TW202202530A - 具有H2L2與HCAb結構的結合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本發明公開了一種含有至少兩個蛋白功能區的結合蛋白，其中，所述結合蛋白包括蛋白功能區A和蛋白功能區B；所述蛋白功能區A和所述蛋白功能區B標靶不同的抗原或抗原表位，其中所述蛋白功能區A為Fab或scFv結構，所述蛋白功能區B為VH結構，所述蛋白功能區A和蛋白功能區B的數量分別為一個或多個。本發明的多特異性結合蛋白具有較小的分子量、較少的多肽鏈、更簡單的結構，透過不同的結構類型、相對位置、結合價數等參數來調節針對不同標的的功能活性，進而設計出不同的活性組合，以滿足不同的臨床聯合用藥劑量組合的需求。

Description

具有H2L2與HCAb結構的結合蛋白
本發明涉及生物醫藥領域，尤其涉及一種具有H2L2與HCAb結構的雙特異性或多特異性結合蛋白及其應用。
大多數物種中的抗體是包含兩個完全相同的重鏈和兩個完全相同的輕鏈的四聚體結構，也稱為“H2L2”。在駱駝科及鯊魚科動物血清中還天然存在一種缺失輕鏈的重鏈抗體(heavy-chain antibody, HCAb)。重鏈抗體的可變區VHH片段與H2L2抗體的Fab類似，具有穩定的結構和特異的抗原結合活性，但是VHH的分子量只有約13 KDa，因此也被稱作奈米抗體或單域抗體。人的抗體天然結構為“H2L2”，因而無法從天然來源中獲得有用的人源的重鏈抗體；但是Frank Grosveld等人提出了一種利用基因轉殖動物獲得全人源重鏈抗體的方法(WO2007/096779)，並可以利用該方法得到穩定和可溶的全人源VH單域抗體。
雙特異性抗體(bispecific antibodies)和多特異性抗體(multispecific antibodies)是一類在天然的單株抗體基礎上透過蛋白質工程技術製備出的人工抗體，其可以結合兩種或多種不同的抗原或者同一個抗原上的不同表位，可以實現一些單特異性抗體無法實現的作用機制和功能效果。
雙特異性抗體的結構設計是非常重要的。從兩個不同的H2L2抗體產生雙特異性抗體，其中一個最主要的挑戰就是怎樣從超過10種的不同的重鏈和輕鏈的組合中獲得具有正確的鏈組合的功能性的雙特異性抗體分子，即如何解決鏈的錯配問題。科學家已經研發出多種策略來嘗試解決這一問題：例如，使用單鏈可變區抗體片段(scFv)的結構將VH和VL融合在一起；或者，利用knob-into-hole (KiH)技術或其他空間結構互補的突變體來促進重鏈的異二聚化；或者，利用“共有輕鏈”或者“共有重鏈”技術來減少不同多肽鏈的數目，等等。但是，各種技術手段都有其局限性，例如，scFv結構經常是不穩定的且易於聚集的；“共有輕鏈”技術需要使用非常複雜的篩選過程來獲得可以與不同VH配對的VL；FIT-Ig等技術產生的雙抗分子的尺寸比較大(約250 KDa)，可能會影響其對細胞或組織的穿透能力。因此，仍然亟需開發新的雙特異性抗體的結構和製備雙特異性抗體的技術。
重鏈抗體及其衍生的單域抗體在建構雙特異甚至多特異抗體方面有其獨特的優勢。重鏈抗體的抗原結合結構域只有常規抗體的Fab的四分之一大小；而且沒有輕鏈，避免了輕鏈錯配的問題。所以，利用重鏈抗體及其衍生的單域抗體，可以建構分子量較小的、多肽鏈較少的、結構更簡單的雙特異甚至多特異抗體。但是，非人源重鏈抗體的潛在的免疫原性風險可能會限制它的治療性用途。因而，相較於駱駝科動物的奈米抗體，利用全人源重鏈抗體來建構雙特異或多特異抗體會在免疫原性和成藥性方面更有優勢。
為克服現有技術中缺乏療效好、穩定且生產方便的雙特異性或多特異性結合蛋白的缺陷，本發明提供了一種具有H2L2與HCAb結構的雙或多特異性結合蛋白以及製備和使用此類結合蛋白的方法，其利用全人源重鏈抗體及其衍生的單域抗體所建構的多價和多特異性結合蛋白。其相較於利用常規IgG抗體建構的多價和多特異性結合蛋白有諸多優勢，在調整特異性和結合價數方面更為靈活。本文提供的多價和多特異性結合蛋白含有至少一個來源於人源重鏈抗體的重鏈可變區結構域VH，並且能夠結合兩個或更多個抗原，或同一抗原的兩個或更多個表位，或同一表位的兩個或更多個拷貝。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案之一為：提供一種含有至少兩個蛋白功能區的結合蛋白，其中，所述結合蛋白包括蛋白功能區A和蛋白功能區B；所述蛋白功能區A和所述蛋白功能區B標靶不同的抗原或抗原表位，其中所述蛋白功能區A為Fab或scFv結構，所述蛋白功能區B為VH結構，所述蛋白功能區A和蛋白功能區B的數量分別為一個或多個。優選地，所述結合蛋白還包括Fc，所述Fc的數量為二個，形成Fc二聚體。較佳地，所述結合蛋白為對稱結構或非對稱結構，和/或，所述Fc二聚體為同源二聚體或異源二聚體。
在一些具體的實施例中，(I)所述結合蛋白為對稱結構，所述對稱結構為左右對稱的類IgG結構，其中所述蛋白功能區A的數量為二個，所述蛋白功能區B的數量為二個或四個。二個所述蛋白功能區A與二個所述Fc形成IgG結構。在所述左右對稱的類IgG結構中，左和右只是空間相對位置，其可以為上下對稱也可以為前後對稱。所述左右對稱的類IgG結構指在IgG結構的抗體上還左右對稱地連接了額外的蛋白功能區，這些額外的蛋白功能區可以連接在Fc功能區的CH3的C末端或VH或VL的N末端，也可以以嵌入的形式連接在IgG結構的可變區和Fc功能區之間。本文所述“額外的”在此表示相對IgG結構以外的結構或功能區。
較佳地，當所述蛋白功能區B的數量為二個時，所述結合蛋白為四價結合蛋白，具體包括以下結構：(a)所述結合蛋白從N末端至C末端依次為蛋白功能區A、蛋白功能區B和Fc，其中所述蛋白功能區A與所述蛋白功能區B透過第一連接肽(L1)連接，所述蛋白功能區B與所述Fc透過第二連接肽(L2)連接；在該實施方式中，兩份的所述蛋白功能區B與所述Fc形成對稱的單鏈抗體的二聚體形式，並在所述單鏈抗體的二聚體的N末端上連接了所述蛋白功能區A，此時所述蛋白功能區A可以以其CH1(圖1的(2))或CL(圖1的(1))與所述蛋白功能區B的N末端連接；或，(b)所述結合蛋白從N末端至C末端依次為蛋白功能區B、蛋白功能區A和Fc，其中所述蛋白功能區B與所述蛋白功能區A透過連接肽連接，所述蛋白功能區A與所述Fc透過樞紐區連接；在該實施方式中，兩份的所述蛋白功能區A與所述Fc形成對稱的IgG結構，並在所述IgG結構的N末端上連接了所述蛋白功能區B，此時所述蛋白功能區B可以與所述蛋白功能區A的VH(圖1的(3))或VL(圖1的(4))的N末端連接；或，(c)所述結合蛋白從N末端至C末端依次為蛋白功能區A、Fc和蛋白功能區B，其中所述蛋白功能區A與Fc透過樞紐區連接，所述Fc與所述蛋白功能區B透過連接肽連接；在該實施方式中，兩份的所述蛋白功能區A與所述Fc形成對稱的IgG結構，並在所述IgG結構的C末端上連接了所述蛋白功能區B，此時所述蛋白功能區B可以與所述蛋白功能區A的CH3(圖1的(5))或CL(圖1的(6))的C末端連接；
較佳地，當所述蛋白功能區B的數量為四個時，所述結合蛋白為六價結合蛋白，具體包括以下結構：新增的二個蛋白功能區B進一步連接在上述(a)或(b)或(c)所述結合蛋白的N末端或C末端；優選連接在上述(c)所述結合蛋白的Fc的C末端或者原有的蛋白功能區B的C末端，或與上述(b)所述結合蛋白的原有的蛋白功能區B一同連接於蛋白功能區A的N末端。本文所述“新增的”僅為表述方便，以區分上文提到的蛋白功能區B即“原有的”蛋白功能區，在實際設計或生產抗體時，新增的蛋白功能區與原有的蛋白功能區之間並無先後之分。在該實施方式中，兩份的所述蛋白功能區A與所述Fc形成對稱的IgG結構，並在所述IgG結構的C末端上連接了所述蛋白功能區B，此時其中兩個蛋白功能區B可以與所述蛋白功能區A的CH3透過第一連接肽連接，另外兩個蛋白功能區B與前述兩個蛋白功能區B透過第二連接肽連接(圖1的(7))；或其中兩個蛋白功能區B可以與所述蛋白功能區A的VH的N末端透過第一連接肽連接，另外兩個蛋白功能區B與所述蛋白功能區A的VL的N末端透過第二連接肽連接(圖1的(9))。
上述具有二個不同的蛋白功能區的結合蛋白又稱為雙特異性結合蛋白。更佳地，所述結合蛋白還包括蛋白功能區C，所述結合蛋白為六價或八價的三特異性結合蛋白，其具體包括以下結構：所述蛋白功能區C與所述蛋白功能區A、蛋白功能區B標靶不同的抗原或抗原表位，所述蛋白功能區C連接在上述抗體的N末端或C末端；優選所述蛋白功能區C的數量為二個，所述蛋白功能區C連接在上述(c)所述結合蛋白的C末端，或，與上述(b)所述結合蛋白的蛋白功能區B一樣，連接於所述蛋白功能區A的N末端。在該實施方式中，兩份的蛋白功能區C透過第二連接肽進一步連接於結構(5)的C末端(圖1的(8))，或結構(3)或(4)的N末端(圖1的(10)顯示了連接在結構(3)的N末端的情形)。
進一步更佳地，所述結合蛋白具有四條多肽鏈，分別為兩條相同的短鏈(或稱“多肽鏈1”)和兩條相同的長鏈(或稱“多肽鏈2”)，其中，(1)所述短鏈從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1，所述長鏈從N末端至C末端依次包括VL_A-CL-L1-VH_B-L2-CH2-CH3；或(2)所述短鏈從N末端至C末端依次包括VL_A-CL，所述長鏈從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1-L1-VH_B-L2-CH2-CH3；或(3)所述短鏈從N末端至C末端依次包括VL_A-CL，所述長鏈從N末端至C末端依次包括VH_B-L-VH_A-CH1-h-CH2-CH3；或(4)所述短鏈從N末端至C末端依次包括VH_B-L-VL_A-CL，所述長鏈從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1-h-CH2-CH3；或(5)所述短鏈從N末端至C末端依次包括VL_A-CL，所述長鏈從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1-h-CH2-CH3-L-VH_B；或(6)所述短鏈從N末端至C末端依次包括VL_A-CL-L-VH_B，所述長鏈從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1-h-CH2-CH3；或(7)所述短鏈從N末端至C末端依次包括VL_A-CL，所述長鏈從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1-h-CH2-CH3-L1-VH_B-L2-VH_B；或(8)所述短鏈從N末端至C末端依次包括VL_A-CL，所述長鏈從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1-h-CH2-CH3-L1-VH_B-L2-VH_C；或(9)所述短鏈從N末端至C末端依次包括VH_B-L1-VL_A-CL，所述長鏈從N末端至C末端依次包括VH_B-L2-VH_A-CH1-h-CH2-CH3；或(10)所述短鏈從N末端至C末端依次包括VH_B-L1-VL_A-CL，所述長鏈從N末端至C末端依次包括VH_C-L2-VH_A-CH1-h-CH2-CH3；其中，所述L、L1和L2為連接肽，所述h為樞紐區或連接肽，所述樞紐區或連接肽例如“-”、GS或如SEQ ID NO: 495- 519的胺基酸序列所示。本文中VL、VH、CL、CH的含義均為本領域常規，分別代表輕鏈可變區、重鏈可變區、輕鏈恆定區和重鏈恆定區，其中CH包括CH1、CH2和CH3；_A與_B與_C分別代表該功能區為蛋白功能區A或蛋白功能區B或蛋白功能區C或其組成；“-”代表聯結不同結構區的多肽鍵或用來分隔不同結構區；C末端即肽鏈的羧基末端(也可寫成“C’”)，N末端即肽鏈的胺基末端(也可寫成“N’”)。上述不同蛋白功能區融合在同一條多肽鏈上，可以避免錯配副產物。在一些實施方案中，L、L1和L2可以是相同的序列。在另一些實施方案中，L、L1和L2可以是不同的序列。本發明的蛋白功能區在一些情況中可以為Fab、scFv或VH，在另一些情況中也可以為F(ab)2或全長抗體，在某些情況中也稱為抗體或抗原結合蛋白或結合蛋白。在一些具體的實施例中，所述蛋白功能區A又稱作針對第一抗原的抗體A或第一抗原結合結構域；所述蛋白功能區B又稱作針對第二抗原的抗體B或第二抗原結合結構域；所述蛋白功能區C又稱作針對第三抗原的抗體C或第三抗原結合結構域；所述蛋白功能區D又稱作針對第四抗原的抗體D或第四抗原結合結構域，以此類推。
在一些具體的實施例中，(II)所述結合蛋白為非對稱結構，所述非對稱結構呈左右不對稱的類IgG結構，其中左臂為Fab或scFv結構的蛋白功能區A，右臂為VH結構的蛋白功能區B，所述蛋白功能區A和所述蛋白功能區B分別與一個Fc連接；優選所述蛋白功能區A的數量為一個，所述蛋白功能區B的數量為一個或二個或三個。
較佳地，當所述蛋白功能區B的數量為一個時，所述結合蛋白為二價結合蛋白，其包括以下結構：所述蛋白功能區A為(d)常規Fab結構，或(e)Fab(cross VH/VL)結構，或(f)Fab(cross Fd/LC)結構；當所述蛋白功能區B的數量為二個時，所述結合蛋白為三價結合蛋白，其包括以下結構：左臂的所述蛋白功能區A為上述(d)或(e)或(f)，第二個蛋白功能區B連接在左臂的所述蛋白功能區A的N末端或C末端，或右臂的第一個蛋白功能區B的N末端，或所述Fc的C末端，優選第二個蛋白功能區B連接在右臂的第一個蛋白功能區B的N末端；當所述蛋白功能區B的數量為三個時，所述結合蛋白為四價結合蛋白，具體包括以下結構：左臂的所述蛋白功能區A為上述(d)或(e)或(f)結構，第三個蛋白功能區B進一步連接在左臂的所述蛋白功能區A的N末端或C末端，或左臂的第二個蛋白功能區B的N末端或C末端，或右臂的第一個或第二個蛋白功能區B的N末端，或所述Fc的C末端，優選第二個蛋白功能區B連接在右臂的第一個蛋白功能區B的N末端，且第三個蛋白功能區B連接在所述第二個蛋白功能區B的N末端。
當所述蛋白功能區B的數量為一個時，所述結合蛋白為二價結合蛋白，其包括以下結構：左臂的所述蛋白功能區A為(g)scFv結構，所述scFv透過VH的末端或VL的末端與Fc連接；當所述蛋白功能區B的數量為二個時，所述結合蛋白為三價結合蛋白，具體包括以下結構：左臂的所述蛋白功能區A為(g)，第二個蛋白功能區B連接在左臂的所述蛋白功能區A的N末端，或右臂的原有的蛋白功能區B的N末端，或所述Fc的C末端，優選第二個蛋白功能區B連接在右臂的第一個蛋白功能區B的N末端；當所述蛋白功能區B的數量為三個時，所述結合蛋白為四價結合蛋白，具體包括以下結構：左臂的所述蛋白功能區A為(g)，第三個蛋白功能區B進一步連接在左臂的所述蛋白功能區A的N末端，或第二個蛋白功能區B的N末端或C末端，或所述Fc的C末端，優選第二個蛋白功能區B連接在右臂的第一個蛋白功能區B的N末端，且第三個蛋白功能區B連接在所述第二個蛋白功能區B的N末端。
更佳地，所述結合蛋白還包括蛋白功能區C，所述結合蛋白為三價或多價的多特異性結合蛋白，其中，所述蛋白功能區C與所述蛋白功能區A、蛋白功能區B標靶不同的抗原或抗原表位，所述蛋白功能區C連接在上述結合蛋白的N末端或C末端；優選所述蛋白功能區C連接在上述(d)、(e)、(f)或(g)所述結合蛋白的蛋白功能區B的N末端；
進一步更佳地，所述結合蛋白還包括蛋白功能區D，所述結合蛋白為四價或多價的多特異性結合蛋白，具體地：所述蛋白功能區D與所述蛋白功能區A、蛋白功能區B、蛋白功能區C標靶不同的抗原或抗原表位，所述蛋白功能區D連接在上述結合蛋白的N末端或C末端；優選所述蛋白功能區D連接在上述(d)、(e)、(f)或(g)所述結合蛋白的蛋白功能區B的N末端。
進一步更佳地，所述結合蛋白具有多肽鏈1、多肽鏈2和多肽鏈3三種多肽鏈，每種多肽鏈各一條。在本發明中，所述多肽鏈1又稱為第一多肽鏈，所述多肽鏈2又稱為第二多肽鏈，所述多肽鏈3又稱為第三多肽鏈。其中，(11)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VL_A-CL，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1-h-CH2-CH3，所述多肽鏈3從N末端至C末端依次包括VH_B-h-CH2-CH3；或(12)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VH_A-CL，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VL_A-CH1-h-CH2-CH3，所述多肽鏈3從N末端至C末端依次包括VH_B-h-CH2-CH3；或(13)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VL_A-CL-h-CH2-CH3，所述多肽鏈3從N末端至C末端依次包括VH_B-h-CH2-CH3；或(14)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VL_A-CL，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1-h-CH2-CH3，所述多肽鏈3從N末端至C末端依次包括VH_B-L-VH_B-h-CH2-CH3；或(15)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VL_A-CL，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1-h-CH2-CH3，所述多肽鏈3從N末端至C末端依次包括VH_C-L-VH_B-h-CH2-CH3；或(16)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VH_A-CL，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VL_A-CH1-h-CH2-CH3，所述多肽鏈3從N末端至C末端依次包括VH_B-L-VH_B-h-CH2-CH3；或(17)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VH_A-CL，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VL_A-CH1-h-CH2-CH3，所述多肽鏈3從N末端至C末端依次包括VH_C-L-VH_B-h-CH2-CH3；或(18)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VL_A-CL-h-CH2-CH3，所述多肽鏈3從N末端至C末端依次包括VH_B-L-VH_B-h-CH2-CH3；或(19)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VL_A-CL-h-CH2-CH3，所述多肽鏈3從N末端至C末端依次包括VH_C-L-VH_B-h-CH2-CH3；或(26)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VL_A-CL，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1-h-CH2-CH3，所述多肽鏈3從N末端至C末端依次包括VH_B-L1-VH_B-L2-VH_B-h-CH2-CH3；或(27)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VL_A-CL，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1-h-CH2-CH3，所述多肽鏈3從N末端至C末端依次包括VH_D-L1-VH_C-L2-VH_B-h-CH2-CH3；其中，所述L、L1和L2為連接肽，所述h為樞紐區或連接肽，所述樞紐區或連接肽例如“-”、GS或如SEQ ID NO: 495-519的胺基酸序列所示。
進一步更佳地，所述結合蛋白具有多肽鏈1和多肽鏈2兩種多肽鏈，每種多肽鏈各一條，同樣地，所述多肽鏈1又稱為第一多肽鏈，所述多肽鏈2又稱為第二多肽鏈。其中，(20)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VL_A-L-VH_A-h-CH2-CH3，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VH_B-h-CH2-CH3；或(21)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VH_A-L-VL_A-h-CH2-CH3，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VH_B-h-CH2-CH3；或(22)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VL_A-L1-VH_A-h-CH2-CH3，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VH_B-L2-VH_B-h-CH2-CH3；或(23)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VH_A-L1-VL_A-h-CH2-CH3，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VH_B-L2-VH_B-h-CH2-CH3；或(24)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VL_A-L1-VH_A-h-CH2-CH3，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VH_C-L2-VH_B-CH2-CH3；或(25)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VH_A-L1-VL_A-h-CH2-CH3，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VH_C-L2-VH_B-h-CH2-CH3；其中，所述L、L1和L2為連接肽，所述h為樞紐區或連接肽，所述樞紐區或連接肽例如“-”、GS或如SEQ ID NO: 495-519的胺基酸序列所示。
在一些具體的實施例中，所述結合蛋白含有至少兩個蛋白功能區即蛋白功能區A和蛋白功能區B；所述蛋白功能區A和所述蛋白功能區B為PD-L1抗體、HER2抗體、B7H4抗體、CD3抗體、CTLA4抗體、4-1BB抗體或BCMA抗體中的一種。較佳地，所述蛋白功能區A為PD-L1抗體、HER2抗體、B7H4抗體或CD3抗體，所述蛋白功能區B為CTLA4抗體、4-1BB抗體或BCMA抗體。更佳地，所述蛋白功能區A為PD-L1抗體，所述蛋白功能區B為CTLA4抗體；或，所述蛋白功能區A為PD-L1抗體，所述蛋白功能區B為4-1BB抗體；或，所述蛋白功能區A為HER2抗體，所述蛋白功能區B為CTLA4抗體；或，所述蛋白功能區A為B7H4抗體，所述蛋白功能區B為4-1BB抗體；或，所述蛋白功能區A為CD3抗體，所述蛋白功能區B為BCMA抗體。
在一些具體的實施例中，所述PD-L1抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 167、188和211所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 15、62和122所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 167、188和211所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 15、69和122所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。優選地，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 282所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 233所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 282所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 240所示的胺基酸序列。更優選地，所述PD-L1抗體包含兩個多肽鏈；其中，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 347所示的胺基酸序列，第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 300所示的胺基酸序列；或，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 353所示的胺基酸序列，第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 308所示的胺基酸序列；或，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 353所示的胺基酸序列，第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 310所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述PD-L1抗體的如本領域已知的atezolizumab的胺基酸序列所示。
在一些具體的實施例中，所述HER2抗體的如本領域已知的trastuzumab或pertuzumab的胺基酸序列所示。
在一些具體的實施例中，所述B7H4抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 180、191和225所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 32、87和143所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 177、191和226所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 33、88和144所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。優選地，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 298所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 261所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 299所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 262所示的胺基酸序列。更優選地，所述B7H4抗體包含兩個多肽鏈；其中，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 360所示的胺基酸序列，第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 326所示的胺基酸序列；或，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 361所示的胺基酸序列，第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 327所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述CTLA4抗體包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 17、65和125所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。優選地，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 236所示的胺基酸序列。更優選地，所述CTLA4抗體包含一個多肽鏈，所述多肽鏈包括如SEQ ID NO: 303所示的胺基酸序列，如SEQ ID NO: 306所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述4-1BB抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 170、191和214所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 18、66和126所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 170、191和214所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 18、71和126所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。優選地，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 285所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 237所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 289所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 242所示的胺基酸序列。更優選地，所述4-1BB抗體包含兩個多肽鏈；其中，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 350所示的胺基酸序列，第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 304所示的胺基酸序列；或，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 355所示的胺基酸序列，第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 311所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述4-1BB抗體包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 27、79和137所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 28、80和138所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 29、82和138所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 28、89和145所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 28、81和139所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 15、83和140所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照 Chothia 定義規則所示。優選地，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 252所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 253所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 255所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 264所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 254所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 256所示的胺基酸序列。更優選地，所述4-1BB抗體包含一個多肽鏈，所述多肽鏈包括如SEQ ID NO: 320所示的胺基酸序列，如SEQ ID NO: 321所示的胺基酸序列，如SEQ ID NO: 323所示的胺基酸序列，如SEQ ID NO: 322所示的胺基酸序列，如SEQ ID NO: 324所示的胺基酸序列，或如SEQ ID NO: 329所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述CD3抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 177、191和221所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 15、84和141所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 178、197和222所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 31、85和142所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 177、191和223所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 31、86和141所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 179、198和224所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 31、85和142所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照 Chothia 定義規則所示。優選地，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 294所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 258所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 295所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 259所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 296所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 260所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 297所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 259所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述CD3抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 20、68和128所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照 Chothia 定義規則所示。優選地，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 245所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 257所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 281所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 244所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述CD3抗體包含兩種多肽鏈；其中，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列，第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 313所示的胺基酸序列；或，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列，第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 325所示的胺基酸序列；或，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列，第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 328所示的胺基酸序列；或，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列，第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 346所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述CD3抗體包含一個多肽鏈，所述多肽鏈包括如SEQ ID NO: 489所示的胺基酸序列，如SEQ ID NO: 490所示的胺基酸序列，如SEQ ID NO: 491所示的胺基酸序列，如SEQ ID NO: 492所示的胺基酸序列，或，如SEQ ID NO: 493所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述BCMA抗體包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 15、75和133所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 24、76和134所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 25、77和135所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 26、78和136所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照 Chothia 定義規則所示。優選地，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 248所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 249所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 250所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 251所示的胺基酸序列。更優選地，所述BCMA抗體包含一個多肽鏈，所述多肽鏈包含如SEQ ID NO: 316所示的胺基酸序列，如SEQ ID NO: 317所示的胺基酸序列，如SEQ ID NO: 318所示的胺基酸序列，或，如SEQ ID NO: 319所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述BCMA抗體包含重鏈可變區，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 26、90和136所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 34、78和146所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、78和147所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、90和147所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 36、90和146所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、76和147所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 34、78和148所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、76和136所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、90和146所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 34、76和136所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、76和146所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 34、76和146所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、90和148所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、90和136所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照 Chothia 定義規則所示。優選地，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 265所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 266所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 267所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 268所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 269所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 270所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 271所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 272所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 273所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 274所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 275所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 276所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 277所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 278所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 279所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 280所示的胺基酸序列。更優選地，所述BCMA抗體包含一個多肽鏈，所述多肽鏈包含如SEQ ID NO: 330所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 331所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 332所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 333所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 334所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 335所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 336所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 337所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 338所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 339所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 340所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 341所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 342所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 343所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 344所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 345所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述蛋白功能區C是BCMA重鏈抗體的重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 24、76和134所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 26、78和136所示的胺基酸序列。優選地，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 249所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 251所示的胺基酸序列。
在以上具體實施例中，所述結合蛋白還可以包括輕鏈恆定區，所述輕鏈恆定區優選人輕鏈恆定區，更優選人輕鏈恆定區Cκ或Cλ。
在以上具體實施例中，所述結合蛋白還可以包括重鏈恆定區(CH1、CH2和/或CH3)，所述重鏈恆定區優選人重鏈恆定區，更優選人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4重鏈恆定區。在一些具體實施例中，所述IgG1重鏈恆定區的Fc上具有C220S、N297A、L234A、L235A、P329G、S239D、I332E、S354C、T366W 、Y349C、T366S、L368A、Y407V、M252Y、S254T、T256E 等突變中的一種或多種，所述突變位址使用EU編號規則。
在一些優選的實施例中，所述結合蛋白含有蛋白功能區A和蛋白功能區B：所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 167、188和211所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 15、69和122所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 17、65和125所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 167、188和211所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 15、62和122所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 17、65和125所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 171、190和215所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 19、67和127所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 17、65和125所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 176、196和220所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 23、74和132所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 17、65和125所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 167、188和211所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 15、69和122所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 28、80和138所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 167、188和211所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 15、69和122所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 27、79和137所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 167、188和211所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 15、69和122所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 29、82和138所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 180、191和225所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 32、87和143所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 28、80和138所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 180、191和225所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 32、87和143所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 27、79和137所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 180、191和225所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 32、87和143所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 28、89和145所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 177、191和226所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 33、88和144所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 28、80和138所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 177、191和226所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 33、88和144所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 28、81和139所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 177、191和226所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 33、88和144所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 15、83和140所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 20、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 24、76和134所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 20、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 26、78和136所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 20、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 15、75和133所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 15、75和133所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 26、78和136所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 26、90和136所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 36、90和146所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、76和147所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 34、78和148所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、76和136所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、90和146所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 34、76和136所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、76和146所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 34、76和146所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、90和148所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、90和136所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 34、78和146所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、78和147所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、90和147所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 177、191和221所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 15、84和141所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 26、78和136所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 178、197和222所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 31、85和142所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 26、78和136所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 177、191和223所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 31、86和141所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 26、78和136所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 179、198和224所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 31、85和142所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 26、78和136所示的胺基酸序列；或，
在一些優選的實施例中，所述結合蛋白含有蛋白功能區A、蛋白功能區B和蛋白功能區C：其中，所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 15、75和133所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區C包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 24、76和134所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 25、77和135所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區C包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 26、78和136所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照 Chothia 定義規則所示。
在一些更優選的實施例中，所述結合蛋白包括蛋白功能區A和蛋白功能區B：所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 282所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 240所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 236所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 282所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 233所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 236所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 286所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 238所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 236所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 293所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 247所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 236所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 282所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 240所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 253所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 282所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 240所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 252所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 282所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 240所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 255所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 298所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 261所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 253所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 298所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 261所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 252所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 298所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 261所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 264所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 299所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 262所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 253所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 299所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 262所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 254所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 299所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 262所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 256所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 245所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 249所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 245所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 251所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 245所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 248所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 257所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 248所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 257所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 251所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 281所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 251所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 251所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 265所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 269所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 270所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 271所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 272所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 273所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 274所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 275所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 276所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 277所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 278所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 279所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 280所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 266所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 267所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 268所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 244所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 249所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 244所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 251所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 294所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 258所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 251所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 295所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 259所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 251所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 296所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 260所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 251所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 297所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 259所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 251所示的胺基酸序列；或，
在一些更優選的實施例中，所述結合蛋白含有蛋白功能區A、蛋白功能區B和蛋白功能區C：其中，所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 257所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 248所示的胺基酸序列。所述蛋白功能區C包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 249所示的胺基酸序列；或，
所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 257所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 250所示的胺基酸序列。所述蛋白功能區C包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 251所示的胺基酸序列。
在一些更優選的實施例中，所述結合蛋白包含兩種多肽鏈。其中，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 371所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 372所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 371所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 373所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 353所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 362所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 363所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 364所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 365所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 364所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 353所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 366所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 353所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 369所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 353所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 370所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 353所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 394所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 353所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 395所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 363所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 310所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 363所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 396所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 363所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 362所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 363所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 394所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 363所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 395所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 367所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 368所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 367所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 378所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 367所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 379所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 367所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 380所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 367所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 381所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 367所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 382所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 367所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 383所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 367所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 385所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 367所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 388所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 367所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 389所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 374所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 375所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 386所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 387所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 401所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 402所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 305所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 403所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 402所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 409所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 359所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 404所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 405所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 315所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 359所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 406所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 376所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 377所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 397所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 398所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 399所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 400所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 402所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 401所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 402所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 403所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 405所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 404所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 405所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 406所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 371所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 486所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 353所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 460所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 353所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 461所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 353所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 462所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 487所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 488所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 360所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 455所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 360所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 456所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 360所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 457所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 360所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 458所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 360所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 459所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 419所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 412所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 419所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 414所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 440所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 428所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 441所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 428所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 442所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 428所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 443所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 428所示的胺基酸序列；或,， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 487所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 520所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 353所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 521所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 371所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 522所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 360所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 523所示的胺基酸序列。
在一些更優選的實施例中，所述結合蛋白包含三個多肽鏈。其中，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 353所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 407所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 390所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 353所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 408所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 392所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 391所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 390所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 393所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 392所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 391所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 434所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 391所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 435所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 393所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 436所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 393所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 437所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 367所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 438所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 434所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 367所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 438所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 435所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 367所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 439所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 436所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 367所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 439所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 437所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 361所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 481所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 482所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 361所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 481所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 483所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 361所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 481所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 484所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 361所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 481所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 485所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 411所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 412所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 411所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 414所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 415所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 416所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 410所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 415所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 416所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 412所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 415所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 416所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 414所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 417所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 418所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 412所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 417所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 418所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 414所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 423所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 426所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 423所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 427所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 423所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 428所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 423所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 429所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 444所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 449所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 450所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 449所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 444所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 445所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 444所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 446所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 450所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 445所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 450所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 446所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 444所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 447所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 444所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 448所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 450所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 447所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 450所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 448所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 445所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 446所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 463所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 464所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 465所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 466所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 467所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 468所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 469所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 470所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 471所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 472所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 473所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 474所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 475所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 476所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 477所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 478所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 479所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 480所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 423所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 430所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 423所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 431所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 423所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 432所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 423所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 433所示的胺基酸序列。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案之二為：提供一種分離的核酸，其編碼如上所述結合蛋白。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案之三為：提供一種表現載體，其包含如上所述的分離的核酸。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案之四為：提供一種宿主細胞，其包含根據以上所述的表現載體，其中所述宿主細胞是原核細胞或真核細胞。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案之五為：提供一種如上所述結合蛋白的製備方法，其特徵在於，所述製備方法包括以下步驟：培養如上所述的宿主細胞，從培養物中獲得所述結合蛋白。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案之六為：提供一種藥物組成物，所述藥物組成物包含如上所述結合蛋白。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案之七為：提供一種套裝藥盒，所述套裝藥盒包括藥盒一和藥盒二，所述藥盒一包括如上所述結合蛋白或藥物組成物，所述藥盒二包括治療癌症的其它抗體或藥物組成物。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案之八為：提供一種如上所述結合蛋白或上所述的藥物組成物在製備治療和/或預防癌症的藥物中的應用。所述的癌症優選乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、腎癌、黑色素瘤、肺癌、胃癌、肝癌、食管癌、子宮頸癌、頭頸部腫瘤、膽管癌、膽囊癌、膀胱癌、肉瘤、結直腸癌、淋巴瘤或者多發性骨髓瘤。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案之九為：提供一種治療癌症的方法，其特徵在於，向有需要的受試者施用如本發明技術方案之一所述的結合蛋白，或如技術方案之六所述的藥物組成物，或如技術方案之七所述的套裝藥盒；優選地，還包括施用治療癌症的其它抗體例如免疫檢查點抗體和/或化療藥物。
所述的癌症優選乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、腎癌、黑色素瘤、肺癌、胃癌、肝癌、食管癌、子宮頸癌、頭頸部腫瘤、膽管癌、膽囊癌、膀胱癌、肉瘤、結直腸癌、淋巴瘤或者多發性骨髓瘤。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案之十為：提供一種CD3抗體。
所述CD3抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 177、191和221所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 15、84和141所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 178、197和222所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 31、85和142所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 177、191和223所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 31、86和141所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 179、198和224所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 31、85和142所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照 Chothia 定義規則所示。優選地，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 294所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 258所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 295所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 259所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 296所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 260所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 297所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 259所示的胺基酸序列。
或，所述CD3抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 20、68和128所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照 Chothia 定義規則所示。優選地，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 245所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 257所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 281所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 244所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述CD3抗體包含兩種多肽鏈；其中，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列，第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 313所示的胺基酸序列；或，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列，第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 325所示的胺基酸序列；或，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列，第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 328所示的胺基酸序列；或，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列，第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 346所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述CD3抗體包含一個多肽鏈，所述多肽鏈包括如SEQ ID NO: 489所示的胺基酸序列，如SEQ ID NO: 490所示的胺基酸序列，如SEQ ID NO: 491所示的胺基酸序列，如SEQ ID NO: 492所示的胺基酸序列，或，如SEQ ID NO: 493所示的胺基酸序列。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案之十一為：提供一種BCMA抗體。
所述BCMA抗體包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 15、75和133所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 24、76和134所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 25、77和135所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 26、78和136所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。優選地，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 248所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 249所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 250所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 251所示的胺基酸序列。更優選地，所述BCMA抗體包含一個多肽鏈，所述多肽鏈包含如SEQ ID NO: 316所示的胺基酸序列，如SEQ ID NO: 317所示的胺基酸序列，如SEQ ID NO: 318所示的胺基酸序列，或，如SEQ ID NO: 319所示的胺基酸序列。
或，所述BCMA抗體包含重鏈可變區，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 26、90和136所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 34、78和146所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、78和147所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、90和147所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 36、90和146所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、76和147所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 34、78和148所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、76和136所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、90和146所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 34、76和136所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、76和146所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 34、76和146所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、90和148所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、90和136所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在一些具體的實施例中，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 265所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 266所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 267所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 268所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 269所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 270所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 271所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 272所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 273所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 274所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 275所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 276所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 277所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 278所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 279所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 280所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述BCMA抗體包含一個多肽鏈，所述多肽鏈包含如SEQ ID NO: 330所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 331所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 332所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 333所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 334所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 335所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 336所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 337所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 338所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 339所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 340所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 341所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 342所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 343所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 344所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 345所示的胺基酸序列。 本發明的積極進步效果：
本發明提供了利用全人源重鏈抗體及其衍生的單域抗體所建構的二價至多價和雙特異性或多特異性結合蛋白以及製備和使用此類結合蛋白的方法。其相較於利用常規IgG抗體建構的二價至多價和雙特異性或多特異性結合蛋白有諸多優勢，在調整特異性和結合價數方面更為靈活；可以建構分子量較小的、多肽鏈較少的、結構更簡單的多特異性結合蛋白；而且可以利用不同的結構來實現不同的生物學功能。
在一些具體實施例中，透過不同的結構類型、相對位置、結合價數等參數來調節針對不同標的的功能活性，進而設計出不同的活性組合，以滿足不同的臨床聯合用藥劑量組合的需求。在一些具體實施例中，利用重鏈抗體VH域可以較方便地串聯形成多價結構，可以透過與標的的多價結合促使標的的交聯，進一步增強標的交聯所誘導的生物學功能。在一些具體實施例中，利用重鏈抗體VH域可以實現諸如“1+3”非對稱四價結構，類似結構難以用常規IgG抗體衍生的結構來實現。
具體實施方式
以下由特定的具體實施例說明本申請發明的實施方式，熟悉此技術的人士可由本說明書所公開的內容容易地瞭解本申請發明的其他優點及效果。
在本申請中，術語“抗體”或者“H2L2”通常是指常規的四鏈抗體。大多數物種中的抗體呈現“Y”型的四聚體結構，其包含兩個完全相同的重鏈(H鏈)和兩個完全相同的輕鏈(L鏈)，也稱為“H2L2”。重鏈包括靠近N端的重鏈可變區(VH)和靠近C端的重鏈恆定區(CH)；輕鏈包括靠近N端的輕鏈可變區(VL)和靠近C端的輕鏈恆定區(CL)。IgG抗體的重鏈恆定區有3個結構域，分別為CH1、CH2和CH3；CH1和CH2之間還有一段樞紐區(hinge)。輕鏈根據κ和λ的不同，其輕鏈可變區進一步分為Vκ和Vλ，與之對應的輕鏈恆定區分別為Cκ和Cλ。抗體的可變區是其辨識和結合抗原的主要部位；抗體的可變區結構域VH和VL以及恆定區結構域CH1和CL共同組成了抗原結合片段(Fab)。CH2和CH3組成了可結晶片段(Fc)，是發揮抗體的效應功能如補體依賴的細胞毒作用(CDC)和抗體依賴的細胞媒介的細胞毒作用(ADCC)以及影響抗體的血清半衰期的主要區域。
在本申請中，術語“重鏈抗體”或者“HCAb”通常是指一類只含有重鏈二聚體的抗體。在駱駝科及鯊魚科動物血清中天然存在一種缺失輕鏈的重鏈抗體(heavy-chain antibody, HCAb)。來源於駱駝科的重鏈抗體與常規H2L2抗體相比，除了缺少輕鏈外，其重鏈可變區與樞紐區之間沒有CH1區，只含有一個重鏈可變區(VHH)和兩個重鏈恆定結構域(CH2和CH3)；其基本結構為重鏈二聚體。駱駝科動物的重鏈抗體的VHH片段與常規抗體的VH特徵不同，其單獨選殖並表現出來的VHH結構具有與原重鏈抗體相當的結構穩定性以及與抗原的結合活性，分子量只有約13 KDa，因此也被稱作奈米抗體或單域抗體。
在本申請中，術語“結合蛋白”或者“抗原結合蛋白”通常是指包含結合抗原的部分的蛋白質，以及任選地允許結合抗原的部分採用促進抗原結合蛋白與抗原結合的構形的支架或骨架部分。可典型地包含抗體輕鏈可變區(VL)、抗體重鏈可變區(VH)或上述兩者。VH和VL區可進一步被區分為稱為互補決定區(CDR)的高度變異區，它們散佈在稱為框架區(FR)的更保守的區域中。每個VH和VL可由三個CDR和四個FR區構成，它們從胺基端至羧基端可按以下順序排列：FR-1、CDR1、FR-2、CDR2、FR-3、CDR3和FR-4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。VH的三個CDR分別表示為HCDR1、HCDR2和HCDR3，也可表示為VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；VL的三個CDR分別表示為LCDR1、LCDR2和LCDR3，也可表示為VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。抗原結合蛋白的實例包括但不限於抗體、抗原結合片段(Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb)、免疫綴合物、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、抗體片段、抗體衍生物、抗體類似物或融合蛋白等，只要它們顯示出所需的抗原結合活性即可。
在本申請中，所述CDR的胺基酸序列均是按照Chothia定義規則所示出的。但是，本領域人員公知，在本領域中可以透過多種方法來定義抗體的CDR，例如基於序列可變性的Kabat定義規則(參見，Kabat等人，免疫學的蛋白質序列，第五版，美國國立衛生研究院，貝塞斯達，馬里蘭州(1991))和基於結構環區域位置的Chothia定義規則(參見JMol Biol 273:927-48,1997)。在本發明的技術方案中，還可以使用包含了Kabat定義和Chothia定義的Combined定義規則來確定可變結構域序列中的胺基酸殘基。其中Combined定義規則即是將Kabat定義和Chothia定義的範圍相結合，基於此取了一個更大的範圍，詳見下表。本領域技術人員應當理解的是，除非另有規定，否則術語給定抗體或其區(例如可變區)的“CDR”及“互補決定區”應瞭解為涵蓋如透過本發明描述的上述已知方案中的任何一種界定的互補決定區。雖然本發明中請求保護的範圍是基於Chothia定義規則所示出的序列，但是根據其他CDR的定義規則所對應的胺基酸序列也應當落在本發明的保護範圍中。 表-I 本申請抗體CDR定義方法
  Kabat Chothia Combined
LCDR1 L24--L34 L24--L34 L24-L34
LCDR2 L50--L56 L50--L56 L50-L56
LCDR3 L89--L97 L89--L97 L89-L97
HCDR1 H31--H35 H26--H32 H26-H35
HCDR2 H50--H65 H52--H56 H50-H65
HCDR3 H95--H102 H95--H102 H95-H102
其中，Laa-Lbb可以指從抗體輕鏈的N端開始，第aa位(Chothia編碼規則)至第bb位(Chothia編碼規則)的胺基酸序列；Haa-Hbb可以指從抗體重鏈的N端開始，第aa位(Chothia編碼規則)至第bb位(Chothia編碼規則)的胺基酸序列。例如，L24-L34可以指從抗體輕鏈N端開始，按照Chothia編碼規則的從第24位至第34位的胺基酸序列；H26-H32可以指從抗體重鏈N端開始，按照Chothia編碼規則的從第26位至第32位的胺基酸序列。本領域技術人員應當知曉的是，在用Chothia編碼CDR時，有些位置會有插入位址的情況(可參見http://bioinf.org.uk/abs/)。
在本申請中，術語“單株抗體”通常是指從一群基本上同質的抗體獲得的抗體，即群體中的個別抗體是相同的，除了可能存在的少量的自然突變。單株抗體通常針對單個抗原位址具有高度特異性。而且，與常規多株抗體製劑(通常具有針對不同決定簇的不同抗體)不同，各單株抗體是針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性之外，單株抗體的優點在於它們可以透過融合瘤培養合成，不受其他免疫球蛋白污染。修飾語“單株”表示從基本上同質的抗體群體獲得的抗體的特徵，並且不被解釋為需要透過任何特定方法產生抗體。例如，根據本發明使用的單株抗體可以在融合瘤細胞中製備，或者可以透過重組DNA方法製備。
在本申請中，術語“全人源抗體”通常是指將人類編碼抗體的基因全部轉移至基因工程改造的抗體基因缺失動物中，使動物表現的抗體。抗體所有部分(包括抗體的可變區和恆定區)均由人類來源的基因所編碼。全人源抗體可以大大減少異源抗體對人體造成的免疫副反應。本領域獲得全人源抗體的方法可以有噬菌體展示技術、基因轉殖小鼠技術等。
在本申請中，術語“全人源重鏈抗體”通常是指利用Harbour HCAb基因轉殖小鼠(專利申請WO2007/096779)得到的具有人源抗體可變區VH的重鏈抗體。該基因轉殖小鼠的內源的抗體重鏈基因座和輕鏈基因座都被剔除或者失活，使其無法產生小鼠的抗體；然後將人源的抗體重鏈基因片段(V，D，J片段)轉入該小鼠，利用該小鼠自身的重排和突變機制產生具有人源抗體基因序列的抗體，其可變區為人源VH。將該人源VH與人源的重鏈恆定區Fc進行融合重組即得到全人源重鏈抗體。
在本申請中，術語“特異性結合”通常是指抗體透過其抗原結合域與表位結合，並且該結合需要抗原結合域和表位之間的一些互補性。根據該定義，當抗體相比於其將結合隨機的，不相關的表位而言更容易透過其抗原結合域與表位結合時，抗體被稱為“特異性結合”該抗原。“表位”是指抗原上與抗原結合蛋白(如抗體)結合的特定的原子基團(例如，醣側鏈、磷醯基、磺醯基)或胺基酸。
在本申請中，術語“Fab”通常指常規抗體(例如IgG)中與抗原結合的部分，包括抗體的重鏈可變區VH、輕鏈可變區VL和重鏈恆定區結構域CH1以及輕鏈恆定區CL。在常規抗體中，VH的C端與CH1的N端聯結形成重鏈Fd片段，VL的C端與CL的N端聯結形成輕鏈，CH1的C端又進一步與重鏈的樞紐區和其他恆定區結構域聯結形成重鏈。在一些實施例中，“Fab”也指Fab的變體結構。例如，在某些實施例中，VH的C端與CL的N端聯結形成一個多肽鏈，VL的C端與CH1的N端聯結形成另一個多肽鏈，形成 Fab(cross VH/VL) 的結構；在某些實施例中，Fab的CH1不與樞紐區聯結，而是CL的C端與重鏈的樞紐區聯結，形成 Fab(cross Fd/LC) 的結構。
在本申請中，術語“VH”通常指抗體的重鏈可變區VH結構域，即可以是人或者其他動物的常規抗體(H2L2結構)的重鏈可變區VH，也可以是駱駝科等動物的重鏈抗體(HCAb結構)的重鏈可變區VHH，還可以是利用Harbour HCAb基因轉殖小鼠產生的全人源重鏈抗體(HCAb結構)的重鏈可變區VH。
在本申請中，術語“結合結構域”(binding moieties)通常指任何可以與抗原特異結合的蛋白功能區域，既可以是“Fab”，也可以是“VH”，還可以是其他抗原結合形式(例如脂質運載蛋白(lipocalins)、神經細胞粘附分子(NCAM)、纖維結合蛋白(fibronectin)、錨蛋白重複片段蛋白(DARPins)等衍生蛋白結構)。
在本申請中，術語“結合價數”通常指結合蛋白中的“結合結構域”的數目，也是指該結合蛋白能夠結合抗原分子或者表位的最大數目，例如常規IgG抗體能同時結合兩個相同的抗原分子，其結合價數為二；而Fab抗體的結合價數為一。
在本申請中，術語“雙特異性結合蛋白”通常指具有兩種抗原結合特異性的結合蛋白。兩種抗原結合特異性可以是結合兩種不同的抗原或是結合同種抗原的兩個不同表位。雙特異性結合蛋白可典型地包括雙特異性抗體及其衍生物等。
在本申請中，術語“多特異性結合蛋白”通常指具有兩種或以上抗原結合特異性的結合蛋白。多特異性結合蛋白可典型地包括多特異性抗體及其衍生物等。
在本申請中，術語“MFI”(Mean Fluorescent Intensity)通常指流式細胞術FACS中分析的螢光強度信號及其數學平均值，通常可以用專業軟體如FlowJo (FlowJo, LLC) 等對流式細胞儀產生的資料進行處理和分析得到。
在本申請中，術語“PD-L1”通常是指程式性死亡配體1蛋白、其功能變體和/或其功能片段。PD-L1也稱為分化簇274(CD274)或B7同源物1(B7-H1)，並且是由(人類中)CD274基因編碼的蛋白。PD-L1序列是本領域已知的。例如，示例性的全長人PD-L1蛋白的胺基酸序列可在NCBI登錄號NP_054862或UniProt登錄號Q9NZQ7下找到；示例性的全長食蟹猴PD-L1蛋白序列可在NCBI登錄號XP_005581836或Uniprot登錄號G7PSE7下找到。
在本申請中，術語“PD-1”通常是指程式性死亡1受體(也稱為CD279)、其功能變體和/或其功能片段。PD-1序列是本領域已知的。例如，示例性的全長人PD-1蛋白序列可在NCBI登錄號NP_005009下找到；示例性的全長食蟹猴的PD-1蛋白序列可在NCBI登錄號NP_001271065或Uniprot登錄號B0LAJ3下找到。
在本申請中，術語“CD80”通常是指分化簇蛋白80(也稱為B7-1)、其功能變體和/或其功能片段。CD80序列是本領域已知的。例如，示例性的全長的人CD80序列可以在Uniprot登錄號P33681中找到。
在本申請中，術語“CTLA4”通常是指細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白-4(也稱為CD152)、其功能變體和/或其功能片段。CTLA4序列是本領域已知的。例如，示例性的全長的人CTLA4序列可以在Uniprot登錄號P16410中找到；示例性的全長的食蟹猴CTLA4序列可以在Uniprot登錄號G7PL88中找到。
在本申請中，術語“HER2”通常是指受體酪胺酸激酶erbB-2(也稱為ERBB2)、其功能變體和/或其功能片段。HER2序列是本領域已知的。例如，示例性的全長的人HER2序列可以在Uniprot登錄號P04626中找到；示例性的全長的食蟹猴HER2序列可以在NCBI登錄號XP_005584091中找到。
在本申請中，術語“B7H4”通常是指含V-Set域T細胞活化抑制激素1(也稱為VTCN1)、其功能變體和/或其功能片段。B7H4序列是本領域已知的。例如，示例性的全長的人B7H4序列可以在Uniprot登錄號Q7Z7D3中找到；示例性的全長的食蟹猴B7H4序列可以在NCBI登錄號XP_005542249中找到；示例性的全長的小鼠B7H4序列可以在Uniprot登錄號Q7TSP5中找到。
在本申請中，術語“4-1BB”通常是指腫瘤壞死激素受體超家族成員9(也稱為CD137，4-1BBL受體)、其功能變體和/或其功能片段。4-1BB序列是本領域已知的。例如，示例性的全長的人4-1BB序列可以在Uniprot登錄號Q07011中找到；示例性的全長的食蟹猴4-1BB序列可以在NCBI登錄號XP_005544945中找到。
在本申請中，術語“BCMA”通常是指腫瘤壞死激素受體超家族成員17(也稱為CD269，B細胞成熟蛋白)、其功能變體和/或其功能片段。BCMA序列是本領域已知的。例如，示例性的全長的人BCMA序列可以在Uniprot登錄號Q02223中找到；示例性的全長的食蟹猴BCMA序列可以在NCBI登錄號XP_005591343中找到。
在本申請中，術語“BAFF”通常是指腫瘤壞死激素配體超家族成員13B(也稱為CD257，B細胞活化激素)、其功能變體和/或其功能片段。BAFF序列是本領域已知的。例如，示例性的全長的人BAFF序列可以在Uniprot登錄號Q9Y275中找到。
在本申請中，術語“APRIL”通常是指腫瘤壞死激素配體超家族成員13(也稱為CD256，增殖誘導配體)、其功能變體和/或其功能片段。APRIL序列是本領域已知的。例如，示例性的全長的人APRIL序列可以在Uniprot登錄號O75888中找到。
在本申請中，術語“CD3”通常是指T細胞上的TCR/CD3受體蛋白複合物。T細胞反應的特異性透過由TCR和CD3的分子複合物對pMHC的辨識來媒介。TCR是由兩條不同跨膜多肽鏈構成的異二聚體，肽鏈有α、β、γ、δ四種；根據肽鏈的不同組合，TCR分為TCRαβ和TCRγδ。CD3有不同的跨膜多肽鏈即γ、δ、ε、ζ，這些肽鏈相互作用形成同源二聚體或異源二聚體，作為TCR-CD3複合物的一部分。由於TCR肽鏈的胞質區很短，一般認為TCR辨識抗原所產生的活化信號由CD3肽鏈轉導至T細胞內。
在本申請中，術語“CD3E”通常是指“CD3”的 ε 肽鏈。CD3E序列是本領域已知的。例如，示例性的全長的人CD3E序列可以在Uniprot登錄號P07766中找到，示例性的全長的食蟹猴CD3E序列可以在Uniprot登錄號Q95LI5中找到。實施例
下面透過實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在所述的實施例範圍之中。實施例不包括對傳統方法的詳細描述，如那些用於建構載體和質體的方法，將編碼蛋白的基因插入到這樣的載體和質體的方法或將質體引入宿主細胞的方法。這樣的方法對於本領域中具有普通技術的人員是眾所周知的，並且在許多出版物中都有所描述。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。實施例 1. 基於 HCAb 的多特異性結合蛋白的結構設計
本實施例列舉了若干種利用全人源重鏈抗體(HCAb)及其衍生的單域抗體(sdAb)所建構的含有Fc的、對稱或者非對稱的、多價和多特異性結合蛋白的結構。在有些結構中，結構域和結構域之間用連接肽進行聯結。在有些結構中，重鏈的Fc區域引入了胺基酸突變以改變其與Fc受體的結合進而改變相關的效應功能或者其他性能。在有些結構中，兩個重鏈的Fc區域各引入了不同的胺基酸突變以減少重鏈同源二聚化的形成。
表1-1和圖1列出了本發明申請所包含的多特異性結合蛋白分子結構，每一個結構會在下文進一步描述。在本實施例以及本發明申請的其他部分，當提及分子結構所含多肽鏈數目的時候，通常是指“不同的多肽鏈”的數目；例如常規IgG抗體有兩條不同的多肽鏈，即重鏈和輕鏈，儘管IgG抗體分子本身是含有兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈的四肽鏈蛋白分子，但是描述其結構特徵時特指其兩條不同的多肽鏈。結合價數是指該分子結構中的抗原結合位址的數目，例如常規IgG抗體能同時結合兩個相同的抗原分子，其結合價數為二。表1-2列出了本發明申請的結構設計中可能用到的連接肽序列。表 1-1 本發明申請所列舉的基於 HCAb 的多特異性結合蛋白分子結構
結構編號 結構模式名稱 結構類型 結合價數 對稱性 不同的多肽鏈數目
1 Fab(CL)-VH-Fc Fab-HCAb 四價 對稱 2
2 Fab(CH1)-VH-Fc Fab-HCAb 四價 對稱 2
3 VH-IgG_HC IgG-VH 四價 對稱 2
4 VH-IgG_LC IgG-VH 四價 對稱 2
5 IgG_HC-VH IgG-VH 四價 對稱 2
6 IgG_LC-VH IgG-VH 四價 對稱 2
7 IgG_HC-VH-VH IgG-VH(2) 六價 對稱 2
8 IgG_HC-VH’-VH” IgG-VH(2) 六價 對稱 2
9 2xVH-IgG(HC+LC) 2xVH-IgG 六價 對稱 2
10 (VH’+VH”)-IgG(HC+LC) 2xVH-IgG 六價 對稱 2
11 Fab-Fc-VH Fab-Fc-VH 二價 非對稱 3
12 Fab(cross VH/VL)-Fc-VH Fab-Fc-VH 二價 非對稱 3
13 Fab(cross Fd/LC)-Fc-VH Fab-Fc-VH 二價 非對稱 3
14 Fab-Fc-VH-VH Fab-Fc-VH(2) 三價 非對稱 3
15 Fab-Fc-VH’-VH” Fab-Fc-VH(2) 三價 非對稱 3
16 Fab(cross VH/VL)-Fc-VH-VH Fab-Fc-VH(2) 三價 非對稱 3
17 Fab(cross VH/VL)-Fc-VH’-VH” Fab-Fc-VH(2) 三價 非對稱 3
18 Fab(cross Fd/LC)-Fc-VH-VH Fab-Fc-VH(2) 三價 非對稱 3
19 Fab(cross Fd/LC)-Fc-VH’-VH” Fab-Fc-VH(2) 三價 非對稱 3
20 scFv(VL-VH)-Fc-VH scFv-Fc-VH 二價 非對稱 2
21 scFv(VH-VL)-Fc-VH scFv-Fc-VH 二價 非對稱 2
22 scFv(VL-VH)-Fc-VH-VH scFv-Fc-VH(2) 三價 非對稱 2
23 scFv(VH-VL)-Fc-VH-VH scFv-Fc-VH(2) 三價 非對稱 2
24 scFv(VL-VH)-Fc-VH’-VH” scFv-Fc-VH(2) 三價 非對稱 2
25 scFv(VH-VL)-Fc-VH’-VH” scFv-Fc-VH(2) 三價 非對稱 2
26 Fab-Fc-VH-VH-VH Fab-Fc-VH(3) 四價 非對稱 3
27 Fab-Fc-VH’-VH’’-VH’’’ Fab-Fc-VH(3) 四價 非對稱 3
表 1-2 連接肽序列
連接肽名字 長度 連接肽序列 SEQ ID NO
GS_2 2 GS 無
GS_4 4 GSGS 495
GS_5 5 GGGGS 496
GS_6 6 GGSGGS 497
GS_7 7 GGGGSGS 498
GS_15 15 GGGGSGGGGSGGGGS 499
GS_20 20 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 500
GS_25 25 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 501
H1_15 15 EPKSSDKTHTPPPPP 502
UH1 6 EPKSSD 503
LH1 10 DKTHTCPPCP 504
G5-LH 15 GGGGG DKTHTCPPCP 505
H1_15-RT 17 EPKSSDKTHTPPPPPRT 506
AS-GS_15 17 ASGGGGSGGGGSGGGGS 507
L-GS_15-RT 18 LGGGGSGGGGSGGGGSRT 508
L-H1_15-RT 18 LEPKSSDKTHTPPPPPRT 509
KL-H1_15-RT 19 KLEPKSSDKTHTPPPPPRT 510
KL-H1_15-AS 19 KLEPKSSDKTHTPPPPPAS 511
RT-GS_5-KL 9 RTGGGGSKL 512
RT-GS_15-KL 19 RTGGGGSGGGGSGGGGSKL 513
RT-GS_25-KL 29 RTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSKL 514
人IgG1樞紐 15 EPKSCDKTHTCPPCP 515
人IgG1樞紐 (C220S) 15 EPKSS DKTHTCPPCP 516
人IgG2樞紐 12 ERKCCVECPPCP 517
人IgG4樞紐 12 ESKYGPPCPSCP 518
人IgG4樞紐 (S228P) 12 ESKYGPPCPP CP 519
實施例 1.1. Fab-HCAb 對稱結構
本發明提供了一種使用兩種親代單株抗體建構雙特異性結合蛋白的方法：結合第一抗原的常規抗體A和結合第二抗原的重鏈抗體B。
如圖1的(1) -(2)所示，Fab端來源於常規抗體A，VH_A和VL_A分別為抗體A的重鏈可變區和輕鏈可變區。VH端來源於重鏈抗體B，VH_B為重鏈抗體B的重鏈可變區。CL是輕鏈恆定區結構域。CH1、CH2和CH3分別是重鏈恆定區的第一、第二和第三結構域。L1和L2分別是第一和第二連接肽。實施例 1.1.1. 結構 (1) : Fab(CL)-VH-Fc
結構 (1) 的結合蛋白包含兩條不同的多肽鏈：多肽鏈1或第一多肽鏈，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CH1；多肽鏈2或第二多肽鏈，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL-L1-VH_B-L2-CH2-CH3。在結構 (1) 中，抗體A的VL_A和重鏈抗體B的VH_B融合在同一條多肽鏈上，這樣可以避免VL_A和VH_B的締合產生的錯配副產物。
多肽鏈2的VH_B經由連接肽L2聯結到CH2；L2可以是IgG的樞紐區或者樞紐區衍生的連接肽序列或是表1-2中所列序列，優選為人IgG1樞紐或者人IgG1樞紐 (C220S)或者G5-LH的序列。
在一個實施方案中，多肽鏈2的CL與VH_B直接融合聯結，即L1的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的CL經由連接肽L1聯結到VH_B；L1可以是表1-2中所列序列。實施例 1.1.2. 結構 (2) : Fab(CH1)-VH-Fc
結構 (2) 的結合蛋白包含兩條不同的多肽鏈：多肽鏈1或第一多肽鏈，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL；多肽鏈2或第二多肽鏈，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CH1-L1-VH_B-L2-CH2-CH3。
多肽鏈2的VH_B經由連接肽L2聯結到CH2；L2可以是IgG的樞紐區或者樞紐區衍生的連接肽序列或是表1-2中所列序列，優選為人IgG1樞紐或者人IgG1樞紐 (C220S) 或者G5-LH的序列。
在一個實施方案中，多肽鏈2的CH1與VH_B直接融合聯結，即L1的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的CH1經由連接肽L1聯結到VH_B；L1可以是表1-2中所列序列。實施例 1.2. IgG-VH 四價對稱結構
本發明提供了一種使用兩種親代單株抗體建構雙特異性結合蛋白的方法：結合第一抗原的常規抗體A和結合第二抗原的重鏈抗體B。
如圖1的(3) - (6)所示，Fab端來源於常規抗體A，VH_A和VL_A分別為抗體A的重鏈可變區和輕鏈可變區。VH端來源於重鏈抗體B，VH_B為重鏈抗體B的重鏈可變區。CL是輕鏈恆定區結構域。CH1、CH2和CH3分別是重鏈恆定區的第一、第二和第三結構域。L是連接肽，h是IgG抗體的樞紐區或衍生序列。實施例 1.2.1. 結構 (3) : VH-IgG_HC
結構 (3) 的結合蛋白包含兩條不同的多肽鏈：多肽鏈1或第一多肽鏈，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL；多肽鏈2或第二多肽鏈，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_B-L-VH_A-CH1-h-CH2-CH3。
在一個實施方案中，多肽鏈2的VH_B與VH_A直接融合聯結，即L的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的VH_B經由連接肽L聯結到VH_A；L可以是表1-2中所列序列。實施例 1.2.2. 結構 (4) : VH-IgG_LC
結構 (4) 的結合蛋白包含兩條不同的多肽鏈：多肽鏈1或第一多肽鏈，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_B-L-VL_A-CL；多肽鏈2或第二多肽鏈，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CH1-h-CH2-CH3。
在一個實施方案中，多肽鏈1的VH_B與VL_A直接融合聯結，即L的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈1的VH_B經由連接肽L聯結到VL_A；L可以是表1-2中所列序列。實施例 1.2.3. 結構 (5) : IgG_HC-VH
結構 (5) 的結合蛋白包含兩條不同的多肽鏈：多肽鏈1或第一多肽鏈，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL；多肽鏈2或第二多肽鏈，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CH1-h-CH2-CH3-L-VH_B。
在一個實施方案中，多肽鏈2的CH3與VH_B直接融合聯結，即L的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的CH3經由連接肽L聯結到VH_B；L可以是表1-2中所列序列。實施例 1.2.4. 結構 (6) : IgG_LC-VH
結構 (6) 的結合蛋白包含兩條不同的多肽鏈：多肽鏈1或第一多肽鏈，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL-L-VH_B；多肽鏈2或第二多肽鏈，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CH1-h-CH2-CH3。
在一個實施方案中，多肽鏈1的CL與VH_B直接融合聯結，即L的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈1的CL經由連接肽L聯結到VH_B；L可以是表1-2中所列序列。實施例 1.3. IgG-VH(2) 六價對稱結構
本發明提供了一種使用兩種親代單株抗體建構雙特異性結合蛋白的方法：結合第一抗原的常規抗體A和結合第二抗原的重鏈抗體B。
本發明還提供了一種使用三種親代單株抗體建構三特異性結合蛋白的方法：結合第一抗原的常規抗體A和結合第二抗原的重鏈抗體B和結合第三抗原的重鏈抗體C。
如圖1的(7) -(8)所示，Fab端來源於常規抗體A，VH_A和VL_A分別為抗體A的重鏈可變區和輕鏈可變區。VH端來源於重鏈抗體B或重鏈抗體C，VH_B為重鏈抗體B的重鏈可變區，VH_C為重鏈抗體C的重鏈可變區。CL是輕鏈恆定區結構域。CH1、CH2和CH3分別是重鏈恆定區的第一、第二和第三結構域。L1和L2分別是第一和第二連接肽，h是IgG抗體的樞紐區或衍生序列。實施例 1.3.1. 結構 (7) : IgG_HC-VH-VH
結構 (7) 表示一種雙特異性結合蛋白，其包含兩條不同的多肽鏈：多肽鏈1或第一多肽鏈，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL；多肽鏈2或第二多肽鏈，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CH1-h-CH2-CH3-L1-VH_B-L2-VH_B。
在一個實施方案中，多肽鏈2的CH3與VH_B直接融合聯結，即L1的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的CH3經由連接肽L1聯結到VH_B；L1可以是表1-2中所列序列。
在一個實施方案中，多肽鏈2的第一個VH_B與第二個VH_B直接融合聯結，即L2的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的第一個VH_B經由連接肽L2聯結到第二個VH_B；L2可以是表1-2中所列序列。實施例 1.3.2. 結構 (8) : IgG_HC-VH'-VH"
結構 (8) 表示一種三特異性結合蛋白，其包含兩條不同的多肽鏈：多肽鏈1或第一多肽鏈，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL；多肽鏈2或第二多肽鏈，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CH1-h-CH2-CH3-L1-VH_B-L2-VH_C。
在一個實施方案中，多肽鏈2的CH3與VH_B直接融合聯結，即L1的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的CH3經由連接肽L1聯結到VH_B；L1可以是表1-2中所列序列。
在一個實施方案中，多肽鏈2的VH_B與VH_C直接融合聯結，即L2的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的VH_B經由連接肽L2聯結到VH_C；L2可以是表1-2中所列序列。實施例 1.4. 2xVH-IgG 六價對稱結構
本發明提供了一種使用兩種親代單株抗體建構雙特異性結合蛋白的方法：結合第一抗原的常規抗體A和結合第二抗原的重鏈抗體B。
本發明還提供了一種使用三種親代單株抗體建構三特異性結合蛋白的方法：結合第一抗原的常規抗體A和結合第二抗原的重鏈抗體B和結合第三抗原的重鏈抗體C。
如圖1的(9)- (10)所示，Fab端來源於常規抗體A，VH_A和VL_A分別為抗體A的重鏈可變區和輕鏈可變區。VH端來源於重鏈抗體B或重鏈抗體C，VH_B為重鏈抗體B的重鏈可變區，VH_C為重鏈抗體C的重鏈可變區。CL是輕鏈恆定區結構域。CH1、CH2和CH3分別是重鏈恆定區的第一、第二和第三結構域。L1和L2分別是第一和第二連接肽，h是IgG抗體的樞紐區或衍生序列。實施例 1.4.1. 結構 (9) : 2xVH-IgG(HC+LC)
結構 (9) 表示一種雙特異性結合蛋白，其包含兩條不同的多肽鏈：多肽鏈1或第一多肽鏈，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_B-L1-VL_A-CL；多肽鏈2或第二多肽鏈，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_B-L2-VH_A-CH1-h-CH2-CH3。
在一個實施方案中，多肽鏈1的VH_B與VL_A直接融合聯結，即L1的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈1的VH_B經由連接肽L1聯結到VL_A；L1可以是表1-2中所列序列。
在一個實施方案中，多肽鏈2的VH_B與VH_A直接融合聯結，即L2的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的VH_B經由連接肽L2聯結到VH_A；L2可以是表1-2中所列序列。
在一個實施方案中，L1和L2可以是相同的序列。在另一個實施方案中，L1和L2可以是不同的序列。實施例 1.4.2. 結構 (10) : (VH'+VH")-IgG(HC+LC)
結構 (10) 表示一種三特異性結合蛋白，其包含兩條不同的多肽鏈：多肽鏈1或第一多肽鏈，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_B-L1-VL_A-CL；多肽鏈2或第二多肽鏈，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_C-L2-VH_A-CH1-h-CH2-CH3。
在一個實施方案中，多肽鏈1的VH_B與VL_A直接融合聯結，即L1的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈1的VH_B經由連接肽L1聯結到VL_A；L1可以是表1-2中所列序列。
在一個實施方案中，多肽鏈2的VH_C與VH_A直接融合聯結，即L2的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的VH_C經由連接肽L2聯結到VH_A；L2可以是表1-2中所列序列。
在一個實施方案中，L1和L2可以是相同的序列。在另一個實施方案中，L1和L2可以是不同的序列。實施例 1.5. Fab-Fc-VH 二價非對稱結構
本發明提供了一種使用兩種親代單株抗體建構雙特異性結合蛋白的方法：結合第一抗原的常規抗體A和結合第二抗原的重鏈抗體B。
如圖1的(11) - (13)所示，Fab端來源於常規抗體A，VH_A和VL_A分別為抗體A的重鏈可變區和輕鏈可變區。VH端來源於重鏈抗體B，VH_B為重鏈抗體B的重鏈可變區。CL是輕鏈恆定區結構域。CH1、CH2和CH3分別是重鏈恆定區的第一、第二和第三結構域。h是IgG抗體的樞紐區或衍生序列。兩個重鏈的Fc區域各引入了不同的胺基酸突變以減少重鏈同源二聚化的形成。
在一個實施方案中，含有VH_B的多肽鏈中的h可以是IgG的樞紐區或者樞紐區衍生的連接肽序列如表1-2中的人IgG1樞紐 (C220S) 或者G5-LH的序列。實施例 1.5.1. 結構 (11) : Fab-Fc-VH
結構 (11) 的結合蛋白包含三條不同的多肽鏈：多肽鏈1或第一多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL；多肽鏈2或第二多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CH1-h-CH2-CH3；多肽鏈3，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_B-h-CH2-CH3。實施例 1.5.2. 結構 (12) : Fab(cross VH/VL)-Fc-VH
結構 (12) 的結合蛋白包含三條不同的多肽鏈：多肽鏈1或第一多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CL；多肽鏈2或第二多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CH1-h-CH2-CH3；多肽鏈3，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_B-h-CH2-CH3。實施例 1.5.3. 結構 (13) : Fab(cross Fd/LC)-Fc-VH
結構 (13) 的結合蛋白包含三條不同的多肽鏈：多肽鏈1或第一多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CH1；多肽鏈2或第二多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL-h-CH2-CH3；多肽鏈3或第三多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_B-h-CH2-CH3。
在一個實施方案中，多肽鏈2中的h為樞紐區或連接肽，其序列可以是如表1-2中的LH1的序列。實施例 1.6. Fab-Fc-VH(2) 三價非對稱結構
本發明提供了一種使用兩種親代單株抗體建構雙特異性結合蛋白的方法：結合第一抗原的常規抗體A和結合第二抗原的重鏈抗體B。
本發明還提供了一種使用三種親代單株抗體建構三特異性結合蛋白的方法：結合第一抗原的常規抗體A和結合第二抗原的重鏈抗體B和結合第三抗原的重鏈抗體C。
如圖1的(14) -(19)所示，Fab端來源於常規抗體A，VH_A和VL_A分別為抗體A的重鏈可變區和輕鏈可變區。VH端來源於重鏈抗體B或重鏈抗體C，VH_B為重鏈抗體B的重鏈可變區，VH_C為重鏈抗體C的重鏈可變區。CL是輕鏈恆定區結構域。CH1、CH2和CH3分別是重鏈恆定區的第一、第二和第三結構域。L是連接肽，h是IgG抗體的樞紐區或衍生序列。兩個重鏈的Fc區域各引入了不同的胺基酸突變以減少重鏈同源二聚化的形成。
在一個實施方案中，含有VH_B的多肽鏈中的h可以是IgG的樞紐區或者樞紐區衍生的連接肽序列如表1-2中的人IgG1樞紐 (C220S) 或者G5-LH的序列。實施例 1.6.1. 結構 (14) : Fab-Fc-VH-VH
結構 (14) 表示一種雙特異性結合蛋白，其包含三條不同的多肽鏈：多肽鏈1或第一多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL；多肽鏈2或第二多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，VH_A-CH1-h-CH2-CH3；多肽鏈3或第三多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_B-L-VH_B-h-CH2-CH3。
在一個實施方案中，多肽鏈3的第一個VH_B與第二個VH_B直接融合聯結，即L的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈3的第一個VH_B經由連接肽L聯結到第二個VH_B；L可以是表1-2中所列序列。實施例 1.6.2. 結構 (15) : Fab-Fc-VH'-VH"
結構 (15) 表示一種三特異性結合蛋白，其包含三條不同的多肽鏈：多肽鏈1或第一多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL；多肽鏈2或第二多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，VH_A-CH1-h-CH2-CH3；多肽鏈3或第三多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_C-L-VH_B-h-CH2-CH3。
在一個實施方案中，多肽鏈3的VH_C與VH_B直接融合聯結，即L的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈3的VH_C經由連接肽L聯結到VH_B；L可以是表1-2中所列序列。實施例 1.6.3. 結構 (16) : Fab(cross VH/VL)-Fc-VH-VH
結構 (16) 表示一種雙特異性結合蛋白，其包含三條不同的多肽鏈：多肽鏈1或第一多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CL；多肽鏈2或第二多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，VL_A-CH1-h-CH2-CH3；多肽鏈3或第三多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_B-L-VH_B-h-CH2-CH3。
在一個實施方案中，多肽鏈3的第一個VH_B與第二個VH_B直接融合聯結，即L的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈3的第一個VH_B經由連接肽L聯結到第二個VH_B；L可以是表1肽2中所列序列。實施例 1.6.4. 結構 (17) : Fab(cross VH/VL)-Fc-VH'-VH"
結構 (17) 表示一種三特異性結合蛋白，其包含三條不同的多肽鏈：多肽鏈1或第一多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CL；多肽鏈2或第二多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，VL_A-CH1-h-CH2-CH3；多肽鏈3或第三多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_C-L-VH_B-h-CH2-CH3。
在一個實施方案中，多肽鏈3的VH_C與VH_B直接融合聯結，即L的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈3的VH_C經由連接肽L聯結到VH_B；L可以是表1-2中所列序列。實施例 1.6.5. 結構 (18) : Fab(cross Fd/LC)-Fc-VH-VH
結構 (18) 表示一種雙特異性結合蛋白，其包含三條不同的多肽鏈：多肽鏈1或第一多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CH1；多肽鏈2或第二多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，VL_A-CL-h-CH2-CH3；多肽鏈3或第三多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_B-L-VH_B-h-CH2-CH3。
在一個實施方案中，多肽鏈3的第一個VH_B與第二個VH_B直接融合聯結，即L的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈3的第一個VH_B經由連接肽L聯結到第二個VH_B；L可以是表1-2中所列序列。
在一個實施方案中，多肽鏈2中的h為樞紐區或連接肽，其序列可以是如表1-2中的LH1的序列。實施例 1.6.6. 結構 (19) : Fab(cross Fd/LC)-Fc-VH'-VH"
結構 (19) 表示一種三特異性結合蛋白，其包含三條不同的多肽鏈：多肽鏈1或第一多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CH1；多肽鏈2或第二多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，VL_A-CL-h-CH2-CH3；多肽鏈3或第三多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_C-L-VH_B-h-CH2-CH3。
在一個實施方案中，多肽鏈3的VH_C與VH_B直接融合聯結，即L的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈3的VH_C經由連接肽L聯結到VH_B；L可以是表1-2中所列序列。
在一個實施方案中，多肽鏈2中的h為樞紐區或連接肽，其序列可以是如表1-2中的LH1的序列。實施例 1.7. scFv-Fc-VH 二價非對稱結構
本發明提供了一種使用兩種親代單株抗體建構雙特異性結合蛋白的方法：結合第一抗原的常規抗體A和結合第二抗原的重鏈抗體B。
如圖1的(20)- (21)所示，scFv端來源於常規抗體A，VH_A和VL_A分別為抗體A的重鏈可變區和輕鏈可變區。VH端來源於重鏈抗體B，VH_B為重鏈抗體B的重鏈可變區。CH2和CH3分別是重鏈恆定區的第二和第三結構域。L是連接肽，h是IgG抗體的樞紐區或衍生序列。兩個重鏈的Fc區域各引入了不同的胺基酸突變以減少重鏈同源二聚化的形成。
在一個實施方案中，scFv的序列可以是VH-連接肽-VL。在另一個實施方案中，scFv的序列可以是VL-連接肽-VH。
在一個實施方案中，多肽鏈中的L是連接肽，可以是表1-2中所列序列，優選為GS_15或GS_20的序列。
在一個實施方案中，多肽鏈中的h是IgG抗體的樞紐區或衍生序列，可以是表1-2中所列序列，優選為人IgG1樞紐 (C220S) 或者G5-LH的序列。實施例 1.7.1. 結構 (20) : scFv(VL-VH)-Fc-VH
結構 (20) 的結合蛋白包含兩條不同的多肽鏈：多肽鏈1或第一多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-L-VH_A- h-CH2-CH3；多肽鏈2或第二多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_B-h-CH2-CH3。實施例 1.7.2. 結構 (21) : scFv(VH-VL)-Fc-VH
結構 (21) 的結合蛋白包含兩條不同的多肽鏈：多肽鏈1或第一多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-L-VL_A- h-CH2-CH3；多肽鏈2或第二多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_B-h-CH2-CH3。實施例 1.8. scFv-Fc-VH(2) 三價非對稱結構
本發明提供了一種使用兩種親代單株抗體建構雙特異性結合蛋白的方法：結合第一抗原的常規抗體A和結合第二抗原的重鏈抗體B。
本發明還提供了一種使用三種親代單株抗體建構三特異性結合蛋白的方法：結合第一抗原的常規抗體A和結合第二抗原的重鏈抗體B和結合第三抗原的重鏈抗體C。
如圖1的(22)–(25)所示，scFv端來源於常規抗體A，VH_A和VL_A分別為抗體A的重鏈可變區和輕鏈可變區。VH端來源於重鏈抗體B或重鏈抗體C，VH_B為重鏈抗體B的重鏈可變區，VH_C為重鏈抗體C的重鏈可變區。CH2和CH3分別是重鏈恆定區的第二和第三結構域。L1和L2分別是第一和第二連接肽，h是IgG抗體的樞紐區或衍生序列。兩個重鏈的Fc區域各引入了不同的胺基酸突變以減少重鏈同源二聚化的形成。
在一個實施方案中，scFv的序列可以是VH-連接肽-VL。在另一個實施方案中，scFv的序列可以是VL-連接肽-VH。
在一個實施方案中，多肽鏈中的L1是聯結scFv中VH和VL的連接肽，可以是表1-2中所列序列，優選為GS_15或GS_20的序列。
在一個實施方案中，多肽鏈中的L2是聯結兩個重鏈抗體的重鏈可變區之間的連接肽，可以是表1-2中所列序列。在另一個實施方案中，兩個重鏈抗體的重鏈可變區之間直接融合，即L2的長度為0。
在一個實施方案中，多肽鏈中的h是IgG抗體的樞紐區或衍生序列，可以是表1-2中所列序列，優選為人IgG1樞紐 (C220S) 或者G5-LH的序列。實施例 1.8.1. 結構 (22) : scFv(VL-VH)-Fc-VH-VH
結構 (22) 表示一種雙特異性結合蛋白，其包含兩條不同的多肽鏈：多肽鏈1或第一多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-L1-VH_A- h-CH2-CH3；多肽鏈2或第二多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_B-L2-VH_B-h-CH2-CH3。
在一個實施方案中，多肽鏈2的第一個VH_B與第二個VH_B直接融合聯結，即L2的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的第一個VH_B經由連接肽L2聯結到第二個VH_B；L2可以是表1-2中所列序列。實施例 1.8.2. 結構 (23) : scFv(VH-VL)-Fc-VH-VH
結構 (23) 表示一種雙特異性結合蛋白，其包含兩條不同的多肽鏈：多肽鏈1或第一多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-L1-VL_A- h-CH2-CH3；多肽鏈2或第二多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_B-L2-VH_B-h-CH2-CH3。
在一個實施方案中，多肽鏈2的第一個VH_B與第二個VH_B直接融合聯結，即L2的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的第一個VH_B經由連接肽L2聯結到第二個VH_B；L2可以是表1-2中所列序列。實施例 1.8.3. 結構 (24) : scFv(VL-VH)-Fc-VH’-VH”
結構 (24) 表示一種三特異性結合蛋白，其包含兩條不同的多肽鏈：多肽鏈1或第一多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-L1-VH_A- h-CH2-CH3；多肽鏈2或第二多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_C-L2-VH_B-h-CH2-CH3。
在一個實施方案中，多肽鏈2的VH_C與VH_B直接融合聯結，即L2的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的VH_C經由連接肽L2聯結到VH_B；L2可以是表1-2中所列序列。實施例 1.8.4. 結構 (25) : scFv(VH-VL)-Fc-VH’-VH”
結構 (25) 表示一種三特異性結合蛋白，其包含兩條不同的多肽鏈：多肽鏈1或第一多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-L1-VL_A- h-CH2-CH3；多肽鏈2或第二多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_C-L2-VH_B-h-CH2-CH3。
在一個實施方案中，多肽鏈2的VH_C與VH_B直接融合聯結，即L2的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的VH_C經由連接肽L2聯結到VH_B；L2可以是表1-2中所列序列。實施例 1.9. Fab-Fc-VH(3) 四價非對稱結構
本發明提供了一種使用兩種親代單株抗體建構雙特異性結合蛋白的方法：結合第一抗原的常規抗體A和結合第二抗原的重鏈抗體B。
本發明還提供了一種使用三種親代單株抗體建構三特異性結合蛋白的方法：結合第一抗原的常規抗體A和結合第二抗原的重鏈抗體B和結合第三抗原的重鏈抗體C。
本發明還提供了一種使用四種親代單株抗體建構四特異性結合蛋白的方法：結合第一抗原的常規抗體A和結合第二抗原的重鏈抗體B和結合第三抗原的重鏈抗體C和結合第四抗原的重鏈抗體D。
如圖1的(26)–(27)所示，Fab端來源於常規抗體A，VH_A和VL_A分別為抗體A的重鏈可變區和輕鏈可變區。VH端來源於重鏈抗體B或重鏈抗體C或重鏈抗體D，VH_B為重鏈抗體B的重鏈可變區，VH_C為重鏈抗體C的重鏈可變區，VH_D為重鏈抗體D的重鏈可變區。CL是輕鏈恆定區結構域。CH1、CH2和CH3分別是重鏈恆定區的第一、第二和第三結構域。L1和L2是連接肽，h是IgG抗體的樞紐區或衍生序列。兩個重鏈的Fc區域各引入了不同的胺基酸突變以減少重鏈同源二聚化的形成。
在一個實施方案中，含有VH_B的多肽鏈中的h可以是IgG的樞紐區或者樞紐區衍生的連接肽序列如表1-2中的人IgG1樞紐 (C220S) 或者G5-LH的序列。實施例 1.9.1. 結構 (26) : Fab-Fc-VH-VH-VH
結構 (26) 表示一種雙特異性結合蛋白，其包含三條不同的多肽鏈：多肽鏈1或第一多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL；多肽鏈2或第二多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，VH_A-CH1-h-CH2-CH3；多肽鏈3或第三多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_B-L1-VH_B-L2-VH_B-h-CH2-CH3。
在一個實施方案中，多肽鏈3的第一個VH_B與第二個VH_B直接融合聯結，即L1的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈3的第一個VH_B經由連接肽L1聯結到第二個VH_B；L1可以是表1-2中所列序列。
在一個實施方案中，多肽鏈3的第二個VH_B與第三個VH_B直接融合聯結，即L2的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈3的第二個VH_B經由連接肽L2聯結到第三個VH_B；L2可以是表1-2中所列序列。實施例 1.9.2. 結構 (27) : Fab-Fc-VH’-VH’’-VH’’’
結構 (27) 表示一種四特異性結合蛋白，其包含三條不同的多肽鏈：多肽鏈1或第一多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL；多肽鏈2或第二多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，VH_A-CH1-h-CH2-CH3；多肽鏈3或第三多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_D-L1-VH_C-L2-VH_B-h-CH2-CH3。
在一個實施方案中，多肽鏈3的VH_D與VH_C直接融合聯結，即L1的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈3的VH_D經由連接肽L1聯結到VH_C；L1可以是表1-2中所列序列。
在一個實施方案中，多肽鏈3的VH_C與VH_B直接融合聯結，即L2的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈3的VH_C經由連接肽L2聯結到VH_B；L2可以是表1-2中所列序列。實施例 2. 抗體的序列分析、表現純化、和理化性質特徵分析 實施例 2.1. 抗體的序列分析和最適化
抗體的重鏈可變結構域序列來源於染色體上重鏈基因群的胚系基因V、D、J基因片段的基因重排和體細胞超突變等事件；輕鏈可變結構域序列來源於輕鏈基因群的胚系基因V、J基因片段的基因重排和體細胞超突變等事件。基因重排和體細胞超突變是增加抗體多樣性的主要因素。來源於相同胚系V基因片段的抗體也可能產生不同的序列，但總體上相似性較高。利用一些演算法，例如IMGT/DomainGapAlign (http://imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi) 或者NCBI/IgBLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) 可以從抗體的可變結構域序列推測出其發生基因重排時可能的胚系基因片段。
蛋白質或多肽胺基酸鏈在細胞中轉譯合成後有時會引入化學修飾，稱為轉譯後修飾(PTM)。對於抗體而言，一些PTM的位址是非常保守的，例如，在人的IgG1抗體的恆定結構域的第297位(EU編號)的保守的胺基酸天冬醯胺Asn通常會發生醣基化修飾形成醣鏈，而該醣鏈結構對於抗體結構和相關的效應功能是至關重要的。但是，如果在抗體的可變結構域尤其是抗原結合區域(如CDR)中存在PTM，那麼這些PTM的存在有可能會對抗原的結合有較大的影響，也可能對抗體的物理化學性質帶來變化。例如，醣基化、脫醯胺、異構化、氧化等都可能增加抗體分子的不穩定性或異質性，從而增加抗體開發的難度和風險。因而避免一些潛在的PTM對於治療性抗體的開發是非常重要的。隨著經驗的積累，人們發現一些PTM是和胺基酸序列的組成尤其是相鄰胺基酸組成的“模式”是高度相關的，這樣使得可以從蛋白質的一級胺基酸序列預測出潛在的PTM。例如，N-x-S/T(第一位是天冬醯胺，第二位是非脯胺酸以外的任意胺基酸，第三位是絲胺酸或者蘇胺酸)的序列模式預測出N-連接醣基化位址。引起PTM的胺基酸序列模式有可能來源於胚系基因序列，例如人胚系基因片段IGHV3-33天然地在FR3區域存在醣基化模式NST；也可能來源於體細胞超突變。例如，NGS或NLT可能是醣基化位址，NS可能是脫醯胺位址，DG可能引起天冬胺酸的異構化。
可以透過胺基酸突變來破壞PTM的胺基酸序列模式，從而降低或者去除特定PTM的形成。根據抗體序列和PTM序列模式的不同，有不同的突變設計方法。一種方法是將“熱點”胺基酸(如NS模式中的N或S)替換成物理化學性質相似的胺基酸(如把N突變為Q)。如果PTM序列模式來源於體細胞超突變，而並不存在於胚系基因序列中，那麼另一種方法可以是把該序列模式替換成對應的胚系基因序列。實際操作中，對同一個PTM序列模式可能採用多種突變設計方法。實施例 2.2. 抗體的表現和純化
本實施例介紹了利用哺乳動物宿主細胞(例如，人胚腎細胞HEK293或中國倉鼠卵巢細胞CHO及其衍生細胞)、暫態轉染表現和親和捕捉分離等技術來製備抗體的一般方法。本方法適用於含有Fc區的目標抗體；目標抗體可以由一條或多條蛋白質多肽鏈組成；可以來源於一個或多個表現質體。
將抗體多肽鏈的胺基酸序列透過密碼子最適化方法轉換成核苷酸序列；合成編碼的核苷酸序列並選殖到與宿主細胞相容的表現載體上。將編碼抗體多肽鏈的質體按照特定比例同時轉染哺乳動物宿主細胞，利用常規的重組蛋白表現和純化技術，可以得到具有正確折疊和多肽鏈組裝的重組抗體。具體地，將FreeStyle™ 293-F細胞 (Thermo, #R79007) 在FreeStyle™ F17 Expression Medium培養基 (Thermo, #A1383504) 中擴大培養。暫態轉染開始之前，調節細胞濃度至6 - 8 x105 細胞/ml，於37℃ 8% CO2 震盪培養箱中培養24小時，細胞濃度在1.2 x106 細胞/ml。準備30 ml培養的細胞。將編碼抗體多肽鏈的質體按照一定比例混合共計30 µg 質體(質體與細胞的比例為 1 µg : 1 ml)溶解於1.5 ml Opti-MEM減血清培養基 (Thermo, #31985088)，並用0.22 µm濾膜過濾除菌。再取1.5 ml Opti-MEM 溶入1 mg/ml PEI (Polysciences, #23966-2) 120 µl，靜置5分鐘。把PEI緩慢加入質體中，室溫培育10分鐘，邊搖晃培養瓶邊緩慢滴入質體PEI混合溶液，於37℃ 8% CO2 震盪培養箱中培養5天。5天後觀測細胞存活率。收集培養物，以3300g轉速離心10分鐘後取上清；然後將上清高速離心去除雜質。用PBS pH7.4緩衝液平衡含有MabSelect™ (GE Healthcare, #71-5020-91) 的重力管柱 (Bio-Rad, #7311550)，2-5倍管柱體積沖洗。將上清樣品過管柱；用5-10倍管柱體積的PBS緩衝液沖洗管柱，再用pH3.5的0.1M甘胺酸洗提目的蛋白，隨後用pH 8.0的Tris-HCl調節至中性，最後用超濾管 (Millipore, #UFC901024) 濃縮換液至PBS緩衝液或者含有其他成分的緩衝液，得到純化的重組抗體溶液。最後用NanoDrop (Thermo, NanoDrop™ One) 測定濃度，分裝、存儲備用。實施例 2.3. 利用 SEC-HPLC 分析蛋白純度和聚合體
本實施例使用分析型分子粒徑篩析層析法(SEC)來分析蛋白樣品的純度和聚合體形式。將分析型層析管柱TSKgel G3000SWxl (Tosoh Bioscience, #08541, 5 µm, 7.8 mm × 30 cm) 連接到高壓液相層析儀HPLC (Agilent Technologies, Agilent 1260 Infinity II)，用PBS緩衝液室溫下平衡至少1小時。適量蛋白樣品(至少10 µg)用0.22 µm濾膜過濾後注射入系統，並設定HPLC程式：用PBS緩衝液將樣品以1.0 ml/分鐘 的流速流過層析管柱，最長時間為25分鐘。HPLC將生成分析報告，報告出樣品內不同分子尺寸組份的滯留時間。
圖65顯示了本發明申請中的數個不同結構的雙抗分子經過暫態轉染表現和一步親和純化後得到的蛋白樣品的SDS-PAGE和SEC-HPLC的分析結果。這些雙抗分子都體現出良好的產率和純度。實施例 2.4. 利用 DSF 測定蛋白分子的熱穩定性
差示掃描螢光法 (Differential Scanning Fluorimetry, DSF) 是一種常用的高通量的測定蛋白質熱穩定性的方法。它使用即時螢光定量PCR儀器透過監測與去折疊的蛋白分子結合的染料的螢光強度的變化，來反應蛋白質的變性的過程，從而反應出蛋白分子的熱穩定性。本實施例利用DSF方法來測定蛋白分子熱變性溫度(Tm)。10 μg蛋白加入96-孔PCR盤 (Thermo, #AB-0700/W)，接著加入2 μl 100×稀釋的染料SYPROTM  (Invitrogen, #2008138)，然後加入緩衝液使得終體積為40 μl每孔。將PCR盤密封，放置於即時螢光定量PCR儀器 (Bio-Rad CFX96 PCR System)，先於25℃培育5 分鐘，然後以0.2℃/0.2分鐘的梯度逐漸從25℃升溫至95℃，在測試結束時將溫度降至25℃。使用FRET掃描模式並使用Bio-Rad CFX Maestro軟體進行資料分析並計算出樣品的Tm。實施例 2.5. 利用 Uncle 測定蛋白的分子穩定性和分子聚集性
Uncle (Unchained Labs) 是一個多功能一站式的蛋白穩定性分析平臺，它透過全螢光，靜態光散射(SLS)和動態光散(DLS)檢測方法來表徵蛋白質的穩定性。同一組樣品可同時得到熔解溫度(Tm)，聚集溫度(Tagg)和粒徑(diameter)等參數。在本實施例中，選擇Uncle的“Tm & Tagg with optional DLS”應用程式進行操作，取9 µL樣品加入Uni管中，設置以0.3℃/分鐘的梯度逐漸從25℃升溫至95℃。進行初始和最終DLS測量四次採集，每次採集5秒。實驗運行結束後， Uncle分析軟體採用重心均值(BCM)公式來計算每個樣品的Tm值；透過SLS在266 nm或473 nm波長下的螢光強度的曲線(聚集曲線)來計算Tagg值；樣品的粒徑和分散度則透過DLS相關的函數來計算。實施例 3. PD-L1 x CTLA4 雙特異性抗體 實施例 3.1. 背景
程式性死亡受體1 (programmed death 1, PD-1) 主要表現於T 細胞等免疫細胞，它有兩個配體，即程式性死亡配體- 1 (programmed death ligand 1, PD-L1) 和PD-L2。PD-L1主要表現在抗原呈現細胞以及多種腫瘤細胞。PD-L1與PD-1相互作用會下調T細胞的活性，減弱細胞激素的分泌，起到免疫抑制作用。在許多人類腫瘤組織中均可檢測到PD-L1蛋白的表現，腫瘤部位的微環境可誘導腫瘤細胞上的PD-L1的表現，表現的PD-L1有利於腫瘤的發生和生長，誘導抗腫瘤T 細胞的凋亡，並進一步保護腫瘤細胞逃避免疫攻擊。PD-1/PD-L1途徑抑制劑可以阻斷PD-1與PD-L1的結合，阻斷負向調控信號，使T細胞恢復活性，發揮毒殺腫瘤細胞的作用，進而抑制腫瘤生長，因此，以PD-1/PD-L1為標的的免疫調節對腫瘤抑制有重要的意義。
細胞毒性T 淋巴細胞相關抗原4 (CTLA4) 是T 細胞上表現的負調控激素，它與抗原呈現細胞上的CD80 或CD86 結合後，在阻斷CD28 的共剌激信號同時，還會下調T細胞的活性，起到免疫抑制作用。CTLA4 媒介的抑制機制則往往成為腫瘤細胞逃逸免疫系統的原因之一。透過阻斷CTLA4 與其配體的相互作用可以恢復T細胞的活性，增強抗腫瘤的能力。
目前，針對PD-1、PD-L1和CTLA4的阻斷型抗體都有在臨床上體現出優秀的抗腫瘤效果，且有多個抗體藥物批准上市。儘管如此，這些藥物和治療手段在臨床上仍面臨諸多挑戰，例如較低的反應率。因而，有很多基於PD-1、PD-L1和CTLA4等阻斷型抗體的聯合用藥方案的臨床試驗正在積極地進行中。由於CTLA4抑制劑體現出較明顯的毒副作用，在目前的PD-1/PD-L1抑制劑和CTLA4抑制劑的聯合用藥方案中，CTLA4抑制劑通常選用較低劑量。例如，在聯用抗PD-1抗體Nivolumab和抗CTLA-4抗體Ipilimumab治療結直腸癌和腎細胞癌的臨床試驗中，Nivolumab和Ipilimumab的劑量分別是3 mg/kg和1 mg/kg。在聯用抗PD-L1抗體Durvalumab和抗CTLA-4抗體Tremelimumab治療非小細胞肺癌的臨床試驗中，Durvalumab和Tremelimumab的劑量分別是10-20 mg/kg和1 mg/kg。
另一方面，人們對腫瘤免疫相關的生物學機制也有越來越多的瞭解。有研究發現，阻斷CTLA4信號途徑會導致PD-1在腫瘤浸潤淋巴細胞 (TILs) 上高表現，而且阻斷PD-1信號途徑會上調CTLA4在TILs上的表現 (Rev Assoc Med Bras 2017; 63(9):814-823)。這提示了透過阻斷單一的共抑制信號途徑有可能引起的抗藥機制，而透過將這些抗體聯用以同時阻斷多個共抑制信號途徑，則可能對T細胞的活化有協同作用。而且，最新的研究報導了PD-1和CTLA4信號途徑相互作用的新的機制，闡釋了PD-L1抗體和CTLA4抗體的協同作用 (Zhao et al., 2019, Immunity 51, 1059–1073)。
基於現有的知識，我們認為同時標靶PD-L1和CTLA4的雙特異性抗體可以利用一個或者多個作用機制來提高抗腫瘤效果和安全性。第一，PD-L1 x CTLA4 雙抗透過阻斷CTLA4信號途徑和PD-1/PD-L1信號途徑在T細胞的不同的階段進行活化；PD-L1和CD80的順式相互作用使其與CTLA4有更好的協同作用。第二，PD-L1高表現於腫瘤組織，PD-L1 x CTLA4 雙抗可以在腫瘤微環境中特異性地解除CTLA4抑制信號來活化T細胞，減少CTLA4單抗在周邊系統非特異活化帶來的毒副作用。第三，PD-L1 x CTLA4 雙抗可以選擇保留Fc效應功能(如ADCC)，在腫瘤微環境中透過CTLA4特異性地毒殺高表現CTLA4的抑制性T細胞如T reg細胞，或透過PD-L1特異性地毒殺高表現PD-L1的腫瘤細胞。另外，雙特異性抗體作為一個藥物產品，比兩個藥物產品的組合，在經濟性和用藥的便利性等方面會更有優勢。實施例 3.2. 獲得抗 PD-L1 的 IgG 抗體和抗 CTLA4 的 HCAb 抗體 實施例 3.2.1. 獲得抗 PD-L1 的全人源 IgG 抗體
Harbour H2L2小鼠 (Harbour Antibodies BV) 是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的基因轉殖小鼠，其產生的抗體具有完整的人的抗體可變結構域和大鼠恆定結構域。
用可溶的重組人PD-L1蛋白 (NovoProtein, #CM06) 對Harbour H2L2小鼠進行多輪免疫。當檢測小鼠血清中PD-L1特異的抗體效價達到一定的位準後，將小鼠的脾細胞取出並與骨髓瘤細胞株融合得到融合瘤細胞；對融合瘤細胞經過多輪篩選和選殖之後，鑒定出若干個特異辨識PD-L1的單株抗體分子。對這些單株抗體進行進一步的鑒定，根據其對人PD-L1的結合能力、食蟹猴PD-L1的結合能力、抑制PD-L1與PD-1結合能力等參數，優選出數個候選抗體分子。然後對候選抗體分子進行序列分析和最適化，得到數個變體序列。將抗體的VL和VH序列與相應的人的κ輕鏈恆定區和IgG1重鏈恆定區序列進行融合表現，得到重組全人源抗體分子。抗PD-L1的重組全人源IgG抗體列於表3-9。實施例 3.2.2. 獲得抗 CTLA4 的全人源 HCAb 抗體
Harbour HCAb小鼠 (Harbour Antibodies BV，WO2010/109165A2) 是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的基因轉殖小鼠，能夠產生僅有重鏈的抗體，該抗體的大小只有傳統IgG抗體的一半。其產生的抗體僅具有人的抗體重鏈可變結構域和小鼠Fc恆定結構域。
用可溶的重組人CTLA4蛋白 (ACRO Biosystems, #CT4-H5229) 對Harbour HCAb小鼠進行多輪免疫。當檢測小鼠血清中CTLA4特異的抗體效價達到一定的位準後，將小鼠的脾細胞取出分離B細胞，用小鼠漿細胞分選試劑盒 (Miltenyi, #130-092-530) 分選CD138陽性的漿細胞。用常規的分子生物學手段從漿細胞中擴增人VH基因，並將擴增的人VH基因片段建構到編碼人IgG1抗體重鏈Fc區域序列的哺乳動物細胞表現質體pCAG載體中。質體轉染哺乳動物宿主細胞 (如人胚腎細胞HEK293) 進行表現，得到全人源HCAb抗體上清。用ELISA測試HCAb抗體上清與重組人CTLA4蛋白的結合，鑒定出陽性HCAb抗體。對這些HCAb抗體進行進一步的鑒定，根據其對人CTLA4的結合能力、食蟹猴CTLA4的結合能力、抑制CTLA4與B7-1結合能力等參數，優選出數個候選HCAb抗體分子。然後對候選HCAb抗體分子進行序列分析和最適化，得到數個變體序列。將HCAb抗體的VH序列和人的IgG1重鏈Fc序列進行融合表現，得到全人源重組HCAb抗體分子。抗CTLA4的重組全人源HCAb抗體列於表3-9。實施例 3.3. 利用抗 PD-L1 的 IgG 抗體和抗 CTLA4 的 HCAb 抗體建構雙特異性抗體分子
本實施例利用抗PD-L1的IgG抗體PR000070或PR000265的抗原結合結構域Fab，和抗CTLA4的HCAb抗體PR000184的抗原結合結構域VH，來建構多種結構的抗PD-L1 x CTLA4的雙特異性抗體分子。
在本實施例及後續實施例中，抗PD-L1的陽性對照分子為抗PD-L1的IgG單抗PR000070或PR000416或PR000265，亦為PD-L1 x CTLA4雙抗分子的PD-L1端的親代單抗。PR000070、PR000265和PR000416都來源於同一個抗PD-L1的單株抗體。PR000070和PR000265都是人IgG1亞型，在其Fc區都有N297A突變，它們僅在重鏈可變區VH有一個胺基酸突變的差異。PR000265和PR000416都是人IgG1亞型且有相同的Fab結構，它們僅有差別在於PR000265的Fc區有N297A突變。
在本實施例及後續實施例中，抗CTLA4的陽性對照分子為抗CTLA4的HCAb單抗PR000184，亦為PD-L1 x CTLA4雙抗分子的CTLA4端的親代單抗。實施例 3.3.1. 建構 Fab-HCAb 對稱結構分子
利用抗PD-L1的IgG抗體和抗CTLA4的重鏈抗體，按照實施例 1.1所述結構設計Fab-HCAb 對稱結構的PD-L1 x CTLA4雙抗分子，總結於表3-1；並按照實施例 2所述方法製備抗體分子樣品並進行分析，總結於表3-2。表 3-1 Fab-HCAb 對稱結構的 PD-L1 x CTLA4 雙抗分子
結構編號 雙抗分子 PD-L1 抗體 (Fab) CTLA4 抗體 (VH_B) 第一連接肽 (Fab 和 VH_B 之間 ) 第二連接肽 (VH_B 和 CH2 之間 ) Fc 類型 ( 突變 )
1 PR000403 PR000265 PR000184 無 人IgG1樞紐 人IgG1 (L234A, L235A, P329G)
1 PR000404 PR000265 PR000184 無 人IgG1樞紐 人IgG1
表 3-2 Fab-HCAb 對稱結構的 PD-L1 x CTLA4 雙抗分子蛋白的表現
結構編號 雙抗分子 表現系統和體積 質體轉染比例 ( 短鏈 : 長鏈 ) 第一步純化後產量 (mg/L) SEC-HPLC 純度 (%)
1 PR000403 HEK293-F (30ml) 3 : 2 32.00 97.57
1 PR000404 HEK293-F (30ml) 3 : 2 19.67 97.02
實施例 3.3.2. 建構 IgG-VH 四價對稱結構分子
利用抗PD-L1的IgG抗體和抗CTLA4的重鏈抗體，按照實施例1.2所述結構設計IgG-VH 四價對稱結構的PD-L1 x CTLA4雙抗分子，總結於表3-3；並按照實施例2所述方法製備抗體分子樣品並進行分析，總結於表3-4。表 3-3 IgG-VH 四價對稱結構的 PD-L1 x CTLA4 雙抗分子
結構編號 雙抗分子 PD-L1 抗體 (IgG) CTLA4 抗體 (VH_B) VH_B 相對 IgG 位置 連接肽 Fc 類型 ( 突變 )
3 PR000300 PR000070 PR000184 重鏈 N 端 KL-H1_15-RT 人IgG1
4 PR000301 PR000070 PR000184 輕鏈 N 端 KL-H1_15-RT 人IgG1
6 PR000302 PR000070 PR000184 輕鏈 C 端 H1_15 人IgG1
5 PR000303 PR000070 PR000184 重鏈 C 端 L-H1_15-RT 人IgG1
5 PR000401 PR000265 PR000184 重鏈 C 端 L-H1_15-RT 人 IgG1 (L234A, L235A, P329G)
5 PR000402 PR000265 PR000184 重鏈 C 端 L-GS_15-RT 人 IgG1 (L234A, L235A, P329G)
3 PR001573 PR000265 PR000184 重鏈 N 端 KL-H1_15-RT 人IgG1
3 PR001576 PR000265 PR000184 重鏈 N 端 KL-H1_15-RT 人IgG1 (S239D, I332E)
4 PR001574 PR000265 PR000184 輕鏈 N 端 KL-H1_15-RT 人IgG1
4 PR001577 PR000265 PR000184 輕鏈 N 端 KL-H1_15-RT 人IgG1 (S239D, I332E)
表 3-4 IgG-VH 四價對稱結構的 PD-L1 x CTLA4 雙抗分子蛋白的表現
結構編號 雙抗分子 表現系統和體積 第一步純化後產量 (mg/L) SEC-HPLC 純度 (%)
3 PR000300 HEK293-F (30ml) 27.33 100.0
4 PR000301 HEK293-F (30ml) 20.64 100.0
6 PR000302 HEK293-F (30ml) 29.11 100.0
5 PR000303 HEK293-F (30ml) 42.57 100.0
5 PR000401 HEK293-F (30ml) 2.67 96.77
5 PR000402 HEK293-F (30ml) 5.33 96.41
3 PR001573 HEK293-F (50ml) 20.00 100.0
3 PR001576 HEK293-F (50ml) 0.4 未檢
4 PR001574 HEK293-F (30ml) 20.00 100.0
4 PR001577 HEK293-F (30ml) 26.00 100.0
實施例 3.3.3. 建構 2xVH-IgG 六價對稱結構分子
利用抗PD-L1的IgG抗體和抗CTLA4的重鏈抗體，按照實施例1.4所述結構設計2xVH-IgG 六價對稱結構的PD-L1 x CTLA4雙抗分子，總結於表3-5；並按照實施例2所述方法製備抗體分子樣品並進行分析，總結於表3-6。表 3-5 2xVH-IgG 六價對稱結構的 PD-L1 x CTLA4 雙抗分子
結構編號 雙抗分子 PD-L1 抗體 (IgG) CTLA4 抗體 (VH_B) 第一連接肽 (VH_B 和 VL_A 之間 ) 第二連接肽 (VH_B 和 VH_A 之間 ) Fc 類型 ( 突變 )
9 PR001572 PR000070 PR000184 KL-H1_15-RT KL-H1_15-RT 人IgG1
9 PR001575 PR000265 PR000184 KL-H1_15-RT KL-H1_15-RT 人 IgG1
9 PR001578 PR000265 PR000184 KL-H1_15-RT KL-H1_15-RT 人IgG1 (S239D, I332E)
表 3-6 2xVH-IgG 六價對稱結構的 PD-L1 x CTLA4 雙抗分子蛋白的表現
結構編號 雙抗分子 表現系統和體積 第一步純化後產量 (mg/L) SEC-HPLC 純度 (%)
9 PR001572 HEK293-F (30ml) 3.7 未測
9 PR001575 HEK293-F (30ml) 5 100
9 PR001578 HEK293-F (30ml) 4.3 100
實施例 3.3.4. 建構 Fab-Fc-VH 二價非對稱結構分子
利用抗PD-L1的IgG抗體和抗CTLA4的重鏈抗體，按照實施例1.4所述結構設計Fab-Fc-VH 二價非對稱結構的PD-L1 x CTLA4雙抗分子，總結於表3-7；並按照實施例2所述方法製備抗體分子樣品並進行分析，總結於表3-8。表 3-7 Fab-Fc-VH 二價非對稱結構的 PD-L1 x CTLA4 雙抗分子
結構編號 雙抗分子 PD-L1 抗體 (Fab) CTLA4 抗體 (VH_B) Fab 端結構 Fab 端的 Fc 類型 ( 突變 ) VH_B 端的 Fc 類型 ( 突變 )
11 PR001609 PR000265 PR000184 正常 人 IgG1 (knob) 人 IgG1 (hole)
11 PR001610 PR000265 PR000184 正常 人 IgG1 (knob, DE) 人 IgG1 (hole, DE)
(突變代號：Knob : S354C, T366W;Hole : Y349C, T366S, L368A, Y407V;DE : S239D, I332E.)表 3-8 Fab-Fc-VH 二價非對稱結構的 PD-L1 x CTLA4 雙抗分子蛋白的表現
結構編號 雙抗分子 表現系統和體積 質體轉染比例 ( 鏈 1 : 2 : 3) 第一步純化後產量 (mg/L) SEC-HPLC 純度 (%)
11 PR001609 HEK293-F (30ml) 1 : 1 : 1 40 98.27
11 PR001610 HEK293-F (30ml) 1 : 1 : 1 12.33 95.68
實施例 3.3.5. PD-L1 x CTLA4 雙抗分子及對照分子序列表
表3-9、表3-10和表3-11列出了本實施例所建構的PD-L1 x CTLA4 雙抗分子和對應的PD-L1單抗、CTLA4單抗等親代單抗分子以及對照分子的序列所對應的序號。表3-11中的結構編號對應於表1-1和圖1。表3-12列出了雙特異性抗體分子的第一和第二抗原結合結構域相應的CDR序列的序列編號。表 3-9 對照分子和親代單抗
抗體編號 抗體
PR000070 抗PD-L1 91G3H5H3, hIgG1(N297A)
PR000265 抗PD-L1 91G3H5H3(D54E) , hIgG1(N297A)
PR000416 抗PD-L1 91G3H5H3(D54E) , hIgG1
PR000184 抗CTLA4 重鏈抗體CL5v3
PR000149 抗CTLA4 單抗Ipilimumab 類似物, hIgG1
PR000151 抗PD-L1單抗Atezolizumab類似物, hIgG1(N297A)
表 3-10 對照分子和親代單抗的序列和 CDR 序列的序列編號表
抗體編號 輕鏈 重鏈 VL VH LCDR1 LCDR2 LCDR3 HCDR1 HCDR2 HCDR3
PR000070 347 300 282 233 167 188 211 15 62 122
PR000265 353 308 282 240 167 188 211 15 69 122
PR000416 353 310 282 240 167 188 211 15 69 122
PR000184 無 303 無 236 無 無 無 17 65 125
PR000149 348 301 283 234 168 189 212 15 63 123
PR000151 349 302 284 235 169 190 213 16 64 124
表 3-11 本實施例的 PD-L1 x CTLA4 雙抗分子的序列編號表
結構編號 抗體編號 多肽鏈 1 多肽鏈 2 多肽鏈 3
3 PR000300 353 362 無
4 PR000301 363 364 無
6 PR000302 365 364 無
5 PR000303 353 366 無
5 PR000401 353 369 無
5 PR000402 353 370 無
1 PR000403 371 372 無
1 PR000404 371 373 無
9 PR001572 363 362 無
3 PR001573 353 394 無
4 PR001574 363 310 無
9 PR001575 363 394 無
3 PR001576 353 395 無
4 PR001577 363 396 無
9 PR001578 363 395 無
11 PR001609 353 407 390
11 PR001610 353 408 392
表 3-12 PD-L1 x CTLA4 雙抗分子的抗原結合結構域的 CDR 的序列編號表
結構編號 抗體編號 抗原結合域序號 LCDR1 LCDR2 LCDR3 HCDR1 HCDR2 HCDR3
1 PR000403, PR000404 #1 167 188 211 15 69 122
#2 無 無 無 17 65 125
3 PR000300 #1 167 188 211 15 62 122
#2 無 無 無 17 65 125
3 PR001573, PR001576 #1 167 188 211 15 69 122
#2 無 無 無 17 65 125
4 PR000301 #1 167 188 211 15 62 122
#2 無 無 無 17 65 125
4 PR001574, PR001577 #1 167 188 211 15 69 122
#2 無 無 無 17 65 125
5 PR000303 #1 167 188 211 15 62 122
#2 無 無 無 17 65 125
5 PR000401, PR000402 #1 167 188 211 15 69 122
#2 無 無 無 17 65 125
6 PR000302 #1 167 188 211 15 62 122
#2 無 無 無 17 65 125
9 PR001572 #1 167 188 211 15 62 122
#2 無 無 無 17 65 125
9 PR001575, PR001578 #1 167 188 211 15 69 122
#2 無 無 無 17 65 125
11 PR001609, PR001610 #1 167 188 211 15 69 122
#2 無 無 無 17 65 125
實施例 3.4. 結合 CTLA4
本實施例是為了研究PD-L1 x CTLA4雙抗分子結合CTLA4的活性。實施例 3.4.1. 結合人 CTLA4 胞外區重組蛋白
利用酵素連結免疫吸附反應ELISA測試抗體分子結合人CTLA4重組蛋白的能力。具體地，首先將2 µg/mL的人CTLA4-His蛋白 (ACRO Biosystems, #CT4-H5229) 以100 µL/孔塗覆96孔盤，於4℃過夜。然後用PBST緩衝液(含有0.05% Tween-20的PBS緩衝液)洗滌3次，接著加入封阻液(含有5%脫脂奶粉的PBS緩衝液)置於37℃培育1小時。然後用PBST緩衝液洗滌3次。隨後以100 µL /孔加入以最高終濃度為30 nM的5倍濃度梯度稀釋的抗體分子，共8個濃度，混合均勻，置於37℃ 培育1小時；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001)作為同型對照。然後用PBST緩衝液洗滌3次。隨後以100 µL /孔加入HRP標記的山羊抗人IgG Fc 二抗 (Sigma, #A0170, 1 : 5000稀釋)，置於37℃ 培育0.5小時。然後用PBST緩衝液洗滌3次。隨後以100 µL /孔加入TMB顯色液反應15分鐘。最後加入終止液中止反應。用Enspire™ 多功能孔盤讀取機 (Perkin Elmer, Inc.) 於450 nM讀取光吸收值(OD值)。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到結合曲線及EC50值等參數。
本實施例中，陽性對照分子為抗CTLA4的HCAb單抗PR000184，亦為PD-L1 x CTLA4雙抗分子的CTLA4端的親代單抗。
圖2和表3-13中所示，IgG-VH 四價對稱結構的雙抗分子結合CTLA4的能力與抗CTLA4的VH端相對於抗PD-L1的IgG在雙抗結構中的相對位置有關。當VH在IgG的重鏈N端(PR000300)或者輕鏈N端(PR000301)時，雙抗分子結合CTLA4的EC50值與親代單抗PR000184的相似甚至略優；當VH在IgG的重鏈C端時(PR000303)，雙抗分子結合CTLA4的EC50值與親代單抗PR000184的相比略弱2.6倍；當VH在IgG的輕鏈C端時(PR000302)，雙抗分子結合CTLA4的能力明顯減弱。這說明，透過調整VH在IgG上的相對位置可以用來調節VH結合標的的能力。表 3-13 結合人 CTLA4 蛋白
抗體 EC50 (nM) OD450 最大值
PR000184 0.599 3.01
PR000300 0.567 2.95
PR000301 0.35 2.92
PR000302 10.6 3.55
PR000303 1.566 2.72
實施例 3.4.2. 結合高表現人 CTLA4 的 CHO-K1 細胞 CHO-K1/hCTLA4 或高表現人 CTLA4 的 HEK293 細胞 HEK293/hCTLA4
利用流式細胞術FACS測試抗體分子與高表現人CTLA4的CHO-K1細胞株 CHO-K1/hCTLA4 (北京康源博創, KC-1406) 或高表現人CTLA4的HEK293T細胞株 HEK293/hCTLA4 (北京康源博創, KC-0209) 等細胞的結合能力。具體地，消化酶處理CHO-K1/hCTLA4和HEK293/hCTLA4細胞，分別用F12K培養基和DMEM培養基重新懸浮；將細胞密度調整為1x106 細胞/mL。接著將細胞以100 µL/孔接種於96孔V底盤 (Corning, #3894)，4℃下離心5分鐘，棄上清。隨後將梯度稀釋的抗體分子以100 µL /孔加入96孔盤並混合均勻，抗體分子可以從最高終濃度為300 nM按照5倍濃度梯度稀釋的共8個濃度，或者可以從最高終濃度為100 nM按照4倍濃度梯度稀釋的共8個濃度；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001) 作為同型對照。將細胞放置於4℃，避光培育1小時。然後，加入100 µL /孔預冷的FACS緩衝液(含有0.5% BSA的 PBS緩衝液)洗滌細胞兩次，4℃下500g離心5分鐘，棄上清。接著，再加入100 µL /孔螢光二抗 (Alexa Fluor 488 anti-human IgG Fc, Biolegend, #409322, 1 : 1000稀釋)，放置於4℃，避光培育1小時。隨後以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液洗滌細胞兩次，然後於4℃下500 g離心5分鐘，棄上清。最後，以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液重新懸浮細胞。使用BD FACS CANTOII 流式細胞儀或ACEA NovoCyte流式細胞儀讀取螢光發光信號值，並用軟體FlowJo v10 (FlowJo, LLC) 處理和分析資料。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到抗體對標的細胞的結合曲線及EC50值等參數。
本實施例中，陽性對照分子為抗CTLA4的HCAb單抗PR000184，亦為PD-L1 x CTLA4雙抗分子的CTLA4端的親代單抗。Ipilimumab 類似物也作為陽性對照分子。結果顯示於圖3、圖4、表3-14和表3-15。
圖3 的(A)-(B) 和圖4的(A) 中所示，IgG-VH 四價對稱結構的雙抗分子結合CTLA4的能力與抗CTLA4的VH端相對於抗PD-L1的IgG在雙抗結構中的相對位置有關。當VH在IgG的重鏈N端(PR000300, PR001573)或輕鏈N端(PR000301, PR001574, PR001577)時，雙抗分子結合CTLA4的EC50值與親代單抗PR000184的相似或略弱，但其在FACS上的MFI最大值比親代單抗PR000184或陽性對照Ipilimumab更高。當VH在IgG的重鏈C端時(PR000303, PR000401, PR000402)，雙抗分子結合CTLA4的EC50值與親代單抗PR000184的相比略弱。當VH在IgG的輕鏈C端時(PR000302)，雙抗分子結合CTLA4的能力明顯減弱。這說明，透過調整VH在IgG上的相對位置可以用來調節VH結合標的的能力。
圖3的 (C) 中所示，2xVH-IgG六價對稱結構的雙抗分子結合CTLA4的EC50值與親代單抗PR000184的相似，MFI最大值比親代單抗PR000184的低。這可能是由於2xVH-IgG六價對稱結構包含了4個結合CTLA4的結合位址，比親代單抗PR000184的CTLA4結合位址多一倍，使得結合相同數目 CTLA4分子所需的雙抗分子要少於親代單抗，而MFI值與結合到雙抗分子的Fc區的螢光二抗分子的數目相關，進而體現為雙抗分子的MFI最大值比親代單抗的低。
圖3的 (D) 中所示，Fab-Fc-VH 非對稱結構的雙抗分子PR001609和PR001610只含有一個CTLA4結合結構域，因而其結合CTLA4的能力弱於具有二價的親代單抗PR000184。
圖3的 (E) 和圖4的 (B) 中所示，Fab-HCAb對稱結構的雙抗分子結合CTLA4的能力弱於具有二價的親代單抗PR000184，但是MFI最大值與陽性對照Ipilimumab的相似。表 3-14 結合 CHO-K1/hCTLA4
抗體 EC50 (nM) MFI 最大值 抗體 EC50 (nM) MFI 最大值 抗體 EC50 (nM) MFI 最大值
PR000184 1.688 1668 PR001573 9.905 780.8 PR001609 未定 355.4
PR000300 2.914 2621 PR001574 11.98 677.2 PR001610 未定 467.9
PR000301 1.935 2360 PR001577 8.516 584.9 PR000403 20.54 343.2
PR000302 26.15 1566 PR001572 2.911 433.7 PR000404 26.92 338.6
PR000303 4.362 2040 PR001575 5.075 415.3 PR000184 4.642 722
PR001578 4.646 401.3 Ipilimumab 3.412 420.3
測試 1 測試 2
表 3-15 結合 HEK293/hCTLA4
抗體 EC50 (nM) MFI 最大值
PR000401 5.173 1911
PR000402 2.4 1764
PR000403 16.3 1408
PR000404 37.22 1615
PR000184 1.147 2261
實施例 3.5. 阻斷 CTLA4 與其配體的結合
本實施例是為了研究PD-L1 x CTLA4雙抗分子抑制CTLA4與其配體B7-1/CD80結合的活性。實施例 3.5.1. 阻斷人 CTLA4 蛋白和其配體蛋白的結合
利用酵素連結免疫吸附反應ELISA測定抗體分子抑制人CTLA4蛋白與其配體B7-1/CD80結合的活性。具體地，首先將2 µg/mL的蛋白人B7-1-Fc (ACRO Biosystems, #B71-H5259) 以100 µL/孔塗覆96孔盤，於4℃過夜。然後用PBST緩衝液(含有0.05% Tween-20的PBS緩衝液)洗滌3次，接著加入封阻液(含有5%脫脂奶粉的PBS緩衝液)置於37℃培育1小時。隨後以90 µL /孔加入以最高終濃度為180 nM的4倍濃度梯度稀釋的抗體分子，共7個濃度，混合均勻，置於37℃ 培育20分鐘；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001)作為同型對照。然後，以10 µL /孔加入生物素化的人CTLA4-Fc蛋白 (ACRO Biosystems, #CT4-H82F3)，使其終濃度為0.25 µg/ml，置於37℃ 培育1小時。然後用PBST緩衝液洗滌3次。隨後以100 µL /孔加入標記Precision Protein™ StrepTactin-HRP Conjugate (Bio-RAD, #1610380, 1 : 4000 稀釋)，於37℃ 培育0.5小時。然後用PBST緩衝液洗滌3次。隨後以100 µL /孔加入TMB顯色液反應15分鐘。最後加入終止液中止反應。用Enspire™ 多功能孔盤讀取機 (Perkin Elmer, Inc.) 於490 nM讀取光吸收值(OD值)。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，將OD值轉換成抑制率，透過四參數非線性擬合，得到抑制曲線、IC50值和最大抑制率等參數。
本實施例中，陽性對照分子為抗CTLA4的HCAb單抗PR000184，亦為PD-L1 x CTLA4雙抗分子的CTLA4端的親代單抗。結果顯示於圖5和表3-16。
圖5中所示，IgG-VH 四價對稱結構的雙抗分子都有阻斷CTLA4蛋白與其配體蛋白結合的能力(抑制活性)，且都能達到近100%抑制率，但其抑制活性的IC50值與抗CTLA4的VH端相對於抗PD-L1的IgG在雙抗結構中的相對位置有關。當VH在IgG的重鏈N端(PR000300)或輕鏈N端(PR000301)時，雙抗分子對CTLA4的抑制活性與親代單抗PR000184的相似。當VH在IgG的重鏈C端時(PR000303)，雙抗分子對CTLA4的抑制活性與親代單抗PR000184的相比略弱。當VH在IgG的輕鏈C端時(PR000302)，雙抗分子抑制活性的IC50值比親代單抗PR000184的弱4倍。這說明，透過調整VH在IgG上的相對位置可以用來調節VH的標的阻斷能力。表 3-16 阻斷人 CTLA4 蛋白和 B7-1 蛋白的結合
抗體 IC50 (nM) 抑制率最大值 (%)
PR000184 2.673 97.20
PR000300 2.091 98.17
PR000301 2.511 98.31
PR000302 11.57 98.91
PR000303 4.121 97.26
實施例 3.5.2. 阻斷人 CTLA4 細胞和其配體蛋白的結合
利用流式細胞術FACS測定抗體分子抑制表現CTLA4的細胞與其配體B7-1/CD80結合的活性。具體地，消化酶處理高表現人CTLA4 的CHO-K1細胞株 CHO-K1/hCTLA4 (北京康源博創, KC-1406)，並用F12K培養基重新懸浮；將細胞密度調整為1x106 細胞/mL，並置於FACS緩衝液(含有2% FBS的 PBS緩衝液)中於37℃下15分鐘。將FACS緩衝液以200 µL /孔加入96孔盤進行封阻，於37℃ 培育1小時後，棄孔內封阻液。接著將CHO-K1/hCTLA4細胞以200 µL/孔接種於96孔盤 (2x105 細胞/孔)，500g轉速於4℃下離心5分鐘，棄上清。隨後將梯度稀釋的抗體分子以100 µL /孔加入96孔盤並混合均勻，抗體分子可以從最高終濃度為200 nM按照3倍濃度梯度稀釋的共8個濃度，或者可以從最高終濃度為400 nM按照5倍濃度梯度稀釋的共8個濃度；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001) 作為同型對照。然後，將1 µg/mL的生物素化的配體蛋白人B7-1-Fc (ACRO Biosystems, #B71-H82F2) 以100 µL /孔加入96孔盤並混合均勻。將96孔盤放置於4℃，避光培育1.5小時。然後，加入200 µL /孔預冷的FACS緩衝液洗滌細胞兩次，4℃下500g離心5分鐘，棄上清。接著再加入100 µL/孔螢光標記 (Streptavidin, Alexa Fluor™ 488 conjugate, Thermo, #S11223, 1 : 500稀釋)，放置於4℃，避光培育1小時。隨後以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液洗滌細胞三次，然後於4℃下500 g離心5分鐘，棄上清。最後，以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液重新懸浮細胞。使用BD FACS CANTOII 流式細胞儀或ACEA NovoCyte流式細胞儀讀取螢光發光信號值，並用軟體FlowJo v10 (FlowJo, LLC) 處理和分析資料。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，將螢光信號值MFI轉換成抑制率，透過四參數非線性擬合，得到抑制曲線、IC50 值和最大抑制率等參數。
本實施例中，陽性對照分子為抗CTLA4的HCAb單抗PR000184，亦為PD-L1 x CTLA4雙抗分子的CTLA4端的親代單抗。結果顯示於圖6和表3-17。
圖6的(A)-(B)中所示，IgG-VH四價對稱結構的雙抗分子對CTLA4的抑制活性與抗CTLA4的VH端相對於抗PD-L1的IgG在雙抗結構中的相對位置有關。當VH在IgG的重鏈N端(PR000300, PR001573)或輕鏈N端(PR000301, PR001574, PR001577)時，雙抗分子抑制活性的IC50值與親代單抗PR000184的相似，都能達到近100%抑制率，PR000301甚至略強於親代單抗PR000184。當VH在IgG的重鏈C端時(PR000303)，雙抗分子抑制活性的IC50值與親代單抗PR000184的相比略弱，且最大抑制率約83%。當VH在IgG的輕鏈C端時(PR000302)，雙抗分子的抑制活性明顯減弱，其最大抑制率只有49%。這說明，透過調整VH在IgG上的相對位置可以用來調節VH的標的阻斷能力。另一方面，同一個雙抗分子在對CTLA4細胞的阻斷實驗和在對CTLA4蛋白的阻斷實驗中的不同抑制活性的結果，可能反應了細胞膜上蛋白的空間位阻的影響。
圖6的 (C) 中所示，2xVH-IgG六價對稱結構的雙抗分子對CTLA4的抑制活性與親代單抗PR000184的相似。
圖6的 (D) 中所示，Fab-Fc-VH非對稱結構的雙抗分子PR001609和PR001610都只含有一個CTLA4結合結構域，因而其對CTLA4的抑制活性明顯弱於具有二價的親代單抗PR000184。表 3-17 阻斷 CHO-K1/hCTLA4 細胞和 B7-1 蛋白的結合
抗體 IC50 (nM) 抑制率最大值 (%) 抗體 IC50 (nM) 抑制率最大值 (%) 抗體 IC50 (nM) 抑制率最大值 (%)
PR000184 4.132 99.71 PR001573 6.222 99.2 PR001578 2.966 100
PR000300 6.417 100.8 PR001574 4.488 99.8 PR001609 98.33 95
PR000301 3.21 99.88 PR001577 4.883 99.7 PR001610 96.56 61.3
PR000302 71.23 48.98 PR001572 2.982 100      
PR000303 9.712 83.3 PR001575 3.795 100 PR000184 3.009 100
實驗 1 實驗 2
實施例 3.6. CTLA4 媒介的 ADCC 效應
本實施例是為了研究PD-L1 x CTLA4雙抗分子對高表現人CTLA4的細胞 293F-hCTLA4 (睿智化學) 的抗體依賴的細胞媒介的細胞毒性 (ADCC)。第一步，用DELFIA BATDA (Perkin Elmer, #C136-100) 標記標的細胞。具體標記方法如下：用2 µL DELFIA BATDA試劑標記1x106 標的細胞；於 37℃，CO2 培養箱中培育20分鐘；用PBS洗滌4次，於1000 rpm離心5分鐘；最後一次洗滌後，將沉澱重新懸浮於完全培養基中，並調整細胞密度至1x105 /ml。 第二步，將標記好的標的細胞以100 µL/孔接種於96孔盤 (Corning, #3599)；隨後以50 µL /孔加入以最高終濃度為0.8 nM的5倍濃度梯度稀釋的抗體分子，共7個濃度，混合均勻；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001) 作為同型對照；於37℃，5% CO2 培養箱中培育10分鐘。第三步，收集NK-92 MI/CD16a細胞 (睿智化學) 作為效應細胞，將NK-92 MI/CD16a細胞密度調至6 x105 /ml；隨後以50 µL /孔加入到96孔盤中，效應細胞 : 標的細胞 = 3 : 1。接著，於37℃，5% CO2 培養箱中培育2小時。第四步，以500 g離心5分鐘，然後從每孔取25 µL上清加到一塊新的96孔檢測盤中；隨後以200 µL /孔加入DELFIA® Europium 溶液 (Perkin Elmer, #C135-100)，並在室溫下以250 rpm搖動平盤15分鐘。最後，用EnVision®2015多功能孔盤讀取機 (Perkin Elmer, Inc.) 測量螢光值。
根據如下公式計算毒殺比率： 毒殺率 (%) = (ER – ETSR) / (TMR – ETSR) * 100% 其中： ER = 實驗孔(抗體+效應細胞+標的細胞)；ETSR = 標的細胞和效應細胞混合自發釋放孔(效應細胞+標的細胞)；TMR = 標的細胞最大釋放孔(標的細胞+裂解液)
應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到抗體對標的細胞的毒殺率曲線和EC50及最大毒殺率等參數。
本實施例中，陽性對照分子為抗CTLA4的HCAb單抗PR000184(hIgG1亞型)，亦為PD-L1 x CTLA4雙抗分子的CTLA4端的親代單抗。陰性對照分子為抗PD-L1的單抗PR000416(hIgG1亞型)。
圖11和表3-18中所示，雙抗分子PR000300和PR000301具有和親代單抗PR000184相似的針對CTLA4特異的ADCC作用。表 3-18 ADCC 效應毒殺標的細胞
抗體 EC50 (nM) 毒殺率最大值 (%)
PR000300 0.008 23.81
PR000301 0.031 36.62
PR000184 0.015 30.20
實施例 3.7. 結合 PD-L1
本實施例是為了研究PD-L1 x CTLA4雙抗分子結合PD-L1的活性。實施例 3.7.1. 結合人 PD-L1 胞外區重組蛋白
利用酵素連結免疫吸附反應ELISA測試抗體分子結合人PD-L1重組蛋白的能力。具體地，首先將2 µg/mL的人PD-L1-His蛋白 (ACRO Biosystems, #PD1-H5229) 以100 µL/孔塗覆96孔盤 (Corning, #9018)，於4℃ 過夜。然後用PBST緩衝液(含有0.05% Tween-20的PBS緩衝液)洗滌3次，接著加入含2% BSA的封阻液，置於37℃培育1小時。棄去封阻液，並用PBST緩衝液洗滌3次。隨後以100 µL /孔加入以最高終濃度為30 nM的5倍濃度梯度稀釋的抗體分子，共8個濃度，混合均勻，置於37℃ 培育1小時；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001)作為同型對照。然後用PBST緩衝液洗滌3次。隨後以100 µL /孔加入HRP標記的山羊抗人IgG Fc 二抗 (Sigma, #A0170, 1 : 5000 稀釋)，置於37℃ 培育0.5小時。然後用PBST緩衝液洗滌3次。隨後以100 µL /孔加入TMB顯色液反應15分鐘。最後加入終止液中止反應。用Enspire™ 多功能孔盤讀取機 (PerkinElmer, Inc.) 於450 nM讀取光吸收值(OD值)。
應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到結合曲線及EC50 值等參數。
本實施例中，陽性對照分子為抗PD-L1的單抗PR000070，亦為PD-L1 x CTLA4雙抗分子的PD-L1端的親代單抗。
圖7 和表3-19中所示，IgG-VH 四價對稱結構的雙抗分子結合PD-L1的能力與親代單抗PR000070的相似。這說明，抗CTLA4的VH結構域對抗PD-L1的Fab結構域沒有明顯的影響。表 3-19 結合人 PDL1 蛋白
抗體 EC50 (nM) OD045 最大值
PR000070 0.146 3.454
PR000300 0.108 3.519
PR000301 0.131 3.528
PR000302 0.152 3.542
PR000303 0.241 3.523
實施例 3.7.2. 結合高表現人 PD-L1 的 CHO-K1 細胞 CHO-K1/hPDL1 和高表現人 PD-L1 的 腫瘤細胞 MDA-MB-231
利用流式細胞術FACS測試抗體分子與高表現人PD-L1的CHO-K1細胞株 CHO-K1/hPDL1 (南京金斯瑞, M00543) 或高表現人PD-L1的腫瘤細胞株 MDA-MB-231 (ATCC, HTB-26) 等細胞的結合能力。具體地，消化酶處理細胞並用完全培養基重新懸浮；將細胞密度調整為1x106 細胞/mL。接著將細胞以100 µL/孔接種於96孔V底盤 (Corning, #3894)，4℃下離心5分鐘，棄上清。隨後將梯度稀釋的抗體分子以100 µL /孔加入96孔盤並混合均勻，抗體分子可以從最高終濃度為60 nM按照5倍濃度梯度稀釋的共8個濃度，或者可以從最高終濃度為300 nM按照5倍濃度梯度稀釋的共8個濃度，或者可以從最高終濃度為100 nM按照4倍濃度梯度稀釋的共8個濃度；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001)作為同型對照。將細胞放置於4℃，避光培育1小時。然後，加入100 µL /孔預冷的FACS緩衝液(含有0.5% BSA的 PBS緩衝液) 洗滌細胞兩次，4℃下500g離心5分鐘，棄上清。接著，再加入100 µL /孔螢光二抗 (Goat human lgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjunction, Thermo, #A11013, 1 : 1000稀釋)，放置於4℃，避光培育1小時。隨後以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液洗滌細胞兩次，然後於4℃下500 g離心5分鐘，棄上清。最後，以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液重新懸浮細胞。使用BD FACS CANTOII 流式細胞儀或ACEA NovoCyte流式細胞儀讀取螢光發光信號值，並用軟體FlowJo v10 (FlowJo, LLC) 處理和分析資料。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到抗體對標的細胞的結合曲線及EC50值等參數。
本實施例中，陽性對照分子為抗PD-L1的單抗PR000070或PR000416(或PR000265)，亦為PD-L1 x CTLA4雙抗分子的PD-L1端的親代單抗。結果顯示於圖8、圖9、表3-20和表3-21。
圖8的 (A)-(B) 和圖9中所示，IgG-VH 四價對稱結構的雙抗分子結合PD-L1的能力與其對應的親代單抗PR000070或PR000416的相似，其結合PD-L1的EC50值非常接近。僅當VH在IgG的輕鏈N端(PR000301, PR001574, PR001577)時，MFI最大值比親代單抗的略低。
圖8的(C) 中所示，2xVH-IgG六價對稱結構的雙抗分子結合PD-L1的能力相較於親代單抗PR000416有降低；說明當VH同時連接到IgG的重鏈和輕鏈的N端後，對IgG的Fab端的功能帶來明顯的影響。
圖8的(D) 中所示，Fab-HCAb對稱結構的雙抗分子結合PD-L1的能力與親代單抗PR000416相似，有相似的EC50值和MFI最大值。這說明，具有Fab-HCAb對稱結構的雙抗分子的抗PD-L1的Fab端結構可以很好地保留了對PD-L1的結合能力。
圖8的(E) 中所示，Fab-Fc-VH 非對稱結構的雙抗分子PR001609和PR001610的PD-L1結合結構域是單價Fab結構，但是其結合PD-L1的能力與具有二價的親代單抗相似，且MFI最大值比親代單抗的更高。表 3-20 結合 CHO-K1/hPDL1 細胞
抗體 EC50 (nM) MFI 最大值 抗體 EC50 (nM) MFI 最大值 抗體 EC50 (nM) MFI 最大值
PR000070 0.747 22681 PR001573 0.83 8308 PR001609 1.51 11168
PR000300 0.884 21029 PR001574 0.93 6712 PR001610 1.37 11146
PR000301 0.918 16556 PR001577 0.96 6609 PR000403 0.73 8094
PR000302 0.737 18580 PR001572 1.07 5828 PR000404 0.78 8102
PR000303 0.848 17992 PR001575 2.41 5879 PR000416 0.5 8379
PR001578 1.94 5658
實驗1 實驗2
表 3-21 結合 MDA-MB-231 細胞
抗體 EC50 (nM) MFI 最大值
PR000401 0.288 994
PR000402 0.259 841
PR000265 0.163 958
實施例 3.8. 阻斷 PD-L1 與其配體的結合
本實施例是為了研究PD-L1 x CTLA4雙抗分子抑制PD-L1與其配體PD-1結合的活性。實施例 3.8.1. 阻斷人 PD-L1 細胞和其配體蛋白的結合
利用流式細胞術FACS測定抗體分子抑制表現PD-L1的細胞與其配體PD-1結合的活性。具體地，消化酶處理高表現人PD-L1的CHO-K1細胞株 CHO-K1/hPDL1 (南京金斯瑞, M00543)，並用F12K培養基重新懸浮；將細胞密度調整為2 x106 細胞/mL，並置於FACS緩衝液(含有1% BSA的PBS緩衝液)中於37℃下15分鐘。將封阻緩衝液以200 µL /孔加入96孔盤，於37℃ 培育1小時後，棄孔內封阻液。接著將CHO-K1/hPDL1細胞以50 µL/孔接種於96孔盤 (1x105 細胞/孔)。隨後將梯度稀釋的抗體分子以100 µL /孔加入96孔盤並混合均勻，抗體分子可以從最高終濃度為100 nM按照5倍濃度梯度稀釋的共8個濃度；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001)作為同型對照。放置於4℃，避光培育0.5小時。然後，以100 µL /孔加入PBS緩衝液，並以500g轉速於4℃下離心5分鐘，棄上清。然後，將1 µg/mL濃度的生物素化的配體蛋白人PD-1蛋白 (ACRO Biosystems, #PD1-H82F2)以50 µL/孔加入96孔盤並混合均勻。將96孔盤置於4℃，避光培育0.5小時。隨後以100 µL/孔加入預冷的PBS緩衝液洗滌細胞兩次，然後於4℃下500 g離心5分鐘，棄上清。接著再加入100 µL/孔螢光二抗 (PE Streptavidin, BD Biosciences, #554061, 1 : 200稀釋)，放置於4℃，避光培育0.5小時。隨後以200 µL/孔加入預冷的PBS緩衝液洗滌細胞兩次，然後於4℃下500 g離心5分鐘，棄上清。最後，以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液重新懸浮細胞。使用BD FACS CANTOII 流式細胞儀或ACEA NovoCyte流式細胞儀讀取螢光發光信號值，並用軟體FlowJo v10 (FlowJo, LLC) 處理和分析資料。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，將螢光信號值MFI轉換成抑制率，透過四參數非線性擬合，得到抑制曲線、IC50 值和最大抑制率等參數。
本實施例中，陽性對照分子為抗PD-L1的單抗PR000070或PR000416(或PR000265)，亦為PD-L1 x CTLA4雙抗分子的PD-L1端的親代單抗。結果顯示於圖10和表3-22。
圖10的 (A)-(B) 中所示，IgG-VH 四價對稱結構的雙抗分子對PD-L1的抑制能力與其對應的親代單抗PR000070或PR000416的相似，與親代單抗有相近的IC50值和最大抑制率。僅當VH在IgG的輕鏈N端(PR001574, PR001577)時，IC50值比親代單抗的略弱2-3倍。
圖10的 (C) 中所示，2xVH-IgG六價對稱結構的雙抗分子對PD-L1的抑制活性弱於親代單抗；相應的IC50值雖然比親代單抗的弱4-6倍，但能達到相似的最大抑制率。
圖10的 (D) 中所示，Fab-HCAb對稱結構的雙抗分子對PD-L1的抑制活性與親代單抗的相似，與親代單抗有相近的IC50值和最大抑制率。
圖10 的(E) 中所示，Fab-Fc-VH 非對稱結構的雙抗分子PR001609和PR001610的PD-L1結合結構域是單價Fab結構，其對PD-L1的抑制活性弱於具有二價的親代單抗；相應的IC50值雖然比親代單抗的弱4-5倍，但能達到相似的最大抑制率。表 3 - 22 阻斷 CHO-K1/hPDL1 和 PD1 蛋白的結合
抗體 IC50 (nM) 抑制率最大值 (%) 抗體 IC50 (nM) 抑制率最大值 (%) 抗體 IC50 (nM) 抑制率最大值 (%)
PR000070 0.725 96.8 PR001573 0.5 82.3 PR001609 1.12 81.6
PR000300 0.677 96.61 PR001574 0.88 81.1 PR001610 1.23 80.2
PR000301 0.882 96.18 PR001577 0.61 81 PR000403 0.42 81.4
PR000302 0.64 96.72 PR001572 1.4 80.7 PR000404 0.6 81.1
PR000303 0.695 95.88 PR001575 1.74 81.7 PR000416 0.27 79.8
      PR001578 1.69 81.4      
實驗1 實驗2
實施例 3.9. 超抗原 SEB 刺激實驗
本實施例是為了研究PD-L1 x CTLA4雙抗分子對周邊血單個核細胞PBMC的活化作用。第一步，首先將分離的人PBMC (妙通生物) 細胞以100 µL/孔(1x105 細胞/孔)加入96孔盤 (Corning, #3799)；隨後以100 µL/孔加入不同濃度的抗體分子，抗體終濃度可以是 (100 nM, 10 nM, 1 nM, 0.1 nM, 0.01 nM)，或者是兩個抗體按照一定比例的混合，兩個重複孔加入樣品；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001) 作為同型對照。於37℃ 培育30分鐘。接著以50 µL/孔加入超抗原Staphylococcal enterotoxin B (SEB)，使其終濃度為100 ng/mL或10 ng/mL。置於37℃，5% CO2 培養箱中培育96小時或者120小時後收集上清。第二步，將收集上清利用IL-2 ELISA試劑盒 (Biolegend, #431805) 檢測上清中的IL-2濃度，操作方法請參考試劑盒的說明書。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析。
本實施例中，陽性對照分子為抗CTLA4的HCAb單抗PR000184和抗PD-L1的IgG單抗PR000416。
如圖12至圖15所示，在有SEB刺激時，抗CTLA4的單抗、抗PD-L1的單抗以及PD-L1 x CTLA4雙抗分子都可以不同程度地促進T細胞產生IL-2，其活化T細胞的能力與其結構有關。
圖12中所示，IgG-VH 四價對稱結構的雙抗分子可以活化T細胞產生IL-2。而且，抗CTLA4的VH在IgG的N端的結構(PR000301)相較於VH在IgG的C端的結構(PR000302, PR000303)，有更強的T細胞活化能力。
圖13中所示，Fab-HCAb對稱結構的雙抗分子可以活化T細胞產生IL-2。而且，PR000404比PR000403有更強的T細胞活化能力。PR000404和PR000403有相似的結構，其僅有的差異在於PR000404有正常的人IgG1的Fc區，而PR000403的Fc區含有三個點突變(L234A, L235A, P329G)以減弱Fc相關的效應功能。據推測，PR000404可以透過CTLA4媒介ADCC作用將Treg細胞清除掉，從而進一步增強T細胞功能。
圖14中所示，雙抗分子PR000300和PR000301比抗CTLA4單抗、抗PD-L1單抗及其1:1濃度組合，有相當甚至更強的T細胞活化能力(在同一次實驗中使用同一個供體PBMC，可以比較IL-2位準絕對值)。
圖15中所示，雙抗分子PR000303(IgG_HC-VH結構，即VH在IgG的重鏈C端)和PR000404(Fab-HCAb結構)的活化T的能力弱於抗CTLA4的HCAb單抗PR000184。這說明，CTLA4端的活性在這兩種結構中相較於其在正常的IgG或HCAb雙價結構中會減弱，從而可以降低CTLA4的劑量相關的毒性，以適用於目前在臨床的組合藥物劑量。實施例 3.10. 混合淋巴細胞反應 (MLR)
本實施例是利用混合淋巴細胞反應 (MLR)來研究PD-L1 x CTLA4雙抗分子對T細胞的活化作用。第一步，在第一供體PBMC細胞(妙通生物)中加入重組人源介白素4 (IL-4, R&D Systems, #204-GMP)和重組人源GM-CSF (R&D Systems, #215-GM)，誘導6天後，獲得未成熟的人CD14+ 樹突狀細胞(iDC細胞)。繼續加入1 μg/ml的脂多醣Lipopolysaccharide (LPS, Sigma, #L2630)，誘導24小時後，獲得成熟的樹突狀細胞(mDC細胞)。第二步，用T細胞分離試劑盒 (StemCell, #17951) 從第二供體PBMC細胞(妙通生物)中分離得到T淋巴細胞。第三步，將獲得的T細胞和mDC細胞按10 : 1比例接種至96孔盤(1×105 /孔的T細胞和1×104 /孔的mDC細胞)。隨後以100 µL/孔加入不同濃度的抗體分子，抗體終濃度可以是 (100 nM, 10 nM, 1 nM, 0.1 nM, 0 nM)，或者是兩個抗體按照一定比例的混合，兩個重複孔加入樣品；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001)作為同型對照。於37℃，5% CO2 培養箱培育5天。第四步，分別收集第3天和第5天的上清液，用IL-2 ELISA試劑盒 (Thermo, #88-7025-88) 檢測第3天的上清中IL-2濃度，用IFN-γ ELISA試劑盒 (Thermo, #88-7316-88) 檢測第5天的上清中IFN-γ濃度。
圖16中所示，在兩次獨立的MLR實驗中(不同的供體配對)，雙抗分子PR000300和PR000301(VH在IgG重鏈或輕鏈的N端)都顯示出比抗CTLA4單抗、抗PD-L1單抗及其1:1濃度組合，有更強的T細胞活化能力，能更好地促進IL-2和IFN-γ的產生。
圖17中所示，當抗CTLA4的VH在IgG重鏈或輕鏈的C端時，雙抗分子PR000302和PR000303在MLR實驗中顯示出比抗PD-L1單抗atezolizumab，有更強的T細胞活化能力。實施例 3.11. 雙抗分子的抗腫瘤藥效
本研究為了評估PD-L1 x CTLA4 抗體的體內抗腫瘤藥效，採用6-8周齡雌性B6-PD1/CTLA4 基因轉殖小鼠，皮下接種MC38-hPDL1細胞(在MC38細胞上過表現人PD-L1)，待腫瘤均值達到約100 mm3 時，將荷瘤小鼠按腫瘤體積分組，然後將特定濃度經PBS稀釋的所述抗體藥物按照特定的劑量和頻率以腹腔注射 (i.p.)方式給藥。本實施例採用的給藥方案 ：每週給藥2次總共給藥8次 (BIW x 4 weeks)。試驗以PBS為空白對照組，雙抗給藥組為3 mg/kg的PR001573，聯合給藥組為3 mg/kg的ipilimumab加3 mg/kg的atezolizumab。在腫瘤接種後第6，9，12，15，19，22，26，29和33天對腫瘤體積和小鼠體重進行測量。
腫瘤體積計算公式：腫瘤體積 (mm3 ) = 0.5 × (腫瘤長徑 × 腫瘤短徑2 ) 。
圖67中所示，在腫瘤接種後第33天，對照組腫瘤體積約700 mm3 。聯合給藥組(3mg/kg ipilimumab + 3mg/kg atezolizumab)的腫瘤完全消退，腫瘤抑制率(TGI)為100%，與對照組相比差異顯著P=0.03。雙抗給藥組(3mg/kg PR001573)的腫瘤完全消退，TGI為100%，與對照組相比差異顯著P=0.03。給藥組小鼠在整個實驗過程中耐受表現良好， 體重沒有明顯變化。說明3mg/kg PR001573的藥效和等劑量下的ipilimumab和atezolizumab的聯用的藥效相當。實施例 3.12. 小結
本實施例利用抗PD-L1的IgG抗體的抗原結合結構域Fab和抗CTLA4的HCAb抗體的抗原結合結構域VH，建構了多種結構的抗PD-L1 x CTLA4的雙特異性抗體分子。展現出了基於HCAb建構雙特異性抗體分子結構的靈活性，透過不同的結構類型、相對位置、結合價數等參數來調節PD-L1端和CTLA4端的功能活性，進而設計出不同的活性組合，以滿足不同的臨床聯合用藥劑量組合的需求。
例如，當抗CTLA4的VH在抗PD-L1的IgG的N端時，雙抗分子PR000300和PR000301的PD-L1端和CTLA4端都能幾乎完全保持與其親代單抗相當的活性，而且在混合淋巴細胞反應和超抗原刺激實驗等體外功能實驗中，顯示出跟親代單抗1:1濃度組合的有相當的甚至更強的T細胞活化能力；因而可以用來實現聯合用藥的1:1的劑量組合。小鼠腫瘤藥效模型也證實了該結構的雙抗PR001573有與聯合用藥相同的藥效。
又例如，當抗CTLA4的VH在抗PD-L1的IgG的C端時，或者在Fab-HCAb結構時，雙抗分子PR000302，PR000303和PR000404的PD-L1端幾乎完全保持與其親代單抗相當的活性，但是其CTLA4端的活性有不同程度的減弱；因而可以用來實現臨床上的3:1甚至10:1的聯合用藥劑量組合。實施例 4. HER2 x CTLA4 雙特異性抗體 實施例 4.1. 背景
細胞毒性T 淋巴細胞相關抗原4 (CTLA4) 是T 細胞上表現的負調控激素，它與抗原呈現細胞上的CD80或CD86結合後，在阻斷CD28的共剌激信號同時，還會下調T細胞的活性，起到免疫抑制作用。CTLA4媒介的抑制機制則往往成為腫瘤細胞逃逸免疫系統的原因之一。透過阻斷CTLA4與其配體的相互作用可以恢復T細胞的活性，增強抗腫瘤的能力。Ipilimumab 單抗(商品名Yervoy®)是第一個獲批上市的抗CTLA4單抗藥物，也是開啟腫瘤免疫治療時代的第一個產品。Ipilimumab 在晚期黑色素瘤的治療上體現出較好的治療效果，但是Ipilimumab也帶來了較高的免疫相關副反應，其相關的3-5級不良反應的發生率甚至高達50%，這嚴重地影響了它的臨床應用。Ipilimumab所表現出來的毒副作用大部分是CTLA4標的相關的，在目前的PD-1/PD-L1抑制劑和CTLA4抑制劑的聯合用藥方案中，CTLA4抑制劑無論Ipilimumab或是Tremelimumab都通常選用較低劑量。
為了降低CTLA4抑制劑的毒副作用，其中一種值得嘗試的方法是將CTLA4抑制劑定向輸送到腫瘤組織內部，使相關的T細胞媒介的反應僅局限於腫瘤微環境內，而減少細胞激素釋放綜合症的風險。這種定向輸送可以透過瘤內注射CTLA4抑制劑來實現，但是瘤內注射的方法既有手術操作的風險，而且也僅限於一些淺表的可及的腫瘤組織。本實施例提供另一種定向輸送的方法，利用辨識腫瘤特異性抗原(tumor-associated antigen)的抗體將CTLA4抑制劑重定向到特定的腫瘤微環境中，使其在腫瘤微環境中解除T細胞的免疫抑制信號，恢復T細胞的功能。
在本實施例中，我們建構了同時標靶HER2和CTLA4的雙特異性抗體，透過一個或者多個作用機制來提高抗腫瘤效果和安全性。第一，HER2 x CTLA4雙抗在保留原有的HER2抑制劑的作用機制(阻止HER2二聚化，促進HER2的內化和降解，抑制下游磷酸化信號)的基礎上，透過阻斷CTLA4信號途徑來活化T細胞。第二，HER2 x CTLA4雙抗富集於HER2高表現的腫瘤組織，在腫瘤微環境中特異性地解除CTLA4抑制信號來活化T細胞，減少CTLA4單抗在周邊系統非特異活化帶來的毒副作用。第三，HER2 x CTLA4 雙抗可以選擇保留Fc效應功能(如ADCC)，在腫瘤微環境中透過CTLA4特異性地毒殺高表現CTLA4的抑制性T細胞如T reg細胞，或透過HER2特異性地毒殺高表現HER2的腫瘤細胞。另外，雙特異性抗體作為一個藥物產品，比兩個藥物產品的組合，在經濟性和用藥的便利性等方面會更有優勢。實施例 4.2. 獲得抗 HER2 的 IgG 抗體和抗 CTLA4 的 HCAb 抗體
本實施例使用抗HER2的IgG抗體trastuzumab和pertuzumab，其相應的胺基酸序列來源於IMGT資料庫，見表4-11。
本實施例使用的抗CTLA4的全人源HCAb抗體PR000184(表4-11)來源於Harbour HCAb小鼠，其發現過程如實施例3.2.2所述。實施例 4.3. 利用抗 HER2 的 IgG 抗體和抗 CTLA4 的 HCAb 抗體建構雙特異性抗體分子
本實施例利用抗HER2的IgG抗體PR000210(trastuzumab 類似物)或PR000672(pertuzumab 類似物)的抗原結合結構域Fab，和抗CTLA4的HCAb抗體PR000184的抗原結合結構域VH，來建構多種結構的抗HER2 x CTLA4的雙特異性抗體分子。
在本實施例及後續實施例中，陽性對照分子為抗HER2的IgG單抗PR000210(trastuzumab 類似物)或PR000672(pertuzumab 類似物)，亦為HER2 x CTLA4雙抗分子的HER2端的親代單抗。
在本實施例及後續實施例中，陽性對照分子為抗CTLA4的HCAb單抗PR000184，亦為HER2 x CTLA4雙抗分子的CTLA4端的親代單抗。實施例 4.3.1. 建構 Fab-HCAb 對稱結構分子
利用抗HER2的IgG抗體和抗CTLA4的重鏈抗體，按照實施例1.1所述結構設計Fab-HCAb對稱結構的HER2 x CTLA4雙抗分子，總結於表4-1；並按照實施例2所述方法製備抗體分子樣品並進行分析，總結於表4-2。表 4-1 Fab-HCAb 對稱結構的 HER2 x CTLA4 雙抗分子
結構編號 雙抗分子 HER2 抗體 (Fab) CTLA4 抗體 (VH_B) 第一連接肽 (Fab 和VH_B 之間) 第二連接肽 (VH_B 和CH2 之間) Fc 類型( 突變)
1 PR000305 PR000210 PR000184 無 人IgG1樞紐 人IgG1
1 PR000653 PR000210 PR000184 GS_7 人IgG1樞紐 人IgG1
1 PR000654 PR000210 PR000184 GS_15 人IgG1樞紐 人IgG1
1 PR000655 PR000210 PR000184 H1_15 人IgG1樞紐 人IgG1
1 PR000656 PR000210 PR000184 無 人IgG1樞紐 (C220S) 人IgG1
1 PR000658 PR000210 PR000184 GS_15 人IgG1樞紐 (C220S) 人IgG1
1 PR000659 PR000210 PR000184 H1_15 人IgG1樞紐 (C220S) 人IgG1
1 PR000706 PR000210 PR000184 GS_7 G5-LH 人IgG1
1 PR000716 PR000210 PR000184 GS_15 人IgG1樞紐 (C220S) 人 IgG1 (L234A, L235A, P329G)
1 PR000717 PR000210 PR000184 GS_15 人IgG1樞紐 (C220S) 人 IgG1 (S239D, I332E)
表 4-2 Fab-HCAb 對稱結構的 HER2 x CTLA4 雙抗分子蛋白的表現
結構編號 雙抗分子 表現系統和體積 質體轉染比例 ( 短鏈 : 長鏈) 第一步純化後產量 (mg/L) SEC-HPLC 純度 (%)
1 PR000305 HEK293-F (30ml) 2 : 3 70.00 87.17
1 PR000653 HEK293-F (30ml) 3 : 2 69.85 100.00
1 PR000654 HEK293-F (30ml) 3 : 2 62.87 100.00
1 PR000655 HEK293-F (30ml) 3 : 2 102.14 97.82
1 PR000656 HEK293-F (30ml) 3 : 2 79.67 99.52
1 PR000658 HEK293-F (30ml) 3 : 2 77.33 97.10
1 PR000659 HEK293-F (30ml) 3 : 2 86.88 95.18
1 PR000706 HEK293-F (30ml) 3 : 2 40.87 100.00
1 PR000716 HEK293-F (30ml) 3 : 2 54.39 100.00
1 PR000717 HEK293-F (30ml) 3 : 2 38.33 100.00
實施例 4.3.2. 建構 IgG-VH 四價對稱結構分子
利用抗HER2的IgG抗體和抗CTLA4的重鏈抗體，按照實施例 1.2所述結構設計IgG-VH四價對稱結構的HER2 x CTLA4雙抗分子，總結於表4-3；並按照實施例 2所述方法製備抗體分子樣品並進行分析，總結於表4-4。表 4-3 IgG-VH 四價對稱結構的 HER2 x CTLA4 雙抗分子
結構編號 雙抗分子 HER2 抗體 (IgG) CTLA4 抗體 (VH_B) VH_B 相對 IgG 位置 連接肽 Fc 類型( 突變)
5 PR000539 PR000210 PR000184 重鏈 C 端 L-GS_15-RT 人IgG1
5 PR000540 PR000210 PR000184 重鏈 C 端 L-H1_15-RT 人IgG1
5 PR000714 PR000210 PR000184 重鏈 C 端 L-GS_15-RT 人 IgG1 (L234A, L235A, P329G)
5 PR000715 PR000210 PR000184 重鏈 C 端 L-GS_15-RT 人 IgG1 (S239D, I332E)
3 PR001583 PR000210 PR000184 重鏈 N 端 KL-H1_15-RT 人IgG1
4 PR001584 PR000210 PR000184 輕鏈 N 端 KL-H1_15-AS 人IgG1
3 PR001586 PR000210 PR000184 重鏈 N 端 KL-H1_15-RT 人 IgG1 (S239D, I332E)
4 PR001974 PR000210 PR000184 輕鏈 N 端 KL-H1_15-AS 人 IgG1 (S239D, I332E)
3 PR001588 PR000672 PR000184 重鏈 N 端 KL-H1_15-RT 人IgG1
4 PR001589 PR000672 PR000184 輕鏈 N 端 KL-H1_15-AS 人IgG1
3 PR001591 PR000672 PR000184 重鏈 N 端 KL-H1_15-RT 人 IgG1 (S239D, I332E)
表 4-4 IgG-VH 四價對稱結構的 HER2 x CTLA4 雙抗分子蛋白的表現
結構編號 雙抗分子 表現系統和體積 第一步純化後產量 (mg/L) SEC-HPLC 純度 (%)
5 PR000539 HEK293-F (30ml) 188.33 100.00
5 PR000540 HEK293-F (30ml) 261.33 99.94
5 PR000714 HEK293-F (30ml) 34.33 98.21
5 PR000715 HEK293-F (30ml) 32.00 99.05
3 PR001583 HEK293-F (40ml) 153.25 96.07
4 PR001584 HEK293-F (40ml) 147.25 95.15
3 PR001586 HEK293-F (40ml) 112.50 96.26
4 PR001974 HEK293-F (40ml) 75.00 100
3 PR001588 HEK293-F (50ml) 35.21 100
4 PR001589 HEK293-F (50ml) 39.45 100
3 PR001591 HEK293-F (50ml) 25.94 100
實施例 4.3.3. 建構 IgG-VH (2) 六價對稱結構分子
利用抗HER2的IgG抗體和抗CTLA4的重鏈抗體，按照實施例1.3所述結構設計IgG-VH(2) 六價對稱結構的HER2 x CTLA4雙抗分子，總結於表4-5；並按照實施例2所述方法製備抗體分子樣品並進行分析，總結於表4-6。表 4-5 IgG-VH(2) 六價對稱結構的 HER2 x CTLA4 雙抗分子
結構編號 雙抗分子 HER2 抗體 (IgG) CTLA4 抗體 (VH_B) 第一連接肽 (Fc 和VH_B 之間) 第二連接肽 (VH_B 和VH_B 之間) Fc 類型( 突變)
7 PR000541 PR000210 PR000184 L-GS_15-RT GS_5 人IgG1
7 PR000542 PR000210 PR000184 L-H1_15-RT GS_5 人IgG1
7 PR001579 PR000210 PR000184 L-H1_15-RT GS_15 人IgG1
7 PR001580 PR000210 PR000184 L-H1_15-RT GS_20 人IgG1
7 PR001581 PR000210 PR000184 L-H1_15-RT H1_15 人IgG1
7 PR001582 PR000210 PR000184 GS_15 GS_5 人 IgG1 (S239D, I332E)
表 4-6 IgG-VH(2) 六價對稱結構的 HER2 x CTLA4 雙抗分子蛋白的表現
結構編號 雙抗分子 表現系統和體積 第一步純化後產量 (mg/L) SEC-HPLC 純度 (%)
7 PR000541 HEK293-F (30ml) 66 98.75
7 PR000542 HEK293-F (30ml) 125 99.83
7 PR001579 HEK293-F (40ml) 127 98.23
7 PR001580 HEK293-F (40ml) 120 98.04
7 PR001581 HEK293-F (40ml) 140 98.18
7 PR001582 HEK293-F (40ml) 39.5 98.19
實施例 4.3.4. 建構 2xVH-IgG 六價對稱結構分子
利用抗HER2的IgG抗體和抗CTLA4的重鏈抗體，按照實施例 1.4所述結構設計2xVH-IgG 六價對稱結構的HER2 x CTLA4雙抗分子，總結於表4-7；並按照實施例 2所述方法製備抗體分子樣品並進行分析，總結於表4-8。表 4-7 2xVH-IgG 六價對稱結構的 HER2 x CTLA4 雙抗分子
結構編號 雙抗分子 HER2 抗體 (IgG) CTLA4 抗體 (VH_B) 第一連接肽 (VH_B 和VL_A 之間) 第二連接肽 (VH_B 和VH_A 之間) Fc 類型( 突變)
9 PR001585 PR000210 PR000184 KL-H1_15-AS KL-H1_15-RT 人IgG1
9 PR001587 PR000210 PR000184 KL-H1_15-AS KL-H1_15-RT 人 IgG1 (S239D, I332E)
9 PR001590 PR000672 PR000184 KL-H1_15-AS KL-H1_15-RT 人IgG1
9 PR001592 PR000672 PR000184 KL-H1_15-AS KL-H1_15-RT 人 IgG1 (S239D, I332E)
表 4-8 2xVH-IgG 六價對稱結構的 HER2 x CTLA4 雙抗分子蛋白的表現
結構編號 雙抗分子 表現系統和體積 第一步純化後產量 (mg/L) SEC-HPLC 純度 (%)
9 PR001585 HEK293-F (50ml) 27.6 100
9 PR001587 HEK293-F (50ml) 19.8 100
9 PR001590 HEK293-F (50ml) 8.2 未測
9 PR001592 HEK293-F (50ml) 6.4 未測
實施例 4.3.5. 建構 Fab-Fc-VH (n) 二價或三價非對稱結構分子
利用抗HER2的IgG抗體和抗CTLA4的重鏈抗體，按照實施例1.5和實施例 1.6所述結構設計 Fab-Fc-VH (n, n={1,2}) 非對稱結構的HER2 x CTLA4雙抗分子，總結於表4-9；並按照實施例2所述方法製備抗體分子樣品並進行分析，總結於表4-10。表 4-9 Fab-Fc-VH(n) 非對稱結構的 HER2 x CTLA4 雙抗分子
結構編號 雙抗分子 HER2 抗體 (Fab) CTLA4 抗體 (VH_B) Fab 端結構 VH_B 重複數 n 連接肽 Fab 端的 Fc 類型( 突變) VH_B 端的 Fc 類型( 突變)
11 PR000916 PR000210 PR000184 正常 1 無 人 IgG1 (knob) 人 IgG1 (hole)
11 PR000917 PR000210 PR000184 正常 1 無 人 IgG1 (knob, DE) 人 IgG1 (hole, DE)
14 PR002666 PR000210 PR000184 正常 2 GS_5 人 IgG1 (knob) 人 IgG1 (hole)
14 PR002667 PR000210 PR000184 正常 2 GS_15 人 IgG1 (knob) 人 IgG1 (hole)
14 PR002668 PR000210 PR000184 正常 2 GS_5 人 IgG1 (knob, DE) 人 IgG1 (hole, DE)
14 PR002669 PR000210 PR000184 正常 2 GS_15 人 IgG1 (knob, DE) 人 IgG1 (hole, DE)
18 PR002670 PR000210 PR000184 cross Fd/LC 2 GS_5 人 IgG1 (knob) 人 IgG1 (hole)
18 PR002671 PR000210 PR000184 cross Fd/LC 2 GS_15 人 IgG1 (knob) 人 IgG1 (hole)
18 PR002672 PR000210 PR000184 cross Fd/LC 2 GS_5 人 IgG1 (knob, DE) 人 IgG1 (hole, DE)
18 PR002673 PR000210 PR000184 cross Fd/LC 2 GS_15 人 IgG1 (knob, DE) 人 IgG1 (hole, DE)
(突變代號：Knob : S354C, T366W;Hole : Y349C, T366S, L368A, Y407V;DE : S239D, I332E.)表 4-10 Fab-Fc-VH(n) 非對稱結構的 HER2 x CTLA4 雙抗分子蛋白的表現
結構編號 雙抗分子 表現系統和體積 質體轉染比例 ( 鏈 2 : 3 : 1) 第一步純化後產量 (mg/L) SEC-HPLC 純度 (%)
11 PR000916 HEK293-F (50ml) 1 : 1 : 1 30.4 98.54
11 PR000917 HEK293-F (50ml) 1 : 1 : 1 13.9 97.62
14 PR002666 HEK293-F (40ml) 3 : 2 : 5 147.8 79.59
14 PR002667 HEK293-F (40ml) 3 : 2 : 5 196.5 79.31
14 PR002668 HEK293-F (40ml) 3 : 2 : 5 10.8 82.76
14 PR002669 HEK293-F (40ml) 3 : 2 : 5 35.5 70
18 PR002670 HEK293-F (40ml) 3 : 2 : 5 94.8 74.19
18 PR002671 HEK293-F (40ml) 3 : 2 : 5 150 76.19
18 PR002672 HEK293-F (40ml) 3 : 2 : 5 3 84.9
18 PR002673 HEK293-F (40ml) 3 : 2 : 5 8 81.31
實施例 4.3.6. HER2 x CTLA4 雙抗分子及對照分子序列表
表4-11、表4-12和表4-13列出了本實施例所建構的HER2 x CTLA4 雙抗分子和對應的HER2單抗、CTLA4單抗等親代單抗分子以及對照分子的序列所對應的序號。表4-13中的結構編號對應於表1-1和圖1。表4-14列出了雙特異性抗體分子的第一和第二抗原結合結構域相應的CDR序列的序列編號。表 4-11 對照分子和親代單抗
抗體編號 抗體
PR000210 抗HER2 單抗trastuzumab 類似物, hIgG1
PR000672 抗HER2單抗 pertuzumab 類似物, hIgG1
PR000184 抗CTLA4 重鏈抗體CL5v3, hIgG1
PR000218 抗CTLA4 重鏈抗體CL5v3, hIgG1(S239D, I332E)
表 4-12 對照分子和親代單抗的序列和 CDR 序列的序列編號表
抗體編號 輕鏈 重鏈 VL VH LCDR1 LCDR2 LCDR3 HCDR1 HCDR2 HCDR3
PR000210 351 305 286 238 171 190 215 19 67 127
PR000672 359 315 293 247 176 196 220 23 74 132
PR000184 無 303 無 236 無 無 無 17 65 125
PR000218 無 306  無 236 無 無 無 17 65 125
表 4-13 本實施例的 HER2 x CTLA4 雙抗分子的序列編號表
結構編號 抗體編號 多肽鏈 1 多肽鏈 2 多肽鏈 3
1 PR000305 367 368 無
5 PR000539 351 374 無
5 PR000540 351 375 無
7 PR000541 351 376 無
7 PR000542 351 377 無
1 PR000653 367 378 無
1 PR000654 367 379 無
1 PR000655 367 380 無
1 PR000656 367 381 無
1 PR000658 367 382 無
1 PR000659 367 383 無
1 PR000706 367 385 無
5 PR000714 351 386 無
5 PR000715 351 387 無
1 PR000716 367 388 無
1 PR000717 367 389 無
11 PR000916 351 391 390
11 PR000917 351 393 392
7 PR001579 351 397 無
7 PR001580 351 398 無
7 PR001581 351 399 無
7 PR001582 351 400 無
3 PR001583 351 401 無
4 PR001584 402 305 無
9 PR001585 402 401 無
3 PR001586 351 403 無
9 PR001587 402 403 無
3 PR001588 359 404 無
4 PR001589 405 315 無
9 PR001590 405 404 無
3 PR001591 359 406 無
9 PR001592 405 406 無
4 PR001974 402 409 無
14 PR002666 351 391 434
14 PR002667 351 391 435
14 PR002668 351 393 436
14 PR002669 351 393 437
18 PR002670 367 438 434
18 PR002671 367 438 435
18 PR002672 367 439 436
18 PR002673 367 439 437
表 4-14 HER2 x CTLA4 雙抗分子的抗原結合結構域的 CDR 的序列編號表
結構編號 抗體編號 抗原結合域序號 LCDR1 LCDR2 LCDR3 HCDR1 HCDR2 HCDR3
1 PR000305, PR000653, PR000654, PR000655, PR000656, PR000658, PR000659, PR000706, PR000716, PR000717 #1 171 190 215 19 67 127
#2 無 無 無 17 65 125
3 PR001583, PR001586 #1 171 190 215 19 67 127
#2 無 無 無 17 65 125
3 PR001588, PR001591 #1 176 196 220 23 74 132
#2 無 無 無 17 65 125
4 PR001584, PR001974 #1 171 190 215 19 67 127
#2 無 無 無 17 65 125
4 PR001589 #1 176 196 220 23 74 132
#2 無 無 無 17 65 125
5 PR000539, PR000540, PR000714, PR000715 #1 171 190 215 19 67 127
#2 無 無 無 17 65 125
7 PR000541, PR000542, PR001579, PR001580, PR001581, PR001582 #1 171 190 215 19 67 127
#2 無 無 無 17 65 125
9 PR001585, PR001587 #1 171 190 215 19 67 127
#2 無 無 無 17 65 125
9 PR001590, PR001592 #1 176 196 220 23 74 132
#2 無 無 無 17 65 125
11 PR000916, PR000917 #1 171 190 215 19 67 127
#2 無 無 無 17 65 125
14 PR002666, PR002667, PR002668, PR002669 #1 171 190 215 19 67 127
#2 無 無 無 17 65 125
18 PR002670, PR002671, PR002672, PR002673 #1 171 190 215 19 67 127
#2 無 無 無 17 65 125
實施例 4.4. 結合 CTLA4
本實施例是為了研究HER2 x CTLA4雙抗分子結合CTLA4的活性。實施例 4.4.1. 結合高表現人 CTLA4 的 CHO-K1 細胞 CHO-K1/hCTLA4
利用流式細胞術FACS測試抗體分子與高表現人CTLA4 的CHO-K1細胞株 CHO-K1/hCTLA4 (睿智化學) 等細胞的結合能力。具體地，消化酶處理CHO-K1/hCTLA4細胞，並用F12K培養基重新懸浮；將細胞密度調整為2x106 細胞/mL。接著將CHO-K1/hCTLA4細胞以100 µL/孔接種於96孔V底盤 (Corning, #3894)，4℃下離心5分鐘，棄上清。隨後將梯度稀釋的抗體分子以100 µL /孔加入96孔盤並混合均勻，抗體分子可以從最高終濃度為300 nM按照5倍濃度梯度稀釋的共8個濃度，或者可以從最高終濃度為300 nM按照4倍濃度梯度稀釋的共12個濃度；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001) 作為同型對照。將細胞放置於4℃，避光培育1小時。然後，加入100 µL /孔預冷FACS緩衝液(含有0.5% BSA的 PBS緩衝液)洗滌細胞兩次，4℃下500g離心5分鐘，棄上清。接著，再加入100 µL /孔螢光二抗 (Goat human lgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjunction, Thermo, #A11013, 1 : 1000稀釋)，放置於4℃，避光培育1小時。隨後以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液洗滌細胞兩次，然後於4℃下500 g離心5分鐘，棄上清。最後，以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液重新懸浮細胞。使用BD FACS CANTOII 流式細胞儀或ACEA NovoCyte流式細胞儀讀取螢光發光信號值，並用軟體FlowJo v10 (FlowJo, LLC) 處理和分析資料。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到抗體對標的細胞的結合曲線及EC50值等參數。
本實施例中，陽性對照分子為抗CTLA4的HCAb單抗PR000184，亦為HER2 x CTLA4雙抗分子的CTLA4端的親代單抗。結果顯示於圖18和表4-15。
圖18的 (A) 中所示，Fab-HCAb對稱結構的雙抗分子都可以結合CTLA4。這些分子具有相似的結構，都是由抗HER2的單抗PR000210的Fab結構域和抗CTLA4的HCAb單抗PR000184的VH結構域組合而成，其細微的差異在於不同的第一連接肽和連接Fc的樞紐區以及不同的Fc類型或者突變。因而這些雙抗分子有相似的結合CTLA4的能力。它們結合CTLA4的EC50值與親代單抗PR000184的相似或者略弱僅1.5 ~ 3 倍，但是在FACS上的最大結合信號(MFI最大值)比親代單抗PR000184低。這可能暗示了， 在Fab-HCAb結構中，Fab結構域可能對HCAb的VH結構域有一種“遮蔽”效應，使得在這個結構中的VH結構域能夠結合的CTLA4分子比處於自由端時更少，但是在對相同數目的可及的CTLA4分子而言，其結合效力與親代單抗PR000184相當(EC50值)。
圖18的 (B)-(D) 中所示，IgG-VH 四價對稱結構的雙抗分子結合CTLA4的能力根據其具體分子結構略有不同。根據抗CTLA4的VH端相對於抗HER2的IgG在雙抗結構中的相對位置，將此類結構的雙抗分子進一步分為三類：VH在IgG的重鏈C端(PR000539, PR000540, PR000714, PR000715)；VH在IgG的重鏈N端(PR001583, PR001586, PR001588, PR001591)；VH在IgG的輕鏈N端(PR001584, PR001589)。當VH在IgG的重鏈C端時，這些雙抗分子結合CTLA4的EC50值與親代單抗PR000184的相似，但是在FACS上的MFI最大值比親代單抗PR000184略低。當VH在IgG的無論重鏈或輕鏈的N端時，這些雙抗分子結合CTLA4的EC50值與親代單抗PR000184的相比略弱，但是在FACS上的MFI最大值比親代單抗PR000184更強。這說明，透過調整VH在IgG上的相對位置可以用來調節VH結合標的分子的數目和結合效力。
圖18的 (E)-(F) 中所示，IgG-VH-VH六價對稱結構的雙抗分子都可以結合CTLA4。這些分子具有相似的結構，都是由抗HER2的單抗PR000210和抗CTLA4的HCAb單抗PR000184的VH結構域組合而成，其細微的差異在於不同的第一連接肽和第二連接肽以及不同的Fc類型或者突變。除PR001582以外，這些雙抗分子結合CTLA4的能力與親代單抗PR000184相似(相似的EC50和相似的MFI最大值)。
圖18的 (G)-(H) 中所示，2xVH-IgG六價對稱結構的雙抗分子都可以結合CTLA4。這些分子具有相似的結構，都是由抗HER2的單抗PR000210或PR000672和抗CTLA4的HCAb單抗PR000184的VH結構域組合而成。基於親代單抗PR000210建構的雙抗分子(PR001585, PR001587)結合CTLA4的能力與親代單抗PR000184相似；基於親代單抗PR000672建構的雙抗分子(PR001590, PR001592)結合CTLA4的能力與親代單抗PR000184相比略弱。
圖18的 (I)-(J) 中所示，Fab-Fc-VH (n, n=1,2) 非對稱結構的雙抗分子結合CTLA4的能力與結構中所含親代單抗PR000184的VH結構域的數目有關。雙抗分子PR000916和PR000917都只含有一個CTLA4結合結構域，因而其結合CTLA4的能力明顯弱於具有二價的親代單抗PR000184。雙抗分子PR002672含有兩個串聯形成的CTLA4結合結構域，其結合CTLA4的能力與親代單抗PR000184相似。這種結構顯示出含有來源HCAb的VH結構域的雙抗分子有這樣的靈活性：透過調節串聯的VH結構域的數目來調節與標的的結合能力。表 4-15 結合 CHO-K1/hCTLA4
抗體 EC50 (nM) MFI 最大值 抗體 EC50 (nM) MFI 最大值 抗體 EC50 (nM) MFI 最大值
PR000184 1.588 214.1 PR000184 1.792 1083 PR000184 3.046 2167
PR000305 5.016 157.1 PR001583 4.426 1934 PR002672 2.785 1804
PR000653 2.507 156.1 PR001584 4.531 1524      
PR000654 1.612 154.2 PR001586 6.131 1861      
PR000655 1.866 147.7 PR001588 7.257 2168      
PR000656 3.421 144 PR001589 9.39 1866      
PR000658 1.491 148.1 PR001591 5.149 2074      
PR000659 1.943 158.8 PR001579 3.193 1078      
PR000706 2.108 141.3 PR001580 2.649 1078      
PR000716 1.395 130.6 PR001581 3.469 1074      
PR000717 1.344 129.9 PR001582 22.83 1034      
PR000539 1.703 148.3 PR001585 1.585 1051      
PR000540 2.029 185.3 PR001587 1.717 1044      
PR000714 1.64 146.5 PR001590 5.444 1048      
PR000715 1.864 143 PR001592 10.4 1299      
PR000541 1.711 203.2            
PR000542 1.766 235.2            
PR000916 4.681 150.9            
PR000917 9.803 142.1            
實驗1 實驗2 實驗3
實施例 4.5. 阻斷 CTLA4 與其配體的結合
本實施例是為了研究HER2 x CTLA4雙抗分子抑制CTLA4與其配體B7-1/CD80結合的活性。實施例 4.5.1. 阻斷人 CTLA4 蛋白和其配體蛋白的結合
利用酵素連結免疫吸附反應ELISA測定抗體分子抑制人CTLA4蛋白與其配體B7-1/CD80蛋白結合的活性。具體地，首先將2 µg/mL的蛋白人B7-1-Fc (ACRO Biosystems, #B71-H5259) 以100 µL/孔塗覆96孔盤，於4℃過夜。然後用PBST緩衝液(含有0.05% Tween-20的PBS緩衝液)洗滌3次，接著加入封阻液(含有5%脫脂奶粉的PBS緩衝液)置於37℃培育1小時。隨後以90 µL /孔加入以最高終濃度為200 nM的3倍濃度梯度稀釋的抗體分子，共7個濃度，混合均勻，置於37℃培育20分鐘；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001) 作為同型對照。然後，以10 µL/孔加入生物素化的人CTLA4-Fc蛋白 (ACRO Biosystems, #CT4-H82F3)，使其終濃度為0.25 µg/ml，置於37℃ 培育1小時。然後用PBST緩衝液洗滌3次。隨後以100 µL/孔加入標記Precision Protein™ StrepTactin-HRP Conjugate (Bio-RAD, #1610380, 1 : 4000 稀釋)，於37℃培育0.5小時。然後用PBST緩衝液洗滌3次。隨後以100 µL /孔加入TMB顯色液反應15分鐘。最後加入終止液中止反應。用Enspire™ 多功能孔盤讀取機 (Perkin Elmer, Inc.) 於490 nM讀取光吸收值(OD值)。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到抑制曲線及IC50值等參數。
本實施例中，陽性對照分子為抗CTLA4的HCAb單抗PR000184，亦為HER2 x CTLA4雙抗分子的CTLA4端的親代單抗。結果顯示於圖19和表4-16。
圖19的 (A) 中所示，Fab-HCAb對稱結構的雙抗分子都有阻斷CTLA4蛋白與其配體蛋白結合的能力(抑制活性)，且與親代單抗PR000184的相似或者略弱，體現為相似的最大OD差值但是IC50值略弱僅1.5 ~ 2.1 倍。
圖19的 (B)- (D) 中所示，IgG-VH 四價對稱結構的雙抗分子的抑制活性根據其具體分子結構略有不同。根據抗CTLA4的VH端相對於抗HER2的IgG在雙抗結構中的相對位置，將此類結構的雙抗分子進一步分為三類：VH在IgG的重鏈C端(PR000539, PR000540, PR000715)；VH在IgG的重鏈N端(PR001583, PR001586, PR001588, PR001591)；VH在IgG的輕鏈N端(PR001584, PR001589)。當VH在IgG的重鏈C端時，這些雙抗分子的抑制活性與親代單抗相比略弱，體現為相似的最大OD差值但是IC50值略弱僅1.5 ~ 2.5 倍。當VH在IgG的無論重鏈或輕鏈的N端時，這些雙抗分子的抑制活性與親代單抗的相似。
圖19的 (E)- (F) 中所示，IgG-VH-VH六價對稱結構的雙抗分子的抑制活性與親代單抗的相似或略優。
圖19的 (G)- (H) 中所示，2xVH-IgG六價對稱結構的雙抗分子的抑制活性與親代單抗的相似或略優。表 4-16 阻斷人 CTLA4 蛋白和 B7-1 蛋白的結合
抗體 IC50 (nM) 抗體 IC50 (nM) 抗體 IC50 (nM)
PR000184 2.464 PR000184 1.687 PR001579 1.152
PR000654 5.307 PR001583 2.426 PR001580 1.132
PR000655 4.024 PR001584 2.762 PR001581 1.145
PR000539 5.406 PR001586 2.012 PR001582 2.149
PR000540 6.374 PR001588 2.197 PR001585 1.306
PR000715 6.281 PR001589 2.588 PR001587 1.455
PR000541 3.314 PR001591 2.703 PR001590 1.985
PR000542 2.816 PR000541 1.718 PR001592 3.213
實驗 1 實驗 2
實施例 4.5.2. 阻斷人 CTLA4 細胞和其配體蛋白的結合
利用流式細胞術FACS測定抗體分子抑制表現CTLA4的細胞與其配體B7-1/CD80結合的活性。具體地，消化酶處理高表現人CTLA4 的CHO-K1細胞株 CHO-K1/hCTLA4 (睿智化學)，並置於FACS緩衝液(含有2% FBS 的PBS緩衝液)重新懸浮，將細胞密度調整為3x106 細胞/mL。將CHO-K1/hCTLA4細胞以100 µL/孔接種於96孔盤 (3x105 細胞/孔)，500g轉速於4℃下離心5分鐘，棄上清。隨後將梯度稀釋的抗體分子以100 µL /孔加入96孔盤並混合均勻，抗體分子可以從最高終濃度為200 nM按照3倍濃度梯度稀釋的共8個濃度；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001)作為同型對照。然後，將3 µg/mL的生物素化的配體蛋白人B7-1-Fc-biotin (ACRO Biosystems, #B71-H82F2) 以100 µL /孔加入96孔盤並混合均勻。將96孔盤放置於4℃，避光培育1小時。然後，加入200 µL /孔預冷的FACS緩衝液洗滌細胞兩次，4℃下500g離心5分鐘，棄上清。接著再加入100 µL /孔螢光標記 (Streptavidin, Alexa Fluor™ 488 conjugate, Thermo, #S32354, 1 : 1000稀釋)，放置於4℃，避光培育1小時。隨後以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液洗滌細胞三次，然後於4℃下500 g離心5分鐘，棄上清。最後，以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液重新懸浮細胞。使用BD FACS CANTOII 流式細胞儀或ACEA NovoCyte流式細胞儀讀取螢光發光信號值，並用軟體FlowJo v10 (FlowJo, LLC) 處理和分析資料。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，將螢光信號值MFI轉換成抑制率，透過四參數非線性擬合，得到抑制曲線、IC50 值和最大抑制率等參數。
本實施例中，陽性對照分子為抗CTLA4的HCAb單抗PR000184，亦為HER2 x CTLA4雙抗分子的CTLA4端的親代單抗。結果顯示於圖20和表4-17。
圖20的 (A)-(B) 中所示，當抗CTLA4的VH位於抗HER2的IgG的重鏈C端時，IgG-VH 四價對稱結構的雙抗分子的抑制活性有較明顯的降低，但是IgG-VH-VH六價對稱結構的雙抗分子(PR000541)的抑制活性與親代單抗的相似。
圖20 的(C) 中所示，Fab-Fc-VH (2) 非對稱結構的雙抗分子PR002672含有兩個串聯形成的CTLA4結合結構域，其抑制活性與具有二價的親代單抗相比，儘管IC50值略弱約4倍，但是能達到近100%抑制。表 4-17 阻斷人 CTLA4 細胞和 B7-1 蛋白的結合
抗體 IC50 (nM) 最大抑制率 (%) 抗體 IC50 (nM) 最大抑制率 (%)
PR000184 1.685 99.62 PR000184 0.239 99.42
PR000539 9.0 88.02 PR002672 0.983 98.97
PR000715 10.24 89.82      
PR000541 1.634 99.55      
實驗 1 實驗 2
實施例 4.6. 結合 HER2
本實施例是為了研究HER2 x CTLA4雙抗分子結合HER2的活性。實施例 4.6.1. 結合高表現人 HER2 的 細胞 SK-BR-3
利用流式細胞術FACS測試抗體與高表現人HER2的腫瘤細胞株SK-BR-3 (ATCC, HTB-30) 的結合能力。具體地，消化酶處理SK-BR-3細胞，並用DMEM完全培養基重新懸浮，將細胞密度調整為1x106 細胞/mL；接著以100 µL細胞/孔接種於96孔V底盤 (Corning, #3894)，4℃下離心5分鐘，棄上清。隨後以100 µL /孔加入以最高終濃度為100 nM的5倍濃度梯度稀釋的抗體分子，共8個濃度，混合均勻；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001) 作為同型對照。將細胞放置於4℃，避光培育1小時。之後，4℃下離心5分鐘，棄上清；隨後以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液(含有0.5% BSA的 PBS緩衝液)洗滌細胞兩次，然後於500 g，4℃下離心5分鐘，棄上清。之後，以100 µL/孔加入螢光二抗 (Goat human lgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjunction, Thermo, #A11013, 1 : 1000稀釋)，放置於4℃，避光培育1小時。隨後以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液洗滌細胞兩次，然後於4℃下500 g離心5分鐘，棄上清。最後，以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液重新懸浮細胞。使用BD FACS CANTOII 流式細胞儀或ACEA NovoCyte流式細胞儀讀取螢光發光信號值，並用軟體FlowJo v10 (FlowJo, LLC) 處理和分析資料。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到抗體對標的細胞的結合曲線及EC50 值等參數。
本實施例中，陽性對照分子為抗HER2的單抗PR000210 (trastuzumab 類似物) 或PR000672 (pertuzumab類似物)，亦為HER2 x CTLA4雙抗分子的親代單抗。結果顯示於圖21和表4-18。
圖21的(A) 中所示，Fab-HCAb對稱結構的雙抗分子結合HER2的能力與親代單抗PR000210相似，體現在相似的EC50值和MFI最大值。這說明，具有Fab-HCAb對稱結構的雙抗分子的抗HER2的Fab端結構可以很好地保留了對HER2的結合能力。
圖21的(B)- (E)中所示，IgG-VH 四價對稱結構的雙抗分子結合HER2的能力根據其具體分子結構略有不同。根據抗CTLA4的VH端相對於抗HER2的IgG在雙抗結構中的相對位置，將此類結構的雙抗分子進一步分為三類：VH在IgG的重鏈C端(PR000539, PR000540)；VH在IgG的重鏈N端(PR001583, PR001586, PR001588, PR001591)；VH在IgG的輕鏈N端(PR001584, PR001974, PR001589)。從EC50值上看，當VH在IgG的重鏈C端時，該結構很好地保留了對HER2的結合能力，說明VH端沒有對IgG的Fab端帶來明顯的影響；當VH在IgG的無論重鏈或輕鏈的N端時，雙抗分子對HER2的結合能力相較於其對應的親代單抗有1.5~2.5倍的降低。
圖21的(F) -(G)中所示，IgG-VH-VH六價對稱結構的雙抗分子結合HER2的能力與對應的親代單抗相似。
圖21的(H) -(I)中所示，2xVH-IgG六價對稱結構的雙抗分子結合HER2的能力相較於其對應的親代單抗有明顯的降低；說明當VH同時連接到IgG的重鏈和輕鏈的N端後，對IgG的Fab端的功能帶來明顯的影響。
圖21的(J) 中所示，Fab-Fc-VH 非對稱結構的雙抗分子PR000916的HER2結合結構域是單價Fab結構，但是其結合HER2的能力與具有二價的親代單抗非常接近；說明trastuzumab的結合結構域在單價結合和二價結合上沒有明顯差別，而且Fab-Fc-VH非對稱結構的雙抗分子很好地保留了對HER2的結合能力。表 4-18 結合 SK-BR-3
抗體 EC50 (nM) MFI 最大值 抗體 EC50 (nM) MFI 最大值
PR000210 1.332 11868 PR000210 2.929 31552
PR000305 1.538 12604 PR001583 3.915 32008
PR000653 1.668 12781 PR001584 7.502 32880
PR000654 1.712 13168 PR001586 4.717 35248
PR000655 1.57 12201 PR001579 3.056 36444
PR000656 1.664 12358 PR001580 3.421 35754
PR000658 1.474 12964 PR001581 3.687 34744
PR000659 1.653 13672 PR001582 3.665 30517
PR000706 1.562 13355 PR001585 n.d. 26700
PR000716 1.386 13418 PR001587 n.d. 26800
PR000717 1.466 13684      
PR000539 1.323 9460      
PR000540 1.471 10894      
PR000541 1.282 7378      
PR000542 1.295 9019      
抗體 EC50 (nM) MFI 最大值 抗體 EC50 (nM) MFI 最大值
PR000210 1.913 7692 PR000210 1.863 10438
PR000916 3.688 9874 PR001586 2.975 9436
      PR001974 4.119 8478
抗體 EC50 (nM) MFI 最大值      
PR000672 3.119 33400      
PR001588 8.445 37900      
PR001589 5.52 37100      
PR001591 6.861 35900      
PR001590 未定 34000      
PR001592 未定 32800      
實施例 4.7. 超抗原 SEB 刺激實驗
本實施例是為了研究HER2 x CTLA4雙抗分子對周邊血單個核細胞PBMC的活化作用。第一步，首先將分離的人PBMC (妙通生物) 調整到5x106 細胞/mL。接著將PBMC以50 µL/孔加入96孔盤 (Corning, #3799)；隨後以100 µL/孔加入不同濃度的抗體分子，抗體終濃度梯度可以是 (150 nM, 30 nM, 1 nM) 或者 (80 nM, 8 nM, 0.8 nM, 0.08 nM)，兩個重複孔加入樣品；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001) 作為同型對照。於37℃ 培育30分鐘。接著以50 µL/孔加入400 ng/mL 的超抗原Staphylococcal enterotoxin B (SEB)，其終濃度為100 ng/mL。置於37℃，5% CO2 培養箱中培育72小時或者96小時後收集上清。第二步，將收集上清利用IL-2檢測試劑盒 (Thermo, #88-7025-77) 檢測上清中的IL-2濃度。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析。
本實施例中，陽性對照分子為抗CTLA4的HCAb單抗PR000184或PR000218，亦為HER2 x CTLA4雙抗分子的CTLA4端的親代單抗。PR000218是在PR000184基礎上透過Fc突變建構的ADCC增強的變體。
如圖25所示，在有SEB刺激時，抗CTLA4的單抗以及HER2 x CTLA4雙抗分子都可以不同程度地促進T細胞產生IL-2，其活化T細胞的能力與其結構有關。
圖25的(F)中所示，與對應的親代單抗相比，Fab-HCAb對稱結構的雙抗分子對T細胞的活化能力較弱。CTLA4端的活性在Fab-HCAb結構中相較於其在正常的IgG或HCAb雙價結構中會減弱，從而可以降低其劑量相關的毒性，以適用於目前在臨床的組合藥物劑量。
圖25的(A), (D), (G), (I)中所示，IgG-VH四價對稱結構的雙抗分子對T細胞的活化能力根據其具體分子結構略有不同。根據抗CTLA4的VH端相對於抗HER2的IgG在雙抗結構中的相對位置，將此類結構的雙抗分子進一步分為三類：VH在IgG的重鏈C端(PR000539, PR000715)；VH在IgG的重鏈N端(PR001583, PR001586)；VH在IgG的輕鏈N端(PR001584, PR001974)。當VH在IgG的重鏈C端時，雙抗分子對T細胞的活化能力與對應的親代單抗相比明顯減弱。當VH在IgG的無論重鏈或輕鏈的N端時，雙抗分子對T細胞的活化能力與對應的親代單抗相似甚至略有增強。這說明，透過調整VH在IgG上的相對位置可以用來調節VH端的抗CTLA4的活性，以適用不同的臨床組合藥物劑量的場景。
圖25的(C)中所示，IgG-VH-VH六價對稱結構的雙抗分子對T細胞的活化能力與親代單抗的相似，其CTLA4端的活性可以透過使用不同的連接肽來調節。
圖25的(B), (E)中所示，2xVH-IgG六價對稱結構的雙抗分子對T細胞的活化能力與親代單抗的相似，說明其幾乎完全保留了CTLA4端的活性。
圖25(H)中所示，Fab-Fc-VH (2) 非對稱結構的雙抗分子含有兩個串聯形成的CTLA4結合結構域，其對T細胞的活化能力與對應的親代單抗相比有減弱。其CTLA4端可以降低其劑量相關的毒性，以適用於目前在臨床的組合藥物劑量。實施例 4.8. 抑制 HER2+ 細胞的增殖
本實施例是為了研究HER2 x CTLA4雙抗分子抑制高表現人HER2的腫瘤細胞株 SK-BR-3 (ATCC, HTB-30) 的增殖。具體地，消化酶處理SK-BR-3細胞，並用DMEM完全培養基重新懸浮。以2000個細胞/50 µL接種於96孔盤中 (Perkin Elmer, #6005225)；然後，於37℃，5% CO2 培養箱中培育過夜。第二天， 以50 µL /孔加入以最高終濃度為100 nM的5倍濃度梯度稀釋的抗體分子，共6個濃度，混合均勻；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001) 作為同型對照；於37℃，5% CO2 培養箱中培育7天。之後，每孔加入100 µL CellTiter-Glo (Promega, #G7573) 並在位準振動震盪培養箱上混合10分鐘以誘導細胞裂解。最後，用Enspire™ 多功能孔盤讀取機 (PerkinElmer, Inc.) 測定化學發光值。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到抗體對標的細胞的抑制率等參數。
本實施例中，陽性對照分子為抗HER2的單抗PR000210 (trastuzumab 類似物)，亦為HER2 x CTLA4雙抗分子的親代單抗。結果顯示於圖23和表4-19。
圖23的 (A) 中所示，Fab-HCAb對稱結構的雙抗分子PR000655對SK-BR-3細胞增殖的抑制能力相較於親代單抗PR000210有較明顯的降低。
圖23的(B)-(C) 中所示，IgG-VH 四價對稱結構的雙抗分子對SK-BR-3細胞增殖的抑制作用根據其具體分子結構略有不同。根據抗CTLA4的VH端相對於抗HER2的IgG在雙抗結構中的相對位置，將此類結構的雙抗分子進一步分為三類：VH在IgG的重鏈C端(PR000539, PR000540, PR000714, PR000715)；VH在IgG的重鏈N端(PR001583, PR001586)；VH在IgG的輕鏈N端(PR001584)。當VH在IgG的重鏈C端時，該結構很好地保留了對SK-BR-3細胞增殖的抑制能力，體現在與親代單抗有相近甚至略優的IC50和最大抑制率；說明VH端沒有對IgG的Fab端帶來明顯的影響。當VH在IgG的無論重鏈或輕鏈的N端時，雙抗分子對SK-BR-3細胞增殖的抑制能力相較於親代單抗略有降低，體現在IC50值有3~4倍差異，但是仍能保留相同的最大抑制率。
圖23的 (D)-(E) 中所示，除了PR000542顯示出降低的最大抑制率位準以外，大多數IgG-VH-VH 六價對稱結構的雙抗分子對SK-BR-3細胞增殖的抑制能力與親代單抗相近。該結果與前文關於對HER2的結合能力的結果是一致的。
圖23 的(F) 中所示，2xVH-IgG六價對稱結構的雙抗分子對SK-BR-3細胞增殖的抑制能力相較於親代單抗有明顯的降低。該結果與前文關於對HER2的結合能力的結果是一致的。表 4-19 抑制 SK-BR-3 的增殖
抗體 IC50 (nM) 最大抑制率 (%) 抗體 IC50 (nM) 最大抑制率 (%)
PR000655 0.4428 28.07 PR000210 0.19 59.39
PR000210 0.7036 36.09 PR001583 0.5974 59.68
PR000539 0.5134 35.58 PR001584 0.7672 61.11
PR000540 0.6929 39.15 PR001586 0.5712 59.35
PR000714 0.8239 37.95 PR001579 0.2543 58.32
PR000715 0.2101 40.05 PR001580 0.3418 57.62
PR000542 0.6676 27.54 PR001581 0.3581 58.55
PR001582 0.4055 60.02
PR001585 1.357 52.59
PR001587 1.732 60.67
實驗 1 實驗 2
實施例 4.9. HER2 媒介的 ADCC 效應
本實施例是為了研究HER2 x CTLA4雙抗分子對高表現人HER2的腫瘤細胞株 BT-474 (ATCC, HTB-20) 的抗體依賴的細胞媒介的細胞毒性 (ADCC)。第一步，用DELFIA BATDA (Perkin Elmer, #C136-100) 標記標的細胞。具體標記方法如下：用2 µL DELFIA BATDA試劑標記1x106 標的細胞；於 37℃，CO2 培養箱中培育20分鐘；用PBS洗滌4次，於1000 rpm離心5分鐘；最後一次洗滌後，將沉澱重新懸浮於含20%FBS的RPMI-1640培養基 (Thermo, #A 10491) 中，並調整細胞密度至1x105 /ml。 第二步，將標記好的標的細胞以100 µL/孔接種於96孔盤 (Corning, #3599)；隨後以50 µL /孔加入以最高終濃度為100 nM的5倍濃度梯度稀釋的抗體分子，共10個濃度，混合均勻；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001) 作為同型對照；於37℃，5% CO2 培養箱中培育10分鐘。第三步，收集NK-92 MI/CD16a細胞 (睿智化學) 作為效應細胞，將NK-92 MI/CD16a細胞密度調至1.2x106 /ml；隨後以50 µL /孔加入到96孔盤中，效應細胞 : 標的細胞 = 6 : 1。接著，於37℃，5% CO2 培養箱中培育4小時。第四步，以500 g離心5分鐘，然後從每孔取25 µL上清加到一塊新的96孔檢測盤中；隨後以200 µL /孔加入DELFIA® Europium 溶液 (Perkin Elmer, #C135-100)，並在室溫下以250 rpm搖動平盤15分鐘。最後，用EnVision®2015多功能孔盤讀取機 (Perkin Elmer, Inc.) 測量螢光值。
根據如下公式計算毒殺比率： 毒殺率 (%) = (ER – ETSR) / (TMR – ETSR) * 100% 其中： ER = 實驗孔(抗體+效應細胞+標的細胞)；ETSR = 標的細胞和效應細胞混合自發釋放孔(效應細胞+標的細胞)；TMR = 標的細胞最大釋放孔(標的細胞+裂解液)
應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到抗體對標的細胞的毒殺率曲線和EC50及最大毒殺率等參數。
本實施例中，陽性對照分子為抗HER2的單抗PR000210 (trastuzumab 類似物) ，亦為HER2 x CTLA4雙抗分子的親代單抗。
圖22和表4-20中所示，具有IgG-VH-VH 六價對稱結構的雙抗分子PR001582和具有IgG-VH 四價對稱結構的雙抗分子PR001586都能引起很強的ADCC作用。表 4-20 ADCC 效應毒殺標的細胞 BT-474
抗體 EC50 (nM) 毒殺率最大值 (%)
PR000210 0.183 41.95
PR001582 0.055 94.65
PR001586 0.053 94.66
實施例 4.10. 利用流式細胞術測定雙抗分子同時結合兩種細胞的能力
本實施例是為了研究HER2 x CTLA4雙抗分子是否能同時結合表現人HER2的細胞 SK-BR-3 (ATCC, HTB-30) 和表現人CTLA4的細胞CHO-K1/hCTLA4  (睿智化學) 的能力。第一步，用CFSE (Thermo, #C34554) 和Far red (Thermo, #C34564) 染料分別對CHO-K1/hCTLA4細胞和SK-BR-3細胞進行螢光標記。具體步驟如下：將CHO-K1/hCTLA4細胞和SK-BR-3細胞分別重新懸浮於PBS中，並調整至2x106 / ml；分別向CHO-K1/hCTLA4細胞和SK-BR-3細胞中加入5 µM CFSE和 1 µM Far red，並在37℃下培育10分鐘，並不時搖動；加入5倍量完全培養基以終止染色。之後，4℃下離心5分鐘，棄上清，隨後加入PBS洗滌兩遍。將標記後的CHO-K1/hCTLA4細胞和SK-BR-3細胞的密度分別調整為4 x106/ ml 和2 x106 / ml。第二步，將標記好的CHO-K1/hCTLA4細胞和SK-BR-3細胞各取25 µl，與50 µl 四倍濃度梯度稀釋的抗體分子混合均勻，加入到96孔盤，其中抗體分子最高終濃度為31.25 nM，共6個濃度，hIgG1 iso (CrownBio, #C0001)作為同型對照；避光4℃ 培育1小時。之後，每孔添加100 µl 4% 多聚甲醛PFA 固定細胞10分鐘。最後，使用BD FACS CANTOII 流式細胞儀讀取螢光信號值，並用軟體FlowJo v10 (FlowJo, LLC) 處理和分析資料。根據不同的螢光標記分別統計不同象限內細胞數目：Q1是Far-red標記的SK-BR-3細胞 (SK-BR-3+ )；Q3是CFSE標記的CHO-K1/hCTLA4細胞 (CTLA4+ )；Q2則包含了由於雙抗分子同時結合兩種細胞而形成的具有兩種標記的細胞群 (CTLA4+ & SK-BR-3+ )。 根據如下公式計算雙標記陽性的細胞群 (Q2) 相對於所有被標記的SK-BR-3細胞 (Q1 + Q2) 的占比，反應了雙抗分子同時結合兩種細胞的能力。 Q2的細胞比率：(Q2 / (Q1 + Q2)) * 100%
應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到抗體同時對兩種標的細胞結合的曲線。
本實施例中，抗HER2的單抗PR000210 (trastuzumab 類似物) 和抗CTLA4的單抗PR000184作為對照分子，亦為HER2 x CTLA4雙抗分子的親代單抗。
圖24的A、B和C中分別顯示了IgG-VH四價對稱結構雙抗(PR000539, PR000540, PR000715)，IgG-VH-VH六價對稱結構雙抗(PR000541和PR000542)，Fab-Fc-VH非對稱結構雙抗(PR000916)同時結合CHOK1/CTLA4和SK-BR-3細胞的能力；其中PR000210、PR000184和hIgG1 iso為對照。對照分子HER2單抗PR000210和CTLA4單抗PR000184都不能同時結合兩種細胞。所示的HER2 x CTLA4雙抗分子在對稱或非對稱結構中，可以同時結合兩種表現不同標的的細胞。實施例 4.11. 藥代動力學研究
本實施例研究了抗體分子在小鼠體內的藥代動力學性能。本實施例測試了如下抗體有：抗HER2的單抗PR000210 (trastuzumab 類似物)；具有IgG-VH 四價對稱結構的HER2 x CTLA4雙抗分子PR000540；具有IgG-VH-VH 六價對稱結構的HER2 x CTLA4雙抗分子 PR000541。
實施方法如下：對於每一個測試抗體分子，選取體重18~22克的雌性C57BL/6小鼠3隻，按5 mg/kg的劑量透過靜脈注射給藥；於給藥前以及給藥後0.5小時、24小時(1天)、第2天、第4天、第7天、第10天和第14天採集全血，將全血靜置30分鐘使其凝固，隨後在4℃下以12,000 g離心5分鐘並將分離的血清樣品在-80℃下凍存直至分析。
本實施例採用Fc端檢測ELISA方法來定量測定小鼠血清中的藥物濃度。即透過塗覆於96孔盤的山羊抗人Fc多株抗體來捕捉小鼠血清中的含有人Fc的融合蛋白，然後加入HRP標記的山羊抗人Fc第二抗體來檢測。使用Phoenix WinNonlin軟體6.4版，選用非房室模型(NCA)對血藥濃度資料進行分析以評價其藥代動力學。
圖26和表4-21中所示，雙抗 PR000540 和親代單抗 PR000210 有相似的清除速率，且PR000540有更長的半衰期t1/2值(超過20天)。可能是由於其複雜的結構，PR000541顯示出較快的清除速率。表 4-21 小鼠體內藥代動力學
結構 抗體 CL  (mL/day/kg) Vss (mL/kg) *Terminal t1/2 (day) AUClast (day*ug/mL) AUCINF (day*ug/mL)
IgG PR000210 4.99 ± 0.93 96.2 ± 4.2 14.0 ± 1.9 470 ± 38 926 ± 177
IgG_HC-VH PR000540 4.85 ± 0.59 142 ± 18 23.1 ± 3.2 374 ± 37 884 ± 109
IgG_HC-VH-VH PR000541 14.3 ± 1.41 152 ± 5.86 7.58 ± 0.58 251 ± 15.7 353 ± 33.4
實施例 4.12. 小結
本實施例利用抗HER2的IgG抗體的抗原結合結構域Fab和抗CTLA4的HCAb抗體的抗原結合結構域VH，建構了多種結構的抗HER2 x CTLA4的雙特異性抗體分子。展現出了基於HCAb建構雙特異性抗體分子結構的靈活性，透過不同的結構類型、相對位置、結合價數等參數來調節HER2端和CTLA4端的功能活性，進而設計出不同的活性組合，以實現不同的作用機制的需求。目前，抗HER2的單抗trastuzumab在治療乳腺癌的推薦初始劑量是4 mg/kg，在治療胃癌的推薦初始劑量是8 mg/kg,；略高於抗CTLA4的單抗Ipilimumab在治療黑色素瘤的推薦劑量3 mg/kg。
例如，當抗CTLA4的VH在抗PD-L1的IgG的N端時，雙抗分子(例如PR001583和PR001584)的HER2端和CTLA4端都能幾乎完全保持與其親代單抗相當的活性，而且在腫瘤細胞增殖抑制實驗和超抗原刺激實驗等體外功能實驗中，顯示出與相應的親代單抗的相似的能力；因而可以用來實現聯合用藥的1:1的劑量組合。
又例如，IgG-VH-VH六價對稱結構的雙抗分子(例如PR001579, PR001580, PR001581)的HER2端和CTLA4端也都能幾乎完全保持與其親代單抗相當的活性，因而可以用來實現聯合用藥的1:1的劑量組合。
又例如，當抗CTLA4的VH在抗HER2的IgG的C端時，或者在Fab-HCAb結構時，雙抗分子(例如PR000539, PR000540, PR000655)HER2端的活性幾乎與其親代單抗相當，但是其CTLA4端的活性有不同程度的減弱；因而可以用來實現臨床上對CTLA4抑制劑的中等或者低劑量的需求。
又例如，在Fab-Fc-VH(2)非對稱結構中，雙抗分子的HER2結合結構域是單價Fab結構，但是其結合HER2的能力與具有二價的親代單抗非常接近；其含有兩個串聯形成的CTLA4結合結構域，其結合CTLA4的能力與親代單抗相似，但是T細胞活化能力比親代單抗相比有所減弱；因而這種結構可以把腫瘤標的細胞和T細胞拉到一起，促進免疫突觸的形成，可以用來實現臨床上對CTLA4抑制劑的中等或者低劑量的需求，同時還增加了腫瘤特異性地標靶能力。實施例 5. PD-L1 x 4-1BB 雙特異性抗體 實施例 5.1. 背景
程式性死亡受體1 (programmed death 1, PD-1)主要表現於T細胞等免疫細胞，它有兩個配體，即程式性死亡配體-1 (programmed death ligand 1, PD-L1)和PD-L2。PD-L1主要表現在抗原呈現細胞以及多種腫瘤細胞。PD-L1與PD-1相互作用會下調T細胞的活性，減弱細胞激素的分泌，起到免疫抑制作用。在許多人類腫瘤組織中均可檢測到PD-L1 蛋白的表現， 腫瘤部位的微環境可誘導腫瘤細胞上的PD-L1的表現， 表現的PD-L1 有利於腫瘤的發生和生長， 誘導抗腫瘤T細胞的凋亡，並進一步保護腫瘤細胞逃避免疫攻擊。
4-1BB (TNFRSF9, CD137) 是一種隸屬於TNF受體超家族的跨膜蛋白。4-1BB是在多種免疫細胞上表現的共刺激分子，為免疫活性的多功能調節劑。其誘導表現於活化的T細胞、NK細胞等免疫細胞。4-1BB 透過其配體4-1BBL媒介的三聚化來活化T細胞，促進細胞增殖和細胞激素釋放。抗4-1BB的促效型抗體具有抑制腫瘤的功能，最早進入臨床試驗的4-1BB抗體是輝瑞的Utomilumab和百時美施貴寶 (BMS) 公司的Urelumab (BMS-663513)。Urelumab最初的臨床結果發表於2008年，儘管在部分患者上觀察到令人鼓舞的療效，但資料顯示Urelumab導致肝臟毒性，且與標的和劑量有關。並且，因為在臨床試驗中有兩位患者因肝毒性死亡，導致相關的臨床試驗被終止。Utomilumab安全性更好，劑量可提高至10 mg/kg，但治療效果依然欠佳。
在本實施例中，我們建構了同時標靶PD-L1和4-1BB的雙特異性抗體，透過一個或者多個作用機制來提高抗腫瘤效果和安全性。第一，PD-L1 x 4-1BB 雙抗可以透過阻斷PD-1/PD-L1信號途徑來活化T細胞。第二，高表現於腫瘤細胞表面的PD-L1分子可以利用雙抗分子促進T細胞表面的4-1BB分子的交聯和三聚化並活化下游信號傳導途徑，進而促進T細胞的活化和增殖。第三，雙抗分子媒介的T細胞活化僅限於在腫瘤微環境內，這樣可以避免類似Urelumab的單抗在正常組織中過度活化T細胞所帶來的毒副作用。實施例 5.2. 獲得抗 PD-L1 的 IgG 抗體和抗 4-1BB 的 H2L2 或 HCAb 抗體 實施例 5.2.1. 獲得抗 PD-L1 的全人源 IgG 抗體
本實施例使用的抗PD-L1的全人源IgG抗體PR000265(表5-8)來源於Harbour H2L2小鼠，其發現過程如實施例 3.2.1所述。實施例 5.2.2. 獲得抗 4-1BB 的全人源 H2L2 抗體
Harbour H2L2小鼠 (Harbour Antibodies BV) 是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的基因轉殖小鼠，其產生的抗體具有完整的人的抗體可變結構域和大鼠恆定結構域。
用可溶的重組人4-1BB-Fc融合蛋白 (GenScript Biotech) 對Harbour H2L2小鼠進行多輪免疫。當檢測小鼠血清中4-1BB特異的抗體效價達到一定的位準後，將小鼠的脾細胞取出並與骨髓瘤細胞株融合得到融合瘤細胞；對融合瘤細胞經過多輪篩選和選殖之後，鑒定出若干個特異辨識4-1BB的單株抗體分子。對這些單株抗體進行進一步的鑒定，根據其對人4-1BB的結合能力、食蟹猴4-1BB的結合能力、T細胞活化能力等參數，優選出數個候選抗體分子。然後對候選抗體分子進行序列分析和最適化，得到數個變體序列。將抗體的VL和VH序列與相應的人的κ輕鏈恆定區和IgG1重鏈恆定區序列進行融合表現，得到重組全人源抗體分子。抗4-1BB的重組全人源IgG抗體PR000197和PR000448列於表5-8。
利用流式細胞術FACS和實施例5.6所述方法測試4-1BB抗體PR000197、PR000448結合高表現人4-1BB的CHO-K1細胞株 CHO-K1/hu4-1BB (南京金斯瑞, M00538)的結合能力，如圖28的(A)–(B)所示，其結合能力與Utomilumab相似。實施例 5.2.3. 獲得抗 4-1BB 的全人源 HCAb 抗體
Harbour HCAb小鼠 (Harbour Antibodies BV，WO2010/109165A2) 是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的基因轉殖小鼠，能夠產生僅有重鏈的抗體，該抗體的大小只有傳統IgG抗體的一半。其產生的抗體僅具有人的抗體重鏈可變結構域和小鼠Fc恆定結構域。
用可溶的重組人4-1BB-Fc融合蛋白 (睿智化學) 或者過表現了人4-1BB的NIH-3T3細胞 (睿智化學) 對Harbour HCAb小鼠進行多輪免疫。當檢測小鼠血清中4-1BB特異的抗體效價達到一定的位準後，將小鼠的脾細胞取出分離B細胞，用小鼠漿細胞分選試劑盒 (Miltenyi, #130-092-530)分選CD138陽性的漿細胞。用常規的分子生物學手段從漿細胞中擴增人VH基因，並將擴增的人VH基因片段建構到編碼人IgG1抗體重鏈Fc區域序列的哺乳動物細胞表現質體pCAG載體中。質體轉染哺乳動物宿主細胞 (如人胚腎細胞HEK293) 進行表現，得到全人源HCAb抗體上清。用FACS測試HCAb抗體上清與高表現人4-1BB的CHO-K1細胞CHO-K1/hu4-1BB的結合，鑒定出陽性HCAb抗體。對這些HCAb抗體進行進一步的鑒定，根據其對人4-1BB的結合能力、食蟹猴4-1BB的結合能力、T細胞活化能力等參數，優選出數個候選HCAb抗體分子。然後對候選HCAb抗體分子進行序列分析和最適化，得到數個變體序列。將HCAb抗體的VH序列和人的IgG1重鏈Fc序列進行融合表現，得到全人源重組HCAb抗體分子。抗4-1BB的重組全人源HCAb抗體PR001758、PR001760和PR001836列於表5-8。
利用流式細胞術FACS和實施例 5.6所述方法測試4-1BB重鏈抗體結合細胞 CHO-K1/hu4-1BB (南京金斯瑞, M00538)的結合能力，如圖28的 (C)-(F)所示，其結合能力與Utomilumab相似，優於Urelumab。實施例 5.3. 利用抗 PD-L1 的 IgG 抗體和抗 4-1BB 的 IgG 抗體建構具有 FIT-Ig 結構的雙特異性抗體分子
本實施例利用抗PD-L1的IgG抗體PR000265或PR000151(atezolizumab類似物)的抗原結合結構域Fab，和抗4-1BB的IgG抗體PR000197或PR000448的抗原結合結構域Fab，來建構具有FIT-Ig結構的抗PD-L1 x 4-1BB的雙特異性抗體分子。FIT-Ig結構的設計可以參考專利WO2015/103072A1，結構見圖1的(28)所示；所建構的分子總結於表5-1；並按照實施例 2所述方法製備抗體分子樣品並進行分析，總結於表5-2。表5-3列出了所述FIT-Ig結構的雙抗分子的多肽鏈序列對應的序列編號。表 5-1 具有 FIT-Ig 結構的 PD-L1 x 4-1BB 雙抗分子
結構編號 雙抗分子 PDL-1 抗體 (Fab A) 4-1BB 抗體 (Fab B) 4-1BB Fab 位置 連接肽 Fc 類型 ( 突變 )
FIT-Ig PR000701 PR000265 PR000197 靠近 Fc 無 人 IgG4
FIT-Ig PR003052 PR000151 PR000448 靠近 Fc 無 人 IgG4
表 5-2 FIT-Ig 結構的 PD-L1 x 4-1BB 雙抗分子蛋白的表現
結構編號 雙抗分子 表現系統和體積 第一步純化後產量 (mg/L) SEC-HPLC 純度 (%)
FIT-Ig PR000701 HEK293-F (30ml) 198.0 79.88
FIT-Ig PR003052 HEK293-6E (40ml) 47.5 87.76
表 5-3 FIT-Ig 結構的 PD-L1 x 4-1BB 雙抗分子的序列編號表
抗體編號 多肽鏈 1 多肽鏈 2 多肽鏈 3
PR000701 384 371 355
PR003052 452 451 355
實施例 5.4. 利用抗 PD-L1 的 IgG 抗體和抗 4-1BB 的 HCAb 抗體建構雙特異性抗體分子
本實施例利用抗PD-L1的IgG抗體PR000265的抗原結合結構域Fab，和抗4-1BB的HCAb抗體PR001758、PR001760或PR001836的抗原結合結構域VH，來建構多種結構的抗PD-L1 x 4-1BB的雙特異性抗體分子。
在本實施例及後續實施例中，陽性對照分子為抗PD-L1的IgG單抗PR000265，亦為PD-L1 x 4-1BB雙抗分子的PD-L1端的親代單抗。陽性對照分子為抗4-1BB的IgG單抗urelumab (IgG4) 或 utomilumab (IgG2)。陽性對照分子為PD-L1 x 4-1BB雙抗分子PR001289，其序列來源於專利WO2017/123650A2所公開的抗4-1BB及抗PD-L1的單域抗體序列。實施例 5.4.1. 建構 Fab-HCAb 對稱結構分子
利用抗PD-L1的IgG抗體和抗4-1BB的重鏈抗體，按照實施例 1.1所述結構設計Fab-HCAb 對稱結構的PD-L1 x 4-1BB雙抗分子，總結於表5-4；並按照實施例 2所述方法製備抗體分子樣品並進行分析，總結於表5-5。表 5-4 Fab-HCAb 對稱結構的 PD-L1 x 4-1BB 雙抗分子
結構編號 雙抗分子 PD-L1 抗體 (Fab) 4-1BB 抗體 (VH_B) 第一連接肽 (Fab 和VH_B 之間) 第二連接肽 (VH_B 和CH2 之間) Fc 類型( 突變)
1 PR004270 PR000265 PR001760 H1_15 人IgG1樞紐 (C220S) 人IgG1 (L234A, L235A)
2 PR007163 PR000265 PR001760 無 人IgG1樞紐 (C220S) 人IgG1 (L234A, L235A)
1 PR007164 PR000265 PR001760 無 人IgG1樞紐 (C220S) 人IgG1 (L234A, L235A)
表 5-5 Fab-HCAb 對稱結構的 PD-L1 x 4-1BB 雙抗分子蛋白的表現
結構編號 雙抗分子 表現系統和體積 質體轉染比例 ( 短鏈 : 長鏈 ) 第一步純化後產量 (mg/L) SEC-HPLC 純度 (%)
1 PR004270 HEK293-6E (40ml) 3 : 2 77.50 92.33
2 PR007163 HEK293 (100ml) 3 : 1 13 97.84
1 PR007164 HEK293 (100ml) 3 : 1 47 93.37
實施例 5.4.2. 建構 IgG-VH 四價對稱結構分子
利用抗PD-L1的IgG抗體和抗4-1BB的重鏈抗體，按照實施例1.2所述結構設計IgG-VH 四價對稱結構的PD-L1 x 4-1BB雙抗分子，總結於表5-6；並按照實施例2所述方法製備抗體分子樣品並進行分析，總結於表5-7。表 5-6 IgG-VH 四價對稱 結構 的 PD-L1 x 4-1BB 雙抗分子
結構編號 雙抗分子 PD-L1 抗體 (IgG) 4-1BB 抗體 (VH_B) VH_B 相對 IgG 位置 連接肽 Fc 類型 ( 突變 )
5 PR003549 PR000265 PR001758 重鏈 C 端 H1_15-RT 人 IgG1 (L234A, L235A, P329G)
5 PR003550 PR000265 PR001760 重鏈 C 端 H1_15-RT 人 IgG1 (L234A, L235A, P329G)
5 PR003551 PR000265 PR001836 重鏈 C 端 H1_15-RT 人 IgG1 (L234A, L235A, P329G)
表 5-7 IgG-VH 四價對稱結構的 PD-L1 x 4-1BB 雙抗分子蛋白的表現
結構編號 雙抗分子 表現系統和體積 第一步純化後產量 (mg/L) SEC-HPLC 純度 (%)
5 PR003549 HEK293-F (30ml) 24.51 98.31
5 PR003550 HEK293-F (30ml) 42.16 95.41
5 PR003551 HEK293-F (30ml) 2.28 99.39
實施例 5.4.3. PD-L1 x 4-1BB 雙抗分子及對照分子序列表
表5-8、表5-9和表5-10列出了本實施例所建構的PD-L1 x 4-1BB 雙抗分子和對應的PD-L1單抗、4-1BB單抗等親代單抗分子以及對照分子的序列所對應的序號。表5-10中的結構編號對應於表1-1和圖1。表5-11列出了雙特異性抗體分子的第一和第二抗原結合結構域相應的CDR序列的序列編號。表 5-8 對照分子 和親代單抗
抗體編號 抗體
PR000265 抗PD-L1 91G3H5H3(D54E), hIgG1(N297A)
PR000151 抗PD-L1單抗 atezolizumab 類似物, hIgG1(N297A)
PR000448 抗 4-1BB 79B10G8D4(H:N52Q;L:F2I) , hIgG4(S228P)
PR000197 抗4-1BB 79B10G8D4, hIgG4(S228P)
PR001758 抗4-1BB 重鏈抗體1016P0010B11, hIgG1
PR001760 抗4-1BB 重鏈抗體1016P0011G10, hIgG1
PR001836 抗4-1BB 重鏈抗體1016P0020G4, hIgG1
PR000628 抗4-1BB 單抗urelumab 類似物, hIgG4(S228P)
PR000483 抗4-1BB 單抗utomilumab 類似物, hIgG2
PR001289 PD-L1 x 4-1BB雙抗分子，僅一個不同的多肽鏈，序列來源於專利WO2017/123650A2公開的抗4-1BB及抗PD-L1的單域抗體序列, hIgG1(LALA)
表 5-9 對照分子和親代單抗的 序列 和 CDR 序列的序列編號表
抗體編號 輕鏈 重鏈 VL VH LCDR1 LCDR2 LCDR3 HCDR1 HCDR2 HCDR3
PR000265 353 308 282 240 167 188 211 15 69 122
PR000151 349 302 284 235 169 190 213 16 64 124
PR000197 350 304 285 237 170 191 214 18 66 126
PR000448 355 311 289 242 170 191 214 18 71 126
PR001758 無 320 無 252 無 無 無 27 79 137
PR001760 無 321 無 253 無 無 無 28 80 138
PR001836 無 323 無 255 無 無 無 29 82 138
PR000628 358 314 292 246 175 195 219 18 73 131
PR000483 356 312 290 243 174 194 218 22 72 130
PR001289 無 494 無 無 無 無 無 無 無 無
表 5-10 本實施例的 PD-L1 x 4-1BB 雙抗分子的序列編號表
結構編號 抗體編號 多肽鏈 1  ( 短鏈 ) 多肽鏈 2 ( 長鏈 )
5 PR003549 353 460
5 PR003550 353 461
5 PR003551 353 462
1 PR004270 371 486
2 PR007163 353 521
1 PR007164 371 522
表 5-11 PD-L1 x 4-1BB 雙抗分子的抗原結合結構域的 CDR 的序列編號表
結構編號 抗體編號 抗原結合域序號 LCDR1 LCDR2 LCDR3 HCDR1 HCDR2 HCDR3
1 PR004270, PR007164 #1 167 188 211 15 69 122
#2 無 無 無 28 80 138
2 PR007163 #1 167 188 211 15 69 122
#2 無 無 無 28 80 138
5 PR003549 #1 167 188 211 15 69 122
#2 無 無 無 27 79 137
5 PR003550 #1 167 188 211 15 69 122
#2 無 無 無 28 80 138
5 PR003551 #1 167 188 211 15 69 122
#2 無 無 無 29 82 138
FIT-Ig PR000701 #1 167 188 211 15 69 122
#2 170 191 214 18 66 126
FIT-Ig PR003052 #1 169 190 213 16 64 124
#2 170 191 214 18 71 126
實施例 5.5. 結合 PD-L1
本實施例是為了研究PD-L1 x 4-1BB雙抗分子結合PD-L1的活性。實施例 5.5.1. 結合高表現人 PD-L1 的 CHO-K1 細胞 CHO-K1/hPDL1
利用流式細胞術FACS測試抗體分子與高表現人PD-L1的CHO-K1細胞株 CHO-K1/hPDL1 (南京金斯瑞, M00543)的結合能力。具體地，消化酶處理CHO-K1/hPDL1細胞並用完全培養基重新懸浮；將細胞密度調整為1x106 細胞/mL。接著將細胞以100 µL/孔接種於96孔V底盤 (Corning, #3894)，4℃下離心5分鐘，棄上清。隨後將梯度稀釋的抗體分子以100 µL /孔加入96孔盤並混合均勻，抗體分子可以從最高終濃度為200 nM按照3倍濃度梯度稀釋的共12個濃度；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001)作為同型對照。將細胞放置於4℃，避光培育1小時。然後，加入100 µL /孔預冷的FACS緩衝液(含有0.5% BSA的 PBS緩衝液) 洗滌細胞兩次，4℃下500g離心5分鐘，棄上清。接著，再加入100 µL /孔螢光二抗 (Goat human lgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjunction, Thermo, #A11013, 1 : 1000稀釋)，放置於4℃，避光培育1小時。隨後以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液洗滌細胞兩次，然後於4℃下500 g離心5分鐘，棄上清。最後，以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液重新懸浮細胞。使用BD FACS CANTOII 流式細胞儀或ACEA NovoCyte流式細胞儀讀取螢光發光信號值，並用軟體FlowJo v10 (FlowJo, LLC) 處理和分析資料。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到抗體對標的細胞的結合曲線及EC50 值等參數。
本實施例中，陽性對照分子為抗PD-L1的單抗PR000265，亦為PD-L1 x 4-1BB雙抗分子的PD-L1端的親代單抗。結果顯示於圖27和表5-12。
圖27 的(A) 中所示，IgG-VH 四價對稱結構的雙抗分子(PR003549, PR003550, PR003551)結合PD-L1的能力與親代單抗PR000265的相似，而且其結合PD-L1的EC50值和MFI最大值略優於FIT-Ig結構的雙抗分子(PR000701, PR003052)。
圖27的 (B) 中所示，Fab-HCAb對稱結構的雙抗分子(PR004270)結合PD-L1的能力與親代單抗相似，其結合PD-L1的EC50值雖略弱於親代單抗，但是結合的MFI最大值比親代單抗更高。
圖27 的(C) 中所示，Fab-HCAb對稱結構的雙抗分子，無論是結構 (1) 的分子(PR007164)還是結構 (2) 的分子(PR007163)，都有幾乎相同的PD-L1結合活性；說明將Fab的CL融合到VH_B所在的重鏈上不影響Fab端的結合活性。表 5-12 結合 CHO-K1/hPDL1
抗體 EC50 (nM) MFI 最大值 抗體 EC50 (nM) MFI 最大值 抗體 EC50 (nM) MFI 最大值
PR003052 1.75 2006 PR004270 0.963 14716 PR007163 2.258 51309
PR000701 1.723 1714 PR000265 0.356 12960 PR007164 1.926 51400
PR003549 1.558 2224       PR000265 1.561 47006
PR003550 1.111 2254            
PR003551 1.294 2149            
PR000265 0.7807 2004            
實驗1 實驗2 實驗3
實施例 5.6. 結合 4-1BB
本實施例是為了研究PD-L1 x 4-1BB雙抗分子結合4-1BB的活性。
利用流式細胞術FACS測試抗體分子與高表現人4-1BB的CHO-K1細胞株 CHO-K1/hu4-1BB (南京金斯瑞, M00538) 和高表現食蟹猴4-1BB的CHO-K1細胞株 CHO-K1/cyno4-1BB (南京金斯瑞, M00569) 等細胞的結合能力。具體地，消化酶處理細胞並用完全培養基重新懸浮；將細胞密度調整為2x106 細胞/mL。接著將細胞以100 µL/孔(2x105 細胞/孔)接種於96孔V底盤 (Corning, #3894)，4℃下離心5分鐘，棄上清。隨後將梯度稀釋的抗體分子以100 µL /孔加入96孔盤並混合均勻，抗體分子可以從最高終濃度為200 nM按照3倍濃度梯度稀釋的共12個濃度；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001) 作為同型對照。將細胞放置於4℃，避光培育1小時。然後，加入100 µL /孔預冷的FACS緩衝液(含有0.5% BSA的 PBS緩衝液) 洗滌細胞兩次，4℃下500g離心5分鐘，棄上清。接著，再加入100 µL /孔螢光二抗 (Goat human lgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjunction, Thermo, #A11013, 1 : 1000稀釋)，放置於4℃，避光培育1小時。隨後以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液洗滌細胞兩次，然後於4℃下500 g離心5分鐘，棄上清。最後，以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液重新懸浮細胞。使用BD FACS CANTOII 流式細胞儀或ACEA NovoCyte流式細胞儀讀取螢光發光信號值，並用軟體FlowJo v10 (FlowJo, LLC) 處理和分析資料。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到抗體對標的細胞的結合曲線及EC50值等參數。
本實施例中，陽性對照分子為抗4-1BB的單抗Urelumab或Utomilumab。實施例 5.6.1. 結合高表現人 4-1BB 的 CHO-K1 細胞 CHO-K1/hu4-1BB
結果顯示於圖28和表5-13。
圖28的 (G) 中所示，IgG-VH 四價對稱結構的雙抗分子(PR003549, PR003550, PR003551)結合人4-1BB的能力優於FIT-Ig結構的雙抗分子(PR000701, PR003052)，而且在MFI最大值上優於陽性對照Urelumab。
圖28的 (H) 中所示，Fab-HCAb對稱結構的雙抗分子(PR004270)結合人4-1BB的能力在MFI最大值上優於陽性對照Urelumab和Utomilumab。
圖28的 (I) 中所示，Fab-HCAb對稱結構的雙抗分子，無論是結構 (1) 的分子(PR007164)還是結構 (2) 的分子(PR007163)，都有幾乎相同的4-1BB結合活性，且與親代單抗PR001760的相當。表 5-13 結合 CHO-K1/hu 4-1BB
抗體 EC50 (nM) MFI 最大值 抗體 EC50 (nM) MFI 最大值 抗體 EC50 (nM) MFI 最大值
PR000197 0.673 15488 PR000448 0.947 8182 PR001838 0.8512 101674
Utomilumab 0.553 13223 Utomilumab 0.627 7747 PR004469 1.295 109216
            Urelumab 0.6834 61805
抗體 EC50 (nM) MFI 最大值 抗體 EC50 (nM) MFI 最大值      
PR001758 0.2122 1644 PR001836 0.2798 1833      
PR001760 0.1981 1742 PR001838 0.2658 1832      
PR001771 0.5323 1716 PR001840 0.4302 1789      
Urelumab 0.2223 1381 Urelumab 0.2197 1278      
Utomilumab 0.1297 1584 Utomilumab 0.1771 1643      
抗體 EC50 (nM) MFI 最大值 抗體 EC50 (nM) MFI 最大值 抗體 EC50 (nM) MFI 最大值
PR003052 36 1390 PR004270 1.576 46812 PR007163 3.762 65156
PR000701 10.15 1338 Urelumab 0.3469 21640 PR007164 3.17 63217
PR003549 1.898 1546 Utomilumab 0.4635 37245 PR001760 3.761 83588
PR003550 1.523 1567            
PR003551 3.148 1570            
Urelumab 1.014 570            
實施例 5.6.2. 結合高表現食蟹猴 4-1BB 的 CHO-K1 細胞 CHO-K1/cyno 4-1BB
圖29和表5-14中所示，本實施例的雙抗分子可以結合食蟹猴4-1BB，而Urelumab不能。雙抗分子結合食蟹猴4-1BB(圖29, (A)-(B))的能力與結合人4-1BB(圖28, (G)-(H))的能力相當，有相似的結合EC50。表 5-14 結合 CHO-K1/cyno 4-1BB
抗體 EC50 (nM) MFI 最大值 抗體 EC50 (nM) MFI 最大值
PR003549 1.859 4977 PR004270 1.554 6103
PR003550 1.321 5365 Utomilumab 0.3368 5271
Utomilumab 0.3469 5389 Urelumab 不結合
Urelumab 不結合      
實驗 1 實驗 2
實施例 5.7. 高表現 PD-L1 的標的細胞媒介的 T 細胞的特異性活化
本實施例是為了研究PD-L1 x 4-1BB雙抗分子在標的細胞的存在是透過結合4-1BB來活化T細胞的活性。標的細胞可以是不同程度表現PD-L1的細胞，例如高表現人PD-L1的CHO-K1/hPDL1 (南京金斯瑞, M00543)，或者高表現人PD-L1的MDA-MB-231 (ATCC, HTB-26)。效應細胞可以是分離的人PBMC或者T細胞。
具體的，首先以100 µL/孔 將0.3 µg/mL抗CD3抗體OKT3 (Thermo, #16-0037-81)塗覆於96孔盤 (Corning, #3599)。接著，將人T細胞(從人PBMC中用T細胞分選試劑盒 (Miltenyi, #130-096-535) 分離得到)的密度調整為2 x106 細胞/mL，將標的細胞的密度調整為3 x105 細胞/mL，隨後把兩種細胞懸浮液各以50 µL/孔接種於96孔盤，最終效應細胞-標的細胞比為20 : 3。然後，以100 µL/孔加入不同濃度的抗體分子，抗體終濃度可以是 (10 nM, 1 nM)，或者是20 nM，或者是從最高終濃度為20 nM按照5倍濃度梯度稀釋的共8個濃度，兩個重複孔加入樣品；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001) 和hIgG4 iso (CrownBio, # C0045) 作為對照。將96孔盤置於37℃，5% CO2 培養箱中培育3天。分別收集培養48小時後和72小時後的上清液，用IL-2 ELISA試劑盒 (Thermo, #88-7025-88) 檢測48小時後的上清中IL-2濃度，用IFN-γ ELISA試劑盒 (Thermo, #88-7316-77) 檢測72小時後的上清中IFN-γ濃度。ELISA檢測方法參照相關試劑盒操作說明。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析。
本實施例中，陽性對照分子為抗4-1BB的單抗Urelumab。實施例 5.7.1. CHO-K1/hPDL1 媒介的 T 細胞特異性活化
圖30中所示，在標的細胞CHO-K1/hPDL1和T細胞混合的系統中，不依賴於交聯的抗4-1BB單抗Urelumab可以活化T細胞釋放IFN-γ，而依賴於交聯的抗4-1BB單抗(PR000448, PR001758, PR001760, PR001836)則幾乎不能活化T細胞。FIT-Ig結構的雙抗分子(PR003052, PR000701)和IgG-VH 四價對稱結構的雙抗分子(PR003549, PR003550, PR003551)和Fab-HCAb結構的雙抗分子(PR004270)都能夠活化T細胞並釋放細胞激素。這說明雙抗分子對T細胞的活化是依賴於標的細胞的特異性的活化。而且IgG-VH 四價對稱結構的雙抗分子(PR003549, PR003550)和Fab-HCAb結構的雙抗分子(PR004270)比FIT-Ig結構的雙抗分子(PR003052, PR000701)能夠引起更高的細胞激素釋放位準，顯示出更強的T細胞活化能力，且優於Urelumab。而且PR003549和PR004270與對照雙抗分子(PR001289)有相當甚至更強的T細胞活化能力。實施例 5.7.2. MDA-MB-231 媒介的 T 細胞特異性活化
圖31的 (A) 中所示，在標的細胞MDA-MB-231和T細胞混合的系統中，IgG-VH 四價對稱結構的雙抗分子(PR003549)和Fab-HCAb結構的雙抗分子(PR004270)有相似的T細胞活化能力；優於FIT-Ig結構的雙抗分子(PR003052, PR000701)和對照雙抗分子(PR001289)。
圖31的 (B)-(C) 和表5-15中所示，在標的細胞MDA-MB-231和T細胞混合的系統中，IgG-VH 四價對稱結構的雙抗分子(PR003549)比Urelumab有更強T細胞活化能力，能更好地促進IFN-γ(B)和IL-2(C)的產生。表 5-15 細胞激素位準
抗體 IFN-γ IL-2
EC50 (nM) 最大值 EC50 (nM) 最大值
PR003549 0.0695 16735 0.1203 1526
Urelumab 0.536 18131 2.944 1554
實施例 5.8. 混合淋巴細胞反應 (MLR)
本實施例是利用混合淋巴細胞反應  (MLR) 來研究PD-L1 x 4-1BB雙抗分子對T細胞的活化作用。
第一步，利用CD14 磁珠 (Meltenyi, #130-050-201) 從第一供體PBMC細胞(妙通生物)中分離單核細胞 (monocytes)；具體操作參照相關試劑盒說明書。然後加入50 ng/mL重組人源 IL-4 (PeproTech, #200-02-A) 和100 ng/mL重組人源GM-CSF (PeproTech, #300-03-A)，於37℃誘導7天後，獲得未成熟的樹突狀細胞(iDC細胞)。繼續加入1 μg/ml的脂多醣Lipopolysaccharide (LPS, Sigma, #L6529)，誘導24小時後，獲得成熟的樹突狀細胞(mDC細胞)。第二步，利用T細胞分離試劑盒 (Meltenyi, #130-096-535) 從第二供體PBMC細胞(妙通生物)中分離得到T淋巴細胞。第三步，將獲得的T細胞和mDC細胞按5 : 1比例接種至96孔盤(1×105 /孔的T細胞和2×104 /孔的mDC細胞)。隨後以50 µL/孔加入不同濃度的抗體分子，抗體終濃度可以是 (10 nM, 1 nM)，或者是從最高終濃度為50 nM按照3倍濃度梯度稀釋的共8個濃度，兩個重複孔加入樣品；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001)或者空白孔作為對照。於37℃，5% CO2 培養箱培育5天。第四步，分別收集第3天和第5天的上清液，用IL-2 ELISA試劑盒 (Thermo, #88-7025-88) 檢測第3天的上清中IL-2濃度，用IFN-γ ELISA試劑盒 (Thermo, #88-7316-77) 檢測第5天的上清中IFN-γ濃度。ELISA檢測方法參照相關試劑盒操作說明。
圖32和圖33中所示，在兩次獨立的MLR實驗中(不同的供體配對)，抗4-1BB單抗對T細胞的活化作用有限，產生細胞激素的能力很弱；抗PD-L1單抗有較明顯的活化作用。雙抗分子可以進一步提高T細胞的功能，優於抗PD-L1單抗。
圖32中所示，IgG-VH 四價對稱結構的雙抗分子(PR003549, PR003550, PR003551)比FIT-Ig結構的雙抗分子(PR003052, PR000701)能夠引起更高的細胞激素釋放位準，顯示出更強的T細胞活化能力；而且雙抗分子優於抗PD-L1單抗。
圖33 中所示，IgG-VH 四價對稱結構的雙抗分子(PR003549, PR003550)和Fab-HCAb結構的雙抗分子(PR004270)比FIT-Ig結構的雙抗分子(PR003052, PR000701)能夠引起更高的細胞激素釋放位準，顯示出更強的T細胞活化能力。而且相較於對照雙抗分子(PR001289)，IgG-VH和和Fab-HCAb結構的雙抗分子能夠刺激產生更多的IFN-γ。實施例 5.9. 藥代動力學研究
本實施例研究了具有Fab-HCAb對稱結構的PD-L1 x 4-1BB 雙抗分子PR004270在小鼠體內的藥代動力學性能。
實施方法如下：對於每一個測試抗體分子，選取體重18~22克的雌性BALB/c小鼠6隻，按5 mg/kg的劑量透過靜脈注射給與雙特異性抗體。一組3隻於給藥前以及給藥後15分鐘、24小時(1天)、第4天、和第10天採集全血，另一組3隻於只於給藥前以及給藥後5小時、第2天、第7天、和第14天採集全血。將全血靜置30分鐘使其凝固，隨後離心並將分離的血清樣品在-80℃下凍存直至分析。本實施例採用兩種ELISA方法來定量測定小鼠血清中的藥物濃度。ELISA方法一，即Fc端檢測(總體檢測)方法，透過塗覆於96孔盤的山羊抗人Fc多株抗體來捕捉小鼠血清中的含有人Fc的抗體，然後加入HRP標記的山羊抗人Fc第二抗體來檢測；ELISA方法二，即PD-L1端檢測(功能結構域檢測)方法，透過塗覆於96孔盤的人PD-L1蛋白來捕捉小鼠血清中的特異辨識PD-L1的抗體，然後加入HRP標記的的山羊抗人Fc第二抗體來檢測。使用Phoenix WinNonlin軟體8.2版，選用非房室模型(NCA)分析藥代動力學參數。
圖34 和表5-16中所示，Fab-HCAb結構的雙抗分子 PR004270有與常規IgG抗體相似的血清半衰期t1/2 值，功能結構域檢測方法顯示其t1/2 值超過10天。表 5-16 PR004270 在 BALB/c 小鼠體內的藥代動力學
雙抗分子 PR004270
動物 (數量) BALB/c 小鼠 (n=6)
抗體劑量 5 mg/kg, I.V.
PK 參數 Fc端檢測 PD-L1端檢測
T1/2 (hour) 465.6 256.5
Vd (mL/kg) 75.7 83.9
AUC (µg*hour/mL) 17,536 13,126
Cl (mL/hour/kg) 0.11 0.23
C0 (µg/mL) 119.7 81.7
實施例 5.10. 小結
本實施例利用抗PD-L1的IgG抗體的抗原結合結構域Fab和抗4-1BB的HCAb抗體的抗原結合結構域VH，建構了多種結構的抗PD-L1 x 4-1BB的雙特異性抗體分子。展現出了基於HCAb建構雙特異性抗體分子結構的靈活性，透過不同的結構類型、相對位置、結合價數等參數來調節活化T細胞的功能活性。
Urelumab對T細胞的活化是沒有標的特異性，這是其臨床毒副作用的原因之一。PD-L1 x 4-1BB 雙抗對T細胞活化作用是特異性依賴PD-L1的表現。依賴於交聯的抗4-1BB的單抗不能直接活化T細胞，但是，利用這些抗4-1BB單抗建構的PD-L1 x 4-1BB 雙抗在高表現 PD-L1的細胞存在時則可以特異地活化 T 細胞。
基於HCAb的雙抗結構，尤其是IgG-VH 四價對稱結構的雙抗分子和Fab-HCAb結構的雙抗分子，一方面保留了PD-L1端的活性，在MLR實驗中體現出比對應的抗PD-L1親代單抗更強的T細胞活化能力；另一方面標的細胞上高表現的PD-L1分子可以媒介4-1BB的交聯和三聚化以傳遞T細胞活化信號，其活化T細胞的能力甚至優於Urelumab。而且IgG-VH四價對稱結構和Fab-HCAb對稱結構的雙抗分子顯示出比FIT-Ig結構的雙抗分子擁有更強的T細胞活化能力。
綜上所述，本實施例建構出了安全性好、功能活性突出、分子穩定性好的PD-L1 x 4-1BB 雙特異性抗體分子。實施例 6. B7H4 x 4-1BB 雙特異性抗體 實施例 6.1. 背景
B7-H4 (VTCN1, B7h.5, B7S1, B7x) 是一種隸屬於B7/CD28超家族的跨膜蛋白。B7-H4 蛋白表現於一些免疫細胞如單核細胞和樹突狀細胞，有可能參與T細胞的負調控免疫反應。此外，B7H4還在乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、非小細胞肺癌、腎癌等的腫瘤細胞表面上高表現，而在大多數正常組織中沒有表現或者表現極低。B7-H4作為這些腫瘤的一個新興標的，近年來受到關注。抗B7-H4的抗體可以透過多種機制作用於腫瘤細胞，但是其研發方向主要集中在單株抗體上，目前尚無雙特異性抗體療法。
4-1BB (TNFRSF9, CD137) 是一種隸屬於TNF受體超家族的跨膜蛋白。4-1BB是在多種免疫細胞上表現的共刺激分子，為免疫活性的多功能調節劑。其誘導表現於活化的T細胞、NK細胞等免疫細胞。4-1BB透過其配體4-1BBL媒介的三聚化來活化T細胞，促進細胞增殖和細胞激素釋放。抗4-1BB的促效型抗體具有抑制腫瘤的功能，最早進入臨床試驗的4-1BB抗體是輝瑞的Utomilumab和百時美施貴寶 (BMS) 公司的Urelumab (BMS-663513)。Urelumab最初的臨床結果發表於2008年，儘管在部分患者上觀察到令人鼓舞的療效，但資料顯示Urelumab導致肝臟毒性，且與標的和劑量有關。並且，因為在臨床試驗中有兩位患者因肝毒性死亡，導致相關的臨床試驗被終止。Utomilumab安全性更好，劑量可提高至10 mg/kg，但治療效果依然欠佳。
在本實施例中，我們建構了同時標靶B7H4和4-1BB的雙特異性抗體，透過一個或者多個作用機制來提高抗腫瘤效果和安全性。第一，B7H4 x 4-1BB 雙抗可以透過解除B7H4的負調控信號來活化T細胞。第二，B7H4 x 4-1BB 雙抗富集於B7H4高表現的腫瘤組織，在腫瘤微環境中，免疫細胞和腫瘤細胞透過雙抗分子結合在一起，促進免疫突觸的形成；同時，高表現於腫瘤細胞表面的B7H4分子可以透過雙抗分子促進T細胞表面的4-1BB分子的交聯，並活化下游信號傳導途徑，提供共刺激信號，進而促進T細胞的活化和增殖，提高抗腫瘤活性。第三，本實施例所使用的抗4-1BB的促效型抗體的功能是依賴於分子交聯的，它只能在腫瘤微環境中利用標的細胞來媒介T細胞的活化，以避免類似Urelumab的單抗在正常組織中過度活化T細胞所帶來的毒副作用。實施例 6.2. 獲得抗 B7H4 的 IgG 抗體和抗 4-1BB 的 HCAb 抗體 實施例 6.2.1. 獲得抗 B7H4 的全人源 H2L2 抗體
Harbour H2L2小鼠 (Harbour Antibodies BV) 是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的基因轉殖小鼠，其產生的抗體具有完整的人的抗體可變結構域和大鼠恆定結構域。
用可溶的重組人B7H4-mFc融合蛋白 (Sino Biological Inc., #10738-H05H) 對Harbour H2L2小鼠進行多輪免疫。當檢測小鼠血清中B7H4特異的抗體效價達到一定的位準後，將小鼠的脾細胞取出並與骨髓瘤細胞株融合得到融合瘤細胞；對融合瘤細胞經過多輪篩選和選殖之後，鑒定出若干個特異辨識B7H4的單株抗體分子。對這些單株抗體進行進一步的鑒定，根據其對人B7H4的結合能力、食蟹猴B7H4的結合能力、標的細胞受體內化能力等參數，優選出數個候選抗體分子。然後對候選抗體分子進行序列分析和最適化，得到數個變體序列。將抗體的VL和VH序列與相應的人的κ輕鏈恆定區和IgG1重鏈恆定區序列進行融合表現，得到重組全人源抗體分子。抗B7H4的重組全人源IgG抗體PR002408和PR002410列於表6-9。實施例 6.2.2. 獲得抗 4-1BB 的全人源 HCAb 抗體
本實施例使用的抗4-1BB的全人源HCAb抗體PR001758、PR001760、PR001771、PR001840和PR004469(表6-9)來源於Harbour HCAb小鼠，其發現過程如實施例 5.2.3所述。
利用流式細胞術FACS和實施例 5.6所述方法測試4-1BB重鏈抗體結合細胞 CHO-K1/hu4-1BB (南京金斯瑞, M00538) 的結合能力，如圖28的 (C)-(F)所示，其結合能力與Utomilumab相似，優於Urelumab。實施例 6.3. 利用抗 B7H4 的 IgG 抗體和抗 4-1BB 的 HCAb 抗體建構雙特異性抗體分子
本實施例利用抗B7H4的IgG抗體PR002408或PR002410的抗原結合結構域Fab，和抗4-1BB的HCAb抗體PR001758、PR001760、PR001771、PR001840或PR004469的抗原結合結構域VH，來建構多種結構的抗B7H4 x 4-1BB的雙特異性抗體分子。
在本實施例及後續實施例中，陽性對照分子為抗B7H4的IgG單抗PR002408，亦為B7H4 x 4-1BB雙抗分子的B7H4端的親代單抗。
在本實施例及後續實施例中，陽性對照分子為抗4-1BB的IgG單抗urelumab。實施例 6.3.1. 建構 Fab-HCAb 對稱結構分子
利用抗B7H4的IgG抗體和抗4-1BB的重鏈抗體，按照實施例 1.1所述結構設計Fab-HCAb 對稱結構的B7H4 x 4-1BB雙抗分子，總結於表6-1；並按照實施例 2所述方法製備抗體分子樣品並進行分析，總結於表6-2。表 6-1 Fab-HCAb 四價對稱結構的 B7H4 x 4-1BB 雙抗分子
結構編號 雙抗分子 B7H4 抗體 (IgG) 4-1BB 抗體 (VH_B) 第一連接肽 (Fab 和 VH_B 之間 ) 第二連接肽 (VH_B 和 CH2 之間 ) Fc 類型 ( 突變 )
1 PR004279 PR002408 PR001760 H1_15 人IgG1樞紐 (C220S) 人 IgG1 (L234A, L235A)
1 PR005189 PR002408 PR001760 無 人IgG1樞紐 (C220S) 人 IgG1 (L234A, L235A)
2 PR007165 PR002408 PR001760 無 人IgG1樞紐 (C220S) 人 IgG1 (L234A, L235A)
表 6-2 Fab-HCAb 四價對稱結構的 B7H4 x 4-1BB 雙抗分子蛋白的表現
結構編號 雙抗分子 表現系統和體積 質體轉染比例 ( 短鏈 : 長鏈 ) 第一步純化後產量 (mg/L) SEC-HPLC 純度 (%)
1 PR004279 HEK293-F (30ml) 1 : 1 11.375 79.18
實施例 6.3.2. 建構 IgG-VH 四價對稱結構分子
利用抗B7H4的IgG抗體和抗4-1BB的重鏈抗體，按照實施例1.2所述結構設計IgG-VH 四價對稱結構的B7H4 x 4-1BB雙抗分子，總結於表6-3；並按照實施例2所述方法製備抗體分子樣品並進行分析，總結於表6-4。表 6-3 IgG-VH 四價對稱結構的 B7H4 x 4-1BB 雙抗分子
結構編號 雙抗分子 B7H4 抗體 (IgG) 4-1BB 抗體 (VH_B) VH_B 相對 IgG 位置 連接肽 Fc 類型 ( 突變 )
5 PR003334 PR002408 PR001758 重鏈 C 端 H1_15-RT 人 IgG1 (L234A, L235A)
5 PR003335 PR002408 PR001760 重鏈 C 端 H1_15-RT 人 IgG1 (L234A, L235A)
5 PR003338 PR002408 PR004469 重鏈 C 端 H1_15-RT 人 IgG1 (L234A, L235A)
表 6-4 IgG-VH 四價對稱結構的 B7H4 x 4-1BB 雙抗分子蛋白的表現
結構編號 雙抗分子 表現系統和體積 質體轉染比例 ( 短鏈 : 長鏈 ) 第一步純化後產量 (mg/L) SEC-HPLC 純度 (%) DSF Tm1 (°C)
5 PR003334 ExpiCHO (200ml) 3 : 2 38.2 97.98 60.32
5 PR003335 ExpiCHO (200ml) 3 : 2 68.9 99.29 65.59
5 PR003338 HEK293-F (10ml) 3 : 2 74.6 98.02 62.17
實施例 6.3.3. 建構 IgG-VH (2) 六價對稱結構分子
利用抗B7H4的IgG抗體和抗4-1BB的重鏈抗體，按照實施例 1.3所述結構設計IgG-VH(2) 六價對稱結構的B7H4 x 4-1BB雙抗分子，總結於表6-5；並按照實施例 2所述方法製備抗體分子樣品並進行分析，總結於表6-6。表 6-5 IgG-VH(2) 六價對稱結構的 B7H4 x 4-1BB 雙抗分子
結構 編號 雙抗分子 B7H4 抗體 (IgG) 4-1BB 抗體 (VH_B) 第一連接肽 (Fc 和VH_B 之間) 第二連接肽 (VH_B 和VH_B 之間) Fc 類型( 突變)
7 PR003487 PR002408 PR001760 H1_15-RT 無 人 IgG1 (L234A, L235A)
7 PR003488 PR002408 PR001760 H1_15-RT GS_5 人 IgG1 (L234A, L235A)
表 6-6 IgG-VH(2) 六價對稱結構的 B7H4 x 4-1BB 雙抗分子蛋白的表現
結構編號 雙抗分子 表現系統和體積 第一步純化後產量 (mg/L) SEC-HPLC 純度 (%)
7 PR003487 HEK293-F (30ml) 19 84
7 PR003488 HEK293-F (30ml) 17.39 85
實施例 6.3.4. 建構 Fab-Fc-VH (n) 非對稱結構分子
利用抗B7H4的IgG抗體和抗4-1BB的重鏈抗體，按照實施例 1.6和實施例 1.9所述結構設計 Fab-Fc-VH (n, n={2,3}) 非對稱結構的B7H4 x 4-1BB雙抗分子，總結於表6-7；並按照實施例 2所述方法製備抗體分子樣品並進行分析，總結於表6-8。所述分子的Fc區使用“knob-into-hole”結構的突變並引入L234A和L235A雙突變。表 6-7 Fab-Fc-VH(n) 非 對稱 結構的 B7H4 x 4-1BB 雙抗分子
結構編號 雙抗分子 B7H4 抗體 (Fab) 4-1BB 抗體 (VH_B) Fab 端結構 VH_B 重複數 n 第一連接肽 第二連接肽
14 PR004160 PR002410 PR001760 正常 2 GS_15 無
26 PR004161 PR002410 PR001760 正常 3 GS_15 AS-GS_15
26 PR004181 PR002410 PR001771 正常 3 GS_15 GS_15
26 PR004182 PR002410 PR001840 正常 3 GS_15 GS_15
表 6-8 Fab-Fc-VH(n) 非對稱結構的 B7H4 x 4-1BB 雙抗分子蛋白的表現
結構編號 雙抗分子 表現系統和體積 質體轉染比例 第一步純化後產量 (mg/L) SEC-HPLC 純度 (%)
14 PR004160 HEK293-F (30ml) 1 : 1 : 1 29.36 89.41
26 PR004161 HEK293-F (30ml) 1 : 1 : 1 31.62 85.47
26 PR004181 HEK293-F (30ml) 1 : 1 : 1 87.25 87.19
26 PR004182 HEK293-F (30ml) 1 : 1 : 1 24.75 79.14
實施例 6.3.5. B7H4 x 4-1BB 雙抗分子及對照分子序列表
表6-9、表6-10和表6-11列出了本實施例所建構的B7H4 x 4-1BB 雙抗分子和對應的B7H4單抗、4-1BB單抗等親代單抗分子以及對照分子的序列所對應的序號。表6-11中的結構編號對應於表1-1和圖1。表6-12列出了雙特異性抗體分子的第一和第二抗原結合結構域相應的CDR序列的序列編號。表 6-9 對照分子和親代單抗
抗體編號 抗體
PR002408 抗B7H4 單抗80C8-2E9(H:G55A; L:N92Q), hIgG1
PR002410 抗B7H4 單抗1025_B-1H11(L:C87Y), hIgG1
PR001758 抗4-1BB 重鏈抗體1016P0010B11, hIgG1
PR001760 抗4-1BB 重鏈抗體1016P0011G10, hIgG1
PR001771 抗4-1BB 重鏈抗體1016P0042C5, hIgG1
PR001840 抗4-1BB 重鏈抗體1016P0037D2, hIgG1
PR004469 抗4-1BB 重鏈抗體PR001838_G53A, hIgG1
PR000628 抗4-1BB 單抗urelumab 類似物, hIgG4(S228P)
表 6-10 對照分子和親代單抗的序列和 CDR 序列的序列編號表
抗體編號 輕鏈 重鏈 VL VH LCDR1 LCDR2 LCDR3 HCDR1 HCDR2 HCDR3
PR002408 360 326 298 261 180 191 225 32 87 143
PR002410 361 327 299 262 177 191 226 33 88 144
PR001758 無 320 無 252 無 無 無 27 79 137
PR001760 無 321 無 253 無 無 無 28 80 138
PR001771 無 322 無 254 無 無 無 28 81 139
PR001840 無 324 無 256 無 無 無 15 83 140
PR004469 無 329 無 264 無 無 無 28 89 145
PR000628 358 314 292 246 175 195 219 18 73 131
表 6-11 本實施例的 B7H4 x 4-1BB 雙抗分子的序列編號表
結構編號 抗體編號 多肽鏈 1 ( 短鏈 ) 多肽鏈 2 ( 長鏈 )
5 PR003334 360 455
5 PR003335 360 456
5 PR003338 360 457
7 PR003487 360 458
7 PR003488 360 459
1 PR004279 487 488
1 PR005189 487 520
2 PR007165 360 523
14 PR004160 361 481
26 PR004161 361 481
26 PR004181 361 481
26 PR004182 361 481
表 6-12 B7H4 x 4-1BB 雙抗分子的抗原結合結構域的 CDR 的序列編號表
結構編號 抗體編號 抗原結合域序號 LCDR1 LCDR2 LCDR3 HCDR1 HCDR2 HCDR3
1 PR004279, PR005189 #1 180 191 225 32 87 143
#2 無 無 無 28 80 138
2 PR007165 #1 180 191 225 32 87 143
#2 無 無 無 28 80 138
5 PR003334 #1 180 191 225 32 87 143
#2 無 無 無 27 79 137
5 PR003335 #1 180 191 225 32 87 143
#2 無 無 無 28 80 138
5 PR003338 #1 180 191 225 32 87 143
#2 無 無 無 28 89 145
7 PR003487, PR003488 #1 180 191 225 32 87 143
#2 無 無 無 28 80 138
14 PR004160 #1 177 191 226 33 88 144
#2 無 無 無 28 80 138
26 PR004161 #1 177 191 226 33 88 144
#2 無 無 無 28 80 138
26 PR004181 #1 177 191 226 33 88 144
#2 無 無 無 28 81 139
26 PR004182 #1 177 191 226 33 88 144
#2 無 無 無 15 83 140
實施例 6.4. 結合 B7H4
本實施例是為了研究B7H4 x 4-1BB雙抗分子結合B7H4的活性。實施例 6.4.1. 結合高表現人 B7H4 的 細胞 SK-BR-3
利用流式細胞術FACS測試抗體與高表現人B7H4的腫瘤細胞株SK-BR-3 (ATCC, HTB-30) 的結合能力。具體地，消化酶處理SK-BR-3細胞並用完全培養基重新懸浮，將細胞密度調整為2x106 細胞/mL；接著以50 µL細胞/孔接種於96孔V底盤 (Corning, #3894)。隨後以50 µL /孔加入5倍濃度梯度稀釋的抗體分子共8個濃度，混合均勻；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001)作為同型對照。將細胞放置於4℃，避光培育2小時。隨後以100 µL/孔加入預冷的PBS緩衝液洗滌細胞兩次，然後於4℃下500 g離心5分鐘，棄上清。之後，以100 µL/孔加入螢光二抗 (Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific, Jackson ImmunoResearch, #109-605-098, 1 : 1000稀釋)，放置於4℃ 避光培育1小時。隨後以100 µL/孔加入預冷的PBS緩衝液洗滌細胞兩次，然後於4℃下500 g離心5分鐘，棄上清。最後，以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液(含有0.5% BSA的 PBS緩衝液)重新懸浮細胞。使用BD FACS CANTOII 流式細胞儀或ACEA NovoCyte流式細胞儀 (ACEA Biosciences Inc.) 讀取螢光發光信號值，並用軟體FlowJo v10 (FlowJo, LLC) 處理和分析資料。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到抗體對標的細胞的結合曲線及EC50值等參數。
圖35和表6-13中所示，雙抗分子都能結合SK-BR-3細胞。圖35的 (A)-(C) 中所示，對稱結構的雙抗分子(PR003334, PR003335, PR003338, PR003487, PR003488, PR004279)具有相同的二價的B7H4結合結構域(源自抗B7H4單抗PR002408)，它們結合B7H4的EC50非常接近。IgG-VH-VH六價對稱結構的雙抗分子PR003487和PR003488與IgG-VH四價對稱結構的雙抗分子PR003335結合B7H4的能力幾乎相同。Fab-HCAb對稱結構的雙抗分子PR004279結合B7H4的活性比IgG-VH結構的PR003335的略強。圖35的 (D)-(E) 中所示，非對稱結構的雙抗分子(PR004160, PR004161, PR004181, PR004182)只有一個B7H4結合結構域，故結合B7H4的能力弱於對稱結構雙抗分子，但是PR004182仍體現出與對稱結構雙抗分子近似的結合EC50。圖35的 (F)中所示，Fab-HCAb對稱結構的雙抗分子，無論是結構 (1)的分子(PR005189)還是結構 (2) 的分子(PR007165)，都有幾乎相同的結合活性；說明將Fab的CL融合到VH_B所在的重鏈上不影響Fab端的結合活性。表 6-13 結合 SK -BR-3
抗體 EC50 (nM) MFI 最大值 抗體 EC50 (nM) MFI 最大值 抗體 EC50 (nM) MFI 最大值
PR003334 0.9685 254417 PR003335 2.725 127965 PR004279 0.6201 25718
PR003335 1.102 244159 PR003487 2.593 131617 PR003335 1.108 25113
PR003338 0.8207 241092 PR003488 2.626 132285      
抗體 EC50 (nM) MFI 最大值 抗體 EC50 (nM) MFI 最大值 抗體 EC50 (nM) MFI 最大值
PR007165 3.462 37793 PR004160 11.33 32312 PR004181 9.254 41920
PR005189 3.173 37457 PR004161 23.44 41230 PR004182 2.616 43637
PR002408 2.853 36029            
實施例 6.5. 結合 4-1BB
本實施例是為了研究B7H4 x 4-1BB雙抗分子結合4-1BB的活性。實施例 6.5.1. 結合高表現人 4-1BB 的 CHO-K1 細胞 CHO-K1/hu4-1BB
利用流式細胞術FACS測試抗體分子與高表現人4-1BB的CHO-K1細胞株 CHO-K1/hu4-1BB (南京金斯瑞, M00538) 的結合能力。具體地，消化酶處理細胞並用完全培養基重新懸浮；將細胞密度調整為2x106 細胞/mL。接著將細胞以100 µL/孔(2x105 細胞/孔)接種於96孔V底盤 (Corning, #3894)，4℃下離心5分鐘，棄上清。隨後將梯度稀釋的抗體分子以100 µL /孔加入96孔盤並混合均勻，抗體分子以5倍濃度梯度稀釋的共8個濃度；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001) 作為同型對照。將細胞放置於4℃，避光培育1小時。然後，加入100 µL /孔預冷的PBS緩衝液洗滌細胞兩次，4℃下500g離心5分鐘，棄上清。接著，再加入100 µL /孔螢光二抗 (Alexa Fluor® 488, Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific, Jackson ImmunoResearch, #109-545-098, 1 : 1000稀釋)，放置於4℃，避光培育1小時。隨後以200 µL/孔加入預冷的PBS緩衝液洗滌細胞兩次，然後於4℃下500 g離心5分鐘，棄上清。最後，以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液(含有0.5% BSA的 PBS緩衝液)重新懸浮細胞。使用BD FACS CANTOII 流式細胞儀或ACEA NovoCyte流式細胞儀讀取螢光發光信號值，並用軟體FlowJo v10 (FlowJo, LLC) 處理和分析資料。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到抗體對標的細胞的結合曲線及EC50值等參數。
本實施例中，陽性對照分子為抗4-1BB的單抗Urelumab。結果顯示於圖36和表6-14。
圖36中所示，雙抗分子都能結合CHO-K1/hu4-1BB細胞，且結合曲線EC50非常接近。圖36的 (A) 中所示，IgG-VH四價對稱結構的雙抗分子結合4-1BB的MFI最大值高於Urelumab；圖36的 (B) 中所示，IgG-VH-VH六價對稱結構的雙抗分子結合4-1BB的活性與Urelumab相似；圖36的 (C) 中所示，Fab-HCAb對稱結構的雙抗分子PR004279結合4-1BB的活性比IgG-VH結構的PR003335的略強；圖36的 (D)-(E) 中所示，Fab-Fc-VH(n) 非對稱結構的雙抗分子結合4-1BB的EC50與Urelumab相似，但是有更高的MFI最大值；圖36的 (F) 中所示，Fab-HCAb對稱結構的雙抗分子，無論是結構 (1) 的分子(PR005189)還是結構 (2) 的分子(PR007165)，都有相似的4-1BB結合活性，且與親代單抗PR001760的相當。表 6-14 結合 CHO-K1/hu 4-1BB
抗體 EC50 (nM) MFI 最大值 抗體 EC50 (nM) MFI 最大值 抗體 EC50 (nM) MFI 最大值
PR003334 0.4831 162519 PR003487 0.755 95740 PR004279 0.5035 104957
PR003335 0.7395 173076 PR003488 0.7735 98153 PR003335 1.349 91013
PR003338 0.6708 163354 Urelumab 0.7945 101473      
Urelumab 0.4241 118060            
抗體 EC50 (nM) MFI 最大值 抗體 EC50 (nM) MFI 最大值 抗體 EC50 (nM) MFI 最大值
PR007165 3.996 71246 PR004160 1.943 158311 PR004181 0.4487 69865
PR005189 4.255 92381 PR004161 1.266 126124 PR004182 0.6107 71139
PR001760 3.761 83588 Urelumab 1.506 88235 Urelumab 0.4488 63326
實施例 6.6. 高表現 B7H4 的標的細胞媒介的 T 細胞的特異性活化
本實施例是為了研究B7H4 x 4-1BB雙抗分子在標的細胞的存在時透過結合4-1BB來活化T細胞的活性。標的細胞可以是不同程度表現B7H4的細胞，例如高表現B7H4的SK-BR-3 (ATCC, HTB-30)，或者不表現B7H4的JIMT-1 (DSMZ, ACC 589)。效應細胞可以是分離的人PBMC或者T細胞。
具體的，首先將抗CD3抗體OKT3 (Thermo, #16-0037-81) 塗覆於96孔盤 (Corning, #3799)。接著，將人T細胞的密度調整為3 x106 細胞/mL，將標的細胞的密度調整為3 x105 細胞/mL，隨後把兩種細胞懸浮液各以50 µL/孔接種於96孔盤，最終效應細胞-標的細胞比為10 : 1。然後，以50 µL/孔加入不同濃度的抗體分子，以5倍濃度梯度稀釋的共6個濃度，兩個重複孔加入樣品；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001)和hIgG4 iso (CrownBio, #C0045) 作為對照。將96孔盤置於37℃，5% CO2 培養箱中培育2天。培育完成後，取100 µL上清液，加入另一96孔盤 (Corning, #3599)，於4℃下500 g離心5分鐘，取出50 µL上清液用於檢測細胞激素的位準。用IL-2 ELISA試劑盒 (Thermo, #88-7025-88)檢測上清中IL-2濃度，用IFN-γ ELISA試劑盒 (Thermo, #88-7316-88)檢測上清中IFN-γ濃度。ELISA檢測方法參照相關試劑盒操作說明。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析。
本實施例中，陽性對照分子為抗4-1BB的單抗Urelumab。實施例 6.6.1. SK-BR-3 媒介的 T 細胞特異性活化
圖37和圖38中所示，在高表現B7-H4的SK-BR-3細胞存在時，B7-H4 x 4-1BB雙抗分子活化T細胞的能力優於陽性對照分子，表現為該系統中產生的細胞激素IFN-γ(圖37)或IL-2(圖38)的釋放高於陽性對照分子。
圖37的(A)-(B)和圖38的(A)中所示，IgG-VH四價對稱結構的雙抗(PR003334, PR003335, PR003338)活化T細胞的能力比Urelumab略強，且PR003335和PR003338比PR003334略強。
圖37的(C)和圖38的(B)中所示，IgG-VH-VH六價對稱結構的雙抗(PR003487, PR003488)活化T細胞的能力明顯強於IgG-VH四價的雙抗(PR003334, PR003335)和Urelumab。
圖38的(C)中所示，Fab-HCAb對稱結構的雙抗(PR004279)活化T細胞的能力比Urelumab略強。
圖38的(D)-(F)中所示，Fab-Fc-VH(n) 非對稱結構的雙抗(PR004160, PR004161, PR004181, PR004182)可以刺激T細胞產生IL-2。PR004160和PR004161具有相同的4-1BB結合結構域(VH)的序列，但是PR004160有兩個串聯的VH域(即Fab-Fc-VH(2)結構)而PR004161有三個串聯的VH域(即Fab-Fc-VH(3)結構)；PR004161活化T細胞的能力明顯強於PR004160和Urelumab。具有相似Fab-Fc-VH(3) 結構的PR004181和PR004182也顯示出優於Urelumab的T細胞活化能力。這些非對稱結構雙抗儘管只有一個B7H4結合結構域且結合B7H4的能力弱於對稱結構雙抗，但是它們仍能利用高表現B7-H4的細胞媒介T細胞的活化，且活化能力優於Urelumab。實施例 6.6.2. B7H4 的表現對 T 細胞的活化的影響
圖39中所示，B7H4 x 4-1BB雙抗對T細胞活化是特異性依賴B7H4的表現。(A)在高表現 B7H4 的細胞SK-BR-3存在時，雙抗PR003334可以特異地活化T細胞釋放IL-2；(B)在不表現 B7H4 的細胞 JIMT-1 存在時，PR003334不能活化 T 細胞。Urelumab則沒有標的特異性，即使沒有B7H4的表現，也可以活化T細胞。實施例 6.7. 血清穩定性
本實施例研究了具有IgG-VH對稱結構的B7H4 x 4-1BB 雙抗分子(PR003334, PR003335)在高濃度人血清中的穩定性。具體地，雙抗分子用90%人血清進行梯度稀釋，初始濃度為100 nM，以3倍梯度稀釋8個濃度點。每個濃度下分成6份樣本，分別在37度培育0天、1天、2天、4天、7天、14天後，液態氮速凍後放置於-40度保存。然後，收集在血清中培育不同時間後的樣品，按照實施例6.4.1和實施例6.5.1所述方法分別測試雙抗分子與SK-BR-3細胞和CHOK1/hu 4-1BB細胞的結合活性，以考察雙抗分子在血清中放置不同時間後的結合活性的變化。
雙抗分子PR003334(圖40，表6-15)和PR003335(圖41，表6-16)在人血清中是穩定的，即使在放置14天後，其B7H4端和4-1BB端的結合活性都沒有明顯的變化。表 6-15 PR003334 血清培育不同時間後結合標的細胞的活性
PR003334 結合 SK-BR-3 結合 CHO-K1/hu 4-1BB
EC50 (nM) MFI 最大值 EC50 (nM) MFI 最大值
第一天 1.707 186430 0.841 360239
第二天 1.912 168183 0.769 397943
第四天 1.562 147497 0.607 374153
第七天 2.004 160471 0.68 381546
第十四天 1.489 164959 0.851 383431
表 6-16 PR003335 血清培育不同時間後結合標的細胞的活性
PR003335 結合 SK-BR-3 結合 CHO-K1/hu 4-1BB
EC50 (nM) MFI 最大值 EC50 (nM) MFI 最大值
第一天 1.285 112575 0.470 432153
第二天 1.039 102557 0.457 396669
第四天 1.072 120474 0.624 389379
第七天 1.41 93520 0.820 410577
第十四天 0.6645 78631 0.561 391641
實施例 6.8. 藥代動力學研究
本實施例研究了具有IgG-VH對稱結構的B7H4 x 4-1BB 雙抗分子(PR003334, PR003335)在小鼠體內的藥代動力學性能。
實施方法如下：對於每一個測試抗體分子，選取體重18~22克的雌性C57BL/6小鼠6隻，按5 mg/kg的劑量透過靜脈注射給與雙特異性抗體。一組3隻於給藥前以及給藥後15分鐘、24小時(1天)、第4天、和第10天採集全血，另一組3隻於只於給藥前以及給藥後5小時、第2天、第7天、和第14天採集全血。將全血靜置30分鐘使其凝固，隨後4℃下以2,000 rpm離心5分鐘，並將分離的血清樣品在-80℃下凍存直至分析。本實施例採用兩種ELISA方法來定量測定小鼠血清中的藥物濃度。ELISA方法一，即Fc端檢測(總體檢測)，透過塗覆於96孔盤的山羊抗人Fc多株抗體來捕捉小鼠血清中的含有人Fc的蛋白，然後加入HRP標記的山羊抗人Fc第二抗體來檢測；ELISA方法二，即4-1BB端檢測(功能結構域檢測)方法，透過塗覆於96孔盤的人4-1BB蛋白 (Acro biosystems, # 41B-H5227)來捕捉小鼠血清中的特異辨識人4-1BB的抗原結合蛋白，然後加入HRP標記的的山羊抗人Fc第二抗體來檢測。使用Phoenix WinNonlin軟體8.2版，選用非房室模型(NCA)分析藥代動力學參數。
圖42和表6-17中所示，IgG-VH結構的雙抗分子 PR003334和PR003335有與常規IgG抗體相似的藥代動力學：在總體檢測方法下，PR003334和PR003335在小鼠體內的血清半衰期t1/2值分別約為8天和14天；在功能域檢測方法下，PR003334和PR003335在小鼠體內的血清半衰期t1/2值分別約為9天和12天。表 6-17 B7H4 x 4-1BB 雙抗分子在 C57BL/6 小鼠體內的藥代動力學
雙抗分子 PR003334 PR003335
動物 (數量) C57BL/6 小鼠 (n=6) C57BL/6 小鼠 (n=6)
抗體劑量 5 mg/kg, I.V. 5 mg/kg, I.V.
PK 參數 Fc端檢測 4-1BB端檢測 Fc端檢測 4-1BB端檢測
T1/2 (hour) 193 218 336 295
Vd (mL/kg) 76 89 81 81
AUC (µg*hour/mL) 12,680 11,471 14,813 14,286
Cl (mL/hour/kg) 0.28 0.28 0.17 0.19
C0 (µg/mL) 111 114 123 124
實施例 6.9. 雙抗分子的抗腫瘤藥效
本實施例研究了B7H4 x 4-1BB 雙抗分子PR003334在BALB/c-hCD137 / CT26-hB7H4小鼠腫瘤模型中的抗腫瘤藥效。
實施方法如下：選用6-8周雌性BALB/c-hCD137小鼠(將BALB/c小鼠引入外源人4-1BB基因轉殖，集萃藥康生物科技)，然後將處於對數生長期的CT26-hB7H4腫瘤細胞(將小鼠結腸癌細胞CT26引入外源人B7H4基因轉殖，和鉑醫藥)以5 ×105 細胞/鼠的劑量接種於實驗小鼠腋右側背部皮下。當平均腫瘤體積達到80 mm3 時對小鼠進行隨機分組，每組6隻小鼠。分組當天，將特定濃度經PBS稀釋的藥物以腹腔注射(i.p.)、每週給藥2次總共給藥6次(BIW*3)的方式進行給藥，以PBS為空白對照組。在初次給藥當天及之後第4、7、11、14和18天對腫瘤體積和小鼠體重進行測量。腫瘤大小計算公式：腫瘤體積 (mm3 ) = 0.5 × (腫瘤長徑 × 腫瘤短徑2 )。實驗結束後將荷瘤小鼠安樂死並剝瘤稱重。計算各組小鼠的腫瘤體積、小鼠體重等實驗結果以平均值±標準誤差 (Mean ±SEM) 表示。多組比較採用單因子變異數分析(one way ANOVA)檢驗方法比較不同治療組與對照組相比有無顯著性差異。
本實施例中，抗4-1BB的單抗Urelumab為陽性對照分子。雙抗分子PR003334的6 mpk (mg/kg) 劑量與Urelumab的5 mpk劑量為同莫耳濃度(根據分子量換算)的對等劑量；雙抗分子PR003334的18 mpk 劑量與Urelumab的15 mpk劑量為同莫耳濃度的對等劑量。10 mpk的抗小鼠PD-1抗體(Bio X Cell, clone RMP1-14,  #BE0146) 也作為對照分子。PBS為空白對照組。
圖43中所示，雙抗分子PR003334和Urelumab在各劑量組都有抑制腫瘤生長的藥效，且優於PD-1抗體(A)。各組小鼠體重變化均在正常範圍內(B)。實施例 6.10. 利用 UNcle 測試雙抗分子的穩定性和理化特性
本實施例利用實施例2.5所述方法測試具有IgG-VH對稱結構的B7H4 x 4-1BB 雙抗分子(PR003334, PR003335, PR003338)的分子穩定性等理化特徵。如表6-18中所示，這些雙抗分子有良好的穩定性。表 6-18 雙抗分子在 UNcle 中的測試參數
PR003334 PR003335 PR003338
Tm (℃) 60.32 65.59 62.17
Tagg (℃) at 266 nm 52.00 50.39 54.14
Tagg (℃) at 473 nm / / /
Initial SLS at 266 nm (counts x104 ) 0.26 0.22 0.20
Max SLS at 266 nm (counts x104 ) 1.00 0.40 0.34
Initial SLS at 473 nm (counts) ＜ 0 ＜ 0 ＜ 0
Max SLS at 473 nm (counts) ＜ 0 ＜ 0 ＜ 0
Initial diameter (nm) (25℃) 16.22 16.38 11.74
Final diameter (nm) (95℃) 23.85 17.51 16.52
Initial PDI 0.267 0.229 0.043
Final PDI 0.089 0.194 0.185
實施例 6.11. 小結
本實施例利用抗B7H4的IgG抗體的抗原結合結構域Fab和抗4-1BB的HCAb抗體的抗原結合結構域VH，建構了多種結構的抗B7H4 x 4-1BB的雙特異性抗體分子。展現出了基於HCAb建構雙特異性抗體分子結構的靈活性，透過不同的結構類型、相對位置、結合價數等參數來調節活化T細胞的功能活性。
Urelumab對T細胞的活化是沒有標的特異性，這是其臨床毒副作用的原因之一。但是，B7H4 x 4-1BB 雙抗對 T 細胞活化作用是特異性依賴 B7H4 的表現。在高表現 B7H4 的細胞存在時，雙抗可以特異地活化 T 細胞；而在沒有 B7H4表現時，雙抗不能活化 T 細胞。因而，B7H4 x 4-1BB 雙抗相較於4-1BB單抗如Urelumab有更好的安全性。
另一方面，B7H4 x 4-1BB 雙抗在B7H4 存在時，可以媒介4-1BB的交聯和三聚化以傳遞T細胞活化信號，而且其活化T細胞的能力甚至優於Urelumab。在Fab-HCAb和IgG-VH四價對稱結構中，4-1BB端的VH是二價的，其活化T細胞的能力略優於Urelumab；在IgG-VH-VH六價對稱結構中，4-1BB端的VH是多價的，其活化T細胞的能力得到明顯的加強，顯著優於Urelumab。
綜上所述，本實施例建構出了安全性好、功能活性突出、分子穩定性好的B7H4 x 4-1BB 雙特異性抗體分子。實施例 7. BCMA x CD3 雙特異性抗體 實施例 7.1. 背景
BCMA (B-細胞成熟抗原，TNFRSF17，CD269) 是一種屬於TNF受體超家族的跨膜蛋白，其參與B細胞成熟、生長和存活。BCMA主要有兩種配體：高親和力配體APRIL (增殖誘導配體)以及低親和力配體BAFF(B細胞活化激素)。BCMA是一種高度分化的漿細胞選擇性蛋白，其表現限於B-細胞譜系且主要存在於漿細胞和漿母細胞上，並在一定程度上存在於記憶B-細胞上，但是不存在於周邊B-細胞上。BCMA在多發性骨髓瘤(MM)患者的惡性漿細胞中表現，支持多發性骨髓瘤細胞的生長和存活。多發性骨髓瘤是繼非霍奇金淋巴瘤的血液系統第二大惡性腫瘤，約占血液系統惡性腫瘤的13%。作為多發性骨髓瘤的一個新興標的，BCMA抗體可以透過多種機制作用於MM細胞。
目前臨床階段最快的針對BCMA的抗體是葛蘭素史克 (GSK) 公司的抗體CA8-J6M0 hIgG1 (下文又稱陽性對照1，在實施例中編號為PR000274)以及在CA8-J6M0基礎上製備的抗體偶聯藥物belantamab mafodotin (CA8-J6M0-mcMMAF, GSK2857916)。GSK2857916在多項臨床試驗中治療不同類型的MM患者。來自一項小型臨床研究的資料顯示，在35例過度預治療(大多數患者至少接受了5種療法治療失敗)復發性或難治性的MM患者中，客觀緩解率(ORR)達到了60%，中位無進展生存期(PFS)為12個月。安全性方面，最常見的副作用包括角膜事件、血小板減少和貧血，這些都與ADC中偶聯的細胞毒性製劑有關。
目前，處於臨床開發階段的雙特異性抗體有安進的AMG-420、再生元的REGN-5458、新基的CC-93269、強生JNJ-64007957、艾伯維的TNB383B。然而這些雙特異性抗體還存在半衰期短、細胞激素釋放綜合症(CRS)等問題。TNB383B雙特異性抗體於2019年進入臨床一期用於MM，其具有細胞激素釋放位準較低的特點。但是TNB383B既不結合食蟹猴的BCMA也不結合食蟹猴的CD3，不能在食蟹猴進行毒理學評估。
因此，急需研發更加安全有效的同時標靶人的BCMA和CD3、並能結合食蟹猴的BCMA和CD3的雙特異性抗體。實施例 7.2. 抗 BCMA 的 HCAb 抗體的發現
可以利用BCMA抗原對實驗動物進行免疫以獲得針對BCMA特異性結合的抗體分子，該實驗動物可以是小鼠、大鼠、兔、羊、駱駝等。通常，其得到的抗體分子是非人源的。在獲得非人源抗體後，需要對這些分子利用抗體工程技術進行人源化改造，以降低免疫原性並提高成藥性。然而，抗體的人源化過程有其技術複雜性，經過人源化改造的分子往往會降低對抗原的親和力。另一方面，基因轉殖技術的進步使得可以培育出基因工程化小鼠，其攜帶人免疫球蛋白免疫庫並使其內源的鼠的免疫庫缺失。這種基因轉殖小鼠產生的抗體具有全人源的序列，因而無需再進一步做人源化改造，大大提高了治療性抗體開發的效率。Harbour HCAb小鼠 (Harbour Antibodies BV, WO2010/109165A2) 是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的基因轉殖小鼠，能夠產生全新的僅“重鏈”抗體，該抗體的大小只有常規IgG抗體的一半。其產生的抗體僅具有人的抗體“重鏈”可變結構域和小鼠Fc恆定結構域。由於不含輕鏈的這一特點，該抗體幾乎解決了輕鏈錯配和異源二聚化的問題，使得這一技術平臺能夠開發出常規抗體平臺難以實現的產品。實施例 7.2.1. 用 BCMA 抗原免疫小鼠
用可溶的重組人BCMA-ECD-Fc融合蛋白對Harbour HCAb小鼠進行多輪免疫。抗原蛋白與免疫佐劑混合成免疫原試劑，然後透過皮下經腹股溝注射或透過腹腔注射。在每一輪免疫中，每隻小鼠接受的總注射劑量是100微升。在首輪免疫中，每隻小鼠接受用50 微克抗原蛋白 (重組人BCMA-ECD-Fc, ACRO Biosystems, #BC7-H82F0) 與完全弗氏佐劑 (Sigma, #F5881) 以體積比1:1混合配製的免疫原試劑的免疫。在隨後的每輪增強免疫中，每隻小鼠接受用25 微克抗原蛋白與Sigma Adjuvant System 佐劑 (Sigma, #S6322) 混合配製的免疫原試劑的免疫。每輪增強免疫的間隔時間至少為兩周，通常不超過五輪增強免疫。免疫時間為第0、14、28、42、56、70天；並且在第49、77天，檢測小鼠血清抗體效價。在進行HCAb小鼠脾B細胞分離前5天，以每隻小鼠25微克抗原蛋白的劑量進行最後一次增強免疫。實施例 7.2.2. 獲得 HCAb 單株和抗體序列
當檢測小鼠血清中BCMA特異的抗體效價達到一定的位準後，將小鼠的脾細胞取出分離B細胞，用BD FACSAria™ III 細胞分選儀分選CD138陽性的漿細胞和BCMA抗原陽性的B細胞群。提取RNA，反轉錄cDNA後PCR擴增人VH基因。擴增的VH基因片段建構到編碼人IgG1抗體重鏈Fc結構域序列的哺乳動物細胞表現質體pCAG載體中，質體轉染哺乳動物宿主細胞 (如人胚腎細胞HEK293) 進行表現，表現的HCAb的抗體上清與重組人BCMA-Fc, Avitag重組蛋白 (ACRO Biosystems, #BC7-H82F0) 進行Mirrorball (SPT Labtech, mirrorball® fluorescence cytometer) 篩選，獲得的陽性單株抗體上清用流式細胞術FACS進一步的鑒定。用FACS測試抗體上清與高表現人BCMA 的HEK293T細胞株 HEK293T/hBCMA (北京康源博創, KC-0233) 、高表現食蟹猴BCMA的HEK293T細胞株HEK293T/cynoBCMA (北京康源博創, KC-0979) 和高表現人BCMA的細胞株NCI-H929 (ATCC, CRL-9068) 等細胞的結合能力。透過多輪篩選，獲得了四個陽性單選殖株。利用常規的定序手段獲得編碼抗體分子可變結構域的核苷酸序列以及對應的胺基酸序列。在本實施例中，從免疫的Harbour HCAb小鼠得到的抗BCMA單株抗體分子可變結構域的序列是人源抗體序列。實施例 7.2.3. 製備抗 BCMA 全人重組抗體
按照實施例 2.2所述方法，用編碼HCAb抗體的質體，利用常規的重組蛋白表現和純化技術，製備純化的抗BCMA重組重鏈抗體。
表7-1列出了本實施例中抗BCMA的HCAb抗體的重鏈可變結構域、重鏈全長胺基酸序列和根據Chothia規則定義的CDR的胺基酸序列所對應的序列編號SEQ ID NO。表7-2列出了陽性對照1即CA8-J6M0 (抗體編號PR000274)的輕、重鏈序列所對應的序列編號SEQ ID NO。表 7-1 抗 BCMA 的 HCAb 抗體的序列編號表
選殖株號 抗體編號 重鏈 VH HCDR1 HCDR2 HCDR3
1005P10H8 PR000940 316 248 15 75 133
1005P16A10 PR000943 317 249 24 76 134
1005P36F3 PR001035 318 250 25 77 135
1005P63B7 PR001046 319 251 26 78 136
表 7-2 抗 BCMA 的對照抗體的序列編號表
抗體別名 抗體編號 重鏈 輕鏈
陽性對照1 PR000274 309 354
實施例 7.3. HCAb 抗體結合 BCMA
本實施例是為了研究抗BCMA的HCAb抗體的結合人和食蟹猴BCMA的活性。利用流式細胞術FACS測試抗BCMA重組抗體與高表現人BCMA 的HEK293T細胞株 HEK293T/hBCMA (北京康源博創, KC-0233) 、高表現食蟹猴BCMA的HEK293T細胞株HEK293T/cynoBCMA (北京康源博創, KC-0979) 和高表現人BCMA的細胞株NCI-H929 (ATCC, CRL-9068)等細胞的結合能力。具體地，消化酶處理HEK293T/hBCMA細胞和HEK293T/cynoBCMA細胞，並用DMEM完全培養基重新懸浮；另外，收集NCI-H929細胞懸浮液。將3種細胞密度分別調整為1x106 細胞/mL。以100 µL細胞/孔接種於96孔V底盤 (Corning, #3894)，隨後加入100 µL /孔，2倍於終濃度的3倍濃度梯度稀釋的待測抗體。將細胞放置於4℃，避光培育1小時。之後，加入100 µL /孔預冷PBS 洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清。再加入100 µL /孔螢光二抗 (Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific, Jackson, #109-545-06, 1 : 500稀釋)，4℃，避光培育30分鐘。用100 µL /孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清。最後，200 µL /孔預冷PBS重新懸浮細胞，使用BD FACS CANTOII流式細胞儀或ACEA NovoCyte流式細胞儀讀取螢光發光信號值，並用軟體FlowJo v10 (FlowJo, LLC) 處理和分析資料。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到抗體對標的細胞的 結合曲線及EC50值等參數。
本實施例中，陽性對照1分子為抗BCMA的單抗PR000274。實施例 7.3.1. 結合高表現人 BCMA 的細胞 HEK293T/hBCMA
圖44和表7-3中所示，抗人BCMA的HCAb單抗PR000943，PR001035和PR001046可以結合HEK293T/hBCMA，且結合曲線的EC50均優於陽性對照1。表 7-3 結合 HEK293T/hBCMA
抗體 EC50 (nM) MFI 最大值
PR000943 0.1535 69991
PR001035 0.3356 39840
PR001046 0.2129 63382
陽性對照1 4.076 86498
實施例 7.3.2. 結合高表現人 BCMA 的細胞 NCI-H929
圖46和表7-4中所示，抗人BCMA的HCAb單抗PR000940，PR000943，PR001035和PR001046可以結合NCI-H929，且結合曲線的EC50均優於陽性對照1。表 7-4 結合 NCI-H929
抗體 EC50 (nM) MFI 最大值
PR000940 1.847 90962
PR000943 4.8 166453
PR001035 1.193 112747
PR001046 1.535 132791
陽性對照1 10.75 124959
實施例 7.3.3. 結合高表現食蟹猴 BCMA 的細胞 HEK293T/cynoBCMA
圖45和表7-5中所示，抗人BCMA的HCAb單抗PR000943和PR001046可以結合HEK293T/cynoBCMA，且結合曲線的EC50均優於陽性對照1。PR001035結合食蟹猴BCMA的能力較弱。表 7-5 結合 HEK293T/cynoBCMA
抗體 EC50 (nM) MFI 最大值
PR000943 0.3293 63990
PR001035 n.d. 10848
PR001046 0.5641 67701
陽性對照1 4.564 116307
實施例 7.4. HCAb 抗體內化對標的細胞的毒殺
本實施例是為了研究抗人BCMA的HCAb抗體內化媒介對表現人BCMA的細胞的毒殺。具體地，消化酶處理高表現人BCMA的HEK293T細胞株HEK293T/hBCMA (北京康源博創, KC-0233)，並用DMEM完全培養基重新懸浮細胞，計數並接種5000或10000個/孔至96-孔黑壁透明底的平盤 (Perkin Elmer,  #6005225)。重組抗體連續稀釋至9個不同濃度並加入，最終濃度從100 nM開始。加入a-hFc-MMAF (Moradec, #AH-102-AF) 使最終濃度為1 μg/ml。平盤在37℃、5% CO2 條件下培育72小時，然後用CTG試劑盒(Promega, #G7573)裂解，並用Enspire™ 多功能孔盤讀取機 (PerkinElmer, Inc.) 檢測發光。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到抗體對標的細胞的結合曲線及EC50 值和最大毒殺率等參數。
圖47和表7-6中所示，抗人BCMA的HCAb抗體PR000943和PR001046比陽性對照1分子有更優的內化能力。表 7-6 抗體內化媒介標的細胞毒殺
抗體 EC50 (nM) 最大毒殺率 (%)
PR000943 0.4917 78.72
PR001046 0.5711 71.20
陽性對照1 2.180 77.19
實施例 7.5. BLI 方法測定結合 BCMA 的親和力
本實施例利用生物膜干涉(BLI)技術，使用Octet Red96e分子相互作用分析儀 (ForteBio, Octet Red96e)，來分析抗BCMA的抗體與BCMA抗原蛋白之間的結合動力學。在本實施例中，BCMA蛋白為生物素化的人BCMA-Fc, Avitag重組蛋白 (ACRO Biosystems, #BC7-H82F0)，測試緩衝液為1x動力學緩衝液(從10x動力學緩衝液 (ForteBio, #18-1105) 稀釋)。
測定抗原和抗體(多濃度)的親和力時，感測器轉動速度為1000 轉/分鐘。先將兩列SA感測器(每列放置8個感測器；第一列稱為參照SA感測器，第二列稱為測試SA感測器)在測試緩衝液中平衡10分鐘。然後用測試SA感測器捕捉生物素化的人BCMA-Fc, Avitag重組蛋白，捕捉高度0.9-1.1 nm；而參照SA感測器浸入緩衝液中30秒。然後將SA感測器在測試緩衝液中平衡2分鐘。兩列SA感測器再與梯度稀釋的抗BCMA抗體(例如，抗體濃度可以從50 nM開始以兩倍梯度稀釋為6個濃度以及0 nM)結合5分鐘，然後解離10分鐘。
使用Octet Data Analysis軟體(Fortebio，版本11.0)進行資料分析時，選擇雙扣除模式(double reference)扣除參照信號，選擇“1:1 Global fitting”方法進行資料擬合，計算出抗原與抗體結合的動力學參數，得到kon (1/Ms) 值、kdis (1/s) 值和KD (M) 值。
圖48及表7-7中所示，抗人BCMA的HCAb抗體與人BCMA蛋白有較強的結合親和力。表 7-7 抗 BCMA 的 HCAb 抗體結合人 BCMA 蛋白的親和力
抗體編號 KD (M) kon (1/Ms) kdis (1/s) Full R^2
PR000940 1.52E-10 4.01E+05 6.09E-05 0.995
PR000943 1.62E-10 1.19E+05 1.93E-05 0.9986
PR001035 2.76E-10 3.25E+05 8.98E-05 0.9926
PR001046 2.53E-11 4.23E+05 1.07E-05 0.9983
實施例 7.6. 最適化 HCAb 抗體序列提高結合 BCMA 的親和力
本實施例利用抗體工程的方法提高HCAb抗體PR001046 結合BCMA的親和力。實施例 7.6.1. 獲得 PR001046 的變體
透過對HCAb抗體PR001046的可變區VH的CDR區進行兩輪定點突變，以獲得結合BCMA的親和力提高的突變體。
第一輪，對PR001046 VH的三個CDR區域(按照Kabat CDR定義規則指定)中的35個位址進行逐點胺基酸掃描，建立35個不同位址的單點飽和突變庫。對35個飽和突變庫利用BCMA結合ELISA進行篩選，信號超過PR001046 VH的2倍的陽性選殖株被挑出來定序，並進一步對這些陽性選殖株利用梯度稀釋的多濃度BCMA結合ELISA來測試其結合BCMA的能力。優選出若干個突變熱點。
第二輪，將第一輪中優選出來的突變熱點進行隨機組合，建立一個包含所有突變組合的庫。然後對組合庫進行篩選。對陽性選殖株進行定序和序列分析，並進一步測試其結合BCMA的能力。選出若干個突變體。
PR001046 VH的變體分子用對應的選殖株號來表示，例如：PR001046-R1-12G7，PR001046-R2-7E7 等。將變體分子的VH區建構到帶有Flag和His標籤的原核表現載體，然後利用常規的重組蛋白表現和純化技術製備變體分子，其對應的序列編號列於表7-8。最後利用FACS和BLI等方法對重組突變分子進行結合能力的測定。表 7-8 PR001046 衍生變體分子的序列編號表
變體選殖株號 抗體編號 重鏈 VH HCDR1 HCDR2 HCDR3
PR001046 319 251 26 78 136
1046-R1-12G7 PR004559 330 265 26 90 136
1046-R2-10F1 PR004560 331 266 34 78 146
1046-R2-10H1 PR004561 332 267 35 78 147
1046-R2-10H5 PR004562 333 268 35 90 147
1046-R2-1A1 PR004563 334 269 36 90 146
1046-R2-2D4 PR004564 335 270 35 76 147
1046-R2-2G4 PR004565 336 271 34 78 148
1046-R2-4G10 PR004566 337 272 35 76 136
1046-R2-5E1 PR004567 338 273 35 90 146
1046-R2-5H1 PR004568 339 274 34 76 136
1046-R2-5H2 PR004569 340 275 35 76 146
1046-R2-6D6 PR004570 341 276 34 76 146
1046-R2-6F1 PR004571 342 277 35 90 148
1046-R2-7E7 PR004572 343 278 35 90 136
1046-R2-8B1 PR004573 344 279 35 90 136
1046-R2-9E5 PR004574 345 280 34 76 146
實施例 7.6.2. 利用 BLI 方法分析變體分子結合 BCMA 蛋白的解離速率排序
利用實施例 7.5所述方法利用BLI技術測定PR001046 VH衍生出的單域結構變體分子與BCMA的結合能力。本實施例直接使用含有PR001046 VH衍生變體分子的上清，用Octet Red96e分子相互作用分析儀分析變體分子和生物素化的人BCMA-Fc, Avitag重組蛋白之間的結合動力學。用結合動力學中的解離速率對變體分子進行排序，挑選出解離速率更慢(更強親和力)的變體分子。本實施例只分析每個變體分子與BCMA結合動力學的解離速率並計算其與初始分子(PR001046 VH)的相對值 (Kdis Fold)；“Kdis 倍數”小於1說明變體分子相較於初始分子有更慢的解離速率。
本實施例由於不使用多濃度結合動力學分析來計算抗原抗體結合親和力，不需要對分析的抗體進行梯度稀釋，因而每個抗體只需要一個SA感測器，從而在每一個分析迴圈中可以分析多個樣品，提高了分析通量。利用這一方法可以對大量的變體分子的上清樣品進行解離速率分析，篩選出解離速率更優的分子。
表7-9中所示，16個PR001046 VH衍生出的變體分子相較於初始分子有更慢的解離速率(即對BCMA有更強的親和力)。表 7-9 PR001046 衍生變體分子結合 BCMA 蛋白的解離速率 Kdis
變體選殖株 抗體編號 Conc. (nM) Response Kdis (1/s) Kdis 倍數
PR001046 100 0.2606 6.96E-04 1.00
1046-R1-12G7 PR004559 100 0.2614 3.79E-04 0.54
1046-R2-10F1 PR004560 100 0.5732 3.01E-04 0.43
1046-R2-10H1 PR004561 100 0.2694 3.00E-04 0.43
1046-R2-10H5 PR004562 100 0.5352 2.17E-04 0.31
1046-R2-1A1 PR004563 100 0.4933 2.59E-04 0.37
1046-R2-2D4 PR004564 100 0.5701 2.28E-04 0.33
1046-R2-2G4 PR004565 100 0.5572 2.36E-04 0.34
1046-R2-4G10 PR004566 100 0.4245 2.86E-04 0.41
1046-R2-5E1 PR004567 100 0.5781 2.01E-04 0.29
1046-R2-5H1 PR004568 100 0.7325 2.30E-04 0.33
1046-R2-5H2 PR004569 100 0.7303 2.54E-04 0.36
1046-R2-6D6 PR004570 100 0.4373 2.34E-04 0.34
1046-R2-6F1 PR004571 100 0.7035 2.19E-04 0.31
1046-R2-7E7 PR004572 100 0.2896 2.36E-04 0.34
1046-R2-8B1 PR004573 100 0.2680 2.82E-04 0.41
1046-R2-9E5 PR004574 100 0.2901 3.14E-04 0.45
實施例 7.6.3. 變體分子結合高表現人 BCMA 的細胞 NCI-H929
利用實施例 7.3所述方法測定PR001046 VH衍生出的單域結構變體分子與高表現人BCMA的細胞NCI-H929的結合。特別指出，其重組變體分子是帶有Flag標籤的VH單域抗體分子，在FACS實驗中需要使用針對此標籤的螢光二抗。
圖49和表7-10中所示，16個PR001046 VH衍生出的單域變體分子可以更好地結合細胞 NCI-H929，結合力優於初始分子。表 7-10 結合 NCI-H929
抗體編號 變體選殖株 EC50 (nM) MFI 最大值
PR001046 未定 764
PR004559 1046-R1-12G7 22.35 1189
PR004560 1046-R2-10F1 3.75 1305
PR004561 1046-R2-10H1 4.38 1242
PR004562 1046-R2-10H5 1.24 1560
PR004563 1046-R2-1A1 7.96 1260
PR004564 1046-R2-2D4 1.34 1530
PR004565 1046-R2-2G4 2.42 1428
PR004566 1046-R2-4G10 3.17 1399
PR004567 1046-R2-5E1 1.72 1436
PR004568 1046-R2-5H1 2.85 1444
PR004569 1046-R2-5H2 5.87 1416
PR004570 1046-R2-6D6 2.15 1355
PR004571 1046-R2-6F1 2.86 1382
PR004572 1046-R2-7E7 0.54 1496
PR004573 1046-R2-8B1 1.72 1232
PR004574 1046-R2-9E5 2.90 1299
實施例 7.7. 抗 CD3 的 IgG 抗體的發現
抗CD3抗體是建構T細胞銜接雙特異性抗體(T-Cell Engager Bispecific Antibody)的重要組成部分。本實施例介紹了不同方法發現和製備抗CD3的抗體。實施例 7.7.1. 全人源 CD3 抗體的發現
Harbour H2L2小鼠(Harbour Antibodies BV)是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的基因轉殖小鼠，其產生的抗體具有完整的人的抗體可變結構域和大鼠恆定結構域。用CD3抗原對Harbour H2L2小鼠進行多輪免疫；所述抗原可以是重組人CD3融合蛋白，或者含有人CD3E的N端前27個胺基酸殘基的短肽，或者人的T細胞。當檢測小鼠血清中CD3特異的抗體效價達到一定的位準後，將小鼠的脾細胞取出，並從中分離出B細胞；然後提取RNA並用RT-PCR製備cDNA。以cDNA為模板，透過PCR擴增出VH和Vκ片段，然後進行重疊PCR製備得到scFv片段，並連接到預先線性化的載體pHBM-scFv-ST。將上述所得的連接產物轉化至MC1061F' 電轉感受態細胞 (Lucigen, #60512-1)，然後製備噬菌體序列庫。用生物素化的抗原蛋白進行多輪生物淘選，並用高表現人CD3/TCR複合物的CHO-K1細胞CHO-K1/hCD3 (和鉑醫藥) 進行篩選，鑒定出陽性選殖株並定序。表7-11列出了透過噬菌體展示技術篩選得到的結合CD3的單鏈可變區融合蛋白(scFv-Fc結構)。表 7-11 全人源的抗人 CD3 的抗體的序列編號表
選殖 株號 抗體編號 多肽鏈 VL VH LCDR1 LCDR2 LCDR3 HCDR1 HCDR2 HCDR3
M15-C10 PR002161 490 294 258 177 191 221 15 84 141
M15-H2 PR002163 491 295 259 178 197 222 31 85 142
M23-F11 PR002337 492 296 260 177 191 223 31 86 141
M27-B11 PR002340 493 297 259 179 198 224 31 85 142
實施例 7.7.2. CD3 抗體的人源化改造
SP34是來源於小鼠的抗人CD3的抗體，具有活化T細胞的功能。SP34是極少數的可以結合多種靈長類CD3(例如人和食蟹猴CD3)的抗體(參見，Salmeron, A. et al, J Immunol 147 (1991) 3047-3052； Conrad M.L., et. al, Cytometry A 71 (2007) 925-933)。其可變區序列VH和VL來源於WO2016071004A1。
本實施例使用“CDR移植”的方法對小鼠抗體SP34的可變區的序列進行人源化，即：將SP34的VH的CDR移植到人抗體VH的框架區，將SP34的VL的CDR移植到人抗體VL的框架區。人抗體VH或VL的框架區的序列可以來源於人的胚系基因序列或者經過V(D)J重排後的抗體序列或者人抗體特定VH或VL基因家族的一致性(consensus)序列。本實施例使用人的胚系基因序列提供的框架區序列作為人源化模板序列，即：人的胚系V基因片段提供框架區FR1，FR2，FR3的序列，人的胚系J基因片段提供框架區FR4的序列。最後以 (人)FR1-(鼠)CDR1-(人)FR2-(鼠)CDR2-(人)FR3- (鼠)CDR3-(人)FR4 的排列方式建構人源化可變區(VH或VL)序列。
本實施例使用人胚系V基因片段IGHV3-73*01或人胚系V基因片段IGHV3-23*01結合人胚系J基因片段IGHJ1*01的序列作為人源化模板提供框架區序列。並且在第30位、第73位、第76位、第78位、第93位或第94位(按照Chothia編碼規則)引入一個或者多個位址的胺基酸突變，得到多個不同的VH變體序列。本實施例還使用人胚系V基因片段IGLV7-46*02結合人胚系J基因片段IGLJ2*01的序列或者人胚系V基因片段IGKV1-39*01結合人胚系J基因片段IGKJ4*01的序列作為人源化模板提供框架區序列。並且在第2位、第36位、第46位、第49位、第66位、第69位、第71位或第87位(按照Chothia編碼規則)引入零個或者多個位址的胺基酸突變，得到多個不同的VL變體序列。
將SP34衍生的VH變體序列和VL變體序列進行配對組合，並按照實施例 2.2中的方法製備重組抗體。表7-12和表7-13列出了SP34及其衍生變體的重組抗體和對應的序列編號。表 7-12 SP34 衍生的人源化重組抗體
抗體編號 可變區變體 Fc 類型 ( 突變 )
PR000260 SP34 鼠抗初始序列 人IgG1 (LALA)
PR000511 VH: VH3231; VL: VL7461 人IgG1 (LALA)
PR001848 VH: VH3232; VL: VL7461 人IgG1 (AAG)
PR003886 VH: VH3730_N30S; VL: VL7461 人IgG1 (LALA)
PR004616 VH: VH3233; VL: VL7461 人IgG1 (LALA)
PR000510 VH: VH3731; VL: VL7461. 建構成scFv 人IgG1 (LALA)
(AAG:  L234A, L235A, P329G; LALA:  L234A, L235A.)表 7-13 SP34 衍生的人源化重組抗體的序列和 CDR 序列的序列編號表
抗體編號 輕鏈 重鏈 VL VH LCDR1 LCDR2 LCDR3 HCDR1 HCDR2 HCDR3
PR000260 352 307 287 239 172 192 216 20 68 128
PR000511 357 313 291 245 172 192 216 20 68 128
PR001848 357 325 291 257 172 192 216 30 68 128
PR003886 357 328 291 263 172 192 216 30 68 128
PR004616 357 346 291 281 172 192 216 30 68 128
PR000510 無 489 291 244 172 192 216 20 68 128
實施例 7.7.3. CD3 抗體結合 T 細胞
利用流式細胞術FACS和實施例 7.10所述方法測試CD3抗體結合人的T細胞的結合能力。如圖66所示，所述CD3抗體都可以與人T細胞結合；特別地，全人源CD3抗體(PR002161, PR002163)結合T細胞的能力與SP34嵌合抗體(PR000260)的相似(圖66的 (F))；PR000510和PR000511是SP34衍生的人源化抗體，其結合T細胞的能力與PR000260的接近(圖66的 (A)-(B))；PR001848、PR003886和PR004616是SP34衍生的人源化抗體，透過序列最適化，不同程度地減弱其與T細胞結合的能力(圖66 的(C)-(E))，以在後續的雙抗設計中有選擇性地調節T細胞活化功能。實施例 7.8. 利用抗 CD3 的 IgG 抗體和抗 BCMA 的 HCAb 抗體建構雙特異性抗體分子
本實施例利用抗CD3的IgG抗體的抗原結合結構域Fab，和抗BCMA的HCAb抗體的抗原結合結構域VH，來建構多種結構的抗BCMA x CD3的雙特異性抗體分子。抗CD3的抗原結合結構域Fab的序列來源於表7-11和表7-13所述序列；抗BCMA的抗原結合結構域VH的序列來源於表7-1和表7-8所述序列。
在本實施例及後續實施例中，對照分子為：陽性對照1分子為抗BCMA的單抗CA8-J6M0(抗體編號PR000274，序列來源專利US9273141B2)；陽性對照2分子為BCMA x CD3雙抗分子(抗體編號PR002199，序列來源專利WO2019133761A1)；陽性對照3分子為BCMA x CD3雙抗分子(抗體編號PR003106，序列來源專利WO2017134134A1)；抗CD3的單抗SP34衍生的hIgG1嵌合抗體(抗體編號PR000260，序列來源專利WO2016071004A1)。對照分子的序列見表7-19。實施例 7.8.1. 建構 Fab-Fc-VH (n) 非對稱結構分子
利用抗CD3的IgG抗體和抗BCMA的重鏈抗體，按照實施例 1.5和實施例 1.6所述結構設計 Fab-Fc-VH (n, n={1,2}) 非對稱結構的BCMA x CD3雙抗分子，總結於表7-14；並按照實施例 1.6.2所述結構設計含有兩個不同抗BCMA的VH結構域序列的三價非對稱結構分子，總結於表7-15；並按照實施例 2所述方法製備抗體分子樣品並進行分析，總結於表7-16。表 7-14 Fab-Fc-VH(n) 非對稱結構的 BCMA x CD3 雙抗分子
結構編號 雙抗分子 CD3 抗體(Fab) BCMA 抗體(VH_B) Fab 端結構 VH_B 重複數 n 連接肽 Fab 端的 Fc 類型( 突變) VH_B 端的 Fc 類型( 突變)
11 PR001987 PR000511 PR000940 正常 1 無 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
11 PR001988 PR000511 PR000943 正常 1 無 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
11 PR001989 PR000511 PR001035 正常 1 無 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
11 PR001990 PR000511 PR001046 正常 1 無 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
12 PR001991 PR000511 PR000940 cross VH/VL 1 無 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
12 PR001992 PR000511 PR000943 cross VH/VL 1 無 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
12 PR001993 PR000511 PR001035 cross VH/VL 1 無 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
12 PR001994 PR000511 PR001046 cross VH/VL 1 無 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
13 PR001995 PR000511 PR000940 cross Fd/LC 1 無 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
13 PR001996 PR000511 PR000943 cross Fd/LC 1 無 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
13 PR001997 PR000511 PR001035 cross Fd/LC 1 無 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
13 PR001998 PR000511 PR001046 cross Fd/LC 1 無 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
14 PR002299 PR001848 PR000940 正常 2 RT-GS_5-KL 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
14 PR002300 PR001848 PR000940 正常 2 RT-GS_15-KL 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
14 PR002301 PR001848 PR000940 正常 2 RT-GS_25-KL 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
14 PR002308 PR001848 PR001046 正常 2 RT-GS_5-KL 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
14 PR002309 PR001848 PR001046 正常 2 RT-GS_15-KL 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
14 PR002310 PR001848 PR001046 正常 2 RT-GS_25-KL 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
11 PR002929 PR001848 PR001046 正常 1 無 人 IgG1 (knob, LALA) 人 IgG1 (hole, LALA)
11 PR002935 PR004616 PR001046 正常 1 無 人 IgG1 (knob, LALA) 人 IgG1 (hole, LALA)
14 PR002892 PR001848 PR001046 正常 2 GS_5 人 IgG1 (knob, LALA) 人 IgG1 (hole, LALA)
14 PR002895 PR001848 PR001046 正常 2 GS_15 人 IgG1 (knob, LALA) 人 IgG1 (hole, LALA)
14 PR002950 PR004616 PR001046 正常 2 GS_5 人 IgG1 (knob, LALA) 人 IgG1 (hole, LALA)
14 PR002953 PR004616 PR001046 正常 2 GS_15 人 IgG1 (knob, LALA) 人 IgG1 (hole, LALA)
14 PR002898 PR001848 PR001046 正常 2 GS_2 人 IgG1 (knob, LALA) 人 IgG1 (hole, LALA)
14 PR002901 PR001848 PR001046 正常 2 GS_4 人 IgG1 (knob, LALA) 人 IgG1 (hole, LALA)
14 PR002956 PR004616 PR001046 正常 2 GS_2 人 IgG1 (knob, LALA) 人 IgG1 (hole, LALA)
14 PR002959 PR004616 PR001046 正常 2 GS_4 人 IgG1 (knob, LALA) 人 IgG1 (hole, LALA)
14 PR003177 PR003886 PR001046 正常 2 GS_5 人 IgG1 (knob, LALA) 人 IgG1 (hole, LALA)
14 PR003178 PR003886 PR001046 正常 2 GS_15 人 IgG1 (knob, LALA) 人 IgG1 (hole, LALA)
14 PR003690 PR003886 PR001046 正常 2 GS_15 人 IgG1 (knob, LALA, YTE) 人 IgG1 (hole, LALA, YTE)
11 PR003867 PR003886 PR004559 正常 1 無 人 IgG1 (knob, LALA) 人 IgG1 (hole, LALA)
11 PR003868 PR003886 PR004563 正常 1 無 人 IgG1 (knob, LALA) 人 IgG1 (hole, LALA)
11 PR003869 PR003886 PR004564 正常 1 無 人 IgG1 (knob, LALA) 人 IgG1 (hole, LALA)
11 PR003870 PR003886 PR004565 正常 1 無 人 IgG1 (knob, LALA) 人 IgG1 (hole, LALA)
11 PR003871 PR003886 PR004566 正常 1 無 人 IgG1 (knob, LALA) 人 IgG1 (hole, LALA)
11 PR003872 PR003886 PR004567 正常 1 無 人 IgG1 (knob, LALA) 人 IgG1 (hole, LALA)
11 PR003873 PR003886 PR004568 正常 1 無 人 IgG1 (knob, LALA) 人 IgG1 (hole, LALA)
11 PR003874 PR003886 PR004569 正常 1 無 人 IgG1 (knob, LALA) 人 IgG1 (hole, LALA)
11 PR003875 PR003886 PR004570 正常 1 無 人 IgG1 (knob, LALA) 人 IgG1 (hole, LALA)
11 PR003876 PR003886 PR004571 正常 1 無 人 IgG1 (knob, LALA) 人 IgG1 (hole, LALA)
11 PR003877 PR003886 PR004572 正常 1 無 人 IgG1 (knob, LALA) 人 IgG1 (hole, LALA)
11 PR003878 PR003886 PR004573 正常 1 無 人 IgG1 (knob, LALA) 人 IgG1 (hole, LALA)
11 PR003879 PR003886 PR004574 正常 1 無 人 IgG1 (knob, LALA) 人 IgG1 (hole, LALA)
11 PR003880 PR003886 PR004560 正常 1 無 人 IgG1 (knob, LALA) 人 IgG1 (hole, LALA)
11 PR003881 PR003886 PR004561 正常 1 無 人 IgG1 (knob, LALA) 人 IgG1 (hole, LALA)
11 PR003882 PR003886 PR004562 正常 1 無 人 IgG1 (knob, LALA) 人 IgG1 (hole, LALA)
(突變代號：Knob : S354C, T366W;Hole : Y349C, T366S, L368A, Y407V;AAG :  L234A, L235A, P329G;LALA :  L234A, L235A;YTE :  M252Y,S254T,T256E.)表 7-15 含有兩個不同抗 BCMA 的 VH 結構域序列的 Fab-Fc-VH(2) 三價非對稱結構的 BCMA x CD3 多特異性抗體分子
結構編號 雙抗分子 CD3 抗體 (Fab) BCMA 抗體 (VH_C) BCMA 抗體 (VH_B) Fab 端結構 連接肽 (VH_B 和VH_C 之間) Fab 端的 Fc 類型( 突變) VH_B 端的 Fc 類型( 突變)
15 PR002313 PR001848 PR000940 PR000943 正常 RT-GS_15-KL 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
15 PR002326 PR001848 PR001035 PR001046 正常 RT-GS_15-KL 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
15 PR002328 PR001848 PR001035 PR001046 正常 RT-GS_25-KL 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
15 PR002332 PR001848 PR001046 PR001035 正常 RT-GS_15-KL 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
(突變代號：Knob: S354C, T366W; Hole: Y349C, T366S, L368A, Y407V; AAG:  L234A, L235A, P329G.)表 7-16 Fab-Fc-VH(n) 非對稱結構的 BCMA x CD3 雙抗分子蛋白的表現
結構編號 雙抗分子 表現系統和體積 質體轉染比例 第一步純化後產量 (mg/L) SEC-HPLC 純度 (%)
11 PR001987 HEK293-F (40ml) 3 : 2 : 4 61 67.88
11 PR001988 HEK293-F (40ml) 3 : 2 : 4 50.7 66.65
11 PR001989 HEK293-F (40ml) 3 : 2 : 4 76 86.06
11 PR001990 HEK293-F (40ml) 3 : 2 : 4 68.3 76.97
12 PR001991 HEK293-F (40ml) 3 : 2 : 4 20.8 71.97
12 PR001992 HEK293-F (40ml) 3 : 2 : 4 8.7 77.76
12 PR001993 HEK293-F (40ml) 3 : 2 : 4 12.6 77.71
12 PR001994 HEK293-F (40ml) 3 : 2 : 4 17.1 80.01
13 PR001995 HEK293-F (40ml) 3 : 2 : 4 118.3 70.29
13 PR001996 HEK293-F (40ml) 3 : 2 : 4 71.3 71.98
13 PR001997 HEK293-F (40ml) 3 : 2 : 4 60.7 79.66
13 PR001998 HEK293-F (40ml) 3 : 2 : 4 62 39.96
14 PR002299 HEK293-F (40ml) 1 : 1 : 1 20.5 46.03
14 PR002300 HEK293-F (40ml) 1 : 1 : 1 31 80.48
14 PR002301 HEK293-F (40ml) 1 : 1 : 1 14.4 75.42
14 PR002308 HEK293-F (40ml) 1 : 1 : 1 14.7 64.92
14 PR002309 HEK293-F (40ml) 1 : 1 : 1 31 75.96
14 PR002310 HEK293-F (40ml) 1 : 1 : 1 26.8 71.46
15 PR002313 HEK293-F (40ml) 1 : 1 : 1 24.8 70.13
15 PR002326 HEK293-F (40ml) 1 : 1 : 1 14 84.62
15 PR002328 HEK293-F (40ml) 1 : 1 : 1 27.5 79.04
15 PR002332 HEK293-F (40ml) 1 : 1 : 1 23.1 82.13
11 PR002929 HEK293-F (40ml) 1 : 1 : 1 13.5 94.45
11 PR002935 HEK293-F (40ml) 1 : 1 : 1 4.55 94.26
14 PR002892 HEK293-F (40ml) 1 : 1 : 1 6.5 76.9
14 PR002895 HEK293-F (40ml) 1 : 1 : 1 16.9 84.34
14 PR002950 HEK293-F (40ml) 1 : 1 : 1 3.3 75.26
14 PR002953 HEK293-F (40ml) 1 : 1 : 1 7.4 89.17
14 PR002898 HEK293-F (40ml) 1 : 1 : 1 5.6 81.72
14 PR002901 HEK293-F (40ml) 1 : 1 : 1 5.8 83.72
14 PR002956 HEK293-F (40ml) 1 : 1 : 1 5.4 78.14
14 PR002959 HEK293-F (40ml) 1 : 1 : 1 6 73.9
14 PR003177 Expi-CHO (300ml) 1 : 1 : 1 196 83.29
14 PR003178 Expi-CHO (300ml) 1 : 1 : 1 188 83.04
14 PR003690 Expi-CHO (300ml) 1 : 1 : 1 200 83.81
11 PR003867 HEK293-F (30ml) 1 : 1 : 1 11.46 100
11 PR003868 HEK293-F (30ml) 1 : 1 : 1 0.12 未測
11 PR003869 HEK293-F (30ml) 1 : 1 : 1 5.63 100
11 PR003870 HEK293-F (30ml) 1 : 1 : 1 2.4 100
11 PR003871 HEK293-F (30ml) 1 : 1 : 1 6.7 100
11 PR003872 HEK293-F (30ml) 1 : 1 : 1 8.92 100
11 PR003873 HEK293-F (30ml) 1 : 1 : 1 10.9 97.4
11 PR003874 HEK293-F (30ml) 1 : 1 : 1 11.31 100
11 PR003875 HEK293-F (30ml) 1 : 1 : 1 26.19 100
11 PR003876 HEK293-F (30ml) 1 : 1 : 1 11.88 100
11 PR003877 HEK293-F (30ml) 1 : 1 : 1 10.87 100
11 PR003878 HEK293-F (30ml) 1 : 1 : 1 12.5 96.2
11 PR003879 HEK293-F (30ml) 1 : 1 : 1 24.05 100
11 PR003880 HEK293-F (30ml) 1 : 1 : 1 4.49 100
11 PR003881 HEK293-F (30ml) 1 : 1 : 1 19.29 100
11 PR003882 HEK293-F (30ml) 1 : 1 : 1 11.61 100
實施例 7.8.2. 建構 scFv-Fc-VH (n) 非對稱結構分子
利用抗CD3的IgG抗體和抗BCMA的重鏈抗體，按照實施例 1.7和實施例 1.8所述結構設計 scFv-Fc-VH (n, n={1,2}) 非對稱結構的BCMA x CD3雙抗分子，總結於表7-17；並按照實施例 2所述方法製備抗體分子樣品並進行分析，總結於表7-18。表 7-17 scFv-Fc-VH(n) 非對稱結構的 BCMA x CD3 雙抗分子
結構編號 雙抗分子 CD3 抗體(scFv) BCMA 抗體(VH) scFv 端結構 VH_B 重複數 n 連接肽 2 (VH_B 和VH_B 之間) Fab 端的Fc 類型( 突變) VH_B 端的Fc 類型( 突變)
20 PR001999 PR000510 PR000940 VL-連接肽-VH 1 無 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
20 PR002000 PR000510 PR000943 VL-連接肽-VH 1 無 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
20 PR002001 PR000510 PR001035 VL-連接肽-VH 1 無 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
20 PR002002 PR000510 PR001046 VL-連接肽-VH 1 無 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
23 PR002867 PR002161 PR001046 VH-連接肽-VL 2 RT-GS_15-KL 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
23 PR002868 PR002163 PR001046 VH-連接肽-VL 2 RT-GS_15-KL 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
23 PR002869 PR002337 PR001046 VH-連接肽-VL 2 RT-GS_15-KL 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
23 PR002870 PR002340 PR001046 VH-連接肽-VL 2 RT-GS_15-KL 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
(突變代號：Knob : S354C, T366W;Hole : Y349C, T366S, L368A, Y407V;AAG :  L234A, L235A, P329G.)表 7-18 scFv-Fc-VH(n) 非對稱結構的 BCMA x CD3 雙抗分子蛋白的表現
結構編號 雙抗分子 表現系統和體積 第一步純化後產量 (mg/L) SEC-HPLC 純度 (%)
20 PR001999 HEK293-F (40ml) 18.4 74.35
20 PR002000 HEK293-F (40ml) 13.6 77.84
20 PR002001 HEK293-F (40ml) 1.0 60.21
20 PR002002 HEK293-F (40ml) 14.0 79.47
23 PR002867 HEK293-F (40ml) 7.4 66.68
23 PR002868 HEK293-F (40ml) 8.8 67.14
23 PR002869 HEK293-F (40ml) 17.4 83.62
23 PR002870 HEK293-F (40ml) 6.5 74.84
實施例 7.8.3. BCMA x CD3 雙抗分子及對照分子序列表
表7-20和表7-19列出了本實施例所建構的BCMA x CD3 雙抗分子和對照分子的序列所對應的序列編號。雙抗分子中，抗CD3的抗原結合結構域Fab的序列來源於表7-11和表7-13所述序列；抗BCMA的抗原結合結構域VH的序列來源於表7-1和表7-8所述序列。表7-20中的結構編號對應於表1-1和圖1。表7-21列出了BCMA x CD3雙特異性或多特異性抗體分子的不同抗原結合結構域相應的CDR序列的序列編號。表 7-19 對照分子的序列編號表
別名 抗體編號 說明 多肽鏈 1 多肽鏈 2 多肽鏈 3
陽性對照1 PR000274 抗BCMA 單抗 CA8-J6M0 309 354 無
陽性對照2 PR002199 BCMA x CD3雙抗， 來源於 WO2019133761A1 420 421 422
陽性對照3 PR003106 BCMA x CD3雙抗， 來源於 WO2017134134A1 453 無 無
SP34 PR000260 抗CD3 單抗 SP34 352 307 無
表 7-20 本實施例的 BCMA x CD3 雙抗分子的序列編號表
結構編號 抗體編號 多肽鏈 1 多肽鏈 2 多肽鏈 3
11 PR001987 357 411 410
11 PR001988 357 411 412
11 PR001989 357 411 413
11 PR001990 357 411 414
11 PR002929 357 444 449
11 PR002935 357 450 449
11 PR003867 357 454 465
11 PR003868 357 454 466
11 PR003869 357 454 467
11 PR003870 357 454 468
11 PR003871 357 454 469
11 PR003872 357 454 470
11 PR003873 357 454 471
11 PR003874 357 454 472
11 PR003875 357 454 473
11 PR003876 357 454 474
11 PR003877 357 454 475
11 PR003878 357 454 476
11 PR003879 357 454 477
11 PR003880 357 454 478
11 PR003881 357 454 479
11 PR003882 357 454 480
12 PR001991 415 416 410
12 PR001992 415 416 412
12 PR001993 415 416 413
12 PR001994 415 416 414
13 PR001995 417 418 410
13 PR001996 417 418 412
13 PR001997 417 418 413
13 PR001998 417 418 414
14 PR002299 357 423 424
14 PR002300 357 423 425
14 PR002301 357 423 426
14 PR002308 357 423 427
14 PR002309 357 423 428
14 PR002310 357 423 429
14 PR002892 357 444 445
14 PR002895 357 444 446
14 PR002898 357 444 447
14 PR002901 357 444 448
14 PR002950 357 450 445
14 PR002953 357 450 446
14 PR002956 357 450 447
14 PR002959 357 450 448
14 PR003177 357 454 445
14 PR003178 357 454 446
14 PR003690 357 463 464
15 PR002313 357 423 430
15 PR002326 357 423 431
15 PR002328 357 423 432
15 PR002332 357 423 433
20 PR001999 419 410 無
20 PR002000 419 412 無
20 PR002001 419 413 無
20 PR002002 419 414 無
23 PR002867 440 428 無
23 PR002868 441 428 無
23 PR002869 442 428 無
23 PR002870 443 428 無
表 7-21 BCMA x CD3 雙特異性或多特異性抗體分子的抗原結合結構域的 CDR 的序列編號表
結構編號 抗體編號 抗原結合域序號 LCDR1 LCDR2 LCDR3 HCDR1 HCDR2 HCDR3
11 PR001987 #1 172 192 216 20 68 128
#2 無 無 無 15 75 133
11 PR001988 #1 172 192 216 20 68 128
#2 無 無 無 24 76 134
11 PR001989 #1 172 192 216 20 68 128
#2 無 無 無 25 77 135
11 PR001990 #1 172 192 216 20 68 128
#2 無 無 無 26 78 136
11 PR002929 #1 172 192 216 30 68 128
#2 無 無 無 26 78 136
11 PR002935 #1 172 192 216 30 68 128
#2 無 無 無 26 78 136
11 PR003867 #1 172 192 216 30 68 128
#2 無 無 無 26 90 136
11 PR003868 #1 172 192 216 30 68 128
#2 無 無 無 36 90 146
11 PR003869 #1 172 192 216 30 68 128
#2 無 無 無 35 76 147
11 PR003870 #1 172 192 216 30 68 128
#2 無 無 無 34 78 148
11 PR003871 #1 172 192 216 30 68 128
#2 無 無 無 35 76 136
11 PR003872 #1 172 192 216 30 68 128
#2 無 無 無 35 90 146
11 PR003873 #1 172 192 216 30 68 128
#2 無 無 無 34 76 136
11 PR003874 #1 172 192 216 30 68 128
#2 無 無 無 35 76 146
11 PR003875 #1 172 192 216 30 68 128
#2 無 無 無 34 76 146
11 PR003876 #1 172 192 216 30 68 128
#2 無 無 無 35 90 148
11 PR003877 #1 172 192 216 30 68 128
#2 無 無 無 35 90 136
11 PR003878 #1 172 192 216 30 68 128
#2 無 無 無 35 90 136
11 PR003879 #1 172 192 216 30 68 128
#2 無 無 無 34 76 146
11 PR003880 #1 172 192 216 30 68 128
#2 無 無 無 34 78 146
11 PR003881 #1 172 192 216 30 68 128
#2 無 無 無 35 78 147
11 PR003882 #1 172 192 216 30 68 128
#2 無 無 無 35 90 147
12 PR001991 #1 172 192 216 20 68 128
#2 無 無 無 15 75 133
12 PR001992 #1 172 192 216 20 68 128
#2 無 無 無 24 76 134
12 PR001993 #1 172 192 216 20 68 128
#2 無 無 無 25 77 135
12 PR001994 #1 172 192 216 20 68 128
#2 無 無 無 26 78 136
13 PR001995 #1 172 192 216 20 68 128
#2 無 無 無 15 75 133
13 PR001996 #1 172 192 216 20 68 128
#2 無 無 無 24 76 134
13 PR001997 #1 172 192 216 20 68 128
#2 無 無 無 25 77 135
13 PR001998 #1 172 192 216 20 68 128
#2 無 無 無 26 78 136
14 PR002299, PR002300, PR002301 #1 172 192 216 30 68 128
#2 無 無 無 15 75 133
14 PR002308, PR002309, PR002310, PR002892, PR002895, PR002898, PR002901 #1 172 192 216 30 68 128
#2 無 無 無 26 78 136
14 PR002950, PR002953, PR002956, PR002959 #1 172 192 216 30 68 128
#2 無 無 無 26 78 136
14 PR003177, PR003178, PR003690 #1 172 192 216 30 68 128
#2 無 無 無 26 78 136
15 PR002313 #1 172 192 216 30 68 128
#2 無 無 無 15 75 133
#3 無 無 無 24 76 134
15 PR002326, PR002328, PR002332 #1 172 192 216 30 68 128
#2 無 無 無 25 77 135
#3 無 無 無 26 78 136
20 PR001999 #1 172 192 216 20 68 128
#2 無 無 無 15 75 133
20 PR002000 #1 172 192 216 20 68 128
#2 無 無 無 24 76 134
20 PR002001 #1 172 192 216 20 68 128
#2 無 無 無 25 77 135
20 PR002002 #1 172 192 216 20 68 128
#2 無 無 無 26 78 136
23 PR002867 #1 177 191 221 15 84 141
#2 無 無 無 26 78 136
23 PR002868 #1 178 197 222 31 85 142
#2 無 無 無 26 78 136
23 PR002869 #1 177 191 223 31 86 141
#2 無 無 無 26 78 136
23 PR002870 #1 179 198 224 31 85 142
#2 無 無 無 26 78 136
實施例 7.9. 雙抗分子結合 BCMA
本實施例是為了研究BCMA x CD3雙特異性抗體結合BCMA的能力。
按照實施例7.3所述方法用流式細胞術FACS測試雙抗分子與高表現人BCMA的HEK293T細胞株 HEK293T/hBCMA (北京康源博創, KC-0233)、高表現食蟹猴BCMA的HEK293T細胞株HEK293T/cynoBCMA (北京康源博創, KC-0979)和高表現人BCMA的細胞株NCI-H929(ATCC, CRL-9068)等細胞的結合能力。
本實施例中，陽性對照1分子為抗BCMA的單抗PR000274。陽性對照2分子為利用專利WO2019133761A1中序列建構的BCMA x CD3雙抗分子PR002199。陽性對照3分子為利用專利WO2017134134A1中序列建構的BCMA x CD3雙抗分子PR003106。實施例 7.9.1. 結合高表現人 BCMA 的細胞 HEK293T/hBCMA
圖50和表7-22中所示，雙抗分子都可以結合人BCMA，而且含有兩個串聯形成的BCMA結合結構域的Fab-Fc-VH (2) 非對稱結構的雙抗分子比僅有一個BCMA結合結構域的Fab-Fc-VH 非對稱結構的雙抗分子，有更強的結合BCMA的能力。表 7-22 結合 HEK293T/hBCMA
抗體 EC50 (nM) MFI 最大值 抗體 EC50 (nM) MFI 最大值 抗體 EC50 (nM) MFI 最大值
PR001990 未定 13368 PR002309 0.3555 14957 PR002309 0.2586 100051
PR002929 9.017 17606 PR002892 0.7675 15526 PR002895 0.1832 93152
PR002935 14.82 23928 PR002895 0.3851 14041 PR002953 0.2261 91617
PR002950 未定 22111 PR003178 0.1878 99267
PR002953 未定 25243 陽性對照2 0.6024 117412
PR002898 0.791 12631
PR002901 0.6536 14732
PR002956 未定 17620
PR002959 未定 23931
陽性對照2 1.13 17043
實驗 1 實驗 2 實驗 3
實施例 7.9.2. 結合高表現人 BCMA 的腫瘤細胞 NCI-H929
圖52和表7-23中所示，雙抗分子都可以結合人BCMA。總體說來，僅有一個BCMA結合結構域的雙抗分子(例如在Fab-Fc-VH結構和scFv-Fc-VH結構)結合BCMA的能力比具有二價BCMA結合結構域的分子(如IgG單抗，或者Fab-Fc-VH (2) 非對稱結構的雙抗分子)的弱。圖52的 (E) 中所示，從PR001046衍生的親和力提高的HCAb變體基礎上建構了一系列Fab-Fc-VH結構的雙抗分子(PR003867, …, PR003882)，這些雙抗分子結合BCMA的能力相對於PR002929(用PR001046 HCAb建構的Fab-Fc-VH結構)有更強的結合BCMA的能力。Fab-Fc-VH(2) 非對稱結構的雙抗分子結合BCMA的能力優於陽性對照1和3。表 7-23 結合 NCI-H929
抗體 EC50 (nM) MFI 最大值 抗體 EC50 (nM) MFI 最大值 抗體 EC50 (nM) MFI 最大值
PR001990 未定 1837 PR001991 未定 1979 PR002929 50.2 6420
PR002929 未定 3194 PR001992 未定 3208 PR003867 4.6 8594
PR002935 未定 3836 PR001993 未定 1290 PR003868 7.3 17363
PR001994 未定 3434 PR003869 1.7 12479
PR001995 未定 2593 PR003870 3.3 10638
PR001996 未定 3325 PR003871 2 10580
PR001997 未定 1456 PR003872 1.1 11274
PR001998 未定 3259 PR003873 1.3 10202
PR001999 未定 3476 PR003874 1.5 10978
PR002000 未定 4643 PR003875 1.2 9845
PR002002 未定 4500 PR003876 2.3 10901
陽性對照1 未定 6160 PR003877 1.7 11127
PR003878 1.5 9241
PR003879 2.1 10842
PR003880 5.6 8662
PR003881 2.6 10278
PR003882 1.8 11109
抗體 EC50 (nM) MFI 最大值 抗體 EC50 (nM) MFI 最大值 抗體 EC50 (nM) MFI 最大值
PR002299 未定 32843 PR002309 1.731 4712 PR003178 1.232 15578
PR002300 未定 44154 PR002892 4.272 4360 PR002895 1.53 15431
PR002301 未定 52958 PR002895 2.006 4201 PR002953 1.339 15078
PR002308 1.816 63931 PR002950 4.114 4188 陽性對照3 未定 25908
PR002309 1.336 68011 PR002953 2.908 4303
PR002310 2.094 61263 PR002898 1.941 3728
PR002313 17.15 78009 PR002901 2.319 4182
PR002326 3.537 59994 PR002956 3.948 3566
PR002328 6.893 58892 PR002959 4.3 4212
PR002332 9.004 84510
陽性對照2 4.294 88218
陽性對照1 28.94 109555
實施例 7.9.3. 結合高表現食蟹猴 BCMA 的細胞 HEK293T/cynoBCMA
圖51和表7-24中所示，雙抗分子都可以結合食蟹猴BCMA，但是陽性對照2雙抗分子不能結合食蟹猴BCMA。並且含有兩個PR001046的VH串聯結構域的Fab-Fc-VH(2) 具有更強的結合食蟹猴BCMA的能力。表 7-24 結合 HEK293T/cynoBCMA
抗體 MFI 最大值 抗體 MFI 最大值 抗體 MFI 最大值
PR001990 9167 PR002309 16248 PR002301 12958
PR002929 13791 PR002892 14983 PR002308 39286
PR002935 21994 PR002895 13799 PR002309 41640
PR002950 26570 PR002310 42045
PR002953 35655
PR002898 8188
PR002901 11033
PR002956 16151
PR002959 30644
陽性對照2 926
抗體 MFI 最大值 抗體 MFI 最大值
PR002313 7608 PR002309 128176
PR002326 6444 PR002895 103462
PR002328 7807 PR002953 109345
PR003178 115022
陽性對照2 4698
實施例 7.10. 雙抗分子結合 T 細胞
本實施例是為了研究BCMA × CD3雙特異性抗體結合T細胞的能力。
利用流式細胞術FACS測試抗體分子與人或食蟹猴T細胞的結合能力。具體地，利用T細胞分離試劑盒 (Meltenyi, #130-096-535) 從人或食蟹猴的PBMC細胞中分離得到T細胞。將T細胞密度分別調整為1 x106 細胞/mL。以100 µL細胞/孔接種於96孔盤 (Corning, #3894)，隨後以100 µL/孔加入2倍於終濃度的3倍濃度梯度稀釋的待測抗體。將細胞放置於4℃，避光培育1小時。之後，以100 µL /孔加入預冷PBS洗滌細胞兩次，於4℃下500 g離心5分鐘，棄上清。再加入100 µL /孔螢光二抗 (Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific, Jackson, #109-545-06, 1 : 500稀釋)，於4℃下避光培育30分鐘。用100 µL /孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於4℃下500 g離心5分鐘，棄上清。最後，200 µL /孔預冷PBS重新懸浮細胞，使用BD FACS CANTOII流式細胞儀或ACEA NovoCyte流式細胞儀讀取螢光發光信號值，並用軟體FlowJo v10 (FlowJo, LLC) 處理和分析資料。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到抗體對標的細胞的 結合曲線及EC50 值等參數。
本實施例中，陽性對照為抗CD3的單抗SP34 (抗體編號PR000260)；陽性對照2雙抗分子(抗體編號PR002199)為另一個對照分子。實施例 7.10.1. 結合人的 T 細胞
圖53和表7-25中所示，雙抗分子都能結合人的T細胞。陽性對照分子SP34是二價的IgG結構，其結合T細胞的能力非常強。陽性對照2雙抗分子結合T細胞很弱。雙抗分子的CD3端結構是單價的Fab，其Fab序列是來源於抗CD3的單抗SP34的變體序列，透過序列設計和突變，這些變體序列結合T細胞的能力有不同程度的降低，這是為了降低CD3端的T細胞活化能力並減少細胞激素的過度釋放帶來的副作用。不同的雙抗分子的CD3端有不同的結構或者變體序列，其結合T細胞的能力也不相同。在臨床上對於平衡活性和安全性的不同的需求，使得對T細胞的結合能力的要求也不同。表 7-25 結合人的 T 細胞
抗體 MFI 最大值 抗體 MFI 最大值 抗體 MFI 最大值
PR001987 5159 PR001995 2917 PR001990 350167
PR001988 5796 PR001996 3439 PR002929 283045
PR001989 6680 PR001997 4458 PR002309 316716
PR001990 5453 PR001998 3318 PR002895 321582
PR001991 3244 PR001999 1166 PR003178 23926
PR001992 2240 PR002000 1731 PR002953 16961
PR001993 4785 PR002002 1118 陽性對照2 6847
PR001994 3381 SP34 6026 hIgG1 iso 2995
SP34 7162 hIgG1 iso 12    
實驗 1 實驗 2 實驗 3
實施例 7.10.2. 結合食蟹猴的 T 細胞
圖54和表7-26中所示，由於本實施例的雙抗分子的CD3端Fab序列是來源於抗CD3的單抗SP34的變體序列，因而可以結合食蟹猴的T細胞，而陽性對照2雙抗分子不能結合食蟹猴的T細胞。表 7-26 結合食蟹猴的 T 細胞
抗體 MFI 最大值
PR001990 15557
PR002929 10128
PR002309 11664
PR003178 10725
PR002895 18601
PR002953 9708
PR003177 12107
PR002950 8827
陽性對照2 1109
hIgG1 iso 794
實施例 7.11. BLI 方法測定雙抗分子結合 BCMA 的親和力
本實施例按照實施例 7.5所述方法使用Octet Red96e分子相互作用分析儀 (ForteBio, Octet Red96e) 來分析BCMA x CD3雙抗分子與BCMA抗原蛋白之間的結合動力學。
本實施例的雙抗分子都可以結合人和食蟹猴的BCMA(表7-27和表7-28)，但是陽性對照2雙抗分子不能結合食蟹猴的BCMA。而且本實施例的雙抗分子的結合人BCMA (ACRO Biosystems, #BC7-H82F0)和食蟹猴BCMA (ACRO Biosystems, #BCA-C82F4) 的親和力(KD)的比值(表7-29)在5倍以內(0.5 ~ 5)，說明有很好的相關性。表 7-27 BCMA x CD3 雙抗分子結合人 BCMA 蛋白的親和力
抗體 抗原 KD (M) kon(1/Ms) kdis(1/s) Full R^2
陽性對照1 huBCMA.Fc 6.55E-10 2.06E+05 1.35E-04 0.9994
PR001046 huBCMA.Fc 7.75E-11 4.59E+05 3.56E-05 0.9952
PR001990 huBCMA.Fc 1.95E-09 3.22E+05 6.29E-04 0.995
陽性對照2 huBCMA.Fc 4.52E-11 5.45E+05 2.46E-05 0.9969
PR002309 huBCMA.Fc 4.48E-11 4.22E+05 1.89E-05 0.9974
PR002895 huBCMA.Fc 1.97E-10 4.12E+05 8.11E-05 0.9974
PR002929 huBCMA.Fc 5.95E-09 2.49E+05 1.48E-03 0.9933
PR002953 huBCMA.Fc 2.25E-10 4.74E+05 1.07E-04 0.998
PR003178 huBCMA.Fc 2.36E-10 4.94E+05 1.17E-04 0.9978
表 7-28 BCMA x CD3 雙抗分子結合食蟹猴 BCMA 蛋白的親和力
抗體 抗原 KD (M) kon(1/Ms) kdis(1/s) Full R^2
陽性對照1 cyBCMA.Fc 3.88E-11 2.00E+05 7.76E-06 0.9456
PR001046 cyBCMA.Fc 1.19E-10 6.33E+05 7.54E-05 0.9965
PR001990 cyBCMA.Fc 3.35E-09 7.46E+05 2.50E-03 0.9689
陽性對照2 cyBCMA.Fc \
PR002309 cyBCMA.Fc 1.41E-10 8.23E+05 1.16E-04 0.9973
PR002895 cyBCMA.Fc 2.72E-10 8.90E+05 2.42E-04 0.9983
PR002929 cyBCMA.Fc 6.62E-09 8.79E+05 5.82E-03 0.9437
PR002953 cyBCMA.Fc 1.95E-10 3.65E+05 7.12E-05 0.9989
PR003178 cyBCMA.Fc 3.19E-10 8.22E+05 2.62E-04 0.9981
表 7-29 結合 BCMA 親和力的比值
抗體 KD 比值 (cyBCMA / huBCMA)
陽性對照1 0.06
PR001046 1.54
PR001990 1.72
陽性對照2 N/A
PR002309 3.16
PR002895 1.38
PR002929 1.11
PR002953 0.87
PR003178 1.35
實施例 7.12. 雙抗分子對標的細胞毒殺實驗
本實施例研究了BCMA x CD3雙抗分子媒介的T細胞活化和特異性的標的細胞毒殺能力。實施例 7.12.1. 對高表現 BCMA 的細胞 NCI-H929 的體外毒殺實驗以及細胞激素的釋放
本實施例研究了在高表現BCMA的腫瘤細胞NCI-H929 (ATCC, CRL-9068) 存在時，雙抗分子活化T細胞，釋放細胞激素並毒殺腫瘤細胞的能力。效應細胞可以是人周邊血單個核細胞PBMC或者是從PBMC分離得到的T細胞。
具體地，用培養基(還有5% FBS 的RPMI1640培養基)將效應細胞(PBMC或者T細胞)的密度調整為1.1 x106 細胞/mL，NCI-H929的密度調整為0.11 x106 細胞/mL，將兩種細胞懸浮液各以90 µL細胞/孔接種於96孔盤 (Corning, #3799)。隨後以20 µL /孔加入不同濃度的待測抗體(10倍於終濃度的梯度稀釋)，抗體濃度可以是終濃度為30 nM，或者從最高終濃度為1 nM按照20倍濃度梯度稀釋的共3個濃度，或者從最高終濃度為30 nM按照4倍濃度梯度稀釋的共10個濃度；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001)作為同型對照。最終效應細胞-標的細胞比為10：1，設置兩個重複孔加入樣品。加入了待測抗體的孔稱為ER(實驗孔，含有待測抗體樣品和效應細胞及標的細胞)；同時，在盤內按照下面公式中的參數組成設置不同的對照組：ESR(效應細胞自然釋放孔，僅效應細胞和培養基)；TSR(標的細胞自然釋放孔，僅標的細胞和培養基)；CMB(培養基參照孔，僅培養基)；TMR(標的細胞最大釋放空，僅標的細胞和培養基)；VCC(體積參照孔，僅培養基)。將96孔盤置於37℃二氧化碳培養箱培育24小時。隨後向TMR孔和VCC孔加入10 µL裂解液，繼續培育30分鐘。培育完成後，取50 µL/孔的上清液，加入96孔盤 (Corning, #:3599)，並以50 µL/孔加入細胞毒性檢測試劑(CytoTox 96®非放射性細胞毒性檢測試劑盒，Promega, #G1780)。室溫培育30分鐘後，加入50 µL 反應終止液來終止反應。最後用Enspire™ 多功能孔盤讀取機 (Perkin Elmer, Inc.) 於490 nM讀取光吸收值，並根據下面計算公式計算標的細胞毒殺率。 毒殺率 = ((ER – CMB) - (ESR – CMB) - (TSR – CMB)) /  (TMR - VCC) × 100% 其中： ER    = 實驗孔，樣品+效應細胞+標的細胞 ESR   = 效應細胞自然釋放孔，效應細胞+培養基 TSR   = 標的細胞自然釋放孔，標的細胞+培養基 TMR  = 標的細胞最大釋放空，標的細胞+培養基+裂解液 VCC  = 體積參照孔，培養基+裂解液 CMB  = 培養基參照孔，培養基
在檢測細胞毒性的同時，還可以檢測細胞上清中的細胞激素釋放位準。簡言之，取出50 µL上清液用於檢測細胞激素的位準。用TNF-α ELISA 試劑盒 (Thermo, #88-7346-88) 檢測上清中TNF-α濃度；用IL-6 ELISA 試劑盒 (Thermo, #88-7066-88) 檢測上清中IL-6濃度；用IL-2 ELISA試劑盒 (Thermo, #88-7025-88) 檢測上清中IL-2濃度；用IFN-γ ELISA試劑盒 (Thermo, #88-7316-88) 檢測上清中IFN-γ濃度；用IL-10 ELISA試劑盒 (Thermo, #88-7106-88) 檢測上清中IL-10濃度。ELISA檢測方法參照相關試劑盒操作說明。使用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析。
圖56中所示，scFv-Fc-VH(1) 非對稱結構的雙抗分子(PR002000, PR002002)可以對標的細胞產生有效的毒殺。基於抗BCMA的HCAb單抗PR000940建構的雙抗分子PR001999對標的細胞沒有毒殺功能。這些分子結構相似，都含有相同CD3的結合結構域(scFv)的序列，差異在於BCMA的結合結構域(VH)的序列不同，不同的VH與BCMA抗原結合的親和力或表位的差異導致了雙抗分子對標的細胞的毒殺活性的差異。抗BCMA的IgG單抗陽性對照1分子也沒有毒殺功能。
圖55中所示，scFv-Fc-VH(2) 非對稱結構的雙抗分子(PR002867, PR002868, PR002869, PR002870)可以對標的細胞產生不同程度的毒殺。這些分子結構相似，都含有兩個相同的串聯的BCMA的結合結構域(VH)，其僅有的差異在於CD3的結合結構域scFv的序列來源於不同的抗CD3單抗。PR002867和PR002870的標的細胞毒殺能力與陽性對照2雙抗分子相似，而PR002868和PR002869的標的細胞毒殺能力較弱。
圖57的 (A)-(B) 中所示，12個Fab-Fc-VH(1) 非對稱結構的雙抗分子(PR001987,…, PR001998)有相似的分子結構，但是BCMA的結合結構域和CD3的結合結構域的序列不同；對標的細胞的毒殺能力也是不同的。其中，PR001988、PR001990、PR001994、PR001996和PR001998有較強的標的細胞毒殺能力。圖57的(C)中所示，PR001990比PR001988有更強的標的細胞毒殺能力。圖57的(D)-(F)中所示，從PR001046衍生的親和力提高的HCAb變體基礎上建構的Fab-Fc-VH結構的雙抗分子，對標的細胞有毒殺能力。
圖58中所示，Fab-Fc-VH(2) 非對稱結構的雙抗分子可以對標的細胞產生有效的毒殺。這些分子都含有兩個串聯的BCMA的結合結構域(VH)。其標的細胞毒殺能力明顯優於Fab-Fc-VH(1)結構的分子PR001990，也優於陽性對照2雙抗分子。圖58的(A)-(B)中所示，雙抗分子PR002301、PR002308、PR002309、PR002310、PR002313、PR002326和PR002328具有相同的CD3的結合結構域的序列；其中，PR002301、PR002308、PR002309和PR002310的BCMA結合結構域是由兩個相同的VH序列串聯而成；PR002313、PR002326和PR002328的BCMA結合結構域是由兩個不同的VH序列串聯而成；特別是，PR002326和PR002328的BCMA結合結構域所使用的兩個不同的VH可以結合BCMA的不同表位。圖58的(C)中所示，雙抗分子PR002892、PR002895、PR002950、PR002953、PR003177和PR003178的BCMA結合結構域是由兩個相同的來源於PR001046的VH序列透過不同長度的連接肽序列串聯而成；但是它們具有不同的CD3的結合結構域的序列，有不同的結合T細胞的能力，因而也體現出不同的標的細胞毒殺效率(EC50)。圖58的(D) 中所示，雙抗分子PR003690是在PR003178的基礎上，在Fc區引入了額外的胺基酸突變以進一步提高血清半衰期，其標的結合結構域沒有變化，因而PR003690的標的細胞毒殺能力與PR003178的一致。
圖59和圖60中所示，更系統性地研究了雙抗分子PR001990(Fab-Fc-VH(1)結構，強CD3結合)、PR002309 (Fab-Fc-VH(2)結構，強CD3結合)、PR002895(Fab-Fc-VH(2)結構，強CD3結合)、PR002953 (Fab-Fc-VH(2)結構，弱CD3結合)和PR003178(Fab-Fc-VH(2)結構，中等CD3結合)以及陽性對照 2和陽性對照 3等對標的細胞的毒殺能力和多種細胞激素釋放位準(表7-30和表7-31)。這些雙抗分子都能達到相似的最大毒殺率，但是毒殺效率EC50不同，誘導的細胞激素釋放位準也不同。PR002309、PR002895、PR002953和PR003178的標的細胞毒殺EC50優於陽性對照 2；而且，PR002895、PR002953和PR003178引起的多種細胞激素釋放位準低於陽性對照3。特別是，相較於陽性對照2，PR003178的標的細胞毒殺能力優於陽性對照 2(EC50強10倍)；相較於陽性對照 3，PR003178有與陽性對照 3相當的毒殺能力，但是有更低的細胞激素釋放最大值。這說明，PR003178在保持有效的腫瘤毒殺效率的同時，能夠控制細胞激素的釋放位準，以減少細胞激素釋放綜合症的風險，可能可以在臨床上更好地平衡有效性和安全性以及帶來更好的藥物治療窗。表 7-30 BCMA x CD3 雙抗分子媒介效應細胞對 NCI-H929 細胞的體外毒殺和細胞激素釋放
抗體 PR001990 PR002309 陽性對照 2
NCI-H929 毒殺 最大毒殺率 % 61.38 69.52 61.2
EC50 (nM) 0.5901 0.007717 0.1603
IFN-γ 最大值 (pg/ml) 1232 1950 1017
EC50 (nM) 1.358 0.01945 0.483
TNF-α 最大值 (pg/ml) 1198 1298 608.1
EC50 (nM) 5.486 0.0445 0.4638
IL-2 最大值 (pg/ml) 185.4 222 21.51
EC50 (nM) 5.292 0.03746 2.272
IL-6 最大值 (pg/ml) 272.9 208.9 245.1
EC50 (nM) 8.204 0.1945 13.13
IL-10 最大值 (pg/ml) 776.8 1054 582.8
EC50 (nM) 1.956 0.02982 0.8611
表 7-31 BCMA x CD3 雙抗分子媒介效應細胞對 NCI-H929 細胞的體外毒殺和細胞激素釋放
抗體 PR002895 PR002953 PR003178 陽性對照 2 陽性對照 3
NCI-H929 毒殺 最大毒殺率 % 57.93 57.51 56.78 62.03 61.5
EC50 (nM) 0.002932 0.04699 0.01018 0.1154 0.01919
IFN-γ 最大值 (pg/ml) 1441 639.8 1207 658.4 2247
EC50 (nM) 0.02232 0.2124 0.0595 0.2607 0.09596
TNF-α 最大值 (pg/ml) 1282 894.2 1330 1021 2506
EC50 (nM) 0.008184 0.1965 0.02814 0.2243 0.08062
IL-2 最大值 (pg/ml) 100.1 23.57 101.1 25.79 300.2
EC50 (nM) 0.02112 0.7954 0.1748 0.3118 0.3374
IL-6 最大值 (pg/ml) 118.1 68.45 89.66 71.43 128.4
EC50 (nM) 0.008391 0.1278 0.04478 0.3411 0.1101
IL-10 最大值 (pg/ml) 239.6 129.2 321.5 190.5 516.9
EC50 (nM) 0.01341 0.2081 0.1044 0.335 0.1007
實施例 7.12.2. 可溶性 APRIL 和可溶性 BAFF 對於雙抗分子的標的細胞毒殺效果的影響
本實施例在實施例 7.12.1所述方法的基礎上進一步研究BCMA配體(APRIL和BAFF)對雙抗分子的標的細胞毒殺效果的影響，在多發性骨髓瘤患者的血漿中APRIL和BAFF的濃度約100 ng/ml (Blood 2004; 103: 3148–3157)。具體地，在如實施例 7.12.1所述方法中，在加入不同濃度的待測抗體時，也以20 µL /孔加入BCMA配體蛋白，使可溶性的配體蛋白的終濃度為100 ng/ml和10 ng/ml。可溶性APRIL蛋白(sAPRIL)是重組人源APRIL蛋白 (Novoprotein, #CU89)；可溶性BAFF蛋白(sBAFF)是重組人源BAFF蛋白 (ACRO Biosystems, #BAF-H5248)。效應細胞是人PBMC或者T細胞，標的細胞是NCI-H929。用實施例 7.12.1所述方法計算標的細胞毒殺率。
圖61和表7-32中所示，可溶性APRIL和BAFF對於雙抗分子的標的細胞毒殺能力幾乎沒有影響。表 7-32 不同濃度可溶性 APRIL 或 BAFF 存在時， BCMA x CD3 雙抗分子對 NCI-H929 的毒殺
T 細胞 + NCI-H929 PR001990 PR001990 + 10 ng/mL sBAFF PR001990 + 100 ng/mL sBAFF PR001990 + 10 ng/mL sAPRIL PR001990 + 100 ng/mL sAPRIL
最大毒殺率 % 83.57 81.46 84.47 87.3 86.13
EC50 (nM) 0.07327 0.07866 0.09395 0.08791 0.1545
T 細胞 + NCI-H929 PR002309 PR002309 + 10 ng/mL sBAFF PR002309 + 100 ng/mL sBAFF PR002309 + 10 ng/mL sAPRIL PR002309 + 100 ng/mL sAPRIL
最大毒殺率 % 78.49 79.37 79.63 76.24 78.13
EC50 (nM) 0.0004388 0.0004473 0.0004741 0.0005381 0.0009908
PBMC + NCI-H929 PR003178 PR003178 + 10 ng/mL sBAFF PR003178 + 100 ng/mL sBAFF PR003178 + 10 ng/mL sAPRIL PR003178 + 100 ng/mL sAPRIL
最大毒殺率 % 53.3 58 63.5 61.6 57.6
EC50 (nM) 0.007 0.005 0.008 0.009 0.011
PBMC + NCI-H929 陽性對照 2 陽性對照 2 + 10 ng/mL sBAFF 陽性對照 2 + 100 ng/mL sBAFF 陽性對照 2 + 10 ng/mL sAPRIL 陽性對照 2 + 100 ng/mL sAPRIL
最大毒殺率 % 60.5 58.3 67.7 61 67.2
EC50 (nM) 0.103 0.063 0.076 0.096 0.253
PBMC + NCI-H929 陽性對照 3 陽性對照 3 + 10 ng/mL sBAFF 陽性對照 3 + 100 ng/mL sBAFF 陽性對照 3 + 10 ng/mL sAPRIL 陽性對照 3 + 100 ng/mL sAPRIL
最大毒殺率 % 58.2 61.4 61.7 55.9 62.3
EC50 (nM) 0.014 0.015 0.022 0.027 0.026
實施例 7.12.3. 可溶性 BCMA 對於雙抗分子的標的細胞毒殺效果的影響
BCMA是跨膜蛋白，但是其胞外區有可以從細胞膜上脫落下來形成可溶性BCMA(sBCMA)，在多發性骨髓瘤患者的血漿中都觀察到sBCMA的位準有不同程度的升高，中位值濃度為176.0 ng/ml (Leuk Res. 2019 Jun; 81: 62-66)。
本實施例在實施例 7.12.1所述方法的基礎上做了最適化，研究可溶性BCMA(sBCMA)對雙抗分子的標的細胞毒殺效果的影響。具體地，在如實施例 7.12.1所述方法中，在加入不同濃度的待測抗體時，也以20 µL /孔加入重組人源BCMA蛋白 (ACRO Biosystems, #BCA-H522y)，使其終濃度為500 ng/ml、250 ng/ml、125 ng/ml、和62.5 ng/ml。效應細胞是人PBMC，標的細胞是NCI-H929。用實施例 7.12.1所述方法計算標的細胞毒殺率。
圖62和表7-33中所示，可溶性BCMA對雙抗分子的標的細胞毒殺率EC50有影響，且呈劑量依賴關係，但是不影響最大毒殺率。當可溶性BCMA的濃度為176.0 ng/ml時，雙抗分子PR002309和PR003178的標的細胞毒殺率EC50優於陽性對照2和陽性對照3；也就是說可溶性BCMA對雙抗分子PR002309和PR003178的標的細胞毒殺率的影響小於對陽性對照2和陽性對照3的影響。表 7-33 不同濃度可溶性 BCMA 存在時， BCMA x CD3 雙抗分子對 NCI-H929 的毒殺
T 細胞 + NCI-H929 PR001990 PR001990 + 62.5 ng/mL sBCMA PR001990 + 125 ng/mL sBCMA PR001990 + 250 ng/mL sBCMA PR001990 + 500 ng/mL sBCMA
最大毒殺率 % 83.77 82.11 83.23 82.17 82.71
EC50 (nM) 0.07867 0.1763 0.2341 0.387 0.5458
T 細胞 + NCI-H929 PR002309 PR002309  + 62.5 ng/mL sBCMA PR002309  + 125 ng/mL sBCMA PR002309 + 250 ng/mL sBCMA PR002309 + 500 ng/mL sBCMA
最大毒殺率 % 78.68 78.68 77.21 78.39 78.47
EC50 (nM) 0.000393 0.002961 0.00347 0.005002 0.008797
PBMC + NCI-H929 PR003178 PR003178 + 62.5 ng/mL sBCMA PR003178 + 125 ng/mL sBCMA PR003178 + 250 ng/mL sBCMA PR003178 + 500 ng/mL sBCMA
最大毒殺率 % 56.1 51.7 52.2 50.9 45.2
EC50 (nM) 0.005 0.009 0.014 0.065 0.12
PBMC + NCI-H929 陽性對照 2 陽性對照 2 + 62.5 ng/mL sBCMA 陽性對照 2 + 125 ng/mL sBCMA 陽性對照 2 + 250 ng/mL sBCMA 陽性對照 2 + 500 ng/mL sBCMA
最大毒殺率 % 43.3 48.9 39.6 40.9 41.8
EC50 (nM) 0.2 0.8 1 3.5 7.7
PBMC + NCI-H929 陽性對照 3 陽性對照 3 + 62.5 ng/mL sBCMA 陽性對照 3 + 125 ng/mL sBCMA 陽性對照 3 + 250 ng/mL sBCMA 陽性對照 3 + 500 ng/mL sBCMA
最大毒殺率 % 57.3 58.6 55.5 56.8 68.3
EC50 (nM) 0.01 0.033 0.074 0.107 0.829
實施例 7.13. 藥代動力學研究
本實施例研究了具有Fab-Fc-VH非對稱結構的BCMA x CD3雙抗分子(PR002929)和具有Fab-Fc-VH(2)非對稱結構的BCMA x CD3雙抗分子(PR003178)在小鼠或者大鼠體內的單劑量的藥代動力學性能。
實施方法如下：選取體重合適的雌性BALB/c小鼠6隻或者SD大鼠3隻，按5mg/kg 的劑量透過靜脈注射給與融合蛋白藥物；於給藥前以及給藥後0.25小時、5小時、24小時(1天)、第2天、第4天、第7天、第10天和第14天採集全血，將全血靜置30分鐘使其凝固，隨後在4℃下以2,000 rpm離心5分鐘並將分離的血清樣品在-80℃下凍存直至分析。本實施例採用兩種方法來定量測定血清中的藥物濃度。方法一，Fc端檢測ELISA方法來定量測定血清中的抗體藥物濃度：即透過塗覆於96孔盤的山羊抗人Fc多株抗體來捕捉血清中的含有人Fc的BCMA x CD3雙抗分子，然後加入HRP標記的山羊抗人Fc第二抗體來檢測。方法二，BCMA端檢測ELISA方法來定量測定血清中的抗體藥物濃度：即透過塗覆於96孔盤的BCMA重組蛋白 (Human BCMA / TNFRSF17 Protein His Tag, ACRO Biosystems, #BCA-H522y) 來捕捉血清中的含有抗BCMA的VH端的完整BCMA x CD3雙抗分子，然後加入HRP標記的山羊抗人Fc第二抗體來檢測。使用Phoenix WinNonlin軟體8.2版，選用非房室模型(NCA)分析藥代動力學參數。
圖63的(A)-(B)中所示，雙抗分子 PR002929和PR003178有相似的藥代動力學：在Fc端檢測方法下，PR002929和PR003178在BALB/c小鼠體內的血清半衰期t1/2 值分別約為7天和9.6天；在BCMA端檢測方法下，PR002929和PR003178在小鼠體內的血清半衰期t1/2 值分別約為4天和4天。
圖63的(C)中所示，分別用Fc端檢測方法和BCMA端檢測方法，PR003178在大鼠體內的血清半衰期t1/2 值分別約為5.6天和4.6天。
表7-34總結了BCMA x CD3 雙抗分子在小鼠或者大鼠體內的藥代動力學性能參數。表 7-34 BCMA x CD3 雙抗分子在小鼠或者大鼠體內的藥代動力學參數
雙抗分子 PR003178 PR002929 PR003178
動物 (數量) BALB/c 小鼠 (n=6) BALB/c 小鼠 (n=6) SD大鼠 (n=3)
抗體劑量 5 mg/kg, I.V. 5 mg/kg, I.V. 5 mg/kg, I.V.
PK 參數 Fc端檢測 BCMA端檢測 Fc端檢測 BCMA端檢測 Fc端檢測 BCMA端檢測
T1/2 (hr) 230.5 98.0 167.5 100.8 135.1 109.8
Vd (mL/kg) 218.4 189.4 126.7 171.2 137.2 181.2
AUCall (µg*hour/mL) 4,650 3,381 6,886 3,878 5,593 3,799
Cl (mL/hr/kg) 0.72 1.34 0.56 1.18 0.76 1.21
C0 (µg/mL) 93.4 87.4 106.4 100.1 83.3 76.3
實施例 7.14. 在 NCI-H929/ 人 PBMC 小鼠模型中的抗腫瘤藥效評估
為了評估BCMA x CD3雙特異性抗體的體內抗腫瘤藥效。採用6-8周雌性NCG小鼠，瘤細胞接種前3天，所有小鼠腹腔注射 (i.p.)3 ×106 人PBMC，然後於腫瘤細胞接種當天每隻實驗小鼠皮下接種5 x106 NCI-H929細胞，細胞重新懸浮在PBS與Matrigel (1:1)混合液中 (0.1 mL/隻)。當腫瘤體積達到90 mm3 時對小鼠進行隨機分組，每組6隻小鼠。分組後將特定濃度經PBS稀釋的抗體藥物按照特定的劑量和頻率以靜脈注射(i.v.)方式給藥。本實施例採用了多種給藥方案：1)  10 µg/鼠的劑量組，單次給藥；2)   10 µg/鼠和3 µg/鼠的劑量組，每週給藥1次總共給藥2次 (QW*2)。每次試驗以PBS為空白對照組。在初次給藥後第3天，7天，10天和14天對腫瘤體積和小鼠體重進行測量。腫瘤大小計算公式：腫瘤體積(mm3 ) = 0.5 × (腫瘤長徑 × 腫瘤短徑2 )。
圖64的(A)-(B) 中所示，PR001990，PR002309，PR002313和陽性對照2等雙抗分子的10 µg/鼠單次給藥劑量組都顯示出抑制腫瘤生長的藥效，而且PR001990和PR002309的藥效顯著優於同等劑量的陽性對照2分子。各組小鼠體重變化均在正常範圍內。
圖64的(C)-(D) 中所示，所有雙抗分子的不同劑量組都顯示出不同程度的抑制腫瘤生長的藥效。總體說來，10 µg/鼠組的藥效優於3 µg/鼠組的藥效；而且，在10 µg/鼠QW*2的給藥劑量下，PR003177和PR003178的藥效優於同等劑量的陽性對照2分子；PR002895的3 µg/鼠劑量組的藥效甚至略優於陽性對照2分子的10 µg/鼠劑量組。各組小鼠體重變化均在正常範圍內。實施例 7.15. 小結
本實施例利用抗CD3的IgG抗體的抗原結合結構域Fab(或scFv形式)和抗BCMA的HCAb抗體的抗原結合結構域VH，建構了多種非對稱結構的抗BCMA x CD3的雙特異性抗體分子。展現出了基於HCAb建構雙特異性抗體分子結構的靈活性。本實施例的雙抗分子可以同時結合人的BCMA和人的T細胞，而且可以結合食蟹猴的BCMA和食蟹猴的T細胞，因而可以利用食蟹猴做非靈長類毒理評估，而這一點對臨床開發非常重要。而陽性對照2雙抗分子卻沒有這種結合食蟹猴標的的性能。
本實施例建構了一系列BCMA x CD3雙抗分子，透過調節CD3結合結構域的序列及細微結構來改變其結合T細胞的能力，透過調節BCMA結合結構域的序列和結構域數目來改變其結合表現BCMA的標的細胞的能力，進而調節雙抗分子的T細胞活化和特異性的標的細胞毒殺能力。在體外標的細胞毒殺實驗中，具有Fab-Fc-VH(2)非對稱結構的雙抗分子PR002309、PR002895、PR002953和PR003178的標的細胞毒殺EC50優於陽性對照 2；而且，PR002895、PR002953和PR003178引起的多種細胞激素釋放位準低於陽性對照3。在小鼠體內抗腫瘤藥效模型中，PR002309和PR003178的藥效顯著優於同等劑量的陽性對照2分子；PR002895的低劑量組的藥效甚至略優於陽性對照2分子的高劑量組。
特別是，PR003178的標的細胞毒殺能力明顯優於陽性對照2且與陽性對照3相當；但是PR003178比陽性對照3有更低的細胞激素釋放位準。這說明，PR003178在保持有效的腫瘤毒殺效率的同時，能夠控制細胞激素的釋放位準，以減少細胞激素釋放綜合症的風險，可能可以在臨床上更好地平衡有效性和安全性以及帶來更好的藥物治療窗。
圖1. 分子結構示意圖。
圖2. PD-L1 x CTLA4 雙抗分子結合 hCTLA4-His蛋白的結合活性。
圖3. PD-L1 x CTLA4 雙抗分子結合 CHO-K1/hCTLA4細胞的結合活性。
圖4. PD-L1 x CTLA4 雙抗分子結合 HEK293/hCTLA4細胞的結合活性。
圖5. PD-L1 x CTLA4 雙抗分子阻斷人 CTLA4 蛋白和其配體蛋白 B7-1 的結合的活性。
圖6. PD-L1 x CTLA4雙抗分子阻斷CHO-K1/hCTLA4細胞和其配體蛋白 B7-1 的結合的活性。
圖7. PD-L1 x CTLA4 雙抗分子結合 hPDL1-His蛋白的結合活性。
圖8. PD-L1 x CTLA4 雙抗分子結合 CHO-K1/hPDL1細胞的結合活性。
圖9. PD-L1 x CTLA4 雙抗分子結合高表現人PD-L1的MDA-MB-231細胞的結合活性。
圖10. PD-L1 x CTLA4 雙抗分子阻斷CHO-K1/hPDL1細胞和其配體蛋白 PD-1 的結合的活性。
圖11. PD-L1 x CTLA4 雙抗分子透過ADCC效應毒殺CTLA4+ 標的細胞的能力。
圖12. IgG-VH結構的PD-L1 x CTLA4雙抗在SEB刺激實驗中活化T細胞的能力。
圖13. Fab-HCAb結構的PD-L1 x CTLA4雙抗在SEB刺激實驗中活化T細胞的能力。
圖14. 在SEB刺激實驗中，當VH在IgG HC或LC的N端時，PD-L1 x CTLA4雙抗比對應單抗的1:1劑量組合有相當甚至更強的T細胞活化能力。
圖15. 在SEB刺激實驗中，CTLA4端的活性在IgG_HC-VH (VH在IgG HC的C端) 和Fab-HCAb結構中相較於其在IgG或HCAb雙價結構中會減弱，從而可以降低其劑量相關的毒性。
圖16. 在混合淋巴細胞反應實驗中，當VH在IgG HC或LC的N端時，PD-L1 x CTLA4雙抗比對應單抗的1:1劑量組合有更強的T細胞活化能力。
圖17. 在混合淋巴細胞反應實驗中，當VH在IgG HC或LC的C端時，PD-L1 x CTLA4雙抗比PD-L1單抗有更強的T細胞活化能力。
圖18. HER2 x CTLA4 雙抗分子結合 CHO-K1/hCTLA4細胞的結合活性。
圖19. HER2 x CTLA4 雙抗分子阻斷人 CTLA4 蛋白和其配體蛋白 B7-1 的結合的活性。
圖20. HER2 x CTLA4 雙抗分子阻斷CHO-K1/hCTLA4細胞和其配體蛋白 B7-1 的結合的活性。
圖21. HER2 x CTLA4 雙抗分子結合 SK-BR-3細胞的結合活性。
圖22. HER2 x CTLA4 雙抗分子透過ADCC效應毒殺HER2+ 標的細胞的能力。
圖23. HER2 x CTLA4 雙抗分子抑制 HER2+ 標的細胞 SK-BR-3 增殖的能力。
圖24. HER2 x CTLA4 雙抗分子同時結合CTLA4+ 細胞和HER2+ 細胞的能力。
圖25. HER2 x CTLA4 雙抗分子在SEB刺激實驗中活化T細胞的能力。
圖26. HER2 x CTLA4雙抗分子在小鼠體內的藥代動力學。
圖27. PD-L1 x 4-1BB 雙抗分子結合 CHO-K1/hPDL1細胞的結合活性。
圖28. 4-1BB抗體或PD-L1 x 4-1BB 雙抗分子結合 CHO-K1/hu 4-1BB細胞的結合活性。
圖29. PD-L1 x 4-1BB 雙抗分子結合 CHO-K1/cyno 4-1BB細胞的結合活性。
圖30. PD-L1 x 4-1BB 雙抗分子透過CHO-K1/hPDL1細胞媒介 T 細胞特異性活化。
圖31. PD-L1 x 4-1BB 雙抗分子透過MDA-MB-231 細胞媒介 T 細胞特異性活化。
圖32. 在混合淋巴細胞反應實驗中，IgG-VH結構的 PD-L1 x 4-1BB 雙抗分子比FIT-Ig結構的雙抗分子有更強的T細胞活化能力。
圖33. 在混合淋巴細胞反應實驗中，IgG-VH結構和Fab-HCAb結構的 PD-L1 x 4-1BB 雙抗分子比FIT-Ig結構的雙抗分子有更強的T細胞活化能力。
圖34. PD-L1 x 4-1BB 雙抗分子在小鼠體內的藥代動力學。
圖35. B7H4 x 4-1BB雙抗分子結合SK-BR-3細胞的結合活性。
圖36. B7H4 x 4-1BB雙抗分子結合 CHO-K1/hu 4-1BB細胞的結合活性。
圖37. B7H4 x 4-1BB 雙抗分子透過SK-BR-3媒介 T 細胞特異性活化 (INFγ釋放)。
圖38. B7H4 x 4-1BB 雙抗分子透過SK-BR-3媒介 T 細胞特異性活化 (IL-2釋放)。
圖39. B7H4 x 4-1BB 雙抗分子對 T 細胞活化特異性依賴 B7H4 的表現。
圖40. B7H4 x 4-1BB 雙抗分子PR003334 的血清穩定性。
圖41. B7H4 x 4-1BB 雙抗分子PR003335的血清穩定性。
圖42. B7H4 x 4-1BB 雙抗分子在小鼠體內的藥代動力學。
圖43. B7H4 x 4-1BB 雙抗分子在小鼠腫瘤模型中的抗腫瘤效果。
圖44. BCMA HCAb 抗體結合HEK293T/hBCMA細胞的結合活性。
圖45. BCMA HCAb 抗體結合HEK293T/cynoBCMA細胞的結合活性。
圖46. BCMA HCAb 抗體結合NCI-H929細胞的結合活性。
圖47. BCMA HCAb 抗體對HEK293T/hBCMA細胞的內化能力。
圖48. BCMA HCAb 抗體結合人BCMA的親和力(BLI方法)。
圖49. BCMA HCAb 抗體PR001046衍生的變體分子結合NCI-H929細胞的結合活性。
圖50. BCMA x CD3 雙抗分子結合 HEK293T/hBCMA 細胞的結合活性。
圖51. BCMA x CD3 雙抗分子結合 HEK293T/cynoBCMA 細胞的結合活性。
圖52. BCMA x CD3 雙抗分子結合 NCI-H929細胞的結合活性。
圖53. BCMA x CD3 雙抗分子結合人 T 細胞的結合活性。
圖54. BCMA x CD3 雙抗分子結合食蟹猴 T 細胞的結合活性。
圖55. scFv-Fc-VH(2) 非對稱結構的 BCMA x CD3 雙抗分子毒殺NCI-H929細胞的能力。
圖56. scFv-Fc-VH(1) 非對稱結構的 BCMA x CD3 雙抗分子毒殺 NCI-H929細胞的能力。
圖57. Fab-Fc-VH(1) 非對稱結構的 BCMA x CD3 雙抗分子毒殺 NCI-H929細胞的能力。
圖58. Fab-Fc-VH(2) 非對稱結構的 BCMA x CD3 雙抗分子毒殺 NCI-H929細胞的能力。
圖59. BCMA x CD3 雙抗分子 (PR001990, PR002309) 媒介效應細胞對NCI-H929細胞的特異性毒殺和細胞激素釋放檢測。
圖60. BCMA x CD3 雙抗分子 (PR002895, PR002953, PR003178) 媒介效應細胞對NCI-H929細胞的特異性毒殺和細胞激素釋放檢測。
圖61. 可溶性APRIL或BAFF對BCMA x CD3雙抗分子的標的細胞毒殺效果的影響。
圖62. 可溶性BCMA對BCMA x CD3雙抗分子的標的細胞毒殺效果的影響。
圖63. BCMA x CD3雙抗分子在小鼠或大鼠體內的藥代動力學。
圖64. BCMA x CD3雙抗分子在小鼠腫瘤模型中的抗腫瘤效果。
圖65. 雙抗分子經暫態轉染表現和一步親和純化後得到的蛋白樣品的SDS-PAGE和SEC-HPLC的分析結果。
圖66. CD3 抗體結合人T細胞的結合活性。
圖67. PD-L1 x CTLA4 雙抗分子在小鼠腫瘤模型中的抗腫瘤效果。

Claims (19)

  1. 一種含有至少兩個蛋白功能區的結合蛋白，其中，所述結合蛋白包括蛋白功能區A和蛋白功能區B；所述蛋白功能區A和所述蛋白功能區B標靶不同的抗原或抗原表位，其中所述蛋白功能區A為Fab或scFv結構，所述蛋白功能區B為VH結構，所述蛋白功能區A和蛋白功能區B的數量分別為一個或多個；較佳地，所述結合蛋白為對稱結構或非對稱結構，和/或，所述結合蛋白還包括Fc，所述Fc的數量為二個，由此形成Fc二聚體優選為同源二聚體或異源二聚體。
  2. 如請求項1所述的結合蛋白，其中， (I)所述結合蛋白為對稱結構，所述對稱結構為左右對稱的類IgG結構，其中所述蛋白功能區A的數量為二個，所述蛋白功能區B的數量為二個或四個； 較佳地，當所述蛋白功能區B的數量為二個時，所述結合蛋白為四價結合蛋白，其包括以下結構：(a)所述結合蛋白從N末端至C末端依次為蛋白功能區A、蛋白功能區B和Fc，其中所述蛋白功能區A與所述蛋白功能區B透過第一連接肽(L1)連接，所述蛋白功能區B與所述Fc透過第二連接肽(L2)連接；或，(b)所述結合蛋白從N末端至C末端依次為蛋白功能區B、蛋白功能區A和Fc，其中所述蛋白功能區B與所述蛋白功能區A透過連接肽連接，所述蛋白功能區A與所述Fc透過樞紐區連接；或，(c)所述結合蛋白從N末端至C末端依次為蛋白功能區A、Fc和蛋白功能區B，其中所述蛋白功能區A與Fc透過樞紐區連接，所述Fc與所述蛋白功能區B透過連接肽連接； 當所述蛋白功能區B的數量為四個時，所述結合蛋白為六價結合蛋白，其包括以下結構：新增的二個蛋白功能區B進一步連接在上述(a)或(b)或(c)所述結合蛋白的N末端或C末端；優選連接在上述(c)所述結合蛋白的Fc的C末端或者原有的蛋白功能區B的C末端，或與上述(b)所述結合蛋白的原有的蛋白功能區B一同連接於蛋白功能區A的N末端； 更佳地，所述結合蛋白還包括蛋白功能區C，所述蛋白功能區C與所述蛋白功能區A、蛋白功能區B標靶不同的抗原或抗原表位，所述結合蛋白為六價或八價的三特異性結合蛋白，其包括以下結構：所述蛋白功能區C連接在上述結合蛋白的N末端或C末端；優選所述蛋白功能區C的數量為二個，所述蛋白功能區C連接在上述(c)所述結合蛋白的C末端，或，與上述(b)所述結合蛋白的蛋白功能區B一樣，連接於所述蛋白功能區A的N末端；或， (II)所述結合蛋白為非對稱結構，所述非對稱結構呈左右不對稱的類IgG結構，其中左臂為Fab或scFv結構的蛋白功能區A，右臂為VH結構的蛋白功能區B，所述蛋白功能區A和所述蛋白功能區B分別與一個Fc連接；優選所述蛋白功能區A的數量為一個，所述蛋白功能區B的數量為一個或二個或三個； 較佳地，當所述蛋白功能區B的數量為一個時，所述結合蛋白為二價結合蛋白，其包括以下結構：所述蛋白功能區A為(d)常規Fab結構，或(e)Fab(cross VH/VL)結構，或(f)Fab(cross Fd/LC)結構；當所述蛋白功能區B的數量為二個時，所述結合蛋白為三價結合蛋白，其包括以下結構：左臂的所述蛋白功能區A為上述(d)或(e)或(f)，第二個蛋白功能區B連接在左臂的所述蛋白功能區A的N末端或C末端，或右臂的第一個蛋白功能區B的N末端，或所述Fc的C末端，優選第二個蛋白功能區B連接在右臂的第一個蛋白功能區B的N末端；當所述蛋白功能區B的數量為三個時，所述結合蛋白為四價結合蛋白，具體包括以下結構：左臂的所述蛋白功能區A為上述(d)或(e)或(f)結構，第三個蛋白功能區B進一步連接在左臂的所述蛋白功能區A的N末端或C末端，或左臂的第二個蛋白功能區B的N末端或C末端，或右臂的第一個或第二個蛋白功能區B的N末端，或所述Fc的C末端，優選第二個蛋白功能區B連接在右臂的第一個蛋白功能區B的N末端，且第三個蛋白功能區B連接在所述第二個蛋白功能區B的N末端；或， 當所述蛋白功能區B的數量為一個時，所述結合蛋白為二價結合蛋白，其包括以下結構：左臂的所述蛋白功能區A為(g)scFv結構，所述scFv透過VH的末端或VL的末端與Fc連接；當所述蛋白功能區B的數量為二個時，所述結合蛋白為三價結合蛋白，具體包括以下結構：左臂的所述蛋白功能區A為(g)，第二個蛋白功能區B連接在左臂的所述蛋白功能區A的N末端，或右臂的第一個蛋白功能區B的N末端，或所述Fc的C末端，優選第二個蛋白功能區B連接在右臂的第一個蛋白功能區B的N末端；當所述蛋白功能區B的數量為三個時，所述結合蛋白為四價結合蛋白，具體包括以下結構：左臂的所述蛋白功能區A為(g)，第三個蛋白功能區B進一步連接在左臂的所述蛋白功能區A的N末端，或第二個蛋白功能區B的N末端或C末端，或所述Fc的C末端，優選第二個蛋白功能區B連接在右臂的第一個蛋白功能區B的N末端，且第三個蛋白功能區B連接在所述第二個蛋白功能區B的N末端； 更佳地，所述結合蛋白還包括蛋白功能區C，所述結合蛋白為三價或多價的多特異性結合蛋白，其中，所述蛋白功能區C與所述蛋白功能區A、蛋白功能區B標靶不同的抗原或抗原表位，所述蛋白功能區C連接在上述結合蛋白的N末端或C末端；優選所述蛋白功能區C連接在上述(d)、(e)、(f)或(g)所述結合蛋白的蛋白功能區B的N末端； 進一步更佳地，所述結合蛋白還包括蛋白功能區D，所述結合蛋白為四價或多價的多特異性結合蛋白，具體地：所述蛋白功能區D與所述蛋白功能區A、蛋白功能區B、蛋白功能區C標靶不同的抗原或抗原表位，所述蛋白功能區D連接在上述結合蛋白的N末端或C末端；優選所述蛋白功能區D連接在上述(d)、(e)、(f)或(g)所述結合蛋白的蛋白功能區B的N末端。
  3. 如請求項1或2所述的結合蛋白，其中，(A)所述結合蛋白具有四條多肽鏈，其中兩條為相同的短鏈，另兩條為相同的長鏈，其中，(1)所述短鏈從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1，所述長鏈從N末端至C末端依次包括VL_A-CL-L1-VH_B-L2-CH2-CH3；或(2)所述短鏈從N末端至C末端依次包括VL_A-CL，所述長鏈從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1-L1-VH_B-L2-CH2-CH3；或(3)所述短鏈從N末端至C末端依次包括VL_A-CL，所述長鏈從N末端至C末端依次包括VH_B-L-VH_A-CH1-h-CH2-CH3；或(4)所述短鏈從N末端至C末端依次包括VH_B-L-VL_A-CL，所述長鏈從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1-h-CH2-CH3；或(5)所述短鏈從N末端至C末端依次包括VL_A-CL，所述長鏈從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1-h-CH2-CH3-L-VH_B；或(6)所述短鏈從N末端至C末端依次包括VL_A-CL-L-VH_B，所述長鏈從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1-h-CH2-CH3；或(7)所述短鏈從N末端至C末端依次包括VL_A-CL，所述長鏈從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1-h-CH2-CH3-L1-VH_B-L2-VH_B；或(8)所述短鏈從N末端至C末端依次包括VL_A-CL，所述長鏈從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1-h-CH2-CH3-L1-VH_B-L2-VH_C；或(9)所述短鏈從N末端至C末端依次包括VH_B-L1-VL_A-CL，所述長鏈從N末端至C末端依次包括VH_B-L2-VH_A-CH1-h-CH2-CH3；或(10)所述短鏈從N末端至C末端依次包括VH_B-L1-VL_A-CL，所述長鏈從N末端至C末端依次包括VH_C-L2-VH_A-CH1-h-CH2-CH3；其中，所述L、L1和L2為連接肽，所述h為樞紐區或連接肽，所述樞紐區或連接肽例如“-”、GS或如SEQ ID NO: 495- 519的胺基酸序列所示；或， (B)所述結合蛋白具有多肽鏈1、多肽鏈2和多肽鏈3三種多肽鏈，每種多肽鏈各一條，其中，(11)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VL_A-CL，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1-h-CH2-CH3，所述多肽鏈3從N末端至C末端依次包括VH_B-h-CH2-CH3；或(12)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VH_A-CL，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VL_A-CH1-h-CH2-CH3，所述多肽鏈3從N末端至C末端依次包括VH_B-h-CH2-CH3；或(13)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VL_A-CL-h-CH2-CH3，所述多肽鏈3從N末端至C末端依次包括VH_B-h-CH2-CH3；或(14)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VL_A-CL，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1-h-CH2-CH3，所述多肽鏈3從N末端至C末端依次包括VH_B-L-VH_B-h-CH2-CH3；或(15)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VL_A-CL，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1-h-CH2-CH3，所述多肽鏈3從N末端至C末端依次包括VH_C-L-VH_B-h-CH2-CH3；或(16)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VH_A-CL，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VL_A-CH1-h-CH2-CH3，所述多肽鏈3從N末端至C末端依次包括VH_B-L-VH_B-h-CH2-CH3；或(17)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VH_A-CL，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VL_A-CH1-h-CH2-CH3，所述多肽鏈3從N末端至C末端依次包括VH_C-L-VH_B-h-CH2-CH3；或(18)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VL_A-CL-h-CH2-CH3，所述多肽鏈3從N末端至C末端依次包括VH_B-L-VH_B-h-CH2-CH3；或(19)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VL_A-CL-h-CH2-CH3，所述多肽鏈3從N末端至C末端依次包括VH_C-L-VH_B-h-CH2-CH3；或(26)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VL_A-CL，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1-h-CH2-CH3，所述多肽鏈3從N末端至C末端依次包括VH_B-L1-VH_B-L2-VH_B-h-CH2-CH3；或(27)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VL_A-CL，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1-h-CH2-CH3，所述多肽鏈3從N末端至C末端依次包括VH_D-L1-VH_C-L2-VH_B-h-CH2-CH3；其中，所述L、L1和L2為連接肽，所述h為樞紐區或連接肽，所述樞紐區或連接肽例如“-”、GS或如SEQ ID NO: 495-519的胺基酸序列所示；或， (C)所述結合蛋白具有多肽鏈1和多肽鏈2兩種多肽鏈，每種多肽鏈各一條，其中，(20)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VL_A-L-VH_A-h-CH2-CH3，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VH_B-h-CH2-CH3；或(21)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VH_A-L-VL_A-h-CH2-CH3，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VH_B-h-CH2-CH3；或(22)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VL_A-L1-VH_A-h-CH2-CH3，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VH_B-L2-VH_B-h-CH2-CH3；或(23)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VH_A-L1-VL_A-h-CH2-CH3，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VH_B-L2-VH_B-h-CH2-CH3；或(24)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VL_A-L1-VH_A-h-CH2-CH3，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VH_C-L2-VH_B-CH2-CH3；或(25)所述多肽鏈1從N末端至C末端依次包括VH_A-L1-VL_A-h-CH2-CH3，所述多肽鏈2從N末端至C末端依次包括VH_C-L2-VH_B-h-CH2-CH3；其中，所述L、L1和L2為連接肽，所述h為樞紐區或連接肽，所述樞紐區或連接肽例如“-”、GS或如SEQ ID NO: 495-519的胺基酸序列所示。
  4. 如請求項1-3任一項所述的結合蛋白，其中，所述蛋白功能區A或所述蛋白功能區B選自PD-L1抗體、HER2抗體、B7H4抗體、CD3抗體、CTLA4抗體、4-1BB抗體或BCMA抗體中的一種；較佳地，所述蛋白功能區A為PD-L1抗體、HER2抗體、B7H4抗體或CD3抗體，所述蛋白功能區B為CTLA4抗體、4-1BB抗體或BCMA抗體； 更佳地，所述蛋白功能區A為PD-L1抗體，所述蛋白功能區B為CTLA4抗體；或，所述蛋白功能區A為PD-L1抗體，所述蛋白功能區B為4-1BB抗體；或，所述蛋白功能區A為HER2抗體，所述蛋白功能區B為CTLA4抗體；或，所述蛋白功能區A為B7H4抗體，所述蛋白功能區B為4-1BB抗體；或，所述蛋白功能區A為CD3抗體，所述蛋白功能區B為BCMA抗體。
  5. 如請求項4所述的結合蛋白，其中，所述PD-L1抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 167、188和211所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 15、62和122所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 167、188和211所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 15、69和122所示的胺基酸序列；優選地，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 282所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 233所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 282所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 240所示的胺基酸序列；和， 所述PD-L1抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 169、190和213所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 16、64和124所示的胺基酸序列；優選地，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 284所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 235所示的胺基酸序列；和， 所述HER2抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 171、190和215所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 19、67和127所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 176、196和220所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 23、74和132所示的胺基酸序列；優選地，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 286所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 238所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 293所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 247所示的胺基酸序列；和， 所述B7H4抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 180、191和225所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 32、87和143所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 177、191和226所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 33、88和144所示的胺基酸序列；優選地，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 298所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 261所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 299所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 262所示的胺基酸序列；和， 所述CTLA4抗體包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 17、65和125所示的胺基酸序列；優選地，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 236所示的胺基酸序列；和， 所述4-1BB抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 170、191和214所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 18、66和126所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 170、191和214所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 18、71和126所示的胺基酸序列；優選地，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 285所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 237所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 289所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 242所示的胺基酸序列；和， 所述4-1BB抗體包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 27、79和137所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 28、80和138所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 29、82和138所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 28、89和145所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 28、81和139所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 15、83和140所示的胺基酸序列；優選地，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 252所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 253所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 255所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 264所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 254所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 256所示的胺基酸序列；和， 所述CD3抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 177、191和221所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 15、84和141所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 178、197和222所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 31、85和142所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 177、191和223所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 31、86和141所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 179、198和224所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 31、85和142所示的胺基酸序列；優選地，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 294所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 258所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 295所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 259所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 296所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 260所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 297所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 259所示的胺基酸序列；和， 所述CD3抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 20、68和128所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；優選地，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 245所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 257所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 281所示的胺基酸序列；或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 244所示的胺基酸序列；和， 所述BCMA抗體包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 15、75和133所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 24、76和134所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 25、77和135所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 26、78和136所示的胺基酸序列；優選地，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 248所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 249所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 250所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 251所示的胺基酸序列；和， 所述BCMA抗體包含重鏈可變區，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 26、90和136所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 34、78和146所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、78和147所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、90和147所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 36、90和146所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、76和147所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 34、78和148所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、76和136所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、90和146所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 34、76和136所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、76和146所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 34、76和146所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、90和148所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、90和136所示的胺基酸序列；優選地，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 265所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 266所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 267所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 268所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 269所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 270所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 271所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 272所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 273所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 274所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 275所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 276所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 277所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 278所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 279所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 280所示的胺基酸序列。
  6. 如請求項1-4任一項所述的結合蛋白，其中， (A)所述結合蛋白含有蛋白功能區A和蛋白功能區B： 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 167、188和211所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 15、69和122所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 17、65和125所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 167、188和211所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 15、62和122所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 17、65和125所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 171、190和215所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 19、67和127所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 17、65和125所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 176、196和220所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 23、74和132所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 17、65和125所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 167、188和211所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 15、69和122所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 28、80和138所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 167、188和211所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 15、69和122所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 27、79和137所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 167、188和211所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 15、69和122所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 29、82和138所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 180、191和225所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 32、87和143所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 28、80和138所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 180、191和225所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 32、87和143所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 27、79和137所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 180、191和225所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 32、87和143所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 28、89和145所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 177、191和226所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 33、88和144所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 28、80和138所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 177、191和226所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 33、88和144所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 28、81和139所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 177、191和226所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 33、88和144所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 15、83和140所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 20、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 24、76和134所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 20、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 26、78和136所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 20、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 15、75和133所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 15、75和133所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 26、78和136所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 26、90和136所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 36、90和146所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、76和147所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 34、78和148所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、76和136所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、90和146所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 34、76和136所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、76和146所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 34、76和146所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、90和148所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、90和136所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 34、78和146所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、78和147所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 35、90和147所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 177、191和221所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 15、84和141所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 26、78和136所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 178、197和222所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 31、85和142所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 26、78和136所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 177、191和223所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 31、86和141所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 26、78和136所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 179、198和224所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 31、85和142所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 26、78和136所示的胺基酸序列；或， (B)所述結合蛋白含有蛋白功能區A、蛋白功能區B和蛋白功能區C： 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 15、75和133所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區C包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 24、76和134所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 25、77和135所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區C包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 26、78和136所示的胺基酸序列。
  7. 如請求項1-6任一項所述的結合蛋白，其中， (A)所述結合蛋白包括蛋白功能區A和蛋白功能區B： 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 282所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 240所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 236所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 282所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 233所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 236所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 286所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 238所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 236所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 293所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 247所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 236所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 282所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 240所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 253所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 282所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 240所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 252所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 282所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 240所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 255所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 298所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 261所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 253所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 298所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 261所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 252所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 298所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 261所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 264所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 299所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 262所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 253所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 299所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 262所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 254所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 299所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 262所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 256所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 245所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 249所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 245所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 251所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 245所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 248所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 257所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 248所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 257所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 251所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 281所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 251所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 251所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 265所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 269所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 270所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 271所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 272所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 273所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 274所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 275所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 276所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 277所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 278所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 279所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 280所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 266所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 267所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 268所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 244所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 249所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 244所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 251所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 294所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 258所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 251所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 295所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 259所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 251所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 296所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 260所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 251所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 297所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 259所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 251所示的胺基酸序列；或， (B)所述結合蛋白含有蛋白功能區A、蛋白功能區B和蛋白功能區C： 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 257所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 248所示的胺基酸序列。所述蛋白功能區C包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 249所示的胺基酸序列；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 257所示的胺基酸序列；所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 250所示的胺基酸序列。所述蛋白功能區C包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 251所示的胺基酸序列。
  8. 如請求項1-7任一項所述的結合蛋白，其特徵在於， (1)所述結合蛋白包含兩種多肽鏈，其中， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 371所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 372所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 371所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 373所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 353所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 362所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 363所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 364所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 365所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 364所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 353所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 366所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 353所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 369所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 353所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 370所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 353所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 394所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 353所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 395所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 363所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 310所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 363所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 396所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 363所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 362所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 363所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 394所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 363所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 395所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 367所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 368所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 367所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 378所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 367所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 379所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 367所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 380所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 367所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 381所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 367所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 382所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 367所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 383所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 367所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 385所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 367所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 388所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 367所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 389所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 374所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 375所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 386所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 387所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 401所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 402所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 305所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 403所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 402所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 409所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 359所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 404所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 405所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 315所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 359所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 406所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 376所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 377所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 397所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 398所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 399所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 400所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 402所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 401所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 402所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 403所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 405所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 404所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 405所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 406所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 371所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 486所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 353所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 460所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 353所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 461所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 353所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 462所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 487所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 488所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 360所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 455所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 360所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 456所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 360所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 457所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 360所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 458所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 360所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 459所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 419所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 412所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 419所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 414所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 440所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 428所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 441所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 428所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 442所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 428所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 443所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 428所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 487所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 520所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 353所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 521所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 371所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 522所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 360所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 523所示的胺基酸序列；或， (2)所述結合蛋白包含三個多肽鏈，其中， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 353所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 407所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 390所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 353所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 408所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 392所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 391所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 390所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 393所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 392所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 391所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 434所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 391所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 435所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 393所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 436所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 393所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 437所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 367所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 438所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 434所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 367所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 438所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 435所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 367所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 439所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 436所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 367所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 439所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 437所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 361所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 481所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 482所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 361所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 481所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 483所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 361所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 481所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 484所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 361所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 481所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 485所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 411所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 412所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 411所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 414所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 415所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 416所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 410所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 415所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 416所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 412所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 415所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 416所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 414所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 417所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 418所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 412所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 417所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 418所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 414所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 423所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 426所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 423所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 427所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 423所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 428所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 423所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 429所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 444所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 449所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 450所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 449所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 444所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 445所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 444所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 446所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 450所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 445所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 450所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 446所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 444所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 447所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 444所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 448所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 450所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 447所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 450所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 448所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 445所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 446所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 463所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 464所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 465所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 466所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 467所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 468所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 469所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 470所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 471所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 472所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 473所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 474所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 475所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 476所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 477所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 478所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 479所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 480所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 423所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 430所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 423所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 431所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 423所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 432所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 423所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO: 433所示的胺基酸序列。
  9. 如請求項1-8任一項所述的結合蛋白，還可以包括輕鏈恆定區，所述輕鏈恆定區優選人輕鏈恆定區，更優選人輕鏈恆定區Cκ或Cλ；所述的結合蛋白還可以包括重鏈恆定區的CH1、CH2和/或CH3，所述重鏈恆定區優選人重鏈恆定區，更優選人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4重鏈恆定區；所述IgG1重鏈恆定區的Fc上還可以具有C220S、N297A、L234A、L235A、P329G、S239D、I332E、S354C、T366W 、Y349C、T366S、L368A、Y407V、M252Y、S254T、T256E 等突變中的一種或多種，所述突變位址使用EU編號規則。
  10. 一種分離的核酸，其特徵在於，其編碼如請求項1-9任一項所述的結合蛋白。
  11. 一種表現載體，其特徵在於，其包含如請求項10所述的分離的核酸。
  12. 一種宿主細胞，其特徵在於，其包含如請求項11所述的表現載體，其中所述宿主細胞是原核細胞或真核細胞。
  13. 一種如請求項1-9任一項所述的結合蛋白的製備方法，其特徵在於，所述製備方法包括以下步驟：培養如上所述的宿主細胞，從培養物中獲得所述結合蛋白。
  14. 一種藥物組成物，所述藥物組成物包含如請求項1-9任一項所述的結合蛋白。
  15. 一種套裝藥盒，其特徵在於，所述套裝藥盒包括藥盒一和藥盒二，所述藥盒一包括如請求項1-9任一項所述的結合蛋白或如請求項14所述的藥物組成物，所述藥盒二包括治療癌症的其它抗體或藥物組成物。
  16. 一種如請求項1-9任一項所述的結合蛋白或如請求項14所述的藥物組成物在製備治療和/或預防癌症的藥物中的應用；優選地，所述的癌症優選乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、腎癌、黑色素瘤、肺癌、胃癌、肝癌、食管癌、子宮頸癌、頭頸部腫瘤、膽管癌、膽囊癌、膀胱癌、肉瘤、結直腸癌、淋巴瘤或者多發性骨髓瘤等。
  17. 一種治療癌症的方法，其特徵在於，向有需要的受試者施用如請求項1-9任一項所述的結合蛋白，或如請求項14所述的藥物組成物，或如請求項15所述的套裝藥盒；優選地，還包括施用治療癌症的其它抗體例如免疫檢查點抗體和/或化療藥物。
  18. 一種CD3抗體，其特徵在於，所述CD3抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區； 其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為如SEQ ID NO: 177、191和221所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為如SEQ ID NO: 15、84和141所示的胺基酸序列； 或，其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為如SEQ ID NO: 178、197和222所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為如SEQ ID NO: 31、85和142所示的胺基酸序列； 或，其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為如SEQ ID NO: 177、191和223所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為如SEQ ID NO: 31、86和141所示的胺基酸序列； 或，其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為如SEQ ID NO: 179、198和224所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為如SEQ ID NO: 31、85和142所示的胺基酸序列； 或，其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為如SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為如SEQ ID NO: 20、68和128所示的胺基酸序列； 或，其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為如SEQ ID NO: 172、192和216所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為如SEQ ID NO: 30、68和128所示的胺基酸序列； 優選地，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 294所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 258所示的胺基酸序列； 或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 295所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 259所示的胺基酸序列； 或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 296所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 260所示的胺基酸序列； 或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 297所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 259所示的胺基酸序列； 或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 245所示的胺基酸序列； 或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 257所示的胺基酸序列； 或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列； 或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 281所示的胺基酸序列； 或，其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 244所示的胺基酸序列； 更優選地，所述CD3抗體包含兩種多肽鏈；其中，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列，第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 313所示的胺基酸序列； 或，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列，第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 325所示的胺基酸序列； 或，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列，第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 328所示的胺基酸序列； 或，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列，第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 346所示的胺基酸序列； 或，所述CD3抗體包含一個多肽鏈，所述多肽鏈包括如SEQ ID NO: 489所示的胺基酸序列，如SEQ ID NO: 490所示的胺基酸序列，如SEQ ID NO: 491所示的胺基酸序列，如SEQ ID NO: 492所示的胺基酸序列，或，如SEQ ID NO: 493所示的胺基酸序列。
  19. 一種BCMA抗體，其特徵在於， 所述BCMA抗體包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為如SEQ ID NO: 15、75和133所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為如SEQ ID NO: 24、76和134所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為如SEQ ID NO: 25、77和135所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為如SEQ ID NO: 26、78和136所示的胺基酸序列； 或，所述BCMA抗體包含重鏈可變區，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為如SEQ ID NO: 26、90和136所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為如SEQ ID NO: 34、78和146所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為如SEQ ID NO: 35、78和147所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為如SEQ ID NO: 35、90和147所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為如SEQ ID NO: 36、90和146所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為如SEQ ID NO: 35、76和147所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為如SEQ ID NO: 34、78和148所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為如SEQ ID NO: 35、76和136所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為如SEQ ID NO: 35、90和146所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為如SEQ ID NO: 34、76和136所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為如SEQ ID NO: 35、76和146所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為如SEQ ID NO: 34、76和146所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為如SEQ ID NO: 35、90和148所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為如SEQ ID NO: 35、90和136所示的胺基酸序列； 優選地，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 248所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 249所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 250所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 251所示的胺基酸序列； 或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 265所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 266所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 267所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 268所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 269所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 270所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 271所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 272所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 273所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 274所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 275所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 276所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 277所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 278所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 279所示的胺基酸序列；或，其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 280所示的胺基酸序列； 更優選地，所述BCMA抗體包含一個多肽鏈，所述多肽鏈包含如SEQ ID NO: 316所示的胺基酸序列，如SEQ ID NO: 317所示的胺基酸序列，如SEQ ID NO: 318所示的胺基酸序列，或，如SEQ ID NO: 319所示的胺基酸序列； 或，所述BCMA抗體包含一個多肽鏈，所述多肽鏈包含如SEQ ID NO: 330所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 331所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 332所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 333所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 334所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 335所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 336所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 337所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 338所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 339所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 340所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 341所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 342所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 343所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 344所示的胺基酸序列；或，如SEQ ID NO: 345所示的胺基酸序列。
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