JP2023531672A - Ｈ２Ｌ２とＨＣＡｂ構造を有する結合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
本発明は、少なくとも2つのタンパク質機能領域を含有する結合タンパク質であって、前記結合タンパク質がタンパク質機能領域A及びタンパク質機能領域Bを含み；前記タンパク質機能領域A及び前記タンパク質機能領域Bが異なる抗原または抗原エピトープを標的とし、そのなかで前記タンパク質機能領域AはFabまたはscFv構造であり、前記タンパク質機能領域BはVH構造であり、前記タンパク質機能領域A及びタンパク質機能領域Bの数はそれぞれ1つまたは複数である、結合タンパク質を開示した。本発明の多特異性結合タンパク質が小さい分子量、少ないポリペプチド鎖、より簡単な構造を有し、異なる構造タイプ、相対位置、結合価数などのパラメータによって、異なる標的に対する機能活性を調整し、さらに異なる活性組み合わせを設計し、それによって異なる臨床併用投与量組み合わせの需求を満たしている。【選択図】なし
Description
本発明は、生物医薬分野に係り、とりわけH2L2とHCAb構造を有する二重特異性または多特異性結合タンパク質及びその用途に係る。
ほとんどの生物種における抗体は、2つの完全に同じ重鎖と2つの完全に同じ軽鎖を含む四量体構造であり、「H2L2」とも呼ばれる。ラクダ科及びサメ科の動物の血清には、軽鎖を欠いた重鎖抗体(heavy-chain antibody、HCAb)も天然に存在する。重鎖抗体の可変領域VHHフラグメントは、H2L2抗体のFabと類似しており、安定した構造と特異的な抗原結合活性を持っているが、VHHの分子量は約13Kdaしかないため、ナノ抗体または単一ドメイン抗体とも呼ばれる。ヒトの抗体は天然構造が「H2L2」であるため、天然源から有用なヒト由来の重鎖抗体を得ることができない；しかし、Frank Grosveldらは、トランスジェニック動物を用いて全ヒト由来重鎖抗体を得る方法(WO2007/096779)、及びこの方法を用いて安定で可溶な全ヒト由来VH単一ドメイン抗体を得ることができることを提案した。
二重特異性抗体(bispecific antibodies)と多特異性抗体(multispecific antibodies)は、天然のモノクローナル抗体に基づいてタンパク質工学技術によって作製された人工抗体であり、2種類以上の異なる抗原または同じ抗原上の異なるエピトープを結合することができ、いくつかの単特異性抗体では実現できない作用機序と機能効果を実現することができる。
二重特異性抗体の構造設計は非常に重要である。2つの異なるH2L2抗体から二重特異性抗体を産生することにおいて、1つの最も主要な挑戦は、どのように10種類を超える異なる重鎖と軽鎖の組み合わせから正しい鎖の組み合わせの機能性を持つ二重特異性抗体分子を獲得するか、すなわち鎖のミスマッチ問題をどのように解決するかである。科学者は、すでに多くの戦略を開発してこの問題を解決しようとしている：例えば、単鎖可変領域抗体フラグメント(scFv)の構造を用いてVHとVLを融合させる；あるいは、knob‐into‐hole(KiH)技術または他の空間構造相補的変異体を用いて重鎖の異二量化を促進する；あるいは、「共有軽鎖」または「共有重鎖」技術を用いて異なるポリペプチド鎖の数を減少させることなどが挙げられる。しかし、様々な技術的手段には限界があり、例えば、scFv構造は常に不安定で凝集しやすい；「共有軽鎖」技術は、異なるVHとペアリングできるVLを得るために非常に複雑なフィルタ処理を使用する必要がある；FIT-Igなどの技術で生成された二重抗体分子のサイズは比較的大きく(約250KDa)、細胞や組織への浸透能力に影響を与える可能性がある。そのため、新たな二重特異性抗体の構造開発と二重特異性抗体の作製に係る技術が依然として必要である。
重鎖抗体及びその由来の単一ドメイン抗体は、二重特異又は多特異抗体の構築において特有の利点を有する。重鎖抗体の抗原結合ドメインは、従来の抗体のFabの4分の1の大きさしかない；しかも、軽鎖がなく、軽鎖のミスマッチの問題を回避することができる。したがって、重鎖抗体及びその由来の単一ドメイン抗体を用いて、分子量が小さく、ポリペプチド鎖が少なく、構造がより簡単な二重特異更には多特異抗体を構築することができる。しかし、非ヒト由来重鎖抗体の潜在的な免疫原性リスクは、その治療的用途を制限する可能性がある。したがって、ラクダ科動物のナノ抗体に比べて、全ヒト由来重鎖抗体を利用して二重特異または多特異抵抗体を構築することは、免疫原性と薬剤性の面でより優位である。
従来技術における治療効果が良く、安定で生産が便利な二重特異性または多特異性結合タンパク質の欠乏に係る不足を克服するために、本発明は、H2L2とHCAb構造を有する二重または多特異性結合タンパク質及びそのような結合タンパク質の作製及び使用方法を提供し、それは全ヒト由来重鎖抗体及びその由来の単一ドメイン抗体から構築された多価及び多特異性結合タンパク質を利用する。これは従来のIgG抗体を用いて構築された多価及び多特異性結合タンパク質に比べて多くの利点があり、特異性と結合価数を調整する面でより便利である。本願で提供される多価及び多特異性結合タンパク質は、ヒト由来重鎖抗体に由来する少なくとも1つの重鎖可変領域ドメインVHを含み、且つ2つ以上の抗原、または同一抗原の2つ以上のエピトープ、または同一エピトープの2つ以上のコピーを結合することができる。
前記技術的課題を解決するために、本発明の技術構成の第一は、少なくとも2つのタンパク質機能領域を含有する結合タンパク質であって、前記結合タンパク質がタンパク質機能領域A及びタンパク質機能領域Bを含み；前記タンパク質機能領域A及び前記タンパク質機能領域Bが異なる抗原または抗原エピトープを標的とし、そのなかで前記タンパク質機能領域AはFabまたはscFv構造であり、前記タンパク質機能領域BはVH構造であり、前記タンパク質機能領域A及びタンパク質機能領域Bの数はそれぞれ1つまたは複数であり；好ましく、前記結合タンパク質はさらにFcを含み、前記Fcの数は2つであり、Fc二量体を形成しており；好ましく、前記結合タンパク質は対称構造または非対称構造であり、及び／または、前記Fc二量体はホモ二量体またはヘテロ二量体である、結合タンパク質を提供している。
いくつかの具体的な実施形態では、(I)前記結合タンパク質は対称構造であり、前記対称構造は左右対称のIgG類似構造であり、そのなかで前記タンパク質機能領域Aの数は2つであり、前記タンパク質機能領域Bの数は2つまたは4つである。2つの前記タンパク質機能領域Aと2つの前記Fcは、IgG構造を形成する。前記左右対称のIgG類似構造では、左と右は空間相対位置のみであり、それは上下対称であっても前後対称であってもよい。前記左右対称のIgG類似構造とは、IgG構造の抗体にさらに左右対称に追加のタンパク質機能領域が接続されていることを意味し、これら追加のタンパク質機能領域はFc機能領域のCH3のC末端またはVHまたはVLのN末端に接続されていてもよく、埋め込みの形でIgG構造の可変領域とFc機能領域との間に接続されていてもよい。本願で説明する「追加」は、ここでIgG構造以外の構造または機能領域を指す。
好ましく、前記タンパク質機能領域Bの数は2つである場合、前記結合タンパク質は四価結合タンパク質であり、具体に下記の構造を含み：(a)前記結合タンパク質はN末端からC末端まで順にタンパク質機能領域A、タンパク質機能領域B及びFcであり、そのなかで前記タンパク質機能領域Aと前記タンパク質機能領域Bは第一接続ペプチド(L1)によって接続され、前記タンパク質機能領域Bと前記Fcは第二接続ペプチド(L2)によって接続され；当該実施形態において、両部の前記タンパク質機能領域Bと前記Fcが対称の単鎖抗体の二量体形態を形成し、且つ前記単鎖抗体の二量体のN末端に前記タンパク質機能領域Aが接続され、この際に前記タンパク質機能領域AがそのCH1(図1(2))またはCL(図1(1))で前記タンパク質機能領域BのN末端と接続され；または、(b)前記結合タンパク質はN末端からC末端まで順にタンパク質機能領域B、タンパク質機能領域A及びFcであり、そのなかで前記タンパク質機能領域Bと前記タンパク質機能領域Aは接続ペプチドによって接続され、前記タンパク質機能領域Aと前記Fcはヒンジ領域によって接続され；当該実施形態において、両部の前記タンパク質機能領域Aと前記Fcが対称のIgG構造を形成し、且つ前記IgG構造のN末端に前記タンパク質機能領域Bが接続され、この際に前記タンパク質機能領域Bが前記タンパク質機能領域AのVH(図1(3))またはVL(図1(4))のN末端と接続され；または、(c)前記結合タンパク質はN末端からC末端まで順にタンパク質機能領域A、Fc及びタンパク質機能領域Bであり、そのなかで前記タンパク質機能領域AとFcはヒンジ領域によって接続され、前記Fcと前記タンパク質機能領域Bは接続ペプチドによって接続され；当該実施形態において、両部の前記タンパク質機能領域Aと前記Fcが対称のIgG構造を形成し、且つ前記IgG構造のC末端に前記タンパク質機能領域Bが接続され、この際に前記タンパク質機能領域Bが前記タンパク質機能領域AのCH3(図1(5))またはCL(図1(6))のC末端と接続され；
好ましく、前記タンパク質機能領域Bの数は4つである場合、前記結合タンパク質は六価結合タンパク質であり、具体に下記の構造を含み：追加の2つのタンパク質機能領域Bはさらに前記(a)または(b)または(c)に記載の結合タンパク質のN末端またはC末端に接続され；好ましく前記(c)に記載の結合タンパク質のFcのC末端または元のタンパク質機能領域BのC末端に接続され、または前記(b)に記載の結合タンパク質の元のタンパク質機能領域Bとともにタンパク質機能領域AのN末端に接続される。本文に記載の「追加」とは、上述したタンパク質機能領域B、すなわち「元の」タンパク質機能領域を区別するために、便宜的な表現にすぎず、実際に抗体を設計または生産する際に、追加のタンパク質機能領域と元のタンパク質機能領域との間には前後の区別がない。当該実施形態において、両部の前記タンパク質機能領域Aと前記Fcが対称のIgG構造を形成し、且つ前記IgG構造のC末端に前記タンパク質機能領域Bが接続され、この際にそのなかで2つのタンパク質機能領域Bが前記タンパク質機能領域AのCH3と第一接続ペプチドによって接続され、他の2つのタンパク質機能領域Bが前記2つのタンパク質機能領域Bと第二接続ペプチドによって接続され(図1(7))；または、そのなかで2つのタンパク質機能領域Bが前記タンパク質機能領域AのVHのN末端と第一接続ペプチドによって接続され、他の2つのタンパク質機能領域Bと前記タンパク質機能領域AのVLのN末端は第二接続ペプチドによって接続される(図1(9))。
前記2つの異なるタンパク質機能領域を有する結合タンパク質は、二重特異性結合タンパク質とも呼ばれる。好ましく、前記結合タンパク質はさらにタンパク質機能領域Cを含み、前記結合タンパク質は六価または八価の三重特異性結合タンパク質であり、具体に下記の構造を含み：前記タンパク質機能領域Cと前記タンパク質機能領域A、タンパク質機能領域Bが異なる抗原または抗原エピトープを標的とし、前記タンパク質機能領域Cが前記抗体のN末端またはC末端に接続され；好ましく前記タンパク質機能領域Cの数は2つであり、前記タンパク質機能領域Cが前記(c)に記載の結合タンパク質のC末端に接続され、または、前記(b)に記載の結合タンパク質のタンパク質機能領域Bと同じ、前記タンパク質機能領域AのN末端に接続される。当該実施形態において、両部のタンパク質機能領域Cは第二接続ペプチドによってさらに構造(5)のC末端(図1(8))、または構造(3)または(4)のN末端(図1(10)には構造(3)のN末端に接続されるシチュエーションを示す)に接続される。
より一層好ましく、前記結合タンパク質が四本のポリペプチド鎖を有し、それぞれ両本の同じの短鎖(または「ポリペプチド鎖1」と呼ばれる)及び両本の同じの長鎖(または「ポリペプチド鎖2」と呼ばれる)に分け、そのなかで、(1)前記短鎖はN末端からC末端まで順にVH_A-CH1を含み、前記長鎖はN末端からC末端まで順にVL_A-CL-L1-VH_B-L2-CH2-CH3を含み；または(2)前記短鎖はN末端からC末端まで順にVL_A-CLを含み、前記長鎖はN末端からC末端まで順にVH_A-CH1-L1-VH_B-L2-CH2-CH3を含み；または(3)前記短鎖はN末端からC末端まで順にVL_A-CLを含み、前記長鎖はN末端からC末端まで順にVH_B-L-VH_A-CH1-h-CH2-CH3を含み；または(4)前記短鎖はN末端からC末端まで順にVH_B-L-VL_A-CLを含み、前記長鎖はN末端からC末端まで順にVH_A-CH1-h-CH2-CH3を含み；または(5)前記短鎖はN末端からC末端まで順にVL_A-CLを含み、前記長鎖はN末端からC末端まで順にVH_A-CH1-h-CH2-CH3-L-VH_Bを含み；または(6)前記短鎖はN末端からC末端まで順にVL_A-CL-L-VH_Bを含み、前記長鎖はN末端からC末端まで順にVH_A-CH1-h-CH2-CH3を含み；または(7)前記短鎖はN末端からC末端まで順にVL_A-CLを含み、前記長鎖はN末端からC末端まで順にVH_A-CH1-h-CH2-CH3-L1-VH_B-L2-VH_Bを含み；または(8)前記短鎖はN末端からC末端まで順にVL_A-CLを含み、前記長鎖はN末端からC末端まで順にVH_A-CH1-h-CH2-CH3-L1-VH_B-L2-VH_Cを含み；または(9)前記短鎖はN末端からC末端まで順にVH_B-L1-VL_A-CLを含み、前記長鎖はN末端からC末端まで順にVH_B-L2-VH_A-CH1-h-CH2-CH3を含み；または(10)前記短鎖はN末端からC末端まで順にVH_B-L1-VL_A-CLを含み、前記長鎖はN末端からC末端まで順にVH_C-L2-VH_A-CH1-h-CH2-CH3を含み；そのなかで、前記L、L1及びL2は接続ペプチドであり、前記hはヒンジ領域または接続ペプチドであり、前記ヒンジ領域または接続ペプチドは例えば「-」、GSまたはSEQ ID NO: 495-519のアミノ酸配列に示す。本文中のVL、VH、CL、CHの意味はすべて本分野の通常であり、それぞれ軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖定常領域と重鎖定常領域を代表し、そのうちCHはCH1、CH2とCH3を含み；_Aと_Bと_Cはそれぞれ当該機能領域がタンパク質機能領域Aまたはタンパク質機能領域Bまたはタンパク質機能領域Cまたはその組成であることを表し、「‐」は、異なるドメインを結合するためのポリペプチド結合であり、または異なるドメインを分離するためであり；C末端がペプチド鎖のカルボキシル末端(「C’」とも書く)であり、N末端がペプチド鎖のアミノ末端(「N’」とも書く)である。前記異なるタンパク質機能領域が同一のポリペプチド鎖に融合し、ミスマッチ副生成物を回避することができる。いくつかの実施形態では、L、L1、L2は同じ配列であってもよい。別の実施形態では、L、L1、L2は異なる配列であってもよい。本発明のタンパク質機能領域は、場合によってはFab、scFvまたはVHであってもよく、他の場合にはF(ab)2または全長抗体であってもよく、場合によっては抗体または抗原結合タンパク質または結合タンパク質とも呼ばれる。いくつかの具体的な実施形態では、タンパク質機能領域Aは、第1抗原に対する抗体Aまたは第1抗原結合ドメインとも呼ばれ、タンパク質機能領域Bは、第2抗原に対する抗体Bまたは第2抗原結合ドメインとも呼ばれ、タンパク質機能領域Cは、第3抗原に対する抗体Cまたは第3抗原結合ドメインとも呼ばれる、タンパク質機能領域Dは、第4抗原に対する抗体Dまたは第4抗原結合ドメインとも呼ばれ、このように類推される。
いくつかの具体的な実施例において、(II)前記結合タンパク質は非対称構造であり、前記非対称構造が左右非対称のIgG類似構造を呈し、そのなかで左アームはFabまたはscFv構造のタンパク質機能領域Aであり、右アームはVH構造のタンパク質機能領域Bであり、前記タンパク質機能領域A及び前記タンパク質機能領域Bがそれぞれ1つのFcと接続され；好ましく前記タンパク質機能領域Aの数は1つであり、前記タンパク質機能領域Bの数は1つまたは2つまたは3つである。
好ましく、前記タンパク質機能領域Bの数は1つである場合、前記結合タンパク質は二価結合タンパク質であり、下記の構造を含み：前記タンパク質機能領域Aは(d)従来のFab構造、または(e)Fab(cross VH/VL)構造、または(f)Fab(cross Fd/LC)構造であり；前記タンパク質機能領域Bの数は2つである場合、前記結合タンパク質は三価結合タンパク質であり、下記の構造を含み：左アームの前記タンパク質機能領域Aは前記(d)または(e)または(f)であり、2つ目のタンパク質機能領域Bが左アームの前記タンパク質機能領域AのN末端またはC末端、または右アームの1つ目のタンパク質機能領域BのN末端、または前記FcのC末端に接続され、好ましく2つ目のタンパク質機能領域Bが右アームの1つ目のタンパク質機能領域BのN末端に接続され；前記タンパク質機能領域Bの数は3つである場合、前記結合タンパク質は四価結合タンパク質であり、具体に下記の構造を含み：左アームの前記タンパク質機能領域Aは前記(d)または(e)または(f)構造であり、3つ目のタンパク質機能領域Bはさらに左アームの前記タンパク質機能領域AのN末端またはC末端、または左アームの2つ目のタンパク質機能領域BのN末端またはC末端、または右アームの1つ目または2つ目のタンパク質機能領域BのN末端、または前記FcのC末端に接続され、好ましく2つ目のタンパク質機能領域Bが右アームの1つ目のタンパク質機能領域BのN末端に接続され、且つ3つ目のタンパク質機能領域Bが前記2つ目のタンパク質機能領域BのN末端に接続される。
好ましく、前記タンパク質機能領域Bの数は1つである場合、前記結合タンパク質は二価結合タンパク質であり、下記の構造を含み：前記タンパク質機能領域Aは(d)従来のFab構造、または(e)Fab(cross VH/VL)構造、または(f)Fab(cross Fd/LC)構造であり；前記タンパク質機能領域Bの数は2つである場合、前記結合タンパク質は三価結合タンパク質であり、下記の構造を含み：左アームの前記タンパク質機能領域Aは前記(d)または(e)または(f)であり、2つ目のタンパク質機能領域Bが左アームの前記タンパク質機能領域AのN末端またはC末端、または右アームの1つ目のタンパク質機能領域BのN末端、または前記FcのC末端に接続され、好ましく2つ目のタンパク質機能領域Bが右アームの1つ目のタンパク質機能領域BのN末端に接続され；前記タンパク質機能領域Bの数は3つである場合、前記結合タンパク質は四価結合タンパク質であり、具体に下記の構造を含み：左アームの前記タンパク質機能領域Aは前記(d)または(e)または(f)構造であり、3つ目のタンパク質機能領域Bはさらに左アームの前記タンパク質機能領域AのN末端またはC末端、または左アームの2つ目のタンパク質機能領域BのN末端またはC末端、または右アームの1つ目または2つ目のタンパク質機能領域BのN末端、または前記FcのC末端に接続され、好ましく2つ目のタンパク質機能領域Bが右アームの1つ目のタンパク質機能領域BのN末端に接続され、且つ3つ目のタンパク質機能領域Bが前記2つ目のタンパク質機能領域BのN末端に接続される。
前記タンパク質機能領域Bの数は1つである場合、前記結合タンパク質は二価結合タンパク質であり、下記の構造を含み：左アームの前記タンパク質機能領域Aは(g)scFv構造であり、前記scFvはVHの末端またはVLの末端によってFcと接続され；前記タンパク質機能領域Bの数は2つである場合、前記結合タンパク質は三価結合タンパク質であり、具体に下記の構造を含み：左アームの前記タンパク質機能領域Aは(g)であり、2つ目のタンパク質機能領域Bが左アームの前記タンパク質機能領域AのN末端、または右アームの元のタンパク質機能領域BのN末端、または前記FcのC末端に接続され、好ましく2つ目のタンパク質機能領域Bが右アームの1つ目のタンパク質機能領域BのN末端に接続され；前記タンパク質機能領域Bの数は3つである場合、前記結合タンパク質は四価結合タンパク質であり、具体に下記の構造を含み：左アームの前記タンパク質機能領域Aは(g)であり、3つ目のタンパク質機能領域Bはさらに左アームの前記タンパク質機能領域AのN末端、または2つ目のタンパク質機能領域BのN末端またはC末端、または前記FcのC末端に接続され、好ましく2つ目のタンパク質機能領域Bが右アームの1つ目のタンパク質機能領域BのN末端に接続され、且つ3つ目のタンパク質機能領域Bが前記2つ目のタンパク質機能領域BのN末端に接続される。
好ましく、前記結合タンパク質はさらにタンパク質機能領域Cを含み、前記結合タンパク質は三価または多価の多特異性結合タンパク質であり、そのなかで、前記タンパク質機能領域Cと前記タンパク質機能領域A、タンパク質機能領域Bが異なる抗原または抗原エピトープを標的とし、前記タンパク質機能領域Cが前記結合タンパク質のN末端またはC末端に接続され；好ましく前記タンパク質機能領域Cが前記(d)、(e)、(f)または(g)に記載の結合タンパク質のタンパク質機能領域BのN末端に接続され；
より一層好ましく、前記結合タンパク質はさらにタンパク質機能領域Dを含み、前記結合タンパク質は四価または多価の多特異性結合タンパク質であり、具体に：前記タンパク質機能領域Dと前記タンパク質機能領域A、タンパク質機能領域B、タンパク質機能領域Cが異なる抗原または抗原エピトープを標的とし、前記タンパク質機能領域Dが前記結合タンパク質のN末端またはC末端に接続され；好ましく前記タンパク質機能領域Dが前記(d)、(e)、(f)または(g)に記載の結合タンパク質のタンパク質機能領域BのN末端に接続される。
より一層好ましく、前記結合タンパク質はさらにタンパク質機能領域Dを含み、前記結合タンパク質は四価または多価の多特異性結合タンパク質であり、具体に：前記タンパク質機能領域Dと前記タンパク質機能領域A、タンパク質機能領域B、タンパク質機能領域Cが異なる抗原または抗原エピトープを標的とし、前記タンパク質機能領域Dが前記結合タンパク質のN末端またはC末端に接続され；好ましく前記タンパク質機能領域Dが前記(d)、(e)、(f)または(g)に記載の結合タンパク質のタンパク質機能領域BのN末端に接続される。
より一層好ましく、前記結合タンパク質がポリペプチド鎖1、ポリペプチド鎖2及びポリペプチド鎖3の三種ポリペプチド鎖を有し、各種のポリペプチド鎖は一本である。本発明において、前記ポリペプチド鎖1が第一ポリペプチド鎖とも呼ばれ、前記ポリペプチド鎖2が第二ポリペプチド鎖とも呼ばれ、前記ポリペプチド鎖3が第三ポリペプチド鎖とも呼ばれる。そのなかで、(11)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVL_A-CLを含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVH_A-CH1-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖3はN末端からC末端まで順にVH_B-h-CH2-CH3を含み；または(12)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVH_A-CLを含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVL_A-CH1-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖3はN末端からC末端まで順にVH_B-h-CH2-CH3を含み；または(13)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVH_A-CH1を含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVL_A-CL-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖3はN末端からC末端まで順にVH_B-h-CH2-CH3を含み；または(14)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVL_A-CLを含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVH_A-CH1-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖3はN末端からC末端まで順にVH_B-L-VH_B-h-CH2-CH3を含み；または(15)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVL_A-CLを含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVH_A-CH1-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖3はN末端からC末端まで順にVH_C-L-VH_B-h-CH2-CH3を含み；または(16)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVH_A-CLを含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVL_A-CH1-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖3はN末端からC末端まで順にVH_B-L-VH_B-h-CH2-CH3を含み；または(17)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVH_A-CLを含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVL_A-CH1-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖3はN末端からC末端まで順にVH_C-L-VH_B-h-CH2-CH3を含み；または(18)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVH_A-CH1を含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVL_A-CL-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖3はN末端からC末端まで順にVH_B-L-VH_B-h-CH2-CH3を含み；または(19)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVH_A-CH1を含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVL_A-CL-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖3はN末端からC末端まで順にVH_C-L-VH_B-h-CH2-CH3を含み；または(26)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVL_A-CLを含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVH_A-CH1-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖3はN末端からC末端まで順にVH_B-L1-VH_B-L2-VH_B-h-CH2-CH3を含み；または(27)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVL_A-CLを含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVH_A-CH1-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖3はN末端からC末端まで順にVH_D-L1-VH_C-L2-VH_B-h-CH2-CH3を含み；そのなかで、前記L、L1及びL2は接続ペプチドであり、前記hはヒンジ領域または接続ペプチドであり、前記ヒンジ領域または接続ペプチドは例えば「-」、GSまたはSEQ ID NO: 495-519のアミノ酸配列に示す。
より一層好ましく、前記結合タンパク質がポリペプチド鎖1及びポリペプチド鎖2の両種のポリペプチド鎖を有し、各種のポリペプチド鎖は一本であり、同様に、前記ポリペプチド鎖1が第一ポリペプチド鎖とも呼ばれ、前記ポリペプチド鎖2が第二ポリペプチド鎖とも呼ばれる。そのなかで、(20)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVL_A-L-VH_A-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVH_B-h-CH2-CH3を含み；または(21)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVH_A-L-VL_A-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVH_B-h-CH2-CH3を含み；または(22)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVL_A-L1-VH_A-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVH_B-L2-VH_B-h-CH2-CH3を含み；または(23)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVH_A-L1-VL_A-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVH_B-L2-VH_B-h-CH2-CH3を含み；または(24)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVL_A-L1-VH_A-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVH_C-L2-VH_B-CH2-CH3を含み；または(25)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVH_A-L1-VL_A-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVH_C-L2-VH_B-h-CH2-CH3を含み；そのなかで、前記L、L1及びL2は接続ペプチドであり、前記hはヒンジ領域または接続ペプチドであり、前記ヒンジ領域または接続ペプチドは例えば「-」、GSまたはSEQ ID NO: 495-519のアミノ酸配列に示す。
いくつかの具体的な実施例において、前記結合タンパク質が少なくとも2つのタンパク質機能領域、すなわちタンパク質機能領域A及びタンパク質機能領域Bを含有し；前記タンパク質機能領域A及び前記タンパク質機能領域BはPD-L1抗体、HER2抗体、B7H4抗体、CD3抗体、CTLA4抗体、4-1BB抗体またはBCMA抗体から選択される一種である。好ましく、前記タンパク質機能領域AはPD-L1抗体、HER2抗体、B7H4抗体またはCD3抗体であり、前記タンパク質機能領域BはCTLA4抗体、4-1BB抗体またはBCMA抗体である。好ましく、前記タンパク質機能領域AはPD-L1抗体であり、前記タンパク質機能領域BはCTLA4抗体であり；または、前記タンパク質機能領域AはPD-L1抗体であり、前記タンパク質機能領域Bは4-1BB抗体であり；または、前記タンパク質機能領域AはHER2抗体であり、前記タンパク質機能領域BはCTLA4抗体であり；または、前記タンパク質機能領域AはB7H4抗体であり、前記タンパク質機能領域Bは4-1BB抗体であり；または、前記タンパク質機能領域AはCD3抗体であり、前記タンパク質機能領域BはBCMA抗体である。
いくつかの具体的な実施例において、前記PD-L1抗体が軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 167、188及び211に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、62及び122に示すアミノ酸配列であり；または、その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 167、188及び211に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、69及び122に示すアミノ酸配列である。挙げられたCDRのアミノ酸配列は、Chothia定義規則に従って示されている。好ましく、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 282に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 233に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 282に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 240に示すアミノ酸配列を含む。より好ましく、前記PD-L1抗体が2つのポリペプチド鎖を含み；そのなかで、第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 347に示すアミノ酸配列を含み、第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 300に示すアミノ酸配列を含み；または、第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み、第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 308に示すアミノ酸配列を含み；または、第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み、第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 310に示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの具体的な実施例において、前記PD-L1抗体が本分野の既知のatezolizumabのアミノ酸配列に示す。
いくつかの具体的な実施例において、前記HER2抗体が本分野の既知のtrastuzumabまたはpertuzumabのアミノ酸配列に示す。
いくつかの具体的な実施例において、前記B7H4抗体が軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 180、191及び225に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 32、87及び143に示すアミノ酸配列であり；または、その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 177、191及び226に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 33、88及び144に示すアミノ酸配列である。挙げられたCDRのアミノ酸配列は、Chothia定義規則に従って示されている。好ましく、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 298に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 261に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 299に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 262に示すアミノ酸配列を含む。より好ましく、前記B7H4抗体が2つのポリペプチド鎖を含み；そのなかで、第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 360に示すアミノ酸配列を含み、第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 326に示すアミノ酸配列を含み；または、第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 361に示すアミノ酸配列を含み、第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 327に示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの具体的な実施例において、前記CTLA4抗体が重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 17、65及び125に示すアミノ酸配列である。挙げられたCDRのアミノ酸配列は、Chothia定義規則に従って示されている。好ましく、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 236に示すアミノ酸配列を含む。より好ましく、前記CTLA4抗体が1つのポリペプチド鎖を含み、前記ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 303に示すアミノ酸配列、SEQ ID NO: 306に示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの具体的な実施例において、前記4-1BB抗体が軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 170、191及び214に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 18、66及び126に示すアミノ酸配列であり；または、その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 170、191及び214に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 18、71及び126に示すアミノ酸配列である。挙げられたCDRのアミノ酸配列は、Chothia定義規則に従って示されている。好ましく、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 285に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 237に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 289に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 242に示すアミノ酸配列を含む。より好ましく、前記4-1BB抗体が2つのポリペプチド鎖を含み；そのなかで、第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 350に示すアミノ酸配列を含み、第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 304に示すアミノ酸配列を含み；または、第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 355に示すアミノ酸配列を含み、第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 311に示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの具体的な実施例において、前記4-1BB抗体が重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 27、79及び137に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 28、80及び138に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 29、82及び138に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 28、89及び145に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 28、81及び139に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、83及び140に示すアミノ酸配列である。挙げられたCDRのアミノ酸配列は、Chothia定義規則に従って示されている。好ましく、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 252に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 253に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 255に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 264に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 254に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 256に示すアミノ酸配列を含む。より好ましく、前記4-1BB抗体が1つのポリペプチド鎖を含み、前記ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 320に示すアミノ酸配列、SEQ ID NO: 321に示すアミノ酸配列、SEQ ID NO: 323に示すアミノ酸配列、SEQ ID NO: 322に示すアミノ酸配列、SEQ ID NO: 324に示すアミノ酸配列、またはSEQ ID NO: 329に示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの具体的な実施例において、前記CD3抗体が軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 177、191及び221に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、84及び141に示すアミノ酸配列であり；または、その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 178、197及び222に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 31、85及び142に示すアミノ酸配列であり；または、その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 177、191及び223に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 31、86及び141に示すアミノ酸配列であり；または、その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 179、198及び224に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 31、85及び142に示すアミノ酸配列である。挙げられたCDRのアミノ酸配列は、Chothia定義規則に従って示されている。好ましく、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 294に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 258に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 295に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 259に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 296に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 260に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 297に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 259に示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの具体的な実施例において、前記CD3抗体が軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 20、68及び128に示すアミノ酸配列であり；または、その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列である。挙げられたCDRのアミノ酸配列は、Chothia定義規則に従って示されている。好ましく、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 245に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 257に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 281に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 244に示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの具体的な実施例において、前記CD3抗体が両種のポリペプチド鎖を含み；そのなかで、第一ポリペプチド鎖(VL)がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み、第二ポリペプチド鎖(VH)がSEQ ID NO: 313に示すアミノ酸配列を含み；または、第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み、第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 325に示すアミノ酸配列を含み；または、第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み、第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 328に示すアミノ酸配列を含み；または、第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み、第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 346に示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの具体的な実施例において、前記CD3抗体が1つのポリペプチド鎖を含み、前記ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 489に示すアミノ酸配列、SEQ ID NO: 490に示すアミノ酸配列、SEQ ID NO: 491に示すアミノ酸配列、SEQ ID NO: 492に示すアミノ酸配列、または、SEQ ID NO: 493に示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの具体的な実施例において、前記BCMA抗体が重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、75及び133に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 24、76及び134に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 25、77及び135に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、78及び136に示すアミノ酸配列である。挙げられたCDRのアミノ酸配列は、Chothia定義規則に従って示されている。好ましく、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 248に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 249に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 250に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含む。より好ましく、前記BCMA抗体が1つのポリペプチド鎖を含み、前記ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 316に示すアミノ酸配列、SEQ ID NO: 317に示すアミノ酸配列、SEQ ID NO: 318に示すアミノ酸配列、または、SEQ ID NO: 319に示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの具体的な実施例において、前記BCMA抗体が重鎖可変領域を含み、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、90及び136に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 34、78及び146に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、78及び147に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、90及び147に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 36、90及び146に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、76及び147に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 34、78及び148に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、76及び136に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、90及び146に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 34、76及び136に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、76及び146に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 34、76及び146に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、90及び148に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、90及び136に示すアミノ酸配列である。挙げられたCDRのアミノ酸配列は、Chothia定義規則に従って示されている。好ましく、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 265に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 266に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 267に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 268に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 269に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 270に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 271に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 272に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 273に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 274に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 275に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 276に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 277に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 278に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 279に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 280に示すアミノ酸配列を含む。より好ましく、前記BCMA抗体が1つのポリペプチド鎖を含み、前記ポリペプチド鎖は、SEQ ID NO: 330に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 331に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 332に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 333に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 334に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 335に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 336に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 337に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 338に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 339に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 340に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 341に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 342に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 343に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 344に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 345に示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの具体的な実施例において、前記タンパク質機能領域CはBCMA重鎖抗体の重鎖可変領域であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 24、76及び134に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、78及び136に示すアミノ酸配列である。好ましく、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 249に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含む。
以上の具体的な実施例において、前記結合タンパク質はさらに軽鎖定常領域を含み、前記軽鎖定常領域は好ましくヒト軽鎖定常領域であり、より好ましくはヒト軽鎖定常領域CκまたはCλである。
以上の具体的な実施例において、前記結合タンパク質はさらに重鎖定常領域(CH1、CH2及び／またはCH3)を含み、前記重鎖定常領域は好ましくヒト重鎖定常領域であり、より好ましくはヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4重鎖定常領域である。いくつかの具体実施例において、前記IgG1重鎖定常領域のFcにはC220S、N297A、L234A、L235A、P329G、S239D、I332E、S354C、T366W 、Y349C、T366S、L368A、Y407V、M252Y、S254T、T256Eなどの突然変異における一種または多種を有し、前記突然変異部位についてはEU番号規則を使用する。
いくつかの好ましい実施例において、前記結合タンパク質がタンパク質機能領域A及びタンパク質機能領域Bを含有し：前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 167、188及び211に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、69及び122に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 17、65及び125に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 167、188及び211に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、62及び122に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 17、65及び125に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 171、190及び215に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 19、67及び127に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 17、65及び125に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 176、196及び220に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 23、74及び132に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 17、65及び125に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 167、188及び211に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、69及び122に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 28、80及び138に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 167、188及び211に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、69及び122に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 27、79及び137に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 167、188及び211に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、69及び122に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 29、82及び138に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 180、191及び225に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 32、87及び143に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 28、80及び138に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 180、191及び225に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 32、87及び143に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 27、79及び137に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 180、191及び225に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 32、87及び143に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 28、89及び145に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 177、191及び226に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 33、88及び144に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 28、80及び138に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 177、191及び226に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 33、88及び144に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 28、81及び139に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 177、191及び226に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 33、88及び144に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、83及び140に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 20、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 24、76及び134に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 20、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、78及び136に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 20、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、75及び133に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、75及び133に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、78及び136に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、90及び136に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 36、90及び146に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、76及び147に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 34、78及び148に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、76及び136に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、90及び146に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 34、76及び136に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、76及び146に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 34、76及び146に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、90及び148に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、90及び136に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 34、78及び146に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、78及び147に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、90及び147に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 177、191及び221に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、84及び141に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、78及び136に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 178、197及び222に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 31、85及び142に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、78及び136に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 177、191及び223に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 31、86及び141に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、78及び136に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 179、198及び224に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 31、85及び142に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、78及び136に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 167、188及び211に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、62及び122に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 17、65及び125に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 171、190及び215に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 19、67及び127に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 17、65及び125に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 176、196及び220に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 23、74及び132に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 17、65及び125に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 167、188及び211に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、69及び122に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 28、80及び138に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 167、188及び211に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、69及び122に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 27、79及び137に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 167、188及び211に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、69及び122に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 29、82及び138に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 180、191及び225に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 32、87及び143に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 28、80及び138に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 180、191及び225に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 32、87及び143に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 27、79及び137に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 180、191及び225に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 32、87及び143に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 28、89及び145に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 177、191及び226に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 33、88及び144に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 28、80及び138に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 177、191及び226に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 33、88及び144に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 28、81及び139に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 177、191及び226に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 33、88及び144に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、83及び140に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 20、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 24、76及び134に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 20、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、78及び136に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 20、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、75及び133に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、75及び133に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、78及び136に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、90及び136に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 36、90及び146に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、76及び147に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 34、78及び148に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、76及び136に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、90及び146に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 34、76及び136に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、76及び146に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 34、76及び146に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、90及び148に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、90及び136に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 34、78及び146に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、78及び147に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、90及び147に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 177、191及び221に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、84及び141に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、78及び136に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 178、197及び222に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 31、85及び142に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、78及び136に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 177、191及び223に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 31、86及び141に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、78及び136に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 179、198及び224に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 31、85及び142に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、78及び136に示すアミノ酸配列であり；または、
いくつかの好ましい実施例において、前記結合タンパク質がタンパク質機能領域A、タンパク質機能領域B及びタンパク質機能領域Cを含有し：そのなかで、前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、75及び133に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Cが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 24、76及び134に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 25、77及び135に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Cが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、78及び136に示すアミノ酸配列である。挙げられたCDRのアミノ酸配列は、Chothia定義規則に従って示されている。
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 25、77及び135に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Cが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、78及び136に示すアミノ酸配列である。挙げられたCDRのアミノ酸配列は、Chothia定義規則に従って示されている。
いくつかのより好ましい実施例において、前記結合タンパク質がタンパク質機能領域A及びタンパク質機能領域Bを含み：前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 282に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 240に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 236に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 282に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 233に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 236に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 286に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 238に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 236に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 293に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 247に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 236に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 282に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 240に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 253に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 282に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 240に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 252に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 282に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 240に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 255に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 298に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 261に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 253に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 298に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 261に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 252に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 298に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 261に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 264に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 299に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 262に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 253に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 299に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 262に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 254に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 299に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 262に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 256に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 245に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 249に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 245に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 245に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 248に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 257に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 248に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 257に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 281に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 265に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 269に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 270に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 271に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 272に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 273に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 274に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 275に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 276に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 277に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 278に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 279に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 280に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 266に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 267に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 268に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 244に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 249に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 244に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 294に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 258に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 295に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 259に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 296に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 260に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 297に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 259に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 282に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 233に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 236に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 286に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 238に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 236に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 293に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 247に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 236に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 282に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 240に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 253に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 282に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 240に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 252に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 282に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 240に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 255に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 298に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 261に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 253に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 298に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 261に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 252に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 298に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 261に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 264に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 299に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 262に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 253に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 299に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 262に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 254に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 299に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 262に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 256に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 245に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 249に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 245に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 245に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 248に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 257に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 248に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 257に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 281に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 265に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 269に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 270に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 271に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 272に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 273に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 274に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 275に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 276に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 277に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 278に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 279に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 280に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 266に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 267に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 268に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 244に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 249に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 244に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 294に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 258に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 295に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 259に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 296に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 260に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 297に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 259に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含み；または、
いくつかのより好ましい実施例において、前記結合タンパク質がタンパク質機能領域A、タンパク質機能領域B及びタンパク質機能領域Cを含有し：そのなかで、前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 257に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 248に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Cが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 249に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 257に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 250に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Cが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含む。
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 257に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 250に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Cが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含む。
いくつかのより好ましい実施例において、前記結合タンパク質が両種のポリペプチド鎖を含む。そのなかで、第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 371に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 372に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 371に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 373に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 362に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 363に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 364に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 365に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 364に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 366に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 369に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 370に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 394に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 395に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 363に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 310に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 363に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 396に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 363に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 362に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 363に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 394に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 363に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 395に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 368に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 378に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 379に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 380に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 381に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 382に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 383に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 385に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 388に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 389に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 374に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 375に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 386に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 387に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 401に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 402に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 305に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 403に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 402に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 409に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 359に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 404に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 405に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 315に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 359に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 406に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 376に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 377に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 397に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 398に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 399に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 400に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 402に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 401に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 402に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 403に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 405に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 404に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 405に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 406に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 371に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 486に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 460に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 461に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 462に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 487に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 488に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 360に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 455に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 360に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 456に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 360に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 457に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 360に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 458に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 360に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 459に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 419に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 412に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 419に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 414に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 440に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 428に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 441に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 428に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 442に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 428に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 443に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 428に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 487に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 520に示すアミノ酸配列を含み；または、
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第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 360に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 523に示すアミノ酸配列を含む。
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 371に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 373に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 362に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 363に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 364に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 365に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 364に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 366に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 369に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 370に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 394に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 395に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 363に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 310に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 363に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 396に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 363に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 362に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 363に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 394に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 363に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 395に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 368に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 378に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 379に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 380に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 381に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 382に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 383に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 385に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 388に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 389に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 374に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 375に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 386に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 387に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 401に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 402に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 305に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 403に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 402に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 409に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 359に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 404に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 405に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 315に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 359に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 406に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 376に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 377に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 397に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 398に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 399に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 400に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 402に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 401に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 402に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 403に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 405に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 404に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 405に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 406に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 371に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 486に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 460に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 461に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 462に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 487に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 488に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 360に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 455に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 360に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 456に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 360に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 457に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 360に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 458に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 360に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 459に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 419に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 412に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 419に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 414に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 440に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 428に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 441に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 428に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 442に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 428に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 443に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 428に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 487に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 520に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 521に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 371に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 522に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 360に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 523に示すアミノ酸配列を含む。
いくつかのより好ましい実施例において、前記結合タンパク質が3つのポリペプチド鎖を含む。そのなかで、第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 407に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 390に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 408に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 392に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 391に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 390に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 393に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 392に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 391に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 434に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 391に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 435に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 393に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 436に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 393に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 437に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 438に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 434に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 438に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 435に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 439に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 436に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 439に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 437に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 361に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 481に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 482に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 361に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 481に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 483に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 361に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 481に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 484に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 361に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 481に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 485に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 411に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 412に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 411に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 414に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 415に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 416に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 410に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 415に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 416に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 412に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 415に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 416に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 414に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 417に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 418に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 412に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 417に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 418に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 414に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 423に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 426に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 423に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 427に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 423に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 428に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 423に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 429に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 444に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 449に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 450に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 449に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 444に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 445に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 444に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 446に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 450に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 445に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 450に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 446に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 444に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 447に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 444に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 448に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 450に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 447に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 450に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 448に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 445に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 446に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 463に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 464に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 465に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 466に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 467に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 468に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 469に示すアミノ酸配列を含み；または、
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第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 471に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 472に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 473に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 474に示すアミノ酸配列を含み；または、
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第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 478に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 479に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 480に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 423に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 430に示すアミノ酸配列を含み；または、
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第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 423に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 432に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 423に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 433に示すアミノ酸配列を含む。
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 408に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 392に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 391に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 390に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 393に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 392に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 391に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 434に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 391に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 435に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 393に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 436に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 393に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 437に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 438に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 434に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 438に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 435に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 439に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 436に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 439に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 437に示すアミノ酸配列を含み；または、
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第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 361に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 481に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 483に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 361に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 481に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 484に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 361に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 481に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 485に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 411に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 412に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 411に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 414に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 415に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 416に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 410に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 415に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 416に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 412に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 415に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 416に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 414に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 417に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 418に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 412に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 417に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 418に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 414に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 423に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 426に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 423に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 427に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 423に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 428に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 423に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 429に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 444に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 449に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 450に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 449に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 444に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 445に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 444に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 446に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 450に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 445に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 450に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 446に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 444に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 447に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 444に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 448に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 450に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 447に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 450に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 448に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 445に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 446に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 463に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 464に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 465に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 466に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 467に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 468に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 469に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 470に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 471に示すアミノ酸配列を含み；または、
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第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 474に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 475に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 476に示すアミノ酸配列を含み；または、
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第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 423に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 431に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 423に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 432に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 423に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 433に示すアミノ酸配列を含む。
前記技術課題を解決するために、本発明の技術構成の第二は：前記のような結合タンパク質をコードする、単離の核酸を提供する。
前記技術課題を解決するために、本発明の技術構成の第三は：前記のような単離の核酸を含む、発現ベクターを提供する。
前記技術課題を解決するために、本発明の技術構成の第四は：前記のような発現ベクターを含み、原核細胞または真核細胞である、ホスト細胞を提供する。
前記技術課題を解決するために、本発明の技術構成の第五は：前記のような結合タンパク質の作製方法であって、前記作製方法が下記のステップを含み：前記のようなホスト細胞を培養し、培養物から前記結合タンパク質を獲得する、結合タンパク質の作製方法を提供する。
前記技術課題を解決するために、本発明の技術構成の第六は：前記のような結合タンパク質を含む、薬物組成物を提供する。
前記技術課題を解決するために、本発明の技術構成の第七は：薬カセット一及び薬カセット二を含み、前記薬カセット一が前記のような結合タンパク質または薬物組成物を含み、前記薬カセット二が癌を治療する他の抗体または薬物組成物を含む、薬キットを提供する。
前記技術課題を解決するために、本発明の技術構成の第八は：前記のような結合タンパク質または前記の薬物組成物の、癌を治療及び／または予防する薬物の作製における用途であって、前記癌は好ましく乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、腎癌、メラノーマ、肺癌、胃癌、肝臓癌、食道癌、子宮頸癌、頭頸部腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、膀胱癌、肉腫、結腸直腸癌、リンパ腫または多発性骨髄腫である、用途を提供する。
前記技術課題を解決するために、本発明の技術構成の第九は：必要な被験者に本発明技術構成の第一に記載の結合タンパク質、または技術構成の第六に記載の薬物組成物、または技術構成の第七に記載の薬キットを投与し；好ましく、癌を治療する他の抗体、例えば免疫チェックポイント抗体及び／または化学療法薬物を投与することをさらに含む、癌を治療する方法を提供する。
前記癌は好ましく乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、腎癌、メラノーマ、肺癌、胃癌、肝臓癌、食道癌、子宮頸癌、頭頸部腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、膀胱癌、肉腫、結腸直腸癌、リンパ腫または多発性骨髄腫である。
前記技術課題を解決するために、本発明の技術構成の第十は：CD3抗体を提供する。
前記CD3抗体が軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 177、191及び221に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、84及び141に示すアミノ酸配列であり；または、その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 178、197及び222に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 31、85及び142に示すアミノ酸配列であり；または、その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 177、191及び223に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 31、86及び141に示すアミノ酸配列であり；または、その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 179、198及び224に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 31、85及び142に示すアミノ酸配列である。挙げられたCDRのアミノ酸配列は、Chothia定義規則に従って示されている。好ましく、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 294に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 258に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 295に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 259に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 296に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 260に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 297に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 259に示すアミノ酸配列を含む。
または、前記CD3抗体が軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 20、68及び128に示すアミノ酸配列であり；または、その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列である。挙げられたCDRのアミノ酸配列は、Chothia定義規則に従って示されている。好ましく、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 245に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 257に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 281に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 244に示すアミノ酸配列を含む。
前記CD3抗体が軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 177、191及び221に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、84及び141に示すアミノ酸配列であり；または、その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 178、197及び222に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 31、85及び142に示すアミノ酸配列であり；または、その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 177、191及び223に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 31、86及び141に示すアミノ酸配列であり；または、その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 179、198及び224に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 31、85及び142に示すアミノ酸配列である。挙げられたCDRのアミノ酸配列は、Chothia定義規則に従って示されている。好ましく、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 294に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 258に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 295に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 259に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 296に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 260に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 297に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 259に示すアミノ酸配列を含む。
または、前記CD3抗体が軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 20、68及び128に示すアミノ酸配列であり；または、その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列である。挙げられたCDRのアミノ酸配列は、Chothia定義規則に従って示されている。好ましく、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 245に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 257に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 281に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 244に示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの具体的な実施例において、前記CD3抗体が両種のポリペプチド鎖を含み；そのなかで、第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み、第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 313に示すアミノ酸配列を含み；または、第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み、第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 325に示すアミノ酸配列を含み；または、第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み、第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 328に示すアミノ酸配列を含み；または、第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み、第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 346に示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの具体的な実施例において、前記CD3抗体が1つのポリペプチド鎖を含み、前記ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 489に示すアミノ酸配列、SEQ ID NO: 490に示すアミノ酸配列、SEQ ID NO: 491に示すアミノ酸配列、SEQ ID NO: 492に示すアミノ酸配列、または、SEQ ID NO: 493に示すアミノ酸配列を含む。
前記技術課題を解決するために、本発明の技術構成の第十一は：BCMA抗体を提供する。
前記BCMA抗体が重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、75及び133に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 24、76及び134に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 25、77及び135に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、78及び136に示すアミノ酸配列である。挙げられたCDRのアミノ酸配列は、Chothia定義規則に従って示されている。好ましく、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 248に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 249に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 250に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含む。より好ましく、前記BCMA抗体が1つのポリペプチド鎖を含み、前記ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 316に示すアミノ酸配列、SEQ ID NO: 317に示すアミノ酸配列、SEQ ID NO: 318に示すアミノ酸配列、または、SEQ ID NO: 319に示すアミノ酸配列を含む。
または、前記BCMA抗体が重鎖可変領域を含み、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、90及び136に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 34、78及び146に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、78及び147に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、90及び147に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 36、90及び146に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、76及び147に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 34、78及び148に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、76及び136に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、90及び146に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 34、76及び136に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、76及び146に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 34、76及び146に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、90及び148に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、90及び136に示すアミノ酸配列である。挙げられたCDRのアミノ酸配列は、Chothia定義規則に従って示されている。
または、前記BCMA抗体が重鎖可変領域を含み、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、90及び136に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 34、78及び146に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、78及び147に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、90及び147に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 36、90及び146に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、76及び147に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 34、78及び148に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、76及び136に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、90及び146に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 34、76及び136に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、76及び146に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 34、76及び146に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、90及び148に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、90及び136に示すアミノ酸配列である。挙げられたCDRのアミノ酸配列は、Chothia定義規則に従って示されている。
いくつかの具体的な実施例において、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 265に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 266に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 267に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 268に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 269に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 270に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 271に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 272に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 273に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 274に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 275に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 276に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 277に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 278に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 279に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 280に示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの具体的な実施例において、前記BCMA抗体が1つのポリペプチド鎖を含み、前記ポリペプチド鎖は、SEQ ID NO: 330に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 331に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 332に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 333に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 334に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 335に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 336に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 337に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 338に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 339に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 340に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 341に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 342に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 343に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 344に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 345に示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの具体的な実施例において、前記BCMA抗体が1つのポリペプチド鎖を含み、前記ポリペプチド鎖は、SEQ ID NO: 330に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 331に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 332に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 333に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 334に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 335に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 336に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 337に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 338に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 339に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 340に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 341に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 342に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 343に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 344に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 345に示すアミノ酸配列を含む。
本発明の積極的な進歩効果：
本発明は、全ヒト由来重鎖抗体及びその由来の単一ドメイン抗体を用いて構築された二価～多価の二重特異性又は多特異性結合タンパク質及びそのような結合タンパク質の作製及び使用方法を提供する。これは、従来のIgG抗体を用いて構築された二価～多価の二重特異性または多特異性結合タンパク質より多くの利点があり、特異性と結合価数の調整においてより便利であり；分子量が小さく、ポリペプチド鎖が少なく、構造がより簡単な多特異性結合タンパク質を構築することができる；また、異なる構造を利用して異なる生物学的機能を実現することができる。
本発明は、全ヒト由来重鎖抗体及びその由来の単一ドメイン抗体を用いて構築された二価～多価の二重特異性又は多特異性結合タンパク質及びそのような結合タンパク質の作製及び使用方法を提供する。これは、従来のIgG抗体を用いて構築された二価～多価の二重特異性または多特異性結合タンパク質より多くの利点があり、特異性と結合価数の調整においてより便利であり；分子量が小さく、ポリペプチド鎖が少なく、構造がより簡単な多特異性結合タンパク質を構築することができる；また、異なる構造を利用して異なる生物学的機能を実現することができる。
いくつかの具体的な実施形態では、異なる標的に対する機能活性は、異なる構造タイプ、相対位置、結合価数などのパラメータによって調節され、さらに異なる活性の組み合わせが設計され、それによって異なる臨床併用投与量の組み合わせの需要を満たす。いくつかの具体的な実施形態では、重鎖抗体VHドメインを用いて多価構造を容易に直列に形成することができ、標的との多価結合によって標的の架橋を促進することができ、標的の架橋によって誘導される生物学的機能をさらに強化することができる。いくつかの具体的な実施形態では、重鎖抗体VHドメインを用いて、従来のIgG抗体由来の構造では実現できない「1+3」などの非対称4価構造を実現することができる。
図1. 分子構造の概略図。
図2. PD-L1×CTLA4二重抗体分子のhCTLA4-Hisタンパク質と結合する結合活性。
図3. PD-L1×CTLA4二重抗体分子のCHO-K1/hCTLA4細胞と結合する結合活性。
図4. PD-L1×CTLA4二重抗体分子のHEK293/hCTLA4細胞と結合する結合活性。
図5. PD-L1×CTLA4二重抗体分子がヒトCTLA4タンパク質とそのリガンドタンパク質B7-1との結合を遮断する活性。
図6. PD-L1×CTLA4二重抗体分子がCHO-K1/hCTLA4細胞とそのリガンドタンパク質B7-1との結合を遮断する活性。
図7. PD-L1×CTLA4二重抗体分子のhPDL1-Hisタンパク質と結合する結合活性。
図8. PD-L1×CTLA4二重抗体分子のCHO-K1/hPDL1細胞と結合する結合活性。
図9. PD-L1×CTLA4二重抗体分子のヒトPD-L1を高発現するMDA-MB-231細胞と結合する結合活性。
図10. PD-L1×CTLA4二重抗体分子がCHO-K1/hPDL1細胞とそのリガンドタンパク質 PD-1との結合を遮断する活性。
図11. PD-L1×CTLA4二重抗体分子はADCC効果によってCTLA4+標的細胞を殺傷する能力。
図12. IgG-VH構造のPD-L1×CTLA4二重抗体がSEB刺激実験においてT細胞を活性化する能力。
図13. Fab-HCAb構造のPD-L1×CTLA4二重抗体がSEB刺激実験においてT細胞を活性化する能力。
図14. SEB刺激実験において、VHがIgG HCまたはLCのN端にある場合、PD-L1×CTLA4二重抗体は対応モノクローナル抗体の1:1用量の組み合わせと相当ひいてはより強いT細胞を活性化する能力を有する。
図15. SEB刺激実験において、CTLA4端の活性は、IgG_HC-VH(VHがIgG HCのC端)及びFab-HCAb構造中では、IgGまたはHCAb双価構造中と比べて弱まり、それによってその用量に係る毒性を小さくすることができる。
図16. 混合リンパ球反応実験において、VHがIgG HCまたはLCのN端にある場合、PD-L1×CTLA4二重抗体は対応モノクローナル抗体の1:1用量の組み合わせより強いT細胞を活性化する能力を有する。
図17. 混合リンパ球反応実験において、VHがIgG HCまたはLCのC端にある場合、PD-L1×CTLA4二重抗体はPD-L1モノクローナル抗体より強いT細胞を活性化する能力を有する。
図18. HER2×CTLA4二重抗体分子のCHO-K1/hCTLA4細胞と結合する結合活性。
図19. HER2×CTLA4二重抗体分子がヒトCTLA4タンパク質とそのリガンドタンパク質B7-1との結合を遮断する活性。
図20. HER2×CTLA4二重抗体分子がCHO-K1/hCTLA4細胞とそのリガンドタンパク質B7-1との結合を遮断する活性。
図21. HER2×CTLA4二重抗体分子のSK-BR-3細胞と結合する結合活性。
図22. HER2×CTLA4二重抗体分子はADCC効果によってHER2+標的細胞を殺傷する能力。
図23. HER2×CTLA4二重抗体分子がHER2+標的細胞SK-BR-3増殖を抑制する能力。
図24. HER2×CTLA4二重抗体分子が同時にCTLA4+細胞及びHER2+細胞と結合する能力。
図25. HER2×CTLA4二重抗体分子がSEB刺激実験においてT細胞を活性化する能力。
図26. HER2×CTLA4二重抗体分子のマウス体内の薬物動態学。
図27. PD-L1×4-1BB二重抗体分子のCHO-K1/hPDL1細胞と結合する結合活性。
図28. 4-1BB抗体またはPD-L1×4-1BB二重抗体分子のCHO-K1/hu4-1BB細胞と結合する結合活性。
図29. PD-L1×4-1BB二重抗体分子のCHO-K1/cyno 4-1BB細胞と結合する結合活性。
図30. PD-L1×4-1BB二重抗体分子はCHO-K1/hPDL1細胞によってT細胞特異性活性化を媒介する。
図31. PD-L1×4-1BB二重抗体分子はMDA-MB-231細胞によってT細胞特異性活性化を媒介する。
図32. 混合リンパ球反応実験において、IgG-VH構造のPD-L1×4-1BB二重抗体分子はFIT-Ig構造の二重抗体分子より強いT細胞を活性化する能力を有する。
図33. 混合リンパ球反応実験において、IgG-VH構造及びFab-HCAb構造のPD-L1×4-1BB二重抗体分子はFIT-Ig構造の二重抗体分子より強いT細胞を活性化する能力を有する。
図34. PD-L1×4-1BB二重抗体分子のマウス体内の薬物動態学。
図35. B7H4×4-1BB二重抗体分子がSK-BR-3細胞と結合する結合活性。
図36. B7H4×4-1BB二重抗体分子のCHO-K1/hu4-1BB細胞と結合する結合活性。
図37. B7H4×4-1BB二重抗体分子はSK-BR-3T細胞によって特異性活性化を媒介する(INFγ放出)。
図38. B7H4×4-1BB二重抗体分子はSK-BR-3T細胞によって特異性活性化を媒介する(IL-2放出)。
図39. B7H4×4-1BB二重抗体分子のT細胞に対する活性化は特異的にB7H4の発現を依存する。
図40. B7H4×4-1BB二重抗体分子PR003334の血清安定性。
図41. B7H4×4-1BB二重抗体分子PR003335の血清安定性。
図42. B7H4×4-1BB二重抗体分子のマウス体内の薬物動態学。
図43. B7H4×4-1BB二重抗体分子のマウス腫瘍模型における抗腫瘍効果。
図44. BCMA HCAb抗体がHEK293T/hBCMA細胞と結合する結合活性。
図45. BCMA HCAb抗体がHEK293T/cynoBCMA細胞と結合する結合活性。
図46. BCMA HCAb抗体がNCI-H929細胞と結合する結合活性。
図47. BCMA HCAb抗体のHEK293T/hBCMA細胞に対する内在化能力。
図48. BCMA HCAb抗体がヒトBCMAと結合する親和性(BLI方法)。
図49. BCMA HCAb抗体PR001046由来の変異体分子がNCI-H929細胞と結合する結合活性。
図50. BCMA×CD3二重抗体分子のHEK293T/hBCMA細胞と結合する結合活性。
図51. BCMA×CD3二重抗体分子のHEK293T/cynoBCMA細胞と結合する結合活性。
図52. BCMA×CD3二重抗体分子のNCI-H929細胞と結合する結合活性。
図53. BCMA×CD3二重抗体分子がヒトT細胞と結合する結合活性。
図54. BCMA×CD3二重抗体分子がカニクイザルT細胞と結合する結合活性。
図55. scFv-Fc-VH(2)非対称構造のBCMA×CD3二重抗体分子のNCI-H929細胞を殺傷する能力。
図56. scFv-Fc-VH(1)非対称構造のBCMA×CD3二重抗体分子のNCI-H929細胞を殺傷する能力。
図57. Fab-Fc-VH(1)非対称構造のBCMA×CD3二重抗体分子のNCI-H929細胞を殺傷する能力。
図58. Fab-Fc-VH(2)非対称構造のBCMA×CD3二重抗体分子のNCI-H929細胞を殺傷する能力。
図59. BCMA×CD3二重抗体分子(PR001990, PR002309)はエフェクター細胞のNCI-H929細胞に対する特異性殺傷及びサイトカイン放出検出を媒介する。
図60. BCMA×CD3二重抗体分子(PR002895, PR002953, PR003178)はエフェクター細胞のNCI-H929細胞に対する特異性殺傷及びサイトカイン放出検出を媒介する。
図61. 可溶性APRILまたはBAFFのBCMA×CD3二重抗体分子が標的細胞を殺傷する効果に対する影響。
図62. 可溶性BCMAのBCMA×CD3二重抗体分子が標的細胞を殺傷する効果に対する影響。
図63. BCMA×CD3二重抗体分子のマウスまたはラット体内の薬物動態学。
図64. BCMA×CD3二重抗体分子のマウス腫瘍模型における抗腫瘍効果。
図65. 二重抗体分子が瞬時トランスフェクション発現及び一段階親和精製を経て得られたタンパク質サンプルのSDS-PAGE及びSEC-HPLCの分析結果。
図66. CD3抗体がヒトT細胞と結合する結合活性。
図67. PD-L1×CTLA4二重抗体分子のマウス腫瘍模型における抗腫瘍効果。
図2. PD-L1×CTLA4二重抗体分子のhCTLA4-Hisタンパク質と結合する結合活性。
図3. PD-L1×CTLA4二重抗体分子のCHO-K1/hCTLA4細胞と結合する結合活性。
図4. PD-L1×CTLA4二重抗体分子のHEK293/hCTLA4細胞と結合する結合活性。
図5. PD-L1×CTLA4二重抗体分子がヒトCTLA4タンパク質とそのリガンドタンパク質B7-1との結合を遮断する活性。
図6. PD-L1×CTLA4二重抗体分子がCHO-K1/hCTLA4細胞とそのリガンドタンパク質B7-1との結合を遮断する活性。
図7. PD-L1×CTLA4二重抗体分子のhPDL1-Hisタンパク質と結合する結合活性。
図8. PD-L1×CTLA4二重抗体分子のCHO-K1/hPDL1細胞と結合する結合活性。
図9. PD-L1×CTLA4二重抗体分子のヒトPD-L1を高発現するMDA-MB-231細胞と結合する結合活性。
図10. PD-L1×CTLA4二重抗体分子がCHO-K1/hPDL1細胞とそのリガンドタンパク質 PD-1との結合を遮断する活性。
図11. PD-L1×CTLA4二重抗体分子はADCC効果によってCTLA4+標的細胞を殺傷する能力。
図12. IgG-VH構造のPD-L1×CTLA4二重抗体がSEB刺激実験においてT細胞を活性化する能力。
図13. Fab-HCAb構造のPD-L1×CTLA4二重抗体がSEB刺激実験においてT細胞を活性化する能力。
図14. SEB刺激実験において、VHがIgG HCまたはLCのN端にある場合、PD-L1×CTLA4二重抗体は対応モノクローナル抗体の1:1用量の組み合わせと相当ひいてはより強いT細胞を活性化する能力を有する。
図15. SEB刺激実験において、CTLA4端の活性は、IgG_HC-VH(VHがIgG HCのC端)及びFab-HCAb構造中では、IgGまたはHCAb双価構造中と比べて弱まり、それによってその用量に係る毒性を小さくすることができる。
図16. 混合リンパ球反応実験において、VHがIgG HCまたはLCのN端にある場合、PD-L1×CTLA4二重抗体は対応モノクローナル抗体の1:1用量の組み合わせより強いT細胞を活性化する能力を有する。
図17. 混合リンパ球反応実験において、VHがIgG HCまたはLCのC端にある場合、PD-L1×CTLA4二重抗体はPD-L1モノクローナル抗体より強いT細胞を活性化する能力を有する。
図18. HER2×CTLA4二重抗体分子のCHO-K1/hCTLA4細胞と結合する結合活性。
図19. HER2×CTLA4二重抗体分子がヒトCTLA4タンパク質とそのリガンドタンパク質B7-1との結合を遮断する活性。
図20. HER2×CTLA4二重抗体分子がCHO-K1/hCTLA4細胞とそのリガンドタンパク質B7-1との結合を遮断する活性。
図21. HER2×CTLA4二重抗体分子のSK-BR-3細胞と結合する結合活性。
図22. HER2×CTLA4二重抗体分子はADCC効果によってHER2+標的細胞を殺傷する能力。
図23. HER2×CTLA4二重抗体分子がHER2+標的細胞SK-BR-3増殖を抑制する能力。
図24. HER2×CTLA4二重抗体分子が同時にCTLA4+細胞及びHER2+細胞と結合する能力。
図25. HER2×CTLA4二重抗体分子がSEB刺激実験においてT細胞を活性化する能力。
図26. HER2×CTLA4二重抗体分子のマウス体内の薬物動態学。
図27. PD-L1×4-1BB二重抗体分子のCHO-K1/hPDL1細胞と結合する結合活性。
図28. 4-1BB抗体またはPD-L1×4-1BB二重抗体分子のCHO-K1/hu4-1BB細胞と結合する結合活性。
図29. PD-L1×4-1BB二重抗体分子のCHO-K1/cyno 4-1BB細胞と結合する結合活性。
図30. PD-L1×4-1BB二重抗体分子はCHO-K1/hPDL1細胞によってT細胞特異性活性化を媒介する。
図31. PD-L1×4-1BB二重抗体分子はMDA-MB-231細胞によってT細胞特異性活性化を媒介する。
図32. 混合リンパ球反応実験において、IgG-VH構造のPD-L1×4-1BB二重抗体分子はFIT-Ig構造の二重抗体分子より強いT細胞を活性化する能力を有する。
図33. 混合リンパ球反応実験において、IgG-VH構造及びFab-HCAb構造のPD-L1×4-1BB二重抗体分子はFIT-Ig構造の二重抗体分子より強いT細胞を活性化する能力を有する。
図34. PD-L1×4-1BB二重抗体分子のマウス体内の薬物動態学。
図35. B7H4×4-1BB二重抗体分子がSK-BR-3細胞と結合する結合活性。
図36. B7H4×4-1BB二重抗体分子のCHO-K1/hu4-1BB細胞と結合する結合活性。
図37. B7H4×4-1BB二重抗体分子はSK-BR-3T細胞によって特異性活性化を媒介する(INFγ放出)。
図38. B7H4×4-1BB二重抗体分子はSK-BR-3T細胞によって特異性活性化を媒介する(IL-2放出)。
図39. B7H4×4-1BB二重抗体分子のT細胞に対する活性化は特異的にB7H4の発現を依存する。
図40. B7H4×4-1BB二重抗体分子PR003334の血清安定性。
図41. B7H4×4-1BB二重抗体分子PR003335の血清安定性。
図42. B7H4×4-1BB二重抗体分子のマウス体内の薬物動態学。
図43. B7H4×4-1BB二重抗体分子のマウス腫瘍模型における抗腫瘍効果。
図44. BCMA HCAb抗体がHEK293T/hBCMA細胞と結合する結合活性。
図45. BCMA HCAb抗体がHEK293T/cynoBCMA細胞と結合する結合活性。
図46. BCMA HCAb抗体がNCI-H929細胞と結合する結合活性。
図47. BCMA HCAb抗体のHEK293T/hBCMA細胞に対する内在化能力。
図48. BCMA HCAb抗体がヒトBCMAと結合する親和性(BLI方法)。
図49. BCMA HCAb抗体PR001046由来の変異体分子がNCI-H929細胞と結合する結合活性。
図50. BCMA×CD3二重抗体分子のHEK293T/hBCMA細胞と結合する結合活性。
図51. BCMA×CD3二重抗体分子のHEK293T/cynoBCMA細胞と結合する結合活性。
図52. BCMA×CD3二重抗体分子のNCI-H929細胞と結合する結合活性。
図53. BCMA×CD3二重抗体分子がヒトT細胞と結合する結合活性。
図54. BCMA×CD3二重抗体分子がカニクイザルT細胞と結合する結合活性。
図55. scFv-Fc-VH(2)非対称構造のBCMA×CD3二重抗体分子のNCI-H929細胞を殺傷する能力。
図56. scFv-Fc-VH(1)非対称構造のBCMA×CD3二重抗体分子のNCI-H929細胞を殺傷する能力。
図57. Fab-Fc-VH(1)非対称構造のBCMA×CD3二重抗体分子のNCI-H929細胞を殺傷する能力。
図58. Fab-Fc-VH(2)非対称構造のBCMA×CD3二重抗体分子のNCI-H929細胞を殺傷する能力。
図59. BCMA×CD3二重抗体分子(PR001990, PR002309)はエフェクター細胞のNCI-H929細胞に対する特異性殺傷及びサイトカイン放出検出を媒介する。
図60. BCMA×CD3二重抗体分子(PR002895, PR002953, PR003178)はエフェクター細胞のNCI-H929細胞に対する特異性殺傷及びサイトカイン放出検出を媒介する。
図61. 可溶性APRILまたはBAFFのBCMA×CD3二重抗体分子が標的細胞を殺傷する効果に対する影響。
図62. 可溶性BCMAのBCMA×CD3二重抗体分子が標的細胞を殺傷する効果に対する影響。
図63. BCMA×CD3二重抗体分子のマウスまたはラット体内の薬物動態学。
図64. BCMA×CD3二重抗体分子のマウス腫瘍模型における抗腫瘍効果。
図65. 二重抗体分子が瞬時トランスフェクション発現及び一段階親和精製を経て得られたタンパク質サンプルのSDS-PAGE及びSEC-HPLCの分析結果。
図66. CD3抗体がヒトT細胞と結合する結合活性。
図67. PD-L1×CTLA4二重抗体分子のマウス腫瘍模型における抗腫瘍効果。
以下、本願発明の実施例を特定の具体的な実施形態により説明し、この技術に詳しい人は、本願に開示されている内容から本願発明の他の利点及び効果を容易に理解することができる。
本願において、「抗体」または「H2L2」という用語は、一般に、従来の四鎖抗体を指す。ほとんどの生物種における抗体は、2つの完全に同じ重鎖(H鎖)と2つの完全に同じ軽鎖(L鎖)を含む「Y」型の四量体構造を示し、「H2L2」とも呼ばれる。重鎖は、N端に近い重鎖可変領域(VH)とC端に近い重鎖定常領域(CH)とを含み；軽鎖は、N端に近い軽鎖可変領域(VL)とC端に近い軽鎖定常領域(CL)が含まれる。IgG抗体の重鎖定常領域は、3つのドメインがあり、それぞれCH1、CH2、CH3である。CH1とCH2の間にはヒンジ領域(hinge)もある。軽鎖は、κとλの違いにより、その軽鎖可変領域はさらにVκとVλに分けられ，これに対応する軽鎖定常領域は、それぞれCκとCλに分ける。抗体の可変領域は、その抗原を認識し結合する主要部位であり；抗体の可変領域ドメインVH及びVL並びに定常領域ドメインCH1及びCLは、ともに抗原結合フラグメント(Fab)を構成する。CH2とCH3は、結晶性フラグメント(Fc)を構成し、補体依存の細胞毒作用(CDC)や抗体依存の細胞媒介の細胞毒作用(ADCC)などの抗体の効果機能を発揮し、抗体の血清半減期に影響を与える主要な領域である。
本願において、用語「重鎖抗体」または「HCAb」は、一般に、重鎖二量体のみを含む抗体のクラスを指す。ラクダ科及びサメ科動物の血清には、軽鎖を欠いた重鎖抗体(heavy-chain antibody、HCAb)が天然に存在する。ラクダ科由来の重鎖抗体は、従来のH2L2抗体と比較して、軽鎖が不足しているほか、その重鎖可変領域とヒンジ領域の間にCH1領域がなく、1つの重鎖可変領域(VHH)と2つの重鎖定常ドメイン(CH2とCH3)だけを含んでいる；その基本構造は、重鎖二量体である。ラクダ科動物の重鎖抗体のVHHフラグメントは、従来の抗体のVH特徴と異なり、単独でクローンして発現されるVHH構造は元の重鎖抗体に相当する構造安定性及び抗原との結合活性を有し、分子量は約13Kdaしかないため、ナノ抗体または単一ドメイン抗体とも呼ばれる。
本願において、「結合タンパク質」または「抗原結合タンパク質」という用語は、一般に、抗原を結合する部分を含むタンパク質を指し、任意に抗原を結合する部分が抗原結合タンパク質と抗原結合を促進する立体構造の足場または骨格部分を使用することを可能にする。典型的には、抗体軽鎖可変領域(VL)、抗体重鎖可変領域(VH)、またはこれらの両方を含むことができる。VH及びVL領域は、フレーム領域(FR)と呼ばれるより保守的な領域に点在する相補決定領域(CDR)と呼ばれる高可変領域にさらに区別されることができる。各VH及びVLは、アミノ末端からカルボキシル末端まで、FR‐1、CDR1、FR‐2、CDR2、FR‐3、CDR3及びFR‐4の3つのCDR及び4つのFR領域から構成されてもよい。重鎖と軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。VHの3つのCDRは、それぞれHCDR1、HCDR2、HCDR3と表され、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3と表されてもよい。VLの3つのCDRは、それぞれLCDR1、LCDR2、LCDR3と表示され、VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3と表示されてもよい。抗原結合タンパク質の例としては、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体、抗原結合フラグメント(Fab、Fab’、F(ab)2、Fvフラグメント、F(ab’)2、scFv、di‐scFv及び／またはdAb)、免疫複合体、多特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、抗体フラグメント、抗体誘導体、抗体類似体、または融合タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。
本願では、CDRのアミノ酸配列はすべてChothia定義規則に従って示されている。しかし、当業者には、配列可変性に基づくKabat定義規則(Kabatら、免疫学的タンパク質配列、第5版、米国国立衛生研究院、ベセスダ、メリーランド州(1991)を参照)、及び構造環領域位置に基づくChothia定義規則(Jmol Biol 273：927-48，1997を参照)などの本分野における様々な方法で抗体のCDRを定義することができる。本発明の態様では、可変ドメイン配列中のアミノ酸残基を決定するために、Kabat定義とChothia定義を含むCombined定義規則を使用することもできる。そのなかで、Combined定義規則は、Kabat定義とChothia定義の範囲を組み合わせたものであり、これに基づいてより広い範囲をとりました。詳細は下表を参照してください。当業者は、特に規定がない限り、用語所定の抗体またはその領域(例えば可変領域)の「CDR」及び「相補決定領域」は、本発明によって説明された上述の既知の態様のいずれかによって規定された相補決定領域を包含するものと理解すべきである。本発明の保護範囲は、Chothia定義規則に基づいて示される配列であるが、他のCDRの定義規則に従って対応するアミノ酸配列も本発明の保護範囲に含まれるべきである。
ここで、Laa‐Lbbは、抗体軽鎖のN末端から、第aa位(Chothiaコード規則)から第bb位(Chothiaコード規則)までのアミノ酸配列を指すことができ；Haa‐Hbbは、抗体重鎖のN末端から、第aa位(Chothiaコード規則)から第bb位(Chothiaコード規則)までのアミノ酸配列を指すことができる。例えば、L24‐L34は、Chothiaコード規則に従って抗体軽鎖N末端から24位から34位までのアミノ酸配列を指すことができ、H26‐H32は、Chothiaコード規則に従って、抗体重鎖N末端から26位から32位までのアミノ酸配列を指すことができる。当業者は、ChothiaでCDRをコードする際に、位置によっては位置が挿入されることを認識すべきである(http://bioinf.org.uk/abs/)。
本願において、「モノクローナル抗体」という用語は、一般に、存在する可能性のある少量の自然変異を除いて、クラスタ内の個々の抗体が同じである、実質的に同質な抗体の集団から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は、一般に、単一抗原部位に対して高度な特異性を有する。また、従来のポリクローナル抗体製剤(通常は異なる決定クラスタに対する異なる抗体を有する)と異なり、各モノクロナル抗体は抗原上の単一決定クラスタに対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体の利点は、他の免疫グロブリンに汚染されずにハイブリドーマ培養により合成できることである。修飾語「モノクローナル」は、実質的に同質な抗体集団から得られる抗体の特徴を表し、且つ任意の特定の方法で抗体を生成する必要があるとは解釈されない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞中で作製することができ、または組換えDNA法によって作製することができる。
本願において、用語「全ヒト由来抗体」は、一般に、ヒトが抗体をコードする遺伝子を遺伝子工学的に改変された抗体遺伝子欠損動物に全て移し、動物に発現させる抗体を指す。抗体のすべての部分(抗体の可変領域と定常領域を含む)は、ヒト由来の遺伝子によってコードされる。全ヒト由来抗体は、異種抗体による人体への免疫副反応を大幅に減少させることができる。本分野で全ヒト由来抗体を得る方法としては、ファージディスプレイ技術、トランスジェニックマウス技術などがある。
本願において、「全ヒト由来重鎖抗体」という用語は、一般に、Harbour HCAbトランスジェニックマウス(特許出願WO2007/096779)を用いて得られた、ヒト由来抗体可変領域VHを有する重鎖抗体を指す。このトランスジェニックマウスの内因性抗体重鎖遺伝子座と軽鎖遺伝子座は、いずれもノックアウトまたは不活性化され、マウスの抗体を産生できないようにし；次いで、ヒト由来の抗体重鎖遺伝子フラグメント(V、D、Jフラグメント)をマウスに転入し、マウス自身の組み換えと突然変異機構を用いてヒト由来抗体遺伝子配列を有する抗体を産生し、その可変領域はヒト由来VHである。このヒト由来VHとヒト由来の重鎖定常領域Fcとを融合再編することにより、全ヒト由来重鎖抗体が得られる。
本願において、「特異性結合」という用語は、一般に、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープと結合することを意味し、且つ当該結合には抗原結合ドメインとエピトープとの間のいくつかの相補性が必要である。この定義によれば、抗体はランダム且つ関連性ないエピトープよりその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合しやすい場合、抗体は「特異的に当該抗原と結合する」と呼ばれる。「エピトープ」とは、抗原における抗原結合タンパク質(例えば、抗体)と結合する特定の原子基(例えば、糖側鎖、ホスホニル、スルホニル)またはアミノ酸を意味する。
本願において、「Fab」という用語は、一般に、抗体の重鎖可変領域VH、軽鎖可変領域VL及び重鎖定常領域ドメインCH1及び軽鎖定常領域CLを含む、従来の抗体(例えばIgG)中の抗原と結合する部分を指す。従来の抗体では、VHのC端はCH1のN端に結合して重鎖Fdフラグメントを形成し、VLのC端はCLのN端に結合して軽鎖を形成し、CH1のC端はさらに重鎖のヒンジ領域と他の定常領域ドメインに結合して重鎖を形成する。いくつかの実施形態では、「Fab」は、またFabの変異体構造を指す。例えば、いくつかの実施形態では、VHのC端とCLのN端が結合して1つのポリペプチド鎖を形成し、VLのC端とCH1のN端が結合して別のポリペプチド鎖を形成し、Fab(cross VH／VL)の構造を形成する；いくつかの実施形態では、FabのCH1はヒンジ領域に結合されず、CLのC端が重鎖のヒンジ領域に結合され、Fab(cross Fd／LC)の構造を形成する。
本願において、「VH」という用語は、一般に、抗体の重鎖可変領域VHドメイン、すなわちヒトまたは他の動物の従来の抗体(H2L2構造)の重鎖可変領域VHであってもよく、ラクダ科などの動物の重鎖抗体(HCAb構造)の重鎖可変領域VHHであってもよく、Harbour HCAbトランスジェニックマウスを用いて産生された全ヒト由来重鎖抗体(HCAb構造)の重鎖可変領域VHであってもよい。
本願において、用語「結合ドメイン」(binding moieties)は、一般に、抗原に特異的に結合することができる任意のタンパク質機能領域を指し、「Fab」であってもよく、「VH」であってもよく、他の抗原結合形態(例えば、脂質キャリアタンパク質(lipocalins)、神経細胞接着分子(NCAM)、繊維結合タンパク質(fibronectin)、アンカータンパク質重複フラグメントタンパク質(DARPins)などの誘導体タンパク質構造)であってもよい。
本願において、用語「結合価数」は、一般に、結合タンパク質中の「結合ドメイン」の数を指し、すなわち結合タンパク質が結合可能な抗原分子またはエピトープの最大数を指し、例えば、従来のIgG抗体は2つの同じ抗原分子と同時に結合することができ、その結合価数は2である；また、Fab抗体の結合価数は1である。
本願において、用語「二重特異性結合タンパク質」は、一般に、2つの抗原結合特異性を有する結合タンパク質を指す。2つの抗原結合特異性は、2つの異なる抗原を結合するか、または同種抗原を結合する2つの異なるエピトープであり得る。二重特異性結合タンパク質は、典型的には二重特異性抗体及びその誘導体などを含むことができる。
本願において、用語「多特異性結合タンパク質」は、一般に、2つ以上の抗原結合特異性を有する結合タンパク質を指す。多特異性結合タンパク質は、典型的には、多特異性抗体及びその誘導体などを含むことができる。
本願において、用語「MFI」(Mean Fluorescent Intensity)は、一般的に、フローセル法FACSにおいて分析された蛍光強度信号及びその数学的平均値を指し、一般にフローセル法によって生成されたデータを専門ソフトウェア例えばFlowJo(FlowJo、LLC)等を用いて処理及び分析することで得ることができる。
本願において、用語「PD‐L1」は、一般に、プログラム的死リガンド1タンパク質、その機能的変異体、及び／またはその機能的フラグメントを指す。PD‐L1は、分化クラスター274(CD274)またはB7アイソトープ1(B7‐H1)とも呼ばれ、(ヒトにおける)CD274遺伝子によってコードされるタンパク質である。PD‐L1配列は、当技術分野で知られている。例えば、例示的な全長ヒトPD‐L1タンパク質のアミノ酸配列は、NCBI登録番号NP_054862またはUniProt登録番号Q9NZQ7で見つかり；例示的な全長カニクイザルのPD‐L1タンパク質配列は、NCBI登録番号XP_005581836またはUniprot登録番号G7PSE7で見つかる。
本願において、用語「PD‐1」は、一般に、プログラム的死亡1受容体(CD279とも呼ばれる)、その機能的変異体、及び／またはその機能的フラグメントを指す。PD‐1配列は当技術分野で知られている。例えば、例示的な全長ヒトPD‐1のタンパク質配列は、NCBI登録番号NP_005009で見つかり；例示的な全長カニクイザルのPD‐1タンパク質配列は、NCBI登録番号NP_001271065またはUniprot登録番号B0LAJ3で見つかる。
本願において、用語「CD80」は、一般に、分化クラスタータンパク質80(B7‐1とも呼ばれる)、その機能的変異体、及び／またはその機能的フラグメントを指す。CD80配列は、当技術分野で知られている。例えば、例示的な全長ヒトのCD80配列は、Uniprot登録番号P33681で見つかることができる。
本願において、用語「CTLA4」は、一般に、細胞毒性Tリンパ球関連タンパク質‐4(CD152とも呼ばれる)、その機能変異体、及び／またはその機能フラグメントを指す。CTLA4配列は当技術分野で知られている。例えば、例示的な全長ヒトCTLA4配列は、Uniprot登録番号P16410で見つかることができ、例示的な全長カニクイザルCTLA4配列は、Uniprot登録番号G7PL88で見つかることができる。
本願において、「HER2」という用語は、一般に、アクセプタチロシンキナーゼerbB‐2(ERBB2とも呼ばれる)、その機能的変異体、及び／またはその機能的フラグメントを指す。HER2配列は当技術分野で知られている。例えば、例示的な全長人HER2配列は、Uniprot登録番号P04626で見つかることができ、例示的な全長カニクイザルHER2配列は、NCBI登録番号XP_005584091で見つかることができる。
本願において、用語「B7H4」は、一般に、V‐SetドメインT細胞活性化阻害因子1(VTCN1とも呼ばれる)、その機能変異体、及び／またはその機能フラグメントを含むことを意味する。B7H4配列は当技術分野で知られている。例えば、例示的な全長ヒトB7H4配列は、Uniprot登録番号Q7Z7D3で見つかることができ、例示的な全長カニクイザルB7H4配列は、NCBI登録番号XP_005542249で見つかることができ；例示的な全長マウスB7H4配列は、Uniprot登録番号Q7TSP5で見つかることができる。
本願において、用語「4‐1BB」は、一般に、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー9(CD137、4‐1BBL受容体とも呼ばれる)、その機能変異体、及び／またはその機能フラグメントを指す。4‐1BB配列は当技術分野で知られている。例えば、例示的な全長ヒト4‐1BB配列は、Uniprot登録番号Q07011で見つかることができ、例示的な全長カニクイザル4‐1BB配列は、NCBI登録番号XP_005544945で見つかることができる。
本願において、「BCMA」という用語は、一般に、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー17(CD269、B細胞成熟タンパク質とも呼ばれる)、その機能変異体、及び／またはその機能フラグメントを指す。BCMA配列は当技術分野で知られている。例えば、例示的な全長ヒトBCMA配列は、Uniprot登録番号Q02223で見つかることができ、例示的な全長カニクイザルBCMA配列は、NCBI登録番号XP_005591343で見つかることができる。
本願において、「BAFF」という用語は、一般に、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー13B(CD257、B細胞活性化因子とも呼ばれる)、その機能変異体、及び／またはその機能フラグメントを指す。BAFF配列は当技術分野で知られている。例えば、例示的な全長ヒトBAFF配列は、Uniprot登録番号Q9Y275で見つかることができる。
本願において、用語「APRIL」は、一般に、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー13(CD256、増殖誘導リガンドとも呼ばれる)、その機能変異体、及び／またはその機能フラグメントを指す。APRIL配列は当技術分野で知られている。例えば、例示的な全長ヒトAPRIL配列は、Uniprot登録番号O75888で見つかることができる。
本願において、用語「CD3」は、一般に、T細胞上のTCR／CD3受容体タンパク質複合体を指す。T細胞応答の特異性は、TCRとCD3の分子複合体のpMHCに対する識別によって媒介される。TCRは、2つの異なる膜貫通ポリペプチド鎖からなるヘテロ二量体であり、ペプチド鎖はα、β、γ、δの4種類であり、ペプチド鎖の組み合わせによってTCRはTCRαβ及びTCRγδに分類される。CD3には、異なる膜貫通ポリペプチド鎖、すなわちγ、δ、ε、ζがあり、これらのペプチド鎖が相互作用して、TCR‐CD3複合体の一部として、ホモ二量体またはヘテロ二量体を形成する。TCRペプチド鎖の細胞質領域は短いため、TCRの抗原識別による活性化信号はCD3ペプチド鎖によりT細胞内に転送されると考えられている。
本願において、用語「CD3E」は、一般的に、「CD3」のεペプチド鎖を指す。CD3E配列は当技術分野で知られている。例えば、例示的な全長ヒトCD3E配列は、Uniprot登録番号P07766で見つかることができ、例示的な全長カニクイザルCD3E配列は、Uniprot登録番号Q95LI5で見つかることができる。
実施例
以下、実施例の形態により本発明をさらに説明するが、本発明を当該実施例の範囲に限定するものではない。実施例は、ベクター及びプラスミドを構築するための方法、タンパク質をコードする遺伝子をベクター及びプラスミドに挿入する方法、又はプラスミドを宿主細胞に導入する方法など、従来の方法の詳細な説明を含まない。このような方法は、当業者にとって周知であり、多くの出版物に記載されている。以下の実施例に具体的な条件が明記されていない実験方法は、従来の方法と条件に従って、または商品説明書に従って選択する。
以下、実施例の形態により本発明をさらに説明するが、本発明を当該実施例の範囲に限定するものではない。実施例は、ベクター及びプラスミドを構築するための方法、タンパク質をコードする遺伝子をベクター及びプラスミドに挿入する方法、又はプラスミドを宿主細胞に導入する方法など、従来の方法の詳細な説明を含まない。このような方法は、当業者にとって周知であり、多くの出版物に記載されている。以下の実施例に具体的な条件が明記されていない実験方法は、従来の方法と条件に従って、または商品説明書に従って選択する。
実施例1．HCAbに基づく多特異性結合タンパク質の構造設計
本実施例は、全ヒト由来重鎖抗体(HCAb)及びその由来の単一ドメイン抗体(sdAb)を用いて構築され、Fcを含有し、対称又は非対称であり、多価及び多特異性結合タンパク質の構造をいくつか挙げた。いくつかの構造では、ドメインとドメインとの間に接続ペプチドを用いて結合する。いくつかの構造では、重鎖Fc領域には、Fc受容体との結合を調整し、さらに関連する効果機能または他の性能を調整するためにアミノ酸突然変異が導入される。いくつかの構造では、2つの重鎖のFc領域はそれぞれ異なるアミノ酸突然変異を導入して、重鎖ホモ二量化の形成を減少させる。
本実施例は、全ヒト由来重鎖抗体(HCAb)及びその由来の単一ドメイン抗体(sdAb)を用いて構築され、Fcを含有し、対称又は非対称であり、多価及び多特異性結合タンパク質の構造をいくつか挙げた。いくつかの構造では、ドメインとドメインとの間に接続ペプチドを用いて結合する。いくつかの構造では、重鎖Fc領域には、Fc受容体との結合を調整し、さらに関連する効果機能または他の性能を調整するためにアミノ酸突然変異が導入される。いくつかの構造では、2つの重鎖のFc領域はそれぞれ異なるアミノ酸突然変異を導入して、重鎖ホモ二量化の形成を減少させる。
表1‐1及び図1は、本発明の出願に含まれる多特異性結合タンパク質の分子構造を示し、各構造は以下にさらに説明される。本実施例及び本発明の他の部分では、分子構造に含まれるポリペプチド鎖の数に言及するとき、一般に「異なるポリペプチド鎖」の数を指し；例えば、従来のIgG抗体には2つの異なるポリペプチド鎖、すなわち重鎖と軽鎖があり、IgG抗体分子自体は2つの同じ重鎖と2つの同じ軽鎖を含むテトラペプチド鎖タンパク質分子であるが、その構造的特徴を説明する際には特に2つの異なるポリペプチド鎖を指す。結合価数とは、当該分子構造中の抗原結合部位の数を指し、例えば、従来のIgG抗体は2つの同じ抗原分子と同時に結合することができ、その結合価数は2である。表1‐2は、本発明の出願の構造設計において使用され得る接続ペプチド配列を示す。
実施例1.1. Fab-HCAb対称構造
本発明は、2種類の親モノクローナル抗体を用いて二重特異性結合タンパク質を構築する方法を提供する：第1抗原を結合する従来の抗体Aと第2抗原を結合する重鎖抗体B。
本発明は、2種類の親モノクローナル抗体を用いて二重特異性結合タンパク質を構築する方法を提供する：第1抗原を結合する従来の抗体Aと第2抗原を結合する重鎖抗体B。
図1(1-2)に示すように、Fab末端は従来の抗体Aに由来し、VH_AとVL_Aはそれぞれ抗体Aの重鎖可変領域と軽鎖可変領域である。VH端が重鎖抗体Bに由来し、VH_Bは重鎖抗体Bの重鎖可変領域である。CLは軽鎖定常領域ドメインである。CH1、CH2及びCH3はそれぞれ重鎖定常領域の第一、第二及び第三ドメインである。L1及びL2はそれぞれ第一及び第二接続ペプチドである。
実施例1.1.1. 構造(1): Fab(CL)-VH-Fc
構造(1)の結合タンパク質は両本の異なるポリペプチド鎖を含み：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、短鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CH1を含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、長鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CL-L1-VH_B-L2-CH2-CH3を含む。構造(1)において、抗体AのVL_A及び重鎖抗体BのVH_Bが同じ一つのポリペプチド鎖に融合し、それによってVL_A及びVH_Bの会合で発生するミスマッチ副生成物を回避することができる。
構造(1)の結合タンパク質は両本の異なるポリペプチド鎖を含み：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、短鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CH1を含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、長鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CL-L1-VH_B-L2-CH2-CH3を含む。構造(1)において、抗体AのVL_A及び重鎖抗体BのVH_Bが同じ一つのポリペプチド鎖に融合し、それによってVL_A及びVH_Bの会合で発生するミスマッチ副生成物を回避することができる。
ポリペプチド鎖2のVH_Bは接続ペプチドL2を介してCH2に結合し；L2はIgGのヒンジ領域またはヒンジ領域由来の接続ペプチド配列またはは表1-2に挙げられた配列であってもよく、好ましくヒトIgG1ヒンジまたはヒトIgG1ヒンジ(C220S)またはG5-LHの配列である。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖2のCLとVH_Bは直接的に融合し結合して、すなわちL1の長さは0である。他の1つの実施形態において、ポリペプチド鎖2のCLは接続ペプチドL1を介してVH_Bに結合し；L1は表1-2に挙げられた配列である。
実施例1.1.2．構造(2): Fab(CH1)-VH-Fc
構造(2)の結合タンパク質は両本の異なるポリペプチド鎖を含み：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、短鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CLを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、長鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CH1-L1-VH_B-L2-CH2-CH3を含む。
構造(2)の結合タンパク質は両本の異なるポリペプチド鎖を含み：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、短鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CLを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、長鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CH1-L1-VH_B-L2-CH2-CH3を含む。
ポリペプチド鎖2のVH_Bは接続ペプチドL2を介してCH2に結合し；L2はIgGのヒンジ領域またはヒンジ領域由来の接続ペプチド配列またはは表1-2に挙げられた配列であってもよく、好ましくヒトIgG1ヒンジまたはヒトIgG1ヒンジ(C220S)またはG5-LHの配列である。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖2のCH1とVH_Bは直接的に融合し結合して、すなわちL1の長さは0である。他の1つの実施形態において、ポリペプチド鎖2のCH1は接続ペプチドL1を介してVH_Bに結合し；L1は表1-2に挙げられた配列である。
実施例1.2．IgG-VH四価対称構造
本発明は、2種類の親モノクローナル抗体を用いて二重特異性結合タンパク質を構築する方法を提供する：第1抗原を結合する従来の抗体Aと第2抗原を結合する重鎖抗体B。
本発明は、2種類の親モノクローナル抗体を用いて二重特異性結合タンパク質を構築する方法を提供する：第1抗原を結合する従来の抗体Aと第2抗原を結合する重鎖抗体B。
図1(3-6)に示すように、Fab末端は従来の抗体Aに由来し、VH_AとVL_Aはそれぞれ抗体Aの重鎖可変領域と軽鎖可変領域である。VH端が重鎖抗体Bに由来し、VH_Bは重鎖抗体Bの重鎖可変領域である。CLは軽鎖定常領域ドメインである。CH1、CH2及びCH3はそれぞれ重鎖定常領域の第一、第二及び第三ドメインである。Lは接続ペプチドであり、hはIgG抗体のヒンジ領域または誘導配列である。
実施例1.2.1．構造(3): VH-IgG_HC
構造(3)の結合タンパク質は両本の異なるポリペプチド鎖を含み：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、短鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CLを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、長鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_B-L-VH_A-CH1-h-CH2-CH3を含む。
構造(3)の結合タンパク質は両本の異なるポリペプチド鎖を含み：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、短鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CLを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、長鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_B-L-VH_A-CH1-h-CH2-CH3を含む。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖2のVH_BとVH_Aは直接的に融合し結合して、すなわちLの長さは0である。他の1つの実施形態において、ポリペプチド鎖2のVH_Bは接続ペプチドLを介してVH_Aに結合し；Lは表1-2に挙げられた配列である。
実施例1.2.2．構造(4): VH-IgG_LC
構造(4)の結合タンパク質は両本の異なるポリペプチド鎖を含み：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、短鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_B-L-VL_A-CLを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、長鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CH1-h-CH2-CH3を含む。
構造(4)の結合タンパク質は両本の異なるポリペプチド鎖を含み：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、短鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_B-L-VL_A-CLを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、長鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CH1-h-CH2-CH3を含む。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖1のVH_BとVL_Aは直接的に融合し結合して、すなわちLの長さは0である。他の1つの実施形態において、ポリペプチド鎖1のVH_Bは接続ペプチドLを介してVL_Aに結合し；Lは表1-2に挙げられた配列である。
実施例1.2.3．構造(5): IgG_HC-VH
構造(5)の結合タンパク質は両本の異なるポリペプチド鎖を含み：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、短鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CLを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、長鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CH1-h-CH2-CH3-L-VH_Bを含む。
構造(5)の結合タンパク質は両本の異なるポリペプチド鎖を含み：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、短鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CLを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、長鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CH1-h-CH2-CH3-L-VH_Bを含む。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖2のCH3とVH_Bは直接的に融合し結合して、すなわちLの長さは0である。他の1つの実施形態において、ポリペプチド鎖2のCH3は接続ペプチドLを介してVH_Bに結合し；Lは表1-2に挙げられた配列である。
実施例1.2.4．構造(6): IgG_LC-VH
構造(6)の結合タンパク質は両本の異なるポリペプチド鎖を含み：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、短鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CL-L-VH_Bを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、長鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CH1-h-CH2-CH3を含む。
構造(6)の結合タンパク質は両本の異なるポリペプチド鎖を含み：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、短鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CL-L-VH_Bを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、長鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CH1-h-CH2-CH3を含む。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖1のCLとVH_Bは直接的に融合し結合して、すなわちLの長さは0である。他の1つの実施形態において、ポリペプチド鎖1のCLは接続ペプチドLを介してVH_Bに結合し；Lは表1-2に挙げられた配列である。
実施例1.3．IgG-VH(2)六価対称構造
本発明は、2種類の親モノクローナル抗体を用いて二重特異性結合タンパク質を構築する方法を提供する：第1抗原を結合する従来の抗体Aと第2抗原を結合する重鎖抗体B。
本発明は、2種類の親モノクローナル抗体を用いて二重特異性結合タンパク質を構築する方法を提供する：第1抗原を結合する従来の抗体Aと第2抗原を結合する重鎖抗体B。
本発明は、さらに3つの親モノクローナル抗体を用いて三重特異性結合タンパク質を構築する方法を提供する：第1抗原を結合する従来の抗体Aと第2抗原を結合する重鎖抗体Bと第3抗原を結合する重鎖抗体C。
図1(7-8)に示すように、Fab末端は従来の抗体Aに由来し、VH_AとVL_Aはそれぞれ抗体Aの重鎖可変領域と軽鎖可変領域である。VH端が重鎖抗体Bまたは重鎖抗体Cに由来し、VH_Bは重鎖抗体Bの重鎖可変領域であり、VH_Cは重鎖抗体Cの重鎖可変領域である。CLは軽鎖定常領域ドメインである。CH1、CH2及びCH3はそれぞれ重鎖定常領域の第一、第二及び第三ドメインである。L1及びL2はそれぞれ第一及び第二接続ペプチドであり、hはIgG抗体のヒンジ領域または誘導配列である。
実施例1.3.1．構造(7): IgG_HC-VH-VH
構造(7)は、両本の異なるポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質を示し：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、短鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CLを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、長鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CH1-h-CH2-CH3-L1-VH_B-L2-VH_Bを含む。
構造(7)は、両本の異なるポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質を示し：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、短鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CLを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、長鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CH1-h-CH2-CH3-L1-VH_B-L2-VH_Bを含む。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖2のCH3とVH_Bは直接的に融合し結合して、すなわちL1の長さは0である。他の1つの実施形態において、ポリペプチド鎖2のCH3は接続ペプチドL1を介してVH_Bに結合し；L1は表1-2に挙げられた配列である。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖2の1つ目のVH_Bと2つ目のVH_Bは直接的に融合し結合して、すなわちL2の長さは0である。他の1つの実施形態において、ポリペプチド鎖2の1つ目のVH_Bは接続ペプチドL2を介して2つ目のVH_Bに結合し；L2は表1-2に挙げられた配列である。
実施例1.3.2．構造(8): IgG_HC-VH’-VH’’
構造(8)は、両本の異なるポリペプチド鎖を含む三重特異性結合タンパク質を示し：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、短鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CLを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、長鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CH1-h-CH2-CH3-L1-VH_B-L2-VH_Cを含む。
構造(8)は、両本の異なるポリペプチド鎖を含む三重特異性結合タンパク質を示し：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、短鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CLを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、長鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CH1-h-CH2-CH3-L1-VH_B-L2-VH_Cを含む。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖2のCH3とVH_Bは直接的に融合し結合して、すなわちL1の長さは0である。他の1つの実施形態において、ポリペプチド鎖2のCH3は接続ペプチドL1を介してVH_Bに結合し；L1は表1-2に挙げられた配列である。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖2のVH_BとVH_Cは直接的に融合し結合して、すなわちL2の長さは0である。他の1つの実施形態において、ポリペプチド鎖2のVH_Bは接続ペプチドL2を介してVH_Cに結合し；L2は表1-2に挙げられた配列である。
実施例1.4．2xVH-IgG 六価対称構造
本発明は、2種類の親モノクローナル抗体を用いて二重特異性結合タンパク質を構築する方法を提供する：第1抗原を結合する従来の抗体Aと第2抗原を結合する重鎖抗体B。
本発明は、2種類の親モノクローナル抗体を用いて二重特異性結合タンパク質を構築する方法を提供する：第1抗原を結合する従来の抗体Aと第2抗原を結合する重鎖抗体B。
本発明は、さらに3つの親モノクローナル抗体を用いて三重特異性結合タンパク質を構築する方法を提供する：第1抗原を結合する従来の抗体Aと第2抗原を結合する重鎖抗体Bと第3抗原を結合する重鎖抗体C。
図1(9-10)に示すように、Fab末端は従来の抗体Aに由来し、VH_AとVL_Aはそれぞれ抗体Aの重鎖可変領域と軽鎖可変領域である。VH端が重鎖抗体Bまたは重鎖抗体Cに由来し、VH_Bは重鎖抗体Bの重鎖可変領域であり、VH_Cは重鎖抗体Cの重鎖可変領域である。CLは軽鎖定常領域ドメインである。CH1、CH2及びCH3はそれぞれ重鎖定常領域の第一、第二及び第三ドメインである。L1及びL2はそれぞれ第一及び第二接続ペプチドであり、hはIgG抗体のヒンジ領域または誘導配列である。
実施例1.4.1．構造(9): 2xVH-IgG(HC+LC)
構造(9)は、両本の異なるポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質を示し：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、短鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_B-L1-VL_A-CLを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、長鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_B-L2-VH_A-CH1-h-CH2-CH3を含む。
構造(9)は、両本の異なるポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質を示し：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、短鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_B-L1-VL_A-CLを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、長鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_B-L2-VH_A-CH1-h-CH2-CH3を含む。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖1のVH_BとVL_Aは直接的に融合し結合して、すなわちL1の長さは0である。他の1つの実施形態において、ポリペプチド鎖1のVH_Bは接続ペプチドL1を介してVL_Aに結合し；L1は表1-2に挙げられた配列である。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖2のVH_BとVH_Aは直接的に融合し結合して、すなわちL2の長さは0である。他の1つの実施形態において、ポリペプチド鎖2のVH_Bは接続ペプチドL2を介してVH_Aに結合し；L2は表1-2に挙げられた配列である。
1つの実施形態において、L1及びL2は同じの配列である。他の1つの実施形態において、L1及びL2は異なる配列。
実施例1.4.2．構造(10):(VH’+VH’’)-IgG(HC+LC)
構造(10)は、両本の異なるポリペプチド鎖を含む三重特異性結合タンパク質を示し：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、短鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_B-L1-VL_A-CLを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、長鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_C-L2-VH_A-CH1-h-CH2-CH3を含む。
構造(10)は、両本の異なるポリペプチド鎖を含む三重特異性結合タンパク質を示し：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、短鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_B-L1-VL_A-CLを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、長鎖とも呼ばれ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_C-L2-VH_A-CH1-h-CH2-CH3を含む。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖1のVH_BとVL_Aは直接的に融合し結合して、すなわちL1の長さは0である。他の1つの実施形態において、ポリペプチド鎖1のVH_Bは接続ペプチドL1を介してVL_Aに結合し；L1は表1-2に挙げられた配列である。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖2のVH_CとVH_Aは直接的に融合し結合して、すなわちL2の長さは0である。他の1つの実施形態において、ポリペプチド鎖2のVH_Cは接続ペプチドL2を介してVH_Aに結合し；L2は表1-2に挙げられた配列である。
1つの実施形態において、L1及びL2は同じの配列である。他の1つの実施形態において、L1及びL2は異なる配列。
実施例1.5．Fab-Fc-VH二価非対称構造
本発明は、2種類の親モノクローナル抗体を用いて二重特異性結合タンパク質を構築する方法を提供する：第1抗原を結合する従来の抗体Aと第2抗原を結合する重鎖抗体B。
本発明は、2種類の親モノクローナル抗体を用いて二重特異性結合タンパク質を構築する方法を提供する：第1抗原を結合する従来の抗体Aと第2抗原を結合する重鎖抗体B。
図1(11-13)に示すように、Fab末端は従来の抗体Aに由来し、VH_AとVL_Aはそれぞれ抗体Aの重鎖可変領域と軽鎖可変領域である。VH端が重鎖抗体Bに由来し、VH_Bは重鎖抗体Bの重鎖可変領域である。CLは軽鎖定常領域ドメインである。CH1、CH2及びCH3はそれぞれ重鎖定常領域の第一、第二及び第三ドメインである。hは、IgG抗体のヒンジ領域または誘導配列である。2つの重鎖のFc領域は、それぞれ異なるアミノ酸の突然変異が導入され、それによって重鎖のホモ二量体化の形成を少なくする。
1つの実施形態において、VH_Bを含有するポリペプチド鎖におけるhは、IgGのヒンジ領域またはヒンジ領域由来の接続ペプチド配列または表1-2におけるヒトIgG1ヒンジ(C220S)またはG5-LHの配列である。
実施例1.5.1．構造(11): Fab-Fc-VH
構造(11)の結合タンパク質は三本の異なるポリペプチド鎖を含み：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CLを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CH1-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖3は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_B-h-CH2-CH3を含む。
構造(11)の結合タンパク質は三本の異なるポリペプチド鎖を含み：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CLを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CH1-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖3は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_B-h-CH2-CH3を含む。
実施例1.5.2．構造(12): Fab(cross VH/VL)-Fc-VH
構造(12)の結合タンパク質は三本の異なるポリペプチド鎖を含み：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CLを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CH1-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖3は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_B-h-CH2-CH3を含む。
構造(12)の結合タンパク質は三本の異なるポリペプチド鎖を含み：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CLを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CH1-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖3は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_B-h-CH2-CH3を含む。
実施例1.5.3．構造(13): Fab(cross Fd/LC)-Fc-VH
構造(13)の結合タンパク質は三本の異なるポリペプチド鎖を含み：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CH1を含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CL-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖3または第三ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_B-h-CH2-CH3を含む。
構造(13)の結合タンパク質は三本の異なるポリペプチド鎖を含み：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CH1を含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CL-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖3または第三ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_B-h-CH2-CH3を含む。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖2におけるhはヒンジ領域または接続ペプチドであり、その配列は表1-2におけるLH1の配列である。
実施例1.6．Fab-Fc-VH(2)三価非対称構造
本発明は、2種類の親モノクローナル抗体を用いて二重特異性結合タンパク質を構築する方法を提供する：第1抗原を結合する従来の抗体Aと第2抗原を結合する重鎖抗体B。
本発明は、2種類の親モノクローナル抗体を用いて二重特異性結合タンパク質を構築する方法を提供する：第1抗原を結合する従来の抗体Aと第2抗原を結合する重鎖抗体B。
本発明は、さらに3つの親モノクローナル抗体を用いて三重特異性結合タンパク質を構築する方法を提供する：第1抗原を結合する従来の抗体Aと第2抗原を結合する重鎖抗体Bと第3抗原を結合する重鎖抗体C。
図1(14-19)に示すように、Fab末端は従来の抗体Aに由来し、VH_AとVL_Aはそれぞれ抗体Aの重鎖可変領域と軽鎖可変領域である。VH端が重鎖抗体Bまたは重鎖抗体Cに由来し、VH_Bは重鎖抗体Bの重鎖可変領域であり、VH_Cは重鎖抗体Cの重鎖可変領域である。CLは軽鎖定常領域ドメインである。CH1、CH2及びCH3はそれぞれ重鎖定常領域の第一、第二及び第三ドメインである。Lは接続ペプチドであり、hはIgG抗体のヒンジ領域または誘導配列である。2つの重鎖のFc領域は、それぞれ異なるアミノ酸の突然変異が導入され、それによって重鎖のホモ二量体化の形成を少なくする。
1つの実施形態において、VH_Bを含有するポリペプチド鎖におけるhは、IgGのヒンジ領域またはヒンジ領域由来の接続ペプチド配列または表1-2におけるヒトIgG1ヒンジ(C220S)またはG5-LHの配列である。
実施例1.6.1．構造(14): Fab-Fc-VH-VH
構造(14)は、三本の異なるポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質を示し：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CLを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CH1-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖3または第三ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_B-L-VH_B-h-CH2-CH3を含む。
構造(14)は、三本の異なるポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質を示し：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CLを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CH1-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖3または第三ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_B-L-VH_B-h-CH2-CH3を含む。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖3の1つ目のVH_Bと2つ目のVH_Bは直接的に融合し結合して、すなわちLの長さは0である。他の1つの実施形態において、ポリペプチド鎖3の1つ目のVH_Bは接続ペプチドLを介して2つ目のVH_Bに結合し；Lは表1-2に挙げられた配列である。
実施例1.6.2．構造(15): Fab-Fc-VH’-VH’’
構造(15)は、三本の異なるポリペプチド鎖を含む三重特異性結合タンパク質を示し：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CLを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CH1-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖3または第三ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_C-L-VH_B-h-CH2-CH3を含む。
構造(15)は、三本の異なるポリペプチド鎖を含む三重特異性結合タンパク質を示し：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CLを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CH1-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖3または第三ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_C-L-VH_B-h-CH2-CH3を含む。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖3のVH_CとVH_Bは直接的に融合し結合して、すなわちLの長さは0である。他の1つの実施形態において、ポリペプチド鎖3のVH_Cは接続ペプチドLを介してVH_Bに結合し；Lは表1-2に挙げられた配列である。
実施例1.6.3．構造(16): Fab(cross VH/VL)-Fc-VH-VH
構造(16)は、三本の異なるポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質を示し：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CLを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CH1-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖3または第三ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_B-L-VH_B-h-CH2-CH3を含む。
構造(16)は、三本の異なるポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質を示し：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CLを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CH1-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖3または第三ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_B-L-VH_B-h-CH2-CH3を含む。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖3の1つ目のVH_Bと2つ目のVH_Bは直接的に融合し結合して、すなわちLの長さは0である。他の1つの実施形態において、ポリペプチド鎖3の1つ目のVH_Bは接続ペプチドLを介して2つ目のVH_Bに結合し；Lは表1-2に挙げられた配列である。
実施例1.6.4．構造(17): Fab(cross VH/VL)-Fc-VH’-VH’’
構造(17)は、三本の異なるポリペプチド鎖を含む三重特異性結合タンパク質を示し：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CLを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CH1-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖3または第三ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_C-L-VH_B-h-CH2-CH3を含む。
構造(17)は、三本の異なるポリペプチド鎖を含む三重特異性結合タンパク質を示し：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CLを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CH1-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖3または第三ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_C-L-VH_B-h-CH2-CH3を含む。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖3のVH_CとVH_Bは直接的に融合し結合して、すなわちLの長さは0である。他の1つの実施形態において、ポリペプチド鎖3のVH_Cは接続ペプチドLを介してVH_Bに結合し；Lは表1-2に挙げられた配列である。
実施例1.6.5．構造(18): Fab(cross Fd/LC)-Fc-VH-VH
構造(18)は、三本の異なるポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質を示し：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CH1を含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CL-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖3または第三ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_B-L-VH_B-h-CH2-CH3を含む。
構造(18)は、三本の異なるポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質を示し：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CH1を含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CL-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖3または第三ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_B-L-VH_B-h-CH2-CH3を含む。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖3の1つ目のVH_Bと2つ目のVH_Bは直接的に融合し結合して、すなわちLの長さは0である。他の1つの実施形態において、ポリペプチド鎖3の1つ目のVH_Bは接続ペプチドLを介して2つ目のVH_Bに結合し；Lは表1-2に挙げられた配列である。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖2におけるhはヒンジ領域または接続ペプチドであり、その配列は表1-2におけるLH1の配列である。
実施例1.6.6．構造(19): Fab(cross Fd/LC)-Fc-VH’-VH’’
構造(19)は、三本の異なるポリペプチド鎖を含む三重特異性結合タンパク質を示し：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CH1を含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CL-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖3または第三ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_C-L-VH_B-h-CH2-CH3を含む。
構造(19)は、三本の異なるポリペプチド鎖を含む三重特異性結合タンパク質を示し：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CH1を含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CL-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖3または第三ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_C-L-VH_B-h-CH2-CH3を含む。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖3のVH_CとVH_Bは直接的に融合し結合して、すなわちLの長さは0である。他の1つの実施形態において、ポリペプチド鎖3のVH_Cは接続ペプチドLを介してVH_Bに結合し；Lは表1-2に挙げられた配列である。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖2におけるhはヒンジ領域または接続ペプチドであり、その配列は表1-2におけるLH1の配列である。
実施例1.7．scFv-Fc-VH二価非対称構造
本発明は、2種類の親モノクローナル抗体を用いて二重特異性結合タンパク質を構築する方法を提供する：第1抗原を結合する従来の抗体Aと第2抗原を結合する重鎖抗体B。
本発明は、2種類の親モノクローナル抗体を用いて二重特異性結合タンパク質を構築する方法を提供する：第1抗原を結合する従来の抗体Aと第2抗原を結合する重鎖抗体B。
図1(20-21)に示すように、scFv端は従来の抗体Aに由来し、VH_A及びVL_Aはそれぞれ抗体Aの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域である。VH端が重鎖抗体Bに由来し、VH_Bは重鎖抗体Bの重鎖可変領域である。CH2及びCH3はそれぞれ重鎖定常領域の第二及び第三ドメインである。Lは接続ペプチドであり、hはIgG抗体のヒンジ領域または誘導配列である。2つの重鎖のFc領域は、それぞれ異なるアミノ酸の突然変異が導入され、それによって重鎖のホモ二量体化の形成を少なくする。
1つの実施形態において、scFvの配列はVH-接続ペプチド-VLである。他の1つの実施形態において、scFvの配列はVL-接続ペプチド-VHである。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖におけるLは接続ペプチドであり、表1-2に挙げられた配列であってもよく、好ましくGS_15またはGS_20の配列である。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖におけるhは、IgG抗体のヒンジ領域または誘導配列であり、表1-2に挙げられた配列であってもよく、好ましくヒトIgG1ヒンジ(C220S)またはG5-LHの配列である。
実施例1.7.1．構造(20): scFv(VL-VH)-Fc-VH
構造(20)の結合タンパク質は両本の異なるポリペプチド鎖を含み：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-L-VH_A-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_B-h-CH2-CH3を含む。
構造(20)の結合タンパク質は両本の異なるポリペプチド鎖を含み：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-L-VH_A-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_B-h-CH2-CH3を含む。
実施例1.7.2．構造(21): scFv(VH-VL)-Fc-VH
構造(21)の結合タンパク質は両本の異なるポリペプチド鎖を含み：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-L-VL_A-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_B-h-CH2-CH3を含む。
構造(21)の結合タンパク質は両本の異なるポリペプチド鎖を含み：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-L-VL_A-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_B-h-CH2-CH3を含む。
実施例1.8．scFv-Fc-VH(2)三価非対称構造
本発明は、2種類の親モノクローナル抗体を用いて二重特異性結合タンパク質を構築する方法を提供する：第1抗原を結合する従来の抗体Aと第2抗原を結合する重鎖抗体B。
本発明は、2種類の親モノクローナル抗体を用いて二重特異性結合タンパク質を構築する方法を提供する：第1抗原を結合する従来の抗体Aと第2抗原を結合する重鎖抗体B。
本発明は、さらに3つの親モノクローナル抗体を用いて三重特異性結合タンパク質を構築する方法を提供する：第1抗原を結合する従来の抗体Aと第2抗原を結合する重鎖抗体Bと第3抗原を結合する重鎖抗体C。
図1(22-25)に示すように、scFv端は従来の抗体Aに由来し、VH_A及びVL_Aはそれぞれ抗体Aの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域である。VH端が重鎖抗体Bまたは重鎖抗体Cに由来し、VH_Bは重鎖抗体Bの重鎖可変領域であり、VH_Cは重鎖抗体Cの重鎖可変領域である。CH2及びCH3はそれぞれ重鎖定常領域の第二及び第三ドメインである。L1及びL2はそれぞれ第一及び第二接続ペプチドであり、hはIgG抗体のヒンジ領域または誘導配列である。2つの重鎖のFc領域は、それぞれ異なるアミノ酸の突然変異が導入され、それによって重鎖のホモ二量体化の形成を少なくする。
1つの実施形態において、scFvの配列はVH-接続ペプチド-VLである。他の1つの実施形態において、scFvの配列はVL-接続ペプチド-VHである。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖におけるL1は結合scFvにおけるVH及びVLの接続ペプチドであり、表1-2に挙げられた配列であってもよく、好ましくGS_15またはGS_20の配列である。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖におけるL2は2つの重鎖抗体を結合する重鎖可変領域の間の接続ペプチドであり、表1-2に挙げられた配列である。他の1つの実施形態において、2つの重鎖抗体の重鎖可変領域の間には直接的に融合し、すなわちL2の長さは0である。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖におけるhは、IgG抗体のヒンジ領域または誘導配列であり、表1-2に挙げられた配列であってもよく、好ましくヒトIgG1ヒンジ(C220S)またはG5-LHの配列である。
実施例1.8.1．構造(22): scFv(VL-VH)-Fc-VH-VH
構造(22)は、両本の異なるポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質を示し：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-L1-VH_A-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_B-L2-VH_B-h-CH2-CH3を含む。
構造(22)は、両本の異なるポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質を示し：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-L1-VH_A-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_B-L2-VH_B-h-CH2-CH3を含む。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖2の1つ目のVH_Bと2つ目のVH_Bは直接的に融合し結合して、すなわちL2の長さは0である。他の1つの実施形態において、ポリペプチド鎖2の1つ目のVH_Bは接続ペプチドL2を介して2つ目のVH_Bに結合し；L2は表1-2に挙げられた配列である。
実施例1.8.2．構造(23): scFv(VH-VL)-Fc-VH-VH
構造(23)は、両本の異なるポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質を示し：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-L1-VL_A-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_B-L2-VH_B-h-CH2-CH3を含む。
構造(23)は、両本の異なるポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質を示し：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-L1-VL_A-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_B-L2-VH_B-h-CH2-CH3を含む。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖2の1つ目のVH_Bと2つ目のVH_Bは直接的に融合し結合して、すなわちL2の長さは0である。他の1つの実施形態において、ポリペプチド鎖2の1つ目のVH_Bは接続ペプチドL2を介して2つ目のVH_Bに結合し；L2は表1-2に挙げられた配列である。
実施例1.8.3．構造(24): scFv(VL-VH)-Fc-VH’-VH’’
構造(24)は、両本の異なるポリペプチド鎖を含む三重特異性結合タンパク質を示し：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-L1-VH_A-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_C-L2-VH_B-h-CH2-CH3を含む。
構造(24)は、両本の異なるポリペプチド鎖を含む三重特異性結合タンパク質を示し：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-L1-VH_A-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_C-L2-VH_B-h-CH2-CH3を含む。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖2のVH_CとVH_Bは直接的に融合し結合して、すなわちL2の長さは0である。他の1つの実施形態において、ポリペプチド鎖2のVH_Cは接続ペプチドL2を介してVH_Bに結合し；L2は表1-2に挙げられた配列である。
実施例1.8.4．構造(25): scFv(VH-VL)-Fc-VH’-VH’’
構造(25)は、両本の異なるポリペプチド鎖を含む三重特異性結合タンパク質を示し：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-L1-VL_A-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_C-L2-VH_B-h-CH2-CH3を含む。
構造(25)は、両本の異なるポリペプチド鎖を含む三重特異性結合タンパク質を示し：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-L1-VL_A-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_C-L2-VH_B-h-CH2-CH3を含む。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖2のVH_CとVH_Bは直接的に融合し結合して、すなわちL2の長さは0である。他の1つの実施形態において、ポリペプチド鎖2のVH_Cは接続ペプチドL2を介してVH_Bに結合し；L2は表1-2に挙げられた配列である。
実施例1.9．Fab-Fc-VH(3)四価非対称構造
本発明は、2種類の親モノクローナル抗体を用いて二重特異性結合タンパク質を構築する方法を提供する：第1抗原を結合する従来の抗体Aと第2抗原を結合する重鎖抗体B。
本発明は、2種類の親モノクローナル抗体を用いて二重特異性結合タンパク質を構築する方法を提供する：第1抗原を結合する従来の抗体Aと第2抗原を結合する重鎖抗体B。
本発明は、さらに3つの親モノクローナル抗体を用いて三重特異性結合タンパク質を構築する方法を提供する：第1抗原を結合する従来の抗体Aと第2抗原を結合する重鎖抗体Bと第3抗原を結合する重鎖抗体C。
本発明は、さらに四種類の親モノクローナル抗体を用いて四重特異性結合タンパク質を構築する方法を提供する：第一抗原を結合する従来の抗体Aと第二抗原を結合する重鎖抗体Bと第三抗原を結合する重鎖抗体Cと第四抗原を結合する重鎖抗体D。
図1(26-27)に示すように、Fab末端は従来の抗体Aに由来し、VH_AとVL_Aはそれぞれ抗体Aの重鎖可変領域と軽鎖可変領域である。VH端が重鎖抗体Bまたは重鎖抗体Cまたは重鎖抗体Dに由来し、VH_Bは重鎖抗体Bの重鎖可変領域であり、VH_Cは重鎖抗体Cの重鎖可変領域であり、VH_Dは重鎖抗体Dの重鎖可変領域である。CLは軽鎖定常領域ドメインである。CH1、CH2及びCH3はそれぞれ重鎖定常領域の第一、第二と第三ドメインである。L1及びL2は接続ペプチドであり、hはIgG抗体のヒンジ領域または誘導配列である。2つの重鎖のFc領域は、それぞれ異なるアミノ酸の突然変異が導入され、それによって重鎖のホモ二量体化の形成を少なくする。
1つの実施形態において、VH_Bを含有するポリペプチド鎖におけるhは、IgGのヒンジ領域またはヒンジ領域由来の接続ペプチド配列または表1-2におけるヒトIgG1ヒンジ(C220S)またはG5-LHの配列である。
実施例1.9.1．構造(26): Fab-Fc-VH-VH-VH
構造(26)は、三本の異なるポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質を示し：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CLを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CH1-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖3または第三ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_B-L1-VH_B-L2-VH_B-h-CH2-CH3を含む。
構造(26)は、三本の異なるポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質を示し：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CLを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CH1-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖3または第三ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_B-L1-VH_B-L2-VH_B-h-CH2-CH3を含む。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖3の1つ目のVH_Bと2つ目のVH_Bは直接的に融合し結合して、すなわちL1の長さは0である。他の1つの実施形態において、ポリペプチド鎖3の1つ目のVH_Bは接続ペプチドL1を介して2つ目のVH_Bに結合し；L1は表1-2に挙げられた配列である。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖3の2つ目のVH_Bと3つ目のVH_Bは直接的に融合し結合して、すなわちL2の長さは0である。他の1つの実施形態において、ポリペプチド鎖3の2つ目のVH_Bは接続ペプチドL2を介してに結合し3つ目のVH_Bを含み；L2は表1-2に挙げられた配列である。
実施例1.9.2．構造(27): Fab-Fc-VH’-VH’’-VH’’’
構造(27)は、三本の異なるポリペプチド鎖を含む四重特異性結合タンパク質を示し：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CLを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CH1-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖3または第三ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_D-L1-VH_C-L2-VH_B-h-CH2-CH3を含む。
構造(27)は、三本の異なるポリペプチド鎖を含む四重特異性結合タンパク質を示し：ポリペプチド鎖1または第一ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VL_A-CLを含み；ポリペプチド鎖2または第二ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_A-CH1-h-CH2-CH3を含み；ポリペプチド鎖3または第三ポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、VH_D-L1-VH_C-L2-VH_B-h-CH2-CH3を含む。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖3のVH_DとVH_Cは直接的に融合し結合して、すなわちL1の長さは0である。他の1つの実施形態において、ポリペプチド鎖3のVH_Dは接続ペプチドL1を介してVH_Cに結合し；L1は表1-2に挙げられた配列である。
1つの実施形態において、ポリペプチド鎖3のVH_CとVH_Bは直接的に融合し結合して、すなわちL2の長さは0である。他の1つの実施形態において、ポリペプチド鎖3のVH_Cは接続ペプチドL2を介してVH_Bに結合し；L2は表1-2に挙げられた配列である。
実施例2．抗体の配列分析、発現精製、及び理化学的特性の特徴付けと分析
実施例2.1．抗体の配列分析及び最適化
抗体の重鎖可変ドメイン配列は、染色体上の重鎖遺伝子群の胚系遺伝子V、D、J遺伝子フラグメントの遺伝子組み換えと体細胞の高周波突然変異などの事象に由来する；軽鎖可変ドメイン配列は、軽鎖遺伝子群の胚系遺伝子V、J遺伝子フラグメントの遺伝子組み換え、体細胞の高周波突然変異などの事象に由来する。遺伝子組み換えと体細胞の高周波突然変異は、抗体の多様性を増加させる主要な要素である。同じ胚系V遺伝子フラグメントに由来する抗体も異なる配列を産生する可能性があるが、全体的に類似性が高い。IMGT/DomainGapAlign(http://imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi)またはNCBI/IgBLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)などの計算方法により、抗体の可変ドメイン配列から遺伝子組み換えが発生した場合に可能な胚系遺伝子フラグメントを推定することができる。
実施例2.1．抗体の配列分析及び最適化
抗体の重鎖可変ドメイン配列は、染色体上の重鎖遺伝子群の胚系遺伝子V、D、J遺伝子フラグメントの遺伝子組み換えと体細胞の高周波突然変異などの事象に由来する；軽鎖可変ドメイン配列は、軽鎖遺伝子群の胚系遺伝子V、J遺伝子フラグメントの遺伝子組み換え、体細胞の高周波突然変異などの事象に由来する。遺伝子組み換えと体細胞の高周波突然変異は、抗体の多様性を増加させる主要な要素である。同じ胚系V遺伝子フラグメントに由来する抗体も異なる配列を産生する可能性があるが、全体的に類似性が高い。IMGT/DomainGapAlign(http://imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi)またはNCBI/IgBLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)などの計算方法により、抗体の可変ドメイン配列から遺伝子組み換えが発生した場合に可能な胚系遺伝子フラグメントを推定することができる。
タンパク質またはポリペプチドアミノ酸鎖は、細胞中で翻訳し合成されると、翻訳後修飾(PTM)と呼ばれる化学修飾が導入されることがある。抗体にとって、いくつかのPTMの部位は非常に保守的であり、例えば、ヒトのIgG1抗体の定常ドメインの第297位(EU番号)の保守的アミノ酸であるアスパラギンAsnは通常グリコシル化修飾を起こして糖鎖を形成し、この糖鎖構造は抗体構造と関連する効果機能にとって極めて重要である。しかし、抗体の可変ドメイン、特にCDRなどの抗原結合領域にPTMが存在する場合、これらのPTMの存在は抗原結合に大きな影響を与える可能性があり、抗体の物理化学的特性にも変化をもたらす可能性がある。例えば、グリコシル化、脱アミド、異性化、酸化などはいずれも抗体分子の不安定性または異質性を増加させ、それによって抗体開発の難度とリスクを増加させる可能性がある。したがって、いくつかの潜在的なPTMを回避することは、治療抗体の開発にとって非常に重要である。経験の蓄積に伴い、いくつかのPTMがアミノ酸配列の組成、特に隣接するアミノ酸組成の「パターン」と高度に関連していることが発見され、これによりタンパク質の一級アミノ酸配列から潜在的なPTMを予測することができる。例えば、N‐x‐S／T(第1位はアスパラギンであり、第2位はプロリン以外の任意のアミノ酸であり、第3位はセリンまたはトレオニンである)の配列パターンから、N‐結合グリコシル化部位を予測する。PTMを引き起こすアミノ酸配列パターンは、胚系遺伝子配列に由来する可能性があり、例えば、ヒト胚系遺伝子フラグメントIGHV3‐33は天然にFR3領域にグリコシル化パターンNSTが存在し；体細胞の高周波突然変異に由来する可能性もある。例えば、NGSまたはNLTはグリコシル化部位である可能性があり、NSは脱アミド部位である可能性があり、DGはアスパラギンの異性化を引き起こす可能性がある。
アミノ酸突然変異によってPTMのアミノ酸配列パターンを破壊し、それによって特定のPTMの形成を低減または除去することができる。抗体配列とPTM配列パターンによって、異なる突然変異の設計方法がある。1つの方法は、「ホットスポット」アミノ酸(例えば、NSモードにおけるNまたはS)を物理化学的に類似したアミノ酸(NをQに突然変異させるなど)に置換することである。PTM配列パターンが体細胞の高周波変異に由来し、胚系遺伝子配列に存在しない場合、別の方法は、配列パターンを対応する胚系遺伝子配列に置換することである。実際の操作では、同じPTM配列パターンに対して複数の突然変異の設計方法を採用することができる。
実施例2.2．抗体の発現及び精製
本実施例は、哺乳動物宿主細胞(例えば、ヒト胚腎細胞HEK293またはチャイニーズハムスター卵巣細胞CHO及びその誘導細胞)、瞬時トランスフェクション発現及びアフィニティー捕獲分離などの技術を用いて抗体を作製する一般的な方法を紹介した。本方法は、Fc領域を含む標的抗体に適用する；標的抗体は、1つ以上のタンパク質ポリペプチド鎖から構成することができ；1つ以上の発現プラスミドに由来することができる。
本実施例は、哺乳動物宿主細胞(例えば、ヒト胚腎細胞HEK293またはチャイニーズハムスター卵巣細胞CHO及びその誘導細胞)、瞬時トランスフェクション発現及びアフィニティー捕獲分離などの技術を用いて抗体を作製する一般的な方法を紹介した。本方法は、Fc領域を含む標的抗体に適用する；標的抗体は、1つ以上のタンパク質ポリペプチド鎖から構成することができ；1つ以上の発現プラスミドに由来することができる。
抗体ポリペプチド鎖のアミノ酸配列をコドン最適化法によりヌクレオチド配列に変換し；コードされたヌクレオチド配列を合成し、宿主細胞と互換性のある発現ベクター上にコローナルする。抗体ポリペプチド鎖をコードするプラスミドを哺乳類宿主細胞に特定の割合で同時にトランスフェクションし、従来の組換えタンパク質発現と精製技術を利用して、正確な折り畳みとポリペプチド鎖組立を有する組換え抗体を得ることができる。具体的には、FreeStyle（登録商標） 293-F細胞(Thermo，#R79007)をFreeStyle（登録商標） F17 Expression Medium培地(Thermo，#A1383504)で拡培した。瞬時トランスフェクションを開始する前に、細胞濃度を6～8×105細胞/mlに調節し、37℃、8%CO2ロッカ中で24時間培養し、細胞濃度は1.2×106細胞/mlであった。培養した細胞を30ml用意する。抗体ポリペプチド鎖をコードするプラスミドを特定の割合で混合し、合計30μgのプラスミド(プラスミドと細胞の割合は1μg：1ml)を1.5mlのOpti‐MEM血清減少培地(Thermo，#31985088)に溶解させ、0.22μm濾過膜で濾過除菌した。さらに1.5mlのOpti-MEMを1mg/mlのPEI(Polysciences，#23966-2)120μlに溶解し、5分間静置した。PEIをゆっくりとプラスミドに加え、室温で10分間インキュベートし、培養瓶を揺らしながらプラスミドPEI混合溶液をゆっくり滴下し、37℃、8%CO2ロッキングベッドで5日間培養した。5日後に細胞生存率を観測した。培養物を集め、回転数3300gで10分間遠心分離した後、上清を取った。その後、上清を高速遠心分離して不純物を除去した。PBS pH7.4緩衝液でMabSelect（登録商標）(GE Healthcare，#71-5020-91)を含む重力カラム(Bio-Rad，#7311550)を平衡化させ、2-5倍のカラム体積で洗浄した。上清サンプルをカラムに通す；5‐10倍のカラム体積のPBS緩衝液でカラムを洗浄し、pH3.5の0.1Mグリシンで目的タンパク質を溶出し、その後にpH8.0のTris‐HClで中性に調整し、最後に限外ろ過管(Millipore，#UFC901024)でPBS緩衝液または他の成分を含む緩衝液に濃縮し、精製された組換え抗体溶液を得た。最後にNanoDrop(Thermo，NanoDrop)（登録商標） One)で濃度を測定し、分割し、予備保存する。
実施例2.3．SEC-HPLCを用いたタンパク質純度と多量体の分析
本実施例は、分析型分子サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を用いてタンパク質サンプルの純度及び多量体形態を分析した。分析型カラムTSKgel G3000SWxl(Tosoh Bioscience，##08541，5μm，7.8mm×30cm)を高圧液体クロマトグラフィーHPLC(Agilent Technologies，Agilent 1260 Infinity II)に接続し、PBS緩衝液を用いて室温で少なくとも1時間平衡させる。適量のタンパク質サンプル(少なくとも10μg)を0.22μm濾過膜で濾過してシステムに注入し、HPLCプログラムを設定する：PBS緩衝液でサンプルを1.0ml/分の流速でカラムを流し、最長時間は25分である。HPLCは、分析報告書を生成し、サンプル内の異なる分子サイズ成分の滞留時間を報告する。
本実施例は、分析型分子サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を用いてタンパク質サンプルの純度及び多量体形態を分析した。分析型カラムTSKgel G3000SWxl(Tosoh Bioscience，##08541，5μm，7.8mm×30cm)を高圧液体クロマトグラフィーHPLC(Agilent Technologies，Agilent 1260 Infinity II)に接続し、PBS緩衝液を用いて室温で少なくとも1時間平衡させる。適量のタンパク質サンプル(少なくとも10μg)を0.22μm濾過膜で濾過してシステムに注入し、HPLCプログラムを設定する：PBS緩衝液でサンプルを1.0ml/分の流速でカラムを流し、最長時間は25分である。HPLCは、分析報告書を生成し、サンプル内の異なる分子サイズ成分の滞留時間を報告する。
図65は、本発明の出願におけるいくつかの異なる構造の二重抗体分子の瞬時トランスフェクション発現と一段階親和精製を経て得られたタンパク質サンプルのSDS‐PAGEとSEC‐HPLCの分析結果を示す。これらの二重抗体分子はいずれも良好な収率と純度を示している。
実施例2.4．DSFを用いたタンパク分子の熱安定性の測定
示差走査蛍光法(Differential Scanning Fluorimetry、DSF)は、タンパク質の熱安定性を測定するための一般的な高フラックス法である。当該方法は、リアルタイム蛍光定量PCR装置を用いて、折り畳みが解除されたタンパク質分子と結合した染料の蛍光強度の変化を監視することにより、タンパク質の変性の過程を反映し、さらにタンパク質分子の熱安定性を反映する。本実施例は、DSF法を用いてタンパク質分子の熱変性温度(Tm)を測定した。10μgタンパク質を96-ウェルPCRプレート(Thermo，#AB-0700/W)に添加し、続いて2μLの100×希釈された染料SYPROTM(Invitrogen，#2008138)を添加し、最終体積がウェルあたり40μlになるように緩衝液を添加した。PCRプレートを密封し、リアルタイム蛍光定量PCR装置(Bio-Rad CFX 96 PCR System)に置き、25℃で5分間インキュベートした後、0.2℃/0.2分の勾配で25℃から95℃に徐々に昇温し、試験終了時に温度を25℃に下げた。FRETスキャンモードを使用し、Bio-Rad CFX Maestroソフトウェアを使用してデータ分析を行い、サンプルのTmを算出した。
示差走査蛍光法(Differential Scanning Fluorimetry、DSF)は、タンパク質の熱安定性を測定するための一般的な高フラックス法である。当該方法は、リアルタイム蛍光定量PCR装置を用いて、折り畳みが解除されたタンパク質分子と結合した染料の蛍光強度の変化を監視することにより、タンパク質の変性の過程を反映し、さらにタンパク質分子の熱安定性を反映する。本実施例は、DSF法を用いてタンパク質分子の熱変性温度(Tm)を測定した。10μgタンパク質を96-ウェルPCRプレート(Thermo，#AB-0700/W)に添加し、続いて2μLの100×希釈された染料SYPROTM(Invitrogen，#2008138)を添加し、最終体積がウェルあたり40μlになるように緩衝液を添加した。PCRプレートを密封し、リアルタイム蛍光定量PCR装置(Bio-Rad CFX 96 PCR System)に置き、25℃で5分間インキュベートした後、0.2℃/0.2分の勾配で25℃から95℃に徐々に昇温し、試験終了時に温度を25℃に下げた。FRETスキャンモードを使用し、Bio-Rad CFX Maestroソフトウェアを使用してデータ分析を行い、サンプルのTmを算出した。
実施例2.5．Uncleを用いたタンパク質の分子安定性及び分子凝集性の測定
Uncle(Unchained Labs)は、全蛍光、静止光散乱(SLS)、及び動的光分散(DLS)検出法によりタンパク質の安定性を特徴付ける多機能ワンストップタンパク質安定性解析プラットフォームである。同じ群のサンプルは、同時に溶解温度(Tm)、凝集温度(Tagg)と粒径(diameter)などのパラメータを得ることができる。本実施例では、Uncleの「Tm&Tagg with optional DLS」アプリケーションを選択して操作し、9μLサンプルをUniチューブに加え、0.3℃/分の勾配で25℃から95℃に徐々に昇温するように設定した。初期及び最終DLS測定を5秒ずつ4回採取した。実験実行終了後、Uncle分析ソフトウェアは重心平均値(BCM)公式を用いて各サンプルのTm値を計算し；Tagg値は、266nmまたは473nmの波長におけるSLSの蛍光強度の曲線(凝集曲線)によって計算され；サンプルの粒径と分散度はDLSに関する関数で計算した。
Uncle(Unchained Labs)は、全蛍光、静止光散乱(SLS)、及び動的光分散(DLS)検出法によりタンパク質の安定性を特徴付ける多機能ワンストップタンパク質安定性解析プラットフォームである。同じ群のサンプルは、同時に溶解温度(Tm)、凝集温度(Tagg)と粒径(diameter)などのパラメータを得ることができる。本実施例では、Uncleの「Tm&Tagg with optional DLS」アプリケーションを選択して操作し、9μLサンプルをUniチューブに加え、0.3℃/分の勾配で25℃から95℃に徐々に昇温するように設定した。初期及び最終DLS測定を5秒ずつ4回採取した。実験実行終了後、Uncle分析ソフトウェアは重心平均値(BCM)公式を用いて各サンプルのTm値を計算し；Tagg値は、266nmまたは473nmの波長におけるSLSの蛍光強度の曲線(凝集曲線)によって計算され；サンプルの粒径と分散度はDLSに関する関数で計算した。
実施例3．PD-L1×CTLA4二重特異性抗体
実施例3.1．背景
プログラム死受容体1(programmed death 1、PD-1)は、主にT細胞などの免疫細胞に発現し、2つのリガンド、すなわちプログラム死リガンド-1(programmed death ligand 1、PD-L1)とPD-L2を有する。PD‐L1は、主に抗原提示細胞及び複数の腫瘍細胞に発現される。PD‐L1とPD‐1の相互作用は、T細胞の活性を低下させ、サイトカインの分泌を弱め、免疫抑制作用を果たす。多くのヒト腫瘍組織においてPD‐L1タンパク質の発現が検出され、腫瘍部位のミクロ環境は腫瘍細胞上のPD‐L1の発現を誘導でき、発現されたPD‐L1は腫瘍の発生と成長に有利であり、抗腫瘍T細胞のアポトーシスを誘導し、さらに腫瘍細胞を保護して免疫攻撃から逃れる。PD-1/PD-L1経路阻害剤は、PD-1とPD-L1の結合を遮断し、負方向制御信号を遮断し、T細胞を活性化させ、腫瘍細胞を殺傷する作用を発揮し、さらに腫瘍の成長を抑制することができるため、PD-1/PD-L1を標的とする免疫調節は腫瘍抑制に重要な意義がある。
実施例3.1．背景
プログラム死受容体1(programmed death 1、PD-1)は、主にT細胞などの免疫細胞に発現し、2つのリガンド、すなわちプログラム死リガンド-1(programmed death ligand 1、PD-L1)とPD-L2を有する。PD‐L1は、主に抗原提示細胞及び複数の腫瘍細胞に発現される。PD‐L1とPD‐1の相互作用は、T細胞の活性を低下させ、サイトカインの分泌を弱め、免疫抑制作用を果たす。多くのヒト腫瘍組織においてPD‐L1タンパク質の発現が検出され、腫瘍部位のミクロ環境は腫瘍細胞上のPD‐L1の発現を誘導でき、発現されたPD‐L1は腫瘍の発生と成長に有利であり、抗腫瘍T細胞のアポトーシスを誘導し、さらに腫瘍細胞を保護して免疫攻撃から逃れる。PD-1/PD-L1経路阻害剤は、PD-1とPD-L1の結合を遮断し、負方向制御信号を遮断し、T細胞を活性化させ、腫瘍細胞を殺傷する作用を発揮し、さらに腫瘍の成長を抑制することができるため、PD-1/PD-L1を標的とする免疫調節は腫瘍抑制に重要な意義がある。
細胞毒性Tリンパ球関連抗原4(CTLA4)は、T細胞上で発現する負の調節因子であり、抗原提示細胞上のCD80またはCD86と結合した後、CD28の共刺激信号を遮断すると同時に、T細胞の活性を低下させ、免疫抑制作用を果たす。CTLA4媒介の抑制機序は、しばしば腫瘍細胞が免疫系から逃れる原因の一つとなる。CTLA4とそのリガンドとの相互作用を遮断することで、T細胞の活性を回復し、抗腫瘍能力を増強することができる。
現在、PD-1、PD-L1、CTLA4に対する遮断型抗体はいずれも臨床的に優れた抗腫瘍効果を示し、複数の抗体薬物の発売が承認されている。それでも、これらの薬物と治療手段は臨床的には多くの問題、例えば低い反応率に直面している。したがって、PD‐1、PD‐L1、CTLA4などの遮断型抗体に基づく併用投与スキームの臨床試験が積極的に行われている。CTLA4阻害剤は明らかな毒性副作用を示すため、現在のPD-1/PD-L1阻害剤とCTLA4阻害剤との併用投与スキームでは、一般に、CTLA4阻害剤はより低用量を選択する。例えば、抗PD‐1抗体Nivolumabと抗CTLA‐4抗体Ipilimumabを併用して結腸直腸癌と腎細胞癌を治療する臨床試験において、NivolumabとIpilimumabの投与量はそれぞれ3mg/kgと1mg/kgである。抗PD‐L1抗体Durvalumabと抗CTLA‐4抗体Tremelimummabを併用した非小細胞肺癌を治療する臨床試験において、DurvalumabとTremelimummabの用量はそれぞれ10‐20mg/kgと1mg/kgである。
一方、腫瘍の免疫に関する生物学的メカニズムについてもますます理解されている。CTLA4信号経路を遮断すると、腫瘍浸潤リンパ細胞(TILs)上でのPD‐1の高発現が起こり、PD‐1信号経路を遮断すると、TILs上でのCTLA4の発現が向上することが分かった(Rev Assoc Med Brass 2017；63(9)：814‐823)。これは、単一の共抑制信号経路を遮断することによって引き起こされる可能性のある薬剤耐性の機構を示唆し、これらの抗体を併用して複数の共抑制信号経路を同時に遮断することによって、T細胞に対する活性化に相乗効果がある可能性がある。また、最新の研究では、PD-1とCTLA4の信号経路の相互作用の新たなメカニズムを報告し、PD-L1抗体とCTLA4抗体の相乗作用(Zhao et al.，2019，Immunity 51，1059-1073)を説明した。
従来の知見に基づいて、PD‐L1とCTLA4を同時に標的とする二重特異性抗体は、1つ以上の作用機序を利用することで抗腫瘍効果と安全性を高めることができると考えられている。第一に、PD‐L1×CTLA4二重抗体は、T細胞の異なる段階でCTLA4信号経路とPD‐1／PD‐L1信号経路を遮断することによって活性化される；PD‐L1とCD80のシス型の相互作用により、CTLA4とのより良い相乗効果が得られる。第二に、PD-L1は腫瘍組織に高発現し、PD-L1×CTLA4二重抗体は腫瘍ミクロ環境においてCTLA4抑制信号を特異的に解除してT細胞を活性化し、CTLA4モノクローナル抗体の外周系での非特異活性化による毒副作用を減少させることができる。第三に、PD‐L1×CTLA4二重抗体は、選択的にFc効果機能(例えばADCC)を保持でき、腫瘍ミクロ環境においてCTLA4によってCTLA4を高発現する抑制性T細胞、例えばTreg細胞を特異的に殺傷するか、PD‐L1によってPD‐L1を高発現する腫瘍細胞を特異的に殺傷する。また、二重特異性抗体は、1つの医薬品として、2つの医薬品の組み合わせよりも経済性や投与の便利性などの面で優位に立つことができる。
実施例3.2．抗PD-L1のIgG抗体と抗CTLA4のHCAb抗体の獲得
実施例3.2.1．抗PD-L1の全ヒト由来IgG抗体の獲得
Harbour H2L2マウス(Harbour Antibodies BV)は、ヒト免疫グロブリン免疫ライブラリを持つトランスジェニックマウスであり、その産生抗体は完全なヒト抗体可変ドメインとラット定常ドメインを有する。
実施例3.2.1．抗PD-L1の全ヒト由来IgG抗体の獲得
Harbour H2L2マウス(Harbour Antibodies BV)は、ヒト免疫グロブリン免疫ライブラリを持つトランスジェニックマウスであり、その産生抗体は完全なヒト抗体可変ドメインとラット定常ドメインを有する。
Harbour H2L2マウスを可溶性組換えヒトPD‐L1タンパク質(NovoProtein，#CM06)を用いてマルチラウンド免疫した。マウス血清中のPD‐L1特異性抗体価が特定のレベルに達したことを検出した後、マウスの脾臓細胞を取り出し、骨髄腫細胞系と融合してハイブリドーマ細胞を得た；ハイブリドーマ細胞をマルチラウンドスクリーニング及びコローナルした後、いくつかのPD‐L1を特異的に識別するモノクローナル抗体分子を同定した。これらのモノクローナル抗体をさらに同定し、ヒトPD‐L1に対する結合能力、カニクイザルPD‐L1に対する結合能力、PD‐L1とPD‐1の結合を抑制する能力などのパラメータに基づいて、いくつかの好ましい候補抗体分子を選択する。その後、候補抗体分子の配列分析と最適化を行い、数個の変異体配列を得た。抗体のVL及びVH配列を対応するヒトのκ軽鎖定常領域とIgG1重鎖定常領域配列を融合発現し、組換え全ヒト由来抗体分子を得た。PD‐L1に対する組換え全ヒト由来IgG抗体を表3‐9に示す。
実施例3.2.2．抗CTLA4の全ヒト由来HCAb抗体の獲得
Harbour HCAbマウス(Harbour Antibodies BV、WO2010/109165A2)は、ヒト免疫グロブリン免疫ライブラリを持つトランスジェニックマウスであり、従来のIgG抗体の半分の大きさしかない重鎖のみからなる抗体を産生することができる。その産生抗体は、ヒトの抗体重鎖可変ドメインとマウスFc定常ドメインのみを有する。
Harbour HCAbマウス(Harbour Antibodies BV、WO2010/109165A2)は、ヒト免疫グロブリン免疫ライブラリを持つトランスジェニックマウスであり、従来のIgG抗体の半分の大きさしかない重鎖のみからなる抗体を産生することができる。その産生抗体は、ヒトの抗体重鎖可変ドメインとマウスFc定常ドメインのみを有する。
Harbour HCAbマウスを可溶性組換えヒトCTLA4タンパク質(ACRO Biosystems，#CT4-H5229)で多ラウンド免疫した。マウス血清中のCTLA4特異性抗体価が特定のレベルに達したことを検出した後、マウスの脾臓細胞を取り出してB細胞を分離し、CD138陽性のスラリー細胞をマウススラリー細胞選別キット(Miltenyi，#130-092-530)で選別した。従来の分子生物学的手段を用いて形質細胞からヒトVH遺伝子を増幅し、増幅されたヒトVH遺伝子フラグメントをヒトIgG1抗体重鎖Fc領域配列をコードする哺乳動物細胞発現プラスミドpCAGベクターに構築した。プラスミドで哺乳動物宿主細胞(例えばヒト胚腎細胞HEK293)をトランスフェクションし発現させ、全ヒト由来HCAb抗体上清を得た。ELISAを用いてHCAb抗体上清と組換えヒトCTLA4タンパクの結合を試験し、陽性HCAb抗体を同定した。これらのHCAb抗体をさらに同定し、ヒトCTLA4に対する結合能力、カニクイザルCTLA4に対する結合能力、CTLA4とB7‐1の結合を抑制する能力などのパラメータに基づいて、いくつかの好ましい候補HCAb抗体分子を選択した。その後、候補HCAb抗体分子の配列解析と最適化を行い、数個の変異体配列を得た。HCAb抗体のVH配列とヒトのIgG1重鎖Fc配列を融合発現し、全ヒト由来の組換えHCAb抗体分子を得た。抗CTLA4の組換え全ヒト由来HCAb抗体を表39に示す。
実施例3.3．抗PD-L1のIgG抗体及び抗CTLA4のHCAb抗体を用いた二重特異性抗体分子の構築
本実施例は、抗PD‐L1のIgG抗体PR000070またはPR000265の抗原結合ドメインFabと、抗CTLA4のHCAb抗体PR000184の抗原結合ドメインVHを用いて、多種類の構造の抗PD‐L1×CTLA4二重特異性抗体分子を構築した。
本実施例は、抗PD‐L1のIgG抗体PR000070またはPR000265の抗原結合ドメインFabと、抗CTLA4のHCAb抗体PR000184の抗原結合ドメインVHを用いて、多種類の構造の抗PD‐L1×CTLA4二重特異性抗体分子を構築した。
本実施例及び下記の実施例において、抗PD‐L1の陽性対照分子は、抗PD‐L1のIgGモノクローナル抗体PR000070又はPR000416又はPR000265であり、PD‐L1×CTLA4二重抗体分子のPD‐L1端の親モノクローナル抗体である。PR000070、PR000265、及びPR000416は、同じ抗PD‐L1モノクローナル抗体に由来する。PR000070とPR000265はいずれもヒトIgG1サブクラスであり、そのFc領域にN297A突然変異があり、それらは重鎖可変領域VHに1つのアミノ酸突然変異に係る差異があるだけである。PR000265とPR000416はいずれもヒトIgG1サブタイプであり、同じFab構造を有しており、PR000265のFc領域にN297A突然変異がある点だけが異なる。
本実施例及び下記の実施例において、抗CTLA4の陽性対照分子は抗CTLA4のHCAbモノクローナル抗体PR000184であり、PD‐L1×CTLA4二重抗体分子のCTLA4端の親モノクローナル抗体でもある。
実施例3.3.1．Fab-HCAb対称構造分子の構築
抗PD‐L1のIgG抗体と抗CTLA4の重鎖抗体を用いて、実施例1.1に記載の構造に従ってFab‐HCAb対称構造のPD‐L1×CTLA4二重抗体分子を設計し、表3‐1にまとめた。そして、実施例2に記載の方法に従って、抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表3‐2にまとめた。
抗PD‐L1のIgG抗体と抗CTLA4の重鎖抗体を用いて、実施例1.1に記載の構造に従ってFab‐HCAb対称構造のPD‐L1×CTLA4二重抗体分子を設計し、表3‐1にまとめた。そして、実施例2に記載の方法に従って、抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表3‐2にまとめた。
実施例3.3.2．IgG-VH四価対称構造分子の構築
抗PD‐L1のIgG抗体と抗CTLA4の重鎖抗体を用いて、実施例1.2に記載の構造に従ってIgG‐VH四価対称構造のPD‐L1×CTLA4二重抗体分子を設計し、表33にまとめた。そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表34にまとめた。
抗PD‐L1のIgG抗体と抗CTLA4の重鎖抗体を用いて、実施例1.2に記載の構造に従ってIgG‐VH四価対称構造のPD‐L1×CTLA4二重抗体分子を設計し、表33にまとめた。そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表34にまとめた。
実施例3.3.3. 2xVH-IgG六価対称構造分子の構築
抗PD‐L1のIgG抗体と抗CTLA4の重鎖抗体を用いて、実施例1.4に記載の構造に従って2xVH‐IgG六価対称構造のPD‐L1×CTLA4二重抗体分子を設計し、表35にまとめた。そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表36にまとめた。
抗PD‐L1のIgG抗体と抗CTLA4の重鎖抗体を用いて、実施例1.4に記載の構造に従って2xVH‐IgG六価対称構造のPD‐L1×CTLA4二重抗体分子を設計し、表35にまとめた。そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表36にまとめた。
実施例3.3.4. Fab-Fc-VH二価非対称構造分子の構築
抗PD‐L1のIgG抗体と抗CTLA4の重鎖抗体を用いて、実施例1.4に記載の構造に従ってFab‐FC‐VH二価非対称構造のPD‐L1×CTLA4二重抗体分子を設計し、表37にまとめた。そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表38にまとめた。
抗PD‐L1のIgG抗体と抗CTLA4の重鎖抗体を用いて、実施例1.4に記載の構造に従ってFab‐FC‐VH二価非対称構造のPD‐L1×CTLA4二重抗体分子を設計し、表37にまとめた。そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表38にまとめた。
実施例3.3.5. PD-L1×CTLA4二重抗体分子及び対照分子の配列リスト
表3‐9、表3‐10及び表3‐11は、本実施例によって構築されたPD‐L1×CTLA4二重抗体分子及び対応するPD‐L1モノクローナル抗体、CTLA4モノクローナル抗体などの親モノクローナル抗体分子及び対照分子の配列に対応する配列番号を示す。表3‐11中の構造番号は、表1‐1及び図1に対応する。表3‐12は、二重特異性抗体分子の第1及び第2抗原結合ドメインに対応するCDR配列の配列番号を示す。
表3‐9、表3‐10及び表3‐11は、本実施例によって構築されたPD‐L1×CTLA4二重抗体分子及び対応するPD‐L1モノクローナル抗体、CTLA4モノクローナル抗体などの親モノクローナル抗体分子及び対照分子の配列に対応する配列番号を示す。表3‐11中の構造番号は、表1‐1及び図1に対応する。表3‐12は、二重特異性抗体分子の第1及び第2抗原結合ドメインに対応するCDR配列の配列番号を示す。
実施例3.4．CTLA4との結合
本実施例は、PD‐L1×CTLA4二重抗体分子がCTLA4と結合する活性を研究するためである。
本実施例は、PD‐L1×CTLA4二重抗体分子がCTLA4と結合する活性を研究するためである。
実施例3.4.1．ヒトCTLA4細胞外領域組換えタンパク質との結合
抗体分子がヒトCTLA4組換えタンパク質に結合する能力を、酵素結合免疫吸着反応ELISAを用いて試験した。具体的には、まず2μg/mLのヒトCTLA4-Hisタンパク質(ACRO Biosystems，#CT 4-H5229)を96ウェルプレートに100μL/ウェルで包み、4℃で一晩過ごした。その後、PBST緩衝液(0.05%Tween-20を含むPBS緩衝液)で3回すすぎ、次いで閉鎖液(5%脱脂粉乳を含むPBS緩衝液)を加えて37℃で1時間インキュベートした。次にPBST緩衝液で3回すすぐ。その後、最高最終濃度30nMの5倍の濃度勾配で希釈した抗体分子を100μL/ウェルで加え、合計8つの濃度があり、均一に混合し、37℃で1時間インキュベートした；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。次にPBST緩衝液で3回すすぐ。その後、HRP標識ヤギ抗ヒトIgG Fc二次抗体(Sigma，#A0170，1：5000希釈)を100μL／ウェルで加え、37℃で0.5時間インキュベートした。次にPBST緩衝液で3回すすぐ。その後、TMB発色液を100μL/ウェルで加えて15分間反応させた。最後に終止液を加えて反応を中止した。Enspire（登録商標）マルチファンクションリーダ(Perkin Elmer，Inc.)で450nMで光吸収値(OD値)を読み取る。アプリケーションソフトウェアGraphPad Prism 8でデータ処理と作図分析を行い、4パラメータ非線形フィッティングにより結合曲線やEC50値などのパラメータを得る。
抗体分子がヒトCTLA4組換えタンパク質に結合する能力を、酵素結合免疫吸着反応ELISAを用いて試験した。具体的には、まず2μg/mLのヒトCTLA4-Hisタンパク質(ACRO Biosystems，#CT 4-H5229)を96ウェルプレートに100μL/ウェルで包み、4℃で一晩過ごした。その後、PBST緩衝液(0.05%Tween-20を含むPBS緩衝液)で3回すすぎ、次いで閉鎖液(5%脱脂粉乳を含むPBS緩衝液)を加えて37℃で1時間インキュベートした。次にPBST緩衝液で3回すすぐ。その後、最高最終濃度30nMの5倍の濃度勾配で希釈した抗体分子を100μL/ウェルで加え、合計8つの濃度があり、均一に混合し、37℃で1時間インキュベートした；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。次にPBST緩衝液で3回すすぐ。その後、HRP標識ヤギ抗ヒトIgG Fc二次抗体(Sigma，#A0170，1：5000希釈)を100μL／ウェルで加え、37℃で0.5時間インキュベートした。次にPBST緩衝液で3回すすぐ。その後、TMB発色液を100μL/ウェルで加えて15分間反応させた。最後に終止液を加えて反応を中止した。Enspire（登録商標）マルチファンクションリーダ(Perkin Elmer，Inc.)で450nMで光吸収値(OD値)を読み取る。アプリケーションソフトウェアGraphPad Prism 8でデータ処理と作図分析を行い、4パラメータ非線形フィッティングにより結合曲線やEC50値などのパラメータを得る。
本実施例において、陽性対照分子は抗CTLA4のHCAbモノクローナル抗体PR000184であり、PD‐L1×CTLA4二重抗体分子のCTLA4端の親モノクローナル抗体でもある。
図2及び表3‐13に示すように、IgG‐VH四価対称構造の二重抗体分子がCTLA4と結合する能力は、抗PD‐L1のIgGに対する抗CTLA4のVH端の相対位置に関係している。VHがIgGの重鎖N端(PR000300)または軽鎖N端(PR000301)にある場合、二重抗体分子がCTLA4と結合するEC50値は親モノクローナル抗体PR000184と類似しており、やや優れている。VHがIgGの重鎖C端にある場合(PR000303)、二重抗体分子がCTLA4と結合するEC50値は親モノクローナル抗体PR000184のものと比較して2.6倍弱く；VHがIgGの軽鎖C端(PR000302)にある場合、二重抗体分子がCTLA4と結合する能力は明らかに弱まった。これは、IgG上のVHの相対位置を調整することにより、VHが標的を結合する能力を調整することができることを示している。
実施例3.4.2．ヒトCTLA4を高発現するCHO-K1細胞CHO-K1/hCTLA4またはヒトCTLA4を高発現するHEK293細胞HEK293/hCTLA4との結合
抗体分子の、ヒトCTLA4を高発現するCHO-K1細胞株CHO-K1/hCTLA4(KYINNO、KC-1406)またはヒトCTLA4を高発現するHEK293T細胞株HEK293/hCTLA4(KYINNO、KC-0209)などの細胞と結合する能力について、フローサイトメトリーFACSを用いて試験した。具体的には、CHO-K1/hCTLA4とHEK293/hCTLA4細胞を消化し、それぞれF12K培地とDMEM培地で再懸濁する；細胞密度を1×106細胞/mLに調整した。次いで細胞を96ウェルVプレート(Corning，#3894)に100μL/ウェルで播種し、4℃で5分間遠心分離し、上清を廃棄した。その後、勾配希釈された抗体分子を100μL/ウェルで96ウェルプレートに添加し、均一に混合し、抗体分子が最高最終濃度300nMから5倍濃度勾配で希釈された合計8つの濃度、または最高最終濃度100nMから4倍濃度勾配で希釈された合計8つの濃度に希釈し；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。細胞を4℃に置き、遮光して1時間インキュベートした。その後、100μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液(0.5%BSA含有PBS緩衝液)を加えて細胞を2回すすぎ、4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に、さらに100μL/ウェルで蛍光二次抗体(Alexa Fluor 488 anti-human IgGFc、Biolegend、#409322、1：1000希釈)を加え、4℃に放置し、1時間遮光して培養した。その後、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を加えて細胞を2回すすぎ、その後4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を添加し、細胞を再懸濁した。BD FACS CANTOIIフローサイトメータまたはACEA NovoCyteフローサイトメータを用いて蛍光発光信号値を読み取り、ソフトウェアFlowJov 10(FlowJo，LLC)を用いてデータを処理し分析した。ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、4パラメータの非線形フィッティングにより、抗体の標的細胞に対する結合曲線及びEC50値などのパラメータを得た。
抗体分子の、ヒトCTLA4を高発現するCHO-K1細胞株CHO-K1/hCTLA4(KYINNO、KC-1406)またはヒトCTLA4を高発現するHEK293T細胞株HEK293/hCTLA4(KYINNO、KC-0209)などの細胞と結合する能力について、フローサイトメトリーFACSを用いて試験した。具体的には、CHO-K1/hCTLA4とHEK293/hCTLA4細胞を消化し、それぞれF12K培地とDMEM培地で再懸濁する；細胞密度を1×106細胞/mLに調整した。次いで細胞を96ウェルVプレート(Corning，#3894)に100μL/ウェルで播種し、4℃で5分間遠心分離し、上清を廃棄した。その後、勾配希釈された抗体分子を100μL/ウェルで96ウェルプレートに添加し、均一に混合し、抗体分子が最高最終濃度300nMから5倍濃度勾配で希釈された合計8つの濃度、または最高最終濃度100nMから4倍濃度勾配で希釈された合計8つの濃度に希釈し；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。細胞を4℃に置き、遮光して1時間インキュベートした。その後、100μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液(0.5%BSA含有PBS緩衝液)を加えて細胞を2回すすぎ、4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に、さらに100μL/ウェルで蛍光二次抗体(Alexa Fluor 488 anti-human IgGFc、Biolegend、#409322、1：1000希釈)を加え、4℃に放置し、1時間遮光して培養した。その後、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を加えて細胞を2回すすぎ、その後4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を添加し、細胞を再懸濁した。BD FACS CANTOIIフローサイトメータまたはACEA NovoCyteフローサイトメータを用いて蛍光発光信号値を読み取り、ソフトウェアFlowJov 10(FlowJo，LLC)を用いてデータを処理し分析した。ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、4パラメータの非線形フィッティングにより、抗体の標的細胞に対する結合曲線及びEC50値などのパラメータを得た。
本実施例において、陽性対照分子は抗CTLA4のHCAbモノクローナル抗体PR000184であり、PD‐L1×CTLA4二重抗体分子のCTLA4端の親モノクローナル抗体でもある。Ipilimumab類似体も陽性対照分子として使用する。結果は図3、図4、表3‐14、表3‐15に表示される。
図3(A‐B)及び図4(A)に示すように、IgG‐VH四価対称構造の二重抗体分子がCTLA4と結合する能力は、抗PD‐L1のIgGに対する抗CTLA4のVH端の相対位置に関係している。VHがIgGの重鎖N端(PR000300、PR001573)または軽鎖N端(PR000301、PR001574、PR001577)にある場合、二重抗体分子がCTLA4と結合するEC50値は親モノクローナル抗体PR000184と類似またはやや弱いが、FACS上のMFI最大値は親モノクローナル抗体PR000184または陽性対照Ipilimumabよりも高い。VHがIgGの重鎖C端(PR000303、PR000401、PR000402)にある場合、二重抗体分子がCTLA4と結合するEC50値は親モノクローナル抗体PR000184のものよりやや弱い。VHがIgGの軽鎖C端(PR000302)にある場合、二重抗体分子がCTLA4と結合する能力は明らかに弱まった。これは、IgG上のVHの相対位置を調整することにより、VHが標的を結合する能力を調整することができることを示している。
図3(C)に示すように、2xVH‐IgG六価対称構造の二重抗体分子がCTLA4と結合するEC50値は親モノクローナル抗体PR000184のものと類似しており、MFI最大値は親モノクローナル抗体PR000184のものより低い。これは、2xVH‐IgGの六価対称構造が4つのCTLA4と結合する結合部位を含み、親モノクローナル抗体PR000184のCTLA4結合部位より2倍多く、同じ数のCTLA4分子を結合するのに必要な二重抗体分子が親モノクローナル抗体よりも少ないためであり、MFI値は二重抗体分子のFc領域に結合する蛍光二次抗体分子の数と関連し、さらに二重抗体分子のMFI最大値が親モノクローナル抗体よりも低いことを示す。
図3(D)に示すように、Fab‐Fc‐VH非対称構造の二重抗体分子PR001609とPR001610は1つのCTLA4結合ドメインのみを含むため、そのCTLA4と結合する能力は二価の親モノクローナル抗体PR000184より弱い。
図3(E)及び図4(B)に示すように、Fab‐HCAb対称構造の二重抗体分子がCTLA4と結合する能力は二価の親モノクローナル抗体PR000184より弱いが、MFI最大値は陽性対照Ipilimumabと類似している。
実施例3.5．CTLA4とそのリガンドとの結合を遮断すること
本実施例は、PD‐L1×CTLA4二重抗体分子がCTLA4とそのリガンドB7‐1／CD80との結合を抑制する活性を研究するためである。
本実施例は、PD‐L1×CTLA4二重抗体分子がCTLA4とそのリガンドB7‐1／CD80との結合を抑制する活性を研究するためである。
実施例3.5.1．ヒトCTLA4タンパク質とそのリガンドタンパク質との結合を遮断すること
抗体分子がヒトCTLA4タンパク質とそのリガンドB7‐1／CD80との結合を抑制する活性を酵素結合免疫吸着反応ELISAを用いて測定した。具体的には、まず2μg/mLのタンパク質ヒトB7‐1‐Fc(ACRO Biosystems，#B71‐H5259)を96ウェルプレートに100μL／ウェルで包み、4℃で一晩過ごした。その後、PBST緩衝液(0.05%Tween-20を含むPBS緩衝液)で3回すすぎ、次いで閉鎖液(5%脱脂粉乳を含むPBS緩衝液)を加えて37℃で1時間インキュベートした。その後、最高最終濃度180nMの4倍の濃度勾配で希釈した抗体分子を90μL/ウェルで加え、合計7つの濃度があり、均一に混合し、37℃で20分間インキュベートした；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。その後、ビオチン化ヒトCTLA4-Fcタンパク質(ACRO Biosystems、#CT4-H82F3)を10μL/ウェルで添加し、その最終濃度を0.25μg/mlとし、37℃で1時間インキュベートした。次にPBST緩衝液で3回すすぐ。次に100μL/ウェルで標識Precision Protein（登録商標） StrepTactin-HRP Conjugate(Bio-RAD、#1610380、1：4000希釈)を追加し、37℃で0.5時間インキュベートした。次にPBST緩衝液で3回すすぐ。その後、TMB発色液を100μL/ウェルで加えて15分間反応させた。最後に終止液を加えて反応を中止した。Enspire（登録商標） マルチファンクションリーダ(Perkin Elmer，Inc.)で490nMで光吸収値(OD値)を読み取る。アプリケーションソフトウェアGraphPad Prism 8でデータ処理と作図分析を行い、OD値を抑制率に変換し、4パラメータの非線形フィッティングにより、抑制曲線、IC50値と最大抑制率などのパラメータを得る。
抗体分子がヒトCTLA4タンパク質とそのリガンドB7‐1／CD80との結合を抑制する活性を酵素結合免疫吸着反応ELISAを用いて測定した。具体的には、まず2μg/mLのタンパク質ヒトB7‐1‐Fc(ACRO Biosystems，#B71‐H5259)を96ウェルプレートに100μL／ウェルで包み、4℃で一晩過ごした。その後、PBST緩衝液(0.05%Tween-20を含むPBS緩衝液)で3回すすぎ、次いで閉鎖液(5%脱脂粉乳を含むPBS緩衝液)を加えて37℃で1時間インキュベートした。その後、最高最終濃度180nMの4倍の濃度勾配で希釈した抗体分子を90μL/ウェルで加え、合計7つの濃度があり、均一に混合し、37℃で20分間インキュベートした；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。その後、ビオチン化ヒトCTLA4-Fcタンパク質(ACRO Biosystems、#CT4-H82F3)を10μL/ウェルで添加し、その最終濃度を0.25μg/mlとし、37℃で1時間インキュベートした。次にPBST緩衝液で3回すすぐ。次に100μL/ウェルで標識Precision Protein（登録商標） StrepTactin-HRP Conjugate(Bio-RAD、#1610380、1：4000希釈)を追加し、37℃で0.5時間インキュベートした。次にPBST緩衝液で3回すすぐ。その後、TMB発色液を100μL/ウェルで加えて15分間反応させた。最後に終止液を加えて反応を中止した。Enspire（登録商標） マルチファンクションリーダ(Perkin Elmer，Inc.)で490nMで光吸収値(OD値)を読み取る。アプリケーションソフトウェアGraphPad Prism 8でデータ処理と作図分析を行い、OD値を抑制率に変換し、4パラメータの非線形フィッティングにより、抑制曲線、IC50値と最大抑制率などのパラメータを得る。
本実施例において、陽性対照分子は抗CTLA4のHCAbモノクローナル抗体PR000184であり、PD‐L1×CTLA4二重抗体分子のCTLA4端の親モノクローナル抗体でもある。その結果を図5及び表3‐16に示す。
図5に示すように、IgG‐VH四価対称構造の二重抗体分子はいずれもCTLA4タンパク質とそのリガンドタンパク質の結合を遮断する能力(抑制活性)があり、いずれも100%近くの抑制率を達成することができるが、その抑制活性のIC50値は抗PD‐L1のIgGに対する抗CTLA4のVH端の相対位置と関係がある。VHがIgGの重鎖N端(PR000300)または軽鎖N端(PR000301)にある場合、CTLA4に対する二重抗体分子の抑制活性は親モノクローナル抗体PR000184と類似している。VHがIgGの重鎖C端(PR000303)にある場合、二重抗体分子のCTLA4に対する抑制活性は、親モノクローナル抗体PR000184に比べてやや弱い。VHがIgGの軽鎖C端(PR000302)にある場合、二重抗体分子が活性を抑制するIC50値は親モノクローナル抗体PR000184の4倍弱である。これは、IgG上のVHの相対位置を調整することにより、VHの標的遮断能力を調整することができることを示している。
実施例3.5.2．ヒトCTLA4細胞とそのリガンドタンパク質との結合を遮断すること
抗体分子がCTLA4を発現する細胞とそのリガンドB7‐1／CD80との結合を抑制する活性を、フローサイトメトリーFACSを用いて測定した。具体的には、ヒトCTLA4を高発現するCHO‐K1細胞株CHO‐K1／hCTLA4(KYINNO、KC‐1406)を消化し、F12K培地で再懸濁した。細胞密度を1×106細胞/mLに調整し、FACS緩衝液(2%FBS含有PBS緩衝液)中に37℃で15分間放置した。FACS緩衝液を200μL/ウェルで96ウェルプレートに加えて閉鎖し、37℃で1時間インキュベートした後、ウェル内の閉鎖液を廃棄した。次いで、CHO‐K1/hCTLA4細胞を96ウェルプレート(2×105細胞/ウェル)に200μL/ウェルで播種し、500gの回転速度で4℃で5分間遠心分離し、上清を廃棄した。その後、勾配希釈された抗体分子を100μL/ウェルで96ウェルプレートに添加し、均一に混合し、抗体分子は最高最終濃度200nMから3倍濃度勾配で希釈された合計8つの濃度、または最高最終濃度400nMから5倍濃度勾配で希釈された合計8つの濃度に希釈し；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。次に、1μg/mLのビオチン化リガンドタンパク質ヒトB7-1-Fc(ACRO Biosystems、#B71-H82F2)を100μL/ウェルで96ウェルプレートに加え、均一に混合した。96ウェルプレートを4℃に置き、遮光して1.5時間インキュベートした。その後、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を加えて細胞を2回すすぎ、4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に100μL/ウェルで蛍光標識(Streptavidin，Alexa Fluor（登録商標） 488 conjugate，Thermo，#S11223，1：500希釈)を添加し、4℃に放置し、遮光して1時間インキュベートした。その後、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を加えて細胞を3回すすぎ、4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を添加して、細胞を再懸濁した。BD FACS CANTOIIフローサイトメータまたはACEA NovoCyteフローサイトメータを用いて蛍光発光信号値を読み取り、ソフトウェアFlowJov 10(FlowJo，LLC)を用いてデータを処理し分析した。ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、蛍光信号値MFIを抑制率に変換し、4パラメータの非線形フィッティングにより、抑制曲線、IC50値と最大抑制率などのパラメータを得た。
抗体分子がCTLA4を発現する細胞とそのリガンドB7‐1／CD80との結合を抑制する活性を、フローサイトメトリーFACSを用いて測定した。具体的には、ヒトCTLA4を高発現するCHO‐K1細胞株CHO‐K1／hCTLA4(KYINNO、KC‐1406)を消化し、F12K培地で再懸濁した。細胞密度を1×106細胞/mLに調整し、FACS緩衝液(2%FBS含有PBS緩衝液)中に37℃で15分間放置した。FACS緩衝液を200μL/ウェルで96ウェルプレートに加えて閉鎖し、37℃で1時間インキュベートした後、ウェル内の閉鎖液を廃棄した。次いで、CHO‐K1/hCTLA4細胞を96ウェルプレート(2×105細胞/ウェル)に200μL/ウェルで播種し、500gの回転速度で4℃で5分間遠心分離し、上清を廃棄した。その後、勾配希釈された抗体分子を100μL/ウェルで96ウェルプレートに添加し、均一に混合し、抗体分子は最高最終濃度200nMから3倍濃度勾配で希釈された合計8つの濃度、または最高最終濃度400nMから5倍濃度勾配で希釈された合計8つの濃度に希釈し；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。次に、1μg/mLのビオチン化リガンドタンパク質ヒトB7-1-Fc(ACRO Biosystems、#B71-H82F2)を100μL/ウェルで96ウェルプレートに加え、均一に混合した。96ウェルプレートを4℃に置き、遮光して1.5時間インキュベートした。その後、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を加えて細胞を2回すすぎ、4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に100μL/ウェルで蛍光標識(Streptavidin，Alexa Fluor（登録商標） 488 conjugate，Thermo，#S11223，1：500希釈)を添加し、4℃に放置し、遮光して1時間インキュベートした。その後、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を加えて細胞を3回すすぎ、4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を添加して、細胞を再懸濁した。BD FACS CANTOIIフローサイトメータまたはACEA NovoCyteフローサイトメータを用いて蛍光発光信号値を読み取り、ソフトウェアFlowJov 10(FlowJo，LLC)を用いてデータを処理し分析した。ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、蛍光信号値MFIを抑制率に変換し、4パラメータの非線形フィッティングにより、抑制曲線、IC50値と最大抑制率などのパラメータを得た。
本実施例において、陽性対照分子は抗CTLA4のHCAbモノクローナル抗体PR000184であり、PD‐L1×CTLA4二重抗体分子のCTLA4端の親モノクローナル抗体でもある。結果を図6と表3‐17に示す。
図6(A‐B)に示すように、IgG‐VH四価対称構造の二重抗体分子のCTLA4に対する抑制活性は、抗PD‐L1のIgGに対する抗CTLA4のVH端の相対位置に関係している。VHがIgGの重鎖N端(PR000300、PR001573)または軽鎖N端(PR000301、PR001574、PR001577)にある場合、二重抗体分子が活性を抑制するIC50値は親モノクローナル抗体PR000184と類似しており、いずれも100%近くの抑制率を達成することができ、PR000301は親モノクローナル抗体PR000184よりもやや強い。VHがIgGの重鎖C端(PR000303)にある場合、二重抗体分子が活性を抑制するIC50値は親モノクローナル抗体PR000184に比べてやや弱く、最大抑制率は約83%である。VHがIgGの軽鎖C端(PR000302)にある場合、二重抗体分子の抑制活性は明らかに弱まり、その最大抑制率は49%にすぎない。これは、IgG上のVHの相対位置を調整することにより、VHの標的遮断能力を調整することができることを示している。一方、同じ二重抗体分子の、CTLA4細胞に対する遮断実験とCTLA4タンパク質に対する遮断実験における異なる抑制活性の結果は、細胞膜上のタンパク質の空間障害の影響を反映している可能性がある。
図6(C)に示すように、2xVH‐IgG六価対称構造の二重抗体分子のCTLA4に対する抑制活性は、親モノクローナル抗体PR000184と類似している。
図6(D)に示すように、Fab‐Fc‐VH非対称構造の二重抗体分子PR001609とPR001610はいずれも1つのCTLA4結合ドメインのみを含むため、CTLA4に対する抑制活性は2価の親モノクローナル抗体PR000184より明らかに弱い。
実施例3.6．CTLA4媒介のADCC効果
本実施例は、ヒトCTLA4を高発現する細胞293F‐hCTLA4(CHEMPARTNER)に対するPD‐L1×CTLA4二重抗体分子の抗体依存性の細胞媒介の細胞毒性(ADCC)を調べることである。第一段階に、標的細胞をDELFIA BATDA(Perkin Elmer，#C136‐100)で標識する。具体的な標識方法は以下の通りである：1×106標的細胞を2μL DELFIA BATDA試薬で標識した；37℃で、CO2培養箱中で20分間インキュベートした；PBSで4回洗浄し、1000rpmで5分間遠心分離した。最後の洗浄後、沈殿物を完全培地に再懸濁し、細胞密度を1×105/mlに調整した。第二段階に、標識された標的細胞を96ウェルプレート(Corning，#3599)に100μL／ウェルで播種し、その後、最高最終濃度0.8nMの5倍濃度勾配で希釈した抗体分子を50μL/ウェルで加え、合計7つの濃度があり、均一に混合した；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とし、37℃、5%CO2培養箱中で10分間インキュベートした。第三段階に、NK-92 MI/CD16a細胞(CHEMPARTNER)をエフェクター細胞として収集し、NK-92 MI/CD16a細胞密度を6×105/mlに調整する。次いで、50μL/ウェルで96ウェルプレートに添加し、エフェクター細胞：標的細胞＝3：1である。次いで、37℃、5%CO2培養箱中で2時間インキュベートした。第四段階に、500gで5分間遠心分離し、各ウェルから25μL上清を取って新しい96ウェル検出プレートに加えた。続いて200μL/ウェルでDELFIA（登録商標） Europium溶液(Perkin Elmer，#C135‐100)を添加し、室温でプレートを250rpmで15分間揺動した。最後に、EnVision（登録商標）2015マルチファンクションリーダ(Perkin Elmer，Inc.)で蛍光値を測定した。
本実施例は、ヒトCTLA4を高発現する細胞293F‐hCTLA4(CHEMPARTNER)に対するPD‐L1×CTLA4二重抗体分子の抗体依存性の細胞媒介の細胞毒性(ADCC)を調べることである。第一段階に、標的細胞をDELFIA BATDA(Perkin Elmer，#C136‐100)で標識する。具体的な標識方法は以下の通りである：1×106標的細胞を2μL DELFIA BATDA試薬で標識した；37℃で、CO2培養箱中で20分間インキュベートした；PBSで4回洗浄し、1000rpmで5分間遠心分離した。最後の洗浄後、沈殿物を完全培地に再懸濁し、細胞密度を1×105/mlに調整した。第二段階に、標識された標的細胞を96ウェルプレート(Corning，#3599)に100μL／ウェルで播種し、その後、最高最終濃度0.8nMの5倍濃度勾配で希釈した抗体分子を50μL/ウェルで加え、合計7つの濃度があり、均一に混合した；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とし、37℃、5%CO2培養箱中で10分間インキュベートした。第三段階に、NK-92 MI/CD16a細胞(CHEMPARTNER)をエフェクター細胞として収集し、NK-92 MI/CD16a細胞密度を6×105/mlに調整する。次いで、50μL/ウェルで96ウェルプレートに添加し、エフェクター細胞：標的細胞＝3：1である。次いで、37℃、5%CO2培養箱中で2時間インキュベートした。第四段階に、500gで5分間遠心分離し、各ウェルから25μL上清を取って新しい96ウェル検出プレートに加えた。続いて200μL/ウェルでDELFIA（登録商標） Europium溶液(Perkin Elmer，#C135‐100)を添加し、室温でプレートを250rpmで15分間揺動した。最後に、EnVision（登録商標）2015マルチファンクションリーダ(Perkin Elmer，Inc.)で蛍光値を測定した。
殺傷比率は次の式に基づいて計算される。
殺傷率(%)＝(ER-ETSR)/(TMR-ETSR)*100%
ここで、次の操作を行う。
ER＝実験ウェル(抗体＋エフェクター細胞＋標的細胞)、ETSR＝標的細胞とエフェクター細胞を混合した自発放出ウェル(エフェクター細胞＋標的細胞)、TMR＝標的細胞最大放出ウェル(標的細胞＋溶解液)
ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、4パラメータの非線形フィッティングにより、抗体の標的細胞に対する殺傷率曲線とEC50及び最大殺傷率などのパラメータを得た。
殺傷率(%)＝(ER-ETSR)/(TMR-ETSR)*100%
ここで、次の操作を行う。
ER＝実験ウェル(抗体＋エフェクター細胞＋標的細胞)、ETSR＝標的細胞とエフェクター細胞を混合した自発放出ウェル(エフェクター細胞＋標的細胞)、TMR＝標的細胞最大放出ウェル(標的細胞＋溶解液)
ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、4パラメータの非線形フィッティングにより、抗体の標的細胞に対する殺傷率曲線とEC50及び最大殺傷率などのパラメータを得た。
本実施例において、陽性対照分子は抗CTLA4のHCAbモノクローナル抗体PR000184(hIgG1サブクラス)であり、PD‐L1×CTLA4二重抗体分子のCTLA4端の親モノクローナル抗体でもある。陰性対照分子は、抗PD‐L1のモノクローナル抗体PR000416(hIgG1サブタイプ)であった。
図11及び表3‐18に示すように、二重抗体分子PR000300及びPR000301は、親モノクローナル抗体PR000184と類似のCTLA4に対する特異的なADCC作用を有する。
実施例3.7．PD-L1との結合
本実施例は、PD‐L1×CTLA4二重抗体分子がPD‐L1を結合する活性を研究するためである。
本実施例は、PD‐L1×CTLA4二重抗体分子がPD‐L1を結合する活性を研究するためである。
実施例3.7.1．ヒトPD-L1細胞外領域組換えタンパク質との結合
抗体分子がヒトPD‐L1組換えタンパク質に結合する能力を、酵素結合免疫吸着反応ELISAを用いて試験した。具体的には、まず2μg/mLのヒトPD‐L1‐Hisタンパク質(ACRO Biosystems，#PD1‐H5229)を96ウェルプレート(Corning，#9018)に100μL／ウェルで包み、4℃で一晩過ごした。その後、PBST緩衝液(0.05%Tween‐20を含むPBS緩衝液)で3回すすぎ、次いで2%BSAを含む閉鎖液を加え、37℃で1時間インキュベートした。閉鎖液を捨て、PBST緩衝液で3回すすぐ。その後、最高最終濃度30nMの5倍の濃度勾配で希釈した抗体分子を100μL/ウェルで加え、8つの濃度があり、均一に混合し、37℃で1時間インキュベートした；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。次にPBST緩衝液で3回すすぐ。その後、HRP標識ヤギ抗ヒトIgG Fc二次抗体(Sigma，#A0170，1：5000希釈)を100μL／ウェルで加え、37℃で0.5時間インキュベートした。次にPBST緩衝液で3回すすぐ。その後、TMB発色液を100μL/ウェルで加えて15分間反応させた。最後に終止液を加えて反応を中止した。Enspire（登録商標） マルチファンクションリーダ(PerkinElmer，Inc.)で450nMで光吸収値(OD値)を読み取る。
抗体分子がヒトPD‐L1組換えタンパク質に結合する能力を、酵素結合免疫吸着反応ELISAを用いて試験した。具体的には、まず2μg/mLのヒトPD‐L1‐Hisタンパク質(ACRO Biosystems，#PD1‐H5229)を96ウェルプレート(Corning，#9018)に100μL／ウェルで包み、4℃で一晩過ごした。その後、PBST緩衝液(0.05%Tween‐20を含むPBS緩衝液)で3回すすぎ、次いで2%BSAを含む閉鎖液を加え、37℃で1時間インキュベートした。閉鎖液を捨て、PBST緩衝液で3回すすぐ。その後、最高最終濃度30nMの5倍の濃度勾配で希釈した抗体分子を100μL/ウェルで加え、8つの濃度があり、均一に混合し、37℃で1時間インキュベートした；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。次にPBST緩衝液で3回すすぐ。その後、HRP標識ヤギ抗ヒトIgG Fc二次抗体(Sigma，#A0170，1：5000希釈)を100μL／ウェルで加え、37℃で0.5時間インキュベートした。次にPBST緩衝液で3回すすぐ。その後、TMB発色液を100μL/ウェルで加えて15分間反応させた。最後に終止液を加えて反応を中止した。Enspire（登録商標） マルチファンクションリーダ(PerkinElmer，Inc.)で450nMで光吸収値(OD値)を読み取る。
アプリケーションソフトウェアGraphPad Prism 8でデータ処理と作図分析を行い、4パラメータ非線形フィッティングにより結合曲線やEC50値などのパラメータを得る。
本実施例において、陽性対照分子は抗PD‐L1のモノクローナル抗体PR000070であり、PD‐L1×CTLA4二重抗体分子のPD‐L1端の親モノクローナル抗体でもある。
図7及び表3‐19に示すように、IgG‐VH四価対称構造の二重抗体分子がPD‐L1を結合する能力は、親モノクローナル抗体PR00070と類似している。これは、抗CTLA4のVHドメインはPD‐L1のFabドメインに対して顕著な影響がないことを示している。
実施例3.7.2．ヒトPD-L1を高発現するCHO-K1細胞CHO-K1/hPDL1及びヒトPD-L1を高発現する腫瘍細胞MDA-MB-231との結合
抗体分子の、ヒトPD‐L1を高発現するCHO‐K1細胞株CHO‐K1／hPDL1(GENSCRIPT、M00543)またはヒトPD‐L1を高発現する腫瘍細胞系MDA‐MB‐231(ATCC、HTB‐26)などの細胞との結合能力について、フローサイトメトリー細胞法FACSを用いて試験した。具体的には、細胞を消化し、完全培地で再懸濁する；細胞密度を1×106細胞/mLに調整した。次いで細胞を96ウェルVプレート(Corning，#3894)に100μL/ウェルで播種し、4℃で5分間遠心分離し、上清を廃棄した。その後、勾配希釈された抗体分子を100μL/ウェルで96ウェルプレートに添加し、均一に混合し、抗体分子は最高最終濃度60nMから5倍濃度勾配で希釈された合計8つの濃度、または最高最終濃度300nMから5倍濃度勾配で希釈された合計8つの濃度、または最高最終濃度100nMから4倍濃度勾配で希釈された合計8つの濃度に希釈し；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。細胞を4℃に置き、遮光して1時間インキュベートした。その後、100μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液(0.5%BSA含有PBS緩衝液)を加えて細胞を2回すすぎ、4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に、さらに100μL／ウェルで蛍光二次抗体(Goat human lgG(H＋L)Alexa Fluor 488 conjunction，Thermo，#A11013，1：1000希釈)を加え、4℃に放置し、遮光して1時間インキュベートした。その後、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を加えて細胞を2回すすぎ、その後4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を添加して、細胞を再懸濁した。BD FACS CANTOIIフローサイトメータまたはACEA NovoCyteフローサイトメータを用いて蛍光発光信号値を読み取り、ソフトウェアFlowJov 10(FlowJo，LLC)を用いてデータを処理し分析した。ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、4パラメータの非線形フィッティングにより、抗体の標的細胞に対する結合曲線及びEC50値などのパラメータを得た。
抗体分子の、ヒトPD‐L1を高発現するCHO‐K1細胞株CHO‐K1／hPDL1(GENSCRIPT、M00543)またはヒトPD‐L1を高発現する腫瘍細胞系MDA‐MB‐231(ATCC、HTB‐26)などの細胞との結合能力について、フローサイトメトリー細胞法FACSを用いて試験した。具体的には、細胞を消化し、完全培地で再懸濁する；細胞密度を1×106細胞/mLに調整した。次いで細胞を96ウェルVプレート(Corning，#3894)に100μL/ウェルで播種し、4℃で5分間遠心分離し、上清を廃棄した。その後、勾配希釈された抗体分子を100μL/ウェルで96ウェルプレートに添加し、均一に混合し、抗体分子は最高最終濃度60nMから5倍濃度勾配で希釈された合計8つの濃度、または最高最終濃度300nMから5倍濃度勾配で希釈された合計8つの濃度、または最高最終濃度100nMから4倍濃度勾配で希釈された合計8つの濃度に希釈し；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。細胞を4℃に置き、遮光して1時間インキュベートした。その後、100μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液(0.5%BSA含有PBS緩衝液)を加えて細胞を2回すすぎ、4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に、さらに100μL／ウェルで蛍光二次抗体(Goat human lgG(H＋L)Alexa Fluor 488 conjunction，Thermo，#A11013，1：1000希釈)を加え、4℃に放置し、遮光して1時間インキュベートした。その後、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を加えて細胞を2回すすぎ、その後4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を添加して、細胞を再懸濁した。BD FACS CANTOIIフローサイトメータまたはACEA NovoCyteフローサイトメータを用いて蛍光発光信号値を読み取り、ソフトウェアFlowJov 10(FlowJo，LLC)を用いてデータを処理し分析した。ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、4パラメータの非線形フィッティングにより、抗体の標的細胞に対する結合曲線及びEC50値などのパラメータを得た。
本実施例において、陽性対照分子は抗PD‐L1のモノクローナル抗体PR000070またはPR000416(またはPR000265)であり、PD‐L1×CTLA4二重抗体分子のPD‐L1端の親モノクローナル抗体でもある。結果は、図8、図9、表3‐20、及び表3‐21に表示される。
図8(A‐B)と図9に示すように、IgG‐VH四価対称構造の二重抗体分子がPD‐L1に結合する能力は、対応する親モノクローナル抗体PR00070またはPR000416と類似しており、PD‐L1に結合するEC50の値が非常に近い。MFI最大値は、VHがIgGの軽鎖N端(PR000301、PR001574、PR001577)にある場合のみ、親モノクローナル抗体よりもわずかに低い。
図8(C)に示すように、2xVH‐IgG六価対称構造の二重抗体分子がPD‐L1を結合する能力は親モノクローナル抗体PR000416より低下し；VHがIgGの重鎖と軽鎖のN端に同時に接続されると、IgGのFab端の機能に明らかな影響を与えることを説明する。
図8(D)に示すように、Fab‐HCAb対称構造の二重抗体分子がPD‐L1を結合する能力は、親モノクローナル抗体PR000416と類似しており、類似のEC50値とMFI最大値を有する。これは、Fab‐HCAb対称構造を有する二重抗体分子の抗PD‐L1のFab端における構造がPD‐L1に対する結合能力を良好に保持できることを示している。
図8(E)に示すように、Fab‐Fc‐VH非対称構造の二重抗体分子PR001609とPR001610のPD‐L1結合ドメインは一価Fab構造であるが、そのPD‐L1を結合する能力は二価の親モノクローナル抗体と類似しており、MFI最大値は親モノクローナル抗体よりも高い。
実施例3.8．PD-L1とそのリガンドとの結合を遮断すること
本実施例は、PD‐L1×CTLA4二重抗体分子がPD‐L1とそのリガンドPD‐1との結合を抑制する活性を研究するためである。
本実施例は、PD‐L1×CTLA4二重抗体分子がPD‐L1とそのリガンドPD‐1との結合を抑制する活性を研究するためである。
実施例3.8.1．ヒトPD-L1細胞とそのリガンドタンパク質との結合を遮断すること
抗体分子がPD‐L1を発現する細胞とそのリガンドPD‐1との結合を抑制する活性を、フローサイトメトリーFACSを用いて測定した。具体的には、ヒトPD‐L1を高発現するCHO‐K1細胞株CHO‐K1／hPDL1(GENSCRIPT、M00543)を消化し、F12K培地で再懸濁し、細胞密度を2×106細胞/mLに調整し、37℃で15分間FACS緩衝液(1%BSAを含むPBS緩衝液)中に置いた。閉鎖緩衝液を200μL/ウェルで96ウェルプレートに添加し、37℃で1時間インキュベートした後、ウェル内の閉鎖液を廃棄した。次いで、CHO‐K1/hPDL1細胞を96ウェルプレート(1×105細胞/ウェル)に50μL/ウェルで播種した。その後、勾配希釈された抗体分子を100μL/ウェルで96ウェルプレートに添加し、均一に混合し、抗体分子は最高最終濃度100nMから5倍濃度勾配で希釈された合計8つの濃度で希釈することができ、hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。4℃に放置し、遮光して0.5時間インキュベートした。その後、PBS緩衝液を100μL/ウェルで添加し、500gの回転速度で4℃で5分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に、1μg/mL濃度のビオチン化リガンドタンパク質ヒトPD-1タンパク(ACRO Biosystems、#PD 1-H82F2)を50μL/ウェルで96ウェルプレートに加え、均一に混合した。96ウェルプレートを4℃に置き、遮光して0.5時間インキュベートした。その後、100μL/ウェルで予冷のPBS緩衝液を加えて細胞を2回すすぎ、その後4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に100μL/ウェルで蛍光二次抗体(PE Streptavidin，BD Biosciences，#554061，1：200希釈)を加え、4℃に放置し、遮光して0.5時間インキュベートした。その後、200μL/ウェルで予冷のPBS緩衝液を加えて細胞を2回すすぎ、その後4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を添加して、細胞を再懸濁した。BD FACS CANTOIIフローサイトメータまたはACEA NovoCyteフローサイトメータを用いて蛍光発光信号値を読み取り、ソフトウェアFlowJov 10(FlowJo，LLC)を用いてデータを処理し分析した。ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、蛍光信号値MFIを抑制率に変換し、4パラメータの非線形フィッティングにより、抑制曲線、IC50値と最大抑制率などのパラメータを得た。
抗体分子がPD‐L1を発現する細胞とそのリガンドPD‐1との結合を抑制する活性を、フローサイトメトリーFACSを用いて測定した。具体的には、ヒトPD‐L1を高発現するCHO‐K1細胞株CHO‐K1／hPDL1(GENSCRIPT、M00543)を消化し、F12K培地で再懸濁し、細胞密度を2×106細胞/mLに調整し、37℃で15分間FACS緩衝液(1%BSAを含むPBS緩衝液)中に置いた。閉鎖緩衝液を200μL/ウェルで96ウェルプレートに添加し、37℃で1時間インキュベートした後、ウェル内の閉鎖液を廃棄した。次いで、CHO‐K1/hPDL1細胞を96ウェルプレート(1×105細胞/ウェル)に50μL/ウェルで播種した。その後、勾配希釈された抗体分子を100μL/ウェルで96ウェルプレートに添加し、均一に混合し、抗体分子は最高最終濃度100nMから5倍濃度勾配で希釈された合計8つの濃度で希釈することができ、hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。4℃に放置し、遮光して0.5時間インキュベートした。その後、PBS緩衝液を100μL/ウェルで添加し、500gの回転速度で4℃で5分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に、1μg/mL濃度のビオチン化リガンドタンパク質ヒトPD-1タンパク(ACRO Biosystems、#PD 1-H82F2)を50μL/ウェルで96ウェルプレートに加え、均一に混合した。96ウェルプレートを4℃に置き、遮光して0.5時間インキュベートした。その後、100μL/ウェルで予冷のPBS緩衝液を加えて細胞を2回すすぎ、その後4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に100μL/ウェルで蛍光二次抗体(PE Streptavidin，BD Biosciences，#554061，1：200希釈)を加え、4℃に放置し、遮光して0.5時間インキュベートした。その後、200μL/ウェルで予冷のPBS緩衝液を加えて細胞を2回すすぎ、その後4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を添加して、細胞を再懸濁した。BD FACS CANTOIIフローサイトメータまたはACEA NovoCyteフローサイトメータを用いて蛍光発光信号値を読み取り、ソフトウェアFlowJov 10(FlowJo，LLC)を用いてデータを処理し分析した。ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、蛍光信号値MFIを抑制率に変換し、4パラメータの非線形フィッティングにより、抑制曲線、IC50値と最大抑制率などのパラメータを得た。
本実施例において、陽性対照分子は抗PD‐L1のモノクローナル抗体PR000070またはPR000416(またはPR000265)であり、PD‐L1×CTLA4二重抗体分子のPD‐L1端の親モノクローナル抗体でもある。結果を図10と表3‐22に示す。
図10(A‐B)に示すように、IgG‐VH四価対称構造の二重抗体分子のPD‐L1に対する抑制能力は、対応する親モノクローナル抗体PR000070またはPR000416と類似しており、親モノクローナル抗体に近いIC50値と最大抑制率を有する。IgGの軽鎖N端(PR001574、PR001577)にVHがある場合にのみ、IC50値は親モノクローナル抗体の2～3倍弱である。
図10(C)に示すように、2xVH‐IgG六価対称構造の二重抗体分子のPD‐L1に対する抑制活性は、親モノクローナル抗体より弱い；対応するIC50値は親モノクローナル抗体の4～6倍弱いが、同様の最大抑制率を達成することができる。
図10(D)に示すように、Fab‐HCAb対称構造の二重抗体分子のPD‐L1に対する抑制活性は親モノクローナル抗体と類似しており、親モノクローナル抗体と近いIC50値と最大抑制率を有する。
図10(E)に示すように、Fab‐Fc‐VH非対称構造の二重抗体分子PR001609とPR001610のPD‐L1結合ドメインは一価Fab構造であり、PD‐L1に対する抑制活性は二価の親モノクローナル抗体より弱い；対応するIC50値は親モノクローナル抗体の4～5倍弱いが、同様の最大抑制率を達成することができる。
実施例3.9．超抗原SEB刺激実験
本実施例は、PD‐L1×CTLA4二重抗体分子の外周血単一核細胞PBMCに対する活性化作用を研究するためである。第一段階に、分離されたヒトPBMC(MT‐BIO)細胞を100μL/ウェル(1×105細胞/ウェル)で96ウェルプレート(Corning，#3799)に添加し、その後、100μL/ウェルで異なる濃度の抗体分子を添加し、抗体の最終濃度は(100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM)であってもよく、または2つの抗体を特定の割合で混合し、2つの複合ウェルに添加してもよい。hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。37℃で30分間インキュベートした。次に超抗原Staphylococcal enterotoxin B(SEB)を50μL/ウェルで加え、最終濃度を100ng/mLまたは10ng/mLとした。37℃に置き、5%CO2培養箱中で96時間または120時間インキュベート後に上清を回収した。第二段階に、上清を収集してIL-2 ELISAキット(Biolegend，#431805)を用いて上清中のIL-2濃度を検出し、操作方法はキットの説明書を参照してください。アプリケーションソフトウェアGraphPad Prism 8で、データ処理と作図分析を行う。
本実施例は、PD‐L1×CTLA4二重抗体分子の外周血単一核細胞PBMCに対する活性化作用を研究するためである。第一段階に、分離されたヒトPBMC(MT‐BIO)細胞を100μL/ウェル(1×105細胞/ウェル)で96ウェルプレート(Corning，#3799)に添加し、その後、100μL/ウェルで異なる濃度の抗体分子を添加し、抗体の最終濃度は(100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM)であってもよく、または2つの抗体を特定の割合で混合し、2つの複合ウェルに添加してもよい。hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。37℃で30分間インキュベートした。次に超抗原Staphylococcal enterotoxin B(SEB)を50μL/ウェルで加え、最終濃度を100ng/mLまたは10ng/mLとした。37℃に置き、5%CO2培養箱中で96時間または120時間インキュベート後に上清を回収した。第二段階に、上清を収集してIL-2 ELISAキット(Biolegend，#431805)を用いて上清中のIL-2濃度を検出し、操作方法はキットの説明書を参照してください。アプリケーションソフトウェアGraphPad Prism 8で、データ処理と作図分析を行う。
本実施例において、陽性対照分子は抗CTLA4のHCAbモノクローナル抗体PR000184と抗PD‐L1のIgGモノクローナル抗体PR000416である。
図12～図15に示すように、SEB刺激がある場合、抗CTLA4のモノクローナル抗体、抗PD‐L1のモノクローナル抗体、及びPD‐L1×CTLA4二重抗体分子は、いずれもT細胞のIL‐2産生を異なる程度で促進することができ、そのT細胞を活性化する能力がその構造に関連する。
図12に示すように、IgG‐VH四価対称構造の二重抗体分子は、T細胞を活性化してIL‐2を産生することができる。また、抗CTLA4のVHのIgGのN端における構造(PR000301)は、IgGのC端における構造(PR000302、PR000303)に比べて、より強いT細胞活性化能力を有する。
図13に示すように、Fab‐HCAb対称構造の二重抗体分子は、T細胞を活性化してIL‐2を産生することができる。また、PR000404はPR000403よりもT細胞活性化能力が強い。PR000404とPR000403は類似した構造を有し、その差異は、PR000404が正常なヒトIgG1のFc領域を有することに対して、PR000403のFc領域はFc関連の効果機能を弱めるための3つの点変異(L234A、L235A、P329G)を含む。PR000404は、CTLA4媒介のADCC作用によりTreg細胞を除去することができ、T細胞機能をさらに増強することができると推測されている。
図14に示すように、二重抗体分子PR000300とPR000301は、抗CTLA4モノクローナル抗体、抗PD‐L1モノクローナル抗体、及びその1：1濃度の組み合わせと比べて、相当または強いT細胞活性化能力を有している(同じ実験で同じドナーPBMCを使用し、IL‐2レベルの絶対値を比較することができる)。
図15に示すように、二重抗体分子PR000303(IgG_HC‐VH構造、すなわちVHのIgGにおける重鎖C末端)とPR000404(Fab‐HCAb構造)のTを活性化する能力は、CTLA4のHCAbモノクローナル抗体PR000184より弱い。これは、CTLA4端の活性について、これら2つの構造では、従来のIgGまたはHCAb二価構造と比べて弱まり、それによってCTLA4の用量依存毒性を低減することができ、現在の臨床における併用薬の用量に適することを示している。
実施例3.10．混合リンパ球反応(MLR)
本実施例は、混合リンパ球反応(MLR)を用いてPD‐L1×CTLA4二重抗体分子のT細胞に対する活性化作用を研究する。第一段階に、第一ドナーPBMC細胞(MT-BIO)に組換えヒト由来インターロイキン4(IL-4、R&D Systems、#204-GMP)と組換えヒト由来GM-CSF(R&D Systems、#215-GM)を添加し、6日間誘導した後、未成熟ヒトCD14+樹状細胞(iDC細胞)を得た。続いて、1μg/mlのリポ多糖Lipopololysaccharide(LPS、Sigma、#L2630)を添加し、24時間誘導した後、成熟樹状細胞(mDC細胞)を得た。第二段階に、T細胞分離キット(StemCell，#17951)を用いて第2ドナーPBMC細胞(MT-BIO)からTリンパ細胞を分離した。第三段階に、得られたT細胞とmDC細胞を96ウェルプレートに10：1の割合で播種した(1×105/ウェルのT細胞と1×104/ウェルのmDC細胞)。その後、100μL/ウェルで異なる濃度の抗体分子を添加し、抗体の最終濃度は(100nM、10nM、1nM、0.1nM、0nM)であってもよく、または2つの抗体を特定の割合で混合し、2つの複合ウェルに添加してもよい。hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。37℃、5%CO2培養箱で5日間インキュベートした。第四段階に、それぞれ3日目と5日目の上清を収集し、IL-2 ELISAキット(Thermo，#88-7025-88)で3日目の上清中のIL-2濃度を検出し、IFN-γ ELISAキット(Thermo，#88-7316-88)で5日目の上清中のIFN-γ濃度を検出した。
本実施例は、混合リンパ球反応(MLR)を用いてPD‐L1×CTLA4二重抗体分子のT細胞に対する活性化作用を研究する。第一段階に、第一ドナーPBMC細胞(MT-BIO)に組換えヒト由来インターロイキン4(IL-4、R&D Systems、#204-GMP)と組換えヒト由来GM-CSF(R&D Systems、#215-GM)を添加し、6日間誘導した後、未成熟ヒトCD14+樹状細胞(iDC細胞)を得た。続いて、1μg/mlのリポ多糖Lipopololysaccharide(LPS、Sigma、#L2630)を添加し、24時間誘導した後、成熟樹状細胞(mDC細胞)を得た。第二段階に、T細胞分離キット(StemCell，#17951)を用いて第2ドナーPBMC細胞(MT-BIO)からTリンパ細胞を分離した。第三段階に、得られたT細胞とmDC細胞を96ウェルプレートに10：1の割合で播種した(1×105/ウェルのT細胞と1×104/ウェルのmDC細胞)。その後、100μL/ウェルで異なる濃度の抗体分子を添加し、抗体の最終濃度は(100nM、10nM、1nM、0.1nM、0nM)であってもよく、または2つの抗体を特定の割合で混合し、2つの複合ウェルに添加してもよい。hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。37℃、5%CO2培養箱で5日間インキュベートした。第四段階に、それぞれ3日目と5日目の上清を収集し、IL-2 ELISAキット(Thermo，#88-7025-88)で3日目の上清中のIL-2濃度を検出し、IFN-γ ELISAキット(Thermo，#88-7316-88)で5日目の上清中のIFN-γ濃度を検出した。
図16に示すように、2回の独立したMLR実験(異なるドナーペア)において、二重抗体分子PR000300とPR000301(VHのIgG重鎖または軽鎖におけるN端)はいずれも抗CTLA4モノクローナル抗体、抗PD‐L1モノクローナル抗体及びその1：1濃度の組み合わせよりも強いT細胞活性化能力を示し、IL‐2とIFN‐γの生成をよりよく促進できる。
図17に示すように、抗CTLA4のVHがIgG重鎖または軽鎖のC端にある場合、二重抗体分子PR000302とPR000303はMLR実験において抗PD-L1モノクローナル抗体atezolizumabよりも強いT細胞活性化能力を示した。
実施例3.11. 二重抗体分子の抗腫瘍薬効
本研究は、PD-L1×CTLA4抗体の体内抗腫瘍薬効を評価するために、6-8週齢雌性B6-PD1/CTLA4トランスジェニックマウスを用い、MC38-hPDL1細胞(MC38細胞上でヒトPD-L1を過発現する)を皮下接種し、腫瘍平均値が約100mm3に達すると、腫瘍マウスを腫瘍体積でグループ化し、そして特定濃度のPBSで希釈された抗体薬物を特定の用量と頻度で腹腔注射(i.p.)方式で投与した。本実施例で用いた投与スキーム：週2回、合計8回(BIWx4weeks)投与した。試験はPBSを空白対照群とし、二重抗体投与群は3mg/kgのPR001573であり、併用投与群は3mg/kgのipilimummabに3mg/kgのatezolizumabを加えた。腫瘍接種後6、9、12、15、19、22、26、29、33日目に腫瘍体積とマウス体重を測定した。
本研究は、PD-L1×CTLA4抗体の体内抗腫瘍薬効を評価するために、6-8週齢雌性B6-PD1/CTLA4トランスジェニックマウスを用い、MC38-hPDL1細胞(MC38細胞上でヒトPD-L1を過発現する)を皮下接種し、腫瘍平均値が約100mm3に達すると、腫瘍マウスを腫瘍体積でグループ化し、そして特定濃度のPBSで希釈された抗体薬物を特定の用量と頻度で腹腔注射(i.p.)方式で投与した。本実施例で用いた投与スキーム：週2回、合計8回(BIWx4weeks)投与した。試験はPBSを空白対照群とし、二重抗体投与群は3mg/kgのPR001573であり、併用投与群は3mg/kgのipilimummabに3mg/kgのatezolizumabを加えた。腫瘍接種後6、9、12、15、19、22、26、29、33日目に腫瘍体積とマウス体重を測定した。
腫瘍体積計算式：腫瘍体積(mm3)=0.5×(腫瘍長径×腫瘍短径2)。
図67に示すように、腫瘍接種後33日目に、対照群の腫瘍体積は約700mm3であった。併用投与群(3mg/kg ipilimummab+3mg/kg atezolizummab)の腫瘍は完全に消失し、腫瘍抑制率(TGI)は100%であり、対照群と比較して有意差P=0.03であった。二重抗体投与群(3mg/kg PR001573)の腫瘍は完全に消失し、TGIは100%であり、対照群と比較して有意な差P=0.03であった。投与群のマウスは、全実験過程で良好な耐性を示し、体重に明らかな変化はなかった。3mg/kg PR001573の薬効と、等用量でのipilimummabとatezolizumabとの併用の薬効は、同等であることを説明した。
実施例3.12. まとめ
本実施例は、抗PD‐L1のIgG抗体の抗原結合ドメインFabと抗CTLA4のHCAb抗体の抗原結合ドメインVHを用いて、多種類の構造の抗PD‐L1×CTLA4二重特異性抗体分子を構築した。HCAbに基づいて二重特異性抗体分子構造を構築するフレキシビリティを示し、異なる構造タイプ、相対位置、結合価数などのパラメータを通じてPD-L1端とCTLA4端の機能活性を調節し、さらに異なる活性組み合わせを設計し、異なる臨床併用用量の組み合わせの需要を満たす。
本実施例は、抗PD‐L1のIgG抗体の抗原結合ドメインFabと抗CTLA4のHCAb抗体の抗原結合ドメインVHを用いて、多種類の構造の抗PD‐L1×CTLA4二重特異性抗体分子を構築した。HCAbに基づいて二重特異性抗体分子構造を構築するフレキシビリティを示し、異なる構造タイプ、相対位置、結合価数などのパラメータを通じてPD-L1端とCTLA4端の機能活性を調節し、さらに異なる活性組み合わせを設計し、異なる臨床併用用量の組み合わせの需要を満たす。
例えば、抗CTLA4のVHが抗PD‐L1のIgGのN端にある場合、二重抗体分子PR000300とPR000301のPD‐L1端とCTLA4端はいずれもほぼ完全にその親モノクローナル抗体と同等の活性を維持することができ、またリンパ球反応と超抗原刺激実験などのインビトロ機能実験において、親モノクローナル抗体1：1濃度の組み合わせたと比べて相当または強いT細胞活性化能力を示した；したがって、併用薬の1：1の用量の組み合わせを実現するために使用することができる。マウス腫瘍薬効モデルも、この構造の二重抗体PR001573が併用薬と同じ薬効を有することを確認した。
また、例えば、抗CTLA4のVHが抗PD‐L1のIgGのC端にある場合、またはFab‐HCAb構造にある場合、二重抗体分子PR000302、PR000303、PR000404のPD‐L1端はその親モノクローナル抗体に相当する活性をほぼ完全に維持しているが、そのCTLA4端の活性は異なる程度で弱まっている。したがって、臨床上の3：1～10：1の併用投与量の組み合わせを達成するために使用することができる。
実施例4. HER2×CTLA4二重特異性抗体
実施例4.1. 背景
細胞毒性Tリンパ球関連抗原4(CTLA4)はT細胞上で発現する負の調節因子であり、抗原提示細胞上のCD80またはCD86と結合した後、CD28の共刺激信号を遮断すると同時に、T細胞の活性を低下させ、免疫抑制作用を果たす。CTLA4媒介の抑制機序はしばしば腫瘍細胞が免疫系から逃れる原因の一つとなる。CTLA4とそのリガンドとの相互作用を遮断することでT細胞の活性を回復し、抗腫瘍能力を増強することができる。Ipilimumabモノクローナル抗体(商品名Yervoy（登録商標）)は初めて市販された抗CTLA4モノクローナル抗体薬であり、腫瘍免疫治療時代を切り開く最初の製品でもある。Ipilimumabは末期メラノーマの治療に比較的に良い治療効果を示したが、Ipilimumabが比較的に高い免疫関連副反応をもたらし、その関連する3-5級副作用の発生率は50%にも達し、これはその臨床応用に深刻な影響を与えた。Ipilimumabが示す毒副作用の大部分はCTLA4標的に関連しており、現在のPD-1/PD-L1抑制剤とCTLA4抑制剤の併用投与スキームでは、CTLA4抑制剤はIpilimumabまたはTremelimummabにかかわらず通常より低用量を選択している。
実施例4.1. 背景
細胞毒性Tリンパ球関連抗原4(CTLA4)はT細胞上で発現する負の調節因子であり、抗原提示細胞上のCD80またはCD86と結合した後、CD28の共刺激信号を遮断すると同時に、T細胞の活性を低下させ、免疫抑制作用を果たす。CTLA4媒介の抑制機序はしばしば腫瘍細胞が免疫系から逃れる原因の一つとなる。CTLA4とそのリガンドとの相互作用を遮断することでT細胞の活性を回復し、抗腫瘍能力を増強することができる。Ipilimumabモノクローナル抗体(商品名Yervoy（登録商標）)は初めて市販された抗CTLA4モノクローナル抗体薬であり、腫瘍免疫治療時代を切り開く最初の製品でもある。Ipilimumabは末期メラノーマの治療に比較的に良い治療効果を示したが、Ipilimumabが比較的に高い免疫関連副反応をもたらし、その関連する3-5級副作用の発生率は50%にも達し、これはその臨床応用に深刻な影響を与えた。Ipilimumabが示す毒副作用の大部分はCTLA4標的に関連しており、現在のPD-1/PD-L1抑制剤とCTLA4抑制剤の併用投与スキームでは、CTLA4抑制剤はIpilimumabまたはTremelimummabにかかわらず通常より低用量を選択している。
CTLA4抑制剤の毒副作用を低減するためには、CTLA4抑制剤を腫瘍組織内部に指向性輸送し、関連するT細胞媒介の反応を腫瘍ミクロ環内に限定し、サイトカイン放出症候群のリスクを低減することが試みられるべき方法の1つである。この指向性輸送は、腫瘍内にCTLA4抑制剤を注射することによって達成することができるが、腫瘍内注射の方法は手術操作のリスクがあり、またいくつかの浅い表の操作可能な腫瘍組織に限られている。本実施例は、腫瘍特異性抗原(tumor‐associated antigen)を識別する抗体を用いてCTLA4抑制剤を特定の腫瘍ミクロ環境にリダイレクトし、腫瘍ミクロ環境中でT細胞の免疫抑制信号を解除し、T細胞の機能を回復させる、指向性輸送方法を提供する。
本実施例では、HER2とCTLA4を同時に標的とする二重特異性抗体を構築し、1つ以上の作用機序により抗腫瘍効果と安全性を向上させた。第一に、HER2×CTLA4二重抗体は、従来のHER2抑制剤の作用機序(HER2二量化を阻止し、HER2の内在化と分解を促進し、下流のリン酸化信号を抑制する)を保持した上で、CTLA4信号経路を遮断することによりT細胞を活性化させる。第二に、HER2×CTLA4二重抗体はHER2高発現の腫瘍組織に富化し、腫瘍ミクロ環境においてCTLA4抑制信号を特異的に解除して、T細胞を活性化させ、CTLA4モノクローナル抗体の外周系における非特異活性化による毒副作用を減少させる。第三に、HER2×CTLA4二重抗体は選択的にFc効果機能(例えばADCC)を保持でき、腫瘍ミクロ環境においてCTLA4によってCTLA4を高発現する抑制性T細胞、例えばTreg細胞を特異的に殺傷し、またはHER2によってHER2を高発現する腫瘍細胞を特異的に殺傷する。また、二重特異性抗体は1つの医薬品として、2つの医薬品の組み合わせよりも経済性や投与の便利性などの面で優位に立つことができる。
実施例4.2. 抗HER2のIgG抗体と抗CTLA4のHCAb抗体の獲得
本実施例は、対応するアミノ酸配列がIMGTデータベースに由来する抗HER2のIgG抗体trastuzumab及びpertuzumabを使用し、表4‐11に示す。
本実施例は、対応するアミノ酸配列がIMGTデータベースに由来する抗HER2のIgG抗体trastuzumab及びpertuzumabを使用し、表4‐11に示す。
本実施例で用いた抗CTLA4の全ヒト由来HCAb抗体PR000184(表4‐11)は、実施例3.2.2に記載されているように、Harbour HCAbマウスに由来している。
実施例4.3. 抗HER2のIgG抗体と抗CTLA4のHCAb抗体を用いた二重特異性抗体分子の構築
本実施例は、抗HER2のIgG抗体PR000210(trastuzumamab類似体)またはPR000672(pertuzumamab類似体)の抗原結合ドメインFabと、抗CTLA4のHCAb抗体PR000184の抗原結合ドメインVHを用いて、多様な構造の抗HER2×CTLA4二重特異性抗体分子を構築する。
本実施例は、抗HER2のIgG抗体PR000210(trastuzumamab類似体)またはPR000672(pertuzumamab類似体)の抗原結合ドメインFabと、抗CTLA4のHCAb抗体PR000184の抗原結合ドメインVHを用いて、多様な構造の抗HER2×CTLA4二重特異性抗体分子を構築する。
本実施例及び下記の実施例において、陽性対照分子は抗HER2のIgGモノクローナル抗体PR000210(trastuzumamab類似体)又はPR000672(pertuzumamab類似体)であり、またHER2×CTLA4二重抗体分子のHER2端の親モノクローナル抗体である。
本実施例及び下記の実施例において、陽性対照分子は抗CTLA4のHCAbモノクローナル抗体PR000184であり、HER2×CTLA4二重抗体分子のCTLA4端の親モノクローナル抗体でもある。
実施例4.3.1. Fab‐HCAb対称構造分子の構築
抗HER2のIgG抗体と抗CTLA4の重鎖抗体を用いて、実施例1.1に記載の構造に従ってFab-HCAb対称構造のHER2×CTLA4二重抗体分子を設計し、表4‐1にまとめた。そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表4‐2にまとめた。
抗HER2のIgG抗体と抗CTLA4の重鎖抗体を用いて、実施例1.1に記載の構造に従ってFab-HCAb対称構造のHER2×CTLA4二重抗体分子を設計し、表4‐1にまとめた。そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表4‐2にまとめた。
実施例4.3.2. IgG‐VH四価対称構造分子の構築
抗HER2のIgG抗体と抗CTLA4の重鎖抗体を用いて、実施例1.2に記載の構造に従ってIgG-VH四価対称構造のHER2×CTLA4二重抗体分子を設計し、表4‐3にまとめた。そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表44にまとめた。
抗HER2のIgG抗体と抗CTLA4の重鎖抗体を用いて、実施例1.2に記載の構造に従ってIgG-VH四価対称構造のHER2×CTLA4二重抗体分子を設計し、表4‐3にまとめた。そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表44にまとめた。
実施例4.3.3. IgG‐VH(2)六価対称構造分子の構築
抗HER2のIgG抗体と抗CTLA4の重鎖抗体を用いて、実施例1.3に記載の構造に従ってIgG-VH(2)六価対称構造のHER2×CTLA4二重抗体分子を設計し、表4‐5にまとめた。そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表4‐6にまとめた。
抗HER2のIgG抗体と抗CTLA4の重鎖抗体を用いて、実施例1.3に記載の構造に従ってIgG-VH(2)六価対称構造のHER2×CTLA4二重抗体分子を設計し、表4‐5にまとめた。そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表4‐6にまとめた。
実施例4.3.4. 2xVH‐IgG六価対称構造分子の構築
抗HER2のIgG抗体と抗CTLA4の重鎖抗体を用いて、実施例1.4に記載の構造に従って2xVH‐IgG六価対称構造のHER2×CTLA4二重抗体分子を設計し、表47にまとめた。そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表48にまとめた。
抗HER2のIgG抗体と抗CTLA4の重鎖抗体を用いて、実施例1.4に記載の構造に従って2xVH‐IgG六価対称構造のHER2×CTLA4二重抗体分子を設計し、表47にまとめた。そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表48にまとめた。
実施例4.3.5. Fab‐Fc‐VH(n)二価又は三価非対称構造分子の構築
抗HER2のIgG抗体と抗CTLA4の重鎖抗体を用いて、実施例1.5と実施例1.6に記載の構造に従ってFab‐Fc‐VH(n，n={1，2｝)非対称構造のHER2×CTLA4二重抗体分子を設計し、表49にまとめた。そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表4‐10にまとめた。
抗HER2のIgG抗体と抗CTLA4の重鎖抗体を用いて、実施例1.5と実施例1.6に記載の構造に従ってFab‐Fc‐VH(n，n={1，2｝)非対称構造のHER2×CTLA4二重抗体分子を設計し、表49にまとめた。そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表4‐10にまとめた。
実施例4.3.6. HER2×CTLA4二重抗体分子及び対照分子の配列リスト
表4‐11、表4‐12及び表4‐13は、本実施例によって構築されたHER2×CTLA4二重抗体分子及び対応するHER2モノクローナル抗体、CTLA4モノクローナル抗体等の親モノクローナル抗体分子及び対照分子の配列に対応する配列番号を示す。表4‐13中の構造番号は、表1‐1及び図1に対応する。表4‐14は、二重特異性抗体分子の第1及び第2抗原結合ドメインに対応するCDR配列の配列番号を示す。
表4‐11、表4‐12及び表4‐13は、本実施例によって構築されたHER2×CTLA4二重抗体分子及び対応するHER2モノクローナル抗体、CTLA4モノクローナル抗体等の親モノクローナル抗体分子及び対照分子の配列に対応する配列番号を示す。表4‐13中の構造番号は、表1‐1及び図1に対応する。表4‐14は、二重特異性抗体分子の第1及び第2抗原結合ドメインに対応するCDR配列の配列番号を示す。
実施例4.4. CTLA4との結合
本実施例は、HER2×CTLA4二重抗体分子がCTLA4と結合する活性を研究するためである。
本実施例は、HER2×CTLA4二重抗体分子がCTLA4と結合する活性を研究するためである。
実施例4.4.1. ヒトCTLA4を高発現するCHO-K1細胞CHO-K1/hCTLA4との結合
抗体分子の、ヒトCTLA4を高発現するCHO-K1細胞株CHO-K1/hCTLA4(CHEMPARTNER)などの細胞との結合能力について、フローサイトメトリーFACSを用いて試験した。具体的には、CHO‐K1/hCTLA4細胞を消化し、F12K培地を用いて再懸濁する；細胞密度を2×106細胞/mLに調整した。次に、CHO-K1/hCTLA4細胞を96ウェルVプレート(Corning，#3894)に100μL/ウェルで播種し、4℃で5分間遠心分離し、上清を廃棄した。その後、勾配希釈された抗体分子を100μL/ウェルで96ウェルプレートに添加し、均一に混合し、抗体分子は最高最終濃度300nMから5倍濃度勾配で希釈された合計8つの濃度、または最高最終濃度300nMから4倍濃度勾配で希釈された合計12濃度に希釈し；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。細胞を4℃に置き、遮光して1時間インキュベートした。その後、100μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液(0.5%BSAを含むPBS緩衝液)を加えて細胞を2回すすぎ、4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に、さらに100μL／ウェルで蛍光二次抗体(Goat human lgG(H＋L)Alexa Fluor 488 conjunction，Thermo，#A11013，1：1000希釈)を加え、4℃に放置し、遮光して1時間インキュベートした。その後、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を加えて細胞を2回すすぎ、その後4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を添加して、細胞を再懸濁した。BD FACS CANTOIIフローサイトメータまたはACEA NovoCyteフローサイトメータを用いて蛍光発光信号値を読み取り、ソフトウェアFlowJov 10(FlowJo，LLC)を用いてデータを処理し分析した。ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、4パラメータの非線形フィッティングにより、抗体の標的細胞に対する結合曲線及びEC50値などのパラメータを得た。
抗体分子の、ヒトCTLA4を高発現するCHO-K1細胞株CHO-K1/hCTLA4(CHEMPARTNER)などの細胞との結合能力について、フローサイトメトリーFACSを用いて試験した。具体的には、CHO‐K1/hCTLA4細胞を消化し、F12K培地を用いて再懸濁する；細胞密度を2×106細胞/mLに調整した。次に、CHO-K1/hCTLA4細胞を96ウェルVプレート(Corning，#3894)に100μL/ウェルで播種し、4℃で5分間遠心分離し、上清を廃棄した。その後、勾配希釈された抗体分子を100μL/ウェルで96ウェルプレートに添加し、均一に混合し、抗体分子は最高最終濃度300nMから5倍濃度勾配で希釈された合計8つの濃度、または最高最終濃度300nMから4倍濃度勾配で希釈された合計12濃度に希釈し；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。細胞を4℃に置き、遮光して1時間インキュベートした。その後、100μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液(0.5%BSAを含むPBS緩衝液)を加えて細胞を2回すすぎ、4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に、さらに100μL／ウェルで蛍光二次抗体(Goat human lgG(H＋L)Alexa Fluor 488 conjunction，Thermo，#A11013，1：1000希釈)を加え、4℃に放置し、遮光して1時間インキュベートした。その後、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を加えて細胞を2回すすぎ、その後4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を添加して、細胞を再懸濁した。BD FACS CANTOIIフローサイトメータまたはACEA NovoCyteフローサイトメータを用いて蛍光発光信号値を読み取り、ソフトウェアFlowJov 10(FlowJo，LLC)を用いてデータを処理し分析した。ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、4パラメータの非線形フィッティングにより、抗体の標的細胞に対する結合曲線及びEC50値などのパラメータを得た。
本実施例において、陽性対照分子は抗CTLA4のHCAbモノクローナル抗体PR000184であり、HER2×CTLA4二重抗体分子のCTLA4端の親モノクローナル抗体でもある。結果を図18と表4‐15に示す。
図18(A)に示すように、Fab‐HCAb対称構造の二重抗体分子はいずれもCTLA4に結合することができる。これらの分子は同様の構造を有しており、いずれも抗HER2のモノクローナル抗体PR000210のFabドメインと抗CTLA4のHCAbモノクローナル抗体PR000184のVHドメインを組み合わせたものであり、その微細な違いは異なる第1連結ペプチドと連結Fcのヒンジ領域、及び異なるFcタイプまたは突然変異である。したがって、これらの二重抗体分子は、CTLA4を結合する類似の能力を有する。これらのCTLA4と結合するEC50値は、親モノクローナル抗体PR000184と類似しているか、わずか1.5～3倍弱であるが、FACS上の最大結合信号(MFI最大値)は、親モノクローナル抗体PR000184よりも低い。これは、Fab‐HCAb構造において、FabドメインがHCAbのVHドメインに対して「遮蔽」効果を持つ可能性があり、この構造におけるVHドメインが結合可能なCTLA4分子が自由端にある場合よりも少なくし、同じ数の可及的なCTLA4分子にとって、その結合効果は親モノクローナル抗体PR000184に相当する(EC50値)ことを示唆しているかもしれない。
図18(B‐D)に示すように、IgG‐VH四価対称構造の二重抗体分子がCTLA4と結合する能力は、その具体的な分子構造によってわずかに異なる。抗HER2のIgGに対する抗CTLA4のVH端の二重抗体構造中の相対位置に基づいて、このような構造の二重抗体分子をさらに3つに分類する：VHはIgGの重鎖C端にある(PR000539、PR000540、PR000714、PR000715)；VHはIgGの重鎖N端にある(PR001583、PR001586、PR001588、PR001591)；VHはIgGの軽鎖N端にある(PR001584、PR001589)。VHがIgGの重鎖C端にある場合、これらの二重抗体分子がCTLA4と結合するEC50値は、親モノクローナル抗体PR000184の値と似ているが、FACS上のMFI最大値は親モノクローナル抗体PR000184よりやや低い。VHがIgGの重鎖または軽鎖を問わないN端にある場合、これらの二重抗体分子がCTLA4と結合するEC50値は親モノクローナル抗体PR000184のものよりやや弱いが、FACS上のMFI最大値は親モノクローナル抗体PR000184よりも強い。これは、IgG上のVHの相対位置を調整することにより、VHが標的分子と結合する数と結合効果を調整することができることを示している。
図18(B‐D)に示すように、IgG‐VH四価対称構造の二重抗体分子がCTLA4と結合する能力は、その具体的な分子構造によってわずかに異なる。抗HER2のIgGに対する抗CTLA4のVH端の二重抗体構造中の相対位置に基づいて、このような構造の二重抗体分子をさらに3つに分類する：VHはIgGの重鎖C端にある(PR000539、PR000540、PR000714、PR000715)；VHはIgGの重鎖N端にある(PR001583、PR001586、PR001588、PR001591)；VHはIgGの軽鎖N端にある(PR001584、PR001589)。VHがIgGの重鎖C端にある場合、これらの二重抗体分子がCTLA4と結合するEC50値は、親モノクローナル抗体PR000184の値と似ているが、FACS上のMFI最大値は親モノクローナル抗体PR000184よりやや低い。VHがIgGの重鎖または軽鎖を問わないN端にある場合、これらの二重抗体分子がCTLA4と結合するEC50値は親モノクローナル抗体PR000184のものよりやや弱いが、FACS上のMFI最大値は親モノクローナル抗体PR000184よりも強い。これは、IgG上のVHの相対位置を調整することにより、VHが標的分子と結合する数と結合効果を調整することができることを示している。
図18(E‐F)に示すように、IgG‐VH‐VH六価対称構造の二重抗体分子はいずれもCTLA4に結合することができる。これらの分子は同様の構造を有し、いずれも抗HER2のモノクローナル抗体PR000210と抗CTLA4のHCAbモノクローナル抗体PR000184のVHドメインとから組み合わされており、その微細な違いは異なる第1接続ペプチドと第2接続ペプチド、及び異なるFcタイプまたは突然変異である。これらの二重抗体分子がCTLA4と結合する能力は、PR001582を除いて、親モノクローナル抗体PR000184と類似している(類似のEC50及び類似のMFI最大値を有する)。
図18(G‐H)に示すように、2xVH‐IgG六価対称構造の二重抗体分子はいずれもCTLA4に結合することができる。これらの分子は、いずれも抗HER2のモノクローナル抗体PR000210またはPR000672と抗CTLA4のHCAbモノクローナル抗体PR000184のVHドメインとを組み合わせた類似の構造を有している。親モノクローナル抗体PR000210に基づいて構築された二重抗体分子(PR001585、PR001587)がCTLA4に結合する能力は、親モノクローナル抗体PR000184に似ている；親モノクローナル抗体PR000672に基づいて構築された二重抗体分子(PR001590、PR001592)がCTLA4に結合する能力は、親モノクローナル抗体PR000184に比べてやや弱い。
図18(I‐J)に示すように、Fab‐Fc‐VH(n，n＝1，2)非対称構造の二重抗体分子がCTLA4と結合する能力は、構造に含まれる親モノクローナル抗体PR000184のVHドメインの数に関係している。二重抗体分子PR000916とPR000917はいずれも1つのCTLA4結合ドメインのみを含むため、そのCTLA4と結合する能力は二価の親モノクローナル抗体PR000184より明らかに弱い。二重抗体分子PR002672は、2つの直列に形成されたCTLA4結合ドメインを含み、そのCTLA4と結合する能力は親モノクローナル抗体PR000184と類似している。この構造は、ソースHCAbを含むVHドメインの二重抗体分子は、直列接続されたVHドメインの数を調節することによって標的との結合能力を調節できるというフレキシビリティを有することを示している。
実施例4.5. CTLA4とそのリガンドとの結合を遮断すること
本実施例は、HER2×CTLA4二重抗体分子がCTLA4とそのリガンドB7‐1／CD80との結合を抑制する活性を研究するためである。
本実施例は、HER2×CTLA4二重抗体分子がCTLA4とそのリガンドB7‐1／CD80との結合を抑制する活性を研究するためである。
実施例4.5.1. ヒトCTLA4タンパク質とそのリガンドタンパク質との結合を遮断すること
抗体分子のヒトCTLA4タンパク質とそのリガンドB7‐1／CD80タンパク質との結合を抑制する活性を酵素結合免疫吸着反応ELISAを用いて測定した。具体的には、まず2μg/mLのタンパク質ヒトB7‐1‐Fc(ACRO Biosystems，#B71‐H5259)を96ウェルプレートに100μL／ウェルで包み、4℃で一晩過ごした。その後、PBST緩衝液(0.05%Tween-20を含むPBS緩衝液)で3回すすぎ、次いで閉鎖液(5%脱脂粉乳を含むPBS緩衝液)を加えて37℃で1時間インキュベートした。その後、最高最終濃度が200nMの3倍の濃度勾配で希釈した抗体分子を90μL/ウェルで加え、7つの濃度があり、均一に混合し、37℃で20分間インキュベートした；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。その後、ビオチン化ヒトCTLA4-Fcタンパク質(ACRO Biosystems、#CT4-H82F3)を10μL/ウェルで添加し、その最終濃度を0.25μg/mlとし、37℃で1時間インキュベートした。次にPBST緩衝液で3回すすぐ。次に100μL/ウェルで標識Precision Protein（登録商標） StrepTactin-HRP Conjugate(Bio-RAD、#1610380、1：4000希釈)を追加し、37℃で0.5時間インキュベートした。次にPBST緩衝液で3回すすぐ。その後、TMB発色液を100μL/ウェルで加えて15分間反応させた。最後に終止液を加えて反応を中止した。Enspire（登録商標） マルチファンクションリーダ(Perkin Elmer，Inc.)で490nMで光吸収値(OD値)を読み取る。アプリケーションソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、4パラメータの非線形フィッティングにより、抑制曲線及びIC50値などのパラメータを得た。
抗体分子のヒトCTLA4タンパク質とそのリガンドB7‐1／CD80タンパク質との結合を抑制する活性を酵素結合免疫吸着反応ELISAを用いて測定した。具体的には、まず2μg/mLのタンパク質ヒトB7‐1‐Fc(ACRO Biosystems，#B71‐H5259)を96ウェルプレートに100μL／ウェルで包み、4℃で一晩過ごした。その後、PBST緩衝液(0.05%Tween-20を含むPBS緩衝液)で3回すすぎ、次いで閉鎖液(5%脱脂粉乳を含むPBS緩衝液)を加えて37℃で1時間インキュベートした。その後、最高最終濃度が200nMの3倍の濃度勾配で希釈した抗体分子を90μL/ウェルで加え、7つの濃度があり、均一に混合し、37℃で20分間インキュベートした；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。その後、ビオチン化ヒトCTLA4-Fcタンパク質(ACRO Biosystems、#CT4-H82F3)を10μL/ウェルで添加し、その最終濃度を0.25μg/mlとし、37℃で1時間インキュベートした。次にPBST緩衝液で3回すすぐ。次に100μL/ウェルで標識Precision Protein（登録商標） StrepTactin-HRP Conjugate(Bio-RAD、#1610380、1：4000希釈)を追加し、37℃で0.5時間インキュベートした。次にPBST緩衝液で3回すすぐ。その後、TMB発色液を100μL/ウェルで加えて15分間反応させた。最後に終止液を加えて反応を中止した。Enspire（登録商標） マルチファンクションリーダ(Perkin Elmer，Inc.)で490nMで光吸収値(OD値)を読み取る。アプリケーションソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、4パラメータの非線形フィッティングにより、抑制曲線及びIC50値などのパラメータを得た。
本実施例において、陽性対照分子は抗CTLA4のHCAbモノクローナル抗体PR000184であり、HER2×CTLA4二重抗体分子のCTLA4端の親モノクローナル抗体でもある。その結果を図19及び表4‐16に示す。
図19(A)に示すように、Fab‐HCAb対称構造の二重抗体分子はいずれもCTLA4タンパク質とそのリガンドタンパク質との結合を遮断する能力(抑制活性)があり、しかも親モノクローナル抗体PR000184と比べて相当またはやや弱く、類似の最大OD差を示したが、IC50値はわずか1.5～2.1倍弱である。
図19(B‐D)に示すように、IgG‐VH四価対称構造の二重抗体分子の抑制活性は、その具体的な分子構造によって若干異なる。抗HER2のIgGに対する抗CTLA4のVH端の二重抗体構造中の相対位置に基づいて、このような構造の二重抗体分子をさらに3つに分類する：VHはIgGの重鎖C端にある(PR000539、PR000540、PR000715)；VHはIgGの重鎖N端にある(PR001583、PR001586、PR001588、PR001591)；VHはIgGの軽鎖N端にある(PR001584、PR001589)。VHがIgGの重鎖C端にある場合、これらの二重抗体分子の抑制活性は親モノクローナル抗体に比べてやや弱く、類似の最大OD差を示したが、IC50値は1.5～2.5倍だけ弱かった。VHがIgGの重鎖または軽鎖のN末端にある場合、これらの二重抗体分子の抑制活性は親モノクローナル抗体と類似している。
図19(E‐F)に示すように、IgG‐VH‐VH六価対称構造の二重抗体分子の抑制活性は、親モノクローナル抗体と類似またはやや優れている。
図19(G‐H)に示すように、2xVH‐IgG六価対称構造の二重抗体分子の抑制活性は、親モノクローナル抗体と類似またはやや優れている。
実施例4.5.2. ヒトCTLA4細胞とそのリガンドタンパク質との結合を遮断すること
抗体分子がCTLA4を発現する細胞とそのリガンドB7‐1／CD80との結合を抑制する活性を、フローサイトメトリーFACSを用いて測定した。具体的には、ヒトCTLA4を高発現するCHO-K1細胞株CHO-K1/hCTLA4(CHEMPARTNER)を消化し、FACS緩衝液(2%FBSを含むPBS緩衝液)に再懸濁し、細胞密度を3×106細胞/mLに調整した。CHO-K1/hCTLA4細胞を96ウェルプレート(3×105細胞/ウェル)に100μL/ウェルで播種し、500gの回転速度で4℃で5分間遠心分離し、上清を廃棄した。その後、勾配希釈された抗体分子を100μL/ウェルで96ウェルプレートに添加し、均一に混合し、抗体分子は最高最終濃度200nMから3倍濃度勾配で希釈された合計8つの濃度で希釈することができ、hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。次に、3μg/mLのビオチン化リガンドタンパク質ヒトB7-1-Fc-biotin(ACRO Biosystems，#B71-H82F2)を100μL/ウェルで96ウェルプレートに加え、均一に混合した。96ウェルプレートを4℃に置き、遮光して1時間インキュベートした。その後、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を加えて細胞を2回すすぎ、4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に100μL/ウェルで蛍光標識(Streptavidin，Alexa Fluor（登録商標） 488 conjugate，Thermo，#S32354，1：1000希釈)を添加し、4℃に放置し、遮光して1時間インキュベートした。その後、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を加えて細胞を3回すすぎ、4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を添加して、細胞を再懸濁した。BD FACS CANTOIIフローサイトメータまたはACEA NovoCyteフローサイトメータを用いて蛍光発光信号値を読み取り、ソフトウェアFlowJov 10(FlowJo，LLC)を用いてデータを処理し分析した。ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、蛍光信号値MFIを抑制率に変換し、4パラメータの非線形フィッティングにより、抑制曲線、IC50値と最大抑制率などのパラメータを得た。
抗体分子がCTLA4を発現する細胞とそのリガンドB7‐1／CD80との結合を抑制する活性を、フローサイトメトリーFACSを用いて測定した。具体的には、ヒトCTLA4を高発現するCHO-K1細胞株CHO-K1/hCTLA4(CHEMPARTNER)を消化し、FACS緩衝液(2%FBSを含むPBS緩衝液)に再懸濁し、細胞密度を3×106細胞/mLに調整した。CHO-K1/hCTLA4細胞を96ウェルプレート(3×105細胞/ウェル)に100μL/ウェルで播種し、500gの回転速度で4℃で5分間遠心分離し、上清を廃棄した。その後、勾配希釈された抗体分子を100μL/ウェルで96ウェルプレートに添加し、均一に混合し、抗体分子は最高最終濃度200nMから3倍濃度勾配で希釈された合計8つの濃度で希釈することができ、hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。次に、3μg/mLのビオチン化リガンドタンパク質ヒトB7-1-Fc-biotin(ACRO Biosystems，#B71-H82F2)を100μL/ウェルで96ウェルプレートに加え、均一に混合した。96ウェルプレートを4℃に置き、遮光して1時間インキュベートした。その後、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を加えて細胞を2回すすぎ、4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に100μL/ウェルで蛍光標識(Streptavidin，Alexa Fluor（登録商標） 488 conjugate，Thermo，#S32354，1：1000希釈)を添加し、4℃に放置し、遮光して1時間インキュベートした。その後、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を加えて細胞を3回すすぎ、4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を添加して、細胞を再懸濁した。BD FACS CANTOIIフローサイトメータまたはACEA NovoCyteフローサイトメータを用いて蛍光発光信号値を読み取り、ソフトウェアFlowJov 10(FlowJo，LLC)を用いてデータを処理し分析した。ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、蛍光信号値MFIを抑制率に変換し、4パラメータの非線形フィッティングにより、抑制曲線、IC50値と最大抑制率などのパラメータを得た。
本実施例において、陽性対照分子は抗CTLA4のHCAbモノクローナル抗体PR000184であり、HER2×CTLA4二重抗体分子のCTLA4端の親モノクローナル抗体でもある。結果を図20と表4‐17に示す。
図20(A‐B)に示すように、抗CTLA4のVHが抗HER2のIgGの重鎖C端に位置する場合、IgG‐VH四価対称構造の二重抗体分子の抑制活性は顕著に低下するが、IgG‐VH‐VH六価対称構造の二重抗体分子(PR000541)の抑制活性は親モノクローナル抗体と類似している。
図20(C)に示すように、Fab‐Fc‐VH(2)非対称構造の二重抗体分子PR002672は、2つの直列に形成されたCTLA4結合ドメインを含み、その抑制活性が二価の親モノクローナル抗体と比較して、IC50値が約4倍弱であるが、約100%抑制程度に達することができる。
実施例4.6. HER2との結合
本実施例は、HER2×CTLA4二重抗体分子がHER2と結合する活性を研究するためである。
本実施例は、HER2×CTLA4二重抗体分子がHER2と結合する活性を研究するためである。
実施例4.6.1. ヒトHER2を高発現する細胞SK‐BR‐3との結合
ヒトHER2を高発現する腫瘍細胞系SK‐BR‐3(ATCC、HTB‐30)に対する抗体の結合能力をフローサイトメトリーFACSを用いて試験した。具体的には、SK‐BR‐3細胞を消化し、DMEM完全培地で再懸濁し、細胞密度を1×106細胞/mLに調整する；次いで、96ウェルVプレート(Corning，#3894)に100μL細胞/ウェルで接種し、4℃で5分間遠心分離し、上清を廃棄した。その後、最高最終濃度100nMの5倍濃度勾配で希釈した抗体分子を100μL/ウェルで加え、8つの濃度を均一に混合した；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。細胞を4℃に置き、遮光して1時間インキュベートした。その後、4℃で5分間遠心分離し、上清を廃棄した；その後、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液(0.5%BSAを含むPBS緩衝液)を加えて細胞を2回すすぎ、その後500g、4℃で5分間遠心分離し、上清を廃棄した。その後、蛍光二次抗体(Goat human lgG(H＋L)Alexa Fluor 488 conjunction，Thermo，#A11013，1：1000希釈)を100μL／ウェルで添加し、4℃に放置し、遮光して1時間インキュベートした。その後、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を加えて細胞を2回すすぎ、その後4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を添加して、細胞を再懸濁した。BD FACS CANTOIIフローサイトメータまたはACEA NovoCyteフローサイトメータを用いて蛍光発光信号値を読み取り、ソフトウェアFlowJov 10(FlowJo，LLC)を用いてデータを処理し分析した。ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、4パラメータの非線形フィッティングにより、抗体の標的細胞に対する結合曲線及びEC50値などのパラメータを得た。
ヒトHER2を高発現する腫瘍細胞系SK‐BR‐3(ATCC、HTB‐30)に対する抗体の結合能力をフローサイトメトリーFACSを用いて試験した。具体的には、SK‐BR‐3細胞を消化し、DMEM完全培地で再懸濁し、細胞密度を1×106細胞/mLに調整する；次いで、96ウェルVプレート(Corning，#3894)に100μL細胞/ウェルで接種し、4℃で5分間遠心分離し、上清を廃棄した。その後、最高最終濃度100nMの5倍濃度勾配で希釈した抗体分子を100μL/ウェルで加え、8つの濃度を均一に混合した；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。細胞を4℃に置き、遮光して1時間インキュベートした。その後、4℃で5分間遠心分離し、上清を廃棄した；その後、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液(0.5%BSAを含むPBS緩衝液)を加えて細胞を2回すすぎ、その後500g、4℃で5分間遠心分離し、上清を廃棄した。その後、蛍光二次抗体(Goat human lgG(H＋L)Alexa Fluor 488 conjunction，Thermo，#A11013，1：1000希釈)を100μL／ウェルで添加し、4℃に放置し、遮光して1時間インキュベートした。その後、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を加えて細胞を2回すすぎ、その後4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を添加して、細胞を再懸濁した。BD FACS CANTOIIフローサイトメータまたはACEA NovoCyteフローサイトメータを用いて蛍光発光信号値を読み取り、ソフトウェアFlowJov 10(FlowJo，LLC)を用いてデータを処理し分析した。ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、4パラメータの非線形フィッティングにより、抗体の標的細胞に対する結合曲線及びEC50値などのパラメータを得た。
本実施例において、陽性対照分子は抗HER2のモノクローナル抗体PR000210(trastuzumab類似体)またはPR000672(pertuzumab類似体)であり、HER2×CTLA4二重抗体分子の親モノクローナル抗体でもある。結果を図21と表4‐18に示す。
図21(A)に示すように、Fab‐HCAb対称構造の二重抗体分子がHER2と結合する能力は、親モノクローナル抗体PR000210と類似しており、類似のEC50値とMFI最大値に現れる。これは、Fab‐HCAb対称構造を有する二重抗体分子の抗HER2のFab端における構造がHER2に対する結合能力を良好に保持できることを示している。
図21(B‐E)に示すように、IgG‐VH四価対称構造の二重抗体分子がHER2と結合する能力は、その具体的な分子構造によってわずかに異なる。抗HER2のIgGに対する抗CTLA4のVH端の二重抗体構造中の相対位置に基づいて、このような構造の二重抗体分子をさらに3つに分類する：VHはIgGの重鎖C端にある(PR000539、PR000540)；VHはIgGの重鎖N端にある(PR001583、PR001586、PR001588、PR001591)；VHはIgGの軽鎖N端にある(PR001584、PR001974、PR001589)。EC50の値から見ると、VHがIgGの重鎖C端にある場合、この構造はHER2に対する結合能力をよく保持し、VH端がIgGのFab端に明らかな影響を与えていないことを示し；VHがIgGの重鎖または軽鎖を問わないN端にある場合、二重抗体分子のHER2に対する結合能力は、対応する親モノクローナル抗体に比べて1.5～2.5倍低下する。
図21(F‐G)に示すように、IgG‐VH‐VH六価対称構造の二重抗体分子がHER2と結合する能力は、対応する親モノクローナル抗体と類似している。
図21(H‐I)に示すように、2xVH‐IgG六価対称構造の二重抗体分子がHER2と結合する能力は、対応する親モノクローナル抗体に比べて明らかに低下している；VHがIgGの重鎖と軽鎖のN端に同時に接続されると、IgGのFab端の機能に明らかな影響を与えることを示している。
図21(J)に示すように、Fab‐Fc‐VH非対称構造の二重抗体分子PR000916のHER2結合ドメインは一価Fab構造であるが、HER2を結合する能力は二価の親モノクローナル抗体に非常に近い；trastuzumabの結合ドメインは単価結合と二価結合に有意な差がなく、Fab-Fc-VH非対称構造の二重抵抗体分子はHER2に対する結合能力をよく保持していることを示している。
実施例4.7. 超抗原SEB刺激試験
本実施例は、HER2×CTLA4二重抗体分子の外周血単一核細胞PBMCに対する活性化作用を研究するためである。第一段階に、分離したヒトPBMC(MT‐BIO )を5×106細胞/mLに調整する。次に、PBMCを50μL/ウェルで96ウェルプレート(Corning，#3799)に追加する。その後、100μL/ウェルで異なる濃度の抗体分子を添加し、抗体最終濃度勾配は(150nM、30nM、1nM)または(80nM、8nM、0.8nM、0.08nM)であり、2つの複合ウェルに添加することができる。hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。37℃で30分間インキュベートした。次いで、50μL/ウェルで400ng/mLの超抗原Staphylococcal enterotoxin B(SEB)を添加し、その最終濃度は100ng/mLであった。37℃に置き、5%CO2培養箱中で72時間または96時間インキュベート後に上清を回収した。第二段階に、上清を収集し、IL‐2検出キット(Thermo，#88‐7025‐77)を用いて上清中のIL‐2濃度を検出する。アプリケーションソフトウェアGraphPad Prism 8で、データ処理と作図分析を行う。
本実施例は、HER2×CTLA4二重抗体分子の外周血単一核細胞PBMCに対する活性化作用を研究するためである。第一段階に、分離したヒトPBMC(MT‐BIO )を5×106細胞/mLに調整する。次に、PBMCを50μL/ウェルで96ウェルプレート(Corning，#3799)に追加する。その後、100μL/ウェルで異なる濃度の抗体分子を添加し、抗体最終濃度勾配は(150nM、30nM、1nM)または(80nM、8nM、0.8nM、0.08nM)であり、2つの複合ウェルに添加することができる。hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。37℃で30分間インキュベートした。次いで、50μL/ウェルで400ng/mLの超抗原Staphylococcal enterotoxin B(SEB)を添加し、その最終濃度は100ng/mLであった。37℃に置き、5%CO2培養箱中で72時間または96時間インキュベート後に上清を回収した。第二段階に、上清を収集し、IL‐2検出キット(Thermo，#88‐7025‐77)を用いて上清中のIL‐2濃度を検出する。アプリケーションソフトウェアGraphPad Prism 8で、データ処理と作図分析を行う。
本実施例において、陽性対照分子は抗CTLA4のHCAbモノクローナル抗体PR000184またはPR000218であり、HER2×CTLA4二重抗体分子のCTLA4端の親モノクローナル抗体でもある。PR000218は、PR000184に基づいてFc突然変異によって構築されたADCC増強の変異体である。
図25に示すように、SEB刺激がある場合、抗CTLA4のモノクローナル抗体及びHER2×CTLA4二重抗体分子は、いずれもT細胞のIL‐2産生を異なる程度で促進することができ、T細胞を活性化する能力が構造に関係する。
図25(F)に示すように、対応する親モノクローナル抗体に比べて、Fab‐HCAb対称構造の二重抗体分子はT細胞に対する活性化能力に弱い。CTLA4端の活性は、従来のIgGまたはHCAb二価構造と比べて、Fab‐HCAb構造では弱まり、したがって用量依存毒性を低減することができ、現在の臨床における併用薬の用量に適した。
図25(A、D、G、I)に示すように、IgG‐VH四価対称構造の二重抗体分子のT細胞に対する活性化能力は、その具体的な分子構造によってわずかに異なる。抗HER2のIgGに対する抗CTLA4のVH端の二重抗体構造中の相対位置に基づいて、このような構造の二重抗体分子をさらに3つに分類する：VHはIgGの重鎖C端にある(PR000539、PR000715)；VHはIgGの重鎖N端にある(PR001583、PR001586)；VHはIgGの軽鎖N端にある(PR001584、PR001974)。VHがIgGの重鎖C端にある場合、二重抗体分子のT細胞に対する活性化能力は対応する親モノクローナル抗体に比べて明らかに弱まった。VHがIgGの重鎖または軽鎖を問わないN末端にある場合、二重抗体分子のT細胞に対する活性化能力は対応する親モノクローナル抗体と類似しており、わずかに増強されている。これは、IgG上のVHの相対位置を調整することによって、VH端の抗CTLA4の活性を調整し、異なる臨床的組み合わせ薬の投与量のシナリオを適用できる。
図25(C)に示すように、IgG‐VH‐VH六価対称構造の二重抗体分子のT細胞に対する活性化能力は親モノクローナル抗体と類似しており、そのCTLA4端の活性は異なる接続ペプチドを用いることにより調節することができる。
図25(B，E)に示すように、2xVH‐IgG六価対称構造の二重抗体分子のT細胞に対する活性化能力は親モノクローナル抗体と類似しており、CTLA4端の活性をほぼ完全に保持していることを示している。
図25(H)に示すように、Fab‐Fc‐VH(2)非対称構造の二重抗体分子は、2つの直列に形成されたCTLA4結合ドメインを含み、対応する親モノクローナル抗体に比べてT細胞に対する活性化能力が低下する。そのCTLA4端は、用量依存毒性を低下させることができ、現在の臨床で使用されている併用薬の用量に適した。
実施例4.8. HER2+細胞の増殖抑制
本実施例は、HER2×CTLA4二重抗体分子がヒトHER2を高発現する腫瘍細胞系SK‐BR‐3(ATCC、HTB‐30)の増殖を抑制することを研究するためである。具体的には、SK‐BR‐3細胞を消化し、DMEM完全培地で再懸濁する。2000細胞/50μLで96ウェルプレート(Perkin Elmer，#6005225)に接種した；その後、37℃、5%CO2培養箱中で一晩インキュベートした。翌日、最高最終濃度100nMの5倍の濃度勾配で希釈した抗体分子を50μL/ウェルで加え、合計6つの濃度があり、均一に混合した；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とし、37℃、5%CO2培養箱中で7日間インキュベートした。その後、各ウェルに100μL CellTiter‐Glo(Promega，#G7573)を添加し、水平振動ロッカ上で10分間混合して細胞分解を誘導した。最後に、Enspire（登録商標） マルチファンクションリーダ(PerkinElmer，Inc.)で化学発光値を測定した。ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、4パラメータの非線形フィッティングにより、抗体の標的細胞に対する抑制率などのパラメータを得た。
本実施例は、HER2×CTLA4二重抗体分子がヒトHER2を高発現する腫瘍細胞系SK‐BR‐3(ATCC、HTB‐30)の増殖を抑制することを研究するためである。具体的には、SK‐BR‐3細胞を消化し、DMEM完全培地で再懸濁する。2000細胞/50μLで96ウェルプレート(Perkin Elmer，#6005225)に接種した；その後、37℃、5%CO2培養箱中で一晩インキュベートした。翌日、最高最終濃度100nMの5倍の濃度勾配で希釈した抗体分子を50μL/ウェルで加え、合計6つの濃度があり、均一に混合した；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とし、37℃、5%CO2培養箱中で7日間インキュベートした。その後、各ウェルに100μL CellTiter‐Glo(Promega，#G7573)を添加し、水平振動ロッカ上で10分間混合して細胞分解を誘導した。最後に、Enspire（登録商標） マルチファンクションリーダ(PerkinElmer，Inc.)で化学発光値を測定した。ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、4パラメータの非線形フィッティングにより、抗体の標的細胞に対する抑制率などのパラメータを得た。
本実施例において、陽性対照分子は抗HER2のモノクローナル抗体PR000210(trastuzumab類似体)であり、HER2×CTLA4二重抗体分子の親モノクローナル抗体でもある。結果を図23と表4‐19に示す。
図23(A)に示すように、Fab‐HCAb対称構造の二重抗体分子PR000655のSK‐BR‐3細胞増殖に対する抑制能力は、親モノクローナル抗体PR000210に比べて顕著に低下した。
図23(B‐C)に示すように、SK‐BR‐3細胞の増殖に対するIgG‐VH四価対称構造の二重抗体分子の抑制作用は、その具体的な分子構造によって若干異なる。抗HER2のIgGに対する抗CTLA4のVH端の二重抗体構造中の相対位置に基づいて、このような構造の二重抗体分子をさらに3つに分類する：VHはIgGの重鎖C端にある(PR000539、PR000540、PR000714、PR000715)；VHはIgGの重鎖N端にある(PR001583、PR001586)；VHはIgGの軽鎖N端にある(PR001584)。VHがIgGの重鎖C端にある場合、この構造はSK-BR-3細胞の増殖に対する抑制能力をよく保持し、親モノクローナル抗体に近い、あるいはやや優れたIC50と最大抑制率に現れ；VH端はIgGのFab端に明らかな影響を与えていないことを示している。VHがIgGの重鎖または軽鎖を問わないN端にある場合、二重抗体分子のSK-BR-3細胞増殖に対する抑制能力は親モノクローナル抗体よりやや低下し、IC50値に3～4倍の差が見られるが、同じ最大抑制率を維持することができる。
図23(D‐E)に示すように、PR000542が低下した最大抑制率レベルを示している以外、ほとんどのIgG‐VH‐VH六価対称構造の二重抗体分子のSK‐BR‐3細胞増殖に対する抑制能力は親モノクローナル抗体に近い。この結果は、HER2に対する結合能力に関する前述の結果と一致する。
図23(F)に示すように、2xVH‐IgG六価対称構造の二重抗体分子のSK‐BR‐3細胞増殖に対する抑制能力は親モノクローナル抗体に比べて明らかに低下した。この結果は、HER2に対する結合能力に関する前述の結果と一致する。
実施例4.9. HER2媒介ADCC効果
本実施例は、ヒトHER2を高発現する腫瘍細胞系BT‐474(ATCC、HTB‐20)に対するHER2×CTLA4二重抗体分子の抗体依存性の細胞媒介の細胞毒性(ADCC)を研究するためである。第一段階に、標的細胞をDELFIA BATDA(Perkin Elmer，#C136‐100)で標識する。具体的な標識方法は以下の通りである：1×106標的細胞を2μL DELFIA BATDA試薬で標識する；37℃で、CO2培養箱中で20分間インキュベートした；PBSで4回洗浄し、1000rpmで5分間遠心分離した。最後の洗浄後、沈殿物を20%FBS含有RPMI‐1640培地(Thermo，#A10491)に再懸濁し、細胞密度を1×105／mlに調整した。第二段階に、標識された標的細胞を96ウェルプレート(Corning，#3599)に100μL／ウェルで播種し、その後、最高最終濃度100nMの5倍濃度勾配で希釈した抗体分子を50μL/ウェルで加え、合計10濃度があり、均一に混合した；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とし、37℃、5%CO2培養箱中で10分間インキュベートした。第三段階に、NK-92 MI/CD16a細胞(CHEMPARTNER)をエフェクター細胞として収集し、NK-92 MI/CD16a細胞密度を1.2×106/mlに調整する；次いで、50μL/ウェルで96ウェルプレートに添加し、エフェクター細胞：標的細胞＝6：1。次いで、37℃、5%CO2培養箱中で4時間インキュベートした。第四段階に、500gで5分間遠心分離し、各ウェルから25μL上清を取って新しい96ウェル検出プレートに加えた。続いてDELFIA（登録商標） Europium溶液(Perkin Elmer，#C135‐100)を200μL/ウェルで添加し、室温でプレートを250rpmで15分間揺動した。最後に、EnVision（登録商標）2015マルチファンクションリーダ(Perkin Elmer，Inc.)で蛍光値を測定した。
本実施例は、ヒトHER2を高発現する腫瘍細胞系BT‐474(ATCC、HTB‐20)に対するHER2×CTLA4二重抗体分子の抗体依存性の細胞媒介の細胞毒性(ADCC)を研究するためである。第一段階に、標的細胞をDELFIA BATDA(Perkin Elmer，#C136‐100)で標識する。具体的な標識方法は以下の通りである：1×106標的細胞を2μL DELFIA BATDA試薬で標識する；37℃で、CO2培養箱中で20分間インキュベートした；PBSで4回洗浄し、1000rpmで5分間遠心分離した。最後の洗浄後、沈殿物を20%FBS含有RPMI‐1640培地(Thermo，#A10491)に再懸濁し、細胞密度を1×105／mlに調整した。第二段階に、標識された標的細胞を96ウェルプレート(Corning，#3599)に100μL／ウェルで播種し、その後、最高最終濃度100nMの5倍濃度勾配で希釈した抗体分子を50μL/ウェルで加え、合計10濃度があり、均一に混合した；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とし、37℃、5%CO2培養箱中で10分間インキュベートした。第三段階に、NK-92 MI/CD16a細胞(CHEMPARTNER)をエフェクター細胞として収集し、NK-92 MI/CD16a細胞密度を1.2×106/mlに調整する；次いで、50μL/ウェルで96ウェルプレートに添加し、エフェクター細胞：標的細胞＝6：1。次いで、37℃、5%CO2培養箱中で4時間インキュベートした。第四段階に、500gで5分間遠心分離し、各ウェルから25μL上清を取って新しい96ウェル検出プレートに加えた。続いてDELFIA（登録商標） Europium溶液(Perkin Elmer，#C135‐100)を200μL/ウェルで添加し、室温でプレートを250rpmで15分間揺動した。最後に、EnVision（登録商標）2015マルチファンクションリーダ(Perkin Elmer，Inc.)で蛍光値を測定した。
殺傷比率は次の式に基づいて計算される。
殺傷率(%)＝(ER-ETSR)/(TMR-ETSR)*100%
ここで：
殺傷率(%)＝(ER-ETSR)/(TMR-ETSR)*100%
ここで：
ER＝実験ウェル(抗体＋エフェクター細胞＋標的細胞)、ETSR＝標的細胞とエフェクター細胞を混合した自発放出ウェル(エフェクター細胞＋標的細胞)、TMR＝標的細胞最大放出ウェル(標的細胞＋溶解液)
ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、4パラメータの非線形フィッティングにより、抗体の標的細胞に対する殺傷率曲線とEC50及び最大殺傷率などのパラメータを得た。
本実施例において、陽性対照分子は抗HER2のモノクローナル抗体PR000210(trastuzumab類似体)であり、HER2×CTLA4二重抗体分子の親モノクローナル抗体でもある。
図22及び表4‐20に示すように、IgG‐VH‐VH六価対称構造を有する二重抗体分子PR001582及びIgG‐VH四価対称構造を有する二重抗体分子PR001586はいずれも強いADCC作用を引き起こすことができる。
実施例4.10. フローサイトメトリーを使用して、二重抗体分子が2種類の細胞と同時に結合する能力を測定すること
本実施例は、HER2×CTLA4二重抗体分子がヒトHER2を発現する細胞SK‐BR‐3(ATCC、HTB‐30)及びヒトCTLA4を発現する細胞CHO‐K1／hCTLA4(CHEMPARTNER)と同時に結合する能力を有するかどうかを研究するためである。第一段階に、CHO‐K1/hCTLA4細胞とSK‐BR‐3細胞をそれぞれCFSE(Thermo，#C34554)とFar red(Thermo，#C34564)染料で蛍光標識した。具体的な手順は以下の通り：CHO-K1/hCTLA4細胞とSK-BR-3細胞をそれぞれPBSに再懸濁し、2×106/mlに調整する；CHO-K1/hCTLA4細胞とSK-BR-3細胞に5μM CFSEと1μM Far redをそれぞれ添加し、37℃で10分間インキュベートし、時々揺動した；5倍量の完全培地を添加して染色を中止した。その後、4℃で5分間遠心分離し、上清を捨て、その後PBSを加えて2回洗浄した。標識後のCHO-K1/hCTLA4細胞とSK-BR-3細胞の密度をそれぞれ4×106/mlと2×106/mlに調整した。第二段階に、標識されたCHO-K1/hCTLA4細胞とSK-BR-3細胞をそれぞれ25μl採取し、50μlの4倍濃度勾配で希釈した抗体分子と均一に混合し、96ウェルプレートに添加し、そのうち抗体分子の最高最終濃度は31.25nMで、合計6つの濃度があり、hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。遮光して4℃で1時間インキュベートした。その後、ウェル当たり100μlの4%ポリホルムアルデヒドPFA固定細胞を添加して10分間固定した。最後に、BD FACS CANTOIIフローサイトメータを用いて蛍光信号値を読み取り、ソフトウェアFlowJov 10(FlowJo、LLC)を用いてデータを処理し分析した。異なる蛍光標識に基づいて異なる象限内の細胞数をそれぞれ統計する：Q1はFar-red標識のSK-BR-3細胞(SK-BR-3+)であり；Q3はCFSEによって標識されたCHO‐K1／hCTLA4細胞(CTLA4＋)であり；Q2は二重抗体分子が二種類の細胞と同時に結合することによって形成された二種類の標識を持つ細胞群(CTLA4+&SK-BR-3+)を含む。二重標識陽性細胞群(Q2)の、すべての標識されたSK‐BR‐3細胞(Q1＋Q2)に対する占有率は、以下の式に基づいて計算され、二重抗体分子が2つの細胞と同時に結合する能力を反映した。
本実施例は、HER2×CTLA4二重抗体分子がヒトHER2を発現する細胞SK‐BR‐3(ATCC、HTB‐30)及びヒトCTLA4を発現する細胞CHO‐K1／hCTLA4(CHEMPARTNER)と同時に結合する能力を有するかどうかを研究するためである。第一段階に、CHO‐K1/hCTLA4細胞とSK‐BR‐3細胞をそれぞれCFSE(Thermo，#C34554)とFar red(Thermo，#C34564)染料で蛍光標識した。具体的な手順は以下の通り：CHO-K1/hCTLA4細胞とSK-BR-3細胞をそれぞれPBSに再懸濁し、2×106/mlに調整する；CHO-K1/hCTLA4細胞とSK-BR-3細胞に5μM CFSEと1μM Far redをそれぞれ添加し、37℃で10分間インキュベートし、時々揺動した；5倍量の完全培地を添加して染色を中止した。その後、4℃で5分間遠心分離し、上清を捨て、その後PBSを加えて2回洗浄した。標識後のCHO-K1/hCTLA4細胞とSK-BR-3細胞の密度をそれぞれ4×106/mlと2×106/mlに調整した。第二段階に、標識されたCHO-K1/hCTLA4細胞とSK-BR-3細胞をそれぞれ25μl採取し、50μlの4倍濃度勾配で希釈した抗体分子と均一に混合し、96ウェルプレートに添加し、そのうち抗体分子の最高最終濃度は31.25nMで、合計6つの濃度があり、hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。遮光して4℃で1時間インキュベートした。その後、ウェル当たり100μlの4%ポリホルムアルデヒドPFA固定細胞を添加して10分間固定した。最後に、BD FACS CANTOIIフローサイトメータを用いて蛍光信号値を読み取り、ソフトウェアFlowJov 10(FlowJo、LLC)を用いてデータを処理し分析した。異なる蛍光標識に基づいて異なる象限内の細胞数をそれぞれ統計する：Q1はFar-red標識のSK-BR-3細胞(SK-BR-3+)であり；Q3はCFSEによって標識されたCHO‐K1／hCTLA4細胞(CTLA4＋)であり；Q2は二重抗体分子が二種類の細胞と同時に結合することによって形成された二種類の標識を持つ細胞群(CTLA4+&SK-BR-3+)を含む。二重標識陽性細胞群(Q2)の、すべての標識されたSK‐BR‐3細胞(Q1＋Q2)に対する占有率は、以下の式に基づいて計算され、二重抗体分子が2つの細胞と同時に結合する能力を反映した。
Q2の細胞比率：(Q2/(Q1+Q2)＊100%
ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、4パラメータの非線形フィッティングにより、抗体が同時に2種類の標的細胞に結合する曲線を得た。
ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、4パラメータの非線形フィッティングにより、抗体が同時に2種類の標的細胞に結合する曲線を得た。
本実施例において、抗HER2のモノクローナル抗体PR000210(trastuzumab類似体)と抗CTLA4のモノクローナル抗体PR000184は対照分子として、またHER2×CTLA4二重抗体分子の親モノクローナル抗体である。
図24のA、B、CにはそれぞれIgG-VH四価対称構造二重抗体(PR000539、PR000540、PR000715)、IgG-VH-VH六価対称構造二重抗体(PR000541とPR000542)、Fab-FC-VH非対称構造二重抗体(PR000916)がCHOK1/CTLA4及びSK-BR-3細胞と同時に結合する能力を示し；ここで、PR000210、PR000184及びhIgG1 isoは対照である。対照分子HER2モノクローナル抗体PR000210とCTLA4モノクローナル抗体PR000184は二種類の細胞と同時に結合することができなかった。示されたHER2×CTLA4二重抗体分子は、対称または非対称構造において、異なる標的を発現する2つの細胞と同時に結合することができる。
実施例4.11. 薬物動態学の研究
本実施例は、マウス体内における抗体分子の薬物動態学特性を研究した。本実施例では、抗HER2のモノクローナル抗体PR000210(trastuzumab類似体)、IgG‐VH四価対称構造を有するHER2×CTLA4二重抗体分子PR000540、IgG‐VH‐VH六価対称構造を有するHER2×CTLA4二重抗体分子PR000541について測定した。
本実施例は、マウス体内における抗体分子の薬物動態学特性を研究した。本実施例では、抗HER2のモノクローナル抗体PR000210(trastuzumab類似体)、IgG‐VH四価対称構造を有するHER2×CTLA4二重抗体分子PR000540、IgG‐VH‐VH六価対称構造を有するHER2×CTLA4二重抗体分子PR000541について測定した。
実施方法は以下の通り：各試験抗体分子に対して、体重18～22グラムの雌C57BL/6マウス3匹を選択し、5mg/kgの用量で静脈注射により投与する；投与前及び投与後0.5時間、24時間(1日)、2日目、4日目、7日目、10日目及び14日目に全血を採取し、全血を30分間静置して凝固させた後、4℃で12000gで5分間遠心分離し、分離した血清サンプルを-80℃で分析するまで凍結保存した。
本実施例は、Fc端検出ELISA法を用いてマウス血清中の薬物濃度を定量的に測定した。すなわち、96ウェルプレートに包接されたヤギ抗ヒトFcポリクローナル抗体によりマウス血清中のヒトFc含有融合タンパク質を捕捉し、HRP標識ヤギ抗ヒトFc第2抗体を加えて検出した。Phoenix WinNonlinソフトウェアバージョン6.4を使用して、非房室モデル(NCA)を選択して血中の濃度データを分析し、その薬物動態学を評価した。
図26及び表4‐21に示すように、二重抗体PR000540及び親モノクローナル抗体PR000210は同様のクリアレートを有し、PR000540はより長い半減期t1/2値(20日以上)を有する。複雑な構造のためか、PR000541は速いクリアレートを示している。
実施例4.12. まとめ
本実施例は、抗HER2のIgG抗体の抗原結合ドメインFabと抗CTLA4のHCAb抗体の抗原結合ドメインVHを用いて、多種類の構造の抗HER2×CTLA4二重特異性抗体分子を構築した。HCAbに基づいて二重特異性抗体分子構造を構築するフレキシビリティを示し、異なる構造タイプ、相対位置、結合価数などのパラメータを通じてHER2端とCTLA4端の機能活性を調節し、さらに異なる活性組み合わせを設計し、異なる作用機序の需要を実現する。現在、抗HER2のモノクローナル抗体trastuzumabの乳癌治療における推奨初期用量は4mg/kgであり、胃癌治療における推奨初期用量は8mg/kgであり、メラノーマの治療における抗CTLA4のモノクローナル抗体Ipilimumabの推奨用量としての3mg/kgよりわずかに高い。
本実施例は、抗HER2のIgG抗体の抗原結合ドメインFabと抗CTLA4のHCAb抗体の抗原結合ドメインVHを用いて、多種類の構造の抗HER2×CTLA4二重特異性抗体分子を構築した。HCAbに基づいて二重特異性抗体分子構造を構築するフレキシビリティを示し、異なる構造タイプ、相対位置、結合価数などのパラメータを通じてHER2端とCTLA4端の機能活性を調節し、さらに異なる活性組み合わせを設計し、異なる作用機序の需要を実現する。現在、抗HER2のモノクローナル抗体trastuzumabの乳癌治療における推奨初期用量は4mg/kgであり、胃癌治療における推奨初期用量は8mg/kgであり、メラノーマの治療における抗CTLA4のモノクローナル抗体Ipilimumabの推奨用量としての3mg/kgよりわずかに高い。
例えば、抗CTLA4のVHが抗PD‐L1のIgGのN端にある場合、二重抗体分子(例えばPR001583及びPR001584)のHER2端及びCTLA4端はいずれもその親モノクローナル抗体に相当する活性をほぼ完全に保持することができ、また腫瘍細胞増殖抑制実験及び超抗原刺激実験などの体外機能実験において、対応する親モノクローナル抗体と類似の能力を示し、したがって、併用薬の1：1の用量の組み合わせを実現するために使用することができる。
また、例えば、IgG‐VH‐VH六価対称構造の二重抗体分子(例えば、PR001579、PR001580、PR001581)のHER2末端とCTLA4端もその親モノクローナル抗体に相当する活性をほぼ完全に維持することができるので、併用薬の1：1の用量の組み合わせを実現するために使用することができる。
また、例えば、抗CTLA4のVHが抗HER2のIgGのC端にある場合、またはFab-HCAb構造にある場合、二重抗体分子(例えばPR000539、PR000540、PR000655)HER2端の活性はほとんど親モノクローナル抗体に相当するが、そのCTLA4端の活性は異なる程度で弱まっている；したがって、臨床におけるCTLA4抑制剤の中程度または低用量の需要を実現するために使用することができる。
また、例えば、Fab‐Fc‐VH(2)非対称構造では、二重抗体分子のHER2結合ドメインは一価のFab構造であるが、HER2を結合する能力は二価の親モノクローナル抗体に非常に近い；それは2つの直列に形成されたCTLA4結合ドメインを含み、そのCTLA4と結合する能力は親モノクローナル抗体と似ているが、T細胞活性化能力は親モノクローナル抗体に比べて弱まっている；したがって、この構造は腫瘍標的細胞とT細胞を一緒に引っ張り、免疫シナプスの形成を促進することができ、臨床上のCTLA4抑制剤の中程度または低用量の需要を実現することができ、同時に腫瘍の特異的な標的化能力を増加させることができる。
実施例5. PD-L1×4-1BB二重特異性抗体
実施例5.1. 背景
プログラム死受容体1(programmed death 1、PD-1)は主にT細胞などの免疫細胞に発現し、それは2つのリガンド、すなわちプログラム死リガンド-1(programmed death ligand 1、PD-L1)とPD-L2を有する。PD‐L1は主に抗原提示細胞及び複数の腫瘍細胞に発現される。PD‐L1とPD‐1の相互作用はT細胞の活性を低下させ、サイトカインの分泌を弱め、免疫抑制作用を果たす。多くのヒト腫瘍組織においてPD‐L1タンパク質の発現が検出され、腫瘍部位のミクロ環境は腫瘍細胞上のPD‐L1の発現を誘導でき、発現されたPD‐L1は腫瘍の発生と成長に有利であり、抗腫瘍T細胞のアポトーシスを誘導し、さらに腫瘍細胞を保護して免疫攻撃から逃れる。
実施例5.1. 背景
プログラム死受容体1(programmed death 1、PD-1)は主にT細胞などの免疫細胞に発現し、それは2つのリガンド、すなわちプログラム死リガンド-1(programmed death ligand 1、PD-L1)とPD-L2を有する。PD‐L1は主に抗原提示細胞及び複数の腫瘍細胞に発現される。PD‐L1とPD‐1の相互作用はT細胞の活性を低下させ、サイトカインの分泌を弱め、免疫抑制作用を果たす。多くのヒト腫瘍組織においてPD‐L1タンパク質の発現が検出され、腫瘍部位のミクロ環境は腫瘍細胞上のPD‐L1の発現を誘導でき、発現されたPD‐L1は腫瘍の発生と成長に有利であり、抗腫瘍T細胞のアポトーシスを誘導し、さらに腫瘍細胞を保護して免疫攻撃から逃れる。
4‐1BB(TNFRSF 9、CD137)は、TNF受容体スーパーファミリーに属する膜貫通タンパク質である。4‐1BBは、複数の免疫細胞上で発現される共刺激分子であり、免疫活性の多機能調節剤である。活性化されたT細胞、NK細胞などの免疫細胞に誘導し発現される。4‐1BBは、そのリガンド4‐1BBL媒介の三量化によりT細胞を活性化し、細胞増殖及びサイトカイン放出を促進する。抗4-1BBのアゴニスト抗体は、腫瘍を抑制する機能があり、最初に臨床試験に入った4-1BB抗体はファイザーのUtomilumabとブリストル マイヤーズ スクイブ(BMS)社のUrelumab(BMS-663513)であった。Urelumabの最初の臨床結果は2008年に発表され、一部の患者で鼓舞的な治療効果が観察されたが、データはUrelumabが肝臓毒性をもたらし、標的と用量と関係があることを示した。また、臨床試験で2人の患者が肝毒性で死亡したため、関連臨床試験は中止された。Utomilumabは安全性がより良く、用量は10mg/kgまで高めることができるが、治療効果は依然としてよくない。
本実施例では、PD‐L1と4‐1BBを同時に標的とする二重特異性抗体を構築し、1つ以上の作用機序により抗腫瘍効果と安全性を向上させた。第一に、PD‐L1×4‐1BB二重抗体は、PD‐1／PD‐L1信号経路を遮断することによってT細胞を活性化することができる。第二に、腫瘍細胞表面に高発現するPD‐L1分子は、二重抗体分子を利用することで、T細胞表面の4‐1BB分子の架橋及び三量化を促進し、下流信号伝導経路を活性化し、さらにT細胞に対する活性化及び増殖を促進することができる。第三に、二重抗体分子媒介のT細胞活性化は腫瘍ミクロ環内に限られ、これにより、Urelumabのようなモノクローナル抗体が正常組織でT細胞を過度に活性化することによる毒副作用を回避することができる。
実施例5.2. 抗PD-L1のIgG抗体と抗4-1BBのH2L2またはHCAb抗体の獲得
実施例5.2.1. 抗PD-L1の全ヒト由来IgG抗体の獲得
本実施例で用いた抗PD‐L1の全ヒト由来IgG抗体PR000265(表5‐8)は、実施例3.2.1に記載されているように、Harbour H2L2マウスに由来している。
実施例5.2.1. 抗PD-L1の全ヒト由来IgG抗体の獲得
本実施例で用いた抗PD‐L1の全ヒト由来IgG抗体PR000265(表5‐8)は、実施例3.2.1に記載されているように、Harbour H2L2マウスに由来している。
実施例5.2.2. 抗4-1BBの全ヒト由来H2L2抗体の獲得
Harbour H2L2マウス(Harbour Antibodies BV)はヒト免疫グロブリン免疫ライブラリを持つトランスジェニックマウスであり、その産生抗体は完全なヒト抗体可変ドメインとラット定常ドメインを有する。
Harbour H2L2マウス(Harbour Antibodies BV)はヒト免疫グロブリン免疫ライブラリを持つトランスジェニックマウスであり、その産生抗体は完全なヒト抗体可変ドメインとラット定常ドメインを有する。
Harbour H2L2マウスに対して、可溶性組換えヒト4‐1BB‐Fc融合タンパク(GENSCRIPT Biotech)を用いて多ラウンド免疫を行った。マウス血清中の4‐1BB特異性抗体価が特定のレベルに達したことを検出した後、マウスの脾臓細胞を取り出し、骨髄腫細胞系と融合してハイブリドーマ細胞を得た；ハイブリドーマ細胞を多ラウンドスクリーニング及びコローナルした後、4‐1BBを特異的に識別するいくつかのモノクローナル抗体分子を同定した。これらのモノクローナル抗体をさらに同定し、ヒト4‐1BBに対する結合能力、カニクイザル4‐1BBに対する結合能力、T細胞活性化能力などのパラメータに基づいて、いくつかの好ましい候補抗体分子を出す。その後、候補抗体分子の配列分析と最適化を行い、数個の変異体配列を得た。抗体のVL及びVH配列を対応するヒトのκ軽鎖定常領域とIgG1重鎖定常領域配列を融合発現し、組換え全ヒト由来抗体分子を得た。表5‐8には、抗4‐1BBの組換え全ヒト由来IgG抗体PR000197及びPR000448を示す。
4‐1BB抗体PR000197、PR000448が人4‐1BB高発現するCHO‐K1細胞株CHO‐K1／hu4‐1BB(GENSCRIPT、M00538)と結合する能力を、フローサイトメトリー細胞法FACSと実施例5.6に記載の方法を用いて測定し、図28(A‐B)に示すように、その結合能力はUtomilumabと類似していた。
実施例5.2.3. 抗4-1BBの全ヒト由来HCAb抗体の獲得
Harbour HCAbマウス(Harbour Antibodies BV、WO2010/109165A2)はヒト免疫グロブリン免疫ライブラリを持つトランスジェニックマウスで、従来のIgG抗体の半分の大きさしかなく、重鎖のみからなる抗体を産生することができる。その産生抗体は、ヒトの抗体重鎖可変ドメインとマウスFc定常ドメインのみを有する。
Harbour HCAbマウス(Harbour Antibodies BV、WO2010/109165A2)はヒト免疫グロブリン免疫ライブラリを持つトランスジェニックマウスで、従来のIgG抗体の半分の大きさしかなく、重鎖のみからなる抗体を産生することができる。その産生抗体は、ヒトの抗体重鎖可変ドメインとマウスFc定常ドメインのみを有する。
Harbour HCAbマウスに対して、可溶性組換えヒト4‐1BB‐Fc融合タンパク質(CHEMPARTNER)またはヒト4‐1BBを過発現したNIH‐3T3細胞(CHEMPARTNER)を用いて多ラウンド免疫した。マウス血清中の4‐1BB特異性抗体価が特定のレベルに達したことを検出した後、マウスの脾臓細胞を取り出してB細胞を分離し、マウススラリー細胞選別キット(Miltenyi，#130-092-530)でCD138陽性のスラリー細胞を選別した。従来の分子生物学的手段を用いて形質細胞からヒトVH遺伝子を増幅し、増幅されたヒトVH遺伝子フラグメントをヒトIgG1抗体重鎖Fc領域配列をコードする哺乳動物細胞発現プラスミドpCAGベクターに構築した。プラスミドで哺乳動物宿主細胞(例えばヒト胚腎細胞HEK293)をトランスフェクションし発現させ、全ヒト由来HCAb抗体上清を得た。FACSを用いてHCAb抗体上清と人4-1BBを高発現するCHO-K1細胞CHO-K1/hu4-1BBとの結合を試験し、陽性HCAb抗体を同定した。これらのHCAb抗体をさらに同定し、ヒト4‐1BBに対する結合能力、カニクイザル4‐1BBに対する結合能力、T細胞活性化能力などのパラメータに基づいて、いくつかの好ましい候補HCAb抗体分子を出す。その後、候補HCAb抗体分子の配列解析と最適化を行い、数個の変異体配列を得た。HCAb抗体のVH配列とヒトのIgG1重鎖Fc配列を融合発現し、全ヒト由来の組換えHCAb抗体分子を得た。表5‐8に、抗4‐1BBの組換え全ヒト由来HCAb抗体PR001758、PR001760及びPR001836を示す。
4‐1BB重鎖抗体が細胞CHO‐K1／hu4‐1BB(GENSCRIPT、M00538)と結合する能力をフローサイトメトリー細胞法FACSと実施例5.6に記載の方法を用いて試験し、図28(C‐F)に示すように、その結合能力はUtomilumabと類似し、Urelumabより優れていた。
実施例5.3. 抗PD‐L1のIgG抗体と抗4‐1BBのIgG抗体を用いてFIT‐Ig構造を有する二重特異性抗体分子を構築すること
本実施例は、抗PD‐L1のIgG抗体PR000265またはPR000151(atezolizumab類似体)の抗原結合ドメインFabと、抗4‐1BBのIgG抗体PR000197またはPR000448の抗原結合ドメインFabを用いて、FIT‐Ig構造を有する抗PD‐L1×4‐1BBの二重特異性抗体分子を構築する。FIT‐Ig構造の設計は特許WO2015/103072A1を参照することができ、構造は図1(28)に示すように参照することができる；構築した分子を表5‐1にまとめた。そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表52にまとめた。表53は、FIT‐Ig構造の二重抗体分子のポリペプチド鎖配列に対応する配列番号を示す。
本実施例は、抗PD‐L1のIgG抗体PR000265またはPR000151(atezolizumab類似体)の抗原結合ドメインFabと、抗4‐1BBのIgG抗体PR000197またはPR000448の抗原結合ドメインFabを用いて、FIT‐Ig構造を有する抗PD‐L1×4‐1BBの二重特異性抗体分子を構築する。FIT‐Ig構造の設計は特許WO2015/103072A1を参照することができ、構造は図1(28)に示すように参照することができる；構築した分子を表5‐1にまとめた。そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表52にまとめた。表53は、FIT‐Ig構造の二重抗体分子のポリペプチド鎖配列に対応する配列番号を示す。
実施例5.4. 抗PD‐L1のIgG抗体と抗4‐1BBのHCAb抗体を用いた二重特異性抗体分子の構築
本実施例は、抗PD‐L1のIgG抗体PR000265の抗原結合ドメインFabと、抗4‐1BBのHCAb抗体PR001758、PR001760またはPR001836の抗原結合ドメインVHを用いて、多種類の構造の抗PD‐L1×4‐1BBの二重特異性抗体分子を構築する。
本実施例は、抗PD‐L1のIgG抗体PR000265の抗原結合ドメインFabと、抗4‐1BBのHCAb抗体PR001758、PR001760またはPR001836の抗原結合ドメインVHを用いて、多種類の構造の抗PD‐L1×4‐1BBの二重特異性抗体分子を構築する。
本実施例及び下記の実施例において、陽性対照分子は抗PD‐L1のIgGモノクローナル抗体PR000265であり、PD‐L1×4‐1BB二重抗体分子のPD‐L1端の親モノクローナル抗体でもある。陽性対照分子は抗4‐1BBのIgGモノクローナル抗体urelumab(IgG4)またはutomilumab(IgG2)であった。陽性対照分子はPD‐L1×4‐1BB二重抗体分子PR001289であり、その配列は特許WO2017/123650A2に開示されている抗4‐1BB及び抗PD‐L1の単一ドメイン抗体配列に由来する。
実施例5.4.1. Fab‐HCAb対称構造分子の構築
抗PD‐L1のIgG抗体と抗4‐1BBの重鎖抗体を用いて、実施例1.1に記載の構造に従ってFab‐HCAb対称構造のPD‐L1×4‐1BB二重抗体分子を設計し、表54にまとめた。そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表55にまとめた。
抗PD‐L1のIgG抗体と抗4‐1BBの重鎖抗体を用いて、実施例1.1に記載の構造に従ってFab‐HCAb対称構造のPD‐L1×4‐1BB二重抗体分子を設計し、表54にまとめた。そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表55にまとめた。
実施例5.4.2. IgG‐VH四価対称構造分子の構築
抗PD‐L1のIgG抗体と抗4‐1BBの重鎖抗体を用いて、実施例1.2に記載の構造に従ってIgG‐VH四価対称構造のPD‐L1×4‐1BB二重抗体分子を設計し、表56にまとめた。そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表57にまとめた。
抗PD‐L1のIgG抗体と抗4‐1BBの重鎖抗体を用いて、実施例1.2に記載の構造に従ってIgG‐VH四価対称構造のPD‐L1×4‐1BB二重抗体分子を設計し、表56にまとめた。そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表57にまとめた。
実施例5.4.3. PD-L1×4-1BB二重抗体分子及び対照分子の配列リスト
表5‐8、表5‐9及び表5‐10は、本実施例によって構築されたPD‐L1×4‐1BB二重抗体分子及び対応するPD‐L1モノクローナル抗体、4‐1BBモノクローナル抗体などの親モノクローナル抗体分子及び対照分子の配列に対応する配列番号を示す。表5‐10の構造番号は、表1‐1及び図1に対応する。表5‐11は、二重特異性抗体分子の第1及び第2抗原結合ドメインに対応するCDR配列の配列番号を示す。
表5‐8、表5‐9及び表5‐10は、本実施例によって構築されたPD‐L1×4‐1BB二重抗体分子及び対応するPD‐L1モノクローナル抗体、4‐1BBモノクローナル抗体などの親モノクローナル抗体分子及び対照分子の配列に対応する配列番号を示す。表5‐10の構造番号は、表1‐1及び図1に対応する。表5‐11は、二重特異性抗体分子の第1及び第2抗原結合ドメインに対応するCDR配列の配列番号を示す。
実施例5.5. PD-L1を結合
本実施例はPD‐L1×4‐1BB二重抗体分子がPD‐L1を結合する活性を研究するためである。
本実施例はPD‐L1×4‐1BB二重抗体分子がPD‐L1を結合する活性を研究するためである。
実施例5.5.1. ヒトPD‐L1を高発現するCHO‐K1細胞CHO‐K1／hPDL1との結合
抗体分子の、ヒトPD‐L1を高発現するCHO‐K1細胞株CHO‐K1／hPDL1(GENSCRIPT、M00543)との結合能力を、フローサイトメトリー細胞法FACSを用いて試験した。具体的には、CHO‐K1/hPDL1細胞を消化し、完全培地で再懸濁する；細胞密度を1×106細胞/mLに調整した。次いで細胞を96ウェルVプレート(Corning，#3894)に100μL/ウェルで播種し、4℃で5分間遠心分離し、上清を廃棄した。その後、勾配希釈された抗体分子を100μL/ウェルで96ウェルプレートに添加し、均一に混合し、抗体分子は最高最終濃度200nMから3倍濃度勾配で希釈された合計12濃度であり、hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。細胞を4℃に置き、遮光して1時間インキュベートした。その後、100μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液(0.5%BSA含有PBS緩衝液)を加えて細胞を2回すすぎ、4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に、さらに100μL／ウェルで蛍光二次抗体(Goat human lgG(H＋L)Alexa Fluor 488 conjunction，Thermo，#A11013，1：1000希釈)を加え、4℃に放置し、遮光して1時間インキュベートした。その後、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を加えて細胞を2回すすぎ、その後4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を添加して、細胞を再懸濁した。BD FACS CANTOIIフローサイトメータまたはACEA NovoCyteフローサイトメータを用いて蛍光発光信号値を読み取り、ソフトウェアFlowJov 10(FlowJo，LLC)を用いてデータを処理し分析した。ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、4パラメータの非線形フィッティングにより、抗体の標的細胞に対する結合曲線及びEC50値などのパラメータを得た。
抗体分子の、ヒトPD‐L1を高発現するCHO‐K1細胞株CHO‐K1／hPDL1(GENSCRIPT、M00543)との結合能力を、フローサイトメトリー細胞法FACSを用いて試験した。具体的には、CHO‐K1/hPDL1細胞を消化し、完全培地で再懸濁する；細胞密度を1×106細胞/mLに調整した。次いで細胞を96ウェルVプレート(Corning，#3894)に100μL/ウェルで播種し、4℃で5分間遠心分離し、上清を廃棄した。その後、勾配希釈された抗体分子を100μL/ウェルで96ウェルプレートに添加し、均一に混合し、抗体分子は最高最終濃度200nMから3倍濃度勾配で希釈された合計12濃度であり、hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。細胞を4℃に置き、遮光して1時間インキュベートした。その後、100μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液(0.5%BSA含有PBS緩衝液)を加えて細胞を2回すすぎ、4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に、さらに100μL／ウェルで蛍光二次抗体(Goat human lgG(H＋L)Alexa Fluor 488 conjunction，Thermo，#A11013，1：1000希釈)を加え、4℃に放置し、遮光して1時間インキュベートした。その後、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を加えて細胞を2回すすぎ、その後4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を添加して、細胞を再懸濁した。BD FACS CANTOIIフローサイトメータまたはACEA NovoCyteフローサイトメータを用いて蛍光発光信号値を読み取り、ソフトウェアFlowJov 10(FlowJo，LLC)を用いてデータを処理し分析した。ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、4パラメータの非線形フィッティングにより、抗体の標的細胞に対する結合曲線及びEC50値などのパラメータを得た。
本実施例において、陽性対照分子は抗PD‐L1のモノクローナル抗体PR000265であり、PD‐L1×4‐1BB二重抗体分子のPD‐L1端の親モノクローナル抗体でもある。結果を図27と表5‐12に示す。
図27(A)に示すように、IgG‐VH四価対称構造の二重抗体分子(PR003549、PR003550、PR003551)がPD‐L1を結合する能力は親モノクローナル抗体PR000265と類似しており、PD‐L1を結合するEC50値とMFI最大値はFIT‐Ig構造の二重抗体分子(PR000701、PR003052)よりやや優れている。
図27(B)に示すように、Fab‐HCAb対称構造の二重抗体分子(PR004270)がPD‐L1に結合する能力は親モノクローナル抗体と似ており、PD‐L1を結合するEC50値は親モノクローナル抗体よりやや弱いが、結合のMFI最大値は親モノクローナル抗体よりも高い。
図27(C)に示すように、Fab‐HCAb対称構造の二重抗体分子は、構造(1)の分子(PR007164)であれ構造(2)の分子(PR007163)であれ、ほとんど同じPD‐L1結合活性を有し、FabのCLをVH_Bが位置する重鎖に融合することはFab端の結合活性に影響しないと示している。
実施例5.6. 4-1BBとの結合
本実施例は、PD‐L1×4‐1BB二重抗体分子が4‐1BBと結合する活性を研究するためである。
抗体分子の、ヒト4‐1BBを高発現するCHO‐K1細胞株CHO‐K1／hu4‐1BB(GENSCRIPT、M00538)とカニクイザル4‐1BBを高発現するCHO‐K1細胞株CHO‐K1／cyno 4‐1BB(GENSCRIPT、M00569)などと結合する能力を、フローサイトメトリーFACSを用いて試験した。具体的には、細胞を消化し、完全培地で再懸濁する；細胞密度を2×106細胞/mLに調整した。次いで、細胞を96ウェルVプレート(Corning，#3894)に100μL／ウェル(2×105細胞／ウェル)で播種し、4℃で5分間遠心分離し、上清を廃棄した。その後、勾配希釈された抗体分子を100μL/ウェルで96ウェルプレートに添加し、均一に混合し、抗体分子は最高最終濃度200nMから3倍濃度勾配で希釈された合計12濃度であり、hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。細胞を4℃に置き、遮光して1時間インキュベートした。その後、100μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液(0.5%BSA含有PBS緩衝液)を加えて細胞を2回すすぎ、4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に、さらに100μL／ウェルで蛍光二次抗体(Goat human lgG(H＋L)Alexa Fluor 488 conjunction，Thermo，#A11013，1：1000希釈)を加え、4℃に放置し、遮光して1時間インキュベートした。その後、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を加えて細胞を2回すすぎ、その後4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を添加して、細胞を再懸濁した。BD FACS CANTOIIフローサイトメータまたはACEA NovoCyteフローサイトメータを用いて蛍光発光信号値を読み取り、ソフトウェアFlowJov 10(FlowJo，LLC)を用いてデータを処理し分析した。ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、4パラメータの非線形フィッティングにより、抗体の標的細胞に対する結合曲線及びEC50値などのパラメータを得た。
本実施例は、PD‐L1×4‐1BB二重抗体分子が4‐1BBと結合する活性を研究するためである。
抗体分子の、ヒト4‐1BBを高発現するCHO‐K1細胞株CHO‐K1／hu4‐1BB(GENSCRIPT、M00538)とカニクイザル4‐1BBを高発現するCHO‐K1細胞株CHO‐K1／cyno 4‐1BB(GENSCRIPT、M00569)などと結合する能力を、フローサイトメトリーFACSを用いて試験した。具体的には、細胞を消化し、完全培地で再懸濁する；細胞密度を2×106細胞/mLに調整した。次いで、細胞を96ウェルVプレート(Corning，#3894)に100μL／ウェル(2×105細胞／ウェル)で播種し、4℃で5分間遠心分離し、上清を廃棄した。その後、勾配希釈された抗体分子を100μL/ウェルで96ウェルプレートに添加し、均一に混合し、抗体分子は最高最終濃度200nMから3倍濃度勾配で希釈された合計12濃度であり、hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。細胞を4℃に置き、遮光して1時間インキュベートした。その後、100μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液(0.5%BSA含有PBS緩衝液)を加えて細胞を2回すすぎ、4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に、さらに100μL／ウェルで蛍光二次抗体(Goat human lgG(H＋L)Alexa Fluor 488 conjunction，Thermo，#A11013，1：1000希釈)を加え、4℃に放置し、遮光して1時間インキュベートした。その後、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を加えて細胞を2回すすぎ、その後4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液を添加して、細胞を再懸濁した。BD FACS CANTOIIフローサイトメータまたはACEA NovoCyteフローサイトメータを用いて蛍光発光信号値を読み取り、ソフトウェアFlowJov 10(FlowJo，LLC)を用いてデータを処理し分析した。ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、4パラメータの非線形フィッティングにより、抗体の標的細胞に対する結合曲線及びEC50値などのパラメータを得た。
本実施例において、陽性対照分子は抗4‐1BBのモノクローナル抗体UrelumabまたはUtomilumabである。
実施例5.6.1. ヒト4‐1BBを高発現するCHO‐K1細胞CHO‐K1／hu4‐1BBとの結合
その結果を図28及び表5‐13に示す。
その結果を図28及び表5‐13に示す。
図28(G)に示すように、IgG‐VH四価対称構造の二重抗体分子(PR003549、PR003550、PR003551)がヒト4‐1BBを結合する能力はFIT‐Ig構造の二重抗体分子(PR000701、PR003052)より優れ、MFI最大値では陽性対照Urelumabより優れている。
図28(H)に示すように、Fab‐HCAb対称構造の二重抗体分子(PR004270)がヒト4‐1BBに結合する能力は、MFI最大値において陽性対照Urelumab及びUtomilumabより優れている。
図28(I)に示すように、Fab‐HCAb対称構造の二重抗体分子は、構造(1)の分子(PR007164)であれ構造(2)の分子(PR007163)であれ、ほぼ同じ4‐1BB結合活性を有し、しかも親モノクローナル抗体PR001760に相当する。
実施例5.6.2. カニクイザル4‐1BBを高発現するCHO‐K1細胞CHO‐K1／cyno 4‐1BBとの結合
図29及び表5‐14に示すように、本実施例の二重抗体分子はカニクイザル4‐1BBと結合することができ、Urelumabはできない。二重抗体分子がカニクイザル4‐1BB(図29、A‐B)と結合する能力は、ヒト4‐1BB(図28、G‐H)と結合する能力に匹敵し、類似の結合EC50を有する。
図29及び表5‐14に示すように、本実施例の二重抗体分子はカニクイザル4‐1BBと結合することができ、Urelumabはできない。二重抗体分子がカニクイザル4‐1BB(図29、A‐B)と結合する能力は、ヒト4‐1BB(図28、G‐H)と結合する能力に匹敵し、類似の結合EC50を有する。
実施例5.7. PD‐L1を高発現する標的細胞媒介のT細胞の特異的活性化
本実施例は、標的細胞におけるPD‐L1×4‐1BB二重抗体分子の存在は4‐1BBを結合することによりT細胞の活性を活性化することを研究するためである。標的細胞は、ヒトPD‐L1を高発現するCHO‐K1／hPDL1(GENSCRIPT、M00543)、またはヒトPD‐L1を高発現するMDA‐MB‐231(ATCC、HTB‐26)などの、PD‐L1を異なる程度に発現する細胞であってもよい。エフェクター細胞は、単離されたヒトPBMCまたはT細胞であってもよい。
本実施例は、標的細胞におけるPD‐L1×4‐1BB二重抗体分子の存在は4‐1BBを結合することによりT細胞の活性を活性化することを研究するためである。標的細胞は、ヒトPD‐L1を高発現するCHO‐K1／hPDL1(GENSCRIPT、M00543)、またはヒトPD‐L1を高発現するMDA‐MB‐231(ATCC、HTB‐26)などの、PD‐L1を異なる程度に発現する細胞であってもよい。エフェクター細胞は、単離されたヒトPBMCまたはT細胞であってもよい。
具体的に、まず0.3μg/mLの抗CD3抗体OKT3(Thermo，#16-0037-81)を100μL/ウェルで96ウェルプレート(Corning，#3599)に包接した。次に、ヒトT細胞(ヒトPBMCからT細胞選別キット(Miltenyi，#130-096-535)で分離して得た)の密度を2×106細胞／mLに調整し、標的細胞の密度を3×105細胞／mLに調整した後、2種類の細胞懸濁液をそれぞれ50μL／ウェルで96ウェルプレートに接種し、最終的な標的比は20：3であった。その後、100μL/ウェルで異なる濃度の抗体分子を添加し、抗体最終濃度は(10nM、1nM)、あるいは20nM、あるいは最高最終濃度20nMから5倍濃度勾配で希釈した合計8つの濃度であってもよく、2つの複合ウェルに添加し；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)とhIgG4 iso(CrownBio，#C0045)を対照とした。96ウェルプレートを37℃、5%CO2培養箱に3日間インキュベートした。48時間培養後と72時間培養後の上清をそれぞれ収集し、IL-2 ELISAキット(Thermo，#88-7025-88)で48時間後の上清中のIL-2濃度を検出し、IFN-γ ELISAキット(Thermo，#88-7316-77)を用いて72時間後の上清中のIFN-γ濃度を検出した。ELISAの検出方法は関連キットの操作説明を参照する。アプリケーションソフトウェアGraphPad Prism 8でデータ処理と作図分析を行う。
本実施例において、陽性対照分子は抗4‐1BBのモノクローナル抗体Urelumabである。
本実施例において、陽性対照分子は抗4‐1BBのモノクローナル抗体Urelumabである。
実施例5.7.1. CHO‐K1/hPDL1媒介のT細胞の特異的活性化
図30に示すように、標的細胞CHO-K1/hPDL1とT細胞を混合するシステムにおいて、架橋に依存しない抗4-1BBモノクローナル抗体Urelumabは、T細胞のIFN-γ放出を活性化することができ、一方、架橋に依存する抗4-1BBモノクローナル抗体(PR000448、PR001758、PR001760、PR001836)はT細胞をほとんど活性化できない。FIT‐Ig構造の二重抗体分子(PR003052、PR000701)とIgG‐VH四価対称構造の二重抗体分子(PR003549、PR003550、PR003551)とFab‐HCAb構造の二重抗体分子(PR004270)はいずれもT細胞を活性化させ、サイトカインを放出することができる。これは、二重抗体分子のT細胞に対する活性化が標的細胞の特異的活性化に依存することを示している。また、IgG-VH四価対称構造の二重抗体分子(PR003549、PR003550)とFab-HCAb構造の二重抗体分子(PR004270)はFIT-Ig構造の二重抗体分子(PR003052、PR000701)よりも高いサイトカイン放出レベルを引き起こすことができ、より強いT細胞活性化能力を示し、Urelumabより優れている。また、PR003549及びPR004270は、対照二重抗体分子(PR001289)と比較してかなり強いT細胞活性化能力を有する。
図30に示すように、標的細胞CHO-K1/hPDL1とT細胞を混合するシステムにおいて、架橋に依存しない抗4-1BBモノクローナル抗体Urelumabは、T細胞のIFN-γ放出を活性化することができ、一方、架橋に依存する抗4-1BBモノクローナル抗体(PR000448、PR001758、PR001760、PR001836)はT細胞をほとんど活性化できない。FIT‐Ig構造の二重抗体分子(PR003052、PR000701)とIgG‐VH四価対称構造の二重抗体分子(PR003549、PR003550、PR003551)とFab‐HCAb構造の二重抗体分子(PR004270)はいずれもT細胞を活性化させ、サイトカインを放出することができる。これは、二重抗体分子のT細胞に対する活性化が標的細胞の特異的活性化に依存することを示している。また、IgG-VH四価対称構造の二重抗体分子(PR003549、PR003550)とFab-HCAb構造の二重抗体分子(PR004270)はFIT-Ig構造の二重抗体分子(PR003052、PR000701)よりも高いサイトカイン放出レベルを引き起こすことができ、より強いT細胞活性化能力を示し、Urelumabより優れている。また、PR003549及びPR004270は、対照二重抗体分子(PR001289)と比較してかなり強いT細胞活性化能力を有する。
実施例5.7.2. MDA-MB-231媒介のT細胞の特異的活性化
図31(A)に示すように、標的細胞MDA‐MB‐231とT細胞を混合するシステムにおいて、IgG‐VH四価対称構造の二重抗体分子(PR003549)とFab‐HCAb構造の二重抗体分子(PR004270)は類似のT細胞活性化能力を有し、FIT‐Ig構造の二重抗体分子(PR003052、PR000701)と対照の二重抗体分子(PR001289)より優れた。
図31(A)に示すように、標的細胞MDA‐MB‐231とT細胞を混合するシステムにおいて、IgG‐VH四価対称構造の二重抗体分子(PR003549)とFab‐HCAb構造の二重抗体分子(PR004270)は類似のT細胞活性化能力を有し、FIT‐Ig構造の二重抗体分子(PR003052、PR000701)と対照の二重抗体分子(PR001289)より優れた。
図31(B‐C)と表5‐15に示すように、標的細胞MDA‐MB‐231とT細胞を混合したシステムにおいて、IgG‐VH四価対称構造の二重抗体分子(PR003549)はUrelumabよりもT細胞活性化能力が強く、IFN‐γ(B)及びIL‐2(C)の生成をよりよく促進することができる。
実施例5.8. 混合リンパ球反応(MLR)
本実施例は、混合リンパ球反応(MLR)を用いてT細胞に対するPD‐L1×4‐1BB二重抗体分子の活性化作用を研究する。
第一段階に、CD14ビーズ(Meltenyi，#130‐050‐201)を用いて第一ドナーPBMC細胞(MT‐BIO)から単核細胞(monocytes)を単離する；具体的な操作は、関連キットの説明書を参照する。その後、50ng/mL組換えヒト由来IL-4(PeproTech，#200-02-A)と100ng/mL組換えヒト由来GM-CSF(PeproTech，#300-03-A)を加え、37℃で7日間誘導した後、未成熟樹状細胞(iDC細胞)を得た。続いて、1μg/mlのリポ多糖Lipopololysaccharide(LPS、Sigma、#L 6529)を添加し、24時間誘導した後、成熟樹状細胞(mDC細胞)を得た。第二段階に、T細胞分離キット(Meltenyi，#130‐096‐535)を用いて第二ドナーPBMC細胞(MT-BIO)からTリンパ細胞を分離する。第三段階に、得られたT細胞とmDC細胞を96ウェルプレートに5：1の割合で播種した(1×105/ウェルのT細胞と2×104/ウェルのmDC細胞)。その後、50μL/ウェルで異なる濃度の抗体分子を添加し、抗体最終濃度は(10nM、1nM)、または最高最終濃度50nMから3倍濃度勾配で希釈した計8つの濃度であってもよく、2つの複合ウェルに添加し；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)または空白ウェルを対照とした。37℃、5%CO2培養箱で5日間インキュベートした。第四段階に、それぞれ3日目と5日目の上清を収集し、IL-2 ELISAキット(Thermo，#88-7025-88)で3日目の上清中のIL-2濃度を検出し、IFN-γ ELISAキット(Thermo，#88-7316-77)を用いて5日目の上清中のIFN-γ濃度を検出した。ELISA検出方法は関連キットの操作説明を参照する。
本実施例は、混合リンパ球反応(MLR)を用いてT細胞に対するPD‐L1×4‐1BB二重抗体分子の活性化作用を研究する。
第一段階に、CD14ビーズ(Meltenyi，#130‐050‐201)を用いて第一ドナーPBMC細胞(MT‐BIO)から単核細胞(monocytes)を単離する；具体的な操作は、関連キットの説明書を参照する。その後、50ng/mL組換えヒト由来IL-4(PeproTech，#200-02-A)と100ng/mL組換えヒト由来GM-CSF(PeproTech，#300-03-A)を加え、37℃で7日間誘導した後、未成熟樹状細胞(iDC細胞)を得た。続いて、1μg/mlのリポ多糖Lipopololysaccharide(LPS、Sigma、#L 6529)を添加し、24時間誘導した後、成熟樹状細胞(mDC細胞)を得た。第二段階に、T細胞分離キット(Meltenyi，#130‐096‐535)を用いて第二ドナーPBMC細胞(MT-BIO)からTリンパ細胞を分離する。第三段階に、得られたT細胞とmDC細胞を96ウェルプレートに5：1の割合で播種した(1×105/ウェルのT細胞と2×104/ウェルのmDC細胞)。その後、50μL/ウェルで異なる濃度の抗体分子を添加し、抗体最終濃度は(10nM、1nM)、または最高最終濃度50nMから3倍濃度勾配で希釈した計8つの濃度であってもよく、2つの複合ウェルに添加し；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)または空白ウェルを対照とした。37℃、5%CO2培養箱で5日間インキュベートした。第四段階に、それぞれ3日目と5日目の上清を収集し、IL-2 ELISAキット(Thermo，#88-7025-88)で3日目の上清中のIL-2濃度を検出し、IFN-γ ELISAキット(Thermo，#88-7316-77)を用いて5日目の上清中のIFN-γ濃度を検出した。ELISA検出方法は関連キットの操作説明を参照する。
図32及び図33に示すように、2回の独立したMLR実験(異なるドナーペア)において、T細胞に対する抗4‐1BBモノクローナル抗体の活性化作用は限られており、サイトカインを産生する能力は弱い；抗PD-L1モノクローナル抗体は明らかな活性化作用を有する。二重抗体分子は、T細胞の機能をさらに向上させることができ、PD‐L1モノクローナル抗体よりも優れた。
図32に示すように、IgG-VH四価対称構造の二重抗体分子(PR003549、PR003550、PR003551)はFIT-Ig構造の二重抗体分子(PR003052、PR000701)よりも高いサイトカイン放出レベルを引き起こし、より強いT細胞活性化能力を示すことができる；また、二重抗体分子はPD‐L1モノクローナル抗体より優れている。
図33に示すように、IgG-VH四価対称構造の二重抗体分子(PR003549、PR003550)とFab-HCAb構造の二重抗体分子(PR004270)はFIT-Ig構造の二重抗体分子(PR003052、PR000701)よりも高いサイトカイン放出レベルを引き起こすことができ、より強いT細胞活性化能力を示す。また、IgG-VH及びFab-HCAb構造の二重抗体分子は、対照二重抗体分子(PR001289)に比べて、より多くのIFN-γの産生を誘導できる。
実施例5.9. 薬物動態学の研究
本実施例は、マウス体内におけるFab‐HCAb対称構造を有するPD‐L1×4‐1BB二重抗体分子PR004270の薬物動態学特性を研究した。
実施方法：各試験抗体分子に対して、体重18～22グラムの雌性BALB/cマウス6匹を選択し、5mg/kgの用量で静脈注射により二重特異性抗体を投与した。1群3匹は投与前及び投与後15分、24時間(1日)、4日目、及び10日目に全血を採取し、別の1群3匹は投与前及び投与後5時間、2日目、7日目、及び14日目に全血を採取した。全血を30分間静置して凝固させ、その後遠心分離し、分離した血清サンプルを分析するまで‐80℃で凍結保存した。本実施例は2種類のELISA方法を用いてマウス血清中の薬物濃度を定量的に測定した。ELISA方法1、つまりFc端検出(全体検出)方法であり、96ウェルプレートに包接されたヤギ抗ヒトFcポリクローナル抗体によりマウス血清中のヒトFc含有抗体を捕獲し、HRP標識ヤギ抗ヒトFc第2抗体を加えて検出する；ELISA方法2、すなわちPD‐L1端検出(機能ドメイン検出)方法であり、96ウェルプレートに包接されたヒトPD‐L1タンパク質によりマウス血清中のPD‐L1を特異的に識別する抗体を捕獲し、その後HRP標識されたヤギ抗ヒトFc第2抗体を加えて検出する。Phoenix WinNonlinソフトウェアバージョン8.2を使用して、非房室モデル(NCA)を選択して薬物動態学パラメータを分析した。
本実施例は、マウス体内におけるFab‐HCAb対称構造を有するPD‐L1×4‐1BB二重抗体分子PR004270の薬物動態学特性を研究した。
実施方法：各試験抗体分子に対して、体重18～22グラムの雌性BALB/cマウス6匹を選択し、5mg/kgの用量で静脈注射により二重特異性抗体を投与した。1群3匹は投与前及び投与後15分、24時間(1日)、4日目、及び10日目に全血を採取し、別の1群3匹は投与前及び投与後5時間、2日目、7日目、及び14日目に全血を採取した。全血を30分間静置して凝固させ、その後遠心分離し、分離した血清サンプルを分析するまで‐80℃で凍結保存した。本実施例は2種類のELISA方法を用いてマウス血清中の薬物濃度を定量的に測定した。ELISA方法1、つまりFc端検出(全体検出)方法であり、96ウェルプレートに包接されたヤギ抗ヒトFcポリクローナル抗体によりマウス血清中のヒトFc含有抗体を捕獲し、HRP標識ヤギ抗ヒトFc第2抗体を加えて検出する；ELISA方法2、すなわちPD‐L1端検出(機能ドメイン検出)方法であり、96ウェルプレートに包接されたヒトPD‐L1タンパク質によりマウス血清中のPD‐L1を特異的に識別する抗体を捕獲し、その後HRP標識されたヤギ抗ヒトFc第2抗体を加えて検出する。Phoenix WinNonlinソフトウェアバージョン8.2を使用して、非房室モデル(NCA)を選択して薬物動態学パラメータを分析した。
図34及び表5‐16に示すように、Fab‐HCAb構造の二重抗体分子PR004270は従来のIgG抗体と類似した血清半減期t1/2値を有し、機能ドメイン検出方法はそのt1/2値が10日を超えることを示した。
実施例5.10. まとめ
本実施例は、抗PD‐L1のIgG抗体の抗原結合ドメインFabと抗4‐1BBのHCAb抗体の抗原結合ドメインVHを用いて、多種類の構造の抗PD‐L1×4‐1BBの二重特異性抗体分子を構築した。HCAbに基づいて二重特異性抗体分子構造を構築するフレキシビリティを示し、異なる構造タイプ、相対位置、結合価数などのパラメータによってT細胞を活性化する機能活性を調節した。
本実施例は、抗PD‐L1のIgG抗体の抗原結合ドメインFabと抗4‐1BBのHCAb抗体の抗原結合ドメインVHを用いて、多種類の構造の抗PD‐L1×4‐1BBの二重特異性抗体分子を構築した。HCAbに基づいて二重特異性抗体分子構造を構築するフレキシビリティを示し、異なる構造タイプ、相対位置、結合価数などのパラメータによってT細胞を活性化する機能活性を調節した。
UrelumabのT細胞に対する活性化は標的特異性がないことが臨床毒副作用の原因の一つである。PD‐L1×4‐1BB二重抵抗のT細胞に対する活性化作用は、PD‐L1の発現に特異的に依存する。架橋された抗4‐1BBに依存するモノクローナル抗体はT細胞を直接活性化することはできないが、これらの抗4‐1BBモノクローナル抗体を用いて構築されたPD‐L1×4‐1BB二重抗体は、PD‐L1を高発現する細胞が存在する場合にT細胞を特異的に活性化することができる。
HCAbに基づく二重抗構造、特にIgG-VH四価対称構造の二重抗体分子とFab-HCAb構造の二重抗体分子は、PD-L1端の活性を保留し、MLR実験において対応する抗PD-L1親モノクローナル抗体より強いT細胞活性化能力を体現した；一方、標的細胞上で高発現するPD‐L1分子は、4‐1BBの架橋及び三量化を媒介してT細胞の活性化信号を伝達することができ、そのT細胞を活性化する能力は、Urelumabよりも優れている。また、IgG-VH四価対称構造とFab-HCAb対称構造の二重抗体分子はFIT-Ig構造の二重抗体分子よりも強いT細胞活性化能力を示している。
以上より、本実施例は安全性が良く、機能活性が突出し、分子安定性が良いPD-L1×4-1BB二重特異性抗体分子を構築した。
以上より、本実施例は安全性が良く、機能活性が突出し、分子安定性が良いPD-L1×4-1BB二重特異性抗体分子を構築した。
実施例6. B7H4×4-1BB二重特異性抗体
実施例6.1. 背景
B7-H4(VTCN1、B7h.5、B7S1、B7x)は、B7/CD28スーパーファミリーに属する膜貫通タンパク質である。B7‐H4タンパク質は単核細胞や樹状細胞などの免疫細胞に発現し、T細胞の負の制御免疫応答に関与する可能性がある。また、B7H4は乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、非小細胞肺癌、腎癌などの腫瘍細胞の表面でも高発現しているが、ほとんどの正常組織では発現していないか、極めて低い発現をしている。B7‐H4はこれらの腫瘍の新たな標的として近年注目されている。抗B7-H4の抗体は様々な機構を通じて腫瘍細胞に作用することができるが、その開発方向は主にモノクローナル抗体に集中しており、現在では二重特異性抗体療法はない。
実施例6.1. 背景
B7-H4(VTCN1、B7h.5、B7S1、B7x)は、B7/CD28スーパーファミリーに属する膜貫通タンパク質である。B7‐H4タンパク質は単核細胞や樹状細胞などの免疫細胞に発現し、T細胞の負の制御免疫応答に関与する可能性がある。また、B7H4は乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、非小細胞肺癌、腎癌などの腫瘍細胞の表面でも高発現しているが、ほとんどの正常組織では発現していないか、極めて低い発現をしている。B7‐H4はこれらの腫瘍の新たな標的として近年注目されている。抗B7-H4の抗体は様々な機構を通じて腫瘍細胞に作用することができるが、その開発方向は主にモノクローナル抗体に集中しており、現在では二重特異性抗体療法はない。
4‐1BB(TNFRSF9、CD137)は、TNF受容体スーパーファミリーに属する膜貫通タンパク質である。4‐1BBは、複数の免疫細胞上で発現される共刺激分子であり、免疫活性の多機能調節剤である。活性化されたT細胞、NK細胞などの免疫細胞に誘導し発現される。4‐1BBは、そのリガンド4‐1BBL媒介の三量化によりT細胞を活性化し、細胞増殖及びサイトカイン放出を促進する。抗4-1BBのアゴニスト抗体は、腫瘍を抑制する機能があり、最初に臨床試験に入った4-1BB抗体はファイザーのUtomilumabとブリストル マイヤーズ スクイブ(BMS)社のUrelumab(BMS-663513)であった。Urelumabの最初の臨床結果は2008年に発表され、一部の患者で鼓舞的な治療効果が観察されたが、データはUrelumabが肝臓毒性をもたらし、標的と用量と関係があることを示した。また、臨床試験で2人の患者が肝毒性で死亡したため、関連臨床試験は中止された。Utomilumabは安全性がより良く、用量は10mg/kgまで高めることができるが、治療効果は依然としてよくない。
本実施例では、B7H4と4‐1BBを同時に標的とする二重特異性抗体を構築し、1つ以上の作用機序により抗腫瘍効果と安全性を向上させた。第一に、B7H4×4‐1BB二重抗体は、B7H4の負の制御信号を解除することによってT細胞を活性化することができる。第二に、B7H4×4-1BB二重抗体はB7H4高発現の腫瘍組織に富化し、腫瘍ミクロ環境において、免疫細胞と腫瘍細胞は二重抗体分子を通じて結合し、免疫シナプスの形成を促進する；同時に、腫瘍細胞表面に高発現したB7H4分子は、二重抗体分子によってT細胞表面の4‐1BB分子の架橋を促進し、下流の信号伝導経路を活性化し、共刺激信号を提供し、さらにT細胞に対する活性化と増殖を促進し、抗腫瘍活性を高めることができる。第三に、本実施例で用いた抗4‐1BBのアゴニスト抗体の機能は分子架橋に依存しており、それは腫瘍ミクロ環境中で標的細胞を利用してT細胞の活性化を媒介することしかできず、Urelumabのようなモノクローナル抗体が正常組織中でT細胞を過度に活性化させることによる毒副作用を回避する。
実施例6.2. 抗B7H4のIgG抗体と抗4-1BBのHCAb抗体の獲得
実施例6.2.1. 抗B7H4の全ヒト由来H2L2抗体の獲得
Harbour H2L2マウス(Harbour Antibodies BV)はヒト免疫グロブリン免疫ライブラリを持つトランスジェニックマウスであり、その産生抗体は完全なヒト抗体可変ドメインとラット定常ドメインを有する。
実施例6.2.1. 抗B7H4の全ヒト由来H2L2抗体の獲得
Harbour H2L2マウス(Harbour Antibodies BV)はヒト免疫グロブリン免疫ライブラリを持つトランスジェニックマウスであり、その産生抗体は完全なヒト抗体可変ドメインとラット定常ドメインを有する。
Harbour H2L2マウスに対して、可溶性組換えヒトB7H4‐mFc融合タンパク質(Sino Biological Inc.、#10738‐H05 H)を用いて多ラウンド免疫を行った。マウス血清中のB7H4特異性抗体価が特定のレベルに達したことを検出した後、マウスの脾臓細胞を取り出し、骨髄腫細胞系と融合してハイブリドーマ細胞を得た；ハイブリドーマ細胞を多ラウンドスクリーニング及びコローナルした後、B7H4を特異的に識別するいくつかのモノクローナル抗体分子を同定した。これらのモノクローナル抗体をさらに同定し、ヒトB7H4に対する結合能力、カニクイザルB7H4の結合能力、標的細胞受容体内在化能力などのパラメータに基づいて、いくつかの好ましい候補抗体分子を出す。その後、候補抗体分子の配列分析と最適化を行い、数個の変異体配列を得た。抗体のVL及びVH配列を対応するヒトのκ軽鎖定常領域とIgG1重鎖定常領域配列を融合発現し、組換え全ヒト由来抗体分子を得た。抗B7H4の組換え全ヒト由来IgG抗体PR002408及びPR002410を表6‐9に示す。
実施例6.2.2. 抗4-1BBの全ヒト由来HCAb抗体の獲得
本実施例で用いた抗4‐1BBの全ヒト由来HCAb抗体PR001758、PR001760、PR001771、PR001840、及びPR004469(表6‐9)は、実施例5.2.3に記載されているように、Harbour HCAbマウス由来である。
本実施例で用いた抗4‐1BBの全ヒト由来HCAb抗体PR001758、PR001760、PR001771、PR001840、及びPR004469(表6‐9)は、実施例5.2.3に記載されているように、Harbour HCAbマウス由来である。
4‐1BB重鎖抗体が細胞CHO‐K1／hu4‐1BB(GENSCRIPT、M00538)と結合する能力をフローサイトメトリー細胞法FACSと実施例5.6に記載の方法を用いて試験し、図28(C‐F)に示すように、その結合能力はUtomilumabと類似し、Urelumabより優れていた。
実施例6.3. 抗B7H4のIgG抗体と抗4-1BBのHCAb抗体を用いた二重特異性抗体分子の構築
本実施例では、抗B7H4のIgG抗体PR002408またはPR002410の抗原結合ドメインFabと、抗4-1BBのHCAb抗体PR001758、PR001760、PR001771、PR001840またはPR004469の抗原結合ドメインVHを用いて、多種類の構造の抗B7H4×4-1BBの二重特異性抗体分子を構築した。
本実施例では、抗B7H4のIgG抗体PR002408またはPR002410の抗原結合ドメインFabと、抗4-1BBのHCAb抗体PR001758、PR001760、PR001771、PR001840またはPR004469の抗原結合ドメインVHを用いて、多種類の構造の抗B7H4×4-1BBの二重特異性抗体分子を構築した。
本実施例及び下記の実施例において、陽性対照分子は抗B7H4のIgGモノクローナル抗体PR002408であり、B7H4×4-1BB二重抗体分子のB7H4端の親モノクローナル抗体でもある。
本実施例及び下記の実施例において、陽性対照分子は抗4‐1BBのIgGモノクローナル抗体urelumabであった。
実施例6.3.1. Fab‐HCAb対称構造分子の構築
抗B7H4のIgG抗体と抗4-1BBの重鎖抗体を用いて、実施例1.1に記載の構造に従ってFab-HCAb対称構造のB7H4×4-1BB二重抗体分子を設計し、表6‐1にまとめた；そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表62にまとめた。
抗B7H4のIgG抗体と抗4-1BBの重鎖抗体を用いて、実施例1.1に記載の構造に従ってFab-HCAb対称構造のB7H4×4-1BB二重抗体分子を設計し、表6‐1にまとめた；そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表62にまとめた。
実施例6.3.2. IgG‐VH四価対称構造分子の構築
抗B7H4のIgG抗体と抗4-1BBの重鎖抗体を用いて、実施例1.2に記載の構造に従ってIgG-VH四価対称構造のB7H4×4-1BB二重抗体分子を設計し、表6‐3にまとめた。そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表64にまとめた。
抗B7H4のIgG抗体と抗4-1BBの重鎖抗体を用いて、実施例1.2に記載の構造に従ってIgG-VH四価対称構造のB7H4×4-1BB二重抗体分子を設計し、表6‐3にまとめた。そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表64にまとめた。
実施例6.3.3. IgG‐VH(2)六価対称構造分子の構築
抗B7H4のIgG抗体と抗4-1BBの重鎖抗体を用いて、実施例1.3の構造に従ってIgG-VH(2)六価対称構造のB7H4×4-1BB二重抗体分子を設計し、表65にまとめた。そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表66にまとめた。
抗B7H4のIgG抗体と抗4-1BBの重鎖抗体を用いて、実施例1.3の構造に従ってIgG-VH(2)六価対称構造のB7H4×4-1BB二重抗体分子を設計し、表65にまとめた。そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表66にまとめた。
実施例6.3.4. Fab‐Fc‐VH(n)非対称構造分子の構築
抗B7H4のIgG抗体と抗4-1BBの重鎖抗体を用いて、実施例1.6と実施例1.9に記載の構造に従ってFab-Fc-VH(n，n={2，3})非対称構造のB7H4×4-1BB二重抗体分子を設計し、表67にまとめた。そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表6‐8にまとめた。分子のFc領域は、「knob‐into‐hole」構造の突然変異を使用し、L234AとL235Aの二重突然変異を導入する。
抗B7H4のIgG抗体と抗4-1BBの重鎖抗体を用いて、実施例1.6と実施例1.9に記載の構造に従ってFab-Fc-VH(n，n={2，3})非対称構造のB7H4×4-1BB二重抗体分子を設計し、表67にまとめた。そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表6‐8にまとめた。分子のFc領域は、「knob‐into‐hole」構造の突然変異を使用し、L234AとL235Aの二重突然変異を導入する。
実施例6.3.5. B7H4×4-1BB二重抗体分子及び対照分子の配列リスト
表6‐9、表6‐10及び表6‐11は、本実施例によって構築されたB7H4×4‐1BB二重抗体分子及び対応するB7H4モノクローナル抗体、4‐1BBモノクローナル抗体などの親モノクローナル抗体分子及び対照分子の配列に対応する配列番号を示す。表6‐11中の構造番号は、表1‐1及び図1に対応する。表6‐12は、二重特異性抗体分子の第1及び第2抗原結合ドメインに対応するCDR配列の配列番号を示す。
表6‐9、表6‐10及び表6‐11は、本実施例によって構築されたB7H4×4‐1BB二重抗体分子及び対応するB7H4モノクローナル抗体、4‐1BBモノクローナル抗体などの親モノクローナル抗体分子及び対照分子の配列に対応する配列番号を示す。表6‐11中の構造番号は、表1‐1及び図1に対応する。表6‐12は、二重特異性抗体分子の第1及び第2抗原結合ドメインに対応するCDR配列の配列番号を示す。
実施例6.4. B7H4との結合
本実施例はB7H4×4‐1BB二重抗体分子がB7H4と結合する活性を研究するためである。
本実施例はB7H4×4‐1BB二重抗体分子がB7H4と結合する活性を研究するためである。
実施例6.4.1. ヒトB7H4を高発現する細胞SK‐BR‐3との結合
抗体のヒトB7H4を高発現する腫瘍細胞系SK‐BR‐3(ATCC、HTB‐30)に対する結合能力をフローサイトメトリーFACSを用いて試験した。具体的には、SK‐BR‐3細胞を消化し、完全培地で再懸濁し、細胞密度を2×106細胞/mLに調整する；次いで、96ウェルVプレート(Corning，#3894)に50μL細胞/ウェルで播種した。その後、50μL/ウェルで5倍濃度勾配で希釈した抗体分子の合計8つの濃度を加え、均一に混合した；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。細胞を4℃に置き、遮光して2時間インキュベートした。その後、100μL/ウェルで予冷のPBS緩衝液を加えて細胞を2回すすぎ、その後4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。その後、蛍光二次抗体(Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG，Fcγ Fragment Specific，Jackson ImmunoResearch，#109-605-098，1：1000希釈)を4℃に置いて1時間遮光してインキュベートした。その後、100μL/ウェルで予冷のPBS緩衝液を加えて細胞を2回すすぎ、その後4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液(0.5%BSA含有PBS緩衝液)を添加して細胞を再懸濁した。BD FACS CANTOIIフローサイトメータまたはACEA NovoCyteフローサイトメータ(ACEA Biosciences Inc.)を用いて蛍光発光信号値を読み取り、ソフトウェアFlowJov 10(FlowJo，LLC)を用いてデータを処理し分析した。ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、4パラメータの非線形フィッティングにより、抗体の標的細胞に対する結合曲線及びEC50値などのパラメータを得た。
図35及び表6‐13に示すように、二重抗体分子はいずれもSK‐BR‐3細胞に結合することができる。図35(A‐C)に示すように、対称構造の二重抗体分子(PR003334、PR003335、PR003338、PR003487、PR003488、PR004279)は同じ二価のB7H4結合ドメイン(抗B7H4モノクローナル抗体PR002408に由来)を有し、それらのB7H4を結合するEC50に非常に近い。IgG‐VH‐VH六価対称構造の二重抗体分子PR003487とPR003488は、IgG‐VH四価対称構造の二重抗体分子PR003335と比べて、B7H4を結合する能力がほぼ同じである。Fab‐HCAb対称構造の二重抗体分子PR004279がB7H4と結合する活性は、IgG‐VH構造のPR003335よりやや強い。図35(D‐E)に示すように、非対称構造の二重抗体分子(PR004160、PR004161、PR004181、PR004182)は1つのB7H4結合ドメインしかないため、B7H4を結合する能力は対称構造の二重抗体分子より弱いが、PR004182は対称構造の二重抗体分子に近似した結合EC50を体現している。図35(F)に示すように、Fab‐HCAb対称構造の二重抗体分子は、構造(1)の分子(PR005189)であれ構造(2)の分子(PR007165)であれ、ほとんど同じ結合活性を有し、FabのCLをVH_Bが位置する重鎖に融合することがFab端の結合活性に影響しないと示している。
抗体のヒトB7H4を高発現する腫瘍細胞系SK‐BR‐3(ATCC、HTB‐30)に対する結合能力をフローサイトメトリーFACSを用いて試験した。具体的には、SK‐BR‐3細胞を消化し、完全培地で再懸濁し、細胞密度を2×106細胞/mLに調整する；次いで、96ウェルVプレート(Corning，#3894)に50μL細胞/ウェルで播種した。その後、50μL/ウェルで5倍濃度勾配で希釈した抗体分子の合計8つの濃度を加え、均一に混合した；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。細胞を4℃に置き、遮光して2時間インキュベートした。その後、100μL/ウェルで予冷のPBS緩衝液を加えて細胞を2回すすぎ、その後4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。その後、蛍光二次抗体(Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG，Fcγ Fragment Specific，Jackson ImmunoResearch，#109-605-098，1：1000希釈)を4℃に置いて1時間遮光してインキュベートした。その後、100μL/ウェルで予冷のPBS緩衝液を加えて細胞を2回すすぎ、その後4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液(0.5%BSA含有PBS緩衝液)を添加して細胞を再懸濁した。BD FACS CANTOIIフローサイトメータまたはACEA NovoCyteフローサイトメータ(ACEA Biosciences Inc.)を用いて蛍光発光信号値を読み取り、ソフトウェアFlowJov 10(FlowJo，LLC)を用いてデータを処理し分析した。ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、4パラメータの非線形フィッティングにより、抗体の標的細胞に対する結合曲線及びEC50値などのパラメータを得た。
図35及び表6‐13に示すように、二重抗体分子はいずれもSK‐BR‐3細胞に結合することができる。図35(A‐C)に示すように、対称構造の二重抗体分子(PR003334、PR003335、PR003338、PR003487、PR003488、PR004279)は同じ二価のB7H4結合ドメイン(抗B7H4モノクローナル抗体PR002408に由来)を有し、それらのB7H4を結合するEC50に非常に近い。IgG‐VH‐VH六価対称構造の二重抗体分子PR003487とPR003488は、IgG‐VH四価対称構造の二重抗体分子PR003335と比べて、B7H4を結合する能力がほぼ同じである。Fab‐HCAb対称構造の二重抗体分子PR004279がB7H4と結合する活性は、IgG‐VH構造のPR003335よりやや強い。図35(D‐E)に示すように、非対称構造の二重抗体分子(PR004160、PR004161、PR004181、PR004182)は1つのB7H4結合ドメインしかないため、B7H4を結合する能力は対称構造の二重抗体分子より弱いが、PR004182は対称構造の二重抗体分子に近似した結合EC50を体現している。図35(F)に示すように、Fab‐HCAb対称構造の二重抗体分子は、構造(1)の分子(PR005189)であれ構造(2)の分子(PR007165)であれ、ほとんど同じ結合活性を有し、FabのCLをVH_Bが位置する重鎖に融合することがFab端の結合活性に影響しないと示している。
実施例6.5. 4-1BBとの結合
本実施例は、B7H4×4‐1BB二重抗体分子が4‐1BBと結合する活性を研究するためである。
本実施例は、B7H4×4‐1BB二重抗体分子が4‐1BBと結合する活性を研究するためである。
実施例6.5.1. ヒト4‐1BBを高発現するCHO‐K1細胞CHO‐K1／hu4‐1BBとの結合
抗体分子のヒト4‐1BBを高発現するCHO‐K1細胞株CHO‐K1／hu4‐1BB(GENSCRIPT、M00538)との結合能力をフローサイトメトリーFACSを用いて試験した。具体的には、細胞を消化し、完全培地で再懸濁する；細胞密度を2×106細胞/mLに調整した。次いで、細胞を96ウェルVプレート(Corning，#3894)に100μL／ウェル(2×105細胞／ウェル)で播種し、4℃で5分間遠心分離し、上清を廃棄した。その後、勾配希釈された抗体分子を100μL/ウェルで96ウェルプレートに添加し、均一に混合し、抗体分子を5倍濃度勾配で希釈した合計8つの濃度に希釈し；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。細胞を4℃に置き、遮光して1時間インキュベートした。その後、100μL/ウェルで予冷のPBS緩衝液を加えて細胞を2回すすぎ、4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に、さらに100μL/ウェルで蛍光二次抗体(Alexa Fluor（登録商標） 488, Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific、Jackson ImmunoResearch、#109-545-098、1：1000希釈)を添加し、4℃に放置し、遮光して1時間インキュベートした。その後、200μL/ウェルで予冷のPBS緩衝液を加えて細胞を2回すすぎ、その後4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液(0.5%BSA含有PBS緩衝液)を添加して細胞を再懸濁した。BD FACS CANTOIIフローサイトメータまたはACEA NovoCyteフローサイトメータを用いて蛍光発光信号値を読み取り、ソフトウェアFlowJov 10(FlowJo，LLC)を用いてデータを処理し分析した。ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、4パラメータの非線形フィッティングにより、抗体の標的細胞に対する結合曲線及びEC50値などのパラメータを得た。
抗体分子のヒト4‐1BBを高発現するCHO‐K1細胞株CHO‐K1／hu4‐1BB(GENSCRIPT、M00538)との結合能力をフローサイトメトリーFACSを用いて試験した。具体的には、細胞を消化し、完全培地で再懸濁する；細胞密度を2×106細胞/mLに調整した。次いで、細胞を96ウェルVプレート(Corning，#3894)に100μL／ウェル(2×105細胞／ウェル)で播種し、4℃で5分間遠心分離し、上清を廃棄した。その後、勾配希釈された抗体分子を100μL/ウェルで96ウェルプレートに添加し、均一に混合し、抗体分子を5倍濃度勾配で希釈した合計8つの濃度に希釈し；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。細胞を4℃に置き、遮光して1時間インキュベートした。その後、100μL/ウェルで予冷のPBS緩衝液を加えて細胞を2回すすぎ、4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に、さらに100μL/ウェルで蛍光二次抗体(Alexa Fluor（登録商標） 488, Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific、Jackson ImmunoResearch、#109-545-098、1：1000希釈)を添加し、4℃に放置し、遮光して1時間インキュベートした。その後、200μL/ウェルで予冷のPBS緩衝液を加えて細胞を2回すすぎ、その後4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、200μL/ウェルで予冷のFACS緩衝液(0.5%BSA含有PBS緩衝液)を添加して細胞を再懸濁した。BD FACS CANTOIIフローサイトメータまたはACEA NovoCyteフローサイトメータを用いて蛍光発光信号値を読み取り、ソフトウェアFlowJov 10(FlowJo，LLC)を用いてデータを処理し分析した。ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、4パラメータの非線形フィッティングにより、抗体の標的細胞に対する結合曲線及びEC50値などのパラメータを得た。
本実施例において、陽性対照分子は抗4‐1BBのモノクローナル抗体Urelumabである。結果を図36と表6‐14に示す。
図36に示すように、二重抗体分子はいずれもCHO-K1/hu4-1BB細胞に結合することができ、結合曲線EC50は非常に近い。図36(A)に示すように、IgG‐VH四価対称構造の二重抗体分子が4‐1BBと結合するMFI最大値はUrelumabより高い；図36(B)に示すように、IgG‐VH‐VH六価対称構造の二重抗体分子が4‐1BBと結合する活性はUrelumabと類似している；図36(C)に示すように、Fab‐HCAb対称構造の二重抗体分子PR004279が4‐1BBと結合する活性はIgG‐VH構造のPR003335の活性よりやや強い；図36(D‐E)に示すように、Fab‐Fc‐VH(n)非対称構造の二重抗体分子が4‐1BBと結合するEC50はUrelumabと似ているが、より高いMFI最大値を有し；図36(F)に示すように、Fab‐HCAb対称構造の二重抗体分子は、構造(1)の分子(PR005189)であれ構造(2)の分子(PR007165)であれ、類似の4‐1BB結合活性を有し、親モノクローナル抗体PR001760に相当する。
実施例6.6. B7H4を高発現する標的細胞媒介のT細胞の特異的活性化
本実施例は、標的細胞の存在時にB7H4×4‐1BB二重抗体分子が4‐1BBを結合することによりT細胞の活性を活性化することを研究するためである。標的細胞は、B7H4を高発現するSK‐BR‐3(ATCC、HTB‐30)のようなB7H4を異なる程度で発現する細胞であってもよく、またはB7H4を発現しないJIMT‐1(DSMZ、ACC 589)であってもよい。エフェクター細胞は、単離されたヒトPBMCまたはT細胞であってもよい。
本実施例は、標的細胞の存在時にB7H4×4‐1BB二重抗体分子が4‐1BBを結合することによりT細胞の活性を活性化することを研究するためである。標的細胞は、B7H4を高発現するSK‐BR‐3(ATCC、HTB‐30)のようなB7H4を異なる程度で発現する細胞であってもよく、またはB7H4を発現しないJIMT‐1(DSMZ、ACC 589)であってもよい。エフェクター細胞は、単離されたヒトPBMCまたはT細胞であってもよい。
具体的には、まず抗CD3抗体OKT3(Thermo，#16‐0037‐81)を96ウェルプレート(Corning，#3799)に包接された。次に、ヒトT細胞の密度を3×106細胞/mLに調整し、標的細胞の密度を3×105細胞/mLに調整し、その後、2種類の細胞懸濁液をそれぞれ50μL/ウェルで96ウェルプレートに接種し、最終的な効果標的比は10：1であった。その後、50μL/ウェルで異なる濃度の抗体分子を添加し、5倍濃度勾配で希釈した合計6濃度があり、2つの複合ウェルに添加した。hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)とhIgG 4 iso(CrownBio，#C0045)を対照とした。96ウェルプレートを37℃、5%CO2培養箱に2日間インキュベートした。インキュベーション完了後、上清100μLを採取し、別の96ウェルプレート(Corning，#3599)に加え、4℃で500gで5分間遠心分離し、上清50μLを取り出してサイトカインのレベルを測定した。上清中のIL‐2濃度をIL‐2 ELISAキット(Thermo，#88‐7025‐88)で検出し、IFN‐γ MELISAキット(Thermo，#88-7316-88)で上清中のIFN-γ濃度を検出した。ELISA検出方法は関連キットの操作説明を参照する。アプリケーションソフトウェアGraphPad Prism 8で、データ処理と作図分析を行う。
本実施例において、陽性対照分子は抗4‐1BBのモノクローナル抗体Urelumabである。
本実施例において、陽性対照分子は抗4‐1BBのモノクローナル抗体Urelumabである。
実施例6.6.1. SK‐BR‐3媒介のT細胞の特異的活性化
図37及び図38に示すように、B7‐H4を高発現するSK‐BR‐3細胞が存在する場合、B7‐H4×4‐1BB二重抗体分子がT細胞を活性化する能力は陽性対照分子より優れ、この系で産生されたサイトカインIFN‐γ(図37)またはIL‐2(図38)の放出は陽性対照分子より高かった。
図37及び図38に示すように、B7‐H4を高発現するSK‐BR‐3細胞が存在する場合、B7‐H4×4‐1BB二重抗体分子がT細胞を活性化する能力は陽性対照分子より優れ、この系で産生されたサイトカインIFN‐γ(図37)またはIL‐2(図38)の放出は陽性対照分子より高かった。
図37(A‐B)及び図38(A)に示すように、IgG‐VH四価対称構造の二重抗体(PR003334、PR003335、PR003338)は、T細胞を活性化する能力がUrelumabよりやや強く、PR003335及びPR003338はPR003334よりやや強い。
図37(C)及び図38(B)に示すように、IgG‐VH‐VH六価対称構造の二重抗体(PR003487、PR003488)がT細胞を活性化する能力は、IgG‐VH四価の二重抗体(PR003334、PR003335)及びUrelumabより明らかに優れている。
図38(C)に示すように、Fab‐HCAb対称構造の二重抗(PR004279)は、UrelumabよりもT細胞を活性化する能力がやや強い。
図38(D‐F)に示すように、Fab‐Fc‐VH(n)非対称構造の二重抗体(PR004160、PR004161、PR004181、PR004182)はT細胞を刺激してIL‐2を産生することができる。PR004160とPR004161は同じ4-1BB結合ドメイン(VH)の配列を持っているが、PR004160には2つの直列VHドメイン(すなわちFab-Fc-VH(2)構造)があり、PR004161には3つの直列VHドメイン(すなわちFab-Fc-VH(3)構造)があり；PR004161がT細胞を活性化する能力はPR004160とUrelumabより明らかに優れている。同様のFab‐Fc‐VH(3)構造を有するPR004181及びPR004182もまた、Urelumabより優れたT細胞活性化能力を示した。これらの非対称構造二重抗体は、B7H4結合ドメインが1つしかなく、B7H4を結合する能力は対称構造二重抗体より弱いが、B7H4を高発現する細胞を利用してT細胞に対する活性化を媒介することができ、活性化能力はUrelumabより優れている。
実施例6.6.2. B7H4の発現がT細胞に対する活性化に与える影響
図39に示すように、B7H4×4-1BB二重抗体のT細胞に対する活性化は、特異的にB7H4の発現に依存する。(A)B7H4を高発現する細胞SK‐BR‐3が存在する場合、二重抗体PR003334はT細胞のIL‐2放出を特異的に活性化することができ、(B)B7H4を発現しない細胞JIMT‐1が存在する場合、PR003334はT細胞を活性化できない。Urelumabは標的特異性がなく、B7H4の発現がなくてもT細胞を活性化することができる。
図39に示すように、B7H4×4-1BB二重抗体のT細胞に対する活性化は、特異的にB7H4の発現に依存する。(A)B7H4を高発現する細胞SK‐BR‐3が存在する場合、二重抗体PR003334はT細胞のIL‐2放出を特異的に活性化することができ、(B)B7H4を発現しない細胞JIMT‐1が存在する場合、PR003334はT細胞を活性化できない。Urelumabは標的特異性がなく、B7H4の発現がなくてもT細胞を活性化することができる。
実施例6.7. 血清安定性
本実施例は、高濃度ヒト血清中のIgG‐VH対称構造を有するB7H4×4‐1BB二重抗体分子(PR003334、PR003335)の安定性を研究した。具体的には、二重抗体分子は90%ヒト血清で勾配希釈を行い、初期濃度は100nMで、3倍勾配で8つの濃度点に希釈した。各濃度で6つのサンプルに分け、それぞれ37℃で0日、1日、2日、4日、7日、14日インキュベートし、液体窒素を急速凍結した後、‐40℃に放置して保存した。次に、血清中で異なる時間インキュベートした後のサンプルを収集し、実施例6.4.1及び実施例6.5.1に記載の方法に従って二重抗体分子とSK‐BR‐3細胞及びCHOK1/hu4‐1BB細胞との結合活性をそれぞれ試験し、血清中に異なる時間放置した後の結合活性の変化を調べた。
本実施例は、高濃度ヒト血清中のIgG‐VH対称構造を有するB7H4×4‐1BB二重抗体分子(PR003334、PR003335)の安定性を研究した。具体的には、二重抗体分子は90%ヒト血清で勾配希釈を行い、初期濃度は100nMで、3倍勾配で8つの濃度点に希釈した。各濃度で6つのサンプルに分け、それぞれ37℃で0日、1日、2日、4日、7日、14日インキュベートし、液体窒素を急速凍結した後、‐40℃に放置して保存した。次に、血清中で異なる時間インキュベートした後のサンプルを収集し、実施例6.4.1及び実施例6.5.1に記載の方法に従って二重抗体分子とSK‐BR‐3細胞及びCHOK1/hu4‐1BB細胞との結合活性をそれぞれ試験し、血清中に異なる時間放置した後の結合活性の変化を調べた。
二重抗体分子PR003334(図40、表6‐15)とPR003335(図41、表6‐16)はヒト血清中で安定であり、14日間放置してもB7H4端と4‐1BB端の結合活性に明らかな変化はなかった。
実施例6.8. 薬物動態学の研究
本実施例は、マウス体内におけるIgG‐VH対称構造を有するB7H4×4‐1BB二重抗体分子(PR003334、PR003335)の薬物動態学特性を研究した。
本実施例は、マウス体内におけるIgG‐VH対称構造を有するB7H4×4‐1BB二重抗体分子(PR003334、PR003335)の薬物動態学特性を研究した。
実施方法：各試験抗体分子に対して、体重18～22グラムの雌C57BL/6マウス6匹を選択し、5mg/kgの用量で静脈注射により二重特異性抗体を投与した。1群3匹は投与前及び投与後15分、24時間(1日)、4日目、及び10日目に全血を採取し、もう1群3匹は投与前及び投与後5時間、2日目、7日目、及び14日目に全血を採取した。全血を30分間静置して凝固させ、その後4℃で2000rpmで5分間遠心分離し、分離した血清サンプルを分析するまで‐80℃で凍結保存した。本実施例は2種類のELISA方法を用いてマウス血清中の薬物濃度を定量的に測定した。ELISA方法1、すなわちFc端検出(全体検出)、96ウェルプレートに包接されたヤギ抗ヒトFcポリクローナル抗体によりマウス血清中のヒトFc含有タンパクを捕獲し、その後HRP標識ヤギ抗ヒトFc第2抗体を加えて検出する；ELISA方法2、すなわち4-1BBエンド検出(機能ドメイン検出)方法は、96ウェルプレートに包接されたヒト4-1BBタンパク質(Acro biosystems，#41B-H5227)によりマウス血清中のヒト4-1BBを特異的に認識する抗原結合タンパク質を捕獲し、その後HRP標識ヤギ抗ヒトFc第2抗体を加えて検出する。Phoenix WinNonlinソフトウェアバージョン8.2を使用して、非房室モデル(NCA)を選択して薬物動態学パラメータを分析した。
図42及び表6‐17に示すように、IgG‐VH構造の二重抗体分子PR003334及びPR003335は従来のIgG抗体と類似した薬物動態学を有している：全体的な測定方法で、PR003334及びPR003335のマウス体内の血清半減期t1/2値はそれぞれ約8日と14日であり、機能領域検出方法では、マウス体内のPR003334とPR003335の血清半減期t1/2値はそれぞれ約9日と12日であった。
実施例6.9. 二重抗体分子の抗腫瘍薬効
本実施例は、BALB/c-hCD137/CT26-hB7H4マウス腫瘍モデルにおけるB7H4×4-1BB二重抗体分子PR003334の抗腫瘍薬効を研究した。
本実施例は、BALB/c-hCD137/CT26-hB7H4マウス腫瘍モデルにおけるB7H4×4-1BB二重抗体分子PR003334の抗腫瘍薬効を研究した。
実施方法は以下の通り：6-8週間の雌性BALB/c-hCD137マウス(BALB/cマウスに外来人4-1BB遺伝子組み換えを導入、GEMPHARMATECH)を選択し、そして対数成長期にあるCT26-hB7H4腫瘍細胞(マウス結腸癌細胞CT26に外来人B7H4遺伝子組み換えを導入、HARBOURBIOMED)を5×105細胞/マウスの用量で実験マウスの脇右背部皮下に接種した。平均腫瘍体積が80mm3に達した場合、マウスをランダムにグループ化し、各グループ6匹のマウスを用いた。グループ分け当日、特定濃度のPBS希釈でされた薬を腹腔内注射(i.p.)、週2回の合計6回(BIW*3)投与し、PBSを空白対照群とした。腫瘍体積及びマウス体重は、初回投与当日及び4、7、11、14及び18日目に測定した。腫瘍サイズ計算式：腫瘍体積(mm3)＝0.5×(腫瘍長径×腫瘍短径2)。実験終了後、腫瘍マウスを安楽死させ、腫瘍をはがして重量を測定した。各群のマウスの腫瘍体積、マウス体重などを計算した実験結果は平均値±標準誤差(Mean±SEM)で表した。多群の比較では、単因子分散分析(one way ANOVA)検出方法を用いて、異なる治療群と対照群との比較に有意差があるかどうかを比較した。
本実施例において、抗4‐1BBのモノクローナル抗体Urelumabは陽性対照分子である。二重抗体分子PR003334の6mpk(mg/kg)用量とUrelumabの5mpk用量は、同じモル濃度(分子量換算)の対等用量である；二重抗体分子PR003334の18mpk用量は、Urelumabの15mpk用量と同じモル濃度の対等用量である。10mpkの抗マウスPD‐1抗体(Bio×Cell、clone RMP 1‐14、#BE0146)も対照分子として用いた。PBSは空白対照群である。
図43に示すように、二重抗体分子PR003334とUrelumabは各用量群において腫瘍成長を抑制する薬効があり、PD‐1抗体(A)より優れている。各群のマウスの体重変化はいずれも正常範囲内(B)であった。
実施例6.10. UNcleを用いた二重抗体分子の安定性と理化特性の試験
本実施例は、実施例2.5に記載された方法を用いて、IgG‐VH対称構造を有するB7H4×4‐1BB二重抗体分子(PR003334、PR003335、PR003338)の分子安定性等の物理的特性評価を試験した。表6‐18に示すように、これらの二重抗体分子は良好な安定性を有する。
本実施例は、実施例2.5に記載された方法を用いて、IgG‐VH対称構造を有するB7H4×4‐1BB二重抗体分子(PR003334、PR003335、PR003338)の分子安定性等の物理的特性評価を試験した。表6‐18に示すように、これらの二重抗体分子は良好な安定性を有する。
本実施例は、抗B7H4のIgG抗体の抗原結合ドメインFabと抗4-1BBのHCAb抗体の抗原結合ドメインVHを用いて、多種類の構造の抗B7H4×4-1BBの二重特異性抗体分子を構築した。HCAbに基づいて二重特異性抗体分子構造を構築するフレキシビリティを示し、異なる構造タイプ、相対位置、結合価数などのパラメータによってT細胞を活性化する機能活性を調節した。
UrelumabのT細胞に対する活性化が標的特異性がないことは、臨床毒副作用の原因の一つである。しかし、B7H4×4-1BB二重抗体のT細胞に対する活性化作用は、B7H4の発現に特異的に依存する。B7H4を高発現する細胞が存在する場合、二重抗体はT細胞を特異的に活性化することができ；一方、B7H4発現がない場合、二重抗体はT細胞を活性化することができない。したがって、B7H4×4-1BB二重抗体は、Urelumabなどの4-1BBモノクローナル抗体よりも優れた安全性を有する。
一方、B7H4×4-1BB二重抗体は、B7H4の存在下で、T細胞の活性化信号を伝達するために4-1BBの架橋と三量化を媒介することができ、また、そのT細胞を活性化する能力は、Urelumabよりも優れている。Fab‐HCAbとIgG‐VHの4価対称構造では、4‐1BB端のVHは2価であり、T細胞を活性化する能力はUrelumabよりやや優れている；IgG‐VH‐VH六価対称構造では、4‐1BB端のVHは多価であり、そのT細胞を活性化する能力は明らかに強化され、Urelumabより顕著に優れている。
以上より、本実施例は安全性が良く、機能活性が突出し、分子安定性が良いB7H4×4-1BB二重特異性抗体分子を構築した。
以上より、本実施例は安全性が良く、機能活性が突出し、分子安定性が良いB7H4×4-1BB二重特異性抗体分子を構築した。
実施例7. BCMA×CD3二重特異性抗体
実施例7.1. 背景
BCMA(B‐細胞成熟抗原、TNFRSF 17、CD269)は、B細胞の成熟、成長、生存に関与するTNF受容体超ファミリーに属する膜貫通タンパク質である。BCMAには主に高親和性リガンドAPRIL(増殖誘導リガンド)と低親和性リガンドBAFF(B細胞活性化因子)の2種類のリガンドがある。BCMAは高度に分化した形質細胞選択性タンパク質であり、その発現はB細胞系統に限定され、主に形質細胞と形質母細胞上に存在し、記憶B細胞上にある程度存在するが、末梢B細胞上には存在しない。BCMAは多発性骨髄腫(MM)患者の悪性形質細胞中で発現し、多発性骨髄腫細胞の成長と生存を支持する。多発性骨髄腫は非ホチキンリンパ腫に次ぐ血液系第2位の悪性腫瘍であり、血液系悪性腫瘍の約13%を占めている。多発性骨髄腫の新たな標的として、BCMA抗体はMM細胞に様々な機構によって作用することができる。
実施例7.1. 背景
BCMA(B‐細胞成熟抗原、TNFRSF 17、CD269)は、B細胞の成熟、成長、生存に関与するTNF受容体超ファミリーに属する膜貫通タンパク質である。BCMAには主に高親和性リガンドAPRIL(増殖誘導リガンド)と低親和性リガンドBAFF(B細胞活性化因子)の2種類のリガンドがある。BCMAは高度に分化した形質細胞選択性タンパク質であり、その発現はB細胞系統に限定され、主に形質細胞と形質母細胞上に存在し、記憶B細胞上にある程度存在するが、末梢B細胞上には存在しない。BCMAは多発性骨髄腫(MM)患者の悪性形質細胞中で発現し、多発性骨髄腫細胞の成長と生存を支持する。多発性骨髄腫は非ホチキンリンパ腫に次ぐ血液系第2位の悪性腫瘍であり、血液系悪性腫瘍の約13%を占めている。多発性骨髄腫の新たな標的として、BCMA抗体はMM細胞に様々な機構によって作用することができる。
現在の臨床段階で最も速いBCMA向け抗体は、グラクソスミスクライン(GSK)社の抗体CA8‐J6M0hIgG1(以下、陽性対照1とも称し、実施例ではPR000274と番号付けする)及びCA8‐J6M0に基づいて作製された抗体コンジュゲーション薬belantamab mafodotin(CA8‐J6M0‐mcMMAF、GSK2857916)である。GSK2857916は、複数の臨床試験において異なるタイプのMM患者を治療する。1つの小型臨床研究からのデータによると、35例の過剰予備治療(ほとんどの患者は少なくとも5種類の療法治療を受けて失敗した)の再発性または難治性のMM患者の中で、客観的緩和率(ORR)は60%に達し、中位無進展生存期間(PFS)は12カ月であった。安全性の面では、最も一般的な副作用として、角膜問題、血小板減少、貧血が挙げられ、これらはすべてADCにコンジュゲーションされた細胞毒性製剤と関係がある。
現在、臨床開発段階にある二重特異性抗体は、AMGENのAMG-420、REGENERONのREGN-5458、CELGENEのCC-93269、JOHNSON & JOHNSONのJNJ-64007957、ABBVIEのTNB383Bがある。しかし、これらの二重特異性抗体には、半減期が短く、サイトカイン放出症候群(CRS)などの問題もある。TNB383B二重特異性抗体は2019年にMM用の臨床第一期に入り、サイトカイン放出レベルが低いという特徴がある。しかし、TNB383BはカニクイザルのBCMAもカニクイザルのCD3も結合しておらず、カニクイザルでの毒性学的評価はできない。
そのため、より安全で効果的でありながらヒトのBCMAとCD3を標的とし、カニクイザルのBCMAとCD3を結合できる二重特異性抗体を開発する必要がある。
実施例7.2. 抗BCMAのHCAb抗体の発見
BCMA抗原を用いて実験動物を免疫化してBCMAに特異的に結合する抗体分子を得ることができ、この実験動物はマウス、ラット、ウサギ、羊、ラクダなどであることができる。通常、得られる抗体分子は非ヒト由来である。非ヒト由来の抗体を獲得した後、これらの分子に対して抗体工学技術を利用してヒト由来化改造を行い、免疫原性を低下させ、薬剤性を高める必要がある。しかし、抗体のヒト由来化過程には技術的複雑性があり、ヒト由来化改造を経た分子は抗原への親和性を低下させることが多い。一方、遺伝子組み換え技術の進歩により、ヒト免疫グロブリン免疫ライブラリを持ち、内因性のマウスの免疫ライブラリを欠損させた遺伝子工学化マウスを育成することができる。この遺伝子組み換えマウスが産生した抗体は全ヒト由来の配列を持っているので、これ以上ヒト由来化改造をする必要はなく、治療性抗体開発の効率を大幅に高めた。Harbour HCAbマウス(Harbour Antibodies BV、WO2010/109165A2)はヒト免疫グロブリン免疫ライブラリを持つトランスジェニックマウスで、従来のIgG抗体の半分の大きさしかなく、全く新しい「重鎖」のみからなる抗体を産生することができる。その産生抗体はヒトの抗体「重鎖」可変ドメインとマウスFc定常ドメインのみを有する。軽鎖を含まないという特徴のため、この抗体は軽鎖ミスマッチと異種二量化の問題をほとんど解決し、この技術プラットフォームは従来の抗体プラットフォームでは実現しにくい製品を開発することができる。
BCMA抗原を用いて実験動物を免疫化してBCMAに特異的に結合する抗体分子を得ることができ、この実験動物はマウス、ラット、ウサギ、羊、ラクダなどであることができる。通常、得られる抗体分子は非ヒト由来である。非ヒト由来の抗体を獲得した後、これらの分子に対して抗体工学技術を利用してヒト由来化改造を行い、免疫原性を低下させ、薬剤性を高める必要がある。しかし、抗体のヒト由来化過程には技術的複雑性があり、ヒト由来化改造を経た分子は抗原への親和性を低下させることが多い。一方、遺伝子組み換え技術の進歩により、ヒト免疫グロブリン免疫ライブラリを持ち、内因性のマウスの免疫ライブラリを欠損させた遺伝子工学化マウスを育成することができる。この遺伝子組み換えマウスが産生した抗体は全ヒト由来の配列を持っているので、これ以上ヒト由来化改造をする必要はなく、治療性抗体開発の効率を大幅に高めた。Harbour HCAbマウス(Harbour Antibodies BV、WO2010/109165A2)はヒト免疫グロブリン免疫ライブラリを持つトランスジェニックマウスで、従来のIgG抗体の半分の大きさしかなく、全く新しい「重鎖」のみからなる抗体を産生することができる。その産生抗体はヒトの抗体「重鎖」可変ドメインとマウスFc定常ドメインのみを有する。軽鎖を含まないという特徴のため、この抗体は軽鎖ミスマッチと異種二量化の問題をほとんど解決し、この技術プラットフォームは従来の抗体プラットフォームでは実現しにくい製品を開発することができる。
実施例7.2.1. BCMA抗原でマウスを免疫すること
Harbour HCAbマウスに対して、可溶性組換えヒトBCMA‐ECD‐Fc融合タンパク質を用いて多ラウンド免疫を行った。抗原タンパク質を免疫アジュバントと混合して免疫原試薬とし、その後皮下による鼠径部注射または腹腔内注射を行った。各免疫ラウンドにおいて、各マウスが受けた総注射量は100マイクロリットルであった。1ラウンド目の免疫において、各マウスは50マイクログラムの抗原タンパク質(組換えヒトBCMA‐ECD‐Fc，ACRO Biosystems、#BC7‐H82F0)と完全Freundアジュバント(Sigma、#F 5881)を体積比1：1で混合して作製した免疫原試薬により免疫を受けた。下記の免疫増強の各ラウンドにおいて、各マウスは、25マイクログラムの抗原タンパク質とSigma Adjuvant Systemアジュバント(Sigma，#S6322)とを混合して作製された免疫原試薬により免疫を受けた。1ラウンド当たりの免疫増強間隔は少なくとも2週間であり、通常は5ラウンドを超えない。免疫時間は0、14、28、42、56、70日目であり；そして49、77日目にマウス血清抗体滴下を測定した。HCAbマウス脾臓B細胞分離を行う5日前に、各マウス25マイクログラムの抗原タンパク質の用量で最後の免疫増強を行った。
Harbour HCAbマウスに対して、可溶性組換えヒトBCMA‐ECD‐Fc融合タンパク質を用いて多ラウンド免疫を行った。抗原タンパク質を免疫アジュバントと混合して免疫原試薬とし、その後皮下による鼠径部注射または腹腔内注射を行った。各免疫ラウンドにおいて、各マウスが受けた総注射量は100マイクロリットルであった。1ラウンド目の免疫において、各マウスは50マイクログラムの抗原タンパク質(組換えヒトBCMA‐ECD‐Fc，ACRO Biosystems、#BC7‐H82F0)と完全Freundアジュバント(Sigma、#F 5881)を体積比1：1で混合して作製した免疫原試薬により免疫を受けた。下記の免疫増強の各ラウンドにおいて、各マウスは、25マイクログラムの抗原タンパク質とSigma Adjuvant Systemアジュバント(Sigma，#S6322)とを混合して作製された免疫原試薬により免疫を受けた。1ラウンド当たりの免疫増強間隔は少なくとも2週間であり、通常は5ラウンドを超えない。免疫時間は0、14、28、42、56、70日目であり；そして49、77日目にマウス血清抗体滴下を測定した。HCAbマウス脾臓B細胞分離を行う5日前に、各マウス25マイクログラムの抗原タンパク質の用量で最後の免疫増強を行った。
実施例7.2.2. HCAbモノクローナルと抗体配列の獲得
マウス血清中のBCMA特異性抗体価が特定のレベルに達したことを検出した後、マウスの脾臓細胞を取り出してB細胞を分離し、BD FACSARia（登録商標） III細胞選別器でCD138陽性の形質細胞とBCMA抗原陽性のB細胞群を選別する。RNAを抽出し、cDNAを逆転写した後、ヒトVH遺伝子をPCR増幅した。増幅されたVH遺伝子フラグメントをヒトIgG1抗体重鎖Fcドメイン配列をコードする哺乳動物細胞発現プラスミドpCAGベクターに構築し、プラスミドで哺乳動物宿主細胞(例えばヒト胚腎細胞HEK293)をトランスフェクションし発現し、発現されたHCAbの抗体上清と組換えヒトBCMA-Fc，Avitag組換えタンパク質(ACRO Biosystems、#BC7-H82F0)をMirrorball(SPT Labtech、mirrorball（登録商標） fluorescence cytometer)スクリーニングし、得られた陽性モノクローナル抗体上清をフローサイトメトリーFACSでさらに同定した。抗体上清とヒトBCMAを高発現するHEK293T細胞株HEK293T/hBCMA(KYINNO、KC-0233)、カニクイザルBCMAを高発現するHEK293T細胞株HEK293T/cynoBCMA(KYINNO、KC-0979)、ヒトBCMAを高発現する細胞系NCI-H929(ATCC，CRL-9068)などの細胞との結合能力をFACSを用いて試験した。複数ラウンドのスクリーニングにより、4つの陽性モノクローナルが得られた。抗体分子の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列を、従来の配列決定手段を用いて得る。本実施例では、免疫のHarbour HCAbマウスから得られた抗BCMAモノクローナル抗体分子の可変ドメインの配列はヒト由来抗体配列である。
マウス血清中のBCMA特異性抗体価が特定のレベルに達したことを検出した後、マウスの脾臓細胞を取り出してB細胞を分離し、BD FACSARia（登録商標） III細胞選別器でCD138陽性の形質細胞とBCMA抗原陽性のB細胞群を選別する。RNAを抽出し、cDNAを逆転写した後、ヒトVH遺伝子をPCR増幅した。増幅されたVH遺伝子フラグメントをヒトIgG1抗体重鎖Fcドメイン配列をコードする哺乳動物細胞発現プラスミドpCAGベクターに構築し、プラスミドで哺乳動物宿主細胞(例えばヒト胚腎細胞HEK293)をトランスフェクションし発現し、発現されたHCAbの抗体上清と組換えヒトBCMA-Fc，Avitag組換えタンパク質(ACRO Biosystems、#BC7-H82F0)をMirrorball(SPT Labtech、mirrorball（登録商標） fluorescence cytometer)スクリーニングし、得られた陽性モノクローナル抗体上清をフローサイトメトリーFACSでさらに同定した。抗体上清とヒトBCMAを高発現するHEK293T細胞株HEK293T/hBCMA(KYINNO、KC-0233)、カニクイザルBCMAを高発現するHEK293T細胞株HEK293T/cynoBCMA(KYINNO、KC-0979)、ヒトBCMAを高発現する細胞系NCI-H929(ATCC，CRL-9068)などの細胞との結合能力をFACSを用いて試験した。複数ラウンドのスクリーニングにより、4つの陽性モノクローナルが得られた。抗体分子の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列を、従来の配列決定手段を用いて得る。本実施例では、免疫のHarbour HCAbマウスから得られた抗BCMAモノクローナル抗体分子の可変ドメインの配列はヒト由来抗体配列である。
実施例7.2.3. 抗BCMA全ヒト組換え抗体の作製
実施例2.2に記載の方法に従って、HCAb抗体をコードするプラスミドを用いて、従来の組換えタンパク質発現と精製技術を用いて、精製された抗BCMA組換え重鎖抗体を作製した。
実施例2.2に記載の方法に従って、HCAb抗体をコードするプラスミドを用いて、従来の組換えタンパク質発現と精製技術を用いて、精製された抗BCMA組換え重鎖抗体を作製した。
表7‐1は、本実施例における抗BCMAのHCAb抗体の重鎖可変ドメイン、重鎖全長アミノ酸配列、及びChothia規則に従って定義されたCDRのアミノ酸配列に対応する配列番号SEQ ID NOを示す。表7‐2は、陽性対照1すなわちCA8‐J6M0(抗体番号PR000274)の軽鎖、重鎖配列に対応する配列番号SEQ ID NOを示す。
実施例7.3. HCAb抗体とBCMAとの結合
本実施例は、抗BCMAのHCAb抗体がヒト及びカニクイザルBCMAと結合する活性を研究するためである。抗BCMAの組換え抗体と、ヒトBCMAを高発現するHEK293T細胞株HEK293T/hBCMA(KYINNO、KC-0233)、カニクイザルBCMAを高発現するHEK293T細胞株HEK293T/cynoBCMA(KYINNO、KC-0979)、ヒトBCMAを高発現する細胞系NCI-H929(ATCC，CRL-9068)などの細胞との結合能力を、フローサイトメトリー細胞法FACSを用いて試験した。具体的には、HEK293T/hBCMA細胞とHEK293T/cynoBCMA細胞を消化し、DMEM完全培地で再懸濁する；また、NCI-H929細胞懸濁液を収集した。3種類の細胞の密度をそれぞれ1×106細胞/mLに調整した。96ウェルVプレート(Corning，#3894)に100μL細胞/ウェルで接種した後、最終濃度の2倍の3倍濃度勾配で希釈した測定対象抗体を100μL/ウェルで加えた。細胞を4℃に置き、遮光して1時間インキュベートした。その後、100μL/ウェルで予冷のPBSリンス細胞を2回加え、500gで4℃で5分間遠心分離し、上清を廃棄した。さらに100μL/ウェルで蛍光二次抗体(Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG，Fcγ Fragment Specific、Jackson、#109-545-06、1：500希釈)を添加し、4℃で遮光して30分間インキュベートした。細胞を100μL/ウェルで予冷のPBSで2回洗浄し、500g、4℃で5分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、200μL/ウェルで予冷のPBSで細胞を再懸濁し、BD FACS CANToIIフローサイトメータまたはACEA NovoCyteフローサイトメータを用いて蛍光発光信号値を読み取り、ソフトウェアFlowJov 10(FlowJo、LLC)を用いてデータを処理し分析した。ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、4パラメータの非線形フィッティングにより、抗体の標的細胞に対する結合曲線及びEC50値などのパラメータを得た。
本実施例において、陽性対照1分子は抗BCMAのモノクローナル抗体PR000274である。
本実施例は、抗BCMAのHCAb抗体がヒト及びカニクイザルBCMAと結合する活性を研究するためである。抗BCMAの組換え抗体と、ヒトBCMAを高発現するHEK293T細胞株HEK293T/hBCMA(KYINNO、KC-0233)、カニクイザルBCMAを高発現するHEK293T細胞株HEK293T/cynoBCMA(KYINNO、KC-0979)、ヒトBCMAを高発現する細胞系NCI-H929(ATCC，CRL-9068)などの細胞との結合能力を、フローサイトメトリー細胞法FACSを用いて試験した。具体的には、HEK293T/hBCMA細胞とHEK293T/cynoBCMA細胞を消化し、DMEM完全培地で再懸濁する；また、NCI-H929細胞懸濁液を収集した。3種類の細胞の密度をそれぞれ1×106細胞/mLに調整した。96ウェルVプレート(Corning，#3894)に100μL細胞/ウェルで接種した後、最終濃度の2倍の3倍濃度勾配で希釈した測定対象抗体を100μL/ウェルで加えた。細胞を4℃に置き、遮光して1時間インキュベートした。その後、100μL/ウェルで予冷のPBSリンス細胞を2回加え、500gで4℃で5分間遠心分離し、上清を廃棄した。さらに100μL/ウェルで蛍光二次抗体(Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG，Fcγ Fragment Specific、Jackson、#109-545-06、1：500希釈)を添加し、4℃で遮光して30分間インキュベートした。細胞を100μL/ウェルで予冷のPBSで2回洗浄し、500g、4℃で5分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、200μL/ウェルで予冷のPBSで細胞を再懸濁し、BD FACS CANToIIフローサイトメータまたはACEA NovoCyteフローサイトメータを用いて蛍光発光信号値を読み取り、ソフトウェアFlowJov 10(FlowJo、LLC)を用いてデータを処理し分析した。ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、4パラメータの非線形フィッティングにより、抗体の標的細胞に対する結合曲線及びEC50値などのパラメータを得た。
本実施例において、陽性対照1分子は抗BCMAのモノクローナル抗体PR000274である。
実施例7.3.1. ヒトBCMAを高発現する細胞HEK293T/hBCMAとの結合
図44及び表7‐3に示すように、抗ヒトBCMAのHCAbモノクローナル抗体PR000943、PR001035及びPR001046はHEK293T/hBCMAと結合することができ、結合曲線のEC50はいずれも陽性対照1より優れている。
図44及び表7‐3に示すように、抗ヒトBCMAのHCAbモノクローナル抗体PR000943、PR001035及びPR001046はHEK293T/hBCMAと結合することができ、結合曲線のEC50はいずれも陽性対照1より優れている。
実施例7.3.2. ヒトBCMAを高発現する細胞NCI-H929との結合
図46及び表74に示すように、抗ヒトBCMAのHCAbモノクローナル抗体PR000940、PR000943、PR001035及びPR001046はNCI‐H929と結合することができ、結合曲線のEC50はいずれも陽性対照1より優れている。
図46及び表74に示すように、抗ヒトBCMAのHCAbモノクローナル抗体PR000940、PR000943、PR001035及びPR001046はNCI‐H929と結合することができ、結合曲線のEC50はいずれも陽性対照1より優れている。
実施例7.3.3. カニクイザルBCMAを高発現する細胞HEK293T/cynoBCMAとの結合
図45及び表75に示すように、抗ヒトBCMAのHCAbモノクローナル抗体PR000943及びPR001046はHEK293T/cynoBCMAと結合することができ、結合曲線のEC50はいずれも陽性対照1より優れている。PR001035はカニクイザルBCMAを結合する能力が弱い。
図45及び表75に示すように、抗ヒトBCMAのHCAbモノクローナル抗体PR000943及びPR001046はHEK293T/cynoBCMAと結合することができ、結合曲線のEC50はいずれも陽性対照1より優れている。PR001035はカニクイザルBCMAを結合する能力が弱い。
実施例7.4. HCAb抗体内在化による標的細胞の殺傷
本実施例は、ヒトBCMAを発現する細胞に対する抗ヒトBCMAのHCAb抗体内在化媒介による殺傷を研究するためである。具体的には、ヒトBCMAを高発現するHEK293T細胞株HEK293T/hBCMA(KYINNO、KC-0233)を消化し、DMEM完全培地を用いて細胞を再懸濁し、5000または10000個/ウェルで96ウェル黒壁透明底のプレート(Perkin Elmer，#6005225)を計数し接種した。組換え抗体を9つの異なる濃度に連続的に希釈して添加し、最終濃度は100nMからである。a-hFc-MMAF(Moradec，#AH-102-AF)を加えて最終濃度を1μg/mlとした。プレートを37℃、5%CO2条件下で72時間インキュベートした後、CTGキット(Promega，#G7573)で分解し、Enspire（登録商標）多機能ボードリーダー(PerkinElmer，Inc.)で発光を検出する。ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、4パラメータの非線形フィッティングにより、抗体の標的細胞に対する結合曲線及びEC50値と最大殺傷率などのパラメータを得た。
本実施例は、ヒトBCMAを発現する細胞に対する抗ヒトBCMAのHCAb抗体内在化媒介による殺傷を研究するためである。具体的には、ヒトBCMAを高発現するHEK293T細胞株HEK293T/hBCMA(KYINNO、KC-0233)を消化し、DMEM完全培地を用いて細胞を再懸濁し、5000または10000個/ウェルで96ウェル黒壁透明底のプレート(Perkin Elmer，#6005225)を計数し接種した。組換え抗体を9つの異なる濃度に連続的に希釈して添加し、最終濃度は100nMからである。a-hFc-MMAF(Moradec，#AH-102-AF)を加えて最終濃度を1μg/mlとした。プレートを37℃、5%CO2条件下で72時間インキュベートした後、CTGキット(Promega，#G7573)で分解し、Enspire（登録商標）多機能ボードリーダー(PerkinElmer，Inc.)で発光を検出する。ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、4パラメータの非線形フィッティングにより、抗体の標的細胞に対する結合曲線及びEC50値と最大殺傷率などのパラメータを得た。
図47及び表7‐6に示すように、抗ヒトBCMAのHCAb抗体PR000943及びPR001046は、陽性対照1分子よりも内在化能が優れている。
実施例7.5. BLI法によるBCMAと結合する親和性の測定
本実施例では、バイオフィルム干渉(BLI)技術を用いて、Octet Red96e分子相互作用分析器(ForteBio、Octet Red 96 e)を用いて、抗BCMAの抗体とBCMA抗原タンパク質との結合動力学を分析した。本実施例では、BCMAタンパク質はビオチン化されたヒトBCMA‐Fc，Avitag組換えタンパク質(ACRO Biosystems，#BC7‐H82F0)であり、試験緩衝液は1x動力学緩衝液(10x動力学緩衝液(ForteBio，#18‐1105)から希釈)である。
本実施例では、バイオフィルム干渉(BLI)技術を用いて、Octet Red96e分子相互作用分析器(ForteBio、Octet Red 96 e)を用いて、抗BCMAの抗体とBCMA抗原タンパク質との結合動力学を分析した。本実施例では、BCMAタンパク質はビオチン化されたヒトBCMA‐Fc，Avitag組換えタンパク質(ACRO Biosystems，#BC7‐H82F0)であり、試験緩衝液は1x動力学緩衝液(10x動力学緩衝液(ForteBio，#18‐1105)から希釈)である。
抗原と抗体(多濃度)の親和性を測定する場合、センサの回転速度は1000回転／分である。まず、2列のSAセンサ(各列に8個のセンサを配置し、第1列を参照SAセンサ、第2列を試験SAセンサと呼ぶ)を試験緩衝液中で10分間平衡させた。その後、試験SAセンサを用いてビオチン化されたヒトBCMA‐Fc，Avitag組換えタンパク質を捕獲し、捕獲高度が0.9～1.1nmである。一方、参照SAセンサを緩衝液に30秒間浸漬した。次に、SAセンサを試験緩衝液中で2分間平衡させた。2列のSAセンサは、さらに勾配希釈された抗BCMA抗体(例えば、抗体濃度は50nMから2倍の勾配で6つの濃度及び0nMに希釈することができる)と5分間結合し、その後10分間解離する。
Octet Data Analysisソフトウェア(Fortebio、バージョン11.0)を用いてデータ分析を行う場合、二重控除モード(double reference)を選択して参照信号を控除し、「1：1 Global fitting」方法を選択してデータフィッティングを行い、抗原と抗体との結合の動力学パラメータを算出し、kon(1／Ms)値、kdis(1／s)値、KD(M)値を得た。
図48及び表7‐7に示すように、抗ヒトBCMAのHCAb抗体はヒトBCMAタンパク質と強い結合親和性を有する。
実施例7.6. HCAb抗体配列を最適化してBCMAと結合する親和性を高めること
本実施例は、HCAb抗体PR001046がBCMAと結合する親和性を高めるために抗体工学的方法を用いた。
本実施例は、HCAb抗体PR001046がBCMAと結合する親和性を高めるために抗体工学的方法を用いた。
実施例7.6.1. PR001046の変異体の獲得
HCAb抗体PR001046の可変領域VHのCDR領域を二ラウンド定点突然変異することにより、BCMAと結合する親和性が向上した変異体を得る。
HCAb抗体PR001046の可変領域VHのCDR領域を二ラウンド定点突然変異することにより、BCMAと結合する親和性が向上した変異体を得る。
第1ラウンドでは、PR001046 VHの3つのCDR領域(Kabat CDR定義規則に従って指定)中の35個の部位を1点ずつアミノ酸スキャンし、35個の異なる部位の単点飽和突然変異ライブラリを構築した。35個の飽和突然変異ライブラリをBCMA結合ELISAを用いてスクリーニングし、信号がPR001046 VHの2倍を超えた陽性クローンを選別し、さらにこれらの陽性クローンを勾配希釈された多濃度のBCMA結合ELISAを用いてBCMAと結合する能力を試験した。好ましく、いくつかの突然変異ホットスポットを選出した。
第2ラウンドでは、第1ラウンドで好ましい突然変異ホットスポットをランダムに組み合わせ、すべての突然変異の組み合わせを含むライブラリを構築する。次に、組み合わせライブラリをスクリーニングする。陽性クローンに対してシーケンシングと配列解析を行い、BCMAを結合する能力をさらに試験した。いくつかの突然変異体を選出した。
PR001046 VHの変異体分子は、対応するクローン番号で表され、例えば、PR001046‐R1‐12G7、PR001046‐R2‐7E7などである。変異体分子のVH領域をFlag及びHisラベルを有する原核発現ベクターに構築し、次に従来の組換えタンパク質発現及び精製技術を用いて変異体分子を作製し、その対応する配列番号を表7‐8に示す。最後にFACSとBLIなどの方法を用いて組換え突然変異体分子の結合能力の測定を行った。
実施例7.6.2. BLI法を用いて変異体分子がBCMAタンパク質と結合する解離速度ランキングを解析すること
実施例7.5に記載の方法を用いてBLI技術でPR001046 VHから誘導された単一ドメイン構造変異体分子とBCMAとの結合能力を測定した。本実施例は、PR001046 VH誘導体変異体分子を含む上清を直接用い、Octet Red96e分子相互作用分析器を用いて変異体分子とビオチン化したヒトBCMA‐Fc，Avitag組換えタンパク質との結合動力学を分析した。結合動力学における解離速度によって変異体分子をランキングし、解離速度がより遅い(より強い親和性)変異体分子を選択した。本実施例では、各変異体分子とBCMAとの結合動力学の解離速度のみを分析し、初期分子(PR001046 VH)との相対値(Kdis Fold)を計算する；「Kdis倍数」が1未満であることは、変異体分子が初期分子よりも遅い解離速度を有することを意味する。
実施例7.5に記載の方法を用いてBLI技術でPR001046 VHから誘導された単一ドメイン構造変異体分子とBCMAとの結合能力を測定した。本実施例は、PR001046 VH誘導体変異体分子を含む上清を直接用い、Octet Red96e分子相互作用分析器を用いて変異体分子とビオチン化したヒトBCMA‐Fc，Avitag組換えタンパク質との結合動力学を分析した。結合動力学における解離速度によって変異体分子をランキングし、解離速度がより遅い(より強い親和性)変異体分子を選択した。本実施例では、各変異体分子とBCMAとの結合動力学の解離速度のみを分析し、初期分子(PR001046 VH)との相対値(Kdis Fold)を計算する；「Kdis倍数」が1未満であることは、変異体分子が初期分子よりも遅い解離速度を有することを意味する。
本実施例は、多濃度結合動力学分析を用いて抗原抗体結合親和性を計算しないため、分析された抗体を勾配希釈する必要がないため、抗体ごとに1つのSAセンサしか必要とせず、したがって各分析サイクルで複数のサンプルを分析することができ、分析フラックスを向上させることができる。この方法を利用して、大量の変異体分子の上清サンプルに対して解離速度分析を行い、解離速度がより優れた分子を選別することができる。
表79に示すように、16個のPR001046 VHから誘導される変異体分子は、初期分子よりも遅い解離速度(すなわちBCMAに対してより強い親和性)を有する。
表79に示すように、16個のPR001046 VHから誘導される変異体分子は、初期分子よりも遅い解離速度(すなわちBCMAに対してより強い親和性)を有する。
実施例7.6.3. 変異体分子はヒトBCMAを高発現する細胞NCI‐H929に結合すること
実施例7.3に記載の方法を用いて、PR001046 VHから誘導された単一ドメイン構造変異体分子とヒトBCMAを高発現する細胞NCI‐H929との結合を決定した。特に、その組換え変異体分子はFlagタグを持つVH単一ドメイン抗体分子であり、FACS実験ではこのタグに対する蛍光二次抗体を用いる必要があることを指摘した。
実施例7.3に記載の方法を用いて、PR001046 VHから誘導された単一ドメイン構造変異体分子とヒトBCMAを高発現する細胞NCI‐H929との結合を決定した。特に、その組換え変異体分子はFlagタグを持つVH単一ドメイン抗体分子であり、FACS実験ではこのタグに対する蛍光二次抗体を用いる必要があることを指摘した。
図49及び表7‐10に示すように、16個のPR001046 VHから誘導される単一ドメイン変異体分子は、細胞NCI‐H929とよりよく結合することができ、初期分子よりも結合力が優れた。
実施例7.7. 抗CD3のIgG抗体の発見
抗CD3抗体は、T細胞結合二重特異性抗体(T‐Cell Engager Bispecific Antibody)を構築するための重要な構成要素である。本実施例は異なる方法で抗CD3の抗体を発見し、作製することを紹介した。
抗CD3抗体は、T細胞結合二重特異性抗体(T‐Cell Engager Bispecific Antibody)を構築するための重要な構成要素である。本実施例は異なる方法で抗CD3の抗体を発見し、作製することを紹介した。
実施例7.7.1. 全ヒト由来CD3抗体の発見
Harbour H2L2マウス(Harbour Antibodies BV)は、ヒト免疫グロブリン免疫ライブラリを持つトランスジェニックマウスであり、その産生抗体は完全なヒト抗体可変ドメインとラット定常ドメインを有する。CD3抗原を用いてHarbour H2L2マウスに対して多ラウンド免疫を行い；前記抗原は、組換えヒトCD3融合タンパク質、またはヒトCD3EのN末端の前の27個アミノ酸残基を含む短いペプチド、またはヒトT細胞であり得る。マウス血清中のCD3特異性抗体価が特定のレベルに達したことを検出した後、マウスの脾臓細胞を取り出し、そこからB細胞を分離した；その後、RNAを抽出し、RT‐PCRを用いてcDNAを作製した。cDNAをテンプレートとし、PCRによりVHとVκフラグメントを増幅し、その後繰り返しPCRを行ってscFvフラグメントを作製し、予め線形化された担体pHBM‐scFv‐STに接続した。前記で得られた結合生成物をMC1061F'電気転移受容体細胞(Lucigen，#60512‐1)に転換し、次いでファージライブラリを作製した。ビオチン化抗原タンパク質を用いて、多ラウンドのバイオスクリーニングを行い、ヒトCD3/TCR複合体を高発現するCHO-K1細胞CHO-K1/hCD3(HARBOURBIOMED)を用いてスクリーニングし、陽性クローンを同定し、配列を測定した。表7‐11は、ファージディスプレイ技術によってスクリーニングして得られたCD3と結合する単鎖可変領域融合タンパク質(scFv‐Fc構造)を示す。
Harbour H2L2マウス(Harbour Antibodies BV)は、ヒト免疫グロブリン免疫ライブラリを持つトランスジェニックマウスであり、その産生抗体は完全なヒト抗体可変ドメインとラット定常ドメインを有する。CD3抗原を用いてHarbour H2L2マウスに対して多ラウンド免疫を行い；前記抗原は、組換えヒトCD3融合タンパク質、またはヒトCD3EのN末端の前の27個アミノ酸残基を含む短いペプチド、またはヒトT細胞であり得る。マウス血清中のCD3特異性抗体価が特定のレベルに達したことを検出した後、マウスの脾臓細胞を取り出し、そこからB細胞を分離した；その後、RNAを抽出し、RT‐PCRを用いてcDNAを作製した。cDNAをテンプレートとし、PCRによりVHとVκフラグメントを増幅し、その後繰り返しPCRを行ってscFvフラグメントを作製し、予め線形化された担体pHBM‐scFv‐STに接続した。前記で得られた結合生成物をMC1061F'電気転移受容体細胞(Lucigen，#60512‐1)に転換し、次いでファージライブラリを作製した。ビオチン化抗原タンパク質を用いて、多ラウンドのバイオスクリーニングを行い、ヒトCD3/TCR複合体を高発現するCHO-K1細胞CHO-K1/hCD3(HARBOURBIOMED)を用いてスクリーニングし、陽性クローンを同定し、配列を測定した。表7‐11は、ファージディスプレイ技術によってスクリーニングして得られたCD3と結合する単鎖可変領域融合タンパク質(scFv‐Fc構造)を示す。
実施例7.7.2. CD3抗体のヒト由来化改造
SP34は、マウス由来の抗ヒトCD3抗体であり、T細胞を活性化する機能を持つ。SP34は、多種の霊長類CD3(例えばヒト及びカニクイザルCD3)を結合することができるごく少数の抗体である(Salmeron，A.etal，J ImmunoL147(1991)3047‐3052；Conrad M.L., et. al, CytometryA71(2007)925-933を参照)。その可変領域配列VH及びVLはWO2016071004A1に由来する。
SP34は、マウス由来の抗ヒトCD3抗体であり、T細胞を活性化する機能を持つ。SP34は、多種の霊長類CD3(例えばヒト及びカニクイザルCD3)を結合することができるごく少数の抗体である(Salmeron，A.etal，J ImmunoL147(1991)3047‐3052；Conrad M.L., et. al, CytometryA71(2007)925-933を参照)。その可変領域配列VH及びVLはWO2016071004A1に由来する。
本実施例では、「CDR移植」の方法を用いてマウス抗体SP34の可変領域の配列をヒト由来化し、すなわち、SP34のVHのCDRをヒト抗体VHのフレーム領域に移植し、SP34のVLのCDRをヒト抗体VLのフレーム領域に移植した。ヒト抗体VHまたはVLのフレーム領域の配列は、ヒト胚系遺伝子配列またはV(D)J組み換え後の抗体配列、またはヒト抗体の特定VHまたはVL遺伝子ファミリーの一致的(consensus)配列に由来することができる。本実施例は、ヒト胚系遺伝子配列が提供するフレーム領域配列をヒト由来化テンプレート配列として使用し、すなわち、ヒト胚系V遺伝子フラグメントがフレーム領域FR1、FR2、FR3の配列を提供し、ヒト胚系J遺伝子フラグメントがフレーム領域FR4の配列を提供する。最後に、(ヒト)FR1‐(マウス)CDR1‐(ヒト)FR2‐(マウス)CDR2‐(ヒト)FR3‐(マウス)CDR3‐(ヒト)FR4の配列方式でヒト由来化可変領域(VHまたはVL)配列を構築した。
本実施例は、ヒト胚系V遺伝子フラグメントIGHV3-73*01またはヒト胚系V遺伝子フラグメントIGHV3-23*01を用いてヒト胚系J遺伝子フラグメントIGHJ1*01を結合した配列をヒト由来化テンプレートとしてフレーム領域配列を提供する。そして、30位、73位、76位、78位、93位または94位(Chothiaコード規則に従って)に1つまたは複数の部位のアミノ酸突然変異を導入し、複数の異なるVH変異体配列を得た。本実施例はまた、ヒト胚系V遺伝子フラグメントIGLV7-46*02がヒト胚系J遺伝子フラグメントIGLJ2*01と結合した配列またはヒト胚系V遺伝子フラグメントIGKV1-39*01がヒト胚系J遺伝子フラグメントIGKJ4*01と結合した配列を用いてヒト由来化テンプレートとしてフレーム配列を提供する。そして、2位、36位、46位、49位、66位、69位、71位または87位(Chothiaコード規則に従って)にゼロまたは複数の部位のアミノ酸突然変異を導入し、複数の異なるVL変異体配列を得た。
SP34由来のVH変異体配列とVL変異体配列をマッチし組み合わせて、実施例2.2の方法に従って組換え抗体を作製した。表7‐12及び表7‐13は、SP34及びその誘導体変異体の組換え抗体及び対応する配列番号を示す。
実施例7.7.3. CD3抗体がT細胞と結合すること
CD3抗体がヒトのT細胞と結合する結合能力を、フローサイトメトリーFACS及び実施例7.10に記載の方法を用いて試験した。図66に示すように、CD3抗体はすべてヒトT細胞と結合することができ、特に、全ヒト由来CD3抗体(PR002161、PR002163)がT細胞に結合する能力は、SP34キメラ抗体(PR000260)と類似している(図66(F)))；PR000510とPR000511はSP34由来のヒト由来化抗体であり、そのT細胞と結合する能力はPR000260に近い(図66(A‐B)) ；PR001848、PR003886、及びPR004616はSP34由来のヒト由来化抗体であり、そのT細胞と結合する能力を配列最適化により異なる程度で弱めることにより(図66(C‐E))、下記の二重抗体設計においてT細胞活性化機能を選択的に調節する。
CD3抗体がヒトのT細胞と結合する結合能力を、フローサイトメトリーFACS及び実施例7.10に記載の方法を用いて試験した。図66に示すように、CD3抗体はすべてヒトT細胞と結合することができ、特に、全ヒト由来CD3抗体(PR002161、PR002163)がT細胞に結合する能力は、SP34キメラ抗体(PR000260)と類似している(図66(F)))；PR000510とPR000511はSP34由来のヒト由来化抗体であり、そのT細胞と結合する能力はPR000260に近い(図66(A‐B)) ；PR001848、PR003886、及びPR004616はSP34由来のヒト由来化抗体であり、そのT細胞と結合する能力を配列最適化により異なる程度で弱めることにより(図66(C‐E))、下記の二重抗体設計においてT細胞活性化機能を選択的に調節する。
実施例7.8. 抗CD3のIgG抗体と抗BCMAのHCAb抗体を用いた二重特異性抗体分子の構築
本実施例は、抗CD3のIgG抗体の抗原結合ドメインFabと、抗BCMAのHCAb抗体の抗原結合ドメインVHとを用いて、多種類の構造の抗BCMA×CD3の二重特異性抗体分子を構築する。抗CD3の抗原結合ドメインFabの配列は、表7‐11及び表7‐13に記載の配列に由来し；抗BCMAの抗原結合ドメインVHの配列は、表7‐1及び表7‐8に記載の配列に由来する。
本実施例は、抗CD3のIgG抗体の抗原結合ドメインFabと、抗BCMAのHCAb抗体の抗原結合ドメインVHとを用いて、多種類の構造の抗BCMA×CD3の二重特異性抗体分子を構築する。抗CD3の抗原結合ドメインFabの配列は、表7‐11及び表7‐13に記載の配列に由来し；抗BCMAの抗原結合ドメインVHの配列は、表7‐1及び表7‐8に記載の配列に由来する。
本実施例及び下記の実施例において、対照分子は下記の通りである；陽性対照1分子が抗BCMAのモノクローナル抗体CA8‐J6M0(抗体番号PR000274、配列が特許US9273141B2に由来)であり；陽性対照2分子がBCMA×CD3二重抗体分子(抗体番号PR002199、配列が特許WO20133761A1に由来)であり；陽性対照3分子がBCMA×CD3二重抗体分子(抗体番号PR003106、配列が特許WO2017134134A1に由来)であり；抗CD3のモノクローナル抗体SP34由来のhIgG1キメラ抗体(抗体番号PR000260、配列が特許WO201607104A1に由来)である。対照分子の配列を表7‐19に示す。
実施例7.8.1. Fab‐Fc‐VH(n)非対称構造分子の構築
抗CD3のIgG抗体と抗BCMAの重鎖抗体を用いて、実施例1.5と実施例1.6に記載の構造に従ってFab‐FC‐VH(n，n=｛1，2｝)非対称構造のBCMA×CD3二重抗体分子を設計し、表7‐14にまとめた。そして、実施例1.6.2に記載の構造に従って2つの異なる抗BCMAのVHドメイン配列を含む3価非対称構造分子を設計し、表7‐15にまとめた；そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表7‐16にまとめた。
抗CD3のIgG抗体と抗BCMAの重鎖抗体を用いて、実施例1.5と実施例1.6に記載の構造に従ってFab‐FC‐VH(n，n=｛1，2｝)非対称構造のBCMA×CD3二重抗体分子を設計し、表7‐14にまとめた。そして、実施例1.6.2に記載の構造に従って2つの異なる抗BCMAのVHドメイン配列を含む3価非対称構造分子を設計し、表7‐15にまとめた；そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表7‐16にまとめた。
実施例7.8.2. scFv‐Fc‐VH(n)非対称構造分子の構築
抗CD3のIgG抗体と抗BCMAの重鎖抗体を用いて、実施例1.7と実施例1.8に記載の構造に従ってscFv‐FC‐VH(n，n=｛1，2｝)非対称構造のBCMA×CD3二重抗体分子を設計し、表7‐17にまとめた。そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表7‐18にまとめた。
抗CD3のIgG抗体と抗BCMAの重鎖抗体を用いて、実施例1.7と実施例1.8に記載の構造に従ってscFv‐FC‐VH(n，n=｛1，2｝)非対称構造のBCMA×CD3二重抗体分子を設計し、表7‐17にまとめた。そして、実施例2に記載の方法に従って抗体分子サンプルを作製し、分析を行い、表7‐18にまとめた。
実施例7.8.3. BCMA×CD3二重抗体分子及び対照分子の配列リスト
表7‐20及び表7‐19は、本実施例によって構築されたBCMA×CD3二重抗体分子及び対照分子の配列に対応する配列番号を示す。二重抗体分子において、抗CD3の抗原結合ドメインFabの配列は、表7‐11及び表7‐13に記載の配列に由来し；抗BCMAの抗原結合ドメインVHの配列は、表7‐1及び表7‐8に記載の配列に由来する。表7‐20の構造番号は、表1‐1及び図1に対応する。表7‐21は、BCMA×CD3二重特異性または多特異性抗体分子の異なる抗原結合ドメインに対応するCDR配列の配列番号を示す。
表7‐20及び表7‐19は、本実施例によって構築されたBCMA×CD3二重抗体分子及び対照分子の配列に対応する配列番号を示す。二重抗体分子において、抗CD3の抗原結合ドメインFabの配列は、表7‐11及び表7‐13に記載の配列に由来し；抗BCMAの抗原結合ドメインVHの配列は、表7‐1及び表7‐8に記載の配列に由来する。表7‐20の構造番号は、表1‐1及び図1に対応する。表7‐21は、BCMA×CD3二重特異性または多特異性抗体分子の異なる抗原結合ドメインに対応するCDR配列の配列番号を示す。
実施例7.9. 二重抗体分子とBCMAとの結合
本実施例は、BCMA×CD3二重特異性抗体がBCMAに結合する能力を研究するためである。
本実施例は、BCMA×CD3二重特異性抗体がBCMAに結合する能力を研究するためである。
二重抗体分子とヒトBCMAを高発現するHEK293T細胞株HEK293T/hBCMA(KYINNO、KC-0233)、カニクイザルBCMAを高発現するHEK293T細胞株HEK293T/cynoBCMA(KYINNO、KC-0979)、ヒトBCMAを高発現する細胞系NCI-H929(ATCC，CRL-9068)などの細胞との結合能力を、実施例7.3に記載の方法に従って、フローサイトメトリー細胞法FACSを用いて試験した。
本実施例において、陽性対照1分子は抗BCMAのモノクローナル抗体PR000274である。陽性対照2分子は、特許WO2019133761A1中の配列を用いて構築されたBCMA×CD3二重抗体分子PR002199である。陽性対照3分子は、特許WO2017134134A1中の配列を用いて構築されたBCMA×CD3二重抗体分子PR003106である。
実施例7.9.1. ヒトBCMAを高発現する細胞HEK293T/hBCMAとの結合
図50及び表7‐22に示すように、二重抗体分子はいずれもヒトBCMAを結合することができ、しかも2つの直列に形成されたBCMA結合ドメインを含むFab‐Fc‐VH(2)非対称構造の二重抗体分子は、1つのBCMA結合ドメインのみを有するFab‐Fc‐VH非対称構造の二重抗体分子よりも、強いBCMAと結合する能力を有する。
図50及び表7‐22に示すように、二重抗体分子はいずれもヒトBCMAを結合することができ、しかも2つの直列に形成されたBCMA結合ドメインを含むFab‐Fc‐VH(2)非対称構造の二重抗体分子は、1つのBCMA結合ドメインのみを有するFab‐Fc‐VH非対称構造の二重抗体分子よりも、強いBCMAと結合する能力を有する。
実施例7.9.2. 人BCMAを高発現する腫瘍細胞NCI-H929との結合
図52及び表7‐23に示すように、二重抗体分子はいずれもヒトBCMAと結合することができる。全体的に言えば、一つのBCMA結合ドメインのみを有する二重抗体分子(例えば、Fab‐Fc‐VH構造とscFv‐Fc‐VH構造で)がBCMAと結合する能力は、2価BCMA結合ドメインを有する分子(例えば、IgGモノクローナル抗体、またはFab‐Fc‐VH(2)非対称構造の二重抗体分子)より弱い。図52(E)に示すように、PR001046から誘導された親和性が向上したHCAb変異体に基づいて一連のFab‐Fc‐VH構造の二重抗体分子(PR003867，...、PR003882)が構築されており、これらの二重抗体分子は、PR002929(PR001046 HCAbで構築されたFab‐Fc‐VH構造)に対してBCMAを結合する能力がより強い。Fab‐Fc‐VH(2)非対称構造の二重抗体分子がBCMAに結合する能力は、陽性対照1及び3より優れている。
図52及び表7‐23に示すように、二重抗体分子はいずれもヒトBCMAと結合することができる。全体的に言えば、一つのBCMA結合ドメインのみを有する二重抗体分子(例えば、Fab‐Fc‐VH構造とscFv‐Fc‐VH構造で)がBCMAと結合する能力は、2価BCMA結合ドメインを有する分子(例えば、IgGモノクローナル抗体、またはFab‐Fc‐VH(2)非対称構造の二重抗体分子)より弱い。図52(E)に示すように、PR001046から誘導された親和性が向上したHCAb変異体に基づいて一連のFab‐Fc‐VH構造の二重抗体分子(PR003867，...、PR003882)が構築されており、これらの二重抗体分子は、PR002929(PR001046 HCAbで構築されたFab‐Fc‐VH構造)に対してBCMAを結合する能力がより強い。Fab‐Fc‐VH(2)非対称構造の二重抗体分子がBCMAに結合する能力は、陽性対照1及び3より優れている。
実施例7.9.3. カニクイザルBCMAを高発現する細胞HEK293T/cynoBCMAとの結合
図51及び表7‐24に示すように、二重抗体分子はいずれもカニクイザルBCMAと結合することができるが、陽性対照2二重抗体分子はカニクイザルBCMAと結合することができない。また、2つのPR001046のVH直列ドメインを含むFab‐FC‐VH(2)は、カニクイザルBCMAを結合する能力がより強い。
図51及び表7‐24に示すように、二重抗体分子はいずれもカニクイザルBCMAと結合することができるが、陽性対照2二重抗体分子はカニクイザルBCMAと結合することができない。また、2つのPR001046のVH直列ドメインを含むFab‐FC‐VH(2)は、カニクイザルBCMAを結合する能力がより強い。
実施例7.10. 二重抗体分子がT細胞と結合すること
本実施例は、BCMA×CD3二重特異性抗体がT細胞に結合する能力を研究するためのものである。
抗体分子のヒトまたはカニクイザルT細胞に対する結合能力を、フローサイトメトリーFACSを用いて試験した。具体的には、T細胞分離キット(Meltenyi，#130‐096‐535)を用いてヒトまたはカニクイザルのPBMC細胞からT細胞を分離した。T細胞密度をそれぞれ1×106細胞/mLに調整した。96ウェルプレート(Corning，#3894)に100μL細胞/ウェルで接種し、次いで最終濃度の2倍の3倍濃度勾配で希釈された測定対象抗体を100μL/ウェルで添加した。細胞を4℃に置き、遮光して1時間インキュベートした。その後、予冷のPBSリンス細胞を100μL/ウェルで2回添加し、4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。さらに100μL/ウェルで蛍光二次抗体(Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG，Fcγ Fragment Specific，Jackson，#109-545-06，1：500希釈)を添加し、4℃で30分間遮光して培養した。細胞を100μL/ウェルで予冷のPBSで2回洗浄し、4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、200μL/ウェルで予冷のPBSで細胞を再懸濁し、BD FACS CANToIIフローサイトメータまたはACEA NovoCyteフローサイトメータを用いて蛍光発光信号値を読み取り、ソフトウェアFlowJov 10(FlowJo、LLC)を用いてデータを処理し分析した。ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、4パラメータの非線形フィッティングにより、抗体の標的細胞に対する結合曲線及びEC50値などのパラメータを得た。
本実施例は、BCMA×CD3二重特異性抗体がT細胞に結合する能力を研究するためのものである。
抗体分子のヒトまたはカニクイザルT細胞に対する結合能力を、フローサイトメトリーFACSを用いて試験した。具体的には、T細胞分離キット(Meltenyi，#130‐096‐535)を用いてヒトまたはカニクイザルのPBMC細胞からT細胞を分離した。T細胞密度をそれぞれ1×106細胞/mLに調整した。96ウェルプレート(Corning，#3894)に100μL細胞/ウェルで接種し、次いで最終濃度の2倍の3倍濃度勾配で希釈された測定対象抗体を100μL/ウェルで添加した。細胞を4℃に置き、遮光して1時間インキュベートした。その後、予冷のPBSリンス細胞を100μL/ウェルで2回添加し、4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。さらに100μL/ウェルで蛍光二次抗体(Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG，Fcγ Fragment Specific，Jackson，#109-545-06，1：500希釈)を添加し、4℃で30分間遮光して培養した。細胞を100μL/ウェルで予冷のPBSで2回洗浄し、4℃で500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。最後に、200μL/ウェルで予冷のPBSで細胞を再懸濁し、BD FACS CANToIIフローサイトメータまたはACEA NovoCyteフローサイトメータを用いて蛍光発光信号値を読み取り、ソフトウェアFlowJov 10(FlowJo、LLC)を用いてデータを処理し分析した。ソフトウェアGraphPad Prism 8を用いてデータ処理と作図分析を行い、4パラメータの非線形フィッティングにより、抗体の標的細胞に対する結合曲線及びEC50値などのパラメータを得た。
本実施例では、陽性対照は抗CD3のモノクローナル抗体SP34(抗体番号PR000260)であり、陽性対照2二重抗体分子(抗体番号PR002199)は別の対照分子である。
実施例7.10.1. ヒトのT細胞との結合
図53及び表7‐25に示すように、二重抗体分子はいずれもヒトのT細胞に結合することができる。陽性対照分子SP34は二価のIgG構造であり、T細胞を結合する能力が非常に強い。陽性対照2二重抗体分子がT細胞と結合する能力は弱い。二重抗体分子のCD3末端における構造は一価のFabであり、そのFab配列は抗CD3のモノクローナル抗体SP34に由来する変異体配列であり、配列設計と突然変異によって、これらの変異体配列のT細胞と結合する能力が異なる程度で低下し、これは、CD3末端のT細胞活性化能力を低下させ、サイトカインの過剰放出による副作用を減少させるためである。異なる二重抗体分子のCD3端部には、異なる構造または変異体配列があり、T細胞を結合する能力も異なる。臨床的には活性と安全性とのバランスに対する異なる需要があり、T細胞に対する結合能力についての要求も異なる。
図53及び表7‐25に示すように、二重抗体分子はいずれもヒトのT細胞に結合することができる。陽性対照分子SP34は二価のIgG構造であり、T細胞を結合する能力が非常に強い。陽性対照2二重抗体分子がT細胞と結合する能力は弱い。二重抗体分子のCD3末端における構造は一価のFabであり、そのFab配列は抗CD3のモノクローナル抗体SP34に由来する変異体配列であり、配列設計と突然変異によって、これらの変異体配列のT細胞と結合する能力が異なる程度で低下し、これは、CD3末端のT細胞活性化能力を低下させ、サイトカインの過剰放出による副作用を減少させるためである。異なる二重抗体分子のCD3端部には、異なる構造または変異体配列があり、T細胞を結合する能力も異なる。臨床的には活性と安全性とのバランスに対する異なる需要があり、T細胞に対する結合能力についての要求も異なる。
実施例7.10.2. カニクイザルのT細胞を結合すること
図54及び表7‐26に示すように、本実施例の二重抗体分子のCD3末端Fab配列は、抗CD3のモノクローナル抗体SP34に由来する変異体配列であるため、カニクイザルのT細胞を結合することができ、一方、陽性対照2二重抗体分子はカニクイザルのT細胞を結合することができない。
図54及び表7‐26に示すように、本実施例の二重抗体分子のCD3末端Fab配列は、抗CD3のモノクローナル抗体SP34に由来する変異体配列であるため、カニクイザルのT細胞を結合することができ、一方、陽性対照2二重抗体分子はカニクイザルのT細胞を結合することができない。
実施例7.11. BLI法による二重抗体分子がBCMAと結合する親和性の測定
本実施例は、実施例7.5に記載の方法に従ってOctet Red96e分子相互作用分析器(ForteBio、Octet Red96e)を用いてBCMA×CD3二重抗体分子とBCMA抗原タンパク質との結合動力学を分析した。
本実施例の二重抗体分子はいずれもヒト及びカニクイザルのBCMA(表7‐27及び表7‐28)に結合することができるが、陽性対照2二重抗体分子はカニクイザルのBCMAに結合することができなかった。また、本実施例の二重抗体分子がヒトBCMA(ACRO Biosystems，#BC7‐H82F0)及びカニクイザルBCMA(ACRO Biosystems，#BCA‐C82F4)と結合する親和性(KD)の比(表7‐29)は5倍以内(0.5～5)であり、良好な関連性があることを示している。
本実施例は、実施例7.5に記載の方法に従ってOctet Red96e分子相互作用分析器(ForteBio、Octet Red96e)を用いてBCMA×CD3二重抗体分子とBCMA抗原タンパク質との結合動力学を分析した。
本実施例の二重抗体分子はいずれもヒト及びカニクイザルのBCMA(表7‐27及び表7‐28)に結合することができるが、陽性対照2二重抗体分子はカニクイザルのBCMAに結合することができなかった。また、本実施例の二重抗体分子がヒトBCMA(ACRO Biosystems，#BC7‐H82F0)及びカニクイザルBCMA(ACRO Biosystems，#BCA‐C82F4)と結合する親和性(KD)の比(表7‐29)は5倍以内(0.5～5)であり、良好な関連性があることを示している。
実施例7.12. 標的細胞に対する二重抗体分子の殺傷実験
本実施例は、BCMA×CD3二重抗体分子媒介のT細胞活性化と特異的な標的細胞殺傷能力を研究した。
本実施例は、BCMA×CD3二重抗体分子媒介のT細胞活性化と特異的な標的細胞殺傷能力を研究した。
実施例7.12.1. BCMAを高発現する細胞NCI-H929に対する体外殺傷実験及びサイトカインの放出
本実施例は、BCMAを高発現する腫瘍細胞NCI-H929(ATCC，CRL-9068)が存在する時、二重抗体分子がT細胞を活性化し、サイトカインを放出し、腫瘍細胞を殺傷する能力を研究した。エフェクター細胞は、ヒト末梢血単一核細胞PBMCであってもよいし、PBMCから単離されたT細胞であってもよい。
具体的には、培地(5%FBSを含むRPMI1640培地)を用いてエフェクター細胞(PBMCまたはT細胞)の密度を1.1×106細胞/mLに調整し、NCI-H929の密度を0.11×106細胞/mLに調整し、2種類の細胞懸濁液をそれぞれ90μL細胞/ウェルで96ウェルプレート(Corning，#3799)に接種した。その後、20μL/ウェルで異なる濃度の測定対象抗体(最終濃度の10倍の勾配希釈)を添加し、抗体濃度は最終濃度が30nM、または最高最終濃度が1nMから20倍濃度勾配で希釈された合計3濃度、または最高最終濃度が30nMから4倍濃度勾配で希釈された合計10濃度に希釈し；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。最終的な効果標的比は10：1で、2つの複合ウェル添加を設定する。測定対象抗体を添加したウェルをER(測定対象抗体サンプルとエフェクター細胞及び標的細胞を含む、実験ウェル)と呼び；同時に、プレート内に以下の式中のパラメータ組成に従って異なる対照群を設置する：ESR(エフェクター細胞自然放出ウェル、エフェクター細胞と培地のみ)；TSR(標的細胞自然放出ウェル、標的細胞と培地のみ)；CMB(培地参照ウェル、培地のみ)；TMR(標的細胞の最大放出ウェル、標的細胞と培地のみ)；VCC(体積参照ウェル、培地のみ)。96ウェルプレートを37℃の二酸化炭素培養箱に24時間インキュベートした。その後、TMRウェルとVCCウェルに10μL分解液を加え、30分間インキュベートを続けた。インキュベーション完了後、50μL/ウェルの上清液を採取し、96ウェルプレート(Corning，#：3599)に添加し、そして50μL/ウェルで細胞毒性検出試薬(CytoTox96（登録商標）非放射性細胞毒性検出キット、Promega，#G1780)を添加する。室温で30分間インキュベートした後、50μLの反応停止液を加えて反応を停止した。最後にEnspire（登録商標） マルチファンクションリーダ(Perkin Elmer，Inc.)で490nMで光吸収値を読み取り、次の計算式に従って標的細胞殺傷率を計算した。
本実施例は、BCMAを高発現する腫瘍細胞NCI-H929(ATCC，CRL-9068)が存在する時、二重抗体分子がT細胞を活性化し、サイトカインを放出し、腫瘍細胞を殺傷する能力を研究した。エフェクター細胞は、ヒト末梢血単一核細胞PBMCであってもよいし、PBMCから単離されたT細胞であってもよい。
具体的には、培地(5%FBSを含むRPMI1640培地)を用いてエフェクター細胞(PBMCまたはT細胞)の密度を1.1×106細胞/mLに調整し、NCI-H929の密度を0.11×106細胞/mLに調整し、2種類の細胞懸濁液をそれぞれ90μL細胞/ウェルで96ウェルプレート(Corning，#3799)に接種した。その後、20μL/ウェルで異なる濃度の測定対象抗体(最終濃度の10倍の勾配希釈)を添加し、抗体濃度は最終濃度が30nM、または最高最終濃度が1nMから20倍濃度勾配で希釈された合計3濃度、または最高最終濃度が30nMから4倍濃度勾配で希釈された合計10濃度に希釈し；hIgG1 iso(CrownBio，#C0001)を同型対照とした。最終的な効果標的比は10：1で、2つの複合ウェル添加を設定する。測定対象抗体を添加したウェルをER(測定対象抗体サンプルとエフェクター細胞及び標的細胞を含む、実験ウェル)と呼び；同時に、プレート内に以下の式中のパラメータ組成に従って異なる対照群を設置する：ESR(エフェクター細胞自然放出ウェル、エフェクター細胞と培地のみ)；TSR(標的細胞自然放出ウェル、標的細胞と培地のみ)；CMB(培地参照ウェル、培地のみ)；TMR(標的細胞の最大放出ウェル、標的細胞と培地のみ)；VCC(体積参照ウェル、培地のみ)。96ウェルプレートを37℃の二酸化炭素培養箱に24時間インキュベートした。その後、TMRウェルとVCCウェルに10μL分解液を加え、30分間インキュベートを続けた。インキュベーション完了後、50μL/ウェルの上清液を採取し、96ウェルプレート(Corning，#：3599)に添加し、そして50μL/ウェルで細胞毒性検出試薬(CytoTox96（登録商標）非放射性細胞毒性検出キット、Promega，#G1780)を添加する。室温で30分間インキュベートした後、50μLの反応停止液を加えて反応を停止した。最後にEnspire（登録商標） マルチファンクションリーダ(Perkin Elmer，Inc.)で490nMで光吸収値を読み取り、次の計算式に従って標的細胞殺傷率を計算した。
殺傷率＝((ER‐CMB)‐(ESR‐CMB)‐(TSR‐CMB)／(TMR‐VCC)×100%
ここで、次の操作を行う。
ER＝実験ウェル、サンプル＋エフェクター細胞＋標的細胞
ESR＝エフェクター細胞自然放出ウェル、エフェクター細胞＋培地
TSR＝標的細胞自然放出ウェル、標的細胞＋培地
TMR＝標的細胞最大放出ウェル、標的細胞＋培地＋分解液
VCC＝体積参照ウェル、培地＋溶解液
CMB=培地参照ウェル、培地
ここで、次の操作を行う。
ER＝実験ウェル、サンプル＋エフェクター細胞＋標的細胞
ESR＝エフェクター細胞自然放出ウェル、エフェクター細胞＋培地
TSR＝標的細胞自然放出ウェル、標的細胞＋培地
TMR＝標的細胞最大放出ウェル、標的細胞＋培地＋分解液
VCC＝体積参照ウェル、培地＋溶解液
CMB=培地参照ウェル、培地
細胞毒性を検出すると同時に、細胞上清中のサイトカイン放出レベルを検出することもできる。簡単に言えば、50μLの上清液を取り出してサイトカインのレベル検出に用いた。TNF‐α ELISAキット(Thermo，#88-7346-88)で上清中のTNF‐α濃度を検出し、上清中のIL‐6濃度をIL‐6 ELISAキット(Thermo，#88‐7066‐88)を用いて検出し、上清中のIL‐2濃度をIL‐2 ELISAキット(Thermo，#88‐7025‐88)で検出し、上清中のIFN-γ濃度をIFN－γ ELISAキット(Thermo，#88-7316-88)で検出し、上清中のIL‐10濃度をIL‐10 ELISAキット(Thermo，#88‐7106‐88)で検出した。ELISA検出方法は関連キットの操作説明を参照する。ソフトウェアGraphPad Prism 8を使用してデータ処理と作図分析を行う。
図56に示すように、scFv‐FC‐VH(1)非対称構造の二重抗体分子(PR002000、PR002002)は標的細胞に対して有効な殺傷を発生することができる。抗BCMAのHCAbモノクローナル抗体PR000940に基づいて構築された二重抗体分子PR001999は、標的細胞に対して殺傷機能を有しない。これらの分子構造は類似しており、いずれも同じCD3の結合ドメイン(scFv)の配列を含んでいる。違いはBCMAの結合ドメイン(VH)の配列が異なり、異なるVH及びBCMA抗原と結合する親和性やエピトープの違いが標的細胞に対する二重抗体分子の殺傷活性の違いを招いている。抗BCMAのIgGモノクローナル抗体陽性対照1分子にも殺傷機能はなかった。
図55に示すように、scFv‐FC‐VH(2)非対称構造の二重抗体分子(PR002867、PR002868、PR002869、PR002870)は、標的細胞に対して異なる程度の殺傷を生じさせることができる。これらの分子構造は類似しており、いずれも2つの同じ直列BCMAの結合ドメイン(VH)を含んでおり、そのわずかな違いはCD3の結合ドメインscFvの配列が異なる抗CD3モノクローナル抗体に由来することである。PR002867とPR002870の標的細胞殺傷能力は陽性対照2二重抗体分子と類似しているが、PR002868とPR002869の標的細胞殺傷能力は弱い。
図57(A‐B)に示すように、12個のFab‐Fc‐VH(1)非対称構造の二重抗体分子(PR001987、…、PR001998)は類似の分子構造を有するが、BCMAの結合ドメインとCD3の結合ドメインの配列は異なる；標的細胞に対する殺傷能力も異なる。その中で、PR001988、PR001990、PR001994、PR001996、PR001998は比較的に強い標的細胞殺傷能力を持っている。図57(C)に示すように、PR001990はPR001988よりも標的細胞の殺傷能力が強い。図57(D‐F)に示すように、PR001046から誘導された親和性が向上したHCAb変異体に基づいて構築されたFab‐Fc‐VH構造の二重抗体分子は、標的細胞に対して殺傷能力がある。
図58に示すように、Fab‐Fc‐VH(2)非対称構造の二重抗体分子は標的細胞に有効な殺傷を与えることができる。これらの分子はいずれも2つの直列のBCMAの結合ドメイン(VH)を含む。その標的細胞殺傷能力はFab‐FC‐VH(1)構造の分子PR001990より明らかに優れ、陽性対照2二重抗体分子よりも優れている。図58(A‐B)に示すように、二重抗体分子PR002301、PR002308、PR002309、PR002310、PR002313、PR002326及びPR002328は同じCD3の結合ドメインの配列を有し、ここで、PR002301、PR002308、PR002309、PR002310のBCMA結合ドメインは、2つの同じVH配列が直列に接続されてなる；PR002313、PR002326、PR002328のBCMA結合ドメインは、2つの異なるVH配列が直列に接続されてなる；特に、PR002326とPR002328のBCMA結合ドメインに使用される2つの異なるVHは、BCMAの異なるエピトープと結合することができる。図58(C)に示すように、二重抗体分子PR002892、PR002895、PR002950、PR002953、PR003177及びPR003178のBCMA結合ドメインは、PR001046に由来する2つの同じVH配列が異なる長さの接続ペプチド配列によって直列に結合されてなる；しかし、それらは異なるCD3の結合ドメインの配列を持ち、異なるT細胞を結合する能力があるため、異なる標的細胞殺傷効率(EC50)も体現している。図58(D)に示すように、二重抗体分子PR003690はPR003178に基づいて、Fc領域に追加のアミノ酸突然変異を導入して血清半減期をさらに向上させ、その標的結合ドメインは変化しないため、PR003690の標的細胞殺傷能力はPR003178と一致する。
図59及び図60に示すように、二重抗体分子PR001990(Fab‐Fc‐VH(1)構造、強CD3結合)、PR002309(Fab‐Fc‐VH(2)構造、強CD3結合)、PR002895(Fab‐Fc‐VH(2)構造、強CD3結合)、PR002953(Fab‐Fc‐VH(2)構造、弱CD3結合)及びPR003178(Fab‐Fc‐VH(2)構造、中CD3結合)及び陽性対照2及び陽性対照3などの標的細胞に対する殺傷能力及び複数のサイトカイン放出レベルについて、より系統的に研究した(表7‐30及び表7‐31)。これらの二重抗体分子はいずれも類似の最大殺傷率を達成することができるが、殺傷効率EC50によって誘導されるサイトカインの放出レベルが異なる。PR002309、PR002895、PR002953、PR003178の標的細胞殺傷EC50は陽性対照2より優れている；また、PR002895、PR002953及びPR003178による複数のサイトカイン放出レベルは、陽性対照3よりも低かった。特に、PR003178の標的細胞殺傷能力は、陽性対照2よりも優れている(EC50の10倍強い)；PR003178は、陽性対照3と同等の殺傷能力を有するが、サイトカイン放出の最大値はより低い。これは、PR003178は有効な腫瘍殺傷効率を維持しながら、サイトカイン放出レベルを制御してサイトカイン放出症候群のリスクを低減し、臨床的に有効性と安全性をよりよくバランスさせ、より良い薬物治療ウィンドウをもたらせる可能性があることを示している。
実施例7.12.2. 可溶性APRILと可溶性BAFFが二重抗体分子の標的細胞殺傷効果に与える影響
本実施例は、実施例7.12.1に記載の方法に基づいて、二重抗体分子の標的細胞殺傷効果に対するBCMAリガンド(APRILとBAFF)の影響をさらに研究し、多発性骨髄腫患者の血漿中のAPRILとBAFFの濃度が約100ng/ml(Blood 2004、103：3148-3157)である。具体的には、実施例7.12.1に記載の方法において、異なる濃度の測定対象抗体を添加する際にも、可溶性リガンドタンパク質の最終濃度が100ng/mlと10ng/mlとなるようにBCMAリガンドタンパク質を20μL/ウェルで添加した。可溶性APRILタンパク質(sAPRIL)は、組換えヒト由来APRILタンパク質(Novoprotein，#CU89)である；可溶性BAFFタンパク質(sBAFF)は、組換えヒト由来BAFFタンパク質(ACRO Biosystems，#BAF‐H5248)である。エフェクター細胞は、ヒトPBMCまたはT細胞であり、標的細胞はNCI‐H929である。実施例7.12.1に記載の方法を用いて標的細胞殺傷率を計算した。
本実施例は、実施例7.12.1に記載の方法に基づいて、二重抗体分子の標的細胞殺傷効果に対するBCMAリガンド(APRILとBAFF)の影響をさらに研究し、多発性骨髄腫患者の血漿中のAPRILとBAFFの濃度が約100ng/ml(Blood 2004、103：3148-3157)である。具体的には、実施例7.12.1に記載の方法において、異なる濃度の測定対象抗体を添加する際にも、可溶性リガンドタンパク質の最終濃度が100ng/mlと10ng/mlとなるようにBCMAリガンドタンパク質を20μL/ウェルで添加した。可溶性APRILタンパク質(sAPRIL)は、組換えヒト由来APRILタンパク質(Novoprotein，#CU89)である；可溶性BAFFタンパク質(sBAFF)は、組換えヒト由来BAFFタンパク質(ACRO Biosystems，#BAF‐H5248)である。エフェクター細胞は、ヒトPBMCまたはT細胞であり、標的細胞はNCI‐H929である。実施例7.12.1に記載の方法を用いて標的細胞殺傷率を計算した。
図61及び表7‐32に示すように、可溶性APRIL及びBAFFは、二重抗体分子の標的細胞殺傷能力にほとんど影響を与えなかった。
実施例7.12.3. 二重抗体分子の標的細胞殺傷効果に対する可溶性BCMAの影響
BCMAは、膜貫通タンパク質であるが、その細胞外領域には細胞膜から脱落して可溶性BCMA(sBCMA)を形成できるものがあり、多発性骨髄腫患者の血漿中でsBCMAのレベルの異なる程度の上昇が観察され、中央値濃度は176.0ng/ml(Leuk Res.2019 Jun；81：62-66)であった。
BCMAは、膜貫通タンパク質であるが、その細胞外領域には細胞膜から脱落して可溶性BCMA(sBCMA)を形成できるものがあり、多発性骨髄腫患者の血漿中でsBCMAのレベルの異なる程度の上昇が観察され、中央値濃度は176.0ng/ml(Leuk Res.2019 Jun；81：62-66)であった。
本実施例は、実施例7.12.1に記載の方法に基づいて最適化を行い、可溶性BCMA(sBCMA)が二重抗体分子の標的細胞殺傷効果に与える影響を研究した。具体的には、実施例7.12.1に記載の方法において、異なる濃度の被験抗体を添加する際に、組換えヒト由来BCMAタンパク質(ACRO Biosystems，#BCA‐H522 y)を20μL／ウェルで添加し、最終濃度を500ng／ml、250ng／ml、125ng／ml、及び62.5ng／mlとした。エフェクター細胞はヒトPBMCであり、標的細胞はNCI-H929である。実施例7.12.1に記載の方法を用いて標的細胞殺傷率を計算した。
図62及び表7‐33に示すように、可溶性BCMAは、二重抗体分子の標的細胞殺傷率EC50に影響を与え、用量依存性を示すが、最大殺傷率に影響を与えない。可溶性BCMAの濃度が176.0ng/mlの場合、二重抗体分子PR002309及びPR003178の標的細胞殺傷率EC50は、陽性対照2及び陽性対照3より優れている；すなわち、二重抗体分子PR002309及びPR003178の標的細胞殺傷率に対する可溶性BCMAの影響は、陽性対照2及び陽性対照3に対する影響よりも小さい。
実施例7.13. 薬物動態学の研究
本実施例は、マウスまたはラット内のFab‐Fc‐VH非対称構造を有するBCMA×CD3二重抗体分子(PR002929)とFab‐Fc‐VH(2)非対称構造を有するBCMA×CD3二重抗体分子(PR003178)の単用量の薬物動態学特性を研究した。
本実施例は、マウスまたはラット内のFab‐Fc‐VH非対称構造を有するBCMA×CD3二重抗体分子(PR002929)とFab‐Fc‐VH(2)非対称構造を有するBCMA×CD3二重抗体分子(PR003178)の単用量の薬物動態学特性を研究した。
実施方法は以下の通り：体重の適当な雌性BALB/cマウス6匹またはSDラット3匹を選択し、5mg/kgの用量で静脈注射により融合タンパク薬を投与する；投与前及び投与後0.25時間、5時間、24時間(1日)、2日目、4日目、7日目、10日目及び14日目に全血を採取し、全血を30分間静置して凝固させた後、4℃で2000rpmで5分間遠心分離した血清サンプルを-80℃で分析まで凍結保存した。本実施例は2つの方法を用いて血清中の薬物濃度を定量的に測定した。方法1、Fc端検出ELISA方法により血清中の抗体薬物濃度を定量的に測定する：すなわち、96ウェルプレートに包接されたヤギ抗ヒトFcポリクローナル抗体により血清中のヒトFc含有BCMA×CD3二重抗体分子を捕獲し、その後HRP標識ヤギ抗ヒトFc第2抗体を添加して検出する。方法2、BCMA端検出ELISA方法により血清中の抗体薬物濃度を定量的に測定する：すなわち、96ウェルプレートに包接されたBCMA組換えタンパク質(Human BCMA/TNFRSF 17 Protein His Tag、ACRO Biosystems、#BCA-H522y)により血清中の抗BCMAのVH端を含む完全BCMA×CD3二重抗体分子を捕獲し、その後HRP標識のヤギ抗ヒトFc第2抗体を添加して検出する。Phoenix WinNonlinソフトウェアバージョン8.2を使用して、非房室モデル(NCA)を選択して薬物動態学パラメータを分析した。
図63(A‐B)に示すように、二重抗体分子PR002929とPR003178は類似の薬物動態学がある：Fc端検出方法で、BALB/cマウス内のPR002929とPR003178の血清半減期t1/2値はそれぞれ約7日と9.6日である；BCMA末端検出方法で、マウス内のPR002929とPR003178の血清半減期t1/2値はそれぞれ約4日と4日であった。
図63(C)に示すように、それぞれFc端検出方法とBCMA端検出方法を用い、ラット体内のPR003178の血清半減期t1／2値はそれぞれ約5.6日と4.6日である。
表7‐34は、マウスまたはラット内のBCMA×CD3二重抗体分子の薬物動態学特性パラメータをまとめた。
実施例7.14. NCI-H929/ヒトPBMCマウスモデルにおける抗腫瘍薬効評価
BCMA×CD3双特異性抗体のインビボ抗腫瘍薬効を評価するために、6～8週間雌性NCGマウス用い、腫瘍細胞接種3日前、すべてのマウスに3×106人のPBMCを腹腔内注射(i.p.)し、次いで腫瘍細胞接種当日に各実験マウスに5×106NCI-H929細胞を皮下接種し、細胞をPBSとMatrigel(1：1)混合液(0.1ml/匹)に再懸濁した。腫瘍体積が90mm3に達したとき、マウスをランダムにグループ化し、各グループ6匹のマウスを用いた。グループ化後、特定濃度のPBSで希釈された抗体薬を特定の用量と頻度で静脈内注射(i.v.)で投与した。本実施例は多種の投与方案を採用した：1)10μg/マウスの用量群、単回投与；2)10μg/マウスと3μg/マウスの用量群、週1回合計2回(QW*2)で投与した。各試験はPBSを空白対照群とした。腫瘍体積及びマウス体重は、初回投与後3日目、7日目、10日目及び14日目に測定した。腫瘍サイズ計算式：腫瘍体積(mm3)＝0.5×(腫瘍長径×腫瘍短径2)。
図64(A‐B)に示すように、PR001990、PR002309、PR002313及び陽性対照2などの二重抗体分子の10μg/マウスの単回投与量群は、いずれも腫瘍の成長を抑制する薬効を示し、PR001990及びPR002309の薬効は同等用量の陽性対照2分子より顕著に優れている。各群のマウスの体重変化はいずれも正常範囲内であった。
図64(C‐D)に示すように、すべての二重抗体分子の異なる投与量群は、異なる程度の腫瘍成長抑制の薬効を示している。全体的に言えば、10μg/マウス群の薬効は3μg/マウス群の薬効より優れている；また、10μg/マウスのQW*2の投与量では、PR003177とPR003178の薬効は同用量の陽性対照2分子より優れていた；PR002895の3μg/マウス用量群の薬効は、陽性対照2分子の10μg/マウス用量群よりもやや優れていた。各群のマウスの体重変化はいずれも正常範囲内であった。
BCMA×CD3双特異性抗体のインビボ抗腫瘍薬効を評価するために、6～8週間雌性NCGマウス用い、腫瘍細胞接種3日前、すべてのマウスに3×106人のPBMCを腹腔内注射(i.p.)し、次いで腫瘍細胞接種当日に各実験マウスに5×106NCI-H929細胞を皮下接種し、細胞をPBSとMatrigel(1：1)混合液(0.1ml/匹)に再懸濁した。腫瘍体積が90mm3に達したとき、マウスをランダムにグループ化し、各グループ6匹のマウスを用いた。グループ化後、特定濃度のPBSで希釈された抗体薬を特定の用量と頻度で静脈内注射(i.v.)で投与した。本実施例は多種の投与方案を採用した：1)10μg/マウスの用量群、単回投与；2)10μg/マウスと3μg/マウスの用量群、週1回合計2回(QW*2)で投与した。各試験はPBSを空白対照群とした。腫瘍体積及びマウス体重は、初回投与後3日目、7日目、10日目及び14日目に測定した。腫瘍サイズ計算式：腫瘍体積(mm3)＝0.5×(腫瘍長径×腫瘍短径2)。
図64(A‐B)に示すように、PR001990、PR002309、PR002313及び陽性対照2などの二重抗体分子の10μg/マウスの単回投与量群は、いずれも腫瘍の成長を抑制する薬効を示し、PR001990及びPR002309の薬効は同等用量の陽性対照2分子より顕著に優れている。各群のマウスの体重変化はいずれも正常範囲内であった。
図64(C‐D)に示すように、すべての二重抗体分子の異なる投与量群は、異なる程度の腫瘍成長抑制の薬効を示している。全体的に言えば、10μg/マウス群の薬効は3μg/マウス群の薬効より優れている；また、10μg/マウスのQW*2の投与量では、PR003177とPR003178の薬効は同用量の陽性対照2分子より優れていた；PR002895の3μg/マウス用量群の薬効は、陽性対照2分子の10μg/マウス用量群よりもやや優れていた。各群のマウスの体重変化はいずれも正常範囲内であった。
実施例7.15. まとめ
本実施例は、抗CD3のIgG抗体の抗原結合ドメインFab(またはscFv形式)と抗BCMAのHCAb抗体の抗原結合ドメインVHを用いて、多種の非対称構造の抗BCMA×CD3の二重特異性抗体分子を構築した。HCAbに基づく二重特異性抗体分子構造の構築のフレキシビリティを示した。本実施例の二重抗体分子は、ヒトのBCMA及びヒトのT細胞と同時に結合することができ、またカニクイザルのBCMAとカニクイザルのT細胞を結合することができるので、カニクイザルを非霊長類毒理評価に利用することができ、この点は臨床開発にとって非常に重要である。一方、陽性対照2二重抗体分子は、このようなカニクイザルの標的と結合する性能はなかった。
本実施例は、一連のBCMA×CD3二重抗体分子を構築し、CD3結合ドメインの配列及び微細構造を調節することによってそのT細胞と結合する能力を変え、BCMA結合ドメインの配列とドメイン数を調節することによって、BCMAを発現する標的細胞と結合する能力を変え、さらに二重抗体分子のT細胞活性化と特異的な標的細胞殺傷能力を調節する。インビトロ標的細胞殺傷実験において、Fab‐FC‐VH(2)非対称構造を有する二重抗体分子PR002309、PR002895、PR002953及びPR003178の標的細胞殺傷EC50は、陽性対照2より優れている；また、PR002895、PR002953及びPR003178による複数種類のサイトカイン放出レベルは、陽性対照3よりも低かった。マウス体内の抗腫瘍薬効モデルにおいて、PR002309とPR003178の薬効は同等用量の陽性対照2分子より顕著に優れ；PR002895の低用量群の薬効は、陽性対照2分子の高用量群よりもやや優れていた。
特に、PR003178の標的細胞殺傷能力は陽性対照2より明らかに優れ、陽性対照3と同等である；しかし、PR003178は陽性対照3よりも低いサイトカイン放出レベルを有する。これは、PR003178は有効な腫瘍殺傷効率を維持しながら、サイトカイン放出レベルを制御してサイトカイン放出症候群のリスクを低減し、臨床的に有効性と安全性をよりよくバランスさせ、より良い薬物治療ウィンドウをもたらせる可能性があることを示している。
本実施例は、抗CD3のIgG抗体の抗原結合ドメインFab(またはscFv形式)と抗BCMAのHCAb抗体の抗原結合ドメインVHを用いて、多種の非対称構造の抗BCMA×CD3の二重特異性抗体分子を構築した。HCAbに基づく二重特異性抗体分子構造の構築のフレキシビリティを示した。本実施例の二重抗体分子は、ヒトのBCMA及びヒトのT細胞と同時に結合することができ、またカニクイザルのBCMAとカニクイザルのT細胞を結合することができるので、カニクイザルを非霊長類毒理評価に利用することができ、この点は臨床開発にとって非常に重要である。一方、陽性対照2二重抗体分子は、このようなカニクイザルの標的と結合する性能はなかった。
本実施例は、一連のBCMA×CD3二重抗体分子を構築し、CD3結合ドメインの配列及び微細構造を調節することによってそのT細胞と結合する能力を変え、BCMA結合ドメインの配列とドメイン数を調節することによって、BCMAを発現する標的細胞と結合する能力を変え、さらに二重抗体分子のT細胞活性化と特異的な標的細胞殺傷能力を調節する。インビトロ標的細胞殺傷実験において、Fab‐FC‐VH(2)非対称構造を有する二重抗体分子PR002309、PR002895、PR002953及びPR003178の標的細胞殺傷EC50は、陽性対照2より優れている；また、PR002895、PR002953及びPR003178による複数種類のサイトカイン放出レベルは、陽性対照3よりも低かった。マウス体内の抗腫瘍薬効モデルにおいて、PR002309とPR003178の薬効は同等用量の陽性対照2分子より顕著に優れ；PR002895の低用量群の薬効は、陽性対照2分子の高用量群よりもやや優れていた。
特に、PR003178の標的細胞殺傷能力は陽性対照2より明らかに優れ、陽性対照3と同等である；しかし、PR003178は陽性対照3よりも低いサイトカイン放出レベルを有する。これは、PR003178は有効な腫瘍殺傷効率を維持しながら、サイトカイン放出レベルを制御してサイトカイン放出症候群のリスクを低減し、臨床的に有効性と安全性をよりよくバランスさせ、より良い薬物治療ウィンドウをもたらせる可能性があることを示している。
Claims (19)
- 少なくとも2つのタンパク質機能領域を含有する結合タンパク質であって、
前記結合タンパク質がタンパク質機能領域A及びタンパク質機能領域Bを含み；前記タンパク質機能領域A及び前記タンパク質機能領域Bが異なる抗原または抗原エピトープを標的とし、そのなかで前記タンパク質機能領域AはFabまたはscFv構造であり、前記タンパク質機能領域BはVH構造であり、前記タンパク質機能領域A及びタンパク質機能領域Bの数はそれぞれ1つまたは複数であり；好ましく、前記結合タンパク質は対称構造または非対称構造であり、及び／または、前記結合タンパク質はさらにFcを含み、前記Fcの数は2つであり、それによって形成されたFc二量体は好ましくホモ二量体またはヘテロ二量体である、結合タンパク質。 - 請求項1に記載の結合タンパク質であって、
(I)前記結合タンパク質は対称構造であり、前記対称構造は左右対称のIgG類似構造であり、そのなかで前記タンパク質機能領域Aの数は2つであり、前記タンパク質機能領域Bの数は2つまたは4つであり；
好ましく、前記タンパク質機能領域Bの数は2つである場合、前記結合タンパク質は四価結合タンパク質であり、下記の構造を含み：(a)前記結合タンパク質はN末端からC末端まで順にタンパク質機能領域A、タンパク質機能領域B及びFcであり、そのなかで前記タンパク質機能領域Aと前記タンパク質機能領域Bは第一接続ペプチド(L1)によって接続され、前記タンパク質機能領域Bと前記Fcは第二接続ペプチド(L2)によって接続され；または、(b)前記結合タンパク質はN末端からC末端まで順にタンパク質機能領域B、タンパク質機能領域A及びFcであり、そのなかで前記タンパク質機能領域Bと前記タンパク質機能領域Aは接続ペプチドによって接続され、前記タンパク質機能領域Aと前記Fcはヒンジ領域によって接続され；または、(c)前記結合タンパク質はN末端からC末端まで順にタンパク質機能領域A、Fc及びタンパク質機能領域Bであり、そのなかで前記タンパク質機能領域AとFcはヒンジ領域によって接続され、前記Fcと前記タンパク質機能領域Bは接続ペプチドによって接続され；
前記タンパク質機能領域Bの数は4つである場合、前記結合タンパク質は六価結合タンパク質であり、下記の構造を含み：追加の2つのタンパク質機能領域Bはさらに前記(a)または(b)または(c)に記載の結合タンパク質のN末端またはC末端に接続され；好ましく前記(c)に記載の結合タンパク質のFcのC末端または元のタンパク質機能領域BのC末端に接続され、または前記(b)に記載の結合タンパク質の元のタンパク質機能領域Bとともにタンパク質機能領域AのN末端に接続され；
好ましく、前記結合タンパク質はさらにタンパク質機能領域Cを含み、前記タンパク質機能領域Cと前記タンパク質機能領域A、タンパク質機能領域Bが異なる抗原または抗原エピトープを標的とし、前記結合タンパク質は六価または八価の三重特異性結合タンパク質であり、下記の構造を含み：前記タンパク質機能領域Cが前記結合タンパク質のN末端またはC末端に接続され；好ましく前記タンパク質機能領域Cの数は2つであり、前記タンパク質機能領域Cが前記(c)に記載の結合タンパク質のC末端に接続され、または、前記(b)に記載の結合タンパク質のタンパク質機能領域Bと同じ、前記タンパク質機能領域AのN末端に接続され；または、
(II)前記結合タンパク質は非対称構造であり、前記非対称構造が左右非対称のIgG類似構造を呈し、そのなかで左アームはFabまたはscFv構造のタンパク質機能領域Aであり、右アームはVH構造のタンパク質機能領域Bであり、前記タンパク質機能領域A及び前記タンパク質機能領域Bがそれぞれ1つのFcと接続され；好ましく前記タンパク質機能領域Aの数は1つであり、前記タンパク質機能領域Bの数は1つまたは2つまたは3つであり；
好ましく、前記タンパク質機能領域Bの数は1つである場合、前記結合タンパク質は二価結合タンパク質であり、下記の構造を含み：前記タンパク質機能領域Aは(d)従来のFab構造、または(e)Fab(cross VH/VL)構造、または(f)Fab(cross Fd/LC)構造であり；前記タンパク質機能領域Bの数は2つである場合、前記結合タンパク質は三価結合タンパク質であり、下記の構造を含み：左アームの前記タンパク質機能領域Aは前記(d)または(e)または(f)であり、2つ目のタンパク質機能領域Bが左アームの前記タンパク質機能領域AのN末端またはC末端、または右アームの1つ目のタンパク質機能領域BのN末端、または前記FcのC末端に接続され、好ましく2つ目のタンパク質機能領域Bが右アームの1つ目のタンパク質機能領域BのN末端に接続され；前記タンパク質機能領域Bの数は3つである場合、前記結合タンパク質は四価結合タンパク質であり、具体に下記の構造を含み：左アームの前記タンパク質機能領域Aは前記(d)または(e)または(f)構造であり、3つ目のタンパク質機能領域Bはさらに左アームの前記タンパク質機能領域AのN末端またはC末端、または左アームの2つ目のタンパク質機能領域BのN末端またはC末端、または右アームの1つ目または2つ目のタンパク質機能領域BのN末端、または前記FcのC末端に接続され、好ましく2つ目のタンパク質機能領域Bが右アームの1つ目のタンパク質機能領域BのN末端に接続され、且つ3つ目のタンパク質機能領域Bが前記2つ目のタンパク質機能領域BのN末端に接続され；または、
前記タンパク質機能領域Bの数は1つである場合、前記結合タンパク質は二価結合タンパク質であり、下記の構造を含み：左アームの前記タンパク質機能領域Aは(g)scFv構造であり、前記scFvはVHの末端またはVLの末端によってFcと接続され；前記タンパク質機能領域Bの数は2つである場合、前記結合タンパク質は三価結合タンパク質であり、具体に下記の構造を含み：左アームの前記タンパク質機能領域Aは(g)であり、2つ目のタンパク質機能領域Bが左アームの前記タンパク質機能領域AのN末端、または右アームの1つ目のタンパク質機能領域BのN末端、または前記FcのC末端に接続され、好ましく2つ目のタンパク質機能領域Bが右アームの1つ目のタンパク質機能領域BのN末端に接続され；前記タンパク質機能領域Bの数は3つである場合、前記結合タンパク質は四価結合タンパク質であり、具体に下記の構造を含み：左アームの前記タンパク質機能領域Aは(g)であり、3つ目のタンパク質機能領域Bはさらに左アームの前記タンパク質機能領域AのN末端、または2つ目のタンパク質機能領域BのN末端またはC末端、または前記FcのC末端に接続され、好ましく2つ目のタンパク質機能領域Bが右アームの1つ目のタンパク質機能領域BのN末端に接続され、且つ3つ目のタンパク質機能領域Bが前記2つ目のタンパク質機能領域BのN末端に接続され；
好ましく、前記結合タンパク質はさらにタンパク質機能領域Cを含み、前記結合タンパク質は三価または多価の多特異性結合タンパク質であり、そのなかで、前記タンパク質機能領域Cと前記タンパク質機能領域A、タンパク質機能領域Bが異なる抗原または抗原エピトープを標的とし、前記タンパク質機能領域Cが前記結合タンパク質のN末端またはC末端に接続され；好ましく前記タンパク質機能領域Cが前記(d)、(e)、(f)または(g)に記載の結合タンパク質のタンパク質機能領域BのN末端に接続され；
より一層好ましく、前記結合タンパク質はさらにタンパク質機能領域Dを含み、前記結合タンパク質は四価または多価の多特異性結合タンパク質であり、具体に：前記タンパク質機能領域Dと前記タンパク質機能領域A、タンパク質機能領域B、タンパク質機能領域Cが異なる抗原または抗原エピトープを標的とし、前記タンパク質機能領域Dが前記結合タンパク質のN末端またはC末端に接続され；好ましく前記タンパク質機能領域Dが前記(d)、(e)、(f)または(g)に記載の結合タンパク質のタンパク質機能領域BのN末端に接続される、結合タンパク質。 - 請求項1または2に記載の結合タンパク質であって、
(A)前記結合タンパク質が四本のポリペプチド鎖を有し、そのなかで両本は同じの短鎖であり、他の両本は同じの長鎖であり、そのなかで、(1)前記短鎖はN末端からC末端まで順にVH_A-CH1を含み、前記長鎖はN末端からC末端まで順にVL_A-CL-L1-VH_B-L2-CH2-CH3を含み；または(2)前記短鎖はN末端からC末端まで順にVL_A-CLを含み、前記長鎖はN末端からC末端まで順にVH_A-CH1-L1-VH_B-L2-CH2-CH3を含み；または(3)前記短鎖はN末端からC末端まで順にVL_A-CLを含み、前記長鎖はN末端からC末端まで順にVH_B-L-VH_A-CH1-h-CH2-CH3を含み；または(4)前記短鎖はN末端からC末端まで順にVH_B-L-VL_A-CLを含み、前記長鎖はN末端からC末端まで順にVH_A-CH1-h-CH2-CH3を含み；または(5)前記短鎖はN末端からC末端まで順にVL_A-CLを含み、前記長鎖はN末端からC末端まで順にVH_A-CH1-h-CH2-CH3-L-VH_Bを含み；または(6)前記短鎖はN末端からC末端まで順にVL_A-CL-L-VH_Bを含み、前記長鎖はN末端からC末端まで順にVH_A-CH1-h-CH2-CH3を含み；または(7)前記短鎖はN末端からC末端まで順にVL_A-CLを含み、前記長鎖はN末端からC末端まで順にVH_A-CH1-h-CH2-CH3-L1-VH_B-L2-VH_Bを含み；または(8)前記短鎖はN末端からC末端まで順にVL_A-CLを含み、前記長鎖はN末端からC末端まで順にVH_A-CH1-h-CH2-CH3-L1-VH_B-L2-VH_Cを含み；または(9)前記短鎖はN末端からC末端まで順にVH_B-L1-VL_A-CLを含み、前記長鎖はN末端からC末端まで順にVH_B-L2-VH_A-CH1-h-CH2-CH3を含み；または(10)前記短鎖はN末端からC末端まで順にVH_B-L1-VL_A-CLを含み、前記長鎖はN末端からC末端まで順にVH_C-L2-VH_A-CH1-h-CH2-CH3を含み；そのなかで、前記L、L1及びL2は接続ペプチドであり、前記hはヒンジ領域または接続ペプチドであり、前記ヒンジ領域または接続ペプチドは例えば「-」、GSまたはSEQ ID NO: 495-519のアミノ酸配列に示し；または、
(B)前記結合タンパク質がポリペプチド鎖1、ポリペプチド鎖2及びポリペプチド鎖3の三種ポリペプチド鎖を有し、各種のポリペプチド鎖は一本であり、そのなかで、(11)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVL_A-CLを含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVH_A-CH1-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖3はN末端からC末端まで順にVH_B-h-CH2-CH3を含み；または(12)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVH_A-CLを含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVL_A-CH1-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖3はN末端からC末端まで順にVH_B-h-CH2-CH3を含み；または(13)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVH_A-CH1を含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVL_A-CL-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖3はN末端からC末端まで順にVH_B-h-CH2-CH3を含み；または(14)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVL_A-CLを含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVH_A-CH1-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖3はN末端からC末端まで順にVH_B-L-VH_B-h-CH2-CH3を含み；または(15)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVL_A-CLを含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVH_A-CH1-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖3はN末端からC末端まで順にVH_C-L-VH_B-h-CH2-CH3を含み；または(16)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVH_A-CLを含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVL_A-CH1-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖3はN末端からC末端まで順にVH_B-L-VH_B-h-CH2-CH3を含み；または(17)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVH_A-CLを含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVL_A-CH1-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖3はN末端からC末端まで順にVH_C-L-VH_B-h-CH2-CH3を含み；または(18)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVH_A-CH1を含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVL_A-CL-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖3はN末端からC末端まで順にVH_B-L-VH_B-h-CH2-CH3を含み；または(19)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVH_A-CH1を含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVL_A-CL-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖3はN末端からC末端まで順にVH_C-L-VH_B-h-CH2-CH3を含み；または(26)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVL_A-CLを含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVH_A-CH1-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖3はN末端からC末端まで順にVH_B-L1-VH_B-L2-VH_B-h-CH2-CH3を含み；または(27)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVL_A-CLを含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVH_A-CH1-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖3はN末端からC末端まで順にVH_D-L1-VH_C-L2-VH_B-h-CH2-CH3を含み；そのなかで、前記L、L1及びL2は接続ペプチドであり、前記hはヒンジ領域または接続ペプチドであり、前記ヒンジ領域または接続ペプチドは例えば「-」、GSまたはSEQ ID NO: 495-519のアミノ酸配列に示し；または、
(C)前記結合タンパク質がポリペプチド鎖1及びポリペプチド鎖2の両種のポリペプチド鎖を有し、各種のポリペプチド鎖は一本であり、そのなかで、(20)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVL_A-L-VH_A-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVH_B-h-CH2-CH3を含み；または(21)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVH_A-L-VL_A-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVH_B-h-CH2-CH3を含み；または(22)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVL_A-L1-VH_A-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVH_B-L2-VH_B-h-CH2-CH3を含み；または(23)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVH_A-L1-VL_A-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVH_B-L2-VH_B-h-CH2-CH3を含み；または(24)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVL_A-L1-VH_A-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVH_C-L2-VH_B-CH2-CH3を含み；または(25)前記ポリペプチド鎖1はN末端からC末端まで順にVH_A-L1-VL_A-h-CH2-CH3を含み、前記ポリペプチド鎖2はN末端からC末端まで順にVH_C-L2-VH_B-h-CH2-CH3を含み；そのなかで、前記L、L1及びL2は接続ペプチドであり、前記hはヒンジ領域または接続ペプチドであり、前記ヒンジ領域または接続ペプチドは例えば「-」、GSまたはSEQ ID NO: 495-519のアミノ酸配列に示す、結合タンパク質。 - 請求項1-3のいずれの一項に記載の結合タンパク質であって、
前記タンパク質機能領域Aまたは前記タンパク質機能領域BがPD-L1抗体、HER2抗体、B7H4抗体、CD3抗体、CTLA4抗体、4-1BB抗体またはBCMA抗体から選択される一種であり；好ましく、前記タンパク質機能領域AはPD-L1抗体、HER2抗体、B7H4抗体またはCD3抗体であり、前記タンパク質機能領域BはCTLA4抗体、4-1BB抗体またはBCMA抗体であり；
好ましく、前記タンパク質機能領域AはPD-L1抗体であり、前記タンパク質機能領域BはCTLA4抗体であり；または、前記タンパク質機能領域AはPD-L1抗体であり、前記タンパク質機能領域Bは4-1BB抗体であり；または、前記タンパク質機能領域AはHER2抗体であり、前記タンパク質機能領域BはCTLA4抗体であり；または、前記タンパク質機能領域AはB7H4抗体であり、前記タンパク質機能領域Bは4-1BB抗体であり；または、前記タンパク質機能領域AはCD3抗体であり、前記タンパク質機能領域BはBCMA抗体である、結合タンパク質。 - 請求項4に記載の結合タンパク質であって、
前記PD-L1抗体が軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 167、188及び211に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、62及び122に示すアミノ酸配列であり；または、その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 167、188及び211に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、69及び122に示すアミノ酸配列であり；好ましく、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 282に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 233に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 282に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 240に示すアミノ酸配列を含み；及び、
前記PD-L1抗体が軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 169、190及び213に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 16、64及び124に示すアミノ酸配列であり；好ましく、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 284に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 235に示すアミノ酸配列を含み；及び、
前記HER2抗体が軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 171、190及び215に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 19、67及び127に示すアミノ酸配列であり；または、その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 176、196及び220に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 23、74及び132に示すアミノ酸配列であり；好ましく、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 286に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 238に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 293に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 247に示すアミノ酸配列を含み；及び、
前記B7H4抗体が軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 180、191及び225に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 32、87及び143に示すアミノ酸配列であり；または、その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 177、191及び226に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 33、88及び144に示すアミノ酸配列であり；好ましく、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 298に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 261に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 299に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 262に示すアミノ酸配列を含み；及び、
前記CTLA4抗体が重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 17、65及び125に示すアミノ酸配列であり；好ましく、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 236に示すアミノ酸配列を含み；及び、
前記4-1BB抗体が軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 170、191及び214に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 18、66及び126に示すアミノ酸配列であり；または、その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 170、191及び214に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 18、71及び126に示すアミノ酸配列であり；好ましく、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 285に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 237に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 289に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 242に示すアミノ酸配列を含み；及び、
前記4-1BB抗体が重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 27、79及び137に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 28、80及び138に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 29、82及び138に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 28、89及び145に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 28、81及び139に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、83及び140に示すアミノ酸配列であり；好ましく、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 252に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 253に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 255に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 264に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 254に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 256に示すアミノ酸配列を含み；及び、
前記CD3抗体が軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 177、191及び221に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、84及び141に示すアミノ酸配列であり；または、その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 178、197及び222に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 31、85及び142に示すアミノ酸配列であり；または、その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 177、191及び223に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 31、86及び141に示すアミノ酸配列であり；または、その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 179、198及び224に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 31、85及び142に示すアミノ酸配列であり；好ましく、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 294に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 258に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 295に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 259に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 296に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 260に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 297に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 259に示すアミノ酸配列を含み；及び、
前記CD3抗体が軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 20、68及び128に示すアミノ酸配列であり；または、その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；好ましく、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 245に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 257に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 281に示すアミノ酸配列を含み；または、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 244に示すアミノ酸配列を含み；及び、
前記BCMA抗体が重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、75及び133に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 24、76及び134に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 25、77及び135に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、78及び136に示すアミノ酸配列であり；好ましく、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 248に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 249に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 250に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含み；及び、
前記BCMA抗体が重鎖可変領域を含み、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、90及び136に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 34、78及び146に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、78及び147に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、90及び147に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 36、90及び146に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、76及び147に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 34、78及び148に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、76及び136に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、90及び146に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 34、76及び136に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、76及び146に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 34、76及び146に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、90及び148に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、90及び136に示すアミノ酸配列であり；好ましく、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 265に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 266に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 267に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 268に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 269に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 270に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 271に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 272に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 273に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 274に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 275に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 276に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 277に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 278に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 279に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 280に示すアミノ酸配列を含む、結合タンパク質。 - 請求項1-4のいずれの一項に記載の結合タンパク質であって、
(A)前記結合タンパク質がタンパク質機能領域A及びタンパク質機能領域Bを含有し：
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 167、188及び211に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、69及び122に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 17、65及び125に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 167、188及び211に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、62及び122に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 17、65及び125に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 171、190及び215に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 19、67及び127に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 17、65及び125に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 176、196及び220に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 23、74及び132に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 17、65及び125に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 167、188及び211に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、69及び122に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 28、80及び138に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 167、188及び211に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、69及び122に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 27、79及び137に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 167、188及び211に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、69及び122に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 29、82及び138に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 180、191及び225に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 32、87及び143に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 28、80及び138に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 180、191及び225に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 32、87及び143に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 27、79及び137に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 180、191及び225に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 32、87及び143に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 28、89及び145に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 177、191及び226に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 33、88及び144に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 28、80及び138に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 177、191及び226に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 33、88及び144に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 28、81及び139に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 177、191及び226に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 33、88及び144に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、83及び140に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 20、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 24、76及び134に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 20、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、78及び136に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 20、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、75及び133に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、75及び133に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、78及び136に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、90及び136に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 36、90及び146に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、76及び147に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 34、78及び148に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、76及び136に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、90及び146に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 34、76及び136に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、76及び146に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 34、76及び146に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、90及び148に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、90及び136に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 34、78及び146に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、78及び147に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、90及び147に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 177、191及び221に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、84及び141に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、78及び136に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 178、197及び222に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 31、85及び142に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、78及び136に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 177、191及び223に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 31、86及び141に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、78及び136に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 179、198及び224に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 31、85及び142に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、78及び136に示すアミノ酸配列であり；または、
(B)前記結合タンパク質がタンパク質機能領域A、タンパク質機能領域B及びタンパク質機能領域Cを含有し：
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、75及び133に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Cが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 24、76及び134に示すアミノ酸配列であり；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 25、77及び135に示すアミノ酸配列であり；前記タンパク質機能領域Cが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、78及び136に示すアミノ酸配列である、結合タンパク質。 - 請求項1-6のいずれの一項に記載の結合タンパク質であって、
(A)前記結合タンパク質がタンパク質機能領域A及びタンパク質機能領域Bを含み：
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 282に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 240に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 236に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 282に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 233に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 236に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 286に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 238に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 236に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 293に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 247に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 236に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 282に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 240に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 253に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 282に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 240に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 252に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 282に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 240に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 255に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 298に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 261に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 253に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 298に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 261に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 252に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 298に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 261に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 264に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 299に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 262に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 253に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 299に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 262に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 254に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 299に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 262に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 256に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 245に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 249に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 245に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 245に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 248に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 257に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 248に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 257に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 281に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 265に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 269に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 270に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 271に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 272に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 273に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 274に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 275に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 276に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 277に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 278に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 279に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 280に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 266に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 267に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 268に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 244に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 249に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 244に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 294に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 258に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 295に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 259に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 296に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 260に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 297に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 259に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含み；または、
(B)前記結合タンパク質がタンパク質機能領域A、タンパク質機能領域B及びタンパク質機能領域Cを含有し：
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 257に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 248に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Cが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 249に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記タンパク質機能領域Aが軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み；その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 257に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Bが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 250に示すアミノ酸配列を含み；前記タンパク質機能領域Cが重鎖可変領域を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含む、結合タンパク質。 - 請求項1-7のいずれの一項に記載の結合タンパク質であって、
(1)前記結合タンパク質が両種のポリペプチド鎖を含み、そのなかで、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 371に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 372に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 371に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 373に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 362に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 363に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 364に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 365に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 364に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 366に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 369に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 370に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 394に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 395に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 363に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 310に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 363に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 396に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 363に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 362に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 363に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 394に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 363に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 395に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 368に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 378に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 379に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 380に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 381に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 382に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 383に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 385に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 388に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 389に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 374に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 375に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 386に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 387に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 401に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 402に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 305に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 403に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 402に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 409に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 359に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 404に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 405に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 315に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 359に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 406に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 376に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 377に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 397に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 398に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 399に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 400に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 402に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 401に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 402に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 403に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 405に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 404に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 405に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 406に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 371に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 486に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 460に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 461に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 462に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 487に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 488に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 360に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 455に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 360に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 456に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 360に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 457に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 360に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 458に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 360に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 459に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 419に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 412に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 419に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 414に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 440に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 428に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 441に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 428に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 442に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 428に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 443に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 428に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 487に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 520に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 521に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 371に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 522に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 360に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 523に示すアミノ酸配列を含み；または、
(2)前記結合タンパク質が3つのポリペプチド鎖を含み、そのなかで、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 407に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 390に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 353に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 408に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 392に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 391に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 390に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 393に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 392に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 391に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 434に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 391に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 435に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 393に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 436に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 351に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 393に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 437に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 438に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 434に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 438に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 435に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 439に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 436に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 367に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 439に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 437に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 361に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 481に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 482に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 361に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 481に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 483に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 361に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 481に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 484に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 361に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 481に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 485に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 411に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 412に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 411に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 414に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 415に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 416に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 410に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 415に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 416に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 412に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 415に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 416に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 414に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 417に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 418に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 412に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 417に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 418に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 414に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 423に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 426に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 423に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 427に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 423に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 428に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 423に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 429に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 444に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 449に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 450に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 449に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 444に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 445に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 444に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 446に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 450に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 445に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 450に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 446に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 444に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 447に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 444に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 448に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 450に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 447に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 450に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 448に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 445に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 446に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 463に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 464に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 465に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 466に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 467に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 468に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 469に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 470に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 471に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 472に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 473に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 474に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 475に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 476に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 477に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 478に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 479に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 454に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 480に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 423に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 430に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 423に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 431に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 423に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 432に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み；第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 423に示すアミノ酸配列を含み；第三ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 433に示すアミノ酸配列を含む、結合タンパク質。 - 請求項1-8のいずれの一項に記載の結合タンパク質であって、
さらに軽鎖定常領域を含み、前記軽鎖定常領域は好ましくヒト軽鎖定常領域であり、より好ましくはヒト軽鎖定常領域CκまたはCλであり；前記の結合タンパク質はさらに重鎖定常領域のCH1、CH2及び／またはCH3を含み、前記重鎖定常領域は好ましくヒト重鎖定常領域であり、より好ましくはヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4重鎖定常領域であり；前記IgG1重鎖定常領域のFcにはさらにC220S、N297A、L234A、L235A、P329G、S239D、I332E、S354C、T366W 、Y349C、T366S、L368A、Y407V、M252Y、S254T、T256Eなどの突然変異における一種または多種を有し、前記突然変異部位についてはEU番号規則を使用する、結合タンパク質。 - 請求項1-9のいずれの一項に記載の結合タンパク質をコードする、単離の核酸。
- 請求項10に記載の単離の核酸を含む、発現ベクター。
- 請求項11に記載の発現ベクターを含み、
原核細胞または真核細胞である、ホスト細胞。 - 請求項1-9のいずれの一項に記載の結合タンパク質の作製方法であって、
前記作製方法が下記の段階を含み：前記のようなホスト細胞を培養し、培養物から前記結合タンパク質を獲得する、結合タンパク質の作製方法。 - 請求項1-9のいずれの一項に記載の結合タンパク質を含む、薬物組成物。
- 薬カセット一及び薬カセット二を含み、前記薬カセット一が請求項1-9のいずれの一項に記載の結合タンパク質または請求項14に記載の薬物組成物を含み、前記薬カセット二が癌を治療する他の抗体または薬物組成物を含む、薬キット。
- 請求項1-9のいずれの一項に記載の結合タンパク質または請求項14に記載の薬物組成物の癌を治療及び／または予防する薬物の作製における用途であって、
好ましく、前記癌は好ましく乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、腎癌、メラノーマ、肺癌、胃癌、肝臓癌、食道癌、子宮頸癌、頭頸部腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、膀胱癌、肉腫、結腸直腸癌、リンパ腫または多発性骨髄腫などである、用途。 - 必要な被験者に請求項1-9のいずれの一項に記載の結合タンパク質、または請求項14に記載の薬物組成物、または請求項15に記載の薬キットに投与し；
好ましく、癌を治療する他の抗体、例えば免疫チェックポイント抗体及び／または化学療法薬物を投与することをさらに含む、癌を治療する方法。 - 軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 177、191及び221に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、84及び141に示すアミノ酸配列であり；または、
その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 178、197及び222に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 31、85及び142に示すアミノ酸配列であり；または、
その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 177、191及び223に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 31、86及び141に示すアミノ酸配列であり；または、
その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 179、198及び224に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 31、85及び142に示すアミノ酸配列であり；または、
その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 20、68及び128に示すアミノ酸配列であり；または、
その軽鎖可変領域VLがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 172、192及び216に示すアミノ酸配列であり；その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 30、68及び128に示すアミノ酸配列であり；
好ましく、その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 294に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 258に示すアミノ酸配列を含み；または、
その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 295に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 259に示すアミノ酸配列を含み；または、
その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 296に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 260に示すアミノ酸配列を含み；または、
その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 297に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 259に示すアミノ酸配列を含み；または、
その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 245に示すアミノ酸配列を含み；または、
その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 257に示すアミノ酸配列を含み；または、
その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 263に示すアミノ酸配列を含み；または、
その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 281に示すアミノ酸配列を含み；または、
その軽鎖可変領域VLがSEQ ID NO: 291に示すアミノ酸配列を含み；その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 244に示すアミノ酸配列を含み；
より好ましく、前記CD3抗体が両種のポリペプチド鎖を含み；そのなかで、第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み、第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 313に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み、第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 325に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み、第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 328に示すアミノ酸配列を含み；または、
第一ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 357に示すアミノ酸配列を含み、第二ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 346に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記CD3抗体が1つのポリペプチド鎖を含み、前記ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 489に示すアミノ酸配列、SEQ ID NO: 490に示すアミノ酸配列、SEQ ID NO: 491に示すアミノ酸配列、SEQ ID NO: 492に示すアミノ酸配列、または、SEQ ID NO: 493に示すアミノ酸配列を含む、CD3抗体。 - 重鎖可変領域を含み、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 15、75及び133に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 24、76及び134に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 25、77及び135に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、78及び136に示すアミノ酸配列であり；または、
重鎖可変領域を含み、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 26、90及び136に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 34、78及び146に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、78及び147に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、90及び147に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 36、90及び146に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、76及び147に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 34、78及び148に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、76及び136に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、90及び146に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 34、76及び136に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、76及び146に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 34、76及び146に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、90及び148に示すアミノ酸配列であり；または、その重鎖可変領域VHがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、それぞれSEQ ID NO: 35、90及び136に示すアミノ酸配列であり；
好ましく、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 248に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 249に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 250に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 251に示すアミノ酸配列を含み；または、
その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 265に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 266に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 267に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 268に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 269に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 270に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 271に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 272に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 273に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 274に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 275に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 276に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 277に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 278に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 279に示すアミノ酸配列を含み；または、その重鎖可変領域VHがSEQ ID NO: 280に示すアミノ酸配列を含み；
より好ましく、前記BCMA抗体が1つのポリペプチド鎖を含み、前記ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 316に示すアミノ酸配列、SEQ ID NO: 317に示すアミノ酸配列、SEQ ID NO: 318に示すアミノ酸配列、または、SEQ ID NO: 319に示すアミノ酸配列を含み；または、
前記BCMA抗体が1つのポリペプチド鎖を含み、前記ポリペプチド鎖は、SEQ ID NO: 330に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 331に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 332に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 333に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 334に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 335に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 336に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 337に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 338に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 339に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 340に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 341に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 342に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 343に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 344に示すアミノ酸配列；または、SEQ ID NO: 345に示すアミノ酸配列を含む、BCMA抗体。
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