TWI792371B - 一種4-1bb結合蛋白及其應用 - Google Patents

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Abstract

本發明公開了一種4-1BB結合蛋白及其應用。所述4-1BB結合蛋白，其包括重鏈可變區；所述的重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述的HCDR1包含如SEQ ID NO: 15或其變異體1、或者SEQ ID NO: 16所示的序列，所述的HCDR2包含選自如SEQ ID NO: 60或其變異體2、或者SEQ ID NO: 50或其變異體4所示的序列，所述的HCDR3包含如SEQ ID NO: 103或其變異體3、SEQ ID NO: 333或其變異體5、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 326、SEQ ID NO: 331、SEQ ID NO: 334或者SEQ ID NO: 96所示的序列。本發明的4-1BB結合蛋白為全人源抗體，其具有與人4-1BB和食蟹猴4-1BB結合的活性，部分4-1BB結合蛋白的大小只有傳統IgG抗體的一半，可很好地用於雙特異性抗體。

Description

一種4-1BB結合蛋白及其應用
本申請主張申請日為2020/6/30的中國專利申請202010619500.9的優先權。本申請引用上述中國專利申請的全文。
本申請涉及生物醫藥領域，具體的涉及一種4-1BB結合蛋白及其應用。
4-1BB，也稱為CD137、腫瘤壞死因數受體超家族成員9 (TNFRSF9)，是一種活化誘導型的共刺激受體分子。4-1BB主要在淋巴細胞株上表現，如活化的T細胞，活化的自然殺手(NK)細胞，活化的胸腺細胞以及皮內淋巴細胞。此外，4-1BB也在樹突細胞，單核細胞、嗜中性顆粒細胞以及嗜酸性細胞上表現。T細胞的活化除了需要T細胞表面的抗原辨識受體(TCR)與MHC分子抗原胜肽的特異性結合之外，還需要抗原呈現細胞(APC)表面的共刺激分子與T細胞表面相應受體結合所提供的共刺激信號。4-1BB和其配體4-1BBL的結合能提供共刺激信號活化T細胞，加強細胞激素和免疫功能。4-1BB也被證明可以促進中樞記憶T細胞反應，這點可能支持4-1BB促效劑治療的患者對腫瘤特異性T細胞的治療持久性和對力竭的抵抗[1,2] 。腫瘤上過度表現抗4-1BB單鏈抗體片段(scFv)導致CD4+T細胞和NK細胞依賴的腫瘤清除消除[3,4,5] 。小鼠模型全身性注射抗4-1BB抗體也被證明可導致腫瘤生長的延遲[6] 。
有研究證明，活化性4-1BB抗體可以代替其配體活化4-1BB下游途徑。目前，臨床上正在研究的活化性4-1BB抗體有Urelumab (BMS-663513)和Utomilumab (PF-05082566)。Utomilumab是一種配體阻斷的IgG2抗體，Urelumab是一種非配體阻斷的IgG4抗體。Utomilumab和Urelumab在體內體外都能增強T細胞功能，促進抗腫瘤作用。但是臨床試驗表明，在Urelumab使用劑量大於1 mg/kg時，部分患者出現肺炎毒性(參見NCT00309023，NCT00612664，NCT01471210)。相比Urelumab，Utomilumab的安全性較高，但是活化4-1BB的活性較低。因此，急需研發更加安全有效的標靶4-1BB的新型療法。
為解決現有技術中缺乏抗腫瘤療效，並解決安全性等技術問題，本發明提供一種標靶4-1BB的全人源抗體，以及基於該抗體和腫瘤特異性標的的雙特異性抗體及其應用。本申請提供了一種抗4-1BB抗原結合蛋白，其具有下述性質中的一種或多種：1)能夠結合源自人和猴的4-1BB蛋白；2)能夠刺激免疫細胞分泌IFN-γ，IL2和/或TNFα；3)能夠抑制腫瘤生長和/或腫瘤細胞增殖；4)能夠活化4-1BB信號途徑。本申請還提供了所述抗原結合蛋白在預防和治療腫瘤中的應用。
發明概要
本發明本發明所要解決的技術問題是為克服現有技術中抗體藥物缺乏抗腫瘤療效，以及安全性欠佳等缺陷，提供一種標靶4-1BB結合蛋白及其應用，特別是標靶4-1BB的全人源抗體，以及基於該抗體和腫瘤特異性標的的雙特異性抗體及其應用。
本發明的第一方面提供一種4-1BB結合蛋白，其包括重鏈可變區；所述的重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述的HCDR1包含如SEQ ID NO: 15或其變異體1、或者SEQ ID NO: 16所示的序列，所述的HCDR2包含選自如SEQ ID NO: 60或其變異體2、或者SEQ ID NO: 50或其變異體4所示的序列，所述的HCDR3包含如SEQ ID NO: 103或其變異體3、SEQ ID NO: 333或其變異體5、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 326、SEQ ID NO: 331、SEQ ID NO: 334或者SEQ ID NO: 96所示的序列； 其中： 所述的變異體1的突變包括T3I、S6N/G/R以及Y7F中的一個或多個；較佳地，所述變異體1的序列優選如序列表中SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 300或者SEQ ID NO: 24所示； 所述變異體2的突變包括S1G/N/D、G2S/A、S3D、G5D/N/F/S/V以及S6T/N/D中的一個或多個；所述變異體2的序列優選如序列表中SEQ ID NO: 57-59、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 308-317以及SEQ ID NO: 63-71中的任一個序列所示； 所述的變異體3的突變包括G2R/D/A/K、S3A/T、S4G/N/A/T/H、E5T/V/M/G、T6A、D7G/S、H9Y/S/N、Y10H、Y11F、N12G/D以及V13I/M/T中的一個或多個；所述變異體3的胺基酸序列優選如序列表中SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 104-106、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109以及SEQ ID NO: 112-115中的任一個序列所示； 所述變異體4的突變包括N1I或者N1Q；所述變異體4的胺基酸序列優選如序列表中SEQ ID NO: 53或54所示； 所述變異體5的突變包括E4A/P和/或N13Y；所述變異體5的胺基酸序列優選如序列表中SEQ ID NO: 327-330所示； 所述變異體1、變異體2、變異體3、變異體5以及變異體4至少包含突變前序列的功能。
較佳地，如上所述HCDR1、HCDR2和HCDR3包含分別如序列表中SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 50和SEQ ID NO: 96所示，或者分別如SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 53和SEQ ID NO: 96所示，或者分別如SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 54和SEQ ID NO: 96所示，或者分別如SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 57和SEQ ID NO: 101所示，或者分別如SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 58和SEQ ID NO: 102所示，或者分別如SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 59和SEQ ID NO: 103所示，或者分別如SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 60和SEQ ID NO: 104所示，或者分別如SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 61和SEQ ID NO: 105所示，或者分別如SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 60和SEQ ID NO: 106所示，或者分別如SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 63和SEQ ID NO: 108所示，或者分別如SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 60和SEQ ID NO: 108所示，或者分別如SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 64和SEQ ID NO: 109所示，或者分別如SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 60和SEQ ID NO: 110所示，或者分別如SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 65和SEQ ID NO: 111所示，或者分別如SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 66和SEQ ID NO: 112所示，或者分別如SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 49和SEQ ID NO: 113所示，或者分別如SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 60和SEQ ID NO: 103所示，或者分別如SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 63和SEQ ID NO: 104所示，或者分別如SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 60和SEQ ID NO: 114所示，或者分別如SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 67和SEQ ID NO: 105所示，或者分別如SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 68和SEQ ID NO: 103所示，或者分別如SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 60和SEQ ID NO: 105所示，或者分別如SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 69和SEQ ID NO: 115所示，或者分別如SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 70和SEQ ID NO: 116所示，或者分別如SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 71和SEQ ID NO: 115所示的序列，或者分別如SEQ ID NO: 300、SEQ ID NO: 308和SEQ ID NO: 326所示的序列，或者分別如SEQ ID NO: 300、SEQ ID NO: 309和SEQ ID NO: 327所示的序列，或者分別如SEQ ID NO: 300、SEQ ID NO: 310和SEQ ID NO: 328所示的序列，或者分別如SEQ ID NO: 300、SEQ ID NO: 308和SEQ ID NO: 329所示的序列，或者分別如SEQ ID NO: 300、SEQ ID NO: 311和SEQ ID NO: 330所示的序列，或者分別如SEQ ID NO: 300、SEQ ID NO: 312和SEQ ID NO: 331所示的序列，或者分別如SEQ ID NO: 300、SEQ ID NO: 308和SEQ ID NO: 332所示的序列，或者分別如SEQ ID NO: 300、SEQ ID NO: 313和SEQ ID NO: 330所示的序列，或者分別如SEQ ID NO: 300、SEQ ID NO: 314和SEQ ID NO: 329所示的序列，或者分別如SEQ ID NO: 300、SEQ ID NO: 315和SEQ ID NO: 331所示的序列，或者分別如SEQ ID NO: 300、SEQ ID NO: 314和SEQ ID NO: 327所示的序列，或者分別如SEQ ID NO: 300、SEQ ID NO: 316和SEQ ID NO: 331所示的序列，或者分別如SEQ ID NO: 300、SEQ ID NO: 308和SEQ ID NO: 333所示的序列，或者分別如SEQ ID NO: 300、SEQ ID NO: 317和SEQ ID NO: 334所示的序列。見下表a。 表a
抗體編號 HCDR1 SEQ ID NOs: HCDR1 序列 HCDR2 SEQ ID NOs: HCDR2序列 HCDR3 SEQ ID NOs: HCDR3 序列
PR000197 16 GGSFSGY 50 NHSGS 96 LTGPFDY
PR000447 16 GGSFSGY 53 IHSGS 96 LTGPFDY
PR000448 16 GGSFSGY 54 QHSGS 96 LTGPFDY
PR000980 16 GGSFSGY 54 QHSGS 96 LTGPFDY
PR001758 19 GFTFSRY 57 SGSGDD 101 EKAGTTGDYYYNVDV
PR001759 15 GFTFSSY 58 GGSGGD 102 EGSNGTDDNYYDVDV
PR001760 20 GFTFSNY 59 SGSGVS 103 EGSSETDDHYYNVDV
PR001763 20 GFTFSNY 60 SGSGGS 104 EGSNGTDDYHYDIDV
PR001764 15 GFTFSSY 61 SGGGGS 105 EGTTETDDYHYNMDV
PR001766 15 GFTFSSY 60 SGSGGS 106 EKTGTTGDYYYDMDV
PR001768 20 GFTFSNY 63 SGSGDS 108 EGTGTTSDYYYNVDV
PR001771 20 GFTFSNY 60 SGSGGS 108 EGTGTTSDYYYNVDV
PR001774 22 GFTFSSF 64 SGSGDT 109 EATAMASDYYYGVDV
PR001775 15 GFTFSSY 60 SGSGGS 110 ERAYDYSNYVDFDY
PR001776 15 GFTFSSY 65 SSSGGS 111 DGVTTPSYYYYYDMDV
PR001780 22 GFTFSSF 66 SGSGDN 112 EDTAVASDYYYNIDV
PR001781 15 GFTFSSY 49 SGSGGN 113 ERTGTTGDYYYNVDV
PR001830 20 GFTFSNY 60 SGSGGS 103 EGSSETDDHYYNVDV
PR001831 15 GFTFSSY 63 SGSGDS 104 EGSNGTDDYHYDIDV
PR001833 15 GFTFSSY 60 SGSGGS 114 EGATETDDYHFNTDV
PR001834 23 GFTFSGY 67 SGSGNN 105 EGTTETDDYHYNMDV
PR001836 24 GFIFSNF 68 NGSGFN 103 EGSSETDDHYYNVDV
PR001837 15 GFTFSSY 60 SGSGGS 105 EGTTETDDYHYNMDV
PR001838 20 GFTFSNY 69 DGSGGD 115 EGSHGTDDSHYDVDV
PR001840 15 GFTFSSY 70 NSDGSS 116 KGSSSYYHYSIEDD
PR004469 20 GFTFSNY 71 DASGGD 115 EGSHGTDDSHYDVDV
PR007286 300 GFTFSDY 308 SSSGST 326 VKPVAGTWDWFDP
PR007287 300 GFTFSDY 309 SSSGSI 327 EREAVAGTLDFDN
PR007288 300 GFTFSDY 310 SGSGSI 328 EREAVAGTLDFDY
PR007289 300 GFTFSDY 308 SSSGST 329 EREPVAGTLDFDN
PR007290 300 GFTFSDY 311 SSSGTT 330 EREEVAGTLDFDY
PR007291 300 GFTFSDY 312 SGNGST 331 VRPGGSGNYWDWFDP
PR007292 300 GFTFSDY 308 SSSGST 332 EREEVAGTLDYDN
PR007293 300 GFTFSDY 313 NSSGST 330 EREEVAGTLDFDY
PR007294 300 GFTFSDY 314 SGSGTT 329 EREPVAGTLDFDN
PR007295 300 GFTFSDY 315 SNNGST 331 VRPGGSGNYWDWFDP
PR007296 300 GFTFSDY 314 SGSGTT 327 EREAVAGTLDFDN
PR007297 300 GFTFSDY 316 SRSGST 331 VRPGGSGNYWDWFDP
PR007298 300 GFTFSDY 308 SSSGST 333 EREEVAGTLDFDN
PR007299 300 GFTFSDY 317 SSSGRT 334 EGRFF
PR007300 300 GFTFSDY 315 SNNGST 331 VRPGGSGNYWDWFDP
PR007381 20 GFTFSNY 71 DASGGD 115 EGSHGTDDSHYDVDV
編碼所述重鏈可變區的FR的基因較佳地來源於胚系V基因IGHV4-34、IGHV3-23、IGHV3-11或者IGHV3-74；其中：HFWR1優選包含如SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5-8、SEQ ID NO: 294-299以及SEQ ID NO: 10-13中任一個所示的胺基酸序列，HFWR2優選包含如SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 32-36、SEQ ID NO: 301-307以及SEQ ID NO: 38-46中任一個所示的胺基酸序列，HFWR3優選包含如SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 79-83、SEQ ID NO: 318-325以及SEQ ID NO: 85-92中任一個所示的胺基酸序列，HFWR4優選包含如SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 335、SEQ ID NO: 336或者SEQ ID NO: 123所示的胺基酸序列。較佳地，所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 3所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 27所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 74所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 118所示，所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 5所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 32所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 79所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 119所示，所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 6所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 33所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 80所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 119所示，或者所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 7所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 32所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 81所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 119所示，所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 8所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 34所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 82所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 119所示，所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 6所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 35所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 83所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 119所示，所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 6所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 36所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 80所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 119所示，所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 6所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 38所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 80所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 119所示，所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 6所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 39所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 80所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 119所示，所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 1所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 40所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 85所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 119所示，所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 10所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 41所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 86所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 118所示，所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 6所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 35所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 80所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 119所示，所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 11所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 42所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 87所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 119所示，所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 5所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 32所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 80所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 119所示，所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 8所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 34所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 88所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 119所示，所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 12所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 34所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 89所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 123所示，所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 6所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 34所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 88所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 119所示，所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 6所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 43所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 90所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 119所示，所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 6所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 44所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 91所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 119所示，所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 13所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 34所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 90所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 119所示，所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 6所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 45所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 80所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 119所示，或者所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 1所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 46所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 92所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 118所示，或者所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 294所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 301所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 318所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 335所示，或者所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 295所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 302所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 319所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 118所示，或者所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 294所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 302所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 320所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 118所示，或者所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 294所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 302所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 321所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 335所示，或者所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 296所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 302所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 322所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 335所示，或者所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 297所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 303所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 318所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 335所示，或者所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 294所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 301所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 322所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 118所示，或者所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 294所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 302所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 323所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 118所示，或者所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 298所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 302所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 322所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 118所示，或者所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 294所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 301所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 318所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 120所示，或者所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 298所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 302所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 322所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 335所示，或者所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 294所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 301所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 318所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 118所示，或者所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 294所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 304所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 324所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 118所示，或者所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 294所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 305所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 325所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 336所示，或者所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 299所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 306所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 318所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 335所示，或者所述HFWR1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 6所示、所述HFWR2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 307所示、所述HFWR3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 80所示且所述HFWR4的胺基酸序列如SEQ ID NO: 119所示。詳見下表b。 表b
抗體編號 HFWR1 SEQ ID NOs: HFWR2 SEQ ID NOs: HFWR3 SEQ ID NOs: HFWR4 SEQ ID NOs:
PR000197 3 27 74 118
PR000447 3 27 74 118
PR000448 3 27 74 118
PR000980 3 27 74 118
PR001758 5 32 79 119
PR001759 6 33 80 119
PR001760 7 32 81 119
PR001763 8 34 82 119
PR001764 6 35 83 119
PR001766 6 36 80 119
PR001768 6 38 80 119
PR001771 6 39 80 119
PR001774 1 40 85 119
PR001775 10 41 86 118
PR001776 6 35 80 119
PR001780 11 42 87 119
PR001781 5 32 80 119
PR001830 8 34 88 119
PR001831 12 34 89 123
PR001833 6 34 88 119
PR001834 6 43 90 119
PR001836 6 44 91 119
PR001837 13 34 90 119
PR001838 6 45 80 119
PR001840 1 46 92 118
PR004469 6 45 80 119
PR007286 294 301 318 335
PR007287 295 302 319 118
PR007288 294 302 320 118
PR007289 294 302 321 335
PR007290 296 302 322 335
PR007291 297 303 318 335
PR007292 294 301 322 118
PR007293 294 302 323 118
PR007294 298 302 322 118
PR007295 294 301 318 120
PR007296 298 302 322 335
PR007297 294 301 318 118
PR007298 294 304 324 118
PR007299 294 305 325 336
PR007300 299 306 318 335
PR007381 6 307 80 119
本發明中，所述的重鏈可變區較佳地包含如序列表中SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 172、SEQ ID NO: 175-180、SEQ ID NO: 182-196、SEQ ID NO: 337-352以及SEQ ID NO: 198中的任一個所示的胺基酸序列。
基於如上所述，本發明中所述的4-1BB結合蛋白還含有輕鏈可變區，所述的輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述的LCDR1包含如SEQ ID NO: 133所示的序列，所述的LCDR2包含如SEQ ID NO: 145所示的序列，所述的LCDR3包含如SEQ ID NO: 158所示的序列。較佳地，編碼所述輕鏈可變區的FR的基因來源於胚系V基因IGKV3-15；其中：LFWR1優選包含如SEQ ID NO: 126或者SEQ ID NO: 128所示的胺基酸序列，LFWR2優選包含如SEQ ID NO: 140所示的胺基酸序列，LFWR3優選包含如SEQ ID NO: 151所示的胺基酸序列，LFWR4優選包含如SEQ ID NO: 164所示的胺基酸序列；更佳地，所述的輕鏈可變區包含如序列表中SEQ ID NO: 201所示的序列或其變異體，所述的變異體基於如SEQ ID NO: 201所示的序列發生一個或者多個胺基酸殘基突變；突變後所得輕鏈可變區的序列優選如SEQ ID NO: 204所示。
在本發明一具體實施方案中，所述的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO: 168所示，且所述的輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO: 201所示；或者，所述的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO: 171所示，且所述的輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO: 204所示；或者，所述的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO: 172所示，且所述的輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO: 204所示。詳見下表c。 表c
抗體編號 VL VH
PR000197 201 168
PR000447 204 171
PR000448 204 172
PR000980 204 172
另外，本發明所述的4-1BB結合蛋白還可包含重鏈恆定區和/或輕鏈恆定區；較佳地，所述重鏈恆定區選自hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4或其變異體，所述輕鏈恆定區選自κ鏈或者λ鏈或其突變。
其中，所述hIgG1的變異體的突變優選L234A、L235A、E345R和P329G中的一個或多個，更優選E345R，或者L234A、L235A和E345R的組合，或者L234A、L235A和P329G的組合；所述hIgG4的變異體的突變優選S228P。
在本發明一較佳實施例中，所述的4-1BB結合蛋白的重鏈包含如序列表中SEQ ID NO: 209、SEQ ID NO: 212、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 216-222、SEQ ID NO: 224-238、SEQ ID NO: 353-368以及SEQ ID NO: 240中的任一個所示的序列，和/或其輕鏈包含如序列表中SEQ ID NO: 246或者SEQ ID NO: 243所示的序列。例如：所述重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO: 209所示，且所述輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO: 243所示；或者，所述重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO: 212所示，且所述輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO: 246所示；或者，所述重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO: 213所示，且所述輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO: 246所示；或者，所述重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO: 216所示，且所述輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO: 246所示。如下表d所示。 表d
抗體編號 輕鏈 重鏈
PR000197 243 209
PR000447 246 212
PR000448 246 213
PR000980 246 216
本發明中如上所述的4-1BB結合蛋白，其可為全長抗體、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、雙特異性抗體、多特異性抗體、重鏈抗體、單域抗體或單區抗體的形式，或為由上述抗體製得的單株抗體或多株抗體。
當所述4-1BB結合蛋白為全長抗體時，其重鏈包含如SEQ ID NO: 209所示的序列，且輕鏈包含如SEQ ID NO: 243所示的序列；或者包含如SEQ ID NO: 212所示的序列，且輕鏈包含如SEQ ID NO: 246所示的序列，或者包含如SEQ ID NO: 213所示的序列，且輕鏈包含如SEQ ID NO: 246所示的序列，或者包含SEQ ID NO: 216所示的序列，且輕鏈包含如SEQ ID NO: 246所示的序列。
本發明的第二方面提供一種雙特異性抗體，其包含第一蛋白功能區和第二蛋白功能區，所述的第一蛋白功能區為如上所述的4-1BB結合蛋白，所述的第二蛋白功能區標靶腫瘤抗原；較佳地為HER2抗體或者PD-L1抗體；其中，所述的HER2抗體優選trastuzumab或者pertuzumab，所述的PD-L1抗體優選atezolizumab或者PR000265，所述PR000265的重鏈如SEQ ID NO: 211所示，輕鏈如SEQ ID NO: 245所示。其中，所述PR000265的詳細資訊見申請CN201910944996.4。
具體來說，所述的第一蛋白功能區或者所述的第二蛋白功能區可為scFv、VHH、免疫球蛋白、Fab、Fab’、F(ab’)2或者重鏈可變區的形式；例如，所述的第一蛋白功能區為Fab，所述的第二蛋白功能區為VHH；或者，所述第一蛋白功能區為Fab，所述的第二蛋白功能區為免疫球蛋白；或者，所述的第一蛋白功能區為免疫球蛋白，所述的第二蛋白功能區為重鏈可變區。
較佳地，所述第一蛋白功能區和所述第二蛋白功能區之間和/或所述scFv的重鏈可變區和輕鏈可變區之間透過連接子連接，所述連接子的胺基酸序列為GS或者如序列表中SEQ ID NO: 273-293中任一個所示。
在本發明的具體實施方案中，所述的雙特異性抗體包含多肽鏈1和多肽鏈2，任選地還包含多肽鏈3；較佳地：
所述多肽鏈1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 244所示，且所述多肽鏈2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 251-265中任一個所示；或者所述多肽鏈1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 245所示，且所述多肽鏈2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 271所示；或者所述多肽鏈1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 249所示，且所述多肽鏈2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 272所示；或者所述多肽鏈1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 245所示，且所述多肽鏈2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 270所示；或者所述多肽鏈1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 245所示，且所述多肽鏈2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 269所示；或者所述多肽鏈1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 245所示，且所述多肽鏈2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 268所示；或者所述多肽鏈1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 245所示，且所述多肽鏈2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 369-382中任一個所示；或者所述多肽鏈1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 267所示，所述多肽鏈2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 266所示，且所述多肽鏈3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 246所示；或者所述多肽鏈1的胺基酸序列如SEQ ID NO: 250所示，且所述多肽鏈2的胺基酸序列如SEQ ID NO: 249所示，且所述多肽鏈3的胺基酸序列如SEQ ID NO: 246所示。
本發明的第三方面提供一種分離的核酸，其編碼如本發明第一方面所述的4-1BB結合蛋白或如本發明的第二方面所述的雙特異性抗體。
本發明的第四方面提供一種包含如第三方面所述的分離的核酸的表現載體。
本發明的第五方面提供一種宿主細胞，其包含本發明第四方面所述的表現載體；優選地，所述宿主細胞為原核細胞或真核細胞。其中，所述的真核細胞優選哺乳動物細胞。
本發明的第六方面提供一種4-1BB結合蛋白的製備方法，其包含培養如第五方面的宿主細胞，從培養物中獲得所述4-1BB結合蛋白。
本發明的第七方面提供一種嵌合抗原受體，其包含如本發明第一方面所述的4-1BB結合蛋白或如本發明的第二方面所述的雙特異性抗體。
本發明的第八方面提供一種抗體藥物偶聯物，其包含細胞毒性劑，以及如本發明第一方面所述的4-1BB結合蛋白或如本發明的第二方面所述的雙特異性抗體。
所述細胞毒劑優選細胞毒素、化學治療劑、放射性同位素、治療性核酸、免疫調節劑、抗血管生成劑、抗增殖促凋亡劑或細胞溶解酶。更優選地，所述細胞毒劑為微管蛋白合成酶抑制劑——甲基奧瑞他汀F(MMAF)，或者為甲基奧瑞他汀E(MMAE)。
所述的抗體藥物偶聯物的製備方法可為本領域常規，較佳地採用Doronina，2006，Bioconjugate Chem. 17,114-124所記載的製備方法。優選地，所述的製備方法產生具有最低限度的低偶聯級分(LCF)小於10%的抗體藥物偶聯物。
所述的抗體藥物偶聯物能夠以本領域所知的任何物理形態而存在，較佳地為澄清溶液。
本發明的第九方面提供一種藥物組成物，其包含如本發明第一方面所述的4-1BB結合蛋白、如本發明的第二方面所述的雙特異性抗體和/或如本發明第八方面所述的抗體藥物偶聯物，和藥學上可接受的載劑。
所述的藥物組成物較佳地還包括其他抗腫瘤抗體作為活性成分，和/或含有由激素製劑、標靶小分子製劑、蛋白酶體抑制劑、成像劑、診斷劑、化療劑、溶瘤藥物、細胞毒性劑、細胞激素、共刺激分子的活化劑、抑制性分子的抑制劑以及疫苗組成的群組中的一種或多種。
所述的藥學上可接受的載劑可為本領域常規的載劑，所述的載劑可以為任意合適的生理學或藥學上可接受的藥物輔料。所述的藥物輔料為本領域常規的藥物輔料，較佳地包括藥學上可接受的賦形劑、填充劑、穩定劑或稀釋劑等。更佳地，所述的藥物組成物包括0.01-99.99%的上述蛋白質和/或上述的抗體藥物偶聯物，和0.01-99.99%的藥用載劑，所述百分比為占所述藥物組成物的品質百分比。
較佳地，所述的藥物組成物是抗腫瘤的藥物。更佳地為治療胃癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、黑素瘤、腎癌、乳腺癌、結腸直腸癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、頭頸癌、支氣管癌、神經膠質瘤和/或白血病的藥物。
本發明所述的藥物組成物的給藥途徑較佳地為腸胃外施用、注射給藥或口服給藥。所述注射給藥較佳地包括靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、皮內注射或皮下注射等途徑。所述的藥物組成物為本領域常規的各種劑型，較佳地為固體、半固體或液體的形式，即可以為水溶液、非水溶液或混懸浮液，更佳的為片劑、膠囊、顆粒劑、注射劑或輸液劑等。更佳地為經由血管內、皮下、腹膜內或肌內施用。較佳地，所述藥物組成物還可以作為氣霧劑或粗噴霧劑施用，即經鼻施用；或者，鞘內、髓內或心室內施用。更佳地，所述的藥物組成物還可以透皮、經皮、局部、腸內、陰道內、舌下或經直腸施用。
本發明所述的藥物組成物的給藥劑量位準可以根據達到所需診斷或治療結果的組成物量而調整。施用方案也可以為單次注射或多次注射，或進行調整。所選擇的劑量位準和方案依賴於包括所述藥物組成物的活性和穩定性(即，半衰期)、製劑、施用途徑、與其他藥物或治療的組合、待檢測和/或治療的疾病或病症、以及待治療的受試者的健康狀況和先前醫療史等各種因素而進行合理地調整。
對於本發明的所述藥物組成物的治療有效劑量可以最初在細胞培養實驗或動物模型例如齧齒類動物、兔、犬、豬和/或靈長類動物中進行估計。動物模型也可以用於測定合適的施用濃度範圍和途徑。隨後可以用於確定在人中施用的有用劑量和途徑。一般地，施用有效量或劑量的確定和調整以及何時和如何進行此類調整的評估為本領域技術人員已知。
對於組合療法，上述4-1BB結合蛋白、上述抗體藥物偶聯物和/或另外的治療或診斷劑可以各自作為單一藥劑，在適合於執行預期治療或診斷的任何時間範圍內進行使用。因此，這些單一藥劑可以基本上同時(即作為單一制劑或在數分鐘或數小時內)或以按順序連續施用。例如，這些單一藥劑可以在一年內，或10、8、6、4或2個月內，或4、3、2、或1周內，或5、4、3、2或1天內施用。
關於製劑、劑量、施用方案和可測量的治療結果的另外指導，參見Berkow等人(2000) The Merck Manual of Medical Information(Merck醫學資訊手冊)和Merck&Co.Inc., Whitehouse Station, New Jersey; Ebadi (1998) CRC Desk Reference of Clinical Pharmacology(臨床藥理學手冊)等著作。
本發明的第十方面如第一方面所述的4-1BB結合蛋白、如本發明的第二方面所述的雙特異性抗體和如第七方面所述的藥物組成物在製備治療和/或預防癌症的藥物中的應用；所述癌症優選與HER2、PD-L1以及4-1BB中的一種或多種相關的癌症，如乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、胃癌、肝癌、食管癌、子宮頸癌、頭頸部腫瘤或者結直腸癌。
在一些方面，本公開提供與HER2、PD-L1以及4-1BB中的一種或多種相關的疾病的治療方法，所述方法包括向受試者施用藥物有效量的如前所述的4-1BB結合蛋白，或包含如前所述的藥物組成物，或如前所述的核酸分子，以治療與HER2、PD-L1以及4-1BB中的一種或多種相關的疾病，其中所述疾病優選為腫瘤或癌症。
其中，所述的腫瘤或者癌症即為本領域中常規的HER2、PD-L1以及4-1BB中的一種或多種表現異常的腫瘤或者癌症，例如：鱗狀細胞癌、骨髓瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、頭和頸鱗狀細胞癌(HNSCC)、神經膠質瘤、何傑金淋巴瘤、非何傑金淋巴瘤、彌漫性大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤、急性成淋巴細胞性白血病(ALL)、急性髓細胞樣白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、慢性髓細胞樣白血病(CML)、原發性縱隔大B-細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、富含T-細胞/組織細胞的大B-細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、髓樣細胞白血病-1蛋白(Mcl-1)、骨髓異常增生綜合征(MDS)、胃腸(道)癌、腎癌、卵巢癌、肝癌、成淋巴細胞性白血病、淋巴細胞白血病、結腸直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、前列腺癌、甲狀腺癌、黑素瘤、軟骨肉瘤、神經母細胞瘤、胰腺癌、多形性成膠質細胞瘤、胃癌、骨癌、尤因氏肉瘤、子宮頸癌、腦癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳腺癌、結腸癌、肝細胞癌(HCC)、透明細胞腎細胞癌(RCC)、頭和頸癌、咽喉癌、肝膽癌(hepatobiliary cancer)、中樞神經系統癌、食管癌、惡性胸膜間皮瘤、全身性輕鏈澱粉樣變性、淋巴漿細胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)、骨髓異常增生綜合征、骨髓增生性腫瘤、神經內分泌腫瘤、梅克爾細胞癌、睾丸癌和皮膚癌，最優選為PD-L1陽性的鱗狀細胞癌、骨髓瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、頭和頸鱗狀細胞癌(HNSCC)、神經膠質瘤、何傑金淋巴瘤、非何傑金淋巴瘤、彌漫性大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤、急性成淋巴細胞性白血病(ALL)、急性髓細胞樣白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、慢性髓細胞樣白血病(CML)、原發性縱隔大B-細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、富含T-細胞/組織細胞的大B-細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、髓樣細胞白血病-1蛋白(Mcl-1)、骨髓異常增生綜合征(MDS)、胃腸(道)癌、腎癌、卵巢癌、肝癌、成淋巴細胞性白血病、淋巴細胞白血病、結腸直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、前列腺癌、甲狀腺癌、黑素瘤、軟骨肉瘤、神經母細胞瘤、胰腺癌、多形性成膠質細胞瘤、胃癌、骨癌、尤因氏肉瘤、子宮頸癌、腦癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳腺癌、結腸癌、肝細胞癌(HCC)、透明細胞腎細胞癌(RCC)、頭和頸癌、咽喉癌、肝膽癌(hepatobiliary cancer)、中樞神經系統癌、食管癌、惡性胸膜間皮瘤、全身性輕鏈澱粉樣變性、淋巴漿細胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)、骨髓異常增生綜合征、骨髓增生性腫瘤、神經內分泌腫瘤、梅克爾細胞癌、睾丸癌和皮膚癌。
本發明的第十一方面提供套組，其包括如本發明第一方面所述的4-1BB結合蛋白、如本發明的第二方面所述的雙特異性抗體、如本發明第七方面所述的嵌合抗原受體、如本發明第八方面所述的抗體藥物偶聯物和/或如本發明第九方面所述的藥物組成物。
優選地，所述套組還包括(i)施用抗體或其抗原結合片段或抗體藥物偶聯物或藥物組成物的裝置；和/或(ii)使用說明。
本發明的第十二方面提供一種套裝藥盒，其包含藥盒A和藥盒B，其中：
所述藥盒A含有如本發明第一方面所述的4-1BB結合蛋白、如本發明的第二方面所述的雙特異性抗體、如本發明第七方面所述的嵌合抗原受體、如本發明第八方面所述的抗體藥物偶聯物和/或如本發明第九方面所述的藥物組成物；
所述藥盒B含有其他抗腫瘤抗體或者包含所述其他抗腫瘤抗體的藥物組成物，和/或由激素製劑、標靶小分子製劑、蛋白酶體抑制劑、成像劑、診斷劑、化療劑、溶瘤藥物、細胞毒性劑、細胞激素、共刺激分子的活化劑、抑制性分子的抑制劑以及疫苗組成的群組中的一種或多種。
為了解決上述技術問題，如本發明第一方面所述的4-1BB結合蛋白、如本發明的第二方面所述的雙特異性抗體、如本發明第七方面所述的嵌合抗原受體、本發明第八方面所述的抗體藥物偶聯物和/或如本發明第九方面所述的藥物組成物還可以與其他藥物進行聯合用藥，例如可以與激素製劑、標靶小分子製劑、蛋白酶體抑制劑、成像劑、診斷劑、化療劑、溶瘤藥物、細胞毒性劑、細胞激素、共刺激分子的活化劑、抑制性分子的抑制劑、疫苗等和/或其他抗腫瘤抗體(或者包含所述其他抗腫瘤抗體的藥物組成物)進行聯合用藥。
本發明的第十三方面提供一種診斷、治療和/或預防4-1BB媒介的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治療有效量的如本發明第一方面所述的4-1BB結合蛋白、如本發明的第二方面所述的雙特異性抗體、如本發明第七方面所述的嵌合抗原受體、如本發明第八方面所述的抗體藥物偶聯物或如本發明第九方面所述的藥物組成物，或者使用如本發明第十二方面所述的套裝藥盒治療有需要的患者。
較佳地，所述的疾病或病症為腫瘤，優選4-1BB陽性腫瘤，更優選胃癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、黑素瘤、腎癌、乳腺癌、結腸直腸癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、頭頸癌、支氣管癌、神經膠質瘤和/或白血病。
本發明的第十四方面提供一種免疫檢測或者測定4-1BB的方法，其包括使用如本發明第一方面所述的4-1BB結合蛋白、如本發明的第二方面所述的雙特異性抗體、如本發明第七方面所述的嵌合抗原受體、如本發明第八方面所述的抗體藥物偶聯物或如本發明第九方面所述的藥物組成物；優選地，所述檢測為非診斷和/或治療目的的。
本發明的第十五方面提供一種聯合療法，其包括分別向有需要的患者施用如本發明第一方面所述的4-1BB結合蛋白、如本發明的第二方面所述的雙特異性抗體、如本發明第七方面所述的嵌合抗原受體、如本發明第八方面所述的抗體藥物偶聯物或如本發明第九方面所述的藥物組成物，和第二治療劑；所述第二治療劑較佳地包含其他抗腫瘤抗體或者包含所述其他抗腫瘤抗體的藥物組成物，和/或由激素製劑、標靶小分子製劑、蛋白酶體抑制劑、成像劑、診斷劑、化療劑、溶瘤藥物、細胞毒性劑、細胞激素、共刺激分子的活化劑、抑制性分子的抑制劑以及疫苗組成的群組中的一種或多種。
在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
本發明所用試劑和原料均市售可得。
本發明的積極進步效果在於：
1. 本申請提供了一種抗4-1BB結合蛋白的全人源抗體，其具有至少一種下述性質1)本發明的抗4-1BB結合蛋白的全人源抗體包括一種全長抗體，和一種全新的僅含“重鏈”的全人抗體，具有與人4-1BB和食蟹猴4-1BB結合的活性；其中該4-1BB結合蛋白的重鏈抗體的大小只有傳統IgG抗體的一半，由於不含輕鏈的這一特點，使得該抗體可以用於雙特異性抗體，並解決了輕鏈錯配和異源二聚化的問題。能夠結合源自人和猴的4-1BB蛋白；2)結合表位與Urelumab不同；3)能夠活化4-1BB信號途徑，刺激免疫細胞分泌IFN-γ，IL2和/或TNFα，抑制腫瘤生長和/或腫瘤細胞增殖；活性顯著強於Utomilumab。
2. 本發明提供的PD-L1 × 4-1BB 雙特異性抗體，透過一個或者多個作用機制來提高抗腫瘤效果和安全性。第一，PD-L1 × 4-1BB雙抗可以透過阻斷PD-1/PD-L1信號途徑來活化T細胞。第二，高表現於腫瘤細胞表面的PD-L1分子可以利用雙抗分子促進T細胞表面的4-1BB分子的交聯和三聚化並活化下游信號傳導途徑，進而促進T細胞的活化和增殖，其活化T細胞的能力甚至優於Urelumab。第三，PD-L1 × 4-1BB雙抗對T細胞活化作用是特異性依賴 PD-L1的表現，雙抗分子媒介的T細胞活化僅限於腫瘤微環境內。相比於現有技術中依賴於交聯的抗4-1BB的HCAb單抗不能直接活化T細胞，本發明利用HCAb單抗建構的PD-L1 ×4-1BB 雙抗在高表現PD-L1的細胞存在時則可以特異性地活化T細胞，這樣可以避免類似Urelumab的單抗在正常組織中過度活化T細胞所帶來的毒副作用。第四，本實施例利用抗PD-L1的IgG抗體的抗原結合結構域Fab和抗4-1BB的HCAb抗體的抗原結合結構域VH，建構了多種結構的抗PD-L1 × 4-1BB的雙特異性抗體分子。展現出了基於HCAb建構雙特異性抗體分子結構的靈活性，透過不同的結構類型、相對位置、結合價數等參數來調節活化T細胞的功能活性。基於HCAb的雙抗結構，尤其是IgG-VH 四價對稱結構的雙抗分子和Fab-HCAb結構的雙抗分子，一方面保留了PD-L1端的活性，在MLR實驗中體現出比對應的抗PD-L1親代單抗更強的T細胞活化能力；另一方面標靶細胞上高表現的PD-L1分子可以媒介4-1BB的交聯和三聚化以傳遞T細胞活化信號，其活化T細胞的能力甚至優於Urelumab。而且IgG-VH 四價對稱結構和Fab-HCAb對稱結構的雙抗分子顯示出比FIT-Ig結構的雙抗分子擁有更強的T細胞活化能力。
3. 本發明提供的HER2 × 4-1BB 雙特異性抗體，透過一個或者多個作用機制來提高抗腫瘤效果和安全性。第一，HER2 × 4-1BB雙抗保留了原有的HER2抑制劑的作用機制(阻止HER2二聚化，促進HER2的內化和降解，抑制下游磷酸化信號)。第二，高表現於腫瘤細胞表面的HER2分子可以利用雙抗分子促進T細胞表面的4-1BB分子的交聯和三聚化並活化下游信號傳導途徑，進而促進T細胞的活化和增殖，其活化T細胞的能力甚至優於Urelumab。第三，HER2 × 4-1BB雙抗對T細胞活化作用是特異性依賴HER2的表現，雙抗分子媒介的T細胞活化僅限於腫瘤微環境內。不同於現有技術中依賴於交聯的抗4-1BB的HCAb單抗不能直接活化T細胞，本發明中利用HCAb單抗建構的HER2 × 4-1BB雙抗在高表現HER2的細胞存在時則可以特異地活化T細胞這樣可以避免類似Urelumab的單抗在正常組織中過度活化T細胞所帶來的毒副作用。第四，本實施例建構了IgG-VH和IgG-scFv兩種結構的抗HER2 × 4-1BB的雙特異性抗體分子，透過不同的結構類型、相對位置、結合價數等參數來調節活化T細胞的功能活性。同時展現出了基於HCAb建構雙特異性抗體分子結構的靈活性。
發明的詳細說明
以下具體定義了某些技術和科學術語。除顯而易見在本檔中的它處另有明確定義，否則本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本發明所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。
所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J. Biol. Chem , 243, p3558(1968)中所述。
術語“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈透過鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM，IgD，IgG，IgA和IgE，其相應的重鏈分別為µ鏈，δ鏈，γ鏈，α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其樞紐區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1，IgG2，IgG3，IgG4。輕鏈透過恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中第每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
抗體輕鏈抗體可進一步包含輕鏈恆定區，所述的輕鏈恆定區可包含人源的κ、λ鏈或其變異體。
抗體重鏈抗體可進一步包含重鏈恆定區，所述的重鏈恆定區可包含人源的IgG1, 2, 3, 4或其變異體。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的胺基酸的序列變化很大，為可變區(V區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區(C區)。輕重鏈可變區分別由110個左右胺基酸組成其中有些區域的胺基酸殘基變化較可變區其他部位更大，如輕鏈第24-34、50-56、89-97位和重鏈第31-35、50-65、95-102位。這些區域稱為高度變異區(hypervariable region，HVR)，由於高度變異區是抗體與抗原表位直接接觸的部位，因此又稱為互補決定區(complementarity-region，CDR)。可變區中的非高度變異區，其胺基酸組成與序列變化相對較少，這些胺基酸殘基組成可變區穩定的立體結構，即框架結構或支架結構(framework region，FR)。可變區包括3個高度變異區(HVR)和4個序列相對守恆的骨架區(FR)。每條輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1，LCDR2，和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1，HCDR2和HCDR3。本申請採用Chothia定義規則劃分。但是，本領域人員公知，在本領域中可以透過多種方法來定義抗體的CDR，例如基於序列可變性的Kabat定義規則(參見，Kabat等人，免疫學的蛋白質序列，第五版，美國國立衛生研究院，貝塞斯達，馬里蘭州(1991))和基於結構環區域位置的Chothia定義規則(參見JMol Biol 273:927-48,1997)。在本發明的技術方案中，還可以使用包含了Kabat定義和Chothia定義的Combined定義規則來確定可變結構域序列中的胺基酸殘基。其中Combined定義規則即是將Kabat定義和Chothia定義的範圍相結合。本領域技術人員應當理解的是，除非另有規定，否則術語給定抗體或其區(例如可變區)的“CDR”及“互補決定區”應瞭解為涵蓋如透過本發明描述的上述已知方案中的任何一種界定的互補決定區。雖然本發明中請求保護的範圍是基於Chothia定義規則所示出的序列，但是根據其他CDR的定義規則所對應的胺基酸序列也應當落在本發明的保護範圍中。
在本申請中，術語“全人源抗體”通常是指將人類編碼抗體的基因全部轉移至基因工程改造的抗體基因缺失動物中，使動物表現的抗體。抗體所有部分(包括抗體的可變區和恆定區)均由人類來源的基因所編碼。全人源抗體可以大大減少異源抗體對人體造成的免疫副反應。本領域獲得全人源抗體的方法可以有噬菌體展示技術、基因轉殖小鼠技術等。
術語“單鏈抗體”是由抗體的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)透過一段連接胜肽連接而成的單鏈重組蛋白，它是具有完全抗原結合位址的最小抗體片段。
術語“表位”是指抗原上與免疫球蛋白或抗體特異性結合的位址。表位可以由相鄰的胺基酸、或透過蛋白質的三級折疊而並列的不相鄰的胺基酸形成。由相鄰的胺基酸形成的表位通常在暴露於變性溶劑後保持，而透過三級折疊形成的表位通常在變性溶劑處理後喪失。表位通常以獨特的空間構象包括至少3-15個胺基酸。確定什麼表位由給定的抗體結合的方法在本領域中是熟知的，包括免疫印跡和免疫沉澱檢測分析等。確定表位的空間構象的方法包括本領域中的技術和本文所述的技術，例如X射線晶體分析法和二維核磁共振等。
術語“核酸”是指DNA分子和RNA分子。其可以是單鏈或雙鏈的，但優選是雙鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時，核酸是“有效連接的”。例如，如果活化子或增強子影響編碼序列的轉錄，那麼活化子或增強子有效地連接至所述編碼序列。
在本申請中，術語“特異性結合”通常是指抗體透過其抗原結合域與表位結合，並且該結合需要抗原結合域和表位之間的一些互補性。根據該定義，當抗體相比於其將結合隨機的，不相關的表位而言更容易透過其抗原結合域與表位結合時，抗體被稱為“特異性結合”該抗原。
在本申請中，術語“Fab”通常指常規抗體(例如IgG)中與抗原結合的部分，包括抗體的重鏈可變區VH、輕鏈可變區VL和重鏈恆定區結構域CH1以及輕鏈恆定區CL。在常規抗體中，VH的C端與CH1的N端聯結形成重鏈Fd片段，VL的C端與CL的N端聯結形成輕鏈，CH1的C端又進一步與重鏈的樞紐區和其他恆定區結構域聯結形成重鏈。在一些實施例中，“Fab”也指Fab的變異體結構。例如，在某些實施例中，VH的C端與CL的N端聯結形成一個多肽鏈，VL的C端與CH1的N端聯結形成另一個多肽鏈，形成Fab (cross VH/VL)的結構；在某些實施例中，Fab的CH1不與樞紐區聯結，而是CL的C端與重鏈的樞紐區聯結，形成Fab (cross Fd/LC)的結構。
在本申請中，術語“VH”通常指抗體的重鏈可變區VH結構域，即可以是人或者其他動物的常規抗體(H2L2結構)的重鏈可變區VH，也可以是駱駝科等動物的重鏈抗體(HCAb結構)的重鏈可變區VHH，還可以是利用Harbour HCAb基因轉殖小鼠產生的全人源重鏈抗體(HCAb結構)的重鏈可變區VH。較佳實施例之詳細說明 實施例 實施例 1. 全人源 4-1BB H2L2 抗體的獲得 實施例 1.1. 單株抗體的製備
Harbour H2L2小鼠(Harbour Antibodies BV)是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的基因轉殖小鼠，其產生的抗體具有完整的人的抗體可變結構域和大鼠恆定結構域。用可溶的重組人4-1BB-Fc融合蛋白對Harbour H2L2小鼠進行多輪免疫。當檢測小鼠血清中4-1BB特異的抗體效價達到一定的位準後，將小鼠的脾細胞取出並與骨髓瘤細胞株融合得到融合瘤細胞；對融合瘤細胞經過多輪篩選和選殖之後，分離出2個表現抗4-1BB單株抗體分子的融合瘤細胞株65D4G5G11和79B10G8D4。利用常規的融合瘤定序手段獲得編碼抗體分子可變結構域的核苷酸序列以及對應的胺基酸序列。在本實施例中，從免疫的Harbour H2L2小鼠得到的單株抗體分子可變結構域的序列是人源抗體序列。抗體可變結構域的CDR序列可以透過Kabat、Chothia或者結合了Kabat定義和Chothia定義的稱為Combined定義規則進行分析。本申請實施例中的CDR序列根據Chothia定義規則劃分。實施例 1.2. 重組全人源抗體的製備
在得到編碼抗體分子的輕、重鏈可變結構域序列以後，可以採用常規的重組DNA技術，將輕、重鏈可變結構域序列和相應的人的抗體輕、重鏈恆定結構域序列進行融合表現，得到重組抗體分子。
65D4G5G11選殖株的抗體編號為PR000196，79B10G8D4選殖株的抗體編號為PR000197。
同時，本申請生產製備了抗4-1BB的陽性對照抗體Urelumab和Utomilumab類似物，Urelumab對應的抗體編號為PR000628，Utomilumab對應的抗體編號為PR000483。其相應的胺基酸序列來源於IMGT資料庫。
在本實施例中，抗體輕鏈可變結構域序列(VL)透過基因合成並選殖到編碼人抗體κ輕鏈恆定結構域序列的哺乳動物細胞表現質體載體中，以編碼產生抗體的全長輕鏈。在本實施例中，抗體重鏈可變結構域序列(VH)透過基因合成並選殖到編碼人IgG4抗體重鏈恆定結構域序列的哺乳動物細胞表現質體載體中，以編碼產生IgG4抗體的全長重鏈，並且在該IgG4重鏈恆定區引入S228P突變(根據EU編號，第228位絲胺酸取代成脯胺酸)以增加IgG4抗體的穩定性。在本實施例中，抗體重鏈可變結構域序列(VH)透過基因合成並選殖到編碼人IgG1或者人IgG2抗體重鏈恆定結構域序列的哺乳動物細胞表現質體載體中，以編碼產生IgG1或者IgG2抗體的全長重鏈。在本實施例中，由於從免疫的Harbour H2L2小鼠得到的單株抗體分子可變結構域的序列是人源抗體序列，因而本實施例也得到全人源的抗4-1BB重組抗體。
將編碼抗體重鏈的質體和編碼抗體輕鏈的質體同時轉染哺乳動物宿主細胞(如人胚腎細胞HEK293)，利用常規的重組蛋白表現和純化技術，可以得到輕重鏈正確配對組裝的純化的重組抗體。具體說來，將HEK293細胞在FreeStyle™ F17 Expression Medium培養基(Thermo，A1383504)擴培。暫態轉染開始之前，調節細胞濃度至6-8×105 細胞/ml，於37°C 8% CO2 震盪培養箱中培養24小時，細胞濃度在1.2×106 細胞/ml。準備30 ml培養的細胞。將上述編碼抗體重鏈的質體和編碼抗體輕鏈的質體以2:3的比例混合共計30 µg質體溶解於1.5 ml Opti-MEM減血清培養基(Thermo，31985088)，並用0.22 µm濾膜過濾除菌。再取1.5 ml Opti-MEM 溶入1 mg/ml PEI (Polysciences Inc，23966-2) 120 µl，靜置5分鐘。把PEI緩慢加入質體中，室溫培育10分鐘，邊搖晃培養瓶邊緩慢滴入質體PEI混合溶液，於37°C 8% CO2 震盪培養箱中培養5天。5天後觀測細胞存活率。收集培養物，以3300 G轉速離心10分鐘後取上清液；然後將上清液高速離心去除雜質。用PBS(pH7.4)平衡含有MabSelect ™(GE Healthcare Life Science，71-5020-91 AE)的重力管柱(Bio-Rad，7311550)，2-5倍管柱體積沖洗。將上清液樣品過管柱。用5-10倍管柱體積的PBS沖洗管柱。再用pH3.5的0.1 M甘胺酸洗提目標蛋白，後用pH 8.0的Tris-HCl調節至中性，最後用超濾管(Millipore，UFC901024)濃縮換液至PBS緩衝液，得到純化的抗體溶液。然後用NanoDrop (Thermo Scientific™ NanoDrop™ One)測定濃度，分裝、存儲備用。實施例 1.3. 抗體的序列分析和優化
抗體的重鏈可變結構域序列來源於染色體上重鏈基因群的胚系基因V、D、J基因片段的基因重排和體細胞高頻突變等事件；輕鏈可變結構域序列來源於κ或λ輕鏈基因群的胚系基因V、J基因片段的基因重排和體細胞高頻突變等事件。基因重排和體細胞高頻突變是增加抗體多樣性的主要因素。來源於相同胚系V基因片段的抗體也可能產生不同的序列，但總體上相似性較高。利用一些演算法，例如IMGT/DomainGapAlign (http://imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi) 或者NCBI/IgBLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) 可以從抗體的可變結構域序列推測出其發生基因重排時可能的胚系基因片段。將實施例1.1得到的抗體序列進行分析，其重鏈可變結構域(VH)和輕鏈可變結構域(VL)的胚系基因V基因片段列於表1。
蛋白質或多肽胺基酸鏈在細胞中轉譯合成後有時會引入化學修飾，稱為轉譯後修飾(PTM)。對於抗體而言，一些PTM的位址是非常守恆的，例如，在人的IgG1抗體的恆定結構域的第297位元(EU編號)的守恆的胺基酸天門冬醯胺Asn通常會發生醣基化修飾形成醣鏈，而該醣鏈結構對於抗體結構和相關的效應物功能是至關重要的。但是，如果在抗體的可變結構域尤其是抗原結合區域(如CDR)中存在PTM，那麼這些PTM的存在有可能會對抗原的結合有較大的影響，也可能對抗體的物理化學性質帶來變化。例如，醣基化、脫醯胺、異構化、氧化等都可能增加抗體分子的不穩定性或異質性，從而增加抗體開發的難度和風險。因而避免一些潛在的PTM對於治療性抗體的開發是非常重要的。隨著經驗的積累，人們發現一些PTM是和胺基酸序列的組成尤其是相鄰胺基酸組成的“模式”是高度相關的，這樣使得可以從蛋白質的一級胺基酸序列預測出潛在的PTM。例如，N-x-S/T(第一位是天門冬醯胺，第二位是非脯胺酸以外的任意胺基酸，第三位是絲胺酸或者蘇胺酸)的序列模式預測出N-連接醣基化位址。引起PTM的胺基酸序列模式有可能來源於胚系基因序列，例如人胚系基因片段IGHV3-33天然地在FR3區域存在醣基化模式NST；也可能來源於體細胞高頻突變。表1列出了實施例1.1的抗體的可變結構域VH和VL的預測的PTM。具體說來，NHS可能是醣基化位址，NG可能是脫醯胺位址。 表1 融合瘤單株抗體序列的胚系基因分析和轉譯後修飾位址(PTM)分析
選殖株號 重組抗體 VH胚系V基因 VL胚系V基因 VH PTM VL PTM
65D4G5G11 PR000196 IGHV3-23 IGKV2-28 / NG (LCDR1)
79B10G8D4 PR000197 IGHV4-34 IGKV3-15 NHS (HCDR2) /
可以透過胺基酸突變來破壞PTM的胺基酸序列模式，從而降低或者去除特定PTM的形成。根據抗體序列和PTM序列模式的不同，有不同的突變設計方法。一種方法是將“熱點”胺基酸(如NG模式中的N或G)替換成物理化學性質相似的胺基酸(如把N突變為Q)。如果PTM序列模式來源於體細胞高頻突變，而並不存在於胚系基因序列中，那麼另一種方法可以是把該序列模式替換成對應的胚系基因序列。實際操作中，對同一個PTM序列模式可能採用多種突變設計方法。
抗體Fc結構域媒介的效應物功能如ADCC和CDC也有非常重要的生物學功能，不同的IgG亞型有著不同的ADCC或CDC功能，例如IgG1和IgG3有較強的ADCC和CDC作用，而IgG2和IgG4的作用相對較弱。另外，透過胺基酸突變或者修飾來改變Fc與Fc受體的結合能力也可以調節Fc原有的效應物功能。例如，IgG1中的“LALA”雙突變異體(L234A/L235A)能夠顯著降低與FcγRIIIA(CD16A)的親和力，進而降低ADCC作用。在本實施例中，來源於同一個抗體的可變區可以重組成為不同的IgG亞型或者突變異體，以調節效應物功能，例如，人IgG4(S228P)、人IgG2、人IgG1(LALA)。
D．Zhang等人發現在人IgG的Fc的E345位址引入突變E345R可以有效地增加促效型OX40抗體的活化作用(The Journal of Biological Chemistry, 291:27134-27146, 2016)。
本申請也發現該E345R突變可以有效地增加促效型4-1BB抗體的活化作用。在本實施例中，透過IgG亞型變換、可變區突變和Fc突變對表1的抗4-1BB融合瘤單株抗體進行序列優化，得到一系列的重組抗體或其變異體(見表2)。表3.1、表3.2和表a列出了本實施例中得到的重組抗體的輕、重鏈可變結構域胺基酸序列，輕鏈全長胺基酸序列，重鏈全長胺基酸序列，和根據Chothia定義規則定義的CDR的胺基酸序列。 表 2 透過IgG亞型變換、可變區突變和Fc突變得到的重組抗體
初始抗體 重組抗體( 變異體) 可變區突變 IgG 亞型 Fc 突變
65D4G5G11 PR000196   人 IgG4 S228P
79B10G8D4 PR000197   人 IgG4 S228P
PR000197 PR000447 VH:N52I; VL:F2I 人 IgG4 S228P
PR000197 PR000448 VH:N52Q; VL:F2I 人 IgG4 S228P
PR000448 PR000980 VH:N52Q; VL:F2I 人 IgG1 L234A, L235A, E345R
表 3.1 抗原結合蛋白序列編號表
抗體編號 輕鏈 重鏈 VL VH LCDR1 LCDR2 LCDR3 HCDR1 HCDR2 HCDR3
PR000483 247 214 205 173 136 147 161 18 55 99
PR000628 248 215 206 174 137 148 162 16 56 100
PR000196 242 208 200 167 132 144 157 15 49 95
PR000197 243 209 201 168 133 145 158 16 50 96
PR000447 246 212 204 171 133 145 158 16 53 96
PR000448 246 213 204 172 133 145 158 16 54 96
PR000980 246 216 204 172 133 145 158 16 54 96
表 3.2 CDR序列編號對應具體序列
HCDR1 SEQ ID NO: 具體序列 HCDR2 SEQ ID NO: 具體序列 HCDR3 SEQ ID NO: 具體序列
15 GFTFSSY 49 SGSGGN 95 EAYHYGSGSYYDDYYYGMDV
16 GGSFSGY 50 NHSGS 96 LTGPFDY
18 GYSFSTY 53 IHSGS 99 GYGIFDY
    54 QHSGS 100 DYGPGNYDWYFDL
    55 YPGDSY    
    56 NHGGY    
 
LCDR1 SEQ ID NO: 具體序列 LCDR2 SEQ ID NO: 具體序列 LCDR3 SEQ ID NO: 具體序列
132 RSSQSLLHSNGYNYLD 144 LGSNRAS 157 MQALQTPLT
133 RASQSISSILA 145 GASTRAT 158 QQYYNWPLT
136 SGDNIGDQYAH 147 QDKNRPS 161 ATYTGFGSLAV
137 RASQSVSSYLA 148 DASNRAT 162 QQRSNWPPALT
實施例 1.4.  4-1BB H2L2 抗體與細胞表面的 4-1BB 結合
將表現人4-1BB的CHO-K1細胞和表現食蟹猴4-1BB的CHO-K1細胞擴增培養後，PBS洗滌3次，按3×105 /孔塗佈96孔盤(Corning， #3799)。然後加入100 μl待測抗原結合蛋白或者陽性對照抗體Utomilumab或者Urelumab，最高濃度200 nM，5倍稀釋，4℃培育一小時。用FACS緩衝液清洗兩次，加入1:1000稀釋的羊抗人IgG的AF488偶聯抗體(Life Technologies， #A11013)，4℃培育1小時。用FACS緩衝液清洗兩次，100 μl PBS重新懸浮，進行FACS(BD Biosciences，CantoⅡ)測試，讀取螢光訊號。根據測定結果計算半數最大結合效應濃度(EC50)，作為相對結合活性的評價依據。
結果如圖1及下表4所示。圖1A顯示的是抗原結合蛋白與人4-1BB結合活性，圖1B顯示的是抗原結合蛋白與猴4-1BB結合活性。PR000447和PR000448均能結合人和食蟹猴的4-1BB，結合活性優於陽性對照Urelumab。Urelumab不能交叉結合食蟹猴4-1BB。 表4 抗原結合蛋白與表現人或猴4-1BB的細胞的結合
EC50 (nM) PR000447 PR000448 Urelumab Utomilumab
人4-1BB 1.007 0.9473 1.114 0.6271
食蟹猴4-1BB 1.285 1.064 不結合 0.9293
實施例 1.5.  4-1BB H2L2 抗體阻斷 4-1BB 配體與 4-1BB 結合
為了研究人4-1BB結合蛋白體外阻斷人4-1BB與人4-1BBL結合的活性。採用過度表現人4-1BB的CHO-K1細胞株(CHO-K1/hu4-1BB)進行細胞位準的人4-1BB/人4-1BBL結合阻斷實驗。簡言之，消化CHO-K1/hu4-1BB細胞，並用F-12K完全培養基重新懸浮，將細胞密度調整為1×106 細胞/mL。以100 µL細胞/孔接種於96孔V底盤(Corning, #3894)，隨後加入100 µL /孔，2倍於終濃度的3倍濃度梯度稀釋的待測抗原結合蛋白，混合均勻，其中抗原結合蛋白最高終濃度為100nM，共8個濃度，hIgG1作為對照。將細胞放置於4℃，避光培育1小時。之後，4℃下離心5分鐘，棄上清液，隨後加入50 µL/孔，1 µg/mL濃度的生物素標記的人4-1BBL蛋白(Acro, #41L-H82F9)，4℃，避光培育30分鐘。加入100 µL/孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500 g，4℃下離心5分鐘，棄上清液。加入100 µL/孔螢光二抗(PE Stre-ptavidin, BD, #554061，1：200)，4℃，避光培育30分鐘。用200 µL/孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500 g，4 ℃下離心5分鐘，棄上清液。最後，200 µL /孔預冷PBS重新懸浮細胞，使用BD FACS CANTOII讀取螢光發光訊號值，計算IC50，抑制率%=1-MFI(4-1BB Ab)/MFI(iso)。
結果如圖2所示。PR000448可阻斷4-1BB配體與4-1BB結合，並且阻斷效果與Utomilumab相似。實施例 1.6. 利用報導基因細胞株檢測對 4-1BB 信號途徑的刺激作用
將表現CD32b的CHO-K1細胞CHO-K1/CD32b(Genscript, #M00587)或CHO-K1(ATCC, #CCL-61)塗佈到96孔盤(Perkin Elmer, #6005225)上，細胞量為1.5×104 /孔，100 μL/孔。37℃在5% CO2 環境下培育過夜。去除上清液液，加入40 μL/孔的2倍的待測抗原結合蛋白稀釋液，起始濃度為200 nM，5倍濃度稀釋，hlgG1為對照組。加入4.5×104 /孔的可持續表現4-1BB和NF-Kb反應元件的螢光素酶報導基因的HEK293報導細胞(HEK293/4-1BB/NF-kb報導細胞，BPS Biosciences, #79289) 40 μL/孔。37℃在5% CO2 環境下培養6小時。加入ONE-GloTM螢光素酶試劑(Promega, #E6110)，室溫培育5分鐘，酵素標示讀取儀檢測發光值。
如圖3A、圖3B以及下表5所示，本申請所述4-1BB抗原結合蛋白PR000448是CHO-K1/CD32b交聯依賴型。如圖3A所示，在CHO-K1/CD32b交聯下，本申請所述的PR000448對4-1BB媒介的NF-Kb信號途徑的促進作用與其濃度成正相關關係遞增。與參照抗體(Utomilumab)相比，該抗體的EC50比參照抗體更低，且最大發光值也比參照抗體更高，說明該抗體能以較低的濃度促進NF-Kb的活化。如圖3B所示，而參照抗體Urelumab對4-1BB信號途徑的活化不依賴交聯，在沒有CHO-K1/CD32b交聯，同樣能活化4-1BB媒介的NF-Kb信號途徑。而PR000448在沒有CHO-K1/CD32b交聯不能活化4-1BB媒介的NF-Kb信號途徑。 表5 報導基因系統檢測4-1BB抗體對4-1BB信號途徑的活化
抗體 EC50 (nM) 最大值
PR000448 0.6632 86095
Utomilumab 1.489 40042
Urelumab 0.2728 101148
實施例 1.7.  4-1BB H2L2 抗體的體外功能檢測 實施例 1.7.1 4-1BB H2L2 抗體體外活化 4-1BB 途徑
使用10μg/ml的絲裂黴素(北京中生瑞泰科技，10107409001)處理CHO-K1-CD32b(過度表現人CD32b的CHO-K1細胞)的細胞，37℃放置30分鐘。然後用10% FBS的F-12K培養液，洗滌4次。把處理過的細胞放入96孔盤裡，每孔1.5×104 個，37℃保溫箱培養過夜。第二天，使用MACS套組(Miltenyi Biotec， #130-096-535)從人PBMC裡分離人CD3陽性T細胞。首先確定細胞數量，然後根據細胞數量加入相應量的MACS緩衝液和Pan-T細胞生物素抗體，混勻，4℃靜置5分鐘。然後加入相應量微磁珠，4℃靜置10分鐘。透過LS管柱的是CD3陽性的T細胞。將前一天96孔盤的培養液洗掉，加入純化的T細胞，每孔1×105 個。然後加入相應濃度的4-1BB抗原結合蛋白體或者對照抗體Utomilumab、PR000196，加入OKT3(eBiosciences， #16-0037-85)並且使其最終濃度達到0.3 μg/ml。37℃保溫箱培養72小時。72小時後，收取上清液，使用ELISA套組(Invitrogen， #88-7316-88)來檢測IFN-γ的含量。在96平底盤裡加入塗覆抗體，4℃過夜。第二天加入ELISA緩衝液，室溫1小時。加入收取的上清液，室溫培養2小時。洗盤2次，加入檢測抗體，室溫1小時。洗盤兩次，加入HRP-鏈黴親和素，室溫培育1小時。然後加入TMB基質，稍後加入ELISA終止液(BBI， #E661006-0200)。酵素標示讀取儀(PerkinElemer Enspire)讀取450 nm和570 nm吸光度值，用OD450-OD570計算IFN-γ濃度。
結果如圖4所示，PR000197、PR000447和PR000448抗體都能活化4-1BB途徑，並誘導活化T細胞分泌IFN-γ。且其活化作用都比Utomilumab、PR000196更強。實施例 1.7.2 4-1BB H2L2 抗體誘導 CD4+ 和 CD8+T 細胞的活性
按照實施例1.7.1的方法處理CHO-K1或CHO-K1/CD32b的細胞，塗佈盤，37℃保溫箱培養過夜。第二天，使用分選的試劑(Miltenyi Biotec， #130-096-495， #130-096-533)來分選CD8+和CD4+T細胞。然後加入相應濃度的4-1BB抗體或者是對照抗體，加入OKT3(eBiosciences， #16-0037-85)並且使其最終濃度達到0.3 μg/ml。37℃保溫箱培養72小時。72小時後，收取上清液，使用ELISA套組(Invitrogen， #88-7316-88)來檢測IFN-γ的含量。
CD8+T細胞誘導如圖5A，CD4+T細胞誘導如圖5B。
結果顯示，PR000447和PR000448顯著活化CD8+T細胞分泌IFN-γ，但是對CD4+T細胞活化功能不顯著。這可能是因為4-1BB在CD8+T細胞上的表現比CD4+T細胞高的緣故。實施例 1.8.  4-1BB H2L2 抗體抑制體內腫瘤生長的活性
建立B6-h4-1BB基因轉殖小鼠(北京百奧賽圖基因生物技術有限公司， #110004) MC38皮下結腸癌模型。首先復甦小鼠結腸癌細胞MC38 (Kerafast, ENH204-FP)復甦。培養條件：RPMI-1640培養基(Gibco, 22400089)+100 U/mL青黴素(AMRESCO®, #0242-100MU)+100 μg/mL鏈黴素(AMRESCO®, #0382)+10% FBS (GIBCO® Invitrogen™, #10099)；37℃，飽和濕度，5%CO2 。收集對數生長期的MC38細胞(記錄繼代次數)，去除培養液並用PBS洗兩次後接種(荷瘤前細胞存活率：98.9%、荷瘤後細胞存活率：92%)，接種量：5×105 /100 μl/隻(不添加基質膠)，接種位置：右側皮下。按照分組標準將小鼠分為5組，每組6隻，各組均值相近，且均值的範圍為80-120 mm3 ，入組標準：各組內單隻小鼠腫瘤體積儘量不超過150 mm3 ，且組內SEM儘量不超過均值的1/10。分組當天定義為第0天，並於分組當天第0天開始給藥。
待測樣品用PBS配製，給藥方式為腹腔注射，劑量體積為10 μl/g，給藥劑量為5 mg/kg，給藥頻率2次/周，給藥3周，共給藥6次。給藥當日測量小鼠體重和腫瘤體積，每週測量2次直至腫瘤平均體積達到700-800 mm3 ；當腫瘤平均體積超過700-800 mm3 ，改為一周測量3次腫瘤體積。腫瘤體積計算方式為：腫瘤體積(mm3 )=0.5 × 腫瘤長徑 × 腫瘤短徑2 。
小鼠體重監測如圖6A所示，腫瘤體積監測如圖6B所示，27天後安樂死小鼠，取出腫瘤拍照，腫瘤大小如圖6C所示。
結果顯示，PR000448有明顯腫瘤抑制效果，在實驗過程中，各組動物體重均出現增長，表明動物對受試品耐受良好。未對動物產生明顯毒性作用，安全性較好。實施例 1.9. 藥代動力學試驗
評價PR000448在雌性C57BL/6J小鼠體內的藥代動力學。將PR000448和Utomilumab以5mg/kg靜脈內單次給予小鼠(n=5)，在注射前和注射後1天、2天、4天、7天、10天、14天進行采血。採集的血液立即以4℃、15,000rpm離心15分鐘，獲得血漿，保存在-20℃以下的冰箱中。採用ELISA法測定血漿中待測抗體的濃度。PR000448和Utomilumab在血漿中濃度的變化如圖7所示。透過藥物動力分析軟體WinNolin，對所得血漿中濃度變化資料進行分析，計算藥物半衰期(t1/2 )。tl/2 是由最終三點或軟體自動設定的最終相血漿中濃度計算。所得末端t1/2 如圖7和下表6所示。
結果顯示，與Utomilumab相比，PR000448具有較長的血液半衰期。 表6 抗原結合蛋白的藥代動力學參數
  PR000448 Utomilumab
末端t1/2 (天數) 16.9 12.1
實施例 1.10. Fc 點突變 4-1BB H2L2 抗體的體外活化功能
為了評價Fc突變抗體PR000980對4-1BB途徑的活化效果，按照實施例1.6.1的方法，使用ELISA套組(Invitrogen #88-7316-88，Invitrogen #88-7346-88，Invitrogen #88-7025-77)檢測IFN-γ，TNF-α和IL-2的含量。Utomilumab、IgG1、IgG2、IgG4作為對照。
結果如圖8A、圖8B和圖8C所示，待測抗原結合蛋白均能刺活化化的T細胞分泌細胞激素，強於Utomilumab。且Fc突變後的PR000980保留了親代抗體PR000448刺激T細胞分泌細胞激素(IFN-γ、TNF-α、IL-2)的能力。實施例 1.11. 抗原結合蛋白的表位鑒定
使用ForteBio Octet平臺對實施例1得到的4-1BB H2L2抗體(PR000448和PR000980)和Utomilumab、Urelumab進行表位鑒定。其中，Urelumab為Bristol-Myers Squibb的抗4-1BB抗體BMS-663513(CAS:934823-49-1)，按照實施例1.2的方法表現純化得到。第一步，用感測器捕獲組胺酸標記的4-1BB抗原後，將感測器浸入抗體中，獲取該抗體的100%訊號。第二步，將第一抗體負載至多個AHC尖端上，隨後在測定緩衝液pH 7.5中獲得60秒基線。然後將尖端暴露於組胺酸標記的4-1BB持續180秒，以允許抗原結合。將尖端轉移至含有測定緩衝液中的第二抗體的孔持續90秒，將最終訊號記錄為該第二抗體的訊號。抑制率透過下式計算：抑制率(%)=(A–B) / A * 100，A：某抗體的100%訊號(從第一步中獲得)，B：該抗體作為第二抗體的訊號(從第二步獲得)。
如果第二抗體表現出明顯結合(即抑制率小於40%)，那麼就將它視為非競爭劑(即，在與第一抗體不同的表位區間中)。如果第二抗體不表現明顯結合(即抑制率大於等於40%)，那麼就將它視為競爭劑(即，在與第一抗體相同的表位區間中)。透過比較第二抗體在第一抗體存在下與4-1BB的結合與第一抗體阻斷本身來進行結合測定。
結果如下表7所示，PR000448和PR000980與Utomilumab在4-1BB的結合位址重疊性高，但是與Urelumab的結合位址重疊性低。 表7 本申請抗原結合蛋白與臨床抗體的表位鑒定
抑制率(%) 第二抗體
PR000448 PR000980 Urelumab Utomilumab
第一抗體 PR000448 98.4 90.2 18.3 90.6
PR000980 101.6 98.5 21.0 95.1
Urelumab 32.5 18.5 95.1 34.8
Utomilumab 82.8 69.3 21.8 94.9
實施例 1.12. 4-1BB H2L2 抗體與人或猴 4-1BB 蛋白的親和力測試
使用Biacore平臺對實施例1得到的4-1BB H2L2抗體(PR000448和PR000980)和Utomilumab、Urelumab進行親和力鑒定。測試中使用HBS-EP+(10 mM HEPES，150 mM NaCl，3 mM EDTA和0.05% P20，pH7.4，GE Healthcare，BR-1006-69)作為運行緩衝液，系列S CM5 (GE Healthcare，BR-1005-30)為實驗晶片。先設置流速10 μl/min透過以下程式在CM5的4個通道上偶聯Protein A：1)設置注入時間800 s，將50 mM NHS和200 mM EDC以1：1體積比新鮮混合後注入4個通道；2)用pH4.5的醋酸鈉(GE Healthcare，BR-1003-50)將Protein A 稀釋至20 μg/ml，注入各通道800 s；3)注入1M pH8.5乙醇胺800 s，以封阻晶片表面剩餘的活性羧基。封阻後繼續用1 × HBS-EP+緩衝液平衡儀器兩小時，Protein A最終偶聯量約為2000RU。再設置多迴圈動力學模式進行抗體與蛋白的親和力測定，每個迴圈包括抗體的捕獲、分析物的結合以及晶片的再生。將抗體均稀釋至1 μg/ml，以10 μl/min的流速注入2、3、4通道30 s，由預先偶聯的Protein A捕獲各抗體，捕獲量約為120 RU。將人的4-1BB或食蟹猴4-1BB依次按照0 nM、0.391 nM、0.781 nM、1.5625 nM、3.125 nM、6.25 nM、12.5 nM、25 nM的濃度梯度注入四個通道，流速為30 μl/min，對PR000448、PR000980設置解離時間600 s，對Uremulab、Utomilumab設置解離時間80 s，注入時間均設為120 s。最後為了從表面除去測試的抗體，以同樣流速注入10 mM甘胺酸-鹽酸 pH1.5 (GE Life Sciences，BR-1003-54) 30 s，來再生晶片。使用Biacore T200分析軟體2.0對實驗結果進行分析，1通道作為參考通道扣除，分析模型選用1：1動力學擬合模型。
結果如表8和圖9A-圖9D所示，4-1BB H2L2抗體與組胺酸標記的人4-1BB蛋白和組胺酸標記的猴4-1BB蛋白的親和力結果。結果顯示不管是與人還是猴的4-1BB蛋白的結合親和力上，抗體PR000448和PR000980的結合親和力均高於Uremulab和Utomilumab，而Urelumab不結合猴的4-1BB蛋白。 表8 BIACORE测定的4-1BB抗体的与人或猴4-1BB蛋白的结合亲和力
抗原結合蛋白 人4-1BB 蛋白抗原 (組胺酸標記) 猴4-1BB蛋白抗原 (組胺酸標記)
ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
PR000448 1.42E+06 2.20E-04 1.55E-10 1.19E+06 8.92E-04 7.51E-10
PR000980 1.43E+06 2.50E-04 1.74E-10 1.17E+06 8.40E-04 7.16E-10
Uremulab 1.09E+06 1.50E-03 1.38E-09 NA NA NA
Utomilumab 1.43E+06 1.50E-02 1.05E-08 1.09E+06 1.74E-02 1.59E-08
實施例 1.13. Fc 點突變抗體抑制體內腫瘤生長的活性
按照實施例5的方法建立B6-h4-1BB基因轉殖小鼠MC38皮下結腸癌模型。平均腫瘤體積達到99.14 mm3 時，小鼠根據腫瘤體積隨機分組，每組6隻。分組當天定義為第0天，並於分組當天第0天開始給藥。待測樣品用PBS配製，給藥方式為腹腔注射，給藥劑量為2 mg/kg。開始給藥後，每週稱量體重兩次。每週測量瘤體積兩次，瘤體積計算方式為：腫瘤體積(mm3 )=0.5 × 腫瘤長徑 × 腫瘤短徑2 。
小鼠體重和腫瘤體積變化如圖10A、圖10B結果顯示，給藥29天後測量，PR000448的Fc變異體PR000980具有更強的抑制腫瘤生長的活性。小結
本申請提供了一種抗4-1BB抗原結合蛋白，其具有下述性質中的一種或多種：1)能夠結合源自人和猴的4-1BB蛋白；2)能夠刺激免疫細胞分泌IFN-γ，IL2和/或TNFα；3)能夠抑制腫瘤生長和/或腫瘤細胞增殖；4)能夠活化4-1BB信號途徑。本申請還提供了所述抗原結合蛋白在預防和治療腫瘤中的應用。實施例 2. 全人源 4-1BB HCAB 抗體的獲得 實施例 2.1. 全人源 HCAb 小鼠的免疫和 4-1BB 抗體的獲得
Harbour HCAb小鼠(Harbour Antibodies BV，WO 2002/085945 A3) 是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的基因轉殖小鼠，能夠產生全新的僅“重鏈”抗體，該抗體的大小只有傳統IgG抗體的一半。其產生的抗體僅具有人的抗體“重鏈”可變結構域和小鼠Fc恆定結構域。由於不含輕鏈的這一特點，該抗體幾乎解決了輕鏈錯配和異源二聚化的問題，使得這一技術平臺能夠開發出傳統抗體平臺難以實現的產品。實施例 2.1.1. 免疫 HCAb 小鼠
6～8周齡Harbour人源抗體基因轉殖小鼠採用了2組免疫方案對Harbour HCAb小鼠進行多輪免疫。免疫方案1，用重組的人4-1BB-ECD-Fc(ChemPartner, Shanghai)抗原蛋白進行免疫。每隻小鼠每次免疫時透過皮下經腹股溝注射或透過腹腔注射接受的總注射劑量是100微升。在首輪免疫中，每隻小鼠接受用50微克抗原蛋白與完全弗氏佐劑(Sigma, #F5881)以體積比1:1混合配製的免疫原試劑的免疫。在隨後的每輪增強免疫中，每隻小鼠接受用25微克抗原蛋白與Ribi佐劑(Sigma Adjuvant System, Sigma, #S6322)混合配製的免疫原試劑的免疫。免疫方案2，用過度表現人4-1BB的NIH3T3-h4-1BB (ChemPartner, Shanghai)穩定細胞株進行免疫。每隻小鼠每次免疫時腹腔注射2×106 細胞懸浮液。每輪增強免疫的間隔時間至少為兩周，通常不超過五輪增強免疫。免疫時間為第0、14、28、42、56、70天；並且在第49、77天，檢測小鼠血清抗體效價。在進行HCAb小鼠脾B細胞分離前5天，以每隻小鼠25微克抗原蛋白的劑量進行最後一次增強免疫。實施例 2.1.2. 獲得抗 4-1BB 的 HCAb 抗體序列
採集小鼠血液，對血液進行10倍稀釋取6個濃度(1:100、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000)，在塗覆有人4-1BB-ECD-Fc (Chempartner, Shanghai)的ELISA盤進行ELISA檢測來確定小鼠血液中抗人4-1BB的效價，並經流式細胞術檢測2個濃度的小鼠血液(1:100、1:1000)對4-1BB高表現的CHO-K1/h4-1BB細胞(Chempartner, Shanghai)和CHO-K1母細胞的特異反應性。空白對照組(PB)為免疫前老鼠的血清。當檢測小鼠血清中4-1BB特異的抗體效價達到一定的位準後，將小鼠的脾細胞取出分離B細胞，用BD FACS AriaII Cell Sorter分選CD138陽性的漿細胞和人4-1BB抗原陽性的B細胞群。萃取B細胞的RNA，反轉錄cDNA (SuperScript IV First-Strand synthesis system, Invitrogen, 18091200)，然後用特異性的引子PCR擴增人VH基因。PCR引子5’- GGTGTCCAGTGTSAGGTGCAGCTG-3’, 5’- AATCCCTGGGCACTGAAGAGACGGTGACC-3‘。將擴增的VH基因片段建構到編碼人IgG1抗體重鏈Fc結構域序列的哺乳動物細胞表現質體pCAG載體中。
建構好的質體轉染哺乳動物宿主細胞(如人胚腎細胞HEK293)進行表現獲得HCAb的抗體。檢測表現HCAb的上清液與過度表現人4-1BB的CHO-K1/hu 4-1BB(ChemPartner, Shanghai)穩定細胞株的結合，同時用CHO-K1細胞作為陰性對照，進行Acumen篩選。獲得的陽性單株抗體進一步檢測與過度表現食蟹猴4-1BB的CHO-K1/cyno 4-1BB(ChemPartner, Shanghai)穩定細胞株的結合交叉結合活性。獲得683個結合CHO-K1/hu 4-1BB和CHO-K1/cyno 4-1BB的單選殖株的表現上清液進行NF-kb功能試驗，同時利用常規的定序手段獲得編碼抗體分子可變結構域的核苷酸序列以及對應的胺基酸序列。去除重複序列後得到323個同時結合CHO-K1/hu 4-1BB和CHO-K1/cyno 4-1BB的功能性的具有獨特序列的全人源4-1BB單株抗體。根據人猴細胞結合能力及NF-Kb功能試驗結果，選擇綜合排名靠前的38個抗體進行重組表現。 表9 HCAb抗體序列的胚系基因分析和轉譯後修飾位址(PTM)分析
序號 選殖株號1 重組抗體 VH 胚系V 基因 VH PTM
1 1016P0010B11 PR001758 IGHV3-23
2 1016P0010D7 PR001759 IGHV3-23 NxS/T (HCDR3),NG (HCDR3)
3 1016P0011G10 PR001760 IGHV3-23
4 1016P0016E9 PR001763 IGHV3-23 NxS/T (HCDR3),NG (HCDR3)
5 1016P0022E5 PR001764 IGHV3-23
6 1016P0034F10 PR001766 IGHV3-23
7 1016P0038G1 PR001767 IGHV3-53 DG (HCDR2)
8 1016P0039B9 PR001768 IGHV3-23
9 1016P0042C5 PR001771 IGHV3-23
10 1016P0045F7 PR001774 IGHV3-23
11 1016P0046A9 PR001775 IGHV3-23 NxS/T (HFR3)
12 1016P0049C7 PR001776 IGHV3-23 DG (HCDR3)
13 1016P0058D11 PR001780 IGHV3-23
14 1016P007F3 PR001781 IGHV3-23
15 1016P0014G8 PR001830 IGHV3-23
16 1016P0015C8 PR001831 IGHV3-23 NxS/T (HCDR3),NG (HCDR3)
17 1016P0016F8 PR001833 IGHV3-23
18 1016P0019C9 PR001834 IGHV3-23 NxS/T (HCDR2)
19 1016P0020G4 PR001836 IGHV3-23 NxS/T (HCDR2),NG (HCDR2)
20 1016P0024B10 PR001837 IGHV3-23
21 1016P0030B2 PR001838 IGHV3-23 DG (HCDR2)
22 1016P0037D2 PR001840 IGHV3-74 NS (HCDR2),DG (HCDR2)
23 1016P0045A3 PR001842 IGHV3-23
24 R1016P142D03 PR007286 IGHV3-11  
25 R1016P142F06 PR007287 IGHV3-21  
26 R1016P144G12 PR007288 IGHV3-21  
27 R1016P145B11 PR007289 IGHV3-21  
28 R1016P145C05 PR007290 IGHV3-48  
29 R1016P145C07 PR007291 IGHV3-11  
30 R1016P145D10 PR007292 IGHV3-11  
31 R1016P145E06 PR007293 IGHV3-21  
32 R1016P147A07 PR007294 IGHV3-21  
33 R1016P147A09 PR007295 IGHV3-11  
34 R1016P147B10 PR007296 IGHV3-21  
35 R1016P149F10 PR007297 IGHV3-11  
36 R1016P149G05 PR007298 IGHV3-21  
37 R1016P149H12 PR007299 IGHV3-21  
38 R1016P156E05 PR007300 IGHV3-21  
對其中1個來自實施例2.1.2的具有潛在PTM位址的抗體，進行胺基酸突變得到的新的抗體分子(稱為PTM變異體)。 表10 HCAb序列的突變位址設計
初始抗體 變異體 可變區突變 重組抗體亞型
PR001838 PR004469 G53A 人 IgG1
PR001838 PR007381 F37V, P40A, E42G, T43K, K46E, G53A 人 IgG1
表11 HCAb抗體序列表
抗體編號 重鏈 VH HCDR1 HCDR2 HCDR3
PR001758 217 175 19 57 101
PR001759 218 176 15 58 102
PR001760 219 177 20 59 103
PR001763 220 178 20 60 104
PR001764 221 179 15 61 105
PR001766 222 180 15 60 106
PR001767 223 181 21 62 107
PR001768 224 182 20 63 108
PR001771 225 183 20 60 108
PR001774 226 184 22 64 109
PR001775 227 185 15 60 110
PR001776 228 186 15 65 111
PR001780 229 187 22 66 112
PR001781 230 188 15 49 113
PR001830 231 189 20 60 103
PR001831 232 190 15 63 104
PR001833 233 191 15 60 114
PR001834 234 192 23 67 105
PR001836 235 193 24 68 103
PR001837 236 194 15 60 105
PR001838 237 195 20 69 115
PR001840 238 196 15 70 116
PR001842 239 197 15 60 117
PR004469 240 198 20 71 115
PR007286 353 337 300 308 326
PR007287 354 338 300 309 327
PR007288 355 339 300 310 328
PR007289 356 340 300 308 329
PR007290 357 341 300 311 330
PR007291 358 342 300 312 331
PR007292 359 343 300 308 332
PR007293 360 344 300 313 330
PR007294 361 345 300 314 329
PR007295 362 346 300 315 331
PR007296 363 347 300 314 327
PR007297 364 348 300 316 331
PR007298 365 349 300 308 333
PR007299 366 350 300 317 334
PR007300 367 351 300 315 331
PR007381 368 352 20 71 115
實施例 2.1.3. 製備抗 4-1BB 全人源重組抗體
將編碼HCAb抗體的質體轉染哺乳動物宿主細胞(如人胚腎細胞HEK293)，利用常規的重組蛋白表現和純化技術，可以得到純化的抗4-1BB重組重鏈抗體。具體說來，將HEK293細胞在FreeStyle™ F17 Expression Medium培養基(Thermo, A1383504)擴培。暫態轉染開始之前，調節細胞濃度至6×105 細胞/ml，於37℃ 8% CO2 震盪培養箱中培養24小時，細胞濃度在1.2×106 細胞/ml。準備30 ml培養的細胞，將上述編碼HCAb重鏈的質體30 µg質體溶解於1.5 ml Opti-MEM減血清培養基(Thermo, #31985088)，再取1.5 ml Opti-MEM溶入1 mg/ml PEI(Polysciences, Inc, #23966-2) 120 µl，靜置5分鐘。把PEI緩慢加入質體中，室溫培育10 分鐘，邊搖晃培養瓶邊緩慢滴入質體PEI混合溶液，於37℃ 8% CO2 震盪培養箱中培養5天。5天後觀測細胞存活率。收集培養物，以3300G轉速離心10分鐘後取上清液；然後將上清液高速離心去除雜質。用PBS (pH7.4)平衡含有MabSelect ™(GE Healthcare Life Science, #71-5020-91 AE)的重力管柱(Bio-Rad, #7311550)，2-5倍管柱體積沖洗。將上清液樣品過管柱。用5-10倍管柱體積的PBS沖洗柱子。再用pH3.5的0.1 M甘胺酸洗提目標蛋白，後用pH 8.0的Tris-HCl調節至中性，最後用超濾管(Millipore, UFC901024)濃縮換液至PBS緩衝液，得到純化的抗4-1BB重鏈抗體溶液。抗體濃度用NanoDrop檢測280 nm吸光度測定，抗體的純度用SEC-HPLC和SDS-PAGE測定。實施例 2.1.4. 利用 HPLC-SEC 分析蛋白純度和多聚體
使用分析型分子粒徑篩析層析層析法(SEC)來分析蛋白樣品的純度和聚體形式。將分析型層析管柱TSKgel G3000SWxl(Tosoh Bioscience, 08541, 5 µm, 7.8 mm x 30 cm)連接到高壓液相層析儀(HPLC)(型號：Agilent Technologies, Agilent 1260 Infinity II)，用PBS緩衝液室溫下平衡至少1小時。適量蛋白樣品(至少10 µg，樣品濃度調整到1 mg/ml)用0.22 µm濾膜過濾後注射入系統，並設定HPLC程式：用PBS(pH 7.4)緩衝液將樣品以1.0 ml/min的流速流過層析管柱，最長時間為20分鐘；檢測波長280 nm。採集後用 ChemStation軟體對層析圖進行積分並計算相關資料，生成分析報告，報告出樣品內不同分子粒徑組份的滯留時間。實施例 2.1.5. 利用 HPLC-HIC 分析蛋白純度和疏水性
使用分析型疏水相互作用層析法(HIC)來分析蛋白樣品的純度和疏水性。將分析型層析管柱TSKge1 Buty1-NPR(Tosoh Bioscience, 14947, 4.6 mm × 3.5 cm)連接到高壓液相層析儀(HPLC)(型號：Agilent Technologies, Agilent 1260 Infinity II)，用PBS緩衝液室溫下平衡至少1小時。設定方法由16分鐘內從100%流動相A (20 mM組胺酸，1.8 M硫酸銨，pH 6.0)至100%流動相B (20 mM組胺酸，pH 6.0)的線性梯度，流速設定為0.7 ml/min，蛋白樣品濃度1 mg/ml，進樣體積20 µl，檢測波長280 nm。採集後用ChemStation軟體對層析圖進行積分並計算相關資料，生成分析報告，報告出樣品內不同分子粒徑組份的滯留時間。實施例 2.1.6. 利用 DSF 測定抗體分子的熱穩定性
差示掃描螢光法(Differential Scanning Fluorimetry, DSF)是一種常用的高通量的用來測定蛋白質熱穩定性的方法。它使用即時螢光定量PCR儀器透過監測與去折疊的蛋白分子結合的染料的螢光強度的變化，來反映蛋白質的變性的過程，從而反映出蛋白分子的熱穩定性。本實施例利用DSF方法來測定蛋白分子熱變性溫度(Tm)。10 µg蛋白加入96-孔PCR盤(Thermo, AB-0700/W)，接著加入2 µl 100X稀釋的染料SYPROTM (Invitrogen, 2008138)，然後加入緩衝液使得終體積為40 µl每孔。將PCR盤密封，放置於即時螢光定量PCR儀器(Bio-Rad CFX96 PCR System)，先於25℃培育5分鐘，然後以0.2℃/0.2分鐘的梯度逐漸從25℃升溫至95℃，在測試結束時將溫度降至25℃。使用FRET掃描模式並使用Bio-Rad CFX Maestro軟體進行資料分析並計算出樣品的Tm。 表12 抗4-1BB HCAB抗體的理化性質
抗原結合蛋白 SEC-HPLC (%) 純度 Tm ( ℃) by DSF* HIC-HPLC 滯留時間( 分鐘) 相應的硫酸胺濃度(M) 第一步純化後產量 (mg/L)
PR001758 99.45 57 18.617 0.49 75.3
PR001759 84.47 61.2 17.846 0.58 58.3
PR001760 98.93 62.4 17.993 0.56 42
PR001763 85.12 62.6 17.035 0.67 69.5
PR001764 98.86 57.2 19.335 0.41 35.5
PR001766 97.69 60.6 18.7 0.48 27.5
PR001767 98.76 56 18.591 0.5 36.3
PR001768 99.01 63 20.555 0.28 25
PR001771 99.28 63.4 20.21 0.31 17.5
PR001774 99.79 56.2 20.378 0.29 11.4
PR001775 95.71 55.2 18.398 0.52 17
PR001776 99.1 56.6 20.352 0.3 10
PR001780 99.37 60.8 18.893 0.46 31
PR001781 99.59 61.4 20.564 0.27 11.7
PR001830 97.48 63.8 17.782 0.59 36.8
PR001831 86.78 56.2 16.948 0.68 46.5
PR001833 99.29 58.2 17.6 0.61 42
PR001834 93.7 59 17.711 0.6 27.3
PR001836 99.48 57.4 17.684 0.6 38.3
PR001837 96.57 59.8 18.699 0.48 35.3
PR001838 98.55 63.8 16.785 0.7 42
PR001840 99.6 56.2 17.433 0.63 44.3
PR001842 98.47 55 18.224 0.54 16.5
PR004469 95.43 - - - 81.2
PR007286 - 56.2 20.4 0.31 10.68
PR007287 - 52.2 16.65 0.73 8.18
PR007288 - - - - 2.46
PR007289 - 55.4 19.41 0.42 1.21
PR007290 - 51.2 20.03 0.35 6.81
PR007291 - 44.4 20.88 0.25 5.95
PR007292 - 50.6 16.04 0.79 8.90
PR007293 - - - - 4.01
PR007294 - - - - 1.81
PR007295 - 64 20.33 0.32 7.65
PR007296 - 58.2 18.89 0.48 1.12
PR007297 - 56.8 21.81 0.15 5.48
PR007298 - 50.4 16.22 0.77 10.68
PR007299 - 47.8 17.93 0.58 8.18
PR007300 - 50.4 20.75 0.27 2.46
PR007381 98.52% - - - 152.5
表12顯示大部分4-1BB HCAB具有較好的理化性質。實施例 2.2.  4-1BB HCAb 抗體與細胞表面 4-1BB 的結合
本實施例是為了研究抗人4-1BB的HCAb單抗體外結合人和食蟹猴4-1BB的活性。採用過度表現人4-1BB的CHO-K1細胞株(CHO-K1/hu 4-1BB,Genescript)、過度表現食蟹猴4-1BB的CHO-K1細胞株(CHO-K1/cyno 4-1BB,Genescript)進行細胞位準上的抗體結合實驗。簡言之，消化細胞CHO-K1/hu 4-1BB和CHO-K1/cyno 4-1BB細胞，並用F12K完全培養基重新懸浮，將細胞密度分別調整為1×106 細胞/ml。以100 µL細胞/孔接種於96孔V底盤(Corning, # 3894)，隨後加入100 µl /孔，2倍於終濃度的3倍濃度梯度稀釋的待測抗體。將細胞放置於4℃，避光培育1小時。之後，加入100 µl/孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。再加入100 µl/孔螢光二抗(Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific, Jackson, #109-545-06, 1:500稀釋)，4℃，避光培育30分鐘。用100 µl/孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。最後，200 µl/孔預冷PBS重新懸浮細胞，使用BD FACS CANTOII讀取螢光發光訊號值。
如圖11A到圖11M所示，本發明的抗4-1BB的HCAb抗體均能結合人4-1BB，且檢測到的抗體結合能力與抗體濃度成正相關關係遞增。與參照抗體(Urelumab和Utomilumab)相比，這些抗體能以較低的濃度更靈敏得結合人4-1BB，其中以PR001758-PR001760，PR001764，PR001830，PR001831，PR001833, PR001836, PR001838為最佳，其EC50均小於0.3 nM, 與參照抗體Utomilumab和Urelumab的EC50相當。PR007287, PR007292, PR007293, PR007294, PR007298 結合CHO-K1/hu 4-1BB細胞的螢光最大值要高與參照抗體Utomilumab和Urelumab。
如圖12A到圖12L所示，本發明的抗4-1BB的HCAb抗體均能結合猴4-1BB，且檢測到的抗體結合能力與抗體濃度成正相關關係遞增。與參照抗體Tab(Utomilumab)相比，這些抗體能以較低的濃度更靈敏得結合猴4-1BB，與參照抗體Utomilumab的EC50相當或更優。PR007287, PR007292, PR007293, PR007294, PR007298 結合CHO-K1/hu 4-1BB細胞的螢光最大值要高與參照抗體Utomilumab和Urelumab。而參照抗體Urelumab不具有與猴4-1BB交叉結合的活性。實施例 2.3. 利用報導基因細胞株檢測對 4-1BB 信號途徑的刺激作用
將表現CD32b的CHO-K1細胞(CHO-K1/CD32b)塗佈到96孔盤(Perkin Elmer， #6005225)上，細胞量為1.5×104 /孔，100 μL/孔。37℃在5% CO2 環境下培育過夜。去除上清液液，加入40 μL/孔的2倍的待測抗原結合蛋白稀釋液，起始濃度為200 nM，3倍濃度稀釋或起始濃度為30 nM，5倍濃度稀釋，hlgG1為對照組。加入4.5×104 /孔的可持續表現4-1BB和NF-Kb反應元件的螢光素酶報導基因的HEK293報導細胞(HEK293/4-1BB/NF-kb報導細胞，BPS Biosciences, #79289) 40 μL/孔。37℃在5% CO2 環境下培養6小時。加入ONE-GloTM螢光素酶試劑(Promega, #E6110)，室溫培育5分鐘，酵素標示讀取儀檢測發光值。
結果如圖13A到圖13I所示，在CHO-K1/CD32b交聯下，本申請所述大部分4-1BB抗原結合蛋白對4-1BB媒介的NF-Kb信號途徑的促進作用與其濃度成正相關關係遞增。與參照抗體Tab(Utomilumab)相比，EC50比參照抗體相當或更低，且最大螢光值也與參照抗體相當或更高，說明這些抗體能以較低的濃度促進NF-Kb的活化，其中以PR001758, PR001759和PR001760, PR007286, PR007291, PR007295, PR007296, PR007297, PR007299, PR007300為最佳，其EC50均小於0.8 nM, 與參照抗體的EC50相當。
結果如圖13J所示，在沒有CHO-K1/CD32b交聯下，本申請所述所有4-1BB抗原結合蛋白對4-1BB媒介的NF-Kb信號途徑沒有活化。而參照抗體Tab(Urelumab)仍然具有很強的活化作用。實施例 2.4. 抗原結合蛋白阻斷 4-1BB 配體與 4-1BB 結合
為了研究人4-1BB結合蛋白體外阻斷人4-1BB與人4-1BBL結合的活性。採用過度表現人4-1BB的CHO-K1細胞株(CHO-K1/hu4-1BB)進行細胞位準的人4-1BB/人4-1BBL結合阻斷實驗。簡言之，消化CHO-K1/hu4-1BB細胞，並用F-12K完全培養基重新懸浮，將細胞密度調整為1×106 細胞/mL。以100 µL細胞/孔接種於96孔V底盤(Corning, # 3894)，隨後加入100 µL /孔，2倍於終濃度的3倍濃度梯度稀釋的待測抗原結合蛋白，混合均勻，其中抗原結合蛋白最高終濃度為100 nM，共8個濃度，hIgG1作為對照。將細胞放置於4℃，避光培育1小時。之後，4℃下離心5分鐘，棄上清液，隨後加入50µL/孔，1 µg/mL濃度的生物素標記的人4-1BBL蛋白(ACRO, 41L-H82F9)，4℃，避光培育30分鐘。加入100µL/孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500 g，4℃下離心5分鐘，棄上清液。加入100 µL/孔螢光二抗(PE Streptavidin, BD, # 554061，1：200)，4℃，避光培育30分鐘。用200 µL/孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500 g，4 ℃下離心5分鐘，棄上清液。最後，200 µL /孔預冷PBS重新懸浮細胞，使用BD FACS CANTOII 讀取螢光發光訊號值，計算IC50，抑制率%=1-MFI(4-1BB Ab)/MFI(iso)。
結果如圖14A到圖14K所示。本申請所述4-1BB抗原結合蛋白分成了兩類。一類能阻斷人4-1BBL與細胞表面的人4-1BB結合，顯示出與參照抗體Tab(Utomilumab)相當的阻斷效果(PR001758，PR001759，PR001760， PR001764，PR001766，PR001776，PR001830，PR001831，PR001833，PR001834，PR001836，PR001837，PR001838，PR007287，PR007288，PR007289，PR007290，PR007291，PR007292，PR007293，PR007294， PR007295，PR007296，PR007298，PR007299，PR007300)；另外一類顯示與參照抗體(Urelumab)相似，弱阻斷或者無阻斷效果(PR001763，PR001767， PR001768，PR001771，PR001774，PR001780，PR001781，PR001840， PR001842， PR007286，PR007297)。實施例 2.5. 抗原結合蛋白能在體外活化 4-1BB 途徑
使用10 μg/ml的絲裂黴素(北京中生瑞泰科技， #10107409001)處理CHO-K1(ATCC, #CCL-61)或者是CHO-K1/CD32b (過度表現人CD32b的CHO-K1細胞)的細胞，30分鐘37℃。然後用10% FBS的F-12K培養液，洗滌4次。把處理過的細胞放入96孔盤裡，每孔1.5×104 個，37℃保溫箱培養過夜。第二天，使用MACS套組(Miltenyi Biotec，#130-096-535)從人PBMC裡分離人CD3陽性T細胞。首先確定細胞數量，然後根據細胞數量加入相應量的MACS緩衝液和Pan-T細胞生物素抗體，混勻，4℃靜置5分鐘。然後加入相應量微磁珠，4℃靜置10分鐘。透過LS管柱的是CD3陽性的T細胞。將前一天96孔盤的培養液洗掉，加入純化的T細胞，每孔1×105 個。然後加入相應濃度的4-1BB抗體或者是對照抗體，加入OKT3 (eBiosciences，#16-0037-85)並且使其最終濃度達到0.3 μg/ml。37℃保溫箱培養72小時。72小時後，收取上清液液，使用ELISA套組(Invitrogen, #88-7316-88)來檢測IFN-γ的含量。在96平底盤裡加入塗覆抗體，4℃過夜。第二天加入ELISA緩衝液，室溫1小時。加入收取的上清液，室溫培養2小時。洗盤2次，加入檢測抗體，室溫1小時。洗盤兩次，加入HRP-鏈黴親和素，室溫培育1小時。然後加入TMB基質，稍後加入ELISA終止液(BBI，E661006-0200)。酵素標示讀取儀(PerkinElemer Enspire)讀取450 nm吸光度(OD450)值，計算IFN-γ濃度。
結果如圖15A到圖15D所示，本實例中的絕大多數的4-1BB HCAB的活化作用都比Utomilumab更強，比如PR001758，PR001759，PR001760，PR001764，PR001830，PR001833，PR001834，PR001836，PR001837，PR001838在較低濃度1nM時對T細胞活化能力比參照抗體Utomilumab強。
結果如圖16A到圖16B所示，PR0001758、PR001759和PR001760抗體均是CD32b交聯依賴型活化4-1BB途徑，並誘導活化T細胞的功能。在CHO-K1/CD32b細胞交聯，其活化作用都比Utomilumab更強，而稍微比Urelumab弱。沒有CHO-K1/CD32b細胞交聯時，本實施例中的HCAb抗體則不能活化T細胞的功能，而Urelumab仍然能活化T細胞，這也被認為是Urelumab毒性的原因。活化作用與抗體濃度成正相關關係遞增，EC50均小於參照抗體Utomilumab，說明其能以較低濃度活化4-1BB途徑，而且細胞激素干擾素gamma釋放最大值也高於Utomilumab。實施例 2.6.  4-1BB 抗體對重組 4-1BB 蛋白的結合親和力測定
按照製造商提供的詳細操作和方法，使用Octet RED96儀器(Fortiebio)和抗人IgG Fc親和素感測器(AHC感測器，Pall ForteBio，#18-5060)測定親和力。具體地，用含有0.1% (w/w)BSA和0.02% (v/v)吐溫20的PBS緩衝液(pH7.4)將人的4-1BB蛋白，His標籤(Acrobiosystem，#41B-H5227)或食蟹猴的4-1BB蛋白，his標籤(Acrobiosystem，#41B-C52H4)，稀釋至400 nM，與AHC感測器培育。將40nM的4-1BB抗體與負載人4-1BB蛋白或猴4-1BB蛋白的AHC感測器在30℃培育3分鐘。該反應混合物在含有0.1% (v/w)BSA和0.02% (v/v)吐溫20的PBS緩衝液(pH7.4)中於30℃繼續培育5分鐘。Octet Red 96即時記錄4-1BB抗體與4-1BB蛋白的結合和分離訊號。親和力、關聯和解離常數由Octet使用軟體確定，結果如表13和表14所示。
結果表明，PR001836和PR001838抗體的KD值在檢測的抗體中不管結合人4-1BB或食蟹猴4-1BB都略低，表明其更強的4-1BB結合親和力。 表13 抗體與人的4-1BB蛋白的結合親和力
抗體 抗原蛋白 抗體濃度 (nM) KD (M) kon(1/Ms) kdis(1/s) Response
PR001758 人4-1BB 400 2.56E-08 2.26E+05 5.78E-03 0.3263
PR001759 400 1.23E-08 3.17E+05 3.89E-03 0.2843
PR001760 400 2.26E-08 2.68E+05 6.07E-03 0.2674
PR001833 400 2.34E-08 2.16E+05 5.06E-03 0.3112
PR001830 400 2.49E-08 2.66E+05 6.64E-03 0.3073
PR001836 400 1.35E-08 2.39E+05 3.22E-03 0.2937
PR001838 400 1.12E-08 2.33E+05 2.61E-03 0.3093
PR001840 400 3.27E-08 1.07E+05 3.50E-03 0.2236
表14 抗體與食蟹猴的4-1BB蛋白的結合親和力
抗體 抗原蛋白 抗體濃度 (nM) KD (M) kon(1/Ms) kdis(1/s) Response
PR001758 食蟹猴4-1BB 400 7.41E-09 1.51E+05 1.12E-03 0.274
PR001759 400 1.10E-08 2.15E+05 2.37E-03 0.2832
PR001760 400 2.06E-08 1.56E+05 3.21E-03 0.1779
PR001833 400 2.23E-08 1.39E+05 3.09E-03 0.2733
PR001830 400 1.81E-08 1.92E+05 3.47E-03 0.2222
PR001836 400 8.89E-09 1.65E+05 1.47E-03 0.2504
PR001838 400 1.03E-08 1.43E+05 1.46E-03 0.2242
PR001840 400 1.63E-08 6.20E+04 1.01E-03 0.2028
實施例 2.7. 抗原結合蛋白的表位鑒定 (Epitope binning)
使用ForteBio Octet平臺對實施例1得到的抗原結合蛋白和utomiluab、urelumab進行表位鑒定。簡言之，將第一抗體負載至多個AHC尖端上，隨後在測定緩衝液pH 7.5中獲得60秒基線。然後將尖端暴露於組胺酸標記的4-1BB持續180秒，以允許抗原結合。將尖端轉移至含有測定緩衝液中的第二抗體的孔持續90秒。如果第二抗體表現出明顯結合，那麼就將它視為非競爭劑(即，在與第一抗體不同的表位區間中)。如果第二抗體不表現明顯結合，那麼就將它視為競爭劑(即，在與第一抗體相同的表位區間中)。透過比較第二抗體在第一抗體存在下與4-1BB的結合與第一抗體阻斷本身來進行結合測定。抑制率透過公式計算，抑制率(%)=(A-B)/ A * 100 (注：A：某抗體的100%訊號，B：該抗體作為第二抗體的訊號)。
若抑制率大於80%，則意味著兩種抗體具有非常相近的表位；若抑制率介於40-80%之間，則意味著兩種抗體具有比較接近但是不完全重疊的表位；若抑制率小於40%，則意味著兩種抗體具有不重疊的表位。
結果如下表15所示，PR001760，PR001779，PR001838和PR001840與Utomiluab在4-1BB的結合位址重疊性高，但是與Urelumab的結合位址重疊性低；而PR001767的結合位址具有特異性，與Utomiluab和Urelumab都不同。 表15 本申請抗原結合蛋白與臨床抗體的表位鑒定
抑制率(%) 第二抗體
Utomilumab Urelumab PR001760 PR001767 PR001779 PR001838 PR001840
第一抗體 Utomilumab 93.31 -3.7 101.04 6.51 96.77 98.5 94.94
Urelumab -1.65 96.35 2.35 26.35 8.94 2.11 -7.98
PR001760 78.72 -0.09 91.61 15.34 91.78 89.07 84.56
PR001767 -9.54 2.12 -4.97 88.06 -9.85 1.14 49.51
PR001779 42.12 0.52 65.34 9.28 89.03 63.36 69.98
PR001838 83.94 -2.67 92.53 13.43 84.72 92.26 84.31
PR001840 53.97 1.04 79.78 65.13 90.58 78.42 94.97
實施例 2.8. 抗原結合蛋白的特異性結合 4-1BB
4-1BB屬於TNF腫瘤壞死因數受體超家族，該家族是由一大類多功能的受體組成，這些受體具有媒介免疫和非免疫細胞功能。已鑒定出6種受體是發揮重要作用的免疫共同刺激者，包括CD40、OX40、4-1BB、CD27、GITR和CD30。同樣，誘導型T細胞共刺激因數(ICOS)是另一類對活化的T細胞或記憶型T細胞的功能及存活有重要作用的受體。
本實施例是透過流式檢測TNF腫瘤壞死因數受體超家族的3個受體和ICOS來研究抗人4-1BB的HCAb單抗體外結合的特異性。採用過度表現人4-1BB的CHO-K1細胞株(CHO-K1/hu 4-1BB,Genescript)、過度表現人CD40的CHO-K1細胞株(CHO-K1/hu CD40，北京康源博創，#KC-1286)、過度表現人OX40的CHO-K1細胞株(CHO-K1/hu OX40, Genescript，#M00561)和過度表現人ICOS的HEK293細胞株(HEK293T/ICOS, Genescript，#KC-0210)進行細胞位準上的抗體結合實驗。簡言之，消化這些細胞，並用F12K或DMEM完全培養基重新懸浮，將細胞密度分別調整為1×106 細胞/ml。以100 µL細胞/孔接種於96孔V底盤(Corning, # 3894)，隨後加入100 µl/孔，2倍於終濃度的3倍濃度梯度稀釋的待測抗體。將細胞放置於4℃，避光培育1小時。之後，加入100 µl/孔預冷PBS 洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。再加入100 µl/孔螢光二抗(Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific, Jackson, #109-545-06, 1:1000稀釋)，4℃，避光培育30分鐘。用100 µl/孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。最後，200 µl/孔預冷PBS重新懸浮細胞，使用BD FACS CANTOII讀取螢光發光訊號值。
結果如圖17A到圖17D所示，本申請所述的PR001758，PR001760，PR001836和PR001838特異性地結合CHO-K1/hu 4-1BB細胞，而不結合TNF腫瘤壞死因數受體超家族的其他成員。小結
本發明的積極進步效果在於： 本發明的4-1BB抗體是一種全新的僅含“重鏈”的全人抗體，具有與人4-1BB和食蟹猴4-1BB特異性結合的活性。該4-1BB重鏈抗體的大小只有傳統IgG抗體的一半，由於不含輕鏈的這一特點，使得該抗體可以用於雙特異性抗體，並解決了輕鏈錯配和異源二聚化的問題。實施例 3. HER2 × 4-1BB 雙特異性抗體
人表皮生長因數受體2(HER2)也稱為ERBB2，HER-2，HER-2 / neu，NEU，NGL，TKR1和c-erb B2，在大鼠中也稱為ErbB2或neu，它是ErbB蛋白家族的一員，通常被稱為表皮生長因數受體家族。是一種在乳腺癌中具有較高侵襲性的蛋白質。HER2是細胞膜表面結合的酪胺酸激酶，通常參與導致細胞生長和分化的信號傳遞途徑。HER2被認為是一種孤兒受體，沒有任何EGF配體家族能夠活化它。大約30%的乳腺癌具有HER2基因擴增或其蛋白產物過度表現，該受體在乳腺癌中的過度表現與疾病復發和預後不良有關。HER2在發育，癌症，神經肌肉連接處的通訊以及細胞生長和分化的調節中發揮作用。
HER2 × 4-1BB雙抗，旨在透過將T細胞與HER2陽性腫瘤細胞橋接起來促進4-1BB聚集，為腫瘤抗原特異性T細胞提供有效的共刺激信號，進一步增強T細胞受體(TCR)媒介的活性並導致腫瘤解體。因此HER2 × 4-1BB媒介的4-1BB的活化偏向於體內T細胞和腫瘤細胞的共定位，例如在原發性腫瘤與腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)或含有腫瘤轉移的淋巴結。
在本實施例中，建構了同時標靶HER2和4-1BB的雙特異性抗體，旨在透過一個或者多個作用機制來提高抗腫瘤效果和安全性。第一，HER2 × 4-1BB雙抗富集於HER2高表現的腫瘤組織，T細胞與HER2陽性腫瘤細胞橋接起來促進4-1BB聚集，為腫瘤抗原特異性T細胞提供有效的共刺激信號，進一步增強T細胞受體(TCR)媒介的T細胞的活性，提高抗腫瘤活性。因此HER2 × 4-1BB媒介的4-1BB的活化偏向於體內T細胞和腫瘤細胞的共定位，例如在原發性腫瘤與腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)或含有腫瘤轉移的淋巴結。第二，本實施例所使用的抗4-1BB的促效型抗體的功能是依賴於分子交聯的，它只能在腫瘤微環境中利用標靶細胞來媒介T細胞的活化，以避免類似Urelumab的單抗在正常組織中過度活化T細胞所帶來的毒副作用。實施例 3.1.  HER2 × 4-1BB 雙特異性抗體的結構和設計
本實施例使用抗HER2的IgG抗體trastuzumab，其相應的胺基酸序列來源於IMGT資料庫。生產的抗體編號為PR000210。 表16 抗HER2的trastuzumab抗體序列表
抗體編號 輕鏈 重鏈 VL VH LCDR1 LCDR2 LCDR3 HCDR1 HCDR2 HCDR3
PR000210 244 210 202 169 134 143 159 17 51 97
本實施例使用的抗4-1BB的全人源H2L2抗體PR000448以及衍生的scFv來源於Harbour H2L2小鼠，其發現過程如實施例1所述。
本實施例使用的抗4-1BB的全人源HCAb抗體來源於Harbour HCAb小鼠，其發現過程如實施例2所述。
在本實施例及後續實施例中，陽性對照分子為抗HER2的IgG單抗PR000210 (trastuzumab類似物)，亦為HER2 × 4-1BB雙抗分子的HER2端的親代單抗。
在本實施例及後續實施例中，陽性對照分子為抗4-1BB的IgG單抗Uremulab和Utomilumab。實施例 3.1.1. 利用抗 HER2 的 IgG 抗體和抗 4-1BB 的 HCAb 抗體建構 IgG-VH 四價對稱結構的雙特異性抗體
IgG-VH四價對稱結構(如圖18A所示)的結合蛋白包含兩條多肽鏈：多肽鏈1，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL；多肽鏈2，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CH1-h-CH2-CH3-L-VH_B。
在一個實施方案中，多肽鏈2的CH3與VH_B直接融合聯結，即L的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的CH3經由連接肽L聯結到VH_B；L可以是表17中所列序列。 表17 連接胜肽
連接胜肽名字 連接肽胜肽長度 連接胜肽序列 序列編號
GS_4 4 GSGS 273
GS_5 5 GGGGS 274
GS_6 6 GGSGGS 275
GS_7 7 GGGGSGS 276
GS_15 15 GGGGSGGGGSGGGGS 277
GS_20 20 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 278
GS_25 25 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 279
人IgG1樞紐 15 EPKSCDKTHTCPPCP 280
人IgG1樞紐(C220S) 15 EPKS S DKTHTCPPCP 281
H1_15 15 EPKSSDKTHTPPPPP 282
G5-LH 15 GGGGG DKTHTCPPCP 283
H1_15-RT 17 EPKSSDKTHTPPPPPRT 284
L-GS_15-RT 18 LGGGGSGGGGSGGGGSRT 285
L-H1_15-RT 18 LEPKSSDKTHTPPPPPRT 286
KL-H1_15-RT 19 KLEPKSSDKTHTPPPPPRT 287
KL-H1_15-AS 19 KLEPKSSDKTHTPPPPPAS 288
RT-GS_5-KL 9 RTGGGGSKL 289
RT-GS_15-KL 19 RTGGGGSGGGGSGGGGSKL 290
RT-GS_25-KL 29 RTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSKL 291
EPKSSD 6 EPKSSD 292
AS-GS_15 17 ASGGGGSGGGGSGGGGS 293
GS_2 2 GS  
利用抗HER2的IgG抗體和抗4-1BB的HCAb的重鏈抗體設計IgG-VH 四價對稱結構的HER2 × 4-1BB雙抗分子，總結於表18；製備的雙抗抗體分子樣品並理化性質分析，總結於表19。 表18 IgG-VH四價對稱結構的HER2 × 4-1BB雙抗分子
雙抗分子 HER2 抗體(IgG) 4-1BB 抗體(VH_B) VH_B 相對IgG 位置 連接胜肽(VH_B 和IgG 之間) Fc 類型( 突變)
PR002812 trastuzumab PR001758 重鏈C端 H1_15-RT 人IgG1(L234A,L235A,P329G)
PR002813 trastuzumab PR001760 重鏈C端 H1_15-RT 人IgG1(L234A,L235A,P329G)
PR002815 trastuzumab PR001764 重鏈C端 H1_15-RT 人IgG1(L234A,L235A,P329G)
PR002820 trastuzumab PR001774 重鏈C端 H1_15-RT 人IgG1(L234A,L235A,P329G)
PR002821 trastuzumab PR001775 重鏈C端 H1_15-RT 人IgG1(L234A,L235A,P329G)
PR002822 trastuzumab PR001780 重鏈C端 H1_15-RT 人IgG1(L234A,L235A,P329G)
PR002823 trastuzumab PR001781 重鏈C端 H1_15-RT 人IgG1(L234A,L235A,P329G)
PR002824 trastuzumab PR001830 重鏈C端 H1_15-RT 人IgG1(L234A,L235A,P329G)
PR002825 trastuzumab PR001831 重鏈C端 H1_15-RT 人IgG1(L234A,L235A,P329G)
PR002826 trastuzumab PR001833 重鏈C端 H1_15-RT 人IgG1(L234A,L235A,P329G)
PR002827 trastuzumab PR001836 重鏈C端 H1_15-RT 人IgG1(L234A,L235A,P329G)
PR002828 trastuzumab PR001838 重鏈C端 H1_15-RT 人IgG1(L234A,L235A,P329G)
PR002829 trastuzumab PR001840 重鏈C端 H1_15-RT 人IgG1(L234A,L235A,P329G)
表19 HER2 × 4-1BB雙抗分子的理化性質
雙抗分子 表現系統和體積 質體轉染比例( 短鏈：長鏈) 第一步純化後產量(mg/L) HPLC-SEC 純度(%) HPLC-HIC 滯留時間(min) DSF Tm1 ( °C)
PR002812 Expi293F (10 ml) 3 : 2 52.7 71.15 18.081 65.8
PR002813 Expi293F (10 ml) 3 : 2 37.2 80.50 18.402 66.2
PR002815 Expi293F (10 ml) 3 : 2 44.6 68.08 19.077 67.2
PR002820 Expi293F (10 ml) 3 : 2 92.5 70.72 18.082 67.0
PR002821 Expi293F (10 ml) 3 : 2 55.9 74.62 18.742 62.4
PR002822 Expi293F (10 ml) 3 : 2 29.7 84.14 19.143 63.2
PR002823 Expi293F (10 ml) 3 : 2 49.5 85.87 18.153 66.2
PR002824 Expi293F (10 ml) 3 : 2 48.0 79.89 17.734 67.0
PR002825 Expi293F (10 ml) 3 : 2 82.4 63.99 17.937 67.2
PR002826 Expi293F (10 ml) 3 : 2 61.1 87.09 17.585 67.4
PR002827 Expi293F (10 ml) 3 : 2 29.5 73.75 17.366 66.4
PR002828 Expi293F (10 ml) 3 : 2 77.7 86.83 18.932 67.4
PR002829 Expi293F (10 ml) 3 : 2 83.3 32.37 18.439 67.4
實施例 3.1.2. 利用抗 HER2 的 IgG 抗體和抗 4-1BB 的 H2L2 抗體建構 IgG-scFv 四價對稱結構的雙特異性抗體
IgG-scFv四價對稱結構(如圖18B所示)的結合蛋白包含兩條多肽鏈：多肽鏈1，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL；多肽鏈2，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CH1-h-CH2-CH3-L1-VH_B L2-VL_B。
或者
IgG-scFv四價對稱結構(如圖18C所示)的結合蛋白包含兩條多肽鏈：多肽鏈1，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL；多肽鏈2，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CH1-h-CH2-CH3-L1-VL_B L2-VH_B。
多肽鏈2的連接肽L1和連接肽L2可以是表17中所列序列。
利用抗HER2的IgG抗體和抗4-1BB的H2L2抗體設計IgG-scFv 四價對稱結構的HER2 × 4-1BB雙抗分子，總結於表20；製備的雙抗抗體分子樣品並理化性質分析，總結於表21。 表20 IgG-scFv四價對稱結構的HER2 × 4-1BB雙抗分子
雙抗分子 HER2 抗體(IgG) 4-1BB 抗體(scFv) scFv 端結構 第一連接胜肽(Fc 和scFv 之間) 第二連接肽胜肽(VH_B 和VL_B 之間) Fc 類型( 突變)
PR001212 trastuzumab PR000448 VH-連接胜肽-VL KL-H1_15-RT GS_15 人IgG1
PR002811 trastuzumab PR000448 VH-連接胜肽-VL H1_15-RT GS_15 人IgG1 (L234A, L235A, P329G)
表21 HER2 × 4-1BB雙抗分子的理化性質
雙抗分子 表現系統和體積 質體轉染比例( 短鏈：長鏈) 第一步純化後產量 (mg/L) HPLC-SEC 純度(%) HPLC-HIC 滯留時間(min) DSF Tm1 (°C)
PR001212 HEK293F (30 ml) 3 : 2 22.3 85.05 17.563 51.4
PR002811 Expi293F (10 ml) 3 : 2 2.0
表22 HER2 × 4-1BB雙抗分子的序列表
抗體編號 多肽鏈1 多肽鏈2
PR001212 244 251
PR002811 244 252
PR002812 244 253
PR002813 244 254
PR002815 244 255
PR002820 244 256
PR002821 244 257
PR002822 244 258
PR002823 244 259
PR002824 244 260
PR002825 244 261
PR002826 244 262
PR002827 244 263
PR002828 244 264
PR002829 244 265
實施例 3.2.  FACS 檢測 HER2 × 4-1BB 雙抗與 SK-BR-3 細胞的結合能力
本實施例是為了研究4-1BB的雙特異性抗體體外結合SK-BR-3的活性。SK-BR-3是高表現Her2的乳腺癌細胞，採用SK-BR-3進行細胞位準上的抗體結合實驗。簡言之，消化SK-BR-3細胞，並用完全培養基重新懸浮，將細胞密度分別調整為1×106 細胞/ml。以100 µL細胞/孔接種於96孔V底盤(Corning, #3894)，隨後加入100 µl/孔，2倍於終濃度的3倍濃度梯度稀釋的待測抗體。將細胞放置於4℃，避光培育1小時。之後，加入100 µl/孔預冷PBS 洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。再加入100 µl /孔螢光二抗(Alexa Fluor® 647 AffiniPure Goat Anti-Human IgG, F(ab')2 fragment specific, Jackson Immunoreserach, #109-605-006, 1:1000稀釋)，4℃，避光培育30分鐘。用100 µl/孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。最後，200 µl/孔預冷PBS重新懸浮細胞，使用BD FACS CANTOII讀取螢光發光訊號值。
如圖19A到圖19C所示，本發明的Her2 × 4-1BB的雙特異性抗體均能結合人SK-BR-3，且檢測到的抗體結合能力與抗體濃度成正相關關係遞增。與參照抗體(Trastuzumab)相比，在相同濃度下，PR002813比參照抗體表現出更低的EC50，其他抗體則與參照抗體相當。實施例 3.3.  FACS 檢測 HER2 × 4-1BB 雙抗與 CHO-K1/hu 4-1BB 細胞的結合能力
本實施例是為了研究4-1BB的雙特異性抗體體外結合4-1BB的活性。採用過度表現人4-1BB的CHO-K1細胞株(CHO-K1/hu 4-1BB,Genescript)進行細胞位準上的抗體結合實驗。簡言之，消化細胞CHO-K1/hu 4-1BB細胞，並用F12K完全培養基重新懸浮，將細胞密度分別調整為1×106 細胞/ml。以100 µL細胞/孔接種於96孔V底盤(Corning, # 3894)，隨後加入100 µl/孔，2倍於終濃度的3倍濃度梯度稀釋的待測抗體。將細胞放置於4℃，避光培育1小時。之後，加入100 µl/孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。再加入100 µl /孔螢光二抗(Alexa Fluor® 647 AffiniPure Goat Anti-Human IgG, F(ab')2 fragment specific, Jackson Immunoreserach, #109-605-006, 1:1000稀釋)，4℃，避光培育30分鐘。用100 µl /孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。最後，200 µl /孔預冷PBS重新懸浮細胞，使用NovoCyte流式細胞儀(ACEA Biosciences)讀取螢光發光訊號值。
如圖20A到圖20E所示，本發明的Her2×4-1BB的雙特異性抗體均均能較好地結合人4-1BB，且檢測到的抗體結合能力與抗體濃度成正相關關係遞增。這些抗體能以較低的濃度更靈敏得結合人4-1BB，其中以PR002811，PR001212，PR002813和PR002824為最佳，EC50優於參照抗體Utomilumab。其它雙抗與Utomilumab相當或者稍弱。但是最大MFI都高於參照抗體Utomilumab實施例 3.4.  FACS 檢測 HER2 × 4-1BB 雙抗與 CHO-K1/cyno 4-1BB 細胞的結合能力
本實施例是為了研究4-1BB的雙特異性抗體體外結合4-1BB的活性。採用過度表現食蟹猴4-1BB的CHO-K1細胞株(CHO-K1/cyno 4-1BB,Genescript)進行細胞位準上的抗體結合實驗。簡言之，消化細胞CHO-K1/cyno 4-1BB細胞，並用F12K完全培養基重新懸浮，將細胞密度分別調整為1×106 細胞/ml。以100 µL細胞/孔接種於96孔V底盤(Corning, # 3894)，隨後加入100 µl /孔，2倍於終濃度的3倍濃度梯度稀釋的待測抗體。將細胞放置於4℃，避光培育1小時。之後，加入100 µl/孔預冷PBS 洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。再加入100 µl/孔螢光二抗(Alexa Fluor® 647 AffiniPure Goat Anti-Human IgG, F(ab')2 fragment specific, Jackson Immunoreserach, #109-605-006, 1:1000稀釋)，4℃，避光培育30分鐘。用100 µl/孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。最後，200 µl/孔預冷PBS重新懸浮細胞，使用NovoCyte流式細胞儀(ACEA Biosciences)讀取螢光發光訊號值。
如圖21A到圖21B所示，本發明的HER2 × 4-1BB雙抗均能較好地結合食蟹猴4-1BB，且檢測到的抗體結合能力與抗體濃度成正相關關係遞增。與參照抗體(Utomilumab)相比，PR001212，PR002824，PR002826-PR002829與食蟹猴4-1BB結合相當。實施例 3.5.  HER2/4-1BB 雙抗能在體外活化 T 細胞途徑
用PBS稀釋1mg/ml的OKT3(eBiosciences，#16-0037-85)，每孔取100 μL 0.08 μg/ml OKT3塗覆96孔盤(Corning,#3599)，使其最終濃度達到10 μg/ml。4度塗覆過夜。第二天，消化SK-BR-3細胞，並用完全培養基重新懸浮，將細胞密度分別調整為4×105 細胞/ml備用。使用MACS套組(Miltenyi Biotec，#130-096-535)從人PBMC裡分離人CD3陽性T細胞。首先確定細胞數量，然後根據細胞數量加入相應量的MACS緩衝液和Pan-T細胞生物素抗體，混勻，4℃靜置5分鐘。然後加入相應量微磁珠，4℃靜置10分鐘。透過LS管柱的是CD3陽性的T細胞。將前一天96孔盤塗覆的OKT3洗掉，加入50 μL純化的T細胞，每孔1×105 個。再取50 μL SK-BR-3細胞放入96孔盤裡，每孔2×104 個。然後加入相應濃度的HER2/4-1BB的雙特異性抗體或者是對照單抗，37℃ 5% CO2 培養箱箱培養。培養72小時後取上清液液，使用ELISA套組(Invitrogen，#88-7316)來檢測IFN-γ的含量。按照供應商的說明書進行ELISA檢測，簡言之，在96平底盤裡加入塗覆抗體，4℃過夜。第二天加入ELISA緩衝液，室溫1小時。加入收取的上清液，室溫培養2小時。洗盤2次，加入檢測抗體，室溫1小時。洗盤兩次，加入HRP-鏈黴親和素，室溫培育1小時。然後加入TMB基質，10-30分鐘加入ELISA終止液(BBI life sciences，#E661006-0200)。使用讀盤機(Molecular Devices ，#SpectraMax Plus)讀取OD450-570值。用Graphad 8.0分析該值並做圖。
如圖22A到圖22D所示，本發明的HER2 × 4-1BB雙抗在腫瘤細胞SK-BR-3交聯下均具有活化4-1BB媒介的T細胞途徑。其中PR002813和PR002827顯示出較低的EC50和較高的IFN gamma釋放值。小結
本實施例利用抗Her2的IgG抗體的抗原結合結構域Fab和抗4-1BB的HCAb抗體的抗原結合結構域VH，建構了IgG-VH 四價對稱結構的HER2 × 4-1BB雙抗分子。同時，利用抗Her2的IgG抗體的抗原結合結構域Fab和抗4-1BB的H2L2抗體，建構IgG-scFv 四價對稱結構的雙特異性抗體。
兩種結構的抗HER2 × 4-1BB的雙特異性抗體分子，透過不同的結構類型、相對位置、結合價數等參數來調節活化T細胞的功能活性。同時展現出了基於HCAb建構雙特異性抗體分子結構的靈活性。
Urelumab對T細胞的活化是沒有標的特異性，這是其臨床毒副作用的原因之一。但是，HER2 × 4-1BB雙抗對T細胞活化作用是特異性依賴HER2的表現。在高表現HER2的細胞存在時，HER2 × 4-1BB雙抗可以特異地活化T細胞。
綜上所述，本實施例建構出了功能活性突出、分子穩定性好的HER2 × 4-1BB雙特異性抗體分子。實施例 4. PD-L1 × 4-1BB 雙特異性抗體
程式性細胞死亡受體1 (programmed death 1, PD-1)主要表現於T細胞等免疫細胞，它有兩個配體，即程式性細胞死亡配體-1 (programmed death ligand 1, PD-L1)和PD-L2。PD-L1主要表現在抗原呈現細胞以及多種腫瘤細胞。PD-L1與PD-1相互作用會下調T細胞的活性，減弱細胞激素的分泌，起到免疫抑制作用。在許多人類腫瘤組織中均可檢測到PD-L1蛋白的表現，腫瘤部位的微環境可誘導腫瘤細胞上的PD-L1的表現，表現的PD-L1有利於腫瘤的發生和生長，誘導抗腫瘤T細胞的凋亡，並進一步保護腫瘤細胞逃避免疫攻擊。
4-1BB (TNFRSF9, CD137)是一種隸屬於TNF受體超家族的跨膜蛋白。4-1BB是在多種免疫細胞上表現的共刺激分子，為免疫活性的多功能調節劑。其誘導表現於活化的T細胞、NK細胞等免疫細胞。4-1BB透過其配體4-1BBL媒介的三聚化來活化T細胞，促進細胞增殖和細胞激素釋放。抗4-1BB的促效型抗體具有抑制腫瘤的功能，百時美施貴寶(BMS)公司的Urelumab (BMS-663513)是最早進入臨床試驗的抗4-1BB的全人源單抗。Urelumab最初的臨床結果發表於2008年，儘管在部分患者上觀察到令人鼓舞的療效，但資料顯示Urelumab導致肝臟毒性，且與標的和劑量有關。並且，因為在臨床試驗中有兩位患者因肝毒性死亡，導致相關的臨床試驗被終止。
在本實施例中，建構了同時標靶PD-L1和4-1BB的雙特異性抗體，透過一個或者多個作用機制來提高抗腫瘤效果和安全性。第一，PD-L1 × 4-1BB雙抗可以透過阻斷PD-1/PD-L1信號途徑來活化T細胞。第二，高表現於腫瘤細胞表面的PD-L1分子可以利用雙抗分子促進T細胞表面的4-1BB分子的交聯和三聚化並活化下游信號傳導途徑，進而促進T細胞的活化和增殖。第三，雙抗分子媒介的T細胞活化僅限於在腫瘤微環境內，這樣可以避免類似Urelumab的單抗在正常組織中過度活化T細胞所帶來的毒副作用。實施例 4.1.  PD-L1 × 4-1BB 雙特異性抗體的結構和設計
本實施例使用抗PD-L1的IgG抗體PR000151 (Atezolizumab類似物)，其相應的胺基酸序列來源於IMGT資料庫。
本實施例使用的抗PD-L1的全人源IgG抗體PR000265(表4.2)來源於Harbour H2L2小鼠，其發現過程如下所述。
Harbour H2L2小鼠(Harbour Antibodies BV)是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的基因轉殖小鼠，其產生的抗體具有完整的人的抗體可變結構域和大鼠恆定結構域。用可溶的重組人PD-L1蛋白(NovoProtein, #C764)對Harbour H2L2小鼠進行多輪免疫。當檢測小鼠血清中PD-L1特異的抗體效價達到一定的位準後，將小鼠的脾細胞取出並與骨髓瘤細胞株融合得到融合瘤細胞；對融合瘤細胞經過多輪篩選和選殖之後，鑒定出若干個特異辨識PD-L1的單株抗體分子。對這些單株抗體進行進一步的鑒定，根據其對人PD-L1的結合能力、食蟹猴PD-L1的結合能力、抑制PD-L1與PD-1結合能力等參數，優選出數個候選抗體分子。然後對候選抗體分子進行序列分析和優化，得到數個變異體序列。將抗體的VL和VH序列與相應的人的κ輕鏈恆定區和IgG1重鏈恆定區序列進行融合表現，得到重組全人源抗體分子。抗PD-L1的重組全人源IgG抗體列於表23。 表23 抗PD-L1的重組全人源IgG抗體列於表
抗體編號 輕鏈 重鏈 VL VH LCDR1 LCDR2 LCDR3 HCDR1 HCDR2 HCDR3
PR000265 245 211 203 170 135 146 160 15 52 98
PR000151 241 207 199 166 131 143 156 14 48 94
本實施例使用的抗4-1BB的全人源IgG抗體PR000197和PR000448來源於Harbour H2L2小鼠，其發現過程如實施例1所述。
本實施例使用的抗4-1BB的全人源HCAb抗體PR001758、PR001760和PR001836來源於Harbour HCAB小鼠，其發現過程如實施例2所述。
在本實施例及後續實施例中，陽性對照分子為抗PD-L1的IgG單抗PR000265。
在本實施例及後續實施例中，陽性對照分子為抗4-1BB的IgG單抗Uremulab和Utomilumab。實施例 4.1.1. 利用抗 PD-L1 的 IgG 抗體和抗 4-1BB 的 IgG 抗體建構具有 FIT-Ig 結構的雙特異性抗體分子
本實施例利用抗PD-L1的IgG抗體PR000265或PR000151 (atezolizumab類似物)的抗原結合結構域Fab，和抗4-1BB的IgG抗體PR000197或PR000448的抗原結合結構域Fab，來建構具有FIT-Ig結構的抗PD-L1 × 4-1BB的雙特異性抗體分子。FIT-Ig結構的設計可以參考專利WO2015/103072A1，結構見圖23A所示。
所建構的分子總結於表24；並按照實施例1和2所述方法製備抗體分子樣品並進行分析，總結於表25。表26列出了所述FIT-Ig結構的雙抗分子的多肽鏈序列對應的序列編號。 表24 具有FIT-Ig結構的PD-L1 × 4-1BB雙抗分子
雙抗分子 PDL1 抗體 (Fab A) 4-1BB 抗體 (Fab B) 4-1BB Fab 位置 連接胜肽 (CL 和VH_B 之間) Fc 類型( 突變)
PR000701 PR000265 PR000197 靠近 Fc 無 人IgG4
PR003052 atezolizumab PR000448 靠近 Fc 無 人IgG4
表25 FIT-Ig結構的PD-L1 × 4-1BB雙抗分子蛋白的表現
雙抗分子 表現系統和體積 第一步純化後產量(mg/L) SEC-HPLC 純度(%)
PR000701 HEK293-F (30ml) 198 79.88
PR003052 HEK293-6E (40ml) 47.5 87.76
表26 FIT-Ig結構的PD-L1 × 4-1BB雙抗分子的序列編號表
抗體編號 多肽鏈1 多肽鏈2 多肽鏈3
PR000701 250 249 246
PR003052 267 266 246
實施例 4.1.2. 利用抗 PD-L1 的 IgG 抗體和抗 4-1BB 的 HCAb 抗體建構 Fab-HCAb 結構的雙特異性抗體分子
本實施例利用抗PD-L1的IgG抗體PR000265的抗原結合結構域Fab，和抗4-1BB的HCAb抗體PR001758、PR001760或PR001836的抗原結合結構域VH，來建構多種結構的抗PD-L1 × 4-1BB的雙特異性抗體分子。
在本實施例及後續實施例中，陽性對照分子為抗PD-L1的IgG單抗PR000265，亦為PD-L1 × 4-1BB雙抗分子的PD-L1端的親代單抗。
在本實施例及後續實施例中，陽性對照分子為抗4-1BB的IgG單抗urelumab (IgG4)或utomilumab (IgG2)。
如圖23B和圖23C所示，Fab端來源於本實施例利用抗PD-L1的IgG抗體。VH端來源於抗4-1BB的HCAb抗體PR001758、PR001760或PR001836的抗原結合結構域VH。CL是輕鏈恆定區結構域。CH1、CH2和CH3分別是重鏈恆定區的第一、第二和第三結構域。L1和L2分別是第一和第二連接胜肽。Fab(CL)-VH-Fc
圖23B結構的結合蛋白包含兩條多肽鏈：多肽鏈1，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CH1；多肽鏈2，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL-L1-VH_B-L2-CH2-CH3。在結構 Fab(CL)-VH-Fc中，抗體A的VL_A和重鏈抗體B的VH_B融合在同一條多肽鏈上，這樣可以避免VL_A和VH_B的締合產生的錯配副產物。
多肽鏈2的VH_B經由連接胜肽L2聯結到CH2；L2可以是IgG的樞紐區或者樞紐區衍生的連接胜肽序列；L2可以是表17中所列序列，優選為人IgG1樞紐或者人IgG1樞紐(C220S) 或者G5-LH的序列。
在一個實施方案中，多肽鏈2的CL與VH_B直接融合聯結，即L1的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的CL經由連接胜肽L1聯結到VH_B；L1可以是表17中所列序列。Fab(CH1)-VH-Fc
圖23C結構的結合蛋白包含兩條多肽鏈：多肽鏈1，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL；多肽鏈2，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CH1-L1-VH_B-L2-CH2-CH3。
多肽鏈2的VH_B經由連接胜肽L2聯結到CH2；L2可以是IgG的樞紐區或者樞紐區衍生的連接胜肽序列；L2可以是表17中所列序列，優選為人IgG1樞紐或者人IgG1樞紐(C220S)或者G5-LH的序列。
在一個實施方案中，多肽鏈2的CH1與VH_B直接融合聯結，即L1的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的CH1經由連接胜肽L1聯結到VH_B；L1可以是表17中所列序列。
利用抗PD-L1的IgG抗體和抗4-1BB的重鏈抗體，設計Fab-HCAb 對稱結構的PD-L1 × 4-1BB雙抗分子，總結於表27；製備的雙抗分子理化性質分析，總結於表28。 表27 Fab-HCAb對稱結構的PD-L1 × 4-1BB雙抗分子
雙抗分子 PD-L1 抗體 (Fab) 4-1BB 抗體 (VH_B) 第一連接胜肽 (Fab 和 VH_B 之間 ) 第二連接胜肽 (VH_B 和 CH2 之間 ) Fc 類型 ( 突變 )
PR004270 PR000265 PR001760 H1_15 人IgG1樞紐(C220S) 人IgG1 (L234A,L235A)
表28 Fab-HCAb對稱結構的PD-L1 × 4-1BB雙抗分子蛋白的表現
雙抗分子 表現系統和體積 質體轉染比例 ( 短鏈 : 長鏈 ) 第一步純化後產量 (mg/L) SEC-HPLC 純度 (%)
PR004270 HEK293-6E (40ml) 3 : 2 77.50 92.33
實施例 4.1.3. 建構 IgG-VH 四價對稱結構分子
利用抗PD-L1的IgG抗體和抗4-1BB的重鏈抗體，按照實施例3.1.1所述結構設計IgG-VH 四價對稱結構的PD-L1 × 4-1BB雙抗分子(圖23D)，
或者將抗4-1BB HCAb抗體的VH透過連接胜肽連接到PD-L1 IgG抗體的重鏈的N端(圖23E所示)。圖23E結構的結合蛋白包含兩條不同的多肽鏈：多肽鏈1，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL；多肽鏈2，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_B-L-VH_A-CH1-h-CH2-CH3。在一個實施方案中，多肽鏈2的VH_B與VH_A直接融合聯結，即L的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的VH_B經由連接胜肽L聯結到VH_A；L可以是表17中所列序列。
利用抗PD-L1的IgG抗體和抗4-1BB的重鏈抗體，設計IgG-VH 對稱結構的PD-L1 × 4-1BB雙抗分子，總結於表29；製備的雙抗分子理化性質分析，總結於表30。 表29 IgG-VH四價對稱結構的PD-L1 × 4-1BB 雙抗分子
雙抗分子 PD-L1 抗體 (IgG) 4-1BB 抗體 (VH_B) VH_B 相對 IgG 位置 連接胜肽 (VH_B 和 IgG 之間 ) Fc 類型 ( 突變 )
PR003549 PR000265 PR001758 重鏈C端 H1_15-RT 人IgG1(L234A,L235A,P329G)
PR003550 PR000265 PR001760 重鏈C端 H1_15-RT 人IgG1(L234A,L235A,P329G)
PR003551 PR000265 PR001836 重鏈C端 H1_15-RT 人IgG1(L234A,L235A,P329G)
PR004268 PR000265 PR001760 重鏈N端 GS_15 人IgG1 (L234A, L235A)
PR007130 PR000265 PR004469 重鏈C端 GS_6 人IgG1(L234A,L235A,G237A)
PR007132 PR000265 PR007286 重鏈C端 GS_6 人IgG1(L234A,L235A,G237A)
PR007133 PR000265 PR007287 重鏈C端 GS_6 人IgG1(L234A,L235A,G237A)
PR007135 PR000265 PR007288 重鏈C端 GS_6 人IgG1(L234A,L235A,G237A)
PR007136 PR000265 PR007289 重鏈C端 GS_6 人IgG1(L234A,L235A,G237A)
PR007137 PR000265 PR007290 重鏈C端 GS_6 人IgG1(L234A,L235A,G237A)
PR007138 PR000265 PR007291 重鏈C端 GS_6 人IgG1(L234A,L235A,G237A)
PR007139 PR000265 PR007292 重鏈C端 GS_6 人IgG1(L234A,L235A,G237A)
PR007141 PR000265 PR007294 重鏈C端 GS_6 人IgG1(L234A,L235A,G237A)
PR007142 PR000265 PR007295 重鏈C端 GS_6 人IgG1(L234A,L235A,G237A)
PR007143 PR000265 PR007296 重鏈C端 GS_6 人IgG1(L234A,L235A,G237A)
PR007145 PR000265 PR007297 重鏈C端 GS_6 人IgG1(L234A,L235A,G237A)
PR007146 PR000265 PR007298 重鏈C端 GS_6 人IgG1(L234A,L235A,G237A)
PR007149 PR000265 PR007300 重鏈C端 GS_6 人IgG1(L234A,L235A,G237A)
表30 IgG-VH四價對稱結構的PD-L1 × 4-1BB雙抗分子蛋白的表現
雙抗分子 表現系統和體積 第一步純化後產量(mg/L) SEC-HPLC 純度(%)
PR003549 HEK293-F (30ml) 24.51 98.31
PR003550 HEK293-F (30ml) 42.16 95.41
PR003551 HEK293-F (30ml) 2.28 99.39
PR004268 HEK293-F (30ml) 31.4 97.94
PR007130 HEK293-F (40ml) 37 95.957
PR007132 HEK293-F (40ml) 36 94.96
PR007133 HEK293-F (40ml) 34 94.452
PR007135 HEK293-F (40ml) 43.8 94.557
PR007136 HEK293-F (40ml) 41.5 88.662
PR007137 HEK293-F (40ml) 23.6 93.763
PR007138 HEK293-F (40ml) 18.8 98.629
PR007139 HEK293-F (40ml) 31 96.865
PR007141 HEK293-F (40ml) 56.5 95.219
PR007142 HEK293-F (40ml) 62 96.848
PR007143 HEK293-F (40ml) 56 95.094
PR007145 HEK293-F (40ml) 64 97.083
PR007146 HEK293-F (40ml) 60 97.014
PR007149 HEK293-F (40ml) 66.5 98.657
實施例 4.1.4.    PD-L1 × 4-1BB 雙抗分子及對照分子序列表
表31列出了本實施例所建構的PD-L1 × 4-1BB 雙抗分子的序列所對應的序號。 表31 本實施例的PD-L1 × 4-1BB雙抗分子的序列編號表
抗體編號 多肽鏈1 多肽鏈2 多肽鏈3
PR000701 250 249 246
PR003052 267 266 246
PR003549 245 268
PR003550 245 269
PR003551 245 270
PR004270 249 272
PR004268 245 271
PR007130 245 369  
PR007132 245 370  
PR007133 245 371  
PR007135 245 372  
PR007136 245 373  
PR007137 245 374  
PR007138 245 375  
PR007139 245 376  
PR007141 245 377  
PR007142 245 378  
PR007143 245 379  
PR007145 245 380  
PR007146 245 381  
PR007149 245 382  
實施例 4.2. 結合高表現人 PD-L1 的細胞
本實施例是為了研究PD-L1 × 4-1BB雙抗分子結合PD-L1的活性。
利用流式細胞術FACS測試抗體分子與高表現人PD-L1的CHO-K1細胞株CHO-K1/hPDL1 (南京金斯瑞，M00543) 或者高表現人PD-L1的MDA-MB-231 (ATCC,HTB-26)的結合能力。具體地，消化CHO-K1/hPDL1細胞或者MDA-MB-231並用完全培養基重新懸浮；將細胞密度調整為1x106 細胞/mL。接著將細胞以100 µL/孔接種於96孔V底盤(Corning,#3894)，4℃下離心5分鐘，棄上清液。隨後將梯度稀釋的抗體分子以100 µL/孔加入96孔盤並混合均勻，抗體分子可以從最高終濃度為200 nM按照3倍濃度梯度稀釋的共12個濃度；hIgG1 iso (CrownBio,#C0001) 作為同型對照。將細胞放置於4℃，避光培育1小時。然後，加入100 µL /孔預冷的FACS緩衝液(含有0.5% BSA的PBS緩衝液)洗滌細胞兩次，4℃下500g離心5分鐘，棄上清液。接著，再加入100 µL/孔螢光二抗[Goat human lgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjunction, Thermo, #A11013, 1 : 1000稀釋]，放置於4℃，避光培育1小時。隨後以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液洗滌細胞兩次，然後於4℃下500 g離心5分鐘，棄上清液。最後，以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液重新懸浮細胞。使用BD FACS CANTOII 流式細胞儀讀取螢光發光訊號值。
應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到抗體對標靶細胞的結合曲線及EC50值等參數。
本實施例中，陽性對照分子為抗PD-L1的單抗PR000265，亦為PD-L1 x 4-1BB雙抗分子的PD-L1端的親代單抗。
圖24A所示，IgG-VH (C端)四價對稱結構的雙抗分子(PR003549, PR003550, PR003551)結合PD-L1的能力與親代單抗PR000265的相似，而且其結合PD-L1的EC50值和MFI最大值略優於FIT-Ig結構的雙抗分子(PR000701, PR003052)。
圖24B中所示，Fab-HCAb對稱結構的雙抗分子PR004270和IgG-VH (N端)四價對稱結構的雙抗分子PR004268結合PD-L1的能力與親代單抗相似，其結合PD-L1的EC50值雖略弱於親代單抗，但是結合的MFI最大值比親代單抗更高。
圖24C-圖24E所示，IgG-VH (C端)四價對稱結構的雙抗分子(PR007130, PR007132, PR007133, PR007135, PR007136, PR007137, PR007138, PR007139, PR007141, PR007142, PR007143, PR007145, PR007146, PR007149)結合PD-L1的能力與親代單抗PR000265的相似。實施例 4.3. 結合過度表現 4-1BB 的 CHO-K1 細胞
本實施例是為了研究PD-L1 × 4-1BB雙抗分子結合4-1BB的活性。
利用流式細胞術FACS測試抗體分子與高表現人4-1BB的CHO-K1細胞株 CHO-K1/hu4-1BB (南京金斯瑞，M00538)和高表現食蟹猴4-1BB的CHO-K1細胞株 CHO-K1/cyno4-1BB (南京金斯瑞，M00569) 等細胞的結合能力。具體地，消化細胞並用完全培養基重新懸浮；將細胞密度調整為2×106 細胞/mL。接著將細胞以100 µL/孔(2×105 細胞/孔)接種於96孔V底盤(Corning, #3894)，4℃下離心5分鐘，棄上清液。隨後將梯度稀釋的抗體分子以100 µL/孔加入96孔盤並混合均勻，抗體分子可以從最高終濃度為200 nM按照3倍濃度梯度稀釋的共12個濃度；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001)作為同型對照。將細胞放置於4℃，避光培育1小時。然後，加入100 µL/孔預冷的FACS緩衝液(含有0.5% BSA的PBS緩衝液)洗滌細胞兩次，4℃下500g離心5分鐘，棄上清液。接著，再加入100 µL/孔螢光二抗[Goat human lgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjunction, Thermo, #A11013, 1 : 1000稀釋]，放置於4℃，避光培育1小時。隨後以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液洗滌細胞兩次，然後於4℃下500 g離心5分鐘，棄上清液。最後，以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液重新懸浮細胞。使用BD FACS CANTOII 流式細胞儀讀取螢光發光訊號值。
應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到抗體對標靶細胞的結合曲線及EC50值等參數。
本實施例中，陽性對照分子為抗4-1BB的單抗Urelumab或tomilumab。實施例 4.3.1. 結合高表現人 4-1BB 的 CHO-K1 細胞 CHO-K1/hu4-1BB
圖25A中所示，IgG-VH (C端)四價對稱結構的雙抗分子(PR003549, PR003550, PR003551)結合人4-1BB的能力優於FIT-Ig結構的雙抗分子(PR000701, PR003052)，而且在MFI最大值上優於陽性對照Urelumab。
圖25B中所示，Fab-HCAb對稱結構的雙抗分子PR004270和IgG-VH (N端)四價對稱結構的雙抗分子PR004268結合人4-1BB的能力在MFI最大值上優於陽性對照Urelumab和Utomilumab。
圖25C到圖25E中所示，IgG-VH (C端)四價對稱結構的雙抗分子(PR007130, PR007132, PR007133, PR007135, PR007136, PR007137, PR007138, PR007139, PR007141, PR007142, PR007143, PR007145, PR007146, PR007149)結合人4-1BB在MFI最大值上優於陽性對照Urelumab。實施例 4.3.2. 結合高表現食蟹猴 4-1BB 的 CHO-K1 細胞 CHO-K1/cyno 4-1BB
圖26A和圖26B中所示，本實施例的雙抗分子可以結合食蟹猴4-1BB，而Urelumab不能。PR004270結合食蟹猴4-1BB的能力在MFI最大值上略優於Utomilumab。實施例 4.4. 高表現 PD-L1 的標靶細胞媒介的 T 細胞的特異性活化
本實施例是為了研究PD-L1 × 4-1BB雙抗分子在標靶細胞的存在是透過結合4-1BB來活化T細胞的活性。標靶細胞可以是不同程度表現PD-L1的細胞，例如高表現人PD-L1的CHO-K1/hPDL1 (南京金斯瑞, M00543)，或者高表現人PD-L1的MDA-MB-231 (ATCC, HTB-26)。效應細胞可以是分離的人PBMC或者T細胞。
具體的，首先以100 µL/孔將0.3 µg/mL抗CD3抗體OKT3 (Thermo, #16-0037-81)包盤於96孔盤(Corning, #3599)。接著，將人T細胞[從人PBMC中用T細胞分選套組(Miltenyi, #130-096-535)分離得到]的密度調整為2×106 細胞/mL，將標靶細胞的密度調整為3×105 細胞/mL，隨後把兩種細胞懸浮液各以50 µL/孔接種於96孔盤，最終效靶比為20:3。然後，以100 µL/孔加入不同濃度的抗體分子，抗體終濃度可以是(10 nM, 1 nM)，或者是20 nM，或者是從最高終濃度為20 nM按照5倍濃度梯度稀釋的共8個濃度，兩個重複孔加入樣品；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001)和hIgG4 iso (CrownBio, # C0045)作為對照。將96孔盤置於37℃，5% CO2 培養箱中培育3天。分別收集培養48小時後和72小時後的上清液液，用IL-2 ELISA套組(Thermo, #88-7025-88) 檢測48小時後的上清液中IL-2濃度，用IFN-γ ELISA套組(Thermo, #88-7316-77)檢測72小時後的上清液中IFN-γ濃度。ELISA檢測方法參照相關套組操作說明。
應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析。
本實施例中，陽性對照分子為抗4-1BB的單抗Urelumab。實施例 4.4.1.    CHO-K1/hPDL1 媒介的 T 細胞特異性活化
圖27A-圖27D中所示，在標靶細胞CHO-K1/hPDL1和T細胞混合的系統中，不依賴於交聯的抗4-1BB單抗Urelumab可以活化T細胞釋放IFN-γ，而依賴於交聯的抗4-1BB單抗(PR000448, PR001758, PR001760, PR001836)則幾乎不能活化T細胞。FIT-Ig結構的雙抗分子(PR003502, PR000701)和IgG-VH 四價對稱結構的雙抗分子(PR003549, PR003550, PR003551，PR004268, PR007130, PR007132, PR007133, PR007135, PR007136, PR007137, PR007138, PR007139, PR007141, PR007142, PR007143, PR007145, PR007146, PR007149)和Fab-HCAb結構的雙抗分子(PR004270)都能夠活化T細胞並釋放細胞激素。這說明雙抗分子對T細胞的活化是依賴於標靶細胞的特異性的活化。而且IgG-VH 四價對稱結構的雙抗分子(PR003549, PR003550, PR007130, PR007132, PR007133, PR007135, PR007136, PR007137, PR007138, PR007139, PR007141, PR007142, PR007143, PR007145, PR007146, PR007149)和Fab-HCAb結構的雙抗分子(PR004270)比FIT-Ig結構的雙抗分子(PR003502, PR000701)能夠引起更高的細胞激素釋放位準，顯示出更強的T細胞活化能力，且優於Urelumab。實施例 4.4.2.    MDA-MB-231 媒介的 T 細胞特異性活化
圖27E中所示，在標靶細胞MDA-MB-231和T細胞混合的系統中，IgG-VH四價對稱結構的雙抗分子(PR003549)和Fab-HCAb結構的雙抗分子(PR004270)有相似的T細胞活化能力；優於FIT-Ig結構的雙抗分子(PR003502, PR000701)。
圖27F和圖27G中所示，在標靶細胞MDA-MB-231和T細胞混合的系統中，IgG-VH四價對稱結構的雙抗分子(PR003549)比Urelumab有更強T細胞活化能力，能更好地促進IFN-γ和IL-2的產生。
圖27H和圖27I中所示，在標靶細胞MDA-MB-231和T細胞混合的系統中，IgG-VH四價對稱結構的雙抗分子(PR007130, PR007132, PR007133, PR007138, PR007139, PR007141, PR007142, PR007143, PR007145, PR007146, PR007149)比Urelumab有相當的T細胞活化能力。實施例 4.5. 混合淋巴細胞反應 (MLR)
本實施例是利用混合淋巴細胞反應(MLR)來研究PD-L1 × 4-1BB雙抗分子對T細胞的活化作用。
第一步，利用CD14 磁珠 (Meltenyi, #130-050-201) 從第一供體PBMC細胞(妙通生物)中分離單核細胞 (monocytes)；具體操作參照相關套組說明書。然後加入50 ng/mL重組人源 IL-4 (PeproTech, #200-02-A)和100 ng/mL重組人源GM-CSF (PeproTech, #300-03-A)，於37℃誘導7天後，獲得未成熟的樹突狀細胞(iDC細胞)。繼續加入1 μg/ml的脂多醣Lipopolysaccharide (LPS, Sigma, #L6529)，誘導24小時後，獲得成熟的樹突狀細胞(mDC細胞)。第二步，利用T細胞分離套組(Meltenyi, #130-096-535)從第二供體PBMC細胞(妙通生物)中分離得到T淋巴細胞。第三步，將獲得的T細胞和mDC細胞按5:1比例接種至96孔盤(1×105 /孔的T細胞和2×104 /孔的mDC細胞)。隨後以50 µL/孔加入不同濃度的抗體分子，抗體終濃度可以是(10 nM, 1 nM)，或者是從最高終濃度為50 nM按照3倍濃度梯度稀釋的共8個濃度，兩個重複孔加入樣品；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001)或者空白孔作為對照。於37℃，5% CO2 培養箱培育5天。第四步，分別收集第3天和第5天的上清液，用IL-2 ELISA套組(Thermo, #88-7025-88)檢測第4天的上清液中IL-2濃度，用IFN-γ ELISA套組(Thermo, #88-7316-77)檢測第5天的上清液中IFN-γ濃度。ELISA檢測方法參照相關套組操作說明。
圖28中所示，在多次獨立的MLR實驗中(不同的供體配對)，抗4-1BB單抗對T細胞的活化作用有限，產生細胞激素的能力很弱；抗PD-L1單抗有較明顯的活化作用。雙抗分子可以進一步提高T細胞的功能。
圖28A到圖28F中所示，IgG-VH 四價對稱結構的雙抗分子(PR003549, PR003550, PR003551, PR007130, PR007132, PR007133, PR007138, PR007139, PR007141, PR007142, PR007143, PR007145, PR007146, PR007149)比母本PD-L1抗體PR000265能夠引起更高的細胞激素釋放位準，顯示出更強的T細胞活化能力，說明雙抗分子優於抗PD-L1單抗；
圖28A和圖28D中所示，IgG-VH四價對稱結構的雙抗分子(PR003549, PR003550, PR003551)比FIT-Ig結構的雙抗分子(PR003502, PR000701)能夠引起更高的細胞激素釋放位準，顯示出更強的T細胞活化能力；而且雙抗分子優於抗PD-L1單抗。
圖28G和圖28H中所示，IgG-VH 四價對稱結構的雙抗分子(PR003549, PR003550)和Fab-HCAb結構的雙抗分子(PR004270)比FIT-Ig結構的雙抗分子(PR003502, PR000701)能夠引起更高的細胞激素釋放位準，顯示出更強的T細胞活化能力。
圖28I到圖28K中所示，IgG-VH四價對稱結構的雙抗分子(PR003549, PR003550，PR003551)和Fab-HCAb結構的雙抗分子(PR004270)顯示出很強的T細胞活化能力。實施例 4.6. 藥代動力學研究
本實施例研究了具有Fab-HCAb對稱結構的PD-L1 × 4-1BB 雙抗分子PR004270在小鼠體內的藥代動力學性能。
實施方法如下：對於每一個測試抗體分子，選取體重18-22克的雌性BALB/c小鼠6隻，按5 mg/kg的劑量透過靜脈注射給與雙特異性抗體。一組3隻於給藥前以及給藥後15分鐘、24小時(1天)、第4天、和第10天採集全血，另一組3隻於只於給藥前以及給藥後5小時、第2天、第7天、和第14天採集全血。將全血靜置30分鐘使其凝固，隨後離心並將分離的血清樣品在-80℃下凍存直至分析。本實施例採用兩種ELISA方法來定量測定小鼠血清中的藥物濃度。ELISA方法一，即Fc端檢測(總體檢測)方法，透過塗覆於96孔盤的山羊抗人Fc多株抗體來捕獲小鼠血清中的含有人Fc的抗體，然後加入HRP標記的山羊抗人Fc第二抗體來檢測；ELISA方法二，即PD-L1端檢測(功能結構域檢測)方法，透過塗覆於96孔盤的人PD-L1蛋白來捕獲小鼠血清中的特異辨識PD-L1的抗體，然後加入HRP標記的山羊抗人Fc第二抗體來檢測。使用Phoenix WinNonlin軟體8.2版，選用非房室模型(NCA)分析藥代動力學參數。
如圖29和表32中所示，Fab-HCAb結構的雙抗分子PR004270有與常規IgG抗體相似的血清半衰期t1/2值，功能結構域檢測方法顯示其t1/2值超過10天。 表32  PR004270 在 BALB/c 小鼠體內的藥代動力學
雙抗分子 PR004270
動物 (數量) BALB/c 小鼠 (n=6)
抗體劑量 5 mg/kg, I.V.
PK 參數 Fc端檢測 PD-L1端檢測
T1/2 (hour) 465.6 256.5
Vd (mL/kg) 75.7 83.9
AUC (µg*hour/mL) 17,536 13,126
Cl (mL/hour/kg) 0.11 0.23
C0 (µg/mL) 119.7 81.7
小結
本實施例利用抗PD-L1的IgG抗體的抗原結合結構域Fab和抗4-1BB的HCAb抗體的抗原結合結構域VH，建構了多種結構的抗PD-L1 × 4-1BB的雙特異性抗體分子。展現出了基於HCAb建構雙特異性抗體分子結構的靈活性，透過不同的結構類型、相對位置、結合價數等參數來調節活化T細胞的功能活性。
Urelumab對T細胞的活化是沒有標的特異性，這是其臨床毒副作用的原因之一。PD-L1 × 4-1BB 雙抗對T細胞活化作用是特異性依賴PD-L1的表現。依賴於交聯的抗4-1BB的HCAb單抗不能直接活化T細胞，但是，利用這些HCAb單抗建構的PD-L1 × 4-1BB雙抗在高表現PD-L1的細胞存在時則可以特異地活化T細胞。
基於HCAb的雙抗結構，尤其是IgG-VH四價對稱結構的雙抗分子和Fab-HCAb結構的雙抗分子，一方面保留了PD-L1端的活性，在MLR實驗中體現出比對應的抗PD-L1親代單抗更強的T細胞活化能力；另一方面標靶細胞上高表現的PD-L1分子可以媒介4-1BB的交聯和三聚化以傳遞T細胞活化信號，其活化T細胞的能力甚至優於Urelumab。而且IgG-VH 四價對稱結構和Fab-HCAb對稱結構的雙抗分子顯示出比FIT-Ig結構的雙抗分子擁有更強的T細胞活化能力。
綜上所述，本實施例建構出了安全性好、功能活性突出、分子穩定性好的PD-L1 x 4-1BB雙特異性抗體分子。
參考文獻： 1. Bertram EM, Lau P, Watts TH. Temporal segregation of 4-1BB versus CD28-mediated costimulation: 4-1BB ligand influences T cell numbers late in the primary response and regulates the size of the T cell memory response following influenza infection. Journal of immunology 2002;168: 3777-85. 2. Kawalekar OU, O'Connor RS, Fraietta JA, et al. Distinct Signaling of Coreceptors Regulates Specific Metabolism Pathways and Impacts Memory Development in CAR T Cells. Immunity 2016;44: 380-90. 3. Ye Z, Hellstrom I, Hayden-Ledbetter M, Dahlin A, Ledbetter JA, Hellstrom KE. Gene therapy for cancer using single-chain Fv fragments specific for 4-1BB. Nature medicine 2002;8: 343-8. 4. Zhang H, Knutson KL, Hellstrom KE, Disis ML, Hellstrom I. Antitumor efficacy of CD137 ligation is maximized by the use of a CD137 single-chain Fv-expressing whole-cell tumor vaccine compared with CD137-specific monoclonal antibody infusion. Molecular cancer therapeutics 2006;5: 149-55. 5 Yang Y, Yang S, Ye Z, et al. Tumor cells expressing anti-CD137 scFv induce a tumor-destructive environment. Cancer research 2007;67: 2339-44. 6. Martinet O, Divino CM, Zang Y, et al. T cell activation with systemic agonistic antibody versus local 4- 1BB ligand gene delivery combined with interleukin-12 eradicate liver metastases of breast cancer. Gene therapy2002;9: 786-92。
圖1A-圖1B：FACS檢測4-1BB H2L2抗體與過度表現人或食蟹猴4-1BB的CHO-K1細胞的結合。
圖2：FACS檢測4-1BB H2L2抗體阻斷4-1BB配體與CHO-K1/人4-1BB細胞結。
圖3A-圖3B：利用HEK293/4-1BB/NF-kb報導基因細胞檢測4-1BB H2L2抗體對4-1BB信號途徑的活化。
圖4：4-1BB H2L2抗體體外活化4-1BB途徑，並誘導活化T細胞分泌IFN-γ。
圖5A-圖5B：4-1BB H2L2抗體體外活化4-1BB途徑，並誘導活化CD8+T細胞，CD4+T細胞分泌IFN-γ。
圖6A-圖6C：4-1BB H2L2抗體PR000448在B6-h4-1BB基因轉殖小鼠MC38皮下結腸癌模型中的抑制腫瘤生長活性。
圖7：PR000448在C57BL/6J小鼠體內的藥代動力學。
圖8A-圖8C：PR000980抗體體外活化4-1BB途徑，並誘導活化T細胞分泌IFN-γ、TNF-α和IL-2。
圖9A-圖9D：BIACORE檢測4-1BB H2L2抗體與人4-1BB蛋白或猴4-1BB蛋白的親和力。
圖10A-圖10B：4-1BB H2L2抗體PR000980在B6-h4-1BB基因轉殖小鼠MC38皮下結腸癌模型中的抑制腫瘤生長活性。
圖11A-圖11M：FACS檢測4-1BB HCAb抗體與過度表現人4-1BB的CHO-K1細胞的結合。
圖12A-圖12L：FACS檢測4-1BB HCAb抗體與過度表現食蟹猴4-1BB的CHO-K1細胞的結合。
圖13A-圖13J：利用HEK293/4-1BB/NF-kb報導基因細胞檢測4-1BB HCAb抗體對4-1BB信號途徑的活化。
圖14A-圖14K：FACS檢測4-1BB HCAb抗體阻斷4-1BB配體與CHO-K1/人4-1BB細胞結合。
圖15A-圖15D：4-1BB HCAb抗體體外活化4-1BB途徑，並誘導活化T細胞分泌IFN-γ。
圖16A-圖16B：在CHO-K1/CD32b交聯或者沒有CHO-K1/CD32b交聯的情況下，4-1BB HCAb抗體體外活化4-1BB途徑，並誘導活化T細胞分泌IFN-γ。
圖17A-圖17D：FACS檢測4-1BB HCAb抗體與CHO-K1/人4-1BB細胞的特異性結合。
圖18A-圖18C：HER2 × 4-1BB雙特異性抗體的結構示意圖。
圖19A-圖19C：FACS檢測HER2 × 4-1BB雙特異性抗體與SK-BR-3細胞的結合。
圖20A-圖20E：FACS檢測HER2 × 4-1BB雙特異性抗體與過度表現人4-1BB的CHO-K1細胞的結合。
圖21A-圖21B：FACS檢測HER2 × 4-1BB雙特異性抗體與過度表現食蟹猴4-1BB的CHO-K1細胞的結合。
圖22A-圖22D：HER2 × 4-1BB雙特異性抗體在SK-BR-3細胞的交聯下，體外活化4-1BB途徑，並誘導活化T細胞分泌IFN-γ。
圖23A-圖23E：PD-L1 × 4-1BB雙特異性抗體的結構示意圖。
圖24A-圖24E：FACS檢測PD-L1 × 4-1BB雙特異性抗體與CHO-K1/hPD-L1細胞的結合。
圖25A-圖25E：FACS檢測PD-L1 ×  4-1BB雙特異性抗體與過度表現人4-1BB的CHO-K1細胞的結合。
圖26A-圖26B：FACS檢測PD-L1 × 4-1BB雙特異性抗體與過度表現食蟹猴4-1BB的CHO-K1細胞的結合。
圖27A-圖27I：PD-L1 × 4-1BB雙特異性抗體在CHO-K1/hPD-L1或MDA-MB-231細胞的交聯下，體外活化4-1BB途徑，並誘導活化T細胞分泌IFN-γ。
圖28A-圖28K：利用混合淋巴細胞反應(MLR)來研究PD-L1 × 4-1BB雙抗分子對T細胞的活化作用。
圖29：PD-L1 × 4-1BB雙特異性抗體在C57BL/6J小鼠體內的藥代動力學。
<110> 大陸商諾納生物(蘇州)有限公司(Nona Biosciences(Suzhou)Co.,Ltd.)
<120> 一種4-1BB結合蛋白及其應用
<140> TW110123890
<141> 2021-06-29
<150> CN202010619500.9
<151> 2020-06-30
<160> 382
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 1
Figure 110123890-A0305-02-0120-18
<210> 2
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 2
Figure 110123890-A0305-02-0121-19
<210> 3
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000197 HFWR1 Chothia,PR000447 HFWR1 Chothia,PR000448 HFWR1 Chothia
<400> 3
Figure 110123890-A0305-02-0121-20
<210> 4
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 110123890-A0305-02-0122-21
<210> 5
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 5
Figure 110123890-A0305-02-0122-22
<210> 6
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001759 HFWR1 Chothia,PR001764 HFWR1 Chothia,PR001766 HFWR1 Chothia
<400> 6
Figure 110123890-A0305-02-0123-23
<210> 7
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 7
Figure 110123890-A0305-02-0123-24
<210> 8
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001763 HFWR1 Chothia,PR001830 HFWR1 Chothia
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Figure 110123890-A0305-02-0124-25
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 110123890-A0305-02-0124-26
<210> 10
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001775 HFWR1 Chothia
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Figure 110123890-A0305-02-0125-27
<210> 11
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 11
Figure 110123890-A0305-02-0125-28
<210> 12
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001831 HFWR1 Chothia
<400> 12
Figure 110123890-A0305-02-0126-29
<210> 13
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001837 HFWR1 Chothia
<400> 13
Figure 110123890-A0305-02-0126-30
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 14
Figure 110123890-A0305-02-0127-31
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000196 HCDR1 Chothia,PR000265 HCDR1 Chothia,PR001759 HCDR1 Chothia
<400> 15
Figure 110123890-A0305-02-0127-32
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000197 HCDR1 Chothia,PR000447 HCDR1 Chothia,PR000448 HCDR1 Chothia
<400> 16
Figure 110123890-A0305-02-0128-33
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000210 HCDR1 Chothia
<400> 17
Figure 110123890-A0305-02-0128-34
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 110123890-A0305-02-0129-35
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001758 HCDR1 Chothia
<400> 19
Figure 110123890-A0305-02-0129-36
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001760 HCDR1 Chothia,PR001763 HCDR1 Chothia,PR001768 HCDR1 Chothia
<400> 20
Figure 110123890-A0305-02-0129-11
Figure 110123890-A0305-02-0130-1
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001767 HCDR1 Chothia
<400> 21
Figure 110123890-A0305-02-0130-37
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001774 HCDR1 Chothia,PR001780 HCDR1 Chothia
<400> 22
Figure 110123890-A0305-02-0130-38
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001834 HCDR1 Chothia
<400> 23
Figure 110123890-A0305-02-0131-40
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001836 HCDR1 Chothia
<400> 24
Figure 110123890-A0305-02-0131-41
<210> 25
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000151 HFWR2 Chothia
<400> 25
Figure 110123890-A0305-02-0132-42
<210> 26
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000196 HFWR2 Chothia
<400> 26
Figure 110123890-A0305-02-0132-44
<210> 27
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000197 HFWR2 Chothia,PR000447 HFWR2 Chothia,PR000448 HFWR2 Chothia
<400> 27
Figure 110123890-A0305-02-0133-45
<210> 28
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000210 HFWR2 Chothia
<400> 28
Figure 110123890-A0305-02-0133-46
<210> 29
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000265 HFWR2 Chothia
<400> 29
Figure 110123890-A0305-02-0134-47
<210> 30
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000483 HFWR2 Chothia
<400> 30
Figure 110123890-A0305-02-0134-48
<210> 31
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000628 HFWR2 Chothia
<400> 31
Figure 110123890-A0305-02-0135-49
<210> 32
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001758 HFWR2 Chothia,PR001760 HFWR2 Chothia,PR001781 HFWR2 Chothia
<400> 32
Figure 110123890-A0305-02-0135-50
<210> 33
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001759 HFWR2 Chothia
<400> 33
Figure 110123890-A0305-02-0136-51
<210> 34
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001763 HFWR2 Chothia,PR001830 HFWR2 Chothia,PR001831 HFWR2 Chothia
<400> 34
Figure 110123890-A0305-02-0136-53
<210> 35
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001764 HFWR2 Chothia,PR001776 HFWR2 Chothia
<400> 35
Figure 110123890-A0305-02-0137-54
<210> 36
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001766 HFWR2 Chothia
<400> 36
Figure 110123890-A0305-02-0137-55
<210> 37
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001767 HFWR2 Chothia
<400> 37
Figure 110123890-A0305-02-0138-56
<210> 38
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001768 HFWR2 Chothia
<400> 38
Figure 110123890-A0305-02-0138-57
<210> 39
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001771 HFWR2 Chothia
<400> 39
Figure 110123890-A0305-02-0139-58
<210> 40
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001774 HFWR2 Chothia
<400> 40
Figure 110123890-A0305-02-0139-59
<210> 41
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001775 HFWR2 Chothia
<400> 41
Figure 110123890-A0305-02-0140-60
<210> 42
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001780 HFWR2 Chothia
<400> 42
Figure 110123890-A0305-02-0140-61
<210> 43
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001834 HFWR2 Chothia
<400> 43
Figure 110123890-A0305-02-0141-62
<210> 44
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001836 HFWR2 Chothia
<400> 44
Figure 110123890-A0305-02-0141-63
<210> 45
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001838 HFWR2 Chothia,PR004469 HFWR2 Chothia
<400> 45
Figure 110123890-A0305-02-0142-65
<210> 46
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001840 HFWR2 Chothia
<400> 46
Figure 110123890-A0305-02-0142-66
<210> 47
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001842 HFWR2 Chothia
<400> 47
Figure 110123890-A0305-02-0143-67
<210> 48
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000151 HCDR2 Chothia
<400> 48
Figure 110123890-A0305-02-0143-68
<210> 49
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000196 HCDR2 Chothia,PR001781 HCDR2 Chothia
<400> 49
Figure 110123890-A0305-02-0144-69
<210> 50
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000197 HCDR2 Chothia
<400> 50
Figure 110123890-A0305-02-0144-70
<210> 51
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000210 HCDR2 Chothia
<400> 51
Figure 110123890-A0305-02-0144-12
Figure 110123890-A0305-02-0145-2
<210> 52
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000265 HCDR2 Chothia
<400> 52
Figure 110123890-A0305-02-0145-71
<210> 53
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000447 HCDR2 Chothia
<400> 53
Figure 110123890-A0305-02-0145-72
<210> 54
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000448 HCDR2 Chothia,PR000980 HCDR2 Chothia
<400> 54
Figure 110123890-A0305-02-0146-73
<210> 55
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000483 HCDR2 Chothia
<400> 55
Figure 110123890-A0305-02-0146-74
<210> 56
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000628 HCDR2 Chothia
<400> 56
Figure 110123890-A0305-02-0147-75
<210> 57
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001758 HCDR2 Chothia
<400> 57
Figure 110123890-A0305-02-0147-76
<210> 58
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001759 HCDR2 Chothia
<400> 58
Figure 110123890-A0305-02-0147-77
<210> 59
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001760 HCDR2 Chothia
<400> 59
Figure 110123890-A0305-02-0148-78
<210> 60
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001763 HCDR2 Chothia,PR001766 HCDR2 Chothia,PR001771 HCDR2 Chothia
<400> 60
Figure 110123890-A0305-02-0148-79
<210> 61
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001764 HCDR2 Chothia
<400> 61
Figure 110123890-A0305-02-0149-82
<210> 62
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001767 HCDR2 Chothia
<400> 62
Figure 110123890-A0305-02-0149-81
<210> 63
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001768 HCDR2 Chothia,PR001831 HCDR2 Chothia
<400> 63
Figure 110123890-A0305-02-0150-83
<210> 64
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001774 HCDR2 Chothia
<400> 64
Figure 110123890-A0305-02-0150-84
<210> 65
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001776 HCDR2 Chothia
<400> 65
Figure 110123890-A0305-02-0150-85
<210> 66
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001780 HCDR2 Chothia
<400> 66
Figure 110123890-A0305-02-0151-86
<210> 67
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001834 HCDR2 Chothia
<400> 67
Figure 110123890-A0305-02-0151-87
<210> 68
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001836 HCDR2 Chothia
<400> 68
Figure 110123890-A0305-02-0152-88
<210> 69
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001838 HCDR2 Chothia
<400> 69
Figure 110123890-A0305-02-0152-89
<210> 70
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001840 HCDR2 Chothia
<400> 70
Figure 110123890-A0305-02-0152-90
<210> 71
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR004469 HCDR2 Chothia,PR007381 HCDR2 Chothia
<400> 71
Figure 110123890-A0305-02-0153-91
<210> 72
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000151 HFWR3 Chothia
<400> 72
Figure 110123890-A0305-02-0153-92
<210> 73
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000196 HFWR3 Chothia
<400> 73
Figure 110123890-A0305-02-0154-93
<210> 74
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000197 HFWR3 Chothia,PR000447 HFWR3 Chothia,PR000448 HFWR3 Chothia
<400> 74
Figure 110123890-A0305-02-0154-94
Figure 110123890-A0305-02-0155-95
<210> 75
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000210 HFWR3 Chothia
<400> 75
Figure 110123890-A0305-02-0155-96
<210> 76
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000265 HFWR3 Chothia
<400> 76
Figure 110123890-A0305-02-0156-97
<210> 77
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000483 HFWR3 Chothia
<400> 77
Figure 110123890-A0305-02-0156-98
<210> 78
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000628 HFWR3 Chothia
<400> 78
Figure 110123890-A0305-02-0157-99
<210> 79
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001758 HFWR3 Chothia
<400> 79
Figure 110123890-A0305-02-0157-100
Figure 110123890-A0305-02-0158-101
<210> 80
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001759 HFWR3 Chothia,PR001766 HFWR3 Chothia,PR001768 HFWR3 Chothia
<400> 80
Figure 110123890-A0305-02-0158-102
<210> 81
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001760 HFWR3 Chothia
<400> 81
Figure 110123890-A0305-02-0159-103
<210> 82
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001763 HFWR3 Chothia
<400> 82
Figure 110123890-A0305-02-0159-104
<210> 83
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001764 HFWR3 Chothia
<400> 83
Figure 110123890-A0305-02-0160-105
<210> 84
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001767 HFWR3 Chothia
<400> 84
Figure 110123890-A0305-02-0160-106
Figure 110123890-A0305-02-0161-107
<210> 85
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001774 HFWR3 Chothia
<400> 85
Figure 110123890-A0305-02-0161-108
<210> 86
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001775 HFWR3 Chothia
<400> 86
Figure 110123890-A0305-02-0162-109
<210> 87
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001780 HFWR3 Chothia
<400> 87
Figure 110123890-A0305-02-0162-110
<210> 88
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001830 HFWR3 Chothia,PR001833 HFWR3 Chothia
<400> 88
Figure 110123890-A0305-02-0163-111
<210> 89
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001831 HFWR3 Chothia
<400> 89
Figure 110123890-A0305-02-0163-112
<210> 90
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001834 HFWR3 Chothia,PR001837 HFWR3 Chothia
<400> 90
Figure 110123890-A0305-02-0164-113
<210> 91
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001836 HFWR3 Chothia
<400> 91
Figure 110123890-A0305-02-0164-114
Figure 110123890-A0305-02-0165-115
<210> 92
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001840 HFWR3 Chothia
<400> 92
Figure 110123890-A0305-02-0165-116
<210> 93
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001842 HFWR3 Chothia
<400> 93
Figure 110123890-A0305-02-0166-117
<210> 94
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000151 HCDR3 Chothia
<400> 94
Figure 110123890-A0305-02-0166-118
<210> 95
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000196 HCDR3 Chothia
<400> 95
Figure 110123890-A0305-02-0167-119
<210> 96
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000197 HCDR3 Chothia,PR000447 HCDR3 Chothia,PR000448 HCDR3 Chothia
<400> 96
Figure 110123890-A0305-02-0167-120
<210> 97
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000210 HCDR3 Chothia
<400> 97
Figure 110123890-A0305-02-0168-122
<210> 98
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000265 HCDR3 Chothia
<400> 98
Figure 110123890-A0305-02-0168-123
<210> 99
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000483 HCDR3 Chothia
<400> 99
Figure 110123890-A0305-02-0168-124
<210> 100
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000628 HCDR3 Chothia
<400> 100
Figure 110123890-A0305-02-0169-125
<210> 101
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001758 HCDR3 Chothia
<400> 101
Figure 110123890-A0305-02-0169-126
<210> 102
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001759 HCDR3 Chothia
<400> 102
Figure 110123890-A0305-02-0170-127
<210> 103
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001760 HCDR3 Chothia,PR001830 HCDR3 Chothia,PR001836 HCDR3 Chothia
<400> 103
Figure 110123890-A0305-02-0170-128
<210> 104
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001763 HCDR3 Chothia,PR001831 HCDR3 Chothia
<400> 104
Figure 110123890-A0305-02-0171-129
<210> 105
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001764 HCDR3 Chothia,PR001834 HCDR3 Chothia,PR001837 HCDR3 Chothia
<400> 105
Figure 110123890-A0305-02-0171-130
<210> 106
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001766 HCDR3 Chothia
<400> 106
Figure 110123890-A0305-02-0171-132
Figure 110123890-A0305-02-0172-3
<210> 107
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001767 HCDR3 Chothia
<400> 107
Figure 110123890-A0305-02-0172-133
<210> 108
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001768 HCDR3 Chothia,PR001771 HCDR3 Chothia
<400> 108
Figure 110123890-A0305-02-0172-134
<210> 109
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001774 HCDR3 Chothia
<400> 109
Figure 110123890-A0305-02-0173-135
<210> 110
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001775 HCDR3 Chothia
<400> 110
Figure 110123890-A0305-02-0173-136
<210> 111
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001776 HCDR3 Chothia
<400> 111
Figure 110123890-A0305-02-0174-137
<210> 112
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001780 HCDR3 Chothia
<400> 112
Figure 110123890-A0305-02-0174-138
<210> 113
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001781 HCDR3 Chothia
<400> 113
Figure 110123890-A0305-02-0174-139
Figure 110123890-A0305-02-0175-4
<210> 114
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001833 HCDR3 Chothia
<400> 114
Figure 110123890-A0305-02-0175-140
<210> 115
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001838 HCDR3 Chothia,PR004469 HCDR3 Chothia,PR007381 HCDR3 Chothia
<400> 115
Figure 110123890-A0305-02-0175-141
<210> 116
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001840 HCDR3 Chothia
<400> 116
Figure 110123890-A0305-02-0176-142
<210> 117
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001842 HCDR3 Chothia
<400> 117
Figure 110123890-A0305-02-0176-143
<210> 118
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000151 HFWR4 Chothia,PR000197 HFWR4 Chothia,PR000210 HFWR4 Chothia
<400> 118
Figure 110123890-A0305-02-0177-144
<210> 119
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000196 HFWR4 Chothia,PR001758 HFWR4 Chothia,PR001759 HFWR4 Chothia
<400> 119
Figure 110123890-A0305-02-0177-145
<210> 120
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000265 HFWR4 Chothia,PR007295 HFWR4 Chothia
<400> 120
Figure 110123890-A0305-02-0178-147
<210> 121
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000628 HFWR4 Chothia
<400> 121
Figure 110123890-A0305-02-0178-148
<210> 122
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001767 HFWR4 Chothia
<400> 122
Figure 110123890-A0305-02-0178-149
<210> 123
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001831 HFWR4 Chothia
<400> 123
Figure 110123890-A0305-02-0179-150
<210> 124
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000151 LFWR1 Chothia,PR000210 LFWR1 Chothia
<400> 124
Figure 110123890-A0305-02-0179-151
<210> 125
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000196 LFWR1 Chothia
<400> 125
Figure 110123890-A0305-02-0180-153
<210> 126
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000197 LFWR1 Chothia
<400> 126
Figure 110123890-A0305-02-0180-154
<210> 127
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000265 LFWR1 Chothia
<400> 127
Figure 110123890-A0305-02-0181-155
<210> 128
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000447 LFWR1 Chothia,PR000448 LFWR1 Chothia,PR000980 LFWR1 Chothia
<400> 128
Figure 110123890-A0305-02-0181-156
<210> 129
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000483 LFWR1 Chothia
<400> 129
Figure 110123890-A0305-02-0182-157
<210> 130
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000628 LFWR1 Chothia
<400> 130
Figure 110123890-A0305-02-0182-158
<210> 131
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000151 LCDR1 Chothia
<400> 131
Figure 110123890-A0305-02-0183-159
<210> 132
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000196 LCDR1 Chothia
<400> 132
Figure 110123890-A0305-02-0183-160
<210> 133
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000197 LCDR1 Chothia,PR000447 LCDR1 Chothia,PR000448 LCDR1 Chothia
<400> 133
Figure 110123890-A0305-02-0184-161
<210> 134
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000210 LCDR1 Chothia
<400> 134
Figure 110123890-A0305-02-0184-162
<210> 135
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000265 LCDR1 Chothia
<400> 135
Figure 110123890-A0305-02-0184-163
Figure 110123890-A0305-02-0185-5
<210> 136
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000483 LCDR1 Chothia
<400> 136
Figure 110123890-A0305-02-0185-164
<210> 137
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000628 LCDR1 Chothia
<400> 137
Figure 110123890-A0305-02-0185-165
<210> 138
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000151 LFWR2 Chothia,PR000210 LFWR2 Chothia
<400> 138
Figure 110123890-A0305-02-0186-166
<210> 139
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000196 LFWR2 Chothia
<400> 139
Figure 110123890-A0305-02-0186-167
<210> 140
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000197 LFWR2 Chothia,PR000447 LFWR2 Chothia,PR000448 LFWR2 Chothia
<400> 140
Figure 110123890-A0305-02-0187-168
<210> 141
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000265 LFWR2 Chothia
<400> 141
Figure 110123890-A0305-02-0187-169
<210> 142
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000483 LFWR2 Chothia
<400> 142
Figure 110123890-A0305-02-0187-170
<210> 143
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000151 LCDR2 Chothia,PR000210 LCDR2 Chothia
<400> 143
Figure 110123890-A0305-02-0188-171
<210> 144
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000196 LCDR2 Chothia
<400> 144
Figure 110123890-A0305-02-0188-172
<210> 145
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000197 LCDR2 Chothia,PR000447 LCDR2 Chothia,PR000448 LCDR2 Chothia
<400> 145
Figure 110123890-A0305-02-0189-173
<210> 146
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000265 LCDR2 Chothia
<400> 146
Figure 110123890-A0305-02-0189-174
<210> 147
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000483 LCDR2 Chothia
<400> 147
Figure 110123890-A0305-02-0190-175
<210> 148
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000628 LCDR2 Chothia
<400> 148
Figure 110123890-A0305-02-0190-176
<210> 149
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000151 LFWR3 Chothia
<400> 149
Figure 110123890-A0305-02-0190-177
Figure 110123890-A0305-02-0191-6
<210> 150
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000196 LFWR3 Chothia
<400> 150
Figure 110123890-A0305-02-0191-178
<210> 151
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000197 LFWR3 Chothia,PR000447 LFWR3 Chothia,PR000448 LFWR3 Chothia
<400> 151
Figure 110123890-A0305-02-0191-179
Figure 110123890-A0305-02-0192-180
<210> 152
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000210 LFWR3 Chothia
<400> 152
Figure 110123890-A0305-02-0192-181
<210> 153
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000265 LFWR3 Chothia
<400> 153
Figure 110123890-A0305-02-0192-182
Figure 110123890-A0305-02-0193-183
<210> 154
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000483 LFWR3 Chothia
<400> 154
Figure 110123890-A0305-02-0193-184
<210> 155
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000628 LFWR3 Chothia
<400> 155
Figure 110123890-A0305-02-0193-185
Figure 110123890-A0305-02-0194-186
<210> 156
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000151 LCDR3 Chothia
<400> 156
Figure 110123890-A0305-02-0194-187
<210> 157
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000196 LCDR3 Chothia
<400> 157
Figure 110123890-A0305-02-0194-188
<210> 158
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000197 LCDR3 Chothia,PR000447 LCDR3 Chothia,PR000448 LCDR3 Chothia
<400> 158
Figure 110123890-A0305-02-0195-189
<210> 159
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000210 LCDR3 Chothia
<400> 159
Figure 110123890-A0305-02-0195-190
<210> 160
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000265 LCDR3 Chothia
<400> 160
Figure 110123890-A0305-02-0196-192
<210> 161
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000483 LCDR3 Chothia
<400> 161
Figure 110123890-A0305-02-0196-193
<210> 162
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000628 LCDR3 Chothia
<400> 162
Figure 110123890-A0305-02-0196-13
Figure 110123890-A0305-02-0197-7
<210> 163
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000151 LFWR4 Chothia,PR000210 LFWR4 Chothia,PR000265 LFWR4 Chothia
<400> 163
Figure 110123890-A0305-02-0197-194
<210> 164
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000196 LFWR4 Chothia,PR000197 LFWR4 Chothia,PR000447 LFWR4 Chothia
<400> 164
Figure 110123890-A0305-02-0197-195
<210> 165
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000483 LFWR4 Chothia
<400> 165
Figure 110123890-A0305-02-0198-196
<210> 166
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000151 VH
<400> 166
Figure 110123890-A0305-02-0198-197
Figure 110123890-A0305-02-0199-198
<210> 167
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000196 VH
<400> 167
Figure 110123890-A0305-02-0199-200
Figure 110123890-A0305-02-0200-201
<210> 168
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000197 VH
<400> 168
Figure 110123890-A0305-02-0200-202
Figure 110123890-A0305-02-0201-203
<210> 169
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000210 VH
<400> 169
Figure 110123890-A0305-02-0201-204
Figure 110123890-A0305-02-0202-205
<210> 170
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000265 VH
<400> 170
Figure 110123890-A0305-02-0202-206
Figure 110123890-A0305-02-0203-207
<210> 171
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000447 VH
<400> 171
Figure 110123890-A0305-02-0203-208
Figure 110123890-A0305-02-0204-209
<210> 172
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000448 VH,PR000980 VH
<400> 172
Figure 110123890-A0305-02-0204-210
Figure 110123890-A0305-02-0205-211
<210> 173
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000483 VH
<400> 173
Figure 110123890-A0305-02-0205-213
Figure 110123890-A0305-02-0206-214
<210> 174
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000628 VH
<400> 174
Figure 110123890-A0305-02-0206-215
Figure 110123890-A0305-02-0207-216
<210> 175
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001758 VH
<400> 175
Figure 110123890-A0305-02-0207-218
Figure 110123890-A0305-02-0208-219
<210> 176
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001759 VH
<400> 176
Figure 110123890-A0305-02-0208-220
Figure 110123890-A0305-02-0209-221
<210> 177
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001760 VH
<400> 177
Figure 110123890-A0305-02-0209-222
Figure 110123890-A0305-02-0210-223
<210> 178
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001763 VH
<400> 178
Figure 110123890-A0305-02-0210-224
Figure 110123890-A0305-02-0211-225
<210> 179
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001764 VH
<400> 179
Figure 110123890-A0305-02-0211-226
Figure 110123890-A0305-02-0212-227
<210> 180
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001766 VH
<400> 180
Figure 110123890-A0305-02-0212-229
Figure 110123890-A0305-02-0213-230
<210> 181
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001767 VH
<400> 181
Figure 110123890-A0305-02-0213-231
Figure 110123890-A0305-02-0214-232
<210> 182
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001768 VH
<400> 182
Figure 110123890-A0305-02-0214-233
Figure 110123890-A0305-02-0215-234
<210> 183
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001771 VH
<400> 183
Figure 110123890-A0305-02-0215-235
Figure 110123890-A0305-02-0216-236
<210> 184
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001774 VH
<400> 184
Figure 110123890-A0305-02-0216-238
Figure 110123890-A0305-02-0217-239
<210> 185
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001775 VH
<400> 185
Figure 110123890-A0305-02-0217-240
Figure 110123890-A0305-02-0218-241
<210> 186
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001776 VH
<400> 186
Figure 110123890-A0305-02-0218-242
Figure 110123890-A0305-02-0219-244
<210> 187
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001780 VH
<400> 187
Figure 110123890-A0305-02-0219-247
Figure 110123890-A0305-02-0220-248
<210> 188
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001781 VH
<400> 188
Figure 110123890-A0305-02-0220-249
Figure 110123890-A0305-02-0221-250
<210> 189
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001830 VH
<400> 189
Figure 110123890-A0305-02-0221-251
Figure 110123890-A0305-02-0222-252
<210> 190
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001831 VH
<400> 190
Figure 110123890-A0305-02-0222-253
Figure 110123890-A0305-02-0223-254
<210> 191
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001833 VH
<400> 191
Figure 110123890-A0305-02-0223-255
Figure 110123890-A0305-02-0224-257
<210> 192
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001834 VH
<400> 192
Figure 110123890-A0305-02-0224-258
Figure 110123890-A0305-02-0225-259
<210> 193
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001836 VH
<400> 193
Figure 110123890-A0305-02-0225-260
Figure 110123890-A0305-02-0226-261
<210> 194
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001837 VH
<400> 194
Figure 110123890-A0305-02-0226-262
Figure 110123890-A0305-02-0227-263
<210> 195
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001838 VH
<400> 195
Figure 110123890-A0305-02-0227-264
Figure 110123890-A0305-02-0228-266
<210> 196
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001840 VH
<400> 196
Figure 110123890-A0305-02-0228-267
Figure 110123890-A0305-02-0229-268
<210> 197
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001842 VH
<400> 197
Figure 110123890-A0305-02-0229-269
Figure 110123890-A0305-02-0230-271
<210> 198
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR004469 VH
<400> 198
Figure 110123890-A0305-02-0230-272
Figure 110123890-A0305-02-0231-273
<210> 199
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000151 VL
<400> 199
Figure 110123890-A0305-02-0231-274
Figure 110123890-A0305-02-0232-275
<210> 200
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000196 VL
<400> 200
Figure 110123890-A0305-02-0232-276
Figure 110123890-A0305-02-0233-278
<210> 201
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000197 VL
<400> 201
Figure 110123890-A0305-02-0233-279
Figure 110123890-A0305-02-0234-281
<210> 202
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000210 VL
<400> 202
Figure 110123890-A0305-02-0234-282
Figure 110123890-A0305-02-0235-283
<210> 203
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000265 VL
<400> 203
Figure 110123890-A0305-02-0235-284
Figure 110123890-A0305-02-0236-285
<210> 204
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000447 VL,PR000448 VL,PR000980 VL
<400> 204
Figure 110123890-A0305-02-0236-286
<210> 205
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000483 VL
<400> 205
Figure 110123890-A0305-02-0237-287
<210> 206
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000628 VL
<400> 206
Figure 110123890-A0305-02-0238-288
<210> 207
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000151 HC
<400> 207
Figure 110123890-A0305-02-0239-289
Figure 110123890-A0305-02-0240-290
Figure 110123890-A0305-02-0241-291
<210> 208
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000196 HC
<400> 208
Figure 110123890-A0305-02-0241-292
Figure 110123890-A0305-02-0242-294
Figure 110123890-A0305-02-0243-295
Figure 110123890-A0305-02-0244-296
<210> 209
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000197 HC
<400> 209
Figure 110123890-A0305-02-0244-297
Figure 110123890-A0305-02-0245-299
Figure 110123890-A0305-02-0246-300
<210> 210
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000210 HC
<400> 210
Figure 110123890-A0305-02-0247-301
Figure 110123890-A0305-02-0248-303
Figure 110123890-A0305-02-0249-306
<210> 211
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000265 HC
<400> 211
Figure 110123890-A0305-02-0250-307
Figure 110123890-A0305-02-0251-308
Figure 110123890-A0305-02-0252-309
<210> 212
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000447 HC
<400> 212
Figure 110123890-A0305-02-0252-310
Figure 110123890-A0305-02-0253-311
Figure 110123890-A0305-02-0254-312
Figure 110123890-A0305-02-0255-313
<210> 213
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000448 HC
<400> 213
Figure 110123890-A0305-02-0255-314
Figure 110123890-A0305-02-0256-315
Figure 110123890-A0305-02-0257-316
<210> 214
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000483 HC
<400> 214
Figure 110123890-A0305-02-0258-317
Figure 110123890-A0305-02-0259-318
Figure 110123890-A0305-02-0260-319
<210> 215
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000628 HC
<400> 215
Figure 110123890-A0305-02-0260-320
Figure 110123890-A0305-02-0261-326
Figure 110123890-A0305-02-0262-327
Figure 110123890-A0305-02-0263-328
<210> 216
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000980 HC
<400> 216
Figure 110123890-A0305-02-0263-329
Figure 110123890-A0305-02-0264-330
Figure 110123890-A0305-02-0265-331
<210> 217
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001758 HC
<400> 217
Figure 110123890-A0305-02-0266-332
Figure 110123890-A0305-02-0267-333
<210> 218
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001759 HC
<400> 218
Figure 110123890-A0305-02-0268-334
Figure 110123890-A0305-02-0269-335
Figure 110123890-A0305-02-0270-336
<210> 219
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001760 HC
<400> 219
Figure 110123890-A0305-02-0270-337
Figure 110123890-A0305-02-0271-338
Figure 110123890-A0305-02-0272-339
<210> 220
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001763 HC
<400> 220
Figure 110123890-A0305-02-0272-340
Figure 110123890-A0305-02-0273-341
Figure 110123890-A0305-02-0274-342
<210> 221
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001764 HC
<400> 221
Figure 110123890-A0305-02-0275-343
Figure 110123890-A0305-02-0276-345
<210> 222
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001766 HC
<400> 222
Figure 110123890-A0305-02-0277-346
Figure 110123890-A0305-02-0278-347
Figure 110123890-A0305-02-0279-349
<210> 223
<211> 358
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001767 HC
<400> 223
Figure 110123890-A0305-02-0279-350
Figure 110123890-A0305-02-0280-351
Figure 110123890-A0305-02-0281-352
<210> 224
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001768 HC
<400> 224
Figure 110123890-A0305-02-0281-353
Figure 110123890-A0305-02-0282-354
Figure 110123890-A0305-02-0283-355
<210> 225
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001771 HC
<400> 225
Figure 110123890-A0305-02-0284-356
Figure 110123890-A0305-02-0285-358
<210> 226
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001774 HC
<400> 226
Figure 110123890-A0305-02-0286-359
Figure 110123890-A0305-02-0287-360
Figure 110123890-A0305-02-0288-361
<210> 227
<211> 355
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001775 HC
<400> 227
Figure 110123890-A0305-02-0288-362
Figure 110123890-A0305-02-0289-363
Figure 110123890-A0305-02-0290-364
<210> 228
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001776 HC
<400> 228
Figure 110123890-A0305-02-0290-365
Figure 110123890-A0305-02-0291-366
Figure 110123890-A0305-02-0292-367
<210> 229
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001780 HC
<400> 229
Figure 110123890-A0305-02-0293-368
Figure 110123890-A0305-02-0294-369
<210> 230
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001781 HC
<400> 230
Figure 110123890-A0305-02-0295-370
Figure 110123890-A0305-02-0296-371
Figure 110123890-A0305-02-0297-372
<210> 231
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001830 HC
<400> 231
Figure 110123890-A0305-02-0297-373
Figure 110123890-A0305-02-0298-374
Figure 110123890-A0305-02-0299-375
<210> 232
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001831 HC
<400> 232
Figure 110123890-A0305-02-0299-376
Figure 110123890-A0305-02-0300-377
Figure 110123890-A0305-02-0301-378
<210> 233
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001833 HC
<400> 233
Figure 110123890-A0305-02-0302-379
Figure 110123890-A0305-02-0303-380
<210> 234
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001834 HC
<400> 234
Figure 110123890-A0305-02-0304-381
Figure 110123890-A0305-02-0305-382
Figure 110123890-A0305-02-0306-383
<210> 235
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001836 HC
<400> 235
Figure 110123890-A0305-02-0306-384
Figure 110123890-A0305-02-0307-385
Figure 110123890-A0305-02-0308-386
<210> 236
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001837 HC
<400> 236
Figure 110123890-A0305-02-0308-387
Figure 110123890-A0305-02-0309-388
Figure 110123890-A0305-02-0310-389
<210> 237
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001838 HC
<400> 237
Figure 110123890-A0305-02-0311-390
Figure 110123890-A0305-02-0312-391
<210> 238
<211> 355
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001840 HC
<400> 238
Figure 110123890-A0305-02-0313-392
Figure 110123890-A0305-02-0314-393
Figure 110123890-A0305-02-0315-394
<210> 239
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001842 HC
<400> 239
Figure 110123890-A0305-02-0315-395
Figure 110123890-A0305-02-0316-396
Figure 110123890-A0305-02-0317-397
<210> 240
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR004469 HC
<400> 240
Figure 110123890-A0305-02-0317-398
Figure 110123890-A0305-02-0318-399
Figure 110123890-A0305-02-0319-400
<210> 241
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000151 LC
<400> 241
Figure 110123890-A0305-02-0320-401
Figure 110123890-A0305-02-0321-402
<210> 242
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000196 LC
<400> 242
Figure 110123890-A0305-02-0321-403
Figure 110123890-A0305-02-0322-405
<210> 243
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000197 LC
<400> 243
Figure 110123890-A0305-02-0323-406
Figure 110123890-A0305-02-0324-407
<210> 244
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000210 LC,PR001212 Chain,PR002811 Chain,PR002812 Chain,PR002813
<400> 244
Figure 110123890-A0305-02-0324-408
Figure 110123890-A0305-02-0325-409
<210> 245
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000265 LC,PR003549 Chain,PR003550 Chain,PR003551 Chain,PR004268
<400> 245
Figure 110123890-A0305-02-0326-410
Figure 110123890-A0305-02-0327-411
<210> 246
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000447 LC,PR000448 LC,PR000701 Chain,PR000980 LC,PR003052 Chain
<400> 246
Figure 110123890-A0305-02-0327-412
Figure 110123890-A0305-02-0328-413
<210> 247
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000483 LC
<400> 247
Figure 110123890-A0305-02-0329-414
Figure 110123890-A0305-02-0330-415
<210> 248
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000628 LC
<400> 248
Figure 110123890-A0305-02-0330-416
Figure 110123890-A0305-02-0331-418
<210> 249
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000701 Chain,PR004270 Chain
<400> 249
Figure 110123890-A0305-02-0332-421
Figure 110123890-A0305-02-0333-420
<210> 250
<211> 656
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR000701 Chain
<400> 250
Figure 110123890-A0305-02-0333-422
Figure 110123890-A0305-02-0334-423
Figure 110123890-A0305-02-0335-424
Figure 110123890-A0305-02-0336-425
Figure 110123890-A0305-02-0337-426
<210> 251
<211> 705
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR001212 Chain
<400> 251
Figure 110123890-A0305-02-0337-427
Figure 110123890-A0305-02-0338-428
Figure 110123890-A0305-02-0339-429
Figure 110123890-A0305-02-0340-430
Figure 110123890-A0305-02-0341-431
<210> 252
<211> 703
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR002811 Chain
<400> 252
Figure 110123890-A0305-02-0341-433
Figure 110123890-A0305-02-0342-434
Figure 110123890-A0305-02-0343-435
Figure 110123890-A0305-02-0344-436
Figure 110123890-A0305-02-0345-438
<210> 253
<211> 590
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR002812 Chain
<400> 253
Figure 110123890-A0305-02-0345-439
Figure 110123890-A0305-02-0346-440
Figure 110123890-A0305-02-0347-441
Figure 110123890-A0305-02-0348-442
<210> 254
<211> 590
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR002813 Chain
<400> 254
Figure 110123890-A0305-02-0348-14
Figure 110123890-A0305-02-0349-443
Figure 110123890-A0305-02-0350-444
Figure 110123890-A0305-02-0351-445
Figure 110123890-A0305-02-0352-8
<210> 255
<211> 590
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR002815 Chain
<400> 255
Figure 110123890-A0305-02-0352-446
Figure 110123890-A0305-02-0353-447
Figure 110123890-A0305-02-0354-448
Figure 110123890-A0305-02-0355-449
<210> 256
<211> 590
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR002820 Chain
<400> 256
Figure 110123890-A0305-02-0355-450
Figure 110123890-A0305-02-0356-451
Figure 110123890-A0305-02-0357-453
Figure 110123890-A0305-02-0358-454
<210> 257
<211> 589
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR002821 Chain
<400> 257
Figure 110123890-A0305-02-0359-455
Figure 110123890-A0305-02-0360-456
Figure 110123890-A0305-02-0361-457
Figure 110123890-A0305-02-0362-459
<210> 258
<211> 590
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR002822 Chain
<400> 258
Figure 110123890-A0305-02-0362-460
Figure 110123890-A0305-02-0363-461
Figure 110123890-A0305-02-0364-462
Figure 110123890-A0305-02-0365-463
<210> 259
<211> 590
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR002823 Chain
<400> 259
Figure 110123890-A0305-02-0366-464
Figure 110123890-A0305-02-0367-465
Figure 110123890-A0305-02-0368-466
Figure 110123890-A0305-02-0369-467
<210> 260
<211> 590
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR002824 Chain
<400> 260
Figure 110123890-A0305-02-0369-468
Figure 110123890-A0305-02-0370-469
Figure 110123890-A0305-02-0371-470
Figure 110123890-A0305-02-0372-471
<210> 261
<211> 590
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR002825 Chain
<400> 261
Figure 110123890-A0305-02-0372-15
Figure 110123890-A0305-02-0373-472
Figure 110123890-A0305-02-0374-473
Figure 110123890-A0305-02-0375-474
Figure 110123890-A0305-02-0376-9
<210> 262
<211> 590
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR002826 Chain
<400> 262
Figure 110123890-A0305-02-0376-475
Figure 110123890-A0305-02-0377-476
Figure 110123890-A0305-02-0378-477
Figure 110123890-A0305-02-0379-478
<210> 263
<211> 590
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR002827 Chain
<400> 263
Figure 110123890-A0305-02-0379-479
Figure 110123890-A0305-02-0380-480
Figure 110123890-A0305-02-0381-481
Figure 110123890-A0305-02-0382-482
<210> 264
<211> 590
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR002828 Chain
<400> 264
Figure 110123890-A0305-02-0383-483
Figure 110123890-A0305-02-0384-484
Figure 110123890-A0305-02-0385-485
Figure 110123890-A0305-02-0386-486
<210> 265
<211> 589
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR002829 Chain
<400> 265
Figure 110123890-A0305-02-0386-487
Figure 110123890-A0305-02-0387-488
Figure 110123890-A0305-02-0388-489
Figure 110123890-A0305-02-0389-490
<210> 266
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR003052 Chain
<400> 266
Figure 110123890-A0305-02-0390-491
Figure 110123890-A0305-02-0391-492
<210> 267
<211> 656
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR003052 Chain
<400> 267
Figure 110123890-A0305-02-0391-493
Figure 110123890-A0305-02-0392-494
Figure 110123890-A0305-02-0393-495
Figure 110123890-A0305-02-0394-496
<210> 268
<211> 589
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR003549 Chain
<400> 268
Figure 110123890-A0305-02-0395-497
Figure 110123890-A0305-02-0396-498
Figure 110123890-A0305-02-0397-499
Figure 110123890-A0305-02-0398-500
<210> 269
<211> 589
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR003550 Chain
<400> 269
Figure 110123890-A0305-02-0398-501
Figure 110123890-A0305-02-0399-502
Figure 110123890-A0305-02-0400-504
Figure 110123890-A0305-02-0401-505
<210> 270
<211> 589
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR003551 Chain
<400> 270
Figure 110123890-A0305-02-0402-506
Figure 110123890-A0305-02-0403-507
Figure 110123890-A0305-02-0404-508
Figure 110123890-A0305-02-0405-509
<210> 271
<211> 588
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR004268 Chain
<400> 271
Figure 110123890-A0305-02-0405-510
Figure 110123890-A0305-02-0406-511
Figure 110123890-A0305-02-0407-512
Figure 110123890-A0305-02-0408-513
<210> 272
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR004270 Chain
<400> 272
Figure 110123890-A0305-02-0408-16
Figure 110123890-A0305-02-0409-514
Figure 110123890-A0305-02-0410-515
Figure 110123890-A0305-02-0411-516
Figure 110123890-A0305-02-0412-17
<210> 273
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GS_4
<400> 273
Figure 110123890-A0305-02-0412-517
<210> 274
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GS_5
<400> 274
Figure 110123890-A0305-02-0412-518
<210> 275
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GS_6
<400> 275
Figure 110123890-A0305-02-0413-519
<210> 276
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GS_7
<400> 276
Figure 110123890-A0305-02-0413-520
<210> 277
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GS_15
<400> 277
Figure 110123890-A0305-02-0414-521
<210> 278
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GS_20
<400> 278
Figure 110123890-A0305-02-0414-522
<210> 279
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GS_25
<400> 279
Figure 110123890-A0305-02-0414-523
Figure 110123890-A0305-02-0415-524
<210> 280
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> human IgG1 hinge
<400> 280
Figure 110123890-A0305-02-0415-525
<210> 281
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> human IgG1 hinge(C220S)
<400> 281
Figure 110123890-A0305-02-0415-526
<210> 282
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H1_15
<400> 282
Figure 110123890-A0305-02-0416-527
<210> 283
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G5-LH
<400> 283
Figure 110123890-A0305-02-0416-528
<210> 284
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H1_15-RT
<400> 284
Figure 110123890-A0305-02-0417-529
<210> 285
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L-GS_15-RT
<400> 285
Figure 110123890-A0305-02-0417-530
<210> 286
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L-H1_15-RT
<400> 286
Figure 110123890-A0305-02-0418-531
<210> 287
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KL-H1_15-RT
<400> 287
Figure 110123890-A0305-02-0418-532
<210> 288
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KL-H1_15-AS
<400> 288
Figure 110123890-A0305-02-0419-533
<210> 289
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RT-GS_5-KL
<400> 289
Figure 110123890-A0305-02-0419-534
<210> 290
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RT-GS_15-KL
<400> 290
Figure 110123890-A0305-02-0420-535
<210> 291
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RT-GS_25-KL
<400> 291
Figure 110123890-A0305-02-0420-536
<210> 292
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EPKSSD
<400> 292
Figure 110123890-A0305-02-0421-537
<210> 293
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AS-GS_15
<400> 293
Figure 110123890-A0305-02-0421-538
<210> 294
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007286 HFWR1 Chothia,PR007288 HFWR1 Chothia,PR007289 HFWR1 Chothia
<400> 294
Figure 110123890-A0305-02-0422-539
<210> 295
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007287 HFWR1 Chothia
<400> 295
Figure 110123890-A0305-02-0422-540
<210> 296
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007290 HFWR1 Chothia
<400> 296
Figure 110123890-A0305-02-0423-541
<210> 297
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007291 HFWR1 Chothia
<400> 297
Figure 110123890-A0305-02-0423-542
<210> 298
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007294 HFWR1 Chothia,PR007296 HFWR1 Chothia
<400> 298
Figure 110123890-A0305-02-0424-543
<210> 299
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007300 HFWR1 Chothia
<400> 299
Figure 110123890-A0305-02-0424-545
<210> 300
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007286 HCDR1 Chothia,PR007287 HCDR1 Chothia,PR007288 HCDR1 Chothia
<400> 300
Figure 110123890-A0305-02-0425-546
<210> 301
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007286 HFWR2 Chothia,PR007292 HFWR2 Chothia,PR007295 HFWR2 Chothia
<400> 301
Figure 110123890-A0305-02-0425-547
<210> 302
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007287 HFWR2 Chothia,PR007288 HFWR2 Chothia,PR007289 HFWR2 Chothia
<400> 302
Figure 110123890-A0305-02-0426-548
<210> 303
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007291 HFWR2 Chothia
<400> 303
Figure 110123890-A0305-02-0426-549
<210> 304
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007298 HFWR2 Chothia
<400> 304
Figure 110123890-A0305-02-0427-550
<210> 305
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007299 HFWR2 Chothia
<400> 305
Figure 110123890-A0305-02-0427-551
<210> 306
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007300 HFWR2 Chothia
<400> 306
Figure 110123890-A0305-02-0428-552
<210> 307
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007381 HFWR2 Chothia
<400> 307
Figure 110123890-A0305-02-0428-553
<210> 308
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007286 HCDR2 Chothia,PR007289 HCDR2 Chothia,PR007292 HCDR2 Chothia
<400> 308
Figure 110123890-A0305-02-0429-554
<210> 309
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007287 HCDR2 Chothia
<400> 309
Figure 110123890-A0305-02-0429-555
<210> 310
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007288 HCDR2 Chothia
<400> 310
Figure 110123890-A0305-02-0429-556
<210> 311
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007290 HCDR2 Chothia
<400> 311
Figure 110123890-A0305-02-0430-557
<210> 312
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007291 HCDR2 Chothia
<400> 312
Figure 110123890-A0305-02-0430-558
<210> 313
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007293 HCDR2 Chothia
<400> 313
Figure 110123890-A0305-02-0431-559
<210> 314
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007294 HCDR2 Chothia,PR007296 HCDR2 Chothia
<400> 314
Figure 110123890-A0305-02-0431-560
<210> 315
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007295 HCDR2 Chothia,PR007300 HCDR2 Chothia
<400> 315
Figure 110123890-A0305-02-0432-561
<210> 316
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007297 HCDR2 Chothia
<400> 316
Figure 110123890-A0305-02-0432-562
<210> 317
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007299 HCDR2 Chothia
<400> 317
Figure 110123890-A0305-02-0432-563
<210> 318
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007286 HFWR3 Chothia,PR007291 HFWR3 Chothia,PR007295 HFWR3 Chothia
<400> 318
Figure 110123890-A0305-02-0433-564
<210> 319
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007287 HFWR3 Chothia
<400> 319
Figure 110123890-A0305-02-0433-566
Figure 110123890-A0305-02-0434-567
<210> 320
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007288 HFWR3 Chothia
<400> 320
Figure 110123890-A0305-02-0434-568
<210> 321
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007289 HFWR3 Chothia
<400> 321
Figure 110123890-A0305-02-0435-569
<210> 322
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007290 HFWR3 Chothia,PR007292 HFWR3 Chothia,PR007294 HFWR3 Chothia
<400> 322
Figure 110123890-A0305-02-0435-570
<210> 323
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007293 HFWR3 Chothia
<400> 323
Figure 110123890-A0305-02-0436-571
<210> 324
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007298 HFWR3 Chothia
<400> 324
Figure 110123890-A0305-02-0436-572
Figure 110123890-A0305-02-0437-573
<210> 325
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007299 HFWR3 Chothia
<400> 325
Figure 110123890-A0305-02-0437-574
<210> 326
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007286 HCDR3 Chothia
<400> 326
Figure 110123890-A0305-02-0438-575
<210> 327
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007287 HCDR3 Chothia,PR007296 HCDR3 Chothia
<400> 327
Figure 110123890-A0305-02-0438-576
<210> 328
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007288 HCDR3 Chothia
<400> 328
Figure 110123890-A0305-02-0438-577
<210> 329
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007289 HCDR3 Chothia,PR007294 HCDR3 Chothia
<400> 329
Figure 110123890-A0305-02-0439-578
<210> 330
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007290 HCDR3 Chothia,PR007293 HCDR3 Chothia
<400> 330
Figure 110123890-A0305-02-0439-579
<210> 331
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007291 HCDR3 Chothia,PR007295 HCDR3 Chothia,PR007297 HCDR3 Chothia
<400> 331
Figure 110123890-A0305-02-0440-580
<210> 332
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007292 HCDR3 Chothia
<400> 332
Figure 110123890-A0305-02-0440-581
<210> 333
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007298 HCDR3 Chothia
<400> 333
Figure 110123890-A0305-02-0441-582
<210> 334
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007299 HCDR3 Chothia
<400> 334
Figure 110123890-A0305-02-0441-584
<210> 335
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007286 HFWR4 Chothia,PR007289 HFWR4 Chothia,PR007290 HFWR4 Chothia
<400> 335
Figure 110123890-A0305-02-0441-585
<210> 336
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007299 HFWR4 Chothia
<400> 336
Figure 110123890-A0305-02-0442-586
<210> 337
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007286 VH
<400> 337
Figure 110123890-A0305-02-0442-587
Figure 110123890-A0305-02-0443-588
<210> 338
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007287 VH
<400> 338
Figure 110123890-A0305-02-0443-589
Figure 110123890-A0305-02-0444-590
<210> 339
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007288 VH
<400> 339
Figure 110123890-A0305-02-0444-591
Figure 110123890-A0305-02-0445-592
<210> 340
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007289 VH
<400> 340
Figure 110123890-A0305-02-0445-593
Figure 110123890-A0305-02-0446-594
<210> 341
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007290 VH
<400> 341
Figure 110123890-A0305-02-0446-595
Figure 110123890-A0305-02-0447-596
<210> 342
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007291 VH
<400> 342
Figure 110123890-A0305-02-0447-597
Figure 110123890-A0305-02-0448-598
<210> 343
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007292 VH
<400> 343
Figure 110123890-A0305-02-0448-599
Figure 110123890-A0305-02-0449-600
<210> 344
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007293 VH
<400> 344
Figure 110123890-A0305-02-0449-601
Figure 110123890-A0305-02-0450-602
<210> 345
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007294 VH
<400> 345
Figure 110123890-A0305-02-0450-603
Figure 110123890-A0305-02-0451-604
<210> 346
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007295 VH
<400> 346
Figure 110123890-A0305-02-0451-605
Figure 110123890-A0305-02-0452-606
<210> 347
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007296 VH
<400> 347
Figure 110123890-A0305-02-0452-607
Figure 110123890-A0305-02-0453-608
<210> 348
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007297 VH
<400> 348
Figure 110123890-A0305-02-0453-609
Figure 110123890-A0305-02-0454-610
<210> 349
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007298 VH
<400> 349
Figure 110123890-A0305-02-0454-611
Figure 110123890-A0305-02-0455-612
<210> 350
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007299 VH
<400> 350
Figure 110123890-A0305-02-0455-613
Figure 110123890-A0305-02-0456-614
<210> 351
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007300 VH
<400> 351
Figure 110123890-A0305-02-0456-616
Figure 110123890-A0305-02-0457-617
<210> 352
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007381 VH
<400> 352
Figure 110123890-A0305-02-0457-618
Figure 110123890-A0305-02-0458-619
<210> 353
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007286 HC
<400> 353
Figure 110123890-A0305-02-0458-620
Figure 110123890-A0305-02-0459-622
Figure 110123890-A0305-02-0460-623
<210> 354
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007287 HC
<400> 354
Figure 110123890-A0305-02-0461-624
Figure 110123890-A0305-02-0462-626
<210> 355
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007288 HC
<400> 355
Figure 110123890-A0305-02-0463-627
Figure 110123890-A0305-02-0464-628
Figure 110123890-A0305-02-0465-629
<210> 356
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007289 HC
<400> 356
Figure 110123890-A0305-02-0465-630
Figure 110123890-A0305-02-0466-631
Figure 110123890-A0305-02-0467-632
<210> 357
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007290 HC
<400> 357
Figure 110123890-A0305-02-0467-633
Figure 110123890-A0305-02-0468-634
Figure 110123890-A0305-02-0469-635
<210> 358
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007291 HC
<400> 358
Figure 110123890-A0305-02-0470-636
Figure 110123890-A0305-02-0471-637
<210> 359
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007292 HC
<400> 359
Figure 110123890-A0305-02-0472-638
Figure 110123890-A0305-02-0473-639
Figure 110123890-A0305-02-0474-640
<210> 360
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007293 HC
<400> 360
Figure 110123890-A0305-02-0474-641
Figure 110123890-A0305-02-0475-642
Figure 110123890-A0305-02-0476-643
<210> 361
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007294 HC
<400> 361
Figure 110123890-A0305-02-0476-644
Figure 110123890-A0305-02-0477-645
Figure 110123890-A0305-02-0478-646
<210> 362
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007295 HC
<400> 362
Figure 110123890-A0305-02-0479-647
Figure 110123890-A0305-02-0480-648
<210> 363
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007296 HC
<400> 363
Figure 110123890-A0305-02-0481-649
Figure 110123890-A0305-02-0482-650
Figure 110123890-A0305-02-0483-651
<210> 364
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007297 HC
<400> 364
Figure 110123890-A0305-02-0483-652
Figure 110123890-A0305-02-0484-653
Figure 110123890-A0305-02-0485-654
<210> 365
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007298 HC
<400> 365
Figure 110123890-A0305-02-0485-655
Figure 110123890-A0305-02-0486-656
Figure 110123890-A0305-02-0487-657
<210> 366
<211> 346
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007299 HC
<400> 366
Figure 110123890-A0305-02-0488-658
Figure 110123890-A0305-02-0489-659
<210> 367
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007300 HC
<400> 367
Figure 110123890-A0305-02-0490-660
Figure 110123890-A0305-02-0491-661
Figure 110123890-A0305-02-0492-662
<210> 368
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007381 HC
<400> 368
Figure 110123890-A0305-02-0492-663
Figure 110123890-A0305-02-0493-664
Figure 110123890-A0305-02-0494-665
<210> 369
<211> 578
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007130 Chain
<400> 369
Figure 110123890-A0305-02-0494-666
Figure 110123890-A0305-02-0495-667
Figure 110123890-A0305-02-0496-668
Figure 110123890-A0305-02-0497-669
<210> 370
<211> 576
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007132 Chain
<400> 370
Figure 110123890-A0305-02-0498-671
Figure 110123890-A0305-02-0499-672
Figure 110123890-A0305-02-0500-673
Figure 110123890-A0305-02-0501-674
<210> 371
<211> 576
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007133 Chain
<400> 371
Figure 110123890-A0305-02-0501-675
Figure 110123890-A0305-02-0502-676
Figure 110123890-A0305-02-0503-677
Figure 110123890-A0305-02-0504-678
<210> 372
<211> 576
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007135 Chain
<400> 372
Figure 110123890-A0305-02-0504-679
Figure 110123890-A0305-02-0505-680
Figure 110123890-A0305-02-0506-681
Figure 110123890-A0305-02-0507-682
<210> 373
<211> 576
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007136 Chain
<400> 373
Figure 110123890-A0305-02-0508-683
Figure 110123890-A0305-02-0509-684
Figure 110123890-A0305-02-0510-686
Figure 110123890-A0305-02-0511-687
<210> 374
<211> 576
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007137 Chain
<400> 374
Figure 110123890-A0305-02-0511-688
Figure 110123890-A0305-02-0512-689
Figure 110123890-A0305-02-0513-690
Figure 110123890-A0305-02-0514-691
<210> 375
<211> 578
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007138 Chain
<400> 375
Figure 110123890-A0305-02-0514-692
Figure 110123890-A0305-02-0515-693
Figure 110123890-A0305-02-0516-694
Figure 110123890-A0305-02-0517-695
<210> 376
<211> 576
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007139 Chain
<400> 376
Figure 110123890-A0305-02-0518-696
Figure 110123890-A0305-02-0519-697
Figure 110123890-A0305-02-0520-727
Figure 110123890-A0305-02-0521-699
<210> 377
<211> 576
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007141 Chain
<400> 377
Figure 110123890-A0305-02-0521-700
Figure 110123890-A0305-02-0522-701
Figure 110123890-A0305-02-0523-702
Figure 110123890-A0305-02-0524-703
<210> 378
<211> 578
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007142 Chain
<400> 378
Figure 110123890-A0305-02-0524-704
Figure 110123890-A0305-02-0525-705
Figure 110123890-A0305-02-0526-706
Figure 110123890-A0305-02-0527-707
<210> 379
<211> 576
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007143 Chain
<400> 379
Figure 110123890-A0305-02-0528-708
Figure 110123890-A0305-02-0529-709
Figure 110123890-A0305-02-0530-710
Figure 110123890-A0305-02-0531-713
<210> 380
<211> 578
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007145 Chain
<400> 380
Figure 110123890-A0305-02-0531-714
Figure 110123890-A0305-02-0532-715
Figure 110123890-A0305-02-0533-716
Figure 110123890-A0305-02-0534-717
<210> 381
<211> 576
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007146 Chain
<400> 381
Figure 110123890-A0305-02-0535-718
Figure 110123890-A0305-02-0536-719
Figure 110123890-A0305-02-0537-720
Figure 110123890-A0305-02-0538-10
<210> 382
<211> 578
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR007149 Chain
<400> 382
Figure 110123890-A0305-02-0538-721
Figure 110123890-A0305-02-0539-723
Figure 110123890-A0305-02-0540-724
Figure 110123890-A0305-02-0541-725

Claims (28)

  1. 一種4-1BB結合蛋白，其特徵在於，其包括重鏈可變區；所述的重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3包含分別如序列表中SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：69和SEQ ID NO：115所示的序列，或者，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3包含分別如序列表中SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：115所示的序列。
  2. 如請求項1所述的4-1BB結合蛋白，其特徵在於，編碼所述重鏈可變區的FR的基因來源於胚系V基因IGHV4-34、IGHV3-23、IGHV3-11或者IGHV3-74。
  3. 如請求項1所述的4-1BB結合蛋白，其特徵在於，所述的重鏈可變區包含如序列表中SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：352以及SEQ ID NO：198中的任一個所示的序列。
  4. 如請求項1所述的4-1BB結合蛋白，其特徵在於，所述4-1BB結合蛋白還包含重鏈恆定區；所述重鏈恆定區選自hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4或其變異體。
  5. 如請求項4所述的4-1BB結合蛋白，其特徵在於，所述hIgG1的變異體的突變為L234A、L235A、E345R和P329G中的一個或多個，所述hIgG4的變異體的突變S228P。
  6. 如請求項5所述的4-1BB結合蛋白，其特徵在於，所述hIgG1的變異體的突變為E345R，或者L234A、L235A 和E345R的組合，或者L234A、L235A和P329G的組合。
  7. 如請求項4所述的4-1BB結合蛋白，其特徵在於，所述4-1BB結合蛋白包含重鏈，所述的重鏈包含如序列表中SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：368以及SEQ ID NO：240中的任一個所示的序列。
  8. 如請求項1-7任一項所述的4-1BB結合蛋白，其特徵在於，其為重鏈抗體或單域抗體的形式，或為由上述抗體製得的單株抗體。
  9. 一種雙特異性抗體，其特徵在於，所述的雙特異性抗體包含第一蛋白功能區和第二蛋白功能區，所述的第二蛋白功能區為如請求項1-8任一項所述的4-1BB結合蛋白，所述的第一蛋白功能區為HER2抗體或者PD-L1抗體。
  10. 如請求項9所述的雙特異性抗體，其特徵在於，所述的HER2抗體為trastuzumab或者pertuzumab，所述的PD-L1抗體為atezolizumab或者PR000265，所述PR000265的重鏈如SEQ ID NO：211所示，輕鏈如SEQ ID NO：245所示。
  11. 如請求項10所述的雙特異性抗體，其特徵在於，所述的第一蛋白功能區為Fab，所述的第二蛋白功能區為VHH；或者，所述第一蛋白功能區為Fab，所述的第二蛋白功能區為免疫球蛋白；或者，所述的第一蛋白功能 區為免疫球蛋白，所述的第二蛋白功能區為重鏈可變區。
  12. 如請求項11所述的雙特異性抗體，其特徵在於，所述第一蛋白功能區和所述第二蛋白功能區之間和/或所述scFv的重鏈可變區和輕鏈可變區之間透過連接子連接，所述連接子的胺基酸序列為GS或者如序列表中SEQ ID NO：273-293任一個所示。
  13. 如請求項12所述的雙特異性抗體，其特徵在於，所述的雙特異性抗體包含多肽鏈1和多肽鏈2，所述多肽鏈1的胺基酸序列如SEQ ID NO：244所示，且所述多肽鏈2的胺基酸序列如SEQ ID NO：264所示；或者所述多肽鏈1的胺基酸序列如SEQ ID NO：245所示，且所述多肽鏈2的胺基酸序列如SEQ ID NO：369所示。
  14. 一種分離的核酸，其編碼如請求項1-8任一項所述的4-1BB結合蛋白或如請求項9-13任一項所述的雙特異性抗體。
  15. 一種包含如請求項14所述的分離的核酸的表現載體。
  16. 一種宿主細胞，其包含如請求項15所述的表現載體。
  17. 如請求項16所述的宿主細胞，其特徵在於，所述宿主細胞為原核細胞或真核細胞。
  18. 一種4-1BB結合蛋白的製備方法，其包含培養如請求項16或17所述的宿主細胞，從培養物中獲得所述4-1BB結合蛋白。
  19. 一種抗體藥物偶聯物，其包含細胞毒性劑，以及如請求項1-8任一項所述的4-1BB結合蛋白或如請求項9-13任一項所述的雙特異性抗體。
  20. 如請求項19所述的抗體藥物偶聯物，其特徵在於，所述細胞毒性劑為MMAF或MMAE。
  21. 一種藥物組成物，其包含如請求項1-8任一項所述的4-1BB結合蛋白、如請求項9-13任一項所述的雙特異性抗體和/或如請求項19或20所述的抗體藥物偶聯物。
  22. 一種如請求項1-8任一項所述的4-1BB結合蛋白、如請求項9-13任一項所述的雙特異性抗體和如請求項21所述的藥物組成物在製備治療癌症的藥物中的應用。
  23. 如請求項22所述的應用，其特徵在於，所述癌症為與HER2、PD-L1以及4-1BB中的一種或多種相關的癌症。
  24. 如請求項23所述的應用，其特徵在於，所述癌症為乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、胃癌、肝癌、食管癌、子宮頸癌、頭頸部腫瘤或者結直腸癌。
  25. 一種套組，其包括如請求項1-8任一項所述的4-1BB結合蛋白、如請求項9-13任一項所述的雙特異性抗體、如請求項19或20中所述的抗體藥物偶聯物和/或如請求項21所述的藥物組成物。
  26. 如請求項25所述的套組，其特徵在於，所述套組還包括(i)施用抗體或其抗原結合片段或抗體藥物偶聯物或藥物組成物的裝置；和/或(ii)使用說明。
  27. 一種套裝藥盒，其包含藥盒A和藥盒B，其中：所述藥盒A含有如請求項1-8任一項所述的4-1BB結合蛋白、如請求項9-13任一項所述的雙特異性抗體、如請求項19或20所述的抗體藥物偶聯物和/或如請求項21所述的藥物組成物；所述藥盒B含有其他抗腫瘤抗體或者包含所述其他抗腫瘤抗體的藥物組成物，和/或由激素製劑、標靶小分子製劑、蛋白酶體抑制劑、成像劑、診斷劑、化療劑、溶瘤藥物、細胞毒性劑、細胞激素、共刺激分子的活化劑、抑制性分子的抑制劑以及疫苗組成的群組中的一種或多種。
  28. 一種免疫檢測或者測定4-1BB的方法，其包括使用如請求項1-8任一項所述的4-1BB結合蛋白、如請求項9-13任一項所述的雙特異性抗體、如請求項19或20所述的抗體藥物偶聯物或如請求項21所述的藥物組成物，所述檢測為非診斷和/或治療目的的。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023143534A1 (zh) * 2022-01-28 2023-08-03 三优生物医药(上海)有限公司 一种特异性识别4-1bb的抗体、其制备方法及其用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109651507A (zh) * 2017-10-12 2019-04-19 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 一种激动型4-1bb单克隆抗体
CN110627906A (zh) * 2019-10-10 2019-12-31 上海洛启生物医药技术有限公司 抗pd-l1/4-1bb双特异性抗体及其用途

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0110029D0 (en) 2001-04-24 2001-06-13 Grosveld Frank Transgenic animal
BR112016015140A2 (pt) 2013-12-30 2018-01-23 Epimab Biotherapeutics Inc. imunoglobulina com fabs in-tandem e usos das mesmas
DK3354661T3 (da) * 2015-09-22 2020-07-06 Dingfu Biotarget Co Ltd Fuldstændigt humant antistof mod human CD137 og anvendelse deraf
IL260530B2 (en) * 2016-01-11 2024-01-01 Inhibrx Inc Multispecific and multivalent 41BB-binding fusion proteins, preparations containing them and their uses
CN108473587A (zh) * 2016-01-25 2018-08-31 辉瑞公司 用于治疗癌症的ox40激动剂和4-1bb激动剂单克隆抗体的组合
WO2017182672A1 (en) * 2016-04-22 2017-10-26 Alligator Bioscience Ab Novel bispecific polypeptides against cd137
IL268058B2 (en) * 2017-01-20 2023-09-01 Magenta Therapeutics Inc Compositions and methods for depleting cd137 plus cells
US11459394B2 (en) * 2017-02-24 2022-10-04 Macrogenics, Inc. Bispecific binding molecules that are capable of binding CD137 and tumor antigens, and uses thereof
BR112020001180A2 (pt) * 2017-07-20 2020-09-08 Aptevo Research And Development Llc proteínas de ligação a antígenos que se ligam a 5t4 e 4-1bb e composições e métodos relacionados
WO2019092452A1 (en) * 2017-11-13 2019-05-16 Crescendo Biologics Limited Molecules that bind to cd137 and psma
CN113286825B (zh) * 2018-11-30 2024-06-18 爱必乐生物公司 抗pd-l1/抗4-1bb双特异性抗体及其用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109651507A (zh) * 2017-10-12 2019-04-19 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 一种激动型4-1bb单克隆抗体
CN110627906A (zh) * 2019-10-10 2019-12-31 上海洛启生物医药技术有限公司 抗pd-l1/4-1bb双特异性抗体及其用途

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