD16抗体与人CD16蛋白的结合

Claims (15)

  1. 一种特异性结合人CD16的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含轻链CDRs组合和重链CDRs组合：
    (1)所述轻链CDRs组合包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1、LCDR2、LCDR3选自下表所示序列：
    编号 CDR1 CDR2 CDR3 VL1 SEQ ID NO：40 SEQ ID NO：41 SEQ ID NO：42 VL2 SEQ ID NO：46 SEQ ID NO：41 SEQ ID NO：42 VL3 SEQ ID NO：47 SEQ ID NO：41 SEQ ID NO：42 VL4 SEQ ID NO：40 SEQ ID NO：41 SEQ ID NO：48 VL5 SEQ ID NO：40 SEQ ID NO：41 SEQ ID NO：49 VL6 SEQ ID NO：40 SEQ ID NO：41 SEQ ID NO：50 VL7 SEQ ID NO：40 SEQ ID NO：41 SEQ ID NO：51 VL8 SEQ ID NO：52 SEQ ID NO：41 SEQ ID NO：42 VL9 SEQ ID NO：53 SEQ ID NO：41 SEQ ID NO：42 VL10 SEQ ID NO：54 SEQ ID NO：41 SEQ ID NO：42 VL11 SEQ ID NO：40 SEQ ID NO：55 SEQ ID NO：42 VL12 SEQ ID NO：40 SEQ ID NO：41 SEQ ID NO：56 VL13 SEQ ID NO：40 SEQ ID NO：41 SEQ ID NO：57 VL14 SEQ ID NO：40 SEQ ID NO：41 SEQ ID NO：58 VL15 SEQ ID NO：40 SEQ ID NO：41 SEQ ID NO：59 VL16 SEQ ID NO：52 SEQ ID NO：55 SEQ ID NO：58 VL17 SEQ ID NO：52 SEQ ID NO：55 SEQ ID NO：59 VL18 SEQ ID NO：53 SEQ ID NO：55 SEQ ID NO：58 VL19 SEQ ID NO：53 SEQ ID NO：55 SEQ ID NO：59
    和，
    (2)所述重链CDRs组合包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3选自下表所示序列：
    编号 CDR1 CDR2 CDR3 VH1 SEQ ID NO：43 SEQ ID NO：44 SEQ ID NO：45 VH2 SEQ ID NO：60 SEQ ID NO：44 SEQ ID NO：45 VH3 SEQ ID NO：43 SEQ ID NO：44 SEQ ID NO：61 VH4 SEQ ID NO：62 SEQ ID NO：44 SEQ ID NO：45 VH5 SEQ ID NO：63 SEQ ID NO：44 SEQ ID NO：45 VH6 SEQ ID NO：64 SEQ ID NO：44 SEQ ID NO：45 VH7 SEQ ID NO：43 SEQ ID NO：65 SEQ ID NO：45 VH8 SEQ ID NO：43 SEQ ID NO：44 SEQ ID NO：66 VH9 SEQ ID NO：43 SEQ ID NO：44 SEQ ID NO：67 VH10 SEQ ID NO：62 SEQ ID NO：44 SEQ ID NO：66
  2. 权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含选自以下的轻链CDRs和重链CDRs组合：VL2+VH1、VL3+VH1、VL4+VH1、VL5+VH1、 VL6+VH1、VL7+VH1、VL8+VH1、VL9+VH1、VL10+VH1、VL11+VH1、VL12+VH1、VL13+VH1、VL14+VH1、VL15+VH1、VL1+VH2、VL1+VH3、VL1+VH4、VL1+VH5、VL1+VH6、VL1+VH7、VL1+VH8、VL1+VH9、VL16+VH10、VL17+VH10、VL18+VH10、VL19+VH10、VL16+VH4、VL17+VH4、VL18+VH4和VL19+VH4。
  3. 权利要求1或2所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含：
    SEQ ID NO：12、14～27、68～71任一项所示的轻链可变区序列，或与前述序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高一致性的序列；和，
    SEQ ID NO：13、28～35、72任一项所示的重链可变区序列，或与前述序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高一致性的序列；
    优选地，所述抗体或抗原结合片段包含：
    1)SEQ ID NO：14～27任一项所示轻链可变区序列，和SEQ ID NO：13所示重链可变区序列；
    2)SEQ ID NO：12所示轻链可变区序列，和SEQ ID NO：28～35任一项所示重链可变区序列；
    3)SEQ ID NO：68～71任一项所示轻链可变区序列，和SEQ ID NO：72所示重链可变区序列；
    4)SEQ ID NO：68～71任一项所示轻链可变区序列，和SEQ ID NO：30所示重链可变区序列；或，
    5)与第1)-4)组所示序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高一致性的序列。
  4. 权利要求1～3任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段还偶联有治疗剂或示踪剂；优选地，所述治疗剂选自放射性同位素、化疗药或免疫调节剂，所述示踪剂选自放射学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂和光敏剂。
  5. 权利要求1～4任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段选自F(ab) 2、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异性抗体和纳米抗体中的一种或多种；优选地，所述抗体或抗原结合片段为scFv，更优选地，由N端到C端，所述scFv包括轻链可变区-Linker-重链可变区，所述linker优选为(G2S) 7。
  6. 权利要求1～5任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段还连接有其他功能性分子，优选地，所述其他功能性分子可选自以下的一种或多种：信号肽、蛋白标签、细胞因子、血管生成抑制剂或免疫检查点抑制剂。
  7. 权利要求6所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述细胞因子可为IL2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-21、IFN或TNFα；所述血管生成抑制剂可为内皮抑制素；所述免疫检查点抑制剂可为SIRPα。
  8. 一种多特异性抗原结合分子，其特征在于，所述多特异性抗原结合分子包含权利要求1～7任一项所述的抗体或抗原结合片段，以及结合CD16以外其他抗原的抗原结合分子，或 结合与前述抗体或抗原结合片段不同的CD16表位；可选地，所述CD16以外的其他抗原可选自：CD137、CD258、PD-1、PD-L1、4-1BB、CD40、CD64、EGFR、VEGF、CD3(优选为CD3ε)、HER2、HER1、HER3、IGF-1R、磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)、C-Met、BCMA、HSA、GPRC5D、MSLN或血脑屏障受体；
    优选地，所述其他抗原结合分子为抗体或抗原结合片段；
    优选地，所述多特异性抗原结合分子可为双特异性、三特异性或四特异性；
    优选地，所述多特异性抗原结合分子可为二价、四价或六价。
  9. 一种分离的核酸片段，其特征在于，所述核酸片段编码权利要求1～7所述抗体或抗原结合片段或权利要求8所述多特异性抗原结合分子。
  10. 一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求9所述核酸片段。
  11. 一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求10所述载体；优选地，所述细胞为原核细胞或真核细胞，例如细菌(大肠杆菌)、真菌(酵母)、昆虫细胞或哺乳动物细胞(CHO细胞系或293T细胞系)。
  12. 一种制备权利要求1～7所述抗体或抗原结合片段或权利要求8所述多特异性抗原结合分子的方法，其特征在于，所述方法包括培养权利要求11所述的细胞，以及分离所述细胞表达的抗体、抗原结合片段或多特异性抗原结合分子。
  13. 一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1～7所述抗体或抗原和片段、权利要求8所述多特异性抗原结合分子、权利要求9所述核酸片段、权利要求10所述载体或根据权利要求12的方法制备获得的产品；可选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的运载体(carrier)、稀释剂或助剂；可选地，所述药物组合物还包含额外的抗肿瘤剂。
  14. 一种治疗肿瘤或癌症、炎性疾病或过敏症疾病的方法，其特征在于，所述方法包括向受试者施用有效量的权利要求1～7所述抗体或抗原结合片段、权利要求8所述多特异性抗原结合分子、权利要求9所述核酸片段、权利要求10所述载体、根据权利要求12的方法制备获得的产品或药物组合物；优选地，肿瘤或癌症选自非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、霍奇金氏病、微小残留病、转移瘤。
  15. 权利要求1～7所述抗体或抗原和片段、权利要求8所述多特异性抗原结合分子、权利要求9所述核酸片段、权利要求10所述载体或根据权利要求12的方法制备获得的产品或药物组合物在制备治疗肿瘤或癌症、炎性疾病或过敏症疾病药物中的用途。
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