CN116801905A - Cd5抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种特异性结合CD5的抗体或抗原结合片段、多肽、嵌合抗原受体、免疫效应细胞、核酸片段、载体、宿主细胞、药物组合物,制备方法及其在治疗疾病和检测CD5等方面的应用,其对于开发治疗性药物和CD5检测试剂具有重要意义。
Description
本公开要求于2020年12月17日提交中国专利局、申请号为202011490219.6、发明名称为“CD5抗体及其应用”的中国专利申请的优先权,其全部内容通过引用结合在本公开中。
本公开涉及抗体领域,尤其涉及CD5抗体及其应用。
CD5分子是一个67kDa的单体I型跨膜糖蛋白,是一种细胞分化抗原,属于富含半胱氨酸(SRCR)的清道夫受体超家族(Sarrias MR,et al.Crit Rev Immunol.2004.24(1):1-37)。由347个氨基酸组成的三个胞外SRCR结构域(D1,D2,D3),一个疏水的跨膜域和一个大的含93个氨基酸缺乏固有催化活性的细胞质区域,但包含几个参与信号转导和可能介导蛋白质-蛋白质相互作用的高度保守元件及潜在的磷酸化位点(Ishida,et al.J Exp Med.1992 May 1;175(5):1213-20;Lozano et al.Crit Rev Immunol.2000;20(4):347-58)。在完全加工成熟的CD5蛋白中,主要的信号基序位于酪氨酸激酶Lck靶点-酪氨酸残基Y429和Y463附近(J M Vilà,et al.Eur J Immunol.2001 Apr;31(4):1191-8.),以及酪蛋白激酶II的靶点(CKII)-丝氨酸残基S459和S461(Calvo et al.Tissue Antigens.54:16–26.1999)。人CD5基因克隆于1986年(Jones et al.Nature.1986.323(6086):346-9),CD5基因的上游序列缺乏常规的TATA box,但含有IgM muE2、SV40、AP-1、SP-1、CCAAT、TCF2a/ets、PEA3、c/EBP等调控元件,其中在-125~-27bp间包含有Inr、IgM muE2、SV40、AP-1的序列为CD5基因强效的组织特异性启动子序列(Weichert TR,et al.J Immunol.1995.154(9):4603-12)。CD5主要存在于成熟的外周T淋巴细胞上,在正常人淋巴组织B1a细胞中亦存在有CD5表达,它与存在于T细胞和B细胞上的抗原特异性受体相关联,因此可以很好地调节T细胞和B细胞激活和分化所必需的信号反应。
CD5的主要功能是通过激活CKII(Raman et al.1998.J Biol Chem.273:19183–19189)或Src同源域承载蛋白磷酸酶-1(Perez-Villar et al.1999.Mol Cell Biol.19:2903–2912)等负调控因子来负调控T细胞受体(TCR)和B细胞受体(BCR)信号。在CD5+B细胞中,CD5通过下调BCR介导的信号转导通路阻止B细胞的凋亡,并且加速IL-10的产生从而为B细胞提供生存因子。然而,最近的研究显示CD5具有更广泛的功能,包括调节淋巴细胞存活、调节外周耐受性以及作为病原体相关分子模式的受体(Soldevila et al.2011.Curr Opin Immunol.23:310–318)。CD5作为模式识别受体,通过识别保守的真菌(即β-葡聚糖)的存在,而不是细菌细胞壁成分(Vera et al.2009.Proc Natl Acad Sci U S A.106:1506–1511)。来自实验性自身免疫和肿瘤小鼠模型的证据表明CD5通过下调激活诱导的细胞死亡(AICD)促进T细胞存活(Axtellet al.2004.J Immunol.173:2928–2932;Friedlein et al.2007.J Immunol.178:6821–6827.)。CD5的表 达上调也被报道为调节性淋巴细胞(Treg和B10细胞)(Yanaba et al.2008.Immunity 28:639–650;Ordonez-Rueda et al.2009.Eur J Immunol.39:2233–2247)以及激活的T和B细胞(Hippen et al.2000.J Exp Med.191:883–890;Stamou et al.2003.J Immunol.171:1278–1284)的特征。所有这些报道显示,在自身免疫、肿瘤或感染性起源的生理和病理条件下CD5都是相关的免疫受体(Soldevila et al.2011.Curr Opin Immunol.23:310–318)。
1980年,Royston,Wang(J Exp Med.1992 May 1;175(5):1213-20)等首次在慢性淋巴细胞白血病(CML)患者外周B细胞表面发现了CD5分子,它是大多数淋巴细胞肿瘤,包括T细胞-急性淋巴细胞白血病(T-ALL),慢性淋巴细胞白血病(CLL),T细胞淋巴瘤及部分B细胞淋巴瘤的特征性的表面标志,且其并不表达于正常的造血干细胞及其他类型的非造血细胞。因此作为淋巴细胞肿瘤抗原的特异性高,可成为淋巴细胞恶性肿瘤中的理想治疗靶点。
1993年比利时科学家Hamers-Casterman C在骆驼血液中发现一种只含重链不含轻链的天然重链抗体(Hamers-Casterman C et al.Nature.363(6428):446–8(1993).),重链抗体和普通的抗体相比虽然缺失了轻链,但是依然保留结合抗原的能力。克隆骆驼体内重链抗体的可变区后,得到的仅由一个重链可变区组成的单域抗体(single domain antibody,sdAb),称为纳米抗体或VHH抗体(variable heavy chain domain of a heavy chain antibody)。纳米抗体具有分子量小,可穿透血脑屏障、原核或真核系统中高表达、特异性强,亲和力高、对人的免疫原性弱等优点。基于羊驼重链抗体的VHH单域抗体的特殊结构,兼具了传统抗体与小分子药物的优势,几乎完美克服了传统抗体的开发周期长,稳定性较低,保存条件苛刻等缺陷,逐渐成为新一代治疗性生物医药与临床诊断试剂中的新兴力量。因此,研发CD5治疗性纳米抗体具有广阔的前景。
发明内容
本公开提供抗一种特异性结合CD5的抗体或抗原结合片段、多肽、嵌合抗原受体、免疫效应细胞、核酸片段、载体、宿主细胞、药物组合物,制备方法及其在治疗疾病和检测CD5等方面的应用。
在第一个方面中,本公开提供一种特异性结合CD5的抗体或抗原结合片段,所述抗体或抗原结合片段包含CDR1、CDR2和CDR3,所述CDR1、CDR2和CDR3包含选自SEQ ID NO:6~16任一项所示VHH结构域中的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些具体的实施方式中,根据IMGT编号系统、Kabat编号系统或Chothia编号系统确定所述HCDR1、HCDR2和HCDR3,可选地,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3选自表3;
可选地,所述HCDR1具有如SEQ ID NO:17、20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101、104、107、110或113所示的氨基酸序列;
可选地,所述HCDR2具有如SEQ ID NO:18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111或114所示的氨基酸序列;
可选地,所述HCDR3具有如SEQ ID NO:19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、109、112或115所示的氨基酸序列;
优选地,根据IMGT编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:17~19所示的氨基酸序列;或
优选地,根据Kabat编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:20~22所示的氨基酸序列;或
优选地,根据Chothia编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:23~25所示的氨基酸序列;或
优选地,根据IMGT编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:26~28所示的氨基酸序列;
优选地,根据Kabat编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:29~31所示的氨基酸序列;
优选地,根据Chothia编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:32~34所示的氨基酸序列;
优选地,根据IMGT编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:35~37所示的氨基酸序列;
优选地,根据Kabat编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:38~40所示的氨基酸序列;
优选地,根据Chothia编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:41~43所示的氨基酸序列;
优选地,根据IMGT编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:44~46所示的氨基酸序列;
优选地,根据Kabat编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:47~49所示的氨基酸序列;
优选地,根据Chothia编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:50~52所示的氨基酸序列;
优选地,根据IMGT编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:53~55所示的氨基酸序列;
优选地,根据Kabat编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:56~58所示的氨基酸序列;
优选地,根据Chothia编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:59~61所示的氨基酸序列;
优选地,根据IMGT编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:62~64所示的氨基酸序列;
优选地,根据Kabat编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:65~67所示的氨基酸序列;
优选地,根据Chothia编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:68~70所示的氨基酸序列;
优选地,根据IMGT编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:71~73所示的氨基酸序列;
优选地,根据Kabat编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:74~76所示的氨基酸序列;
优选地,根据Chothia编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:77~79所示的氨基酸序列;
优选地,根据IMGT编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:80~82所示的氨基酸序列;
优选地,根据Kabat编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:83~85所示的氨基酸序列;
优选地,根据Chothia编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:86~88所示的氨基酸序列;
优选地,根据IMGT编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:89~91所示的氨基酸序列;
优选地,根据Kabat编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:92~94所示的氨基酸序列;
优选地,根据Chothia编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:95~97所示的氨基酸序列;
优选地,根据IMGT编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:98~100所示的氨基酸序列;
优选地,根据Kabat编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:101~103所示的氨基酸序列;
优选地,根据Chothia编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:104~106所示的氨基酸序列;
优选地,根据IMGT编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:107~109所示的氨基酸序列;
优选地,根据Kabat编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:110~112所示的氨基酸序列;
优选地,根据Chothia编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:113~115所示的氨基酸序列。
在一些具体的实施方式中,所述CDR1、CDR2和/或CDR3包含在所述HCDR1、HCDR2和/或HCDR3上发生至多10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个突变的氨基酸序列;所述突变可选自插入、缺失和/或替换,所述替换优选为保守氨基酸的替换。
在一些具体的实施方式中,所述CDR1、CDR2和/或CDR3包含与所述HCDR1、HCDR2和/或HCDR3相比具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的序列。
在一些具体的实施方式中,所述抗体或抗原结合片段包含单域抗体,所述单域抗体包含所述CDR1、CDR2和CDR3。
在一些具体的实施方式中,所述单域抗体包含如SEQ ID NO:6~16任一项所示的序列;
可选地,所述单域抗体包含与SEQ ID NO:6~16任一项所示的序列相比发生至多20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个突变的序列,所述突变可选自插入、缺失和/或替换,所述替换优选为保守氨基酸的替换;
可选地,所述单域抗体包含与SEQ ID NO:6~16任一项所示的序列相比具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的序列。
在一些具体的实施方式中,所述单域抗体包含SEQ ID NO:6~16任一项所示VHH结构域中的FR区;
可选地,所述单域抗体包含与SEQ ID NO:6~16任一项所示VHH结构域中的FR区相比发生至多15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个突变的序列,所述突变可选自插入、缺失和/或替换,所述替换优选为保守氨基酸的替换;
可选地,所述单域抗体包含与SEQ ID NO:6~16任一项所示VHH结构域中的FR区相比具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的序列。
在一些具体的实施方式中,所述抗体或抗原结合片段为:(1)嵌合抗体或其片段;(2)人源化抗体或其片段;或(3)全人抗体或其片段。
在一些具体的实施方式中,所述抗体或抗原结合片段包含或不包含抗体重链恒定区;可选的,所述抗体重链恒定区可选自人、羊驼、小鼠、大鼠、兔或羊;可选地,所述抗体重链恒定区可选自IgG、IgM、IgA、IgE或IgD,所述IgG可选自IgG1,IgG2,IgG3或IgG4;可选地,所述重链恒定区可选自Fc区、CH3区或完整重链恒定区,优选为人Fc区;优选地,所述抗体或抗原结合片段为重链抗体。
在一些具体的实施方式中,所述抗体或抗原结合片段还偶联有治疗剂或示踪剂;优选地,所述治疗剂选自放射性同位素、化疗药或免疫调节剂,所述示踪剂选自放射 学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂和光敏剂;更优选地,所述细胞毒性剂选自生物碱类(alkaloids)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蒽环类抗生素(doxorubicin)、紫杉烷类(taxanes)或毒素化合物;所述毒素化合物优选自DM1、DM4、SN-38、MMAE、MMAF、Duocarmycin、Calicheamicin或DX8951。
在一些具体的实施方式中,所述抗体或抗原结合片段特异性结合人和/或猴CD5,优选地,其与人CD5结合的KD优于1.00E-6M、1.00E-7M、1.00E-8M、2.00E-8M、3.00E-8M、4.00E-8M、5.00E-8M、6.00E-8M、7.00E-8M、8.00E-8M、9.00E-8M、1.00E-9M、2.00E-9M、3.00E-9M、4.00E-9M、5.00E-9M、6.00E-9M、7.00E-9M、8.00E-9M、9.00E-9M、1.00E-10M、2.00E-10M、3.00E-10M、4.00E-10M、5.00E-10M、6.00E-10M、7.00E-10M、8.00E-10M、9.00E-10M、1.00E-11M或1.00E-12M。
在第二方面,本公开还提供一种多肽,所述多肽包含前述抗体或抗原结合片段,优选地,所述多肽还连接有其他功能性分子,所述其他功能性分子可选自以下一种或多种:信号肽、蛋白标签或其他抗原结合分子或细胞因子。
在一些具体的实施方式中,所述其他抗原结合分子特异性结合CD5以外的抗原或结合与前述抗体或抗原结合片段不同的CD5表位;
优选地,所述CD5以外的抗原可选自:CD3,优选CD3ε;CD16,优选CD16A;CD19;TGF-beta Ⅱ型受体;NKG2D;CD40;4-1BB;CD137或CD19;EGFR;EGFRvIII;mesothelin;HER2;EphA2;Her3;EpCAM;MUC1;MUC16;CEA;Claudin18.2;叶酸受体;Claudin6;WT1;NY-ESO-1;MAGE3;ASGPR1或CDH16;
优选地,所述其他抗原结合分子为抗体或抗原结合片段;
优选地,所述多肽为多特异性抗原结合分子,例如双特异性、三特异性或四特异性,更优选地,所述多特异性抗原结合分子可为二价、四价或六价。
在一些具体的实施方式中,所述细胞因子可选自IL2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-21、IFN或TNF-alpha。
在第三方面,本公开还提供一种嵌合抗原受体(CAR),所述嵌合抗原受体包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域,所述细胞外抗原结合结构域包含前述抗体或抗原结合片段。
在第四方面,本公开还提供一种免疫效应细胞,所述免疫效应细胞表达前述的嵌合抗原受体或包含编码前述嵌合抗原受体的核酸片段;优选地,所述免疫效应细胞选自T细胞、NK细胞(natural killer cell)、NKT细胞(natural killerT cell)、DNT细胞(double negative T cell)、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或肥大细胞,所述T细胞优选自细胞毒性T细胞、调节性T细胞或辅助性T细胞;优选地,所述免疫效应细胞为自体免疫效应细胞或同种异体免疫效应细胞。
在第五方面,本公开还提供一种分离的核酸片段,所述核酸片段编码前述的抗体或抗原结合片段、多肽或嵌合抗原受体。
在第六方面,本公开还提供一种载体(vector),所述载体包含前述的核酸片段。
在第七方面,本公开还提供一种宿主细胞,所述宿主细胞包含前述载体;优选地,所述细胞为原核细胞或真核细胞,例如细菌(大肠杆菌)、真菌(酵母)、昆虫细胞或哺乳动物细胞(CHO细胞系或293T细胞系)。
在第九方面,本公开还提供一种制备前述抗体或抗原结合片段或多肽的方法,其中,所述方法包括培养前述细胞,以及分离所述细胞表达的抗体或抗原结合片段或多肽。
在第十方面,本公开还提供一种制备前述免疫效应细胞的方法,所述方法包括将编码前述CAR的核酸片段导入所述免疫效应细胞,可选地,所述方法还包括启动所述免疫效应细胞表达前述CAR。
在第十一方面,本公开还提供一种药物组合物,所述药物组合物包含前述的抗体或抗原结合片段、多肽、免疫效应细胞、核酸片段、载体或根据前述方法制备获得的产品;可选地,所述药物组合物还包含药学上可接受的运载体(carrier)、稀释剂或助剂;可选地,所述药物组合物还包含额外的抗肿瘤剂。
在第十二方面,本公开还提供了药物组合,所述药物组合包括前述的抗体或抗原结合片段、多肽、免疫效应细胞、核酸片段、载体、根据前述方法制备获得的产品,和其他任意有效成分的组合。本公开对于“其他任意有效成分”不做限定,任何能够与本公开前述的抗体或抗原结合片段、多肽、免疫效应细胞、核酸片段、载体、根据前述方法制备获得的产品组合的其他任意有效成分构成的药物组合,均在本公开的保护范围之内。
在第十三方面,本公开还提供一种疾病治疗方法,所述方法包括向受试者施用有效量的前述的抗体或抗原结合片段、多肽、免疫效应细胞、核酸片段、载体、药物组合物或根据前述方法制备获得的产品;所述疾病优选自肿瘤或癌症或自身免疫性疾病;所述肿瘤或癌症可选自实体瘤或血液瘤,所述血液瘤可选自T细胞淋巴瘤、慢性淋巴瘤白血病、皮肤T细胞淋巴瘤、T细胞急性淋巴细胞白血病或非霍奇金淋巴瘤,所述自身免疫性疾病可选自类风湿性关节炎或移植物抗宿主病。
在第十四方面,本公开还提供前述抗体或抗原结合片段、多肽、免疫效应细胞、核酸片段、载体、宿主细胞、药物组合物或根据前述方法制备获得的产品在制备治疗肿瘤或癌症或自身免疫性疾病的药物中的用途;优选地,所述肿瘤或癌症可选自实体瘤或血液瘤,所述血液瘤可选自T细胞淋巴瘤、慢性淋巴瘤白血病、皮肤T细胞淋巴瘤、T细胞急性淋巴细胞白血病或非霍奇金淋巴瘤,所述自身免疫性疾病可选自类风湿性关节炎或移植物抗宿主病。
在第十五方面,本公开还提供前述的抗体或抗原结合片段、多肽、免疫效应细胞、核酸片段、载体、药物组合物或根据前述方法制备获得的产品,用于治疗肿瘤或癌症或自身免疫性疾病的药物中的用途;优选地,所述肿瘤或癌症可选自实体瘤或血液瘤,所述血液瘤可选自T细胞淋巴瘤、慢性淋巴瘤白血病、皮肤T细胞淋巴瘤、T细胞急性淋巴细胞白血病或非霍奇金淋巴瘤,所述自身免疫性疾病可选自类风湿性关节炎或 移植物抗宿主病。
在第十六方面,本公开还提供一种试剂盒,所述试剂盒包含前述抗体或抗原结合片段、多肽、免疫效应细胞、核酸片段、载体、宿主细胞、药物组合物或根据前述方法制备获得的产品。
在第十七方面,本公开还提供一种检测生物学样品中CD5表达的方法,所述方法包括在前述的抗体或抗原结合片段与CD5之间能够形成复合物的条件下,使所述生物学样品与前述的抗体或抗原结合片段接触;优选地,所述方法还包括检测所述复合物的形成,指示样品中CD5的存在或表达水平。
在第十八方面,本公开还提供前述抗体或抗原结合片段在制备CD5检测试剂中的用途。
术语定义
除非本公开另外定义,与本公开相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员所理解的含义。
此外,除非本文另有说明,本文单数形式的术语应包括复数形式,复数形式的术语应包括单数形式。更具体地,如在本说明书和所附权利要求中所使用的,除非另外明确指出,否则单数形式“一种”和“这种”包括复数指示物。
本文术语“包括”、“包含”和“具有”之间可互换使用,旨在表示方案的包含性,意味着所述方案可存在除所列出的元素之外的其他元素。同时应当理解,在本文中使用“包括”、“包含”和“具有”描述,也提供“由……组成”方案。
术语“和/或”在本文使用时,包括“和”、“或”和“由所属术语链接的要素的全部或任何其他组合”的含义。
本公开术语“CD5”:一种细胞分化抗原,属于富含半胱氨酸(SRCR)的清道夫受体超家族,其包括人CD5(NCBI:NP_055022.2)及其突变体(variants)、同种型(isoforms)和物种同源物(species homologs),其中,所述物种同源物包括但不限于猴CD5(NCBI:H9ZFB2-1)及其突变体和同种型。
本文术语“特异性结合”是指抗原结合分子(例如抗体)通常以高亲和力特异性结合抗原和实质上相同的抗原,但不以高亲和力结合不相关抗原。亲和力通常以平衡解离常数(equilibrium dissociation constant,KD)来反映,其中较低KD表示较高亲和力。以抗体为例,高亲和力通常指具有约10
-6M或更低、约10
-7M或更低、约10
-8M或更低、约1×10
-9M或更低、约1×10
-10M或更低、1×10
-11M或更低或1×10
-12M或更低的KD。KD计算方式如下:KD=Kd/Ka,其中Kd表示解离速率,Ka表示结合速率。可采用本领域周知的方法测量平衡解离常数KD,如表面等离子共振(例如Biacore)或平衡透析法测定。
本文术语“抗原结合分子”按最广义使用,是指特异性结合抗原的分子。示例性地,抗原结合分子包括但不限于抗体或抗体模拟物。“抗体模拟物”是指能够与抗原特异性结合,但与抗体结构无关的有机化合物或结合域,示例性地,抗体模拟物包括但不限 于affibody、affitin、affilin、经设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、核酸适体或Kunitz型结构域肽。
本文术语“抗体”按最广义使用,是指包含来自免疫球蛋白重链可变区的足够序列和/或来自免疫球蛋白轻链可变区的足够序列,从而能够特异性结合至抗原的多肽或多肽组合。本文“抗体”涵盖各种形式和各种结构,只要它们展现出期望的抗原结合活性。本文“抗体”包括具有移植的互补决定区(CDR)或CDR衍生物的替代蛋白质支架或人工支架。此类支架包括抗体衍生的支架(其包含引入以例如稳定化抗体三维结构的突变)以及包含例如生物相容性聚合物的全合成支架。参见,例如Korndorfer et al.,2003,Proteins:Structure,Function,and Bioinformatics,53(1):121-129(2003);Roque et al.,Biotechnol.Prog.20:639-654(2004)。此类支架还可以包括非抗体衍生的支架,例如本领域已知可用于移植CDR的支架蛋白,包括但不限于肌腱蛋白、纤连蛋白、肽适体等。
本文“抗体”包括一种典型的“四链抗体”,其属于由两条重链(HC)和两条轻链(LC)组成的免疫球蛋白;重链是指这样的多肽链,其在N端到C端的方向上由重链可变区(VH)、重链恒定区CH1结构域、铰链区(HR)、重链恒定区CH2结构域、重链恒定区CH3结构域组成;并且,当所述全长抗体为IgE同种型时,任选地还包括重链恒定区CH4结构域;轻链是在N端到C端方向上由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链;重链与重链之间、重链与轻链之间通过二硫键连接,形成“Y”字型结构。由于免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同,故其抗原性也不同。据此,可将本文“免疫球蛋白”分为五类,或称为免疫球蛋白的同种型,即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE,其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别,又可分为不同的亚类,如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4,IgA可分为IgA1和IgA2。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中第每类Ig都可以有κ链或λ链。
本文“抗体”还包括不包含轻链的抗体,例如,由单峰驼(Camelus dromedarius)、双峰驼(Camelus bactrianus)、大羊驼(Lama glama)、原驼(Lama guanicoe)和羊驼(Vicugna pacos)等产生的重链抗体(heavy-chain antibodies,HCAbs)以及在鲨等软骨鱼纲中发现的免疫球蛋白新抗原受体(Ig new antigen receptor,IgNAR)。
如本文所用,术语“重链抗体”是指缺乏常规抗体的轻链的抗体。该术语具体包括但不限于在不存在CH1结构域的情况下包含VH抗原结合结构域以及CH2和CH3恒定结构域的同型二聚体抗体。
本文术语“VHH结构域”和“纳米抗体(nanobody)”、“单域抗体”(single domain antibody,sdAb)具有相同的含义并可互换使用,是指克隆重链抗体的可变区,构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体,它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的重链抗体后,再克隆抗体重链的可变区,构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体。
关于“重链抗体”和“单域抗体”、“VHH结构域”和“纳米抗体”的进一步描述可参见:Hamers-Casterman等,Nature.1993;363;446-8;Muyldermans的综述文章(Reviews inMolecular Biotechnology 74:277-302,2001);以及以下专利申请,其被作为一般背景技术提及:WO 94/04678,WO 95/04079和WO 96/34103;WO94/25591,WO 99/37681,WO 00/40968,WO 00/43507,WO 00/65057,WO 01/40310,WO 01/44301,EP 1134231和WO 02/48193;WO97/49805,WO 01/21817,WO 03/035694,WO 03/054016和WO 03/055527;WO 03/050531;WO 01/90190;WO03/025020;以及WO 04/041867,WO 04/041862,WO 04/041865,WO 04/041863,WO 04/062551,WO 05/044858,WO 06/40153,WO 06/079372,WO 06/122786,WO 06/122787和WO 06/122825以及这些申请中提到的其他现有技术。
本文“抗体”可以来源于任何动物,包括但不限于人和非人动物,所述非人动物可选自灵长类动物、哺乳动物、啮齿动物和脊椎动物,例如骆驼科动物、大羊驼、原鸵、羊驼、羊、兔、小鼠、大鼠或软骨鱼纲(例如鲨)。
本文术语“多特异性”是指具有至少两个抗原结合位点,所述至少两个抗原结合位点中的每一个抗原结合位点与相同抗原的不同表位或与不同抗原的不同表位结合。因此,诸如“双特异性”、“三特异性”、“四特异性”等术语是指抗体/抗原结合分子可以结合的不同表位的数目。
本文术语“价”表示抗体/抗原结合分子中规定数目的结合位点的存在。因此,术语“单价”、“二价”、“四价”和“六价”分别表示抗体/抗原结合分子中一个结合位点、两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点的存在。
本文“全长抗体”、“完好抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用,是指具有基本上与天然抗体结构相似的结构。
本文“抗原结合片段”和“抗体片段”在本文中可互换使用,其不具备完整抗体的全部结构,仅包含完整抗体的局部或局部的变体,所述局部或局部的变体具备结合抗原的能力。示例性地,本文“抗原结合片段”或“抗体片段”包括但不限于Fab、F(ab’)
2、Fab’、Fab’-SH、Fd、Fv、scFv、双抗体(diabody)和单域抗体。
本文术语“嵌合抗体”是指以下抗体,其具有源自一种来源生物(如大鼠、小鼠、兔或羊驼)的免疫球蛋白的可变序列以及源自不同生物体(例如人)的免疫球蛋白的恒定区。用于生产嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如,Morrison,1985,Science 229(4719):1202-7;Oi等人,1986,Bio Techniques 4:214-221;Gillies等人,1985 J Immunol Methods 125:191-202;以上通过援引加入并入本文。
本文术语“人源化抗体”是指,经基因工程改造的非人源抗体,其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言,人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体),全部或部分的非CDR区(例如,可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留或部分保留了供体抗体的预期性质,包括但不限于,抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力、 增强免疫应答的能力等。
本文术语“全人抗体”是指具有其中FR和CDR二者都源自人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外,如果抗体包含恒定区,则恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本文全人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如,通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而,本文“全人抗体”不包括其中来源于另一个哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。
本文术语“可变区”是指抗体重链或轻链中牵涉使抗体结合抗原的区域,“重链可变区”与“VH”、“HCVR”可互换使用,“轻链可变区”与“VL”、“LCVR”可互换使用。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别是VH和VL)一般具有相似的结构,每个域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如Kindt et al.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,p.91(2007)。单个VH或VL域可足以赋予抗原结合特异性。本文术语“互补决定区”与“CDR”可互换使用,通常指重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)的高变区(HVR),该部位因在空间结构上可与抗原表位形成精密的互补,故又称为互补决定区,其中,重链可变区CDR可缩写为HCDR,轻链可变区CDR可缩写为LCDR。本术语“构架区”或“FR区”可互换,是指抗体重链可变区或轻链可变区中除CDR以外的那些氨基酸残基。通常典型的抗体可变区由4个FR区和3个CDR区按以下顺序组成:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
对于CDR的进一步描述,参考Kabat等人,J.Biol.Chem.,252:6609-6616(1977);Kabat等人,美国卫生与公共服务部,“Sequences of proteins of immunological interest”(1991);Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987);Al-Lazikani B.等人,J.Mol.Biol.,273:927-948(1997);MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996);Abhinandan和Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008);Lefranc M.P.等人,Dev.Comp.Immunol.,27:55-77(2003);以及Honegger和Plückthun,J.Mol.Biol.,309:657-670(2001)。本文“CDR”可由本领域公知的方式加以标注和定义,包括但不限于Kabat编号系统、Chothia编号系统或IMGT编号系统,使用的工具网站包括但不限于AbRSA网站(http://cao.labshare.cn/AbRSA/cdrs.php)、abYsis网站(www.abysis.org/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi)和IMGT网站(http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi#results)。本文CDR包括不同定义方式的氨基酸残基的重叠(overlap)和子集。
本文术语“Kabat编号系统”通常是指由ElvinA.Kabat提出的免疫球蛋白比对及编号系统(参见,例如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。
本文术语“Chothia编号系统”通常是指由Chothia等人提出的免疫球蛋白编号系统,其是基于结构环区的位置鉴定CDR区边界的经典规则(参见,例如Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917;Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)。
本文术语“IMGT编号系统”通常是指基于由Lefranc等人发起的国际免疫遗传学信息系统(The international ImMunoGeneTics information system(IMGT))的编号系统,可参阅Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003。
本文术语“重链恒定区”是指抗体重链的羧基端部分,其不直接参与抗体与抗原的结合,但是表现出效应子功能,诸如与Fc受体的相互作用,其相对于抗体的可变结构域具有更保守的氨基酸序列。“重链恒定区”可选自:CH1结构域,铰链区,CH2结构域,CH3结构域,或其变体或片段。“重链恒定区”包括“全长重链恒定区”和“重链恒定区片段”,前者具有基本上与天然抗体恒定区基本相似的结构,而后者仅包括“全长重链恒定区的一部分”。示例性地,典型的“全长抗体重链恒定区”由CH1结构域-铰链区-CH2结构域-CH3结构域组成;当抗体为IgE时,其还包括CH4结构域;当抗体为重链抗体时,则其不包括CH1结构域。示例性地,典型的“重链恒定区片段”可选自Fc或CH3结构域。
本文术语“轻链恒定区”是指抗体轻链的羧基端部分,其不直接参与抗体与抗原的结合,所述轻链恒定区可选自恒定κ结构域或恒定λ结构域。
本文中的术语“Fc区”用于定义抗体重链中含有恒定区的至少一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。示例性地,人IgG重链Fc区可自Cys226或Pro230延伸至重链的羧基末端。然而,由宿主细胞生成的抗体可经历翻译后切割,自重链的C端切除一个或多个,特别是一个或两个氨基酸。因此,通过编码全长重链的特定核酸分子的表达由宿主细胞生成的抗体可包括全长重链,或者它可包括全长重链的切割变体。当重链的最终两个C端氨基酸是甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447,编号方式依照Kabat EU索引)时可能就是这种情况。因此,Fc区的C端赖氨酸(Lys447),或C端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。
典型地,IgG Fc区包含IgG CH2和IgG CH3域,可选地,在此基础上还可包含完整或部分铰链区,但不包含CH1域。人IgG Fc区的“CH2域”通常自约位置231处的氨基酸残基延伸至约位置340处的氨基酸残基。在一个实施方案中,碳水化合物链附着于CH2域。本文中的CH2域可以是天然序列CH2域或变体CH2域。“CH3域”包含Fc区中在CH2域C端的那段残基(即自IgG的约位置341处的氨基酸残基至约位置447处的氨基酸残基)。本文中的CH3区可以是天然序列CH3域或变体CH3域(例如具有在其一条链中引入的“隆起”(“节”)和在其另一条链中相应引入的“空腔”(“穴”)的CH3域;参见美国专利No.5,821,333,通过援引明确收入本文)。如本文中描述的,此类变体CH3域可用于促进两条不相同抗体重链的异二聚化。
除非本文中另有规定,Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号依照EU编号系统,也称作EU索引,如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中描述的。
本文术语“保守氨基酸”通常是指属于同一类或具有类似特征(例如电荷、侧链大 小、疏水性、亲水性、主链构象和刚性)的氨基酸。
示例性地,以下六组是被认为是互为保守性置换的氨基酸的实例:
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T);
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H);
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
本文术语“同一性”可通过以下方式计算获得:为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的“同一性”百分数,将所述序列出于最佳比较目的比对(例如,可以为最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时,则所述分子在这个位置处是相同的。
考虑到为最佳比对这两个序列而需要引入的空位的数目和每个空位的长度,两个序列之间的同一性百分数随所述序列共有的相同位置变化而变化。
可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。例如,使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法(在www.gcg.com可获得),使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6,确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。又例如,使用GCG软件包中的GAP程序(在www.gcg.com可获得),使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6,确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum62评分矩阵。
还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12,空位罚分4,利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法,((1989)CABIOS,4:11-17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。
额外地或备选地,可以进一步使用本公开所述的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库执行检索,以例如鉴定其他家族成员序列或相关序列。例如,可以使用Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST及XBLAST程序(版本2.0)执行此类检索。BLAST核苷酸检索可以用NBLAST程序,评分=100、字长度=12执行,以获得与本公开核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可以用XBLAST程序、评分=50、字长度=3执行,以获得与本公开蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了出于比较目的获得带空位的比对结果,可以如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中所述那样使用空位BLAST。当使用BLAST和空位BLAST 程序时,可以使用相应程序(例如,XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。
本文术语“嵌合抗原受体(CAR)”是指经改造以在免疫效应细胞上表达并且特异性结合抗原的人工细胞表面受体,其包含至少(1)细胞外抗原结合结构域,例如抗体的可变重链或轻链,(2)锚定CAR进入免疫效应细胞的跨膜结构域,和(3)胞内信号传导结构域。CAR能够利用细胞外抗原结合结构域以非MHC限制性的方式将T细胞和其它免疫效应细胞重定向至所选择的靶标,例如癌细胞。
本文术语“核酸”包括包含核苷酸的聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基,特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸基团组成。通常,核酸分子由碱基的序列描述,由此所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基的序列通常表示为5′至3′。在本文中,术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA),包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA、核糖核酸(RNA),特别是信使RNA(mRNA)、DNA或RNA的合成形式,以及包含两种或更多种这些分子的混合的聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外,术语核酸分子包括有义链和反义链二者,以及单链和双链形式。而且,本文所述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的例子包括具有衍生的糖或磷酸骨架键合或化学修饰的残基的修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖DNA和RNA分子,其适合作为载体用于在体外和/或体内,例如在宿主或患者中,直接表达本公开的抗体。此类DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或修饰的。例如,可以对mRNA进行化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或被编码分子的表达,从而可以将mRNA注入到受试者内以在体内产生抗体(参见例如Stadler等人,Nature Medicine 2017,published online 2017年6月12日,doi:10.1038/nm.4356或EP 2 101 823 B1)。本文“分离的”核酸指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括在下述细胞中含有的核酸分子,所述细胞通常含有该核酸分子,但该核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置处。
本文术语“载体”是指能够扩增与其连接的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的载体以及整合入已引入该载体的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们可操作连接的核酸的表达。这样的载体在本文中称为“表达载体”。
本文术语“宿主细胞”是指细胞中引入外源核酸的细胞,包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”,其包括原代的经转化的细胞和来源于其的后代,而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可能与亲本细胞不完全相同,而是可以包含突变。本文中包括具有与在初始转化的细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。
本文术语“药物组合物”是指这样的制剂,其以允许包含在其中的活性成分的生物 学活性有效的形式存在,并且不含有对施用所述药物组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
本文术语“治疗”是指外科手术或药物处理(surgical or therapeutic treatment),其目的是预防、减缓(减少)治疗对象中不希望的生理变化或病变,如癌症和肿瘤。有益的或所希望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度减弱、疾病状态稳定(即,未恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和、以及缓解(无论是部分缓解或完全缓解),无论是可检测的或不可检测的。需要治疗的对象包括已患有病症或疾病的对象以及易于患上病症或疾病的对象或打算预防病症或疾病的对象。当提到减缓、减轻、减弱、缓和、缓解等术语时,其含义也包括消除、消失、不发生等情况。
本文术语“受试者”是指接受对如本公开所述的特定疾病或病症的治疗的生物体。示例性地,“受试者”包括接受疾病或病症治疗的哺乳动物,如人、灵长类动物(例如,猴)或非灵长类哺乳动物。
本文术语“有效量”指单独给予或与另一治疗剂组合给予细胞、组织或对象时能有效防止或缓解疾病病症或该疾病进展的治疗剂用量。“有效量”还指足以缓解症状,例如治疗、治愈、防止或缓解相关医学病症,或治疗、治愈、防止或缓解这些病症的速度增加的化合物用量。当将活性成分单独给予个体时,治疗有效剂量单指该成分。当应用某一组合时,治疗有效剂量指产生治疗作用的活性成分的组合用量,而无论是组合、连续或同时给予。
本文术语“癌症”指向或描述哺乳动物中典型地以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。此定义中包括良性和恶性癌症。本文术语“肿瘤”或“瘤”是指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖,无论是恶性的还是良性的,及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
本文术语“EC50”是指半最大有效浓度,其包括在指定暴露时间之后诱导基线与最大值之间的半途响应的抗体浓度。EC50本质上代表其中观察到其最大作用的50%的抗体浓度,可通过本领域已知方法测量。
图1A为ELISA检测人CD5蛋白免疫后羊驼血清抗体效价情况;
图1B为FACS检测人CD5蛋白免疫后羊驼血清抗体效价情况;
图2为ELISA检测对照抗体与人CD5-his蛋白的结合反应;
图3为FACS检测对照抗体与Jurkat细胞的结合反应;
图4为内源细胞系Jurkat细胞的FACS检测结果;
图5A-5D为人CD5质粒转染的CHO-K1细胞FACS筛选检测结果;
图6为猴CD5质粒转染的CHO-K1细胞FACS筛选检测结果;
图7A-7B为ELISA检测VHH-hFc与人CD5-his蛋白的结合反应;
图8A-8B为FACS检测VHH-hFc与Jurkat的结合反应;
图8C-8D为FACS检测VHH-hFc与CHO-K1-人CD5细胞的结合反应;
图9A为FACS检测1nM和10nM VHH-hFc抗体与Jurkat细胞和Raji细胞的结合反应;
图9B为FACS检测1nM和10nM VHH-hFc抗体与CHO-K1细胞和CHO-K1-人CD5的结合反应;
图10为ELISA检测VHH-hFc与鼠CD5-his蛋白的结合反应;
图11为FACS检测VHH-hFc与HEK293T-猴CD5的结合反应;
图12A-12B为SPR检测VHH-hFc与人CD5蛋白的亲和力;
图13A-13B为竞争性ELISA方法检测VHH-hFc之间的抑制率;
图14为VHH-hFc的抗原表位分类。
下面结合具体实施例来进一步描述本公开,本公开的优点和特点将会随着描述而更为清楚。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本公开实施例仅是范例性的,并不对本公开的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本公开的精神和范围下可以对本公开技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本公开的保护范围内。
本公开提供的所有序列请详见说明书及序列表。如说明书记载的序列与序列表记载的序列有出入,以说明书中的记载为准。
实施例1针对CD5的重链单域抗体的筛选
1.1羊驼的免疫和血清效价检测
免疫用的人CD5(Arg25-Pro372)-His蛋白购自Acro(货号:CD5-H52H5)。选取两只羊驼(Alpaca,编号为NB144和NB145)进行免疫,每只羊驼免疫四次,每次间隔3周,第三次免疫后和第四次免疫后采集外周血并分离血清,用ELISA和FACS检测血清中针对人CD5的抗体效价和特异性,结果如图1A-1B和表1所示。表1说明,经人CD5蛋白免疫的羊驼的血清呈现抗原抗体反应,最高稀释度在二十一万左右(1:218700)。其中空白对照为1%(w/w)BSA,其中血清样品指第三次(TB2)和第四次(TB3)免疫后第七天的羊驼血清,表中的数据为OD
450nm值。
表1 ELISA检测人CD5蛋白免疫后羊驼血清的效价
1.2文库的构建
采集三次免疫后和四次免疫后的羊驼外周血共100mL;使用淋巴细胞分离液分离PBMC,并使用RNAiso Plus试剂提取总RNA,使用PrimeScript
TMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara,货号:6210A)将提取的RNA反转录成cDNA。用巢式PCR扩增编码重链抗体的可变区核酸片段:
第一轮PCR:
上游引物:CTTGGTGGTCCTGGCTGC(SEQ ID NO:1);
下游引物:GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC(SEQ ID NO:2)。
第二轮PCR:以第一轮PCR产物作为模板。
上游引物:
下游引物-1:
下游引物-2:
回收目标单域抗体核酸片段,并使用限制性内切酶SfiI将其克隆进入噬菌体展示用载体pcomb3XSS中。产物随后电转化至大肠杆菌电转感受态细胞TG1中,构建针对CD5的单域抗体噬菌体展示文库并对文库进行检定。通过梯度稀释铺板,计算库容的大小为5.0×10
9。为检测文库的插入率,随机选取48个克隆做菌落PCR。结果显示插入率达到100%。
1.3针对CD5的单域抗体淘选
用人CD5-His蛋白(Acro,货号:CD5-H52H5)0.5μg/孔包被平板,4℃放置过夜;第二天用3%BSA-PBS 37℃封闭1h后,加入100μl噬菌体展示文库,37℃孵育1h;之后用PBST洗涤6次,PBS洗涤2次,以洗掉不结合的噬菌体。最后加入100μL Gly-HCl洗脱液,洗脱下来特异性结合CD5的噬菌体从而富集阳性的克隆。
1.4噬菌体酶联免疫方法筛选特异性单个阳性克隆
淘选后,将获得的CD5结合阳性的噬菌体感染空白大肠杆菌并铺板。随后挑选96个单菌落分别扩增培养。用人CD5-His蛋白分别包被平板4℃过夜,将噬菌体培养上清加入,37℃孵育1小时。洗涤之后加入TMB显色液显色,于450nm波长测光密度。挑选CD5-His阳性克隆进行测序。对测序结果使用MOE软件进行分析,根据VHH编码蛋白氨基酸序列构建进化树,根据序列相似性剔除在进化树上距离较近的序列后,选择以下VHH抗体(详见表2),采用生物信息学方法分析其CDR区并进行后续的VHH-hFc生产和鉴定(具体结果详见表3)。分析方式包括:网站http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi#results(IMGT);http://www.abysis.org/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi(IMGT、Kabat和Chothia);http://cao.labshare.cn/AbRSA/abrsa.php(Kabat和Chothia)。
表2 VHH抗体序列信息
表3 VHH抗体CDR区信息
实施例2:VHH-hFc、对照抗体、多克隆抗体血清制备
2.1 VHH-hFc的表达纯化
将VHH可变区序列重组到包含信号肽和人IgG1 Fc(SEQ ID NO:116)的表达载体BI3.4-huIgG1中,并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒,具体方法参见Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(Plainview,NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press)。将表达载体按照PEI(购自Polysciences,货号:24765-1)说明书瞬时转染HEK293E细胞(购自苏州益研生物科技有限公司)并使用FreeStyle
TM293(Thermofisher scientific,货号:12338018)在37℃下连续培养5天,离心去除细胞成分,获得含VHH-hFc的培养上清液。将培养上清液上样到蛋白A层析柱(蛋白A填料AT Protein A Diamond和层析柱BXK16/26均购自博格隆),使用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.4)清洗后再用20mM PB,1M NaCl,pH 7.2进行清洗,最后使用pH3.4的柠檬酸缓冲液进行洗脱,收集从蛋白A层析柱上洗脱下来的带hFc标签的抗体,用1/10体积的pH8.0的1M Tris中和,用PBS在4℃条件透析过夜,透析后的蛋白经0.22微米无菌过滤后分装于-80℃保存。
人IgG1 Fc的序列(SEQ ID NO:116):
2.2对照抗体的制备和鉴定
H65是识别人CD5的抗体,它的重链可变区和轻链可变区根据专利US5621083获得。将H65抗体VH和VL以及人IgG1 Fc按照从N端到C端的顺序连接,其中VH和VL之间通过3个GGGGS连接子连接,形成scFv-hFc的形式,将其对应的核苷酸序列分别克隆到pTT5载体(由通用生物系统(安徽)有限公司完成)并按照实施例2.1的方法在HEK293E细胞中进行表达并纯化。对照抗体的序列信息参见表4。
表4对照抗体序列信息
对制备的上述H65抗体和人CD5蛋白的结合活性进行ELISA检测。将购买的商品化抗原(人CD5-His)用PBS稀释到终浓度2μg/mL,以100μl每孔加到96孔ELISA板。用塑料膜封好4℃孵育过夜,第二天用PBS洗板2次,加入封闭液[PBS+2%(w/w)BSA]室温封闭2小时。倒掉封闭液,加入100nM梯度稀释的H65抗体或阴性对照抗体hIgG1,即为针对鸡卵溶菌酶(Hen Egg Lysozyme)的抗体Anti-HEL-hIgG1(购自百英,货号:B117901)50μl每孔。37℃孵育2小时后,用PBS洗板3次。加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗(A0170,购自Sigma),37℃孵育2小时后,用PBS洗板5次。加入TMB底物50μl每孔,室温孵育30分钟后,加入终止液(1.0N HCl)50μl每孔。用ELISA读板机(Multimode Plate Reader,EnSight,购自Perkin Elmer)读取OD450nm数值,如图2所示,H65与人CD5蛋白具有良好的结合活性。
实施例3内源性表达CD5细胞株的鉴定和过表达细胞株的制备
3.1内源性表达CD5细胞株的鉴定
将Jurkat(ATCC,TIB-152)细胞在T-25细胞培养瓶中扩大培养至对数生长期,离心弃去培养基上清,细胞沉淀用PBS洗涤2次。用H65抗体作为一抗(工作浓度:100nM),Alexa Flour488标记的二抗(购自Invitrogen,货号:A11013)用FACS(FACS Canto
TM,购自BD公司)检测和分析结果。分析结果如表5以及图3-4所示,Jurkat细胞与H65结合。
表5内源细胞系Jurkat细胞的FACS检测结果
3.2 CHO-K1稳转人CD5单克隆细胞株的制备
编码人源CD5全长氨基酸序列(NCBI:NP_055022.2)的核苷酸序列被克隆到pcDNA3.1载体(购自Thermofisher scientific)并制备质粒。对CHO-K1细胞系(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)进行质粒转染(
3000 Transfection Kit,购自Invitrogen,货号:L3000-015)后,在含10μg/ml puromycin的含10%(w/w)胎牛血清的DMEM/F12培养基中选择性培养2周,用H65抗体做为一抗,Alexa Flour488标记的二抗(Invitrogen,货号:A11030)在流式细胞仪FACSAraiII(BD Biosciences)上分选阳性单克隆细胞到96孔板,并置于37℃,5%(v/v)CO
2培养,大约2周后选择部分单克隆孔进行扩增。对扩增后的克隆经流式细胞分析法进行筛选。选择长势较好、荧光强度较高、单克隆的细胞系继续扩大培养并液氮冻存。
具体选择结果如表6和图5A-5D所示,IgG亚型对照为人IgG1对照。表6说明已经制得一系列人CD5(即hCD5)阳性表达的CHO-K1单克隆细胞系。图5A-5D中,横坐标为细胞荧光强度,纵坐标为细胞数。图5A-D结果说明,CHO-K1-hCD5-2B2、CHO-K1-hCD5-2E2、CHO-K1-hCD5-2F8以及CHO-K1-hCD5-2C6为hCD5高水平表达细胞株,选择CHO-K1-hCD5-2B2为后续实验中使用的稳转细胞系。
表6人源CD5蛋白的CHO-K1稳转细胞系FACS检测结果
3.3 HEK293T稳转猴CD5细胞株的制备
编码猴CD5全长氨基酸序列(NCBI:H9ZFB2-1)的核苷酸序列被克隆到pcDNA3.1载体(购自Thermofisher scientific)并制备质粒。
对HEK293T细胞系用
HD(Promega,货号:#E2311)进行质粒转染后,在含10μg/ml puromycin的含10%(w/w)胎牛血清的DMEM培养基中选择性培养2周,用有限稀释法在96孔培养板中进行亚克隆,并置于37℃,5%(v/v)CO
2培养,大约2周后选择部分多克隆孔扩增到6孔板中。对扩增后的克隆用NB145(人CD5蛋白免疫羊驼后得到的血清,已验证可与猴CD5蛋白结合)多克隆抗体经流式细胞分析法进行筛选,选择长势较好、荧光强度较高的细胞系作为HEK293T稳转细胞株,继续扩大培养并液氮冻存。图6显示HEK293T稳转细胞株经过puromycin筛选后过表达猴CD5的单一阳性细胞峰,可用于检测抗体的交叉活性。
表7全长人/猴CD5氨基酸序列表
实施例4 VHH-hFc的鉴定
4.1酶联免疫吸附实验(ELISA)检测VHH-hFc与人CD5蛋白的结合
为了检测VHH-hFc与人CD5蛋白的结合活性,按照实施例2.2的方法进行ELISA检测,VHH-hFc与hCD5-His的ELISA结果如图7A-7B和表8所示,表8说明,纯化后的抗体均能与hCD5-His在ELISA水平结合。其中IgG对照为hIgG1,表中的数据为OD
450nm值。
表8 ELISA检测VHH-hFc抗体与人CD5蛋白的结合反应
4.2流式细胞实验(FACS)检测抗体与人CD5表达细胞的结合
将所需细胞在T-75细胞培养瓶中扩大培养至对数生长期,对于贴壁细胞CHO-K1-人CD5吸除培养基,用PBS缓冲液洗涤2次,然后用胰酶消化细胞,终止消化后用PBS缓冲液洗涤细胞2次;对于悬浮细胞Jurkat直接离心弃去培养基上清,细胞沉淀用PBS洗涤2次。对上一步的细胞进行细胞计数后将细胞沉淀用[PBS+2%(w/w)BSA]封闭液重悬至2×10
6细胞每毫升,按每孔50微升加入到96孔FACS反应板中,加入VHH-hFc或对照抗体,每孔50微升,冰上孵育2小时。用PBS缓冲液离心洗涤3次,加入每孔50微升Alexa Flour 488标记的二抗(A-11013,购自Invitrogen),冰上孵育1小时。用PBS缓冲液离心洗涤5次用FACS(FACS Canto
TM,购自BD公司)检测和分析结果。通过软件(BD FACSDiva)进行数据分析,得到细胞的平均荧光强度(MFI)。再通过软件(GraphPad Prism8)分析,进行数据拟合,计算EC50。分析结果如表9以及图8A-8D所示,VHH-hFc均可结合Jurkat细胞和CHO-K1-人CD5细胞表面的人CD5蛋白。使用同样的方法同时检测1nM和10nM VHH-hFc抗体与Jurkat细胞和内源性CD5阴性的Raji细胞的结合反应,以及1nM和10nM VHH-hFc抗体与CHO-K1细胞和CHO-K1-人CD5的结合反应,结果如图9A-9B所示,所有VHH-hFc均不结合Raji细胞以及CHO-K1细胞,具有很好的特异性。
表9 FACS检测VHH-hFc与Jurkat、CHO-K1-人CD5细胞的结合反应
实施例5 VHH-hFc的交叉结合活性检测
5.1 ELISA检测VHH-hFc与鼠CD5蛋白的结合
为检测VHH-hFc的种属交叉活性,将商品化的鼠CD5-His(CD5(Sino Biologicals,货号:50403-M08H)包被ELISA板,按照实施例2.2的方法进行ELISA检测。VHH-hFc与鼠CD5的ELISA结果如图10和表10所示,表10说明,纯化后的抗体与鼠CD5在ELISA水平均无结合。其中阴性对照为hIgG1,NB145作为阳性对照(已验证NB145能够结合鼠CD5蛋白),表中的数据为OD
450nm值。
表10 ELISA检测VHH-hFc抗体与鼠CD5蛋白的结合反应
5.2 FACS检测VHH-hFc与猴CD5稳转表达细胞系的结合
将HEK293T-猴CD5细胞按照实施例4.2的方法进行FACS检测与数据分析。分析结果如表11以及图11所示,只有S002-NB144-31、S002-NB144-43、S002-NB144-73 与猴CD5稳转表达细胞系有结合活性。其中阴性对照为hIgG1,NB145作为阳性对照(NB145的稀释度为1:100)。
表11 FACS检测VHH-hFc抗体与HEK293T-猴CD5细胞的结合反应
实施例6 CD5抗体亲和力测定
使用Protein A芯片(GE Helthcare;29-127-558)捕获抗人CD5 VHH-hFc。样品和运行缓冲液是HBS-EP+(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05%surfactant P20)(GE Healthcare;BR-1006-69)。流经池设置为25℃。样品块设置为16℃。两者都用运行缓冲液预处理。在每一个循环中,首先用Protein A芯片捕获待测抗体,然后注入单一浓度的CD5抗原蛋白,记录抗体和抗原蛋白的结合和解离过程,最后用Glycine pH1.5(GE Helthcare;BR-1003-54)完成芯片再生。通过注射溶液中不同浓度的重组人CD5-His持续240秒来测量结合,其中流速为30μL/分钟,从200nM起始(测试的实际浓度见详细结果),以1:1稀释,总共5个浓度。监测解离相长达600秒,并通过从样品溶液切换到运行缓冲液触发。通过用10mM甘氨酸溶液(pH 1.5)以30μL/分钟的流速洗涤30秒,再生表面。通过减去从山羊抗人Fc表面获得的响应来校正本体折射率(Bulk refractive index)差异,也减去空白注射(=双重参照)。为了计算表观KD和其他动力学参数,使用Langmuir 1:1模型。VHH-hFc与hCD5-His蛋白的结合速率(Kon)、解离速率(Koff)及结合亲和力(KD)如表12所示,其中抗体H65作为对照。如图12A-12B和表12所示,VHH-hFc与人CD5的亲和力都小于1E-6M,除S005-NB144-7外,均小于1E-7M;进一步地,除S005-NB144-6、S005-NB144-31、S005-NB145-74外,均小于1E-8M;而S005-NB144-43、S005-NB144-73、S005-NB145-22 与人CD5具有良好的结合,亲和力均小于1E-9M。
表12 BIAcore检测VHH-hFc抗体与人CD5的亲和力
抗体名称 | ka(1/Ms) | kd(1/s) | KD(M) |
S005-NB144-3 | 7.81E+05 | 2.18E-03 | 2.80E-09 |
S005-NB144-6 | 6.74E+05 | 2.87E-02 | 4.26E-08 |
S005-NB144-7 | 4.57E+03 | 6.80E-04 | 1.49E-07 |
S005-NB144-31 | 4.11E+04 | 9.61E-04 | 2.34E-08 |
S005-NB144-43 | 3.04E+05 | 9.87E-05 | 3.25E-10 |
S005-NB144-73 | 1.41E+06 | 3.51E-04 | 2.48E-10 |
S005-NB145-3 | 5.36E+05 | 9.22E-04 | 1.72E-09 |
S005-NB145-22 | 1.02E+06 | 3.63E-04 | 3.55E-10 |
S005-NB145-74 | 1.13E+06 | 1.46E-02 | 1.29E-08 |
S005-NB145-92 | 4.26E+05 | 2.40E-03 | 5.64E-09 |
S005-NB144-4 | 1.91E+05 | 7.01E-04 | 3.67E-09 |
H65 | 9.47E+05 | 1.48E-03 | 1.56E-09 |
实施例7抗体抗原结合表位(epitope)分析
采用竞争性ELISA方法对VHH-hFc进行表位分类。按照实施例4.1的方法将2μg/mL的抗体包被ELISA板,人CD5-his蛋白从30ug/mL进行梯度稀释,计算出EC80(表13),应用于下步表位分析。将2μg/mL的抗体包被ELISA板,加入25μg/mL待检测的抗体后,再加入每个待检测抗体对应的EC80浓度的hCD5-his蛋白,孵育2h,用PBS洗5次后加入HRP标记的anti-His抗体(金斯瑞,货号:A00612)检测。如果包被抗体与溶液中的待检抗体不存在竞争关系则能够与溶液中的待检抗体-hCD5-his抗原复合物结合,而检测到OD450nm吸收,根据OD450nm吸光值计算出每对抗体之间的抑制率(图13A-3B)。
根据抑制率将各抗体表位进行如图14的分类,S005-NB144-43与H65存在竞争关系,说明它的表位和H65是一类,同时它又和S005-NB144-31存在竞争关系,但是S005-NB144-31和H65没有竞争关系,同时S005-NB144-31与S005-NB144-6存在竞争关系,S005-NB144-6同时与S005-NB144-73有竞争关系,S005-NB144-73与S005-NB144-4,S005-NB144-7有竞争关系,上述抗体可以归为一大类;还有5个抗体与H65完全没有竞争,其中S005-NB145-3,S005-NB145-7,S005-NB145-92与S005-NB144-3有竞争关系,S005-NB144-3同时又与S005-NB145-22有竞争关系,这些抗体可以归为一大类。
表13 VHH-hFc对应的人CD5蛋白EC80值
抗体名称 | EC80(μg/mL) |
S005-NB144-3 | 0.15 |
抗体名称 | EC80(μg/mL) |
S005-NB144-6 | 1.59 |
S005-NB144-7 | 0.67 |
S005-NB144-31 | 0.11 |
S005-NB144-43 | 0.03 |
S005-NB144-73 | 0.02 |
S005-NB145-3 | 0.07 |
S005-NB145-22 | 0.06 |
S005-NB145-74 | 0.59 |
S005-NB145-92 | 0.23 |
S005-NB144-4 | 0.10 |
H65 | 0.25 |
以上对本公开所提供的CD5抗体及其应用进行了详细介绍。本文应用了具体个例对本公开的原理及实施方式进行了阐述,以上实施例的说明只是用于帮助理解本公开的方法及其核心思想。应当指出,对于本技术领域技术人员来说,在不脱离本公开原理的前提下,还可以对本公开进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也落入本公开权利要求的保护范围内。
Claims (29)
- 一种特异性结合CD5的抗体或抗原结合片段,其中,所述抗体或抗原结合片段包含CDR1、CDR2和CDR3,所述CDR1、CDR2和CDR3包含选自SEQ ID NO:6~16任一项所示VHH结构域中的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
- 根据权利要求1所述抗体或抗原结合片段,其中,根据IMGT编号系统、Kabat编号系统或Chothia编号系统确定所述HCDR1、HCDR2和HCDR3;可选地,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3选自表3;可选地,所述HCDR1具有如SEQ ID NO:17、20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101、104、107、110或113所示的氨基酸序列;可选地,所述HCDR2具有如SEQ ID NO:18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111或114所示的氨基酸序列;可选地,所述HCDR3具有如SEQ ID NO:19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、109、112或115所示的氨基酸序列;优选地,根据IMGT编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:17~19所示的氨基酸序列;或优选地,根据Kabat编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:20~22所示的氨基酸序列;或优选地,根据Chothia编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:23~25所示的氨基酸序列;或优选地,根据IMGT编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:26~28所示的氨基酸序列;优选地,根据Kabat编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:29~31所示的氨基酸序列;优选地,根据Chothia编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:32~34所示的氨基酸序列;优选地,根据IMGT编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:35~37所示的氨基酸序列;优选地,根据Kabat编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:38~40所示的氨基酸序列;优选地,根据Chothia编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:41~43所示的氨基酸序列;优选地,根据IMGT编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:44~46所示的氨基酸序列;优选地,根据Kabat编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:47~49所示的氨基酸序列;优选地,根据Chothia编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:50~52所示的氨基酸序列;优选地,根据IMGT编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:53~55所示的氨基酸序列;优选地,根据Kabat编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:56~58所示的氨基酸序列;优选地,根据Chothia编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:59~61所示的氨基酸序列;优选地,根据IMGT编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:62~64所示的氨基酸序列;优选地,根据Kabat编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:65~67所示的氨基酸序列;优选地,根据Chothia编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:68~70所示的氨基酸序列;优选地,根据IMGT编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:71~73所示的氨基酸序列;优选地,根据Kabat编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:74~76所示的氨基酸序列;优选地,根据Chothia编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:77~79所示的氨基酸序列;优选地,根据IMGT编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:80~82所示的氨基酸序列;优选地,根据Kabat编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:83~85所示的氨基酸序列;优选地,根据Chothia编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:86~88所示的氨基酸序列;优选地,根据IMGT编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:89~91所示的氨基酸序列;优选地,根据Kabat编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:92~94所示的氨基酸序列;优选地,根据Chothia编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:95~97所示的氨基酸序列;优选地,根据IMGT编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:98~100所示的氨基酸序列;优选地,根据Kabat编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:101~103所示的氨基酸序列;优选地,根据Chothia编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:104~106所示的氨基酸序列;优选地,根据IMGT编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:107~109所示的氨基酸序列;优选地,根据Kabat编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:110~112所示的氨基酸序列;优选地,根据Chothia编号系统,所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有如SEQ ID NO:113~115所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1或2所述的抗体或抗原结合片段,其中,所述CDR1、CDR2和/或CDR3包含在所述HCDR1、HCDR2和/或HCDR3上发生至多10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个突变的氨基酸序列;所述突变可选自插入、缺失和/或替换,所述替换优选为保守氨基酸的替换。
- 根据权利要求1或2所述的抗体或抗原结合片段,其中,所述CDR1、CDR2和/或CDR3包含与所述HCDR1、HCDR2和/或HCDR3相比具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的序列。
- 根据权利要求1~4任一项所述的抗体或抗原结合片段,其中,所述抗体或抗原结合片段包含单域抗体,所述单域抗体包含所述CDR1、CDR2和CDR3。
- 根据权利要求1~5任一项所述的抗体或抗原结合片段,其中,所述单域抗体包含如SEQ ID NO:6~16任一项所示的序列;可选地,所述单域抗体包含与SEQ ID NO:6~16任一项所示的序列相比发生至多20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个突变的序列,所述突变可选自插入、缺失和/或替换,所述替换优选为保守氨基酸的替换;可选地,所述单域抗体包含与SEQ ID NO:6~16任一项所示的序列相比具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的序列。
- 根据权利要求1~6任一项所述的抗体或抗原结合片段,其中,所述单域抗体包含SEQ ID NO:6~16任一项所示VHH结构域中的FR区;可选地,所述单域抗体包含与SEQ ID NO:6~16任一项所示VHH结构域中的FR区相比发生至多15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个突变的序列,所述突变可选自插入、缺失和/或替换,所述替换优选为保守氨基酸的替换;可选地,所述单域抗体包含与SEQ ID NO:6~16任一项所示VHH结构域中的 FR区相比具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的序列。
- 根据权利要求1~7任一项所述的抗体或抗原结合片段,其中,所述抗体或抗原结合片段为:(1)嵌合抗体或其片段;(2)人源化抗体或其片段;或(3)全人抗体或其片段。
- 根据权利要求1~8任一项所述的抗体或抗原结合片段,其中,所述抗体或抗原结合片段包含或不包含抗体重链恒定区;可选的,所述抗体重链恒定区可选自人、羊驼、小鼠、大鼠、兔或羊;可选地,所述抗体重链恒定区可选自IgG、IgM、IgA、IgE或IgD,所述IgG可选自IgG1,IgG2,IgG3或IgG4;可选地,所述重链恒定区可选自Fc区、CH3区或完整重链恒定区,优选为人Fc区;优选地,所述抗体或抗原结合片段为重链抗体。
- 根据权利要求1~9任一项所述的抗体或抗原结合片段,其中,所述抗体或抗原结合片段还偶联有治疗剂或示踪剂;优选地,所述治疗剂选自放射性同位素、化疗药或免疫调节剂,所述示踪剂选自放射学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂和光敏剂;更优选地,所述细胞毒性剂选自生物碱类(alkaloids)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蒽环类抗生素(doxorubicin)、紫杉烷类(taxanes)或毒素化合物;所述毒素化合物优选自DM1、DM4、SN-38、MMAE、MMAF、Duocarmycin、Calicheamicin或DX8951。
- 根据权利要求1~10任一项所述的抗体或抗原结合片段,其中,所述抗体或抗原结合片段特异性结合人和/或猴CD5,优选地,其与人CD5结合的KD优于1.00E-6M、1.00E-7M、1.00E-8M、2.00E-8M、3.00E-8M、4.00E-8M、5.00E-8M、6.00E-8M、7.00E-8M、8.00E-8M、9.00E-8M、1.00E-9M、2.00E-9M、3.00E-9M、4.00E-9M、5.00E-9M、6.00E-9M、7.00E-9M、8.00E-9M、9.00E-9M、1.00E-10M、2.00E-10M、3.00E-10M、4.00E-10M、5.00E-10M、6.00E-10M、7.00E-10M、8.00E-10M、9.00E-10M、1.00E-11M或1.00E-12M。
- 一种多肽,其中,所述多肽包含权利要求1~11任一项所述抗体或抗原结合片段,优选地,所述多肽还连接有其他功能性分子,所述其他功能性分子可选自以下一种或多种:信号肽、蛋白标签或其他抗原结合分子或细胞因子。
- 根据权利要求12所述的多肽,其中,所述其他抗原结合分子特异性结合CD5以外的抗原或结合与权利要求1~11任一项所述抗体或抗原结合片段不同的CD5表位;优选地,所述CD5以外的抗原可选自:CD3,优选CD3ε;CD16,优选CD16A;CD19;TGF-betaⅡ型受体;NKG2D;CD40;4-1BB;CD137或CD19;EGFR;EGFRvIII;mesothelin;HER2;EphA2;Her3;EpCAM;MUC1;MUC16;CEA;Claudin18.2;叶酸受体;Claudin6;WT1;NY-ESO-1;MAGE3;ASGPR1或CDH16;优选地,所述其他抗原结合分子为抗体或抗原结合片段;优选地,所述多肽为多特异性抗原结合分子,例如双特异性、三特异性或四特异性,更优选地,所述多特异性抗原结合分子可为二价、四价或六价。
- 根据权利要求12所述的多肽,其中,所述细胞因子可选自IL2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-21、IFN或TNF-alpha。
- 一种嵌合抗原受体(CAR),其中,所述嵌合抗原受体包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域,所述细胞外抗原结合结构域包含权利要求1~11任一项所述抗体或抗原结合片段。
- 一种免疫效应细胞,其中,所述免疫效应细胞表达权利要求15所述的嵌合抗原受体或包含编码权利要求15所述嵌合抗原受体的核酸片段;优选地,所述免疫效应细胞选自T细胞、NK细胞(natural killer cell)、NKT细胞(natural killer T cell)、DNT细胞(double negative T cell)、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或肥大细胞,所述T细胞优选自细胞毒性T细胞、调节性T细胞或辅助性T细胞;优选地,所述免疫效应细胞为自体免疫效应细胞或同种异体免疫效应细胞。
- 一种分离的核酸片段,其中,所述核酸片段编码权利要求1~11任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求12~14任一项所述多肽或权利要求15所述的嵌合抗原受体。
- 一种载体(vector),其中,所述载体包含权利要求17所述的核酸片段。
- 一种宿主细胞,其中,所述宿主细胞包含权利要求18所述的载体;优选地,所述细胞为原核细胞或真核细胞,例如细菌(大肠杆菌)、真菌(酵母)、昆虫细胞或哺乳动物细胞(CHO细胞系或293T细胞系)。
- 一种制备权利要求1~11任一项所述抗体或抗原结合片段或权利要求12~14任一项所述多肽的方法,其中,所述方法包括培养权利要求19所述宿主细胞,以及分离所述细胞表达的抗体、抗原结合片段或多肽。
- 一种制备权利要求16所述免疫效应细胞的方法,其中,所述方法包括将编码权利要求15所述嵌合抗原受体(CAR)的核酸片段导入所述免疫效应细胞,可选地,所述方法还包括启动所述免疫效应细胞表达权利要求15所述嵌合抗原受体(CAR)。
- 一种药物组合物,其中,所述药物组合物包含权利要求1~11任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求12~14任一项所述的多肽、权利要求16所述免疫效应细胞、权利要求17所述的核酸片段、权利要求18所述载体或根据权利要求20或21所述方法制备获得的产品;可选地,所述药物组合物还包含药学上可接受的运载体(carrier)、稀释剂或助剂;可选地,所述药物组合物还包含额外的抗肿瘤剂。
- 药物组合,其中,包括权利要求1~11任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求12~14任一项所述的多肽、权利要求16所述免疫效应细胞、权利要求17所述的核酸片段、权利要求18所述载体或根据权利要求20或21所述方法制备获得的产品,以及任意其他有效成分。
- 一种疾病治疗方法,其中,所述方法包括向受试者施用有效量的权利要求 1~11任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求12~14任一项所述的多肽、权利要求16所述免疫效应细胞、权利要求17所述的核酸片段、权利要求18所述载体、权利要求22所述药物组合物、根据权利要求20或21所述方法制备获得的产品或如权利要求23所述的药物组合;所述疾病优选自肿瘤或癌症或自身免疫性疾病;所述肿瘤或癌症可选自实体瘤或血液瘤,所述血液瘤可选自T细胞淋巴瘤、慢性淋巴瘤白血病、皮肤T细胞淋巴瘤、T细胞急性淋巴细胞白血病或非霍奇金淋巴瘤;所述自身免疫性疾病可选自类风湿性关节炎或移植物抗宿主病。
- 权利要求1~11任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求12~14任一项所述的多肽、权利要求15所述免疫效应细胞、权利要求16所述的核酸片段、权利要求17所述载体、权利要求19所述的宿主细胞、权利要求22所述药物组合物、根据权利要求20或21所述方法制备获得的产品或如权利要求23所述的药物组合在制备治疗肿瘤或癌症或自身免疫性疾病的药物中的用途;优选地,所述肿瘤或癌症可选自实体瘤或血液瘤,所述血液瘤可选自T细胞淋巴瘤、慢性淋巴瘤白血病、皮肤T细胞淋巴瘤、T细胞急性淋巴细胞白血病或非霍奇金淋巴瘤,所述自身免疫性疾病可选自类风湿性关节炎或移植物抗宿主病。
- 权利要求1~11任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求12~14任一项所述的多肽、权利要求15所述免疫效应细胞、权利要求16所述的核酸片段、权利要求17所述载体、权利要求22所述药物组合物、根据权利要求20或21所述方法制备获得的产品或如权利要求23所述的药物组合,其中,用于治疗肿瘤或癌症或自身免疫性疾病的药物中的用途;优选地,所述肿瘤或癌症可选自实体瘤或血液瘤,所述血液瘤可选自T细胞淋巴瘤、慢性淋巴瘤白血病、皮肤T细胞淋巴瘤、T细胞急性淋巴细胞白血病或非霍奇金淋巴瘤,所述自身免疫性疾病可选自类风湿性关节炎或移植物抗宿主病。
- 一种试剂盒,其中,所述试剂盒包含权利要求1~11任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求12~14任一项所述的多肽、权利要求16所述免疫效应细胞、权利要求17所述的核酸片段、权利要求18所述载体、权利要求19所述宿主细胞、权利要求22所述药物组合物、根据权利要求20-21任一项所述方法制备获得的产品或如权利要求23所述的药物组合。
- 一种检测生物学样品中CD5表达的方法,其中,所述方法包括在权利要求1~11任一项所述的抗体或抗原结合片段与CD5之间能够形成复合物的条件下,使所述生物学样品与权利要求1~11任一项所述的抗体或抗原结合片段接触;优选地,所述方法还包括检测所述复合物的形成,指示样品中CD5的存在或表达水平。
- 权利要求1~11任一项所述抗体或抗原结合片段在制备CD5检测试剂中的用途。
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