KR20090013748A - 형질전환 동물 내에서의 중쇄만의 항체의 생성 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 형질전환 비-인간 포유동물 내에서 VH 중쇄만의 항체의 생산 방법과 관련된다. 특히, 본 발명은, 형질전환 비-인간 포유동물 내에서 하나 이상의 이종성 VH 중쇄 유전자좌를 발현시키는 단계를 포함하는 VH 중쇄만의 항체의 생산 방법과 관련된다.
형질전화 비-인간 포유동물, 중쇄 유전자좌, 발현, 생산방법

Description

형질전환 동물 내에서의 중쇄만의 항체의 생성{GENERATION OF HEAVY-CHAIN ONLY ANTIBODIES IN TRANSGENIC ANIMALS}
본 발명은 형질전환 비-인간 포유류에 있어서, 항원투여(antigen challenge)에 대한 반응에 따른 다양한 레퍼토리의 친화력이 성숙된(affinity-matured) 기능성 중쇄만의 항체(functional heavy chain-only antibody)의 제조를 위한 개선된 방법 및 그들의 사용에 관련된다. 또한, 본 발명은 다수의 유전자좌로부터 다양한 레퍼토리의 클래스-특이적(class-specific) 중쇄만의 항체를 제조하는 것과 관련된다.
특히, 본 발명은 어떤 클래스 또는 혼합 클래스들의 인간 항원 특이적, 고 친화도 중쇄만의 항체의 생산방법과, 완전 기능성 VH 항원-결합 영역의 분리 및 발현 방법에 관련된다.
또한, 본 발명의 방법을 사용하여 생산된 중쇄만의 항체가 설명된다.
다음의 상세한 설명에서는, 모든 아미노산 잔기 위치 번호는 Kabat 등[1]에 의하여 고안된 기수법에 따른다.
항체들
항체의 구조는 당 분야에 잘 알려져 있다. 대부분의 천연 항체는 4량체로서, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄로 이루어진다. 중쇄들은 각 중쇄를 따라서 약 중간쯤에 위치한 힌지영역들(hinge domain) 사이의 디설피드 결합에 의하여 서로 연결되어 있다. 경쇄는 힌지영역의 N-말단 측에서 각각의 중쇄와 회합되어 있다. 각각의 경쇄는 일반적으로 힌지영역 가까이의 디설피드 결합에 의하여 각각의 중쇄와 연결되어 있다.
항체분자가 정확하게 접힐 때, 각각의 쇄는 더 많은 선형 폴리펩티드 서열에 의해 연결된 다수의 별개의 구형 영역들 내로 접힌다. 예를 들면, 경쇄는 가변 영역(VL)과 불변 영역(CL)내로 접힌다. 중쇄는 하나의 가변 영역 VH, 제 1 불변 영역(CH1), 힌지 영역 및 2개 또는 3개 이상의 추가의 불변 영역들을 가지고 있다. 중쇄 불변 영역 및 힌지 영역은 함께, 일반적으로 항체 중쇄의 불변 지역으로 알려져 있는 부분을 형성한다. 중쇄(VH) 가변 영역과 경쇄(VL) 가변 영역의 상호작용은 항원결합지역(FV)의 형성을 야기한다. 중쇄와 경쇄의 상호작용은 중쇄의 CH1 영역 및 경쇄의 Cκ 또는 Cλ 영역에 의하여 촉진된다. 경쇄가 부재하는 경우에도 중쇄 이합체와 아미노-말단 단편들이 활성을 보유하는 것으로 나타났음에도 불구하고, 항원결합을 위해서는, 일반적으로 VH 및 VL 양쪽 모두가 필요하다.
중쇄(VH) 및 경쇄(VL) 양자의 가변 영역 내에서, 몇몇의 짧은 폴리펩티드 세그먼트들이 특별한 가변성을 나타낸다. 이러한 세그먼트들은 초가변 지 역(hypervariable region) 또는 상보성 결정지역(CDRs)이라는 용어로 정의된다. 그 사이사이에 위치하는 세그먼트들은 프레임워크(framework) 지역(FRs)으로 불린다. 각각의 VH 영역 및 VL 영역에는, 3개의 CDR이 있다(CDR1~CDR3).
포유류에는 5클래스의 항체: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 인간에는 그에 더하여 4종류의 IgG 서브타입 및 2종류의 IgA 서브타입이 존재한다.
Figure 112008060083829-PCT00001
항체 클래스는 그들의 생리학적 작용의 상이함으로 구분한다. 예를 들면, IgG는 면역반응의 성숙에 중요한 역할을 한다. IgM은 상보체결합 및 응집반응에 관여한다. IgA는 항체의 종류들 중 분비액(눈물, 타액, 초유 및 점액)에 가장 많이 존재하는 것으로, 따라서 국지성 면역에 있어서 역할을 한다. 천연 항체의 중쇄 불변 지역은 이펙터 작용을 제공한다.
IgA는 점액을 포함하는 부분(예를 들면, 소화기관, 호흡기관 또는 비뇨생식기관)에서 발견되며, 점막 부분이 병원균에 의하여 군체를 형성하는 것을 예방한다. IgD는 주로 B 세포에서 항원 수용체로 작용한다. IgE는 알레르겐에 결합하여 대식세포에서 히스타민이 분비되도록 자극(알레르기의 기본 메카니즘)하고, 또한 장내 기생충으로부터 몸을 보호한다. IgG(그것의 4개의 동위타입들)는 침입 병원균에 대항하여 대부분의 항체-기반 면역을 제공한다. IgM은 B 세포의 표면에서 발현되고, 또한 B 세포 매개 면역의 초기 단계(즉, 병원균을 제거하기 위한 충분한 IgG가 존재하기 전)에서 병원균을 제거하기 위하여 매우 고친화도를 갖는 분비물형태 내에 존재한다.
정상적인 인간 B 세포는 염색체 14상에 하나의 중쇄 유전자좌를 포함하고, 상기 중쇄 유전자좌로부터 재배치에 의하여 중쇄를 암호화하는 유전자가 생산된다. 마우스 내에서, 중쇄 유전자좌는 염색체 12상에 위치한다. 정상적인 중쇄 유전자좌는 다수의 V 유전자 세그먼트, 다수의 D 유전자 세그먼트 및 다수의 J 유전자 세그먼트를 포함한다. 대부분의 VH 영역은 V 유전자 세그먼트에 의하여 암호화되나, 각각의 VH 영역의 C 말단은 D 유전자 세그먼트 및 J 유전자 세그먼트에 의하여 암호화된다. B 세포 내에서의 VDJ 재배치 및 그에 이은 친화도 성숙은 항원결합 특이성을 갖는 각각의 VH 영역을 제공한다. 정상적인 H2L2 4합체의 서열분석은, 다양성이 일차적으로는 VDJ 재배치 및 체세포성 과변이의 조합에 의하여 일어난다는 사실을 보여준다[3]. 50개 이상의 인간 V유전자 세그먼트가 인간 게놈에 존재하고, 그 중 단 지 39개만이 기능성이다.
완전 인간 항체(H2L2)는 항원투여에 반응한 형질전환 마우스로부터 얻을 수 있다. 이러한 형질전환 마우스는 하나의 인간 중쇄 유전자좌 및 단독의 경쇄 유전자좌를 포함한다. 상응하는 마우스 중쇄 및 경쇄 유전자좌들이 마우스 항체의 부재시에 오직 인간 항체만이 생산되도록 결실되거나 억제된다([4-10]).
새로운 분자생물학 기술의 출현으로, 중쇄만의 항체(경쇄 결핍)의 존재는 인간과 뮤린(murine) 모델 시스템에서의 B 세포 증식 이상(중쇄 질환)에서 확인되었다. 분자 수준에서의 중쇄 질환의 분석은, 게놈 수준에서의 변이 및 결실이, 경쇄와 결합하는 능력이 결핍된 중쇄만의 항체의 발현을 야기하는 중쇄 CH1 영역의 부적절한 발현을 야기할 수 있다는 사실을 보여주었다[11,12].
자연적인 유전자 변이의 결과인 카멜리드(camelid)가, 경쇄와의 결합을 중재하는 CH1 영역의 부재로 인해 경쇄에 결합할 수 없는 기능성 IgG2 및 IgG3 중쇄만의 이합체를 생산한다는 것은 알려져 있다. 카멜리드 중쇄만의 항체의 특징은 인간 및 정상 카멜리드 VH 영역에 비해 개선된 용해성을 제공하는 카멜리드 VH 영역의 특정 부분(subset)이다. 이러한 특정 부분내의 카멜리드 VH 영역은 통상적으로 VHH 영역으로 일컬어진다.
또한, 상어와 같은 종들은, 포유류의 T세포 수용체 또는 항체 경쇄와 관련되어 있을 것으로 추측되는 유사-중쇄만의 결합 단백질 패밀리를 생산한다는 사실이 알려져 있다[14].
카멜리드 중쇄만의 항체의 생산을 위하여, 카멜리드 생식계열 내의 중쇄 유전자좌는 가능한 중쇄 불변 지역의 일부 또는 전부를 코딩하는 유전자 세그먼트를 포함한다. 성숙과정 동안, 재배열된 VHHDJ 결합 영역은, CH1 영역이 결핍되어 경쇄와 회합될 수 없는 중쇄를 암호화하는 재배열된 유전자를 제공하기 위해, 힌지 영역을 암호화하는 유전자 세그먼트의 5' 말단상에 스플라이싱된다.
카멜리드 VHH 영역은 위치 37, 44, 45 및 47의 다수의 특징적 아미노산을 포함한다[49]. 이러한 보존된 아미노산들은 중쇄만의 항체에 용해성을 부여하는데 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 어떠한 특정의 카멜리드 VH 영역들만이 개선된 용해성을 갖는 VHH 영역들이다. 이들은 VH 서브패밀리에 제한되어 있어서, 제한된 범위의 항원에 대하여만 생산적으로 반응한다.
중쇄만의 단일클론항체는 표준 클로닝 기술에 의해 카멜리드 비장의 B 세포로부터 회수되거나, 파아지 또는 다른 디스플레이 기술에 의해 B 세포 mRNA로부터 회수될 수 있다[18]. 카멜리드로부터 유래된 중쇄만의 항체는 높은 친화도를 가진다. 중쇄만의 항체를 암호화하는 mRNA의 서열 분석에 의해, 다양성은 주로 VHHDJ 재배열과 체세포 초변이의 조합으로부터 나타난다는 사실을 알 수 있으며, 이는 또한, 정상적인 4합체 항체의 생산에서도 관찰된다.
천연 카멜리드와 인간 VH 영역의 중요한 공통적인 특징은, 각 영역은 최적의 용해성과 결합 친화도를 위하여, VL 영역과의 이합체화에 의하지 않고, 단량체로서 결합한다는 것이다.
최근, 형질전환 비-인간 포유류내에서 중쇄만의 항체를 생산하는 방법들이 개발되었다(WO 02/085945 및 WO 02/085944 참조).
잠재적으로 어떤 클래스(IgM, IgG, IgD, IgA 또는 IgE)에 속하는, 어떤 포유류로부터 유래된 기능성 중쇄만의 항체는 형질전환 비인간 포유류(바람직하게는, 마우스)로부터 항원 투여의 결과로서 생산될 수 있다. 이러한 초기의 연구는 2개의 라마(llama) V 유전자 세그먼트의 사용에 의존하였고, 항체반응의 제한된 레퍼토리로 인해 어려움을 겪었다.
Janssens 등[15]은 형질전환 마우스로부터 중쇄만의 항체를 얻는 방법을 개발하였다. 이러한 중쇄만의 항체는 B 세포내에서의 항체 성숙의 결과로 높은 결합 친화도를 가지고, 항원투여의 결과로 얻어질 수 있고, 입증된 세포 융합 기술을 이용하여 선별될 수 있으며, 경쇄(예를 들면 IgG, IgA, IgM)가 부재하는 어떤 클래스의 항체로서 또는 VH 결합 영역 단독으로서 생산될 수 있다. 이러한 중쇄만의 항체는, 모든 인간 D 유전자 세그먼트와 J 유전자 세그먼트 및 모든 인간 불변 영역을 암호화하는 유전자 세그먼트들에 커플링되는 2개의 라마 VHH(클래스 3) 유전자 세그먼트들을 포함하는 생식계열(즉, 재배열되지 않은) 배열 내의 항체 중쇄 유전자좌로부터 유래되었다. 각각의 불변 영역을 암호화하는 유전자 세그먼트는 경쇄의 결합을 방지하기 위하여 CH1 영역이 결실되어 있다. 더욱이, 상기 유전자좌는 B 계통 의 세포내에서의 고수준의 발현을 확보하기 위해 3' 말단에 항체 LCR를 포함하였다. 이 유전자좌는 수정란의 미세주사에 의하여 마우스 내로 도입되었다.
항체-기반 산물의 생산
유전자 기술에 의한 항체-기반 산물의 생산, 특히 인간 항체 또는 인간화 항체-기반 산물의 생산은 새로운 의약품류, 진단기구 및 시약의 생산 및 이에 따른 새로운 산업, 고용 및 부(富)의 창출의 기회를 제공하였다(www.drugresearcher.com, www.leaddiscovery.co.uk 참조). 통상적으로 항체-기반 산물은 천연의 4합체 항체로부터 유래된다. 항체-기반 산물의 생산에 관련된 많은 특허 및 특허출원이 있다. 이러한 특허 및 특허출원들은 유래 과정(예를 들면, 형질전환 마우스로부터 유래), 제조 과정 및 생산물-특이적 물질들과 관련된다. 이러한 항체-기반 산물은, 완전한 4합체 항체를 비롯하여 항체 단편부터 단일 쇄 Fv(scFv) 분자까지 다양하다.
항체-기반 산물은 21세기에 개발된 신규 의약품들 중에서 높은 비중을 나타낼 것이다. 단일 클론 항체 치료법은 이미 류마티스 관절염 및 크론병의 치료에 적절한 것으로 받아들여지고 있으며, 암의 치료에 있어서도 괄목할 만한 진전이 있다. 또한, 항체-기반 산물은 심혈관계 질병 및 감염성의 질병들의 치료에 대해서도 개발단계에 있다. 판매되고 있는 많은 항체-기반 산물들은 타겟 리간드(예를 들면, TNFα)상의 단일의 정확한 에피토프를 인식하여, 그것과 결합한다.
최근에, 고친화도 VH 영역들은, 디스플레이 라이브러리 내의 무작위화된 인 간 VH 영역들로부터 선택되거나, 또는 카멜리드의 항원투여에 의하여 자연적으로 생성된 중쇄만의 항체로부터 유래되거나, 또는 카멜리드로부터 만들어진 VH 영역 라이브러리로부터 유래된다. 이러한 고친화도 VH 영역들은 항체-기반 산물 내로 도입되어 왔다. VHH 영역으로도 불리워지는, 이러한 VH 영역들은, 특히 개선된 용해성 및 경쇄 부재하에서의 중쇄의 안정성을 갖게 하는 많은 돌연변이와 같은, 전형적인 VH 영역과는 다른 여러 차이점들을 나타낸다. 이러한 변화들 중에서 가장 두드러진 것은 위치 45에서의 하전된 아미노산의 존재이다[16].
여러 그룹들이 천연의 4합체 항체로부터 유래된 중쇄만의 항체의 생성을 연구하였다. Jaton 등[2 및 그에 인용된 다른 참고문헌들]은, 친화성이 제거되고 특성이 밝혀진 토끼 항체의 환원된 중쇄 성분들의 분리 및 그 후의 각 중쇄의 재생을 기술하고 있다. 재생된 중쇄의 면역학적 특성화는 중쇄 동종이합체 단독으로, 경쇄 없이, 항원결합이 가능하다는 사실을 증명한다.
이후, Ward 등[18]은 클로닝된 뮤린 VH 지역들이 E.cole 발현 시스템내에서 가용성 단백질 단량체로서 발현될 경우, 고친화도로 항원에 결합하는 능력을 갖는다는 사실을 명백하게 증명하였다. Ward 등[18]은 VH 영역들의 분리 및 특성화를 기술하고, 전통적인 단일 클론 항체 생산과 비교하였을 때, 이러한 접근이 잠재적인 상업적 이점이 있음을 제시한다(마지막 단락 참조). 또한, 그들은 경쇄와 정상적으로 회합하는 중쇄로부터 분리된 VH 영역들은 천연의 4합체 항체들에 대한 용해성이 결여되어 있다는 것을 인식하고 있다. 따라서, Ward 등[18]은 이 분자들을 기술하기 위하여 "끈끈한(sticky)"이라는 용어를 사용하였고, 이 "끈끈함(stickiness)"은 개선된 용해성을 갖는 VH 영역들의 설계를 통하여 발휘될 수 있음을 제안하였다.
이 후에, VH 용해성의 개선은, 파아지 디스플레이를 이용하는, 무작위화된 접근법과 부위-특이적인(site-directed) 접근법의 조합을 이용하여 이루어졌다. 예를 들면, Davies와 Riechmann 등[17](WO 92/01047 참조)은, 결합특이성을 유지함과 동시에 용해성을 개선시키기 위하여, 파아지 디스플레이를 조합하여, 카멜리드 중쇄만의 항체로부터의 VH 영역들의 몇가지 특징들을 통합시켰다.
파아지 라이브러리로부터 유래된, 분리된 인간 VH 영역들에 관한 다른 연구들은 VH 영역들의 항원-특이적 결합을 증명하였으나, 이러한 VH 영역들은 낮은 용해성을 갖는 것으로 판명되었다. 더욱이, 파아지 어레이상에 나타난 특이적 결합 특성들을 갖는 인간 VH 영역들의 선별하므로써, 조작된(engineered) 항체를 위한 기본단위들(binding block)을 형성할 수 있다는 것이 제안되었다[18].
인간 VH 영역은 개선된 용해성을 갖도록 조작될 수 있고[19, 20], 또는 체내에서 자연선택에 의하여 용해성이 얻어질 수도 있다[21]. 그러나, VH 결합 영역들이 파아지 라이브러리로부터 유래되는 경우, 예를 들면, 친화도 과열점 무작위화(affinity hot spot randomisation)와 같은 친화도 향상 방법들의 적용에도 불구하고, 항원에 대한 고유 친화도는, 낮게는 마이크로몰부터 높게는 나노몰 범위에 머무른다[22].
파아지 기술 또는 대안적 디스플레이 기술에 의하여 생산되는 인간 VH 영역 또는 카멜리드 VH 영역은 체세포변이에 의한 개선된 특성들의 이점이 결여되어 있고, 정상적인 항체 결합부위의 CDR3 지역에서의 D 유전자 세그먼트 및 J 유전자 세그먼트의 재조합에 의해 제공되는 추가적인 다양성이 결여되어 있다. 몇몇의 카멜리드 VH ( VHH ) 영역은, 인간 VH에 비해 용해성의 이점을 나타내는 반면에, 인간 내에서 항원이 될 수 있고, 더욱이, 카멜리드 VH는 카멜리드의 면역화 또는 파아지 디스플레이 기술에 의하여 생성되어야만 한다는 단점을 갖는다.
파아지-유래 인간 VH 영역들은, 고친화도 결합 특성을 달성하기 위하여, 많은 횟수의 패닝(panning) 및 그에 이은 돌연변이 유발을 필요로 하므로, 이용하기에 어렵다. 카멜리드 VHH 영역들은, 파아지 또는 유사한 디스플레이 라이브러리로부터 분리될 경우, 마찬가지로 어려운 과정을 필요로 하거나, 또는 전통적인 하이브리도마 기술을 적용할 수 없는 큰 동물들(전통적인 항체를 만드는 라마 또는 낙타)의 면역화를 필요로 한다. 더욱이, 카멜리드 결합 영역들은 항원이 될 수 있어, 인간화를 필요로 한다.
항원투여의 결과로서, 형질전환 비-인간 포유류에서의 중쇄만의 항체의 생산을 통하여 이러한 많은 문제점들이 해결된다(WO 02/085945 및 WO 02/085944 참조).
그러나, 당분야에서는, 중쇄만의 항체의 다양성을 최대화하고, 체내 B 세포 반응을 최대화하고자 하는 요구, 및 특히 다양한 의료적, 산업적 및 연구 용도에 이용하기 위한 최대의 항원-결합 잠재성을 갖는 클래스 특이적 인간 중쇄만의 항체 및 기능성 VH 중쇄만의 결합 영역들의 기능성 레퍼토리를 생성하고자 하는 요구가 존재한다.
놀랍게도, 본 발명자들은 선행기술의 제한을 극복하고, 클래스-특이적인(class-specific) 중쇄만의 항체를 생산하는데 사용되는 형질전환 비-인간 포유류내에 존재하는 중쇄만의 유전자좌의 수를 증가시키므로써 항체 반응의 레파토리가 매우 증가할 수 있다는 것을 밝혀내었다.
본 발명은, 형질전환 비-인간 포유류가 복수의 중쇄만의 유전자좌를 갖는 경우, 이러한 유전자좌들은 대립유전자 형질 배제의 적용을 받게 된다는 사실의 발견에 근거한다. 따라서, 오직 하나의 유전자좌만이 확률적으로 선택되고, 성공적으로 재조합되어, 중쇄만의 항체가 생산된다. 그러므로, 포유류로부터 얻을 수 있는 항체 레퍼토리 및 다양성을 최대화하기 위하여, 동일한 형질전환 비-인간 포유류내에서 복수의 VH 중쇄 유전자좌가 사용될 수 있다. 항원투여시, 형질전환 비-인간 포유류는, 나머지 유전자좌들의 형질배제를 위하여, 특이적 항원투여에 대한 반응에 가장 적합화된 V 유전자 세그먼트를 포함하는 유전자좌를 "선택"한다.
본 발명의 방법에 의하여 생산될 수 있는 중쇄만의 항체는, 일반적으로 확장된 CDR3 고리의 부재하에서, 형질전환 비-인간 포유류가, V 유전자, D 유전자 및 J 유전자 세그먼트 재배열 및 체세포 변이가 일어날 수 있는 범위의 유전자좌를 "선택"할 수 있게된 결과로서, 높은 결합 친화도를 나타낸다. 필수적으로, 정상 B 세포 성숙은, 분리된 플라즈마(재조합 유전자좌내에 존재하는 모든 항체 클래스로부터 CH1영역이 제거되었다)에 중쇄만의 항체가 고수준으로 존재하는 것과 함께 관찰된다. B 세포 성숙 및 집합된 2합체(예를 들면, IgG) 또는 다합체(예를 들면, IgM)의 분비는, 경쇄 유전자의 존재 또는 발현에 의존하지 않는다.
따라서, 본 발명의 첫번째 측면에서는, 형질전환 비-인간 포유류내에 하나 이상의 이종성 VH 중쇄 유전자좌들을 제공하는 단계 및 적어도 하나의 상기 유전자좌로부터 VH 중쇄 만의 항체를 발현시키는 단계를 포함하는, 상기 형질전환 비-인간 포유류내에서 VH 중쇄만의 항체를 생산하는 방법을 제공하는 것이고, 여기에서 각 VH 중쇄 유전자좌는 하나 이상의 V 유전자 세그먼트, 하나 이상의 D 유전자 세그먼트, 하나 이상의 J 유전자 세그먼트 및 발현시 CH1 영역을 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 암호화하는 유전자 세그먼트를 포함한다.
바람직하게는, 각각의 VH 중쇄 유전자좌는, 어떠한 척추동물 종에서 유래한 것일 수 있는 1개 또는 복수의 V 유전자 세그먼트, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50 또는 60개의 V 유전자 세그먼트를 포함한다.
하나의 구체예에서, 각각의 유전자좌는 오직 하나의 V 유전자 세그먼트를 포함할 수 있다. 이 구체예의 하나의 대체예에서, 각각의 V 유전자 세그먼트는 다른 모든 V 유전자 세그먼트들과 상이하다. 두 번째 대체예에서, 각각의 V 유전자 세그먼트는 다른 모든 V 유전자 세그먼트들과 동일하다. 이러한 두 번째 대체예에서, 각각의 유전자좌에서 나머지 유전자 세그먼트들은 다른 모든 유전자좌들에 존재하는 유전자 세그먼트들과 서로 같거나 다를 수 있다.
따라서, 비-인간 포유류는, 하나의 VH 중쇄 유전자좌에 대한 다수의 복사체(copy)를 포함할 수 있다는 사실이 파악된다. 이는 B 세포 내에서 생산적인 재배열이 수행될 기회를 최적화한다는 이점을 가지고 있으며, 따라서 유용한 중쇄만의 항체의 생산을 가능하게 한다는 이점을 가지고 있다.
만일, 비-인간 포유류가 많은 상이한 VH 중쇄 유전자좌들을 포함한다면, 이 경우 원하는 특이성을 갖는 중쇄만의 항체를 얻을 수 있는 기회가 더욱 최적화될 것이다.
다른 구체예에서, 각각의 유전자좌는 복수의 V 유전자 세그먼트를 포함한다. 이 구체예에서, 어떤 하나의 유전자좌 내의 V 유전자 세그먼트는 모두 같은 종의 생물에서 유래될 수도 있는데, 예를 들면 모든 V 유전자 세그먼트는 인간 유래의 V 유전자 세그먼트일 수 있다. 또는, 어떤 하나의 유전자좌 내의 V 유전자 세그먼트는 다른 종의 생물에서 유래될 수도 있는데, 예를 들면 몇몇의 V 유전자 세그먼트는 인간으로부터 유래된 것이고, 다른 V 유전자 세그먼트들은 카멜리드 또는 상어로부터 유래된 것일 수 있다.
바람직하게는, 상기 V 유전자 세그먼트는 인간 유래의 것이다.
용어 'V 유전자 세그먼트'는, 카멜리드 및 인간을 포함한 척추동물로부터 유래한, 자연발생적인 V 유전자 세그먼트를 포함한다. 상기 V 유전자 세그먼트는, 핵산 발현시 VH 중쇄만의 항체를 생성시키기 위하여, D 유전자 세그먼트, J 유전자 세그먼트, 및 중쇄 불변(이펙터)지역(CH1 엑손을 제외하고 몇몇의 엑손을 포함할 수 있음)을 암호화하는 유전자 세그먼트와 재조합될 수 있어야 한다.
또한, V 유전자 세그먼트의 범위에는, 여기에서 정의된 바와 같은 중쇄만의 항체를 생성시키기 위하여, D 유전자 세그먼트, J 유전자 세그먼트 및 중쇄 불변 지역(CH1 엑손 이외의 하나 이상의 엑손들을 포함)을 암호화하는 유전자 세그먼트와 재조합될 수 있는 상동체, 유도체 또는 단백질 단편을 암호화하는 어떠한 유전자 서열이 포함된다. 예를 들면, V 유전자 세그먼트는 T 세포 수용체 유전자좌 또는 면역글로불린 경쇄 유전자좌로부터 유래될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 복수의 중쇄 유전자좌는, 복수의 유전자좌 전체에 걸쳐 분포된 어떤 수의 또는 39개의 기능성 인간 V 유전자 세그먼트 및 개선된 용해성을 갖도록 조작된(engineered) 그들의 변이체의 조합을 포함한다. 이들은, 예를 들면, 8개의 V 유전자 세그먼트를 포함하는 4개의 유전자좌 + 7개의 V 유전자 세그먼트를 포함하는 1개의 유전자좌; 4개의 V 유전자 세그먼트를 포함하는 7개의 유전자좌 + 3개의 V 유전자 세그먼트를 포함하는 1개의 유전자좌; 또는 각각 하나의 V 유전자 세그먼트를 포함하는 39개의 유전자좌와 같이, 어떤 수의 유전자좌일 수 있다.
인간 V 유전자는, VH1에서 VH7까지, 7개의 패밀리로 분류될 수 있고, 각각의 패밀리의 개별 유전자들은 숫자가 매겨져 있다. 각 유전자가 사용되는 빈도는 특정한 면역반응의 다양한 조건들에 의존한다. 예를 들면, 박테리아성 항원에 대한 반응시, VH5 패밀리의 유전자들에 비하여 VH3 패밀리의 유전자들이 우선적으로 이용될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 더욱 바람직한 구체예에서는, 특정 항원에 대한 항체반응을 발생시키는데 유용한 것으로 나타난 V 유전자 세그먼트의 군들은 형질전환 비-인간 포유류의 개별 개통들내로 그룹화된다. V 유전자 세그먼트들은 패밀리에 따라 그룹화될 수 있거나, 또는 각각의 작용에 따라 그룹화될 수 있다. 예를 들면, VH3 패밀리의 V 유전자들이 박테리아성 항원에 대한 면역반응을 발생시키는데 유용한 것으로 나타나면, 이들은 박테리아성 항원에 대항하는 중쇄만의 항체를 생성시키는데 특별히 유용한 형질전환 비-인간 포유류를 생성시키는데 사용될 수 있다. 또는, VH3 및 VH5 패밀리에 속하는 몇몇의 개별 유전자들이 박테리아성 항원에 대한 면역 반응을 발생시키는데 유용한 것으로 나타나면, 이들은 함께 그룹화될 수 있고, 박테리아성 항원에 대항하는 중쇄만의 항체를 생성시키는데 특별히 유용한 형질전환 비-인간 포유류를 생성시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 명세서에서, 용어 '이종성(heterologous)'은 본 발명에서 설명되는 뉴클레오티드 서열 또는 유전자좌가, 그것이 위치하는 장소가 포유동물에 내생적이지 않은 것을 의미한다.
본 발명의 "VH 중쇄 유전자좌"는 (CH1 영역이 각각 결핍된) 중쇄 이펙터 지역들을 암호화하는 하나 이상의 유전자 세그먼트에 임의로 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 V 유전자 세그먼트, 하나 이상의 D 유전자 세그먼트 및 하나 이상의 J 유전자 세그먼트를 포함하는 VH 영역을 암호화하는 최소 마이크로-유전자좌와 관련된다. 바람직하게는, 항체 레퍼토리 다양성의 1차적 요인(source)은 V, D 및 J 유전자 세그먼트의 선별 및 V-D와 D-J 연결에 의하여 형성되는 CDR3 지역이다.
본 발명의 이점은, 재배열된 VH 유전자 서열들에서 얻어지는 항체 레퍼토리와 다양성은, 같은 형질전환 비-인간 포유류 내에서 복수의 VH 중쇄 유전자좌의 사용을 통하여 최대화될 수 있다는 것이다. Janssens 등, 2006[15]은, 재배열 및 대립유전자 형질배제의 관점에서, 상기에 설명된 바와 같은 형질전환 유전자좌는 정상 면역글로불린 유전자좌처럼 행동한다는 사실을 보여주었다. 이는 대립유전자 형질배제를 이용함으로써 가능한 VH 재조합의 수를 최대화하기 위하여, 같은 동물내에서 (다른 염색체상에서) 복수의 유전자좌를 가질 가능성을 열어주었다. 각각의 형질전환 유전자좌는 1~40개 이상의 VH 지역을 포함할 것이다. 재조합을 개시하기 위하여 유전자좌 중 하나를 무작위적으로 선택하는 대립유전자 형질배제의 과정은, 첫번째 재조합이 비생산적이라면, 유전자좌 중 하나로부터 생산적인 재조합이 이루어질 때까지, 다음의 유전자좌에 대해 이어서 수행되는데, 이는 실제적으로 조합된 유전자좌 내에 존재하는 모든 VH 지역들이 전체 재조합 과정의 일부를 이룰 수 있도록 보장해 줄 것이다.
또한, 놀랍게도 Janssens 등[15]은 같은 형질전환 비-인간 포유류 내의 복수의 중쇄 유전자좌가 같은 염색체상에 일렬로 있는 경우, 복수의 중쇄 유전자좌로부터 생산적인 재배열 및 항체발현이 일어날 수 있다는 사실을 발견해내었다. 이러한 경우에, 수반되는 하이브리도마 클론들은 다클론성이다. 당업자라면 이것이 항체 다양성을 증가시키기 위한 또 다른 메카니즘이라는 것을 인식할 것이다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 여기에서 설명된 바와 같이, 형질전환 비-인간 포유류 내의 최소 2개 이상의 VH 중쇄 유전자좌가 같은 염색체상에 일렬로 존재하고, 생산적인 재배열 및 항체발현이 2개 이상의 유전자좌로부터 동시에 일어날 수 있는 방법이 제공된다.
바람직하게는, 처음에는 형질전환 비-인간 포유류에 많은 중쇄 유전자좌가 개별적으로 도입될 것이고, 하나의 중쇄 유전자좌를 갖는 형질전환 비-인간 포유류를 생성시킬 것이다. 그 다음, VH 지역의 수를 최대화하기 위하여 복수의 중쇄 유전자좌를 갖는 후손을 생성시키기 위하여 이들 동물들을 교배시켜, 최대의 다양성을 얻게 될 것이다. 또한, 추가의 형질전환 과정을 통해 유전자좌가 새로이 첨가될 수 있다. 새로운 유전자좌는 이미 하나 이상의 이종성 VH 중쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 포유류로부터 유래된 난자에 주입될 것이다. 새로운 이종성 VH 중쇄 유전자좌의 안정한 통합에 의해 이용가능한 VH 지역들이 증가될 것이고, 이로써 다양성이 증가될 것이다. 추가의 이종성 VH 중쇄 유전자좌를 갖는 이종성 VH 중쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 형질전환 포유류로부터 유래된 ES 세포의 안정한 형질감염은, ES 세포 기술이 배융합 및 낭포주입에 의한 형질전환에 이용될 수 있는 비-인간 포유류(예를 들면, 마우스)에서 다양성을 증가시키기 위한 다른 대안을 제공한다.
바람직하게는, 각각의 다른 중쇄 유전자좌는 형질전환 비-인간 포유류의 게놈 내에서 단일 복사체로 존재할 것이다.
더욱이, 복수의 V, D 및 J 유전자 세그먼트의 사용은, 얻을 수 있는 항체 레퍼토리 및 다양성의 추가적 증가를 제공한다. 이어서, VL 및 LC(경쇄) 항체 유전자좌들에 대한 필요없이, 최소 유전자좌(마이크로-유전자좌)를 사용하여 체세포 변이가 이루어진다.
본 발명의 명세서에 있어서, 용어 'D 유전자 세그먼트' 및 'J 유전자 세그먼트'는 자연적으로 발생하는 D 및 J 유전자 세그먼트의 서열들을 포함한다. 바람직하게는, D 및 J 유전자 세그먼트는, V 유전자 세그먼트가 유래된 동일한 척추동물로부터 유래된다. 예를 들면, 만일 V 유전자 세그먼트가 인간 유래이고, 필요에 따라 가용화되거나, 조작된다면, D 및 J 유전자 세그먼트 또한 인간 유래인 것이 바람직하다. 또는, V 유전자 세그먼트는, 예를 들어, 카멜리드로부터 유래될 수 있고, D 및 J 유전자 세그먼트는 인간 유래일 수 있으며, 또는 그 역일 수 있다.
또한, 용어 D 유전자 세그먼트 및 J 유전자 세그먼트는, 결과물 세그먼트가 본 발명에서 설명되는 바와 같은 중쇄만의 항체를 생산하기 위하여, 본 발명에서 설명되는 바와 같은 중쇄만의 항체 유전자좌의 나머지 구성요소들과 재조합할 수 있는 한, 그들의 범위 내에 유도체, 상동체 및 이들의 단편들 또한 포함한다. D 및 J 유전자 세그먼트는 천연 소스로부터 유래될 수 있거나, 또는 당 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된, 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 합성될 수 있다. V, D 및 J 유전자 세그먼트는 재조합될 수 있고, 바람직하게는 체세포 변이를 수행할 수 있다.
D 및 J 유전자 세그먼트는, 바람직하게는 단일의 척추동물 종으로부터 유래된다. 이것은 어떠한 척추동물 종일 수 있으며, 바람직하게는 인간이다.
바람직하게는, VH 중쇄 유전자좌는 1개 내지 40개(2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30 또는 40개) 또는 그 이상의 D 유전자 세그먼트를 포함한다. 상기 D 유전자 세그먼트들은 어떠한 척추동물 종으로부터 유래될 수 있지만, 가장 바람직하게는, 상기 D 유전자 세그먼트들은 인간 D 유전자 세그먼트들(정상적으로 25개의 기능성 D 유전자 세그먼트들)이다.
바람직하게는, 각 VH 중쇄 유전자좌는 1개 내지 20개(2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20개) 이상의 J 유전자 세그먼트를 포함한다. 상기 J 유전자 세그먼트들은 어떠한 척추동물 종으로부터 유래될 수 있지만, 가장 바람직하게는, 상기 J 유전자 세그먼트들은 인간 J 유전자 세그먼트들(정상적으로 6개의 J 유전자 세그먼트들)이다.
각각의 VH 중쇄 유전자좌는 같은 D 및 J 유전자 세그먼트들을 포함할 수 있다. 택일적으로, 각각의 VH 중쇄 유전자좌는 D 및 J 유전자 세그먼트들의 상이한 조합들을 포함할 수 있다. 예를 들면, 각각의 VH 중쇄 유전자좌가 오직 하나의 V 유전자 세그먼트를 포함하고, 이 세그먼트가 각각의 유전자좌 내에서 동일한 경우, 생산적인 재배열을 얻는 기회를 더욱 최적화하기 위하여 각각의 유전자좌 내에서 D 및 J 유전자 세그먼트들의 상이한 조합들을 사용하는 것이 유용하다. 그러나, 각각의 VH 중쇄 유전자좌가 하나 이상의 상이한 V 유전자 세그먼트들을 포함하는 경우, 각각의 유전자좌 내에서 D 및 J 유전자 세그먼트들의 동일한 조합을 사용하는 것이 유용할 수 있다.
바람직하게는, VH 중쇄 유전자좌는 하나 이상의 V 유전자 세그먼트, 25개의 기능성 인간 D 유전자 세그먼트 및 6개의 인간 J 유전자 세그먼트를 포함한다.
중쇄 불변 지역을 암호화하는 각각의 유전자 세그먼트는, 상기 중쇄 불변 지역 유전자 세그먼트가 CH1 영역을 발현하지 않는다는 조건 하에, Cδ, Cγ1-4, Cμ, Cε 및 Cα1-2 클래스의 하나 이상의 중쇄 불변지역 엑손을 포함할 수 있다. 중쇄 불변 지역 유전자 세그먼트들은 바람직한 항체 클래스 또는 요구되는 항체 클래스들의 혼합물에 따라서 선별된다. 선택적으로, 이종성 중쇄 유전자좌는 Cμ- 및 Cδ-결핍이다.
따라서, 각각의 VH 중쇄 유전자좌는, 생체내에서 이펙터 작용을 제공하는(예를 들면, IgG, IgM, IgA, IgE 또는 IgD 또는 그들의 이소타입) 적어도 하나의 중쇄 불변 지역(이 때 각각의 불변 지역은 CH1 영역을 포함하지 않는다)을 암호화하는 유전자 세그먼트를 포함할 수 있다. 각각의 유전자좌는 하나의 특정한 불변 지역을 암호화하는 오직 하나의 유전자 세그먼트를 포함할 수 있다. 이는, 만약 어떤 이펙터 작용이 필요한 경우라면, 유용할 것이다.
또는, 각각의 유전자좌는 각각 다른 불변 지역을 암호화하는 하나 이상의 유전자 세그먼트를 포함할 수 있다. 이는, 만약 다양한 클래스의 중쇄만의 항체가 생산되도록 하는 경우와 같이 특정한 이펙터 작용이 필요한 경우라면, 유용할 것이다.
각각의 유전자좌는 동일한 불변지역-암호화 유전자 세그먼트(들)을 포함할 수 있거나, 또는, 각각의 유전자좌는 상이한 또는 상이한 조합의 불변 지역-암호화 유전자 세그먼트(들)을 가질 수 있다.
작동가능하게, 중쇄 불변 지역은, B 세포에서 V 유전자 세그먼트, D 유전자 세그먼트 및 J 유전자 세그먼트와 재조합할 수 있는, 천연의 유전자 세그먼트 또는 조작된 유전자 세그먼트에 의해 암호화된다.
각각의 중쇄만의 항체에 있어서, 중쇄만의 항체의 생성이 일어날 수 있도록 하기 위하여, 불변 지역은 CH1 영역 없이 발현된다. 위에서 설명한 바와 같이, VH 중쇄만의 항체의 불변 지역이 기능성 CH1 영역을 포함하지 않도록, CH1 엑손을 결실시킬 수 있다.
다가 결합 복합체들을 조작할 때, 클래스-특이적 중쇄 불변 지역의 도입은, 요구되는 기능성에 따른 생체 내 이펙터 작용의 치료적 이점을 제공한다. 또한, 개별적인 이펙터 지역들의 조작에 의해 기능성이 추가 또는 결실될 수 있다[23]. 따라서, IgG1 불변 지역 기능성의 존재는 생체 내에서 개선된 혈청 안정성을 제공하고, IgA 불변 지역 기능성의 도입은 병원체에 대한 개선된 점액성 기능을 제공할 것이다[24]. 중쇄 CH2 및 CH3 불변 영역의 존재는 천연 항체에서 보여지는 바와 같은 안정한 이합체화를 위한 기초를 제공하고, 번역 후 당화를 위한 인식 부위를 제공한다. 또한, CH2 및 CH3의 존재는 이특이적인(bispecific) 다가 복합체가 시약 및 진단시약으로 사용될 때, 2차 항체 인식을 가능하게 한다.
예를 들어, IgM 항체는 마크로파아지와 보체 경로의 활성화에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 그것의 결합 위치의 밀접한 근접성 때문에, IgM은 바이러스를 포함하는 병원체에 대한 높은 결합력을 가진다. 그러나, IgG 항체는 신속 면역검정 기술에 쉽게 사용될 수 있는데 반하여, IgM은 이러한 기술에 사용되기 어려운 것으로 알려져 있다. 이러한 용도를 위해, 바람직한 항체 클래스, 즉 IgG 또는 IgM을 선택하는 것이 유용할 것이다.
CH1이 결핍된 이종성 중쇄 Cγ 유전자좌의 전체 또는 일부의 발현은, 이종성 IgG 유전자좌 내에 존재하는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 이소타입에 따라, 일부의 또는 모든 IgG 이소타입을 선택적으로 생산할 것이다. 또는, 상기 중쇄는 Cε유전자를 포함할 수 있다. 또한, 결과의 IgE 분자는 치료에 사용될 수 있다.
또는, 선택된 항체들의 혼합물이 얻어질 수 있다. 예를 들어, 중쇄 불변 지역이 Cα와 Cμ 유전자를 포함할 경우, IgA와 IgM이 얻어질 수 있다.
바람직하게는, 중쇄 불변 지역은, 특히 중쇄만의 항체가 인간 치료용도에 사용되는 경우, 인간 기원이다. 중쇄만의 항체가 수의학적 목적으로 사용되는 경우, 중쇄 불변 지역은 수의학적 치료가 수행되어질 표적 생물 즉, 척추동물 또는 포유동물 유래인 것이 바람직하다.
발현되었을 때, 각 중쇄 불변 지역은 CH1 영역이 결여되어 있다. 바람직하게는, CH1 엑손이 결실된다. 선택적으로, Cμ 및 Cδ 불변 지역은 변이, 결실 또는 치환될 수 있다. 예를 들어, 기능성 CH1 영역을 가진 IgM의 존재는 B 세포 성숙을 저해하고, 결과적으로 동일한 유전자좌 내의 (CH1 결핍된) 중쇄만의 IgG의 생산적 발현이 제한된다.
본 발명에서 정의된 바와 같은 '중쇄 불변 지역 엑손('CH 엑손')'은 자연적으로 발생하는 척추동물 CH 엑손들, 특히 포유동물 CH 엑손들의 서열들을 포함한다. 이것은 클래스 특이적 방식으로 다양하다. 예를 들면, IgG 및 IgA는 자연적으로 CH4 영역이 결여되어 있다. 또한, 용어 "CH 엑손"은, 그것이 중쇄 불변 지역의 구성요소일 때, CH 엑손이 본 발명에서 정의된 바와 같은 기능성 중쇄만의 항체를 형성할 수 있는 한, 그것의 범위 내에 유도체, 상동체 및 이들의 단편들을 포함한다.
선택적으로, CH4 또는 다른 기능성 영역들은, 존재하는 경우, 세포 내 분비 과정, B 세포 성숙 또는 결과의 항체의 결합능을 저해하지 않는 범위 내에서, 도입유전자 내로 조작되거나, 결실될 수 있다.
중쇄 이펙터 분자들은 기능성 영역, 예를 들면, 카르복시-말단 CH4 영역이 없는 것으로 조작될 수 있고, 상기 조작은 세포 표면 어셈블리를 막는 분비 메카니즘에 영향을 주지 않고, 결과적으로 B 세포 성숙에 영향을 주지 않아야 한다. 예를 들어, 당화를 향상시키거나, 기능을 추가하기 위하여, 추가적인 특징들이 유전자좌 내로 조작될 수 있다.
따라서, 이종성 중쇄 유전자좌는, 필수적으로 정상적인 B 세포 성숙과 함께, 요구되는 항체 클래스(들)에 따라 중쇄만의 항체의 바람직한 클래스들 또는 이들의 혼합물을 생산하기 위하여 디자인된다. 카멜리드 V, D 및 J 유전자 세그먼트와 카멜리드 이펙터 지역들의 사용은, 확장된 CDR3 고리들과 같은 카멜리드 항체에 특이한 특징들을 갖는 카멜리드 항체들을 생산할 것이다. 인간 V, D 및 J 유전자 세그먼트들의 사용은 확장된 CDR3 고리가 결핍된 인간 중쇄만의 항체들을 생산할 것이다.
본 발명에서의 "VH 영역"은, 상기 정의된 바와 같이, D 유전자 세그먼트 및 J 유전자 세그먼트와 재조합되었을 때, V 유전자 세그먼트의 발현 산물을 의미한다. 바람직하게는, VDJ 재조합 및 체세포 변이의 결과로서, VH 영역은 개선된 항원 결합능을 갖는다. 카멜리드 종에 특이한 확장된 CDR3 고리의 존재 또는 부재에는 영향받지 않는다. VH 영역은 단량체로서 항원에 결합할 수 있다. 가용성 중쇄만의 항체 복합체의 일부로서 발현될 때, VL 영역과 결합할 가능성은 CH1 엑손의 제거에 의하여 배제되었다([25]참조).
또한, 단독의 VH 영역은 표적 치료 및 진단 목적을 위한 융합 단백질을 생산하기 위한 다양한 단백질 영역들, 예를 들어 톡신, 효소 및 조영제(imaging agent)와 함께 조작될 수 있다.
VH 영역 암호화 서열은 천연 소스로부터 유래될 수 있거나, 또는 당분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 합성될 수 있다.
VH 영역의 특성은 필요한 특징들을 갖는 서열들을 암호화하는 V, D 및 J 유전자 세그먼트들을 선별하거나 조작하는 것에 의하여 변경되거나 또는 개선될 수 있다. 상기에서 지적한 바와 같이, 39개의 기능성 인간 VH 지역들의 몇몇은 중쇄만의 항체의 생산에 적합하지 않을 수 있다. 선행기술에서 몇몇의 연구를 통하여, 다양한 항체 특성들을 개선하기 위한 시도가 이루어져 왔다[2629]. 특정 VH 지역의 특성들과 관련하여, Dolk 등[30]은, 비듬방지 샴푸와 연관성이 있는 거친 조건들에서 개선된 용해성을 보여주는 중쇄만의 항체를 생성시키기 위하여 파아지 디스플레이 기술들을 사용하였다.
형질전환 비-인간 포유동물은, 바람직하게는 토끼, 기니피그, 쥐 또는 마우스와 같은 설치류이다. 마우스가 특히 바람직하다. 또한, 염소, 양, 고양이, 개 또는 다른 동물과 같은 대체 포유동물들이 적용될 수 있다. 바람직하게는, 포유동물은 마우스이다.
바람직하게는, 형질전환 비인간 동물은 확립된 난세포 주입 기술만을 사용하여 생성된다. 또는, 기술이 확립된 경우, ES 세포 기술 또는 클로닝을 사용할 수도 있다.
유리하게, 포유동물에 내생적인 항체 중쇄 유전자좌 및 선택적으로 경쇄 유전자좌는, 본 발명의 방법에 따라, 중쇄만의 항체가 발현될 때, 결실 또는 사일런싱(silence)된다.
본 발명의 상기 측면들에서 설명된 것과 같은 중쇄만의 항체를 생성하는 방법들은, 항체들의 소스와는 다른 기원인 척추동물 종에 대한 항체 투여를 통해 투여된 항체들에 대항하여 종종 면역 반응을 일으키는 것과 같이, 인간 치료용 항체 생산에 특히 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 얻어진 항체는, 이들이 실질적으로 단일의 또는 공지된 클래스이고, 바람직하게는 인간 기원이라는 점에서 종래 방법에 의하여 얻어진 항체들보다 나은 이점을 갖는다. 항체는, 생체 내에서의 VDJ 재조합 및 친화도 성숙의 조합에 의하여 고친화성을 갖게 된다.
따라서, 본 발명의 추가적인 측면은, 상기에서 정의한 바와 같은 하나 이상의 이종성 VH 중쇄 유전자좌를 포함하는 형질전환 비-인간 포유동물을 제공하는 것이다. 바람직하게는, 형질전환 비-인간 포유동물은 경쇄를 포함하는 항체를 생산하는 능력이 감소되도록 조작될 수 있다.
항체 생산 세포는 본 발명에 따른 형질전환 비-인간 포유동물로부터 유래될 수 있고, 예를 들어, 본 발명에서 정의된 것과 같은 중쇄만의 항체의 생산을 위한 하이브리도마의 제조에 사용될 수 있다. 추가적으로 또는 택일적으로, 핵산 서열들은 본 발명에 따른 형질전환 비-인간 포유동물들로부터 분리될 수 있고, 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여, VH 영역 중쇄만의 항체 또는 이들의 이특이적/이기능성 복합체들을 생산하기 위해 사용될 수 있다.
택일적으로 또는 추가적으로, 항원 특이적 중쇄만의 항체는 본 발명에 따른 형질전환 비인간 포유 동물의 면역화에 의하여 생성될 수 있다.
따라서, 본 발명은, 또한, 상기한 형질전환 비-인간 포유동물을 항원으로 면역화하여 중쇄만의 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 항체들 및 그들의 단편들은 분리될 수 있고, 특성화될 수 있으며, 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 잘 정립된 방법들을 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 항체들은, 특히 PCT/GB2005/00292에 설명된 방법들에 사용된다.
이하, 본 발명은, 이하의 도면을 참조하는 상세한 설명에 의하여, 단지 예시적으로, 설명될 것이다.
도 1: 형질전환 마우스를 생성시키는데 이용되는 DNA 단편들의 개략도. 2개의 라마 VHH 엑손이 인간 중쇄 다양성(D) 유전자 세그먼트 및 인간 중쇄 연결(J) 유전자 세그먼트, 이어서 Cμ, Cδ, Cγ2 및 Cγ3 인간 불변 지역 유전자들 및 인간 중쇄 Ig3'LCR에 연결된다. 구조체 MGΔ 및 GΔ내의 Cγ2 및 Cγ3 유전자, 또는, 구조체 MΔGΔ내의 Cμ로부터 CH1 엑손을 완전 결실시켜, 인간 Cγ2 및 Cγ3 유전자들을 변형시켰다. 같은 방향으로 2개의 Lox P 부위(붉은색)가 존재함으로써, Cre 매개 재조합에 따라 Cμ 및 Cδ 유전자들의 제거가 가능하게 된다. Frt 부위(녹색)가 존재함으로써, Flp 매개 재조합에 의한 다-복사체(multi-copy) 도입유전자 어레이(array)로부터 하나의 복사체 형질전환 마우스의 생산이 가능하게 된다.
도 2: 패널 A: 다양한 기관들에서의 총 세포중의 B220/CD19 양성세포들의 백분율로서 표시된, B 림프구의 유세포분석(flow cytometric analysis)의 표.
패널 B: BM 내의 wt, μMT, MGΔ/μMT, MΔGΔ/μMT 및 GΔ/μMT 마우스의 B 세포 수의 유세포분석. 전면 스캐터링 및 측면 스캐터링에 기초하여 림프세포들은 게이팅(gate)되었고, B220 및 인간 IgM 또는 IgG의 표면발현을 플롯팅하였다. 데이터는 점플롯(dot plot)으로 나타낸다. MGΔμMT 마우스에 대하여, B220+ 분획을 게이팅시키고, 인간 Igμ 및 Igγ중쇄의 세포내 발현에 대하여 분석하여, 막대그래프 오버레이(붉은 라인들)로 나타내고, 대조군으로서 μMT 마우스 유래의 B220+ 세포들을 배경 염색(검은 선)으로 나타내었다.
패널 C: MΔGΔ 또는 GΔ 도입유전자의 발현이 pre-BCR 및 BCR 기능을 회복(rescue)시킨다. μMT 마우스 유래의 총 CD19+ 분획(pro-B 세포)들 내의 지시 마커들, CD19+ 표면 IgM-분획들(pro-B/pre-B 세포) 및 야생형 마우스 유래의 CD19+ 표면 IgM+ 분획들(B세포) 내의 지시마커들, MΔ-GΔμMT 마우스 유래의 CD19+ 표면 인간 IgM+ 분획들(B세포) 및 GΔμMT 마우스 유래의 CD19+ 표면 인간 IgG+ 단편(B 세포) 내의 지시 마커들의 발현 프로파일. ic-Igκ=세포내 Igκ 경쇄. 유세포분석 데이터는 막대그래프로 나타낸다. 나타낸 테이터는 각각의 그룹내에서 실험한 3~8마리의 동물들의 대표값이다.
패널 D: VDJ 재조합을 나타내는, 인간 Cγ2 프라이머와 조합된 VHH1 및 VHH2 특이적 프라이머들을 사용하여 BM cDNA로부터 얻어진 PCR 산물의 서열배열. 서열들은 GΔ으로부터 유래된 것이다. 녹색은 서열 동일성을 나타낸다.
도 3: 패널 A~E: 5개의 인간 GΔ 유전자좌의 복사체의 DNA FISH.
패널 A: LCR(적색)을 포함하는 유전자좌의 절반 및 J 지역(녹색)에 대한 VHH를 운반하는 유전자좌의 절반에 의하여 플랭크된 GΔ 유전자좌의 5개의 완전한 복사체(1~5)를 갖는 GΔ 계열1 형질전환 마우스의 폐세포로부터 유래된, 신장된 염색질 섬유.
패널 B: 하나의 복사체가 재배열된 경우(흰색 화살표)의 GΔ 계열1 B세포로부터 유래된 하이브리도마(G20)의 신장된 염색질 섬유 FISH.
패널 C: LCR 프로브(적색)를 갖는 하이브리도마 T1의 비-신장된 DNA FISH.
패널 D: VHH 및 D(녹색) 사이에 프로브를 갖는 하이브리도마 T1의 비-신장된 DNA FISH.
패널 E: 패널 C 및 E의 오버레이. T1은, 적색신호의 손실이 없는 것에 비하여 4개의 녹색 신호의 손실로 보여지는 4개의 재배열을 갖는다.
패널 F: GΔ 형질전환 마우스 내의 대립유전자 형질 배제가 보존된다. 뮤린 표면 또는 세포내(ic) μ중쇄 및 표시된 마우스 유래의 총 BM CD19+세포 분획들 상 의 형질전환 인간 IgG의 유세포분석. 데이터는 점플롯으로 나타내었고, 표시된 4분원내의 세포들의 백분율을 나타내었다. 나타낸 데이터는 각각의 그룹 내에서 시험된 4마리의 마우스의 대표값이다.
도 4: wt, μMT, GΔ, MΔGΔ 및 MGΔ 마우스의 비장 내의 B 세포 수의 분석. 나타낸 데이터는 각각의 그룹 내에서 시험된 4~8마리의 마우스의 대표값이다.
패널 A: 상부; B220에 대비되는 마우스 IgM, 인간 IgG, 인간 IgM에 대해 염색된 비장 세포들의 FACS 데이터. 하부; 비장 내의 B세포 수의 유세포분석. 전면 스캐터링 및 측면 스캐터링에 기초하여 림프세포를 게이팅하였고 B220 및 표시된 Ig(상부) 또는 CD21/CD23 프로파일의 표면발현을 점 플롯으로 표시하였으며, 표시된 게이트들 내의 세포들의 백분율을 나타내었다. CD21lowCD23low: 미성숙 B 세포; CD21+CD23+: 낭포성 B 세포; CD21highCD23low: 가장자리 지역 B세포들.
패널 B: wt, μMT, GΔ/μMT, MΔGΔ/μMT 및 MGΔ/μMT 마우스의 비장의 조직구조. 면역구조화학적 분석; 5㎛ 동결 구획들은, B 세포들에 대하여는 항- B220(청색)으로 염색되었고, 수지상(dendritic) 세포들에 대하여는 항-CD11c/N418(갈색)로 염색되었다. 화살표는 MGΔ 비장들 내의 B 세포들의 소집단의 위치를 가리킨다.
패널 C: CDR1 및 CDR2 지역 내에서 형질전환 유전자좌가 초변이됨을 보여주는, 인간 Cγ2 프라이머와 조합된 VHH1 및 VHH2 특이적 프라이머들을 사용한 Payer's 패치 cDNA로부터 얻어진 PCR 산물의 서열배열. 서열들은 CH1 결실이 있는 형질전환 유전자좌 GΔ으로부터 유래된 것이다.
패널 D: 상부; 항-CD19 및 항-B220으로 염색된 비장세포들의 FACS 데이터. 하부 왼쪽; FlpeR 형질전환 계열의 배양에 의한 생체 내 F1p 재조합의 개략도 및 5개의 복제 GΔ 계열1로부터 유래된 단일 복제 재조합체의 비장세포들에 대한 FACS 데이터. 하부 오른쪽: MGΔ 계열을 CAGCre 형질전환 계열로 배양하는 것에 의한 생체 내 Cre 재조합의 개략도 및 직접적으로 생성되는 본래의 GΔ 계열 내에서 보여지는 바와 같은 B 세포 회복을 나타내는, 재조합체의 비장세포들에 대한 지지 FACS 스캔 데이터.
도 5: GΔ/μMT(패널 A) 및 MΔGΔ/μMT(패널 B) 형질전환 계열 내에서의 κ경쇄 재배열의 부재를 보여주는 서던 블롯. wt 마우스 및 2마리의 GΔ형질전환 마우스 또는 4마리의 MΔGΔ 형질전환 마우스 유래의 간 DNA(L) 및 B 세포 DNA(B)가 Hind Ⅲ로 소화되었고, 방사성 동위원소 32P 로 표지된 Jκ 프로브 및 탄산탈수효소 Ⅱ(CAⅡ)프로브로 탐침되었다. 4kb 밴드에 혼성화되는 CAⅡ 프로브는 부하(loading) 대조군으로서 사용되었다. κ생식계열 배열을 보여주기 위하여 간 DNA를 사용하였다(2.8Kb 밴드). wt B 세포만이 2.8kb 단편의 감도 감소(간과 비교해 볼 때, 신호의 30%만 남음)로 측정되는 κ유전자좌 재배열을 나타낸다.
도 6: 비-환원(A) 및 환원(B~G) 조건하에서 행해진 μMT 배경에서, 6개의 다른 GΔ계열(A, B), 4개의 다른 MΔGΔ계열(C) 및 2개의 다른 MGΔ계열들(E~G)의, 프롯(Prot) G 또는 콘카발린 정제된 혈청 샘플들. 형질전환 인간 IgG(패널 B, F) 및 IgM(패널 C, D)의 크기는 CH1 결실 및 경쇄의 부재와 일치한다. 마우스 κ경쇄는 정상크기였다(G). 인간 혈청은 양성 대조군으로 사용되었다.
패널 D: 비-환원 조건하에서 인간 IgM 대조군에 혼합한 후의 MΔGΔ 혈청의 수퍼로즈 6 크기 분획화. 각각의 분획은 환원 조건하에서 겔 전기영동에 의하여 분석되었다. 수퍼로즈 6 칼럼으로부터 모아진 분획들은 왼쪽(높은 MW)부터 오른쪽(낮은 MW)까지의 분포이다. 대조군들은 인간 혈청 단독(첫번째 레인(lane) 왼쪽) 및 인간 IgM 대조군 혈청내에 혼합하기 전의 마우스 혈청(레인 MΔGΔ 혈청)이다. 크기 마커가 표시되었다.
도 7: 패널 A: 테타너스 독소(HSP70, rtTA 및 인간 TNFα)에 특이적인 단일 클론 항체 cDNA들의 서열들. 가장 위에 있는 서열은 생식계열 VHH2 서열이다. CDR 1, 2 및 3과 힌지 지역들은 서열 위에 표시되어 있다. 상이한 이소타입들 및 클래스들은 오른쪽에 상이한 색상들로 표시되어 있다. 사용되는 J 지역들은 오른쪽에 표시되어 있다.
패널 B: 상이한 중쇄만의 항체들을 사용한 웨스턴 블롯의 예들(하이브리도마, 세라(sera) 및 sdAb). 왼쪽 패널은 각각 1/100 및 1/250로 희석된 항-rtTA 혈청 및 하이브리도마 배지. 중간패널은 각각 1/200 및 1/100로 희석된 wt 및 GΔ 마우스의 항 DKTP 혈청. 오른쪽 패널은 B. 페르투시스(B. Pertussis ) 항원을 포함하는 백신(DKTP) 또는 이를 결여한 백신(DTP, 정제된 B. 페르투시스 항원을 구입할 수 없었기 때문)에 대항하는 항 B. 페르투시스 sdAb.
패널 C 및 D: 세포질 내에서 마커 단백질을 발현하는 것에 의하여 rtTA의 존 재에 반응하는 마커 플라스미드로 추가적으로 형질감염된 Tet-on 세포 계열중 하나의 면역 염색[51]. 패널 C는 rtTA(녹색)를 발현하는 핵을 나타낸다. 패널 D는 rtTA에 반응하여 세포질(적색) 내에서 마커 단백질의 독시시클린 유도된 발현, 및 DAPI(청색)에 의한 세포의 핵 염색을 나타낸다.
패널 E: 항 rtTA 항체의 BiaCore 분석의 예. 친화도가 표시되어 있다.
도 8: 패널 A: 카멜리드 유사 접합 변이를 갖는 Ig 유전자좌의 개략도. 2개의 인간 IgG 불변 지역들(Cγ2 및 Cγ3)은 접합 G+1을 A+1로 변경하는 것에 의하여 처음에 변이되었고, 이로 인하여 Gγ2-S 및 Gγ3-S로 나타낸 카멜리드 IgG HCAbs[5] 내에서 CH1 엑손 건너뛰기(skipping)가 발생한 것으로 생각된다. 상기 유전자좌는 인간 D 및 JH 지역의 2개의 라마 VHH 지역 전부 및 인간 Cμ, Cδ 및 Cγ2 및 Cγ3 및 LCR을 포함하였다(본문참조). 이러한 유전자좌들은 μMT 형질전환 마우스내로 도입되어, 인간 유전자좌의 발현을 위해 분석되었다.
패널 B: GS 마우스 유래의 골수(BM) 인간 IgG cDNA의 서열화는 상이한 인간 D 및 J 세그먼트와 재조합된 VHH 양쪽 모두가 Cγ2 불변 지역으로 전사되었음을 보여주었다. 그러나, CH1 엑손은 여전히, 접합해제된 최종의 16bp를 보존하며 존재하고 있었다. 진행 과정 동안, CH1 엑손내의 동일한 숨겨진 접합부위는, 인트론 1의 위치 4에서의 A에서 G로의 전이로 인한 백혈병환자에게서 보고되었다[31]. MGS 또는 GS 계열들 중 어느 것도 μMT 마우스내에서 B세포 성장(도시하지 않음)을 회복시키지 않았다. 마우스 B 세포 전사/번역 장치가 재배열된 낙타(dromedary) VHH-γ 2a[34, 60]를 처리할 수 있음에도 불구하고, 우리의 데이터는 G에서 A로의 변이에 더하여 다른 특징들이 CH1 엑손 건너뛰기를 위하여 중요하다는 것을 보여준다.
도 9: 실시예 3 및 4에 나타낸 바와 같은, 다양한 유전자좌 상의 인간 VH 지역들의 클로닝의 개략도.
도 10 및 11: 복수의 VH 유전자 세그먼트, 전체 D 지역, 전체 JH 지역, Cγ2, Cγ3 및 Cx 지역들 및 3'LCR을 포함하는 중쇄 유전자좌의 예들.
도 12: 염색체 1 상에 집합된 하나의 유전자좌 및 염색체 8 상의 하나의 유전자좌를 갖는 염색체도를 보여준다.
실시예 1 - 중쇄만의 항체 유전자좌는 마우스 내에서 완전히 기능적이며, 대립유전자 형질 배제에 민감하다.
상기에서 논의한 바와 같이, Janssen 등[15]은 형질전환 마우스내에서 중쇄만의 항체를 유도하기 위한 방법들을 개발하였다. 당업자는 본 발명에 참고문헌으로 포함된 Janssen 등[15]을 참고하여, 상기 방법들 및 실험들을 더욱 자세히 알 수 있을 것이다.
방법
구조체( constructs )
표준 방법들을 사용하여, Lama Glama의 말초 혈액 세포로부터 게놈 코스미드 라이브러리를 만들었다. 두개의 상이한 생식계열 VHH는, 그들의 서열, 종결 코돈이 없는 오픈 리딩 프레임, 및 Lefranc 기수법[32]에 따른 42, 50 및 52 위치에서의 친수성 아미노산 코돈들의 존재, 및 하나는 49 위치에 친수성 아미노산이 있고, 다른 하나는 49 위치에 친수성 아미노산이 없는 것을 기준으로 하여 선택되었다. 하나는 IGHV1S1(기탁번호 AF305944)와 동일하고, 다른 하나는 IGHV1S3(기탁번호 AF305946)와 94%의 상동성을 가진다. 2개의 클론이 인간 게놈 Pac 라이브러리 RPCI-11(BACPAC Recource Center, USA)로부터 선별되었다: 인간 중쇄 D 및 J 지역, Cμ 및 Cδ를 포함하는 클론 1065 N8과, Cγ3 유전자를 포함하는 클론 1115 N15. 상이한 인간 게놈 라이브러리(Incyte Genomics, CA, USA)로부터의 Bac 클론 11771은 Cγ2 유전자 및 Ig 중쇄 LCR[33]의 소스로서 사용되었다. 표준 기술을 사용하여, Cγ3와 Cγ2 유전자는 각각 pFastBac(Invitrogen) 내로 서브클로닝되었다. 상동성 재조합에 의하여, 하나의 점 변이(G에서 A로)[34] 또는 CH1 엑손의 완전 결실이 수행되었다. 유사하게, frt 및 lox P 부위가 Cμ 스위치 지역의 전면에 도입되었고, 두번째 lox P 부위가 Cγ2 스위치 지역의 전면에 위치하여, MGS 또는 MGΔ가 생산되었다.
GS 또는 GΔ 구조체를 얻기 위하여, 두 개의 라마 VHH 유전자와, 그에 이어서 인간 D 및 J 중쇄 지역, Cμ, Cδ 및 변형된 인간 Cγ2 및 Cγ3 유전자 및 3'LCR을 포함하는 MGS 또는 MGΔ 벡터(도 1)를 16 294 Cre E.coli 균주[44] 내로 도입하여, cre 매개 재조합을 통하여 GS 또는 GΔ유전자좌를 수득하였다. 상동성 재조합을 통하여 CμCH1 지역의 결실에 의해 MGΔ로부터 MΔGΔ이 얻어졌다.
형질전환 마우스의 생산, 육종 및 유전자형( genotyping )
벡터 서열로부터 220 Kb MGS 또는 MGΔ 또는 MΔGΔ 단편들, 150 Kb GS 또는 GΔ 단편들(도 1)이 정제되었고, 수정된 FVB X B16/μMT-/- 난자를 2ng/㎕의 농도로 전핵 내로 주입하였다.
형질전환 유전자좌는 5'와 3' 말단 프로브를 사용하여, 꼬리 DNA(tail DNA)의 서던 블롯 분석에 의해 완전성(integrity) 및 복사체의 수에 대해 검사되었다. 형질전환 μMT-/-파운더(founder)는 μMT-/-백그라운드에서 계통별로 육종되었다. 유전자형 분석은 다음의 프라이머들을 사용하여, PCR(45초 동안 94℃에서 열변성 30회, 30초 동안 60℃에서 어닐링, 1분 40초 동안 72℃에서 신장(extension))에 의해 실시하였다: HLL-MD를 위하여 Asp5'IgM fw: 5'-GCGGGTACCGAATGGTGGCAGGGATGGCTC-3'(서열번호:1)와 Asp 3'IgG2 rv: 5'-CGCGGTACCCTGCGGTGTGGGACAGAGCTG-3'(서열번호:2)의 조합, 또는 MGS를 위하여 상기 Asp5'IgM fw와 Asp3'IgM rv: 5'-CGCGGTACCACGGCCACGGCCACGCTGCTCGATTC-3'(서열번호:3)의 조합, 및 μMT 유전자형을 위하여 MIGMEMBINTRON1:fw: 5'-CCAGTCAATACTACTCGCTAAGATTC-3'(서열번호:4)와 MIGMEMBEXON1 rv: 5'-CAGTGGTCCACAGTTTCTCAAAGC-3'(서열번호:5)의 조합.
RT - PCR
Ultraspec RNA 분리 시스템(Biotecx Laboratories, Houston)을 사용하여 총 RNA를 분리하였다. 역전사효소(Superscript Ⅱ, Life technology) 및 올리고(dT) 프라이머를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 다음의 프라이머들을 사용하여 PCR이 수 행되었다: LVHHfw: 5'-AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGG-3'(서열번호:6)와, HINGEIgG2rv: 5'-CACTCGACACAACATTTGCGCTC-3'(서열번호:7) 또는 hIgMCH2rv: CACTTTGGGAGGCAGCTCAGC-3'(서열번호:8)의 조합. 30초 동안 94℃에서 열변성 30회, 30초 동안 60℃에서 어닐링, 1분 동안 72℃에서 신장에 의해 증폭되었다. PCR 산물은 pGEM T 이지 벡터(Promega)내로 클로닝되었고, T7 또는 SP6 프라이머를 사용하여 서열화되었다.
유세포 분석( Flow Cytometric Analysis )
단일 세포 현탁액은, 이미 설명된 바[45]에 따라서, PBS 내의 림프 기관들로부터 제조했다. 약 1×106 세포들을 4℃에서 30분간 96웰 플레이트 내의 PBS/0.5% BSA(bovine serum albumin) 내에서 항체와 함께 배양했다. 세포들을 PBS/0.5% BSA로 2회 세척했다. 각각의 시료에 대하여, FAC Scan 분석기(Becton Dickinson, Sunnyvale, CA)를 사용하여 3×104 이벤트를 기록했다. FACS 데이터를 셀 퀘스트 버전 1.0(Cell Quest version 1.0) 컴퓨터 소프트웨어를 사용해 분석했다. 4-색상 분석은 벡톤 디킨슨 FACS 칼리브(Becton Dickinson FACS Calibur) 상에서 실시되었다. 사용된 대부분의 항체들은 이미 설명되어 있다[36]; FITC 콘주게이션된 항 인간 IgG 및 항 인간 IgM은 Sigma(Zwijndrecht, NL)에서 구입하였다.
Ig 유전자 재배열 분석
wt 마우스 MΔGΔ 및 GΔ 형질전환 마우스의 비장 및 간으로부터 단일 세포 현탁액들이 만들어졌다. 제조자의 지시에 따라 Automacs 분리기 상의 MACS CD45(B220) MicroBeads(Miltenyi Biotec, Germany)를 사용하여 B 세포들을 확실하게 분리하였다 ~90% 순도[37]. 게놈 DNA는 HIND Ⅲ 소화되었고, Hybond 나일론 필터상에 블롯팅되었다. 상기 필터는 방사성 동위원소 32P로 표지된 Jκ 프로브(Jκ1 및 Jκ5 지역에 걸쳐 게놈 DNA으로부터 PCR 증폭에 의하여 얻어짐) 및 방사성 동위원소 32P로 표지된 탄산탈수효소 Ⅱ(CAⅡ) 프로브에 의하여 혼성화되었다. κ 생식계열 배열(2.8Kb 밴드)의 신호를 보여주기 위하여 간 DNA을 이용하였다. 4kb 밴드에 혼성화된 CAⅡ 프로브가 부하대조군으로 사용되었다. 필터들은 Tyfoon 9200 (Amerscham Biosciences) 상기 스캐닝되었다. 생식계열 Jκ 밴드의 강도는 Image Quant 5.2 소프트웨어를 사용하여 정량되었고, 다양한 재배열 이벤트들의 증폭을 위하여 하이브리도마로부터의 게놈 DNA상에서 사용된 PCR 프라이머는 다음과 같았다:
Figure 112008060083829-PCT00002
DNA FISH 분석
타겟 DNA의 제조: 단일클론 하이브리도마 세포들이 DMEM/10%FCS에서 배양되었고, Heiskanen[38]에 의하여 설명된 바와 같이 아가로즈내에 매입되었다. GΔ 형질전환 계열 1 마우스의 간이 모아졌고, 단일 세포 현탁액이 만들어졌다. 매입된 세포들은 프로테이나아제 K 및 RNA 분해효소 H로 처리되었다. 기계적으로 신장된 DNA는, 다른 슬라이드의 엣지 및 마이크로파 오븐을 사용하여 폴리-L-리신 슬라이드(Sigma) 상에서 제조되었다.
프로브: GΔ 도입유전자의 재배열 및 비-재배열된 복사체를 검출하기 위하여, DNA 단편들이 정제되었다. VHH와 D 사이의 지역을 혼성화하기 위한 2.3kB SpeI 및 3.6kB SpeI-BssHII 단편, 및 5.9kB BamHI-SpeI 단편, 또는 LCR 검출을 위한 IgH 3'LCR(16kB)을 포함하는 낮은 복사체 Bluescript 플라스미드. 상기 프로브들은 비오틴-11-dUTP(Roche) 또는 디곡시제닌-11-dUTP(Roche)로 nick-번역에 의하여 표지되었다. 슬라이드상에 프로브들을 피펫팅하기 전에, 프로브들은 90℃에서 5분간, 얼음 위에서 5분간, 37℃에서 45분간 열변성시켰다.
원위치(in-situ)에서의 혼성화: 혼성화 혼합물은 50% 포름아미드, 2 x SSC, 연어 정자 DNA(200ng/㎕), 5 x Denhart's, 1mM EDTA 및 50mM 인산나트륨을 포함하였고, pH 7.0이었다. 슬라이드 상에 25㎕ 혼합물을 피펫팅하고, 24 x 32-mm 커버 슬립으로 덮어, 프로브들의 혼성화를 수행하였다. 상기 프로브들 및 타겟 서열들을 열변성하기 위하여, 슬라이드들을 2분간 80℃ 열판에 올려놓았다. 상기 프로브들은 습실내(가습제는 50% 포름아미드, 2 x SSC)에서, 37℃에서 밤새 혼성화시켰다. 혼성화 이후, [39]에서 설명된 바와 같이 세척을 하였다.
합텐-표지된 프로브들의 면역학적 검출: 디곡시제닌 프로브가, 양(sheep)-항-디곡시제닌(1:500, Sigma), 플루오레세인-콘주게이션된 토끼-항 양(1:500, Sigma) 및 플루오레세인-콘주게이션된 염소-항-토끼(1:500, Sigma)를 이용하여 검출되었 다. 비오틴 프로브는 Texas Red-콘주게이션된 아비딘(1:500, Sigma) 및 비오틴 콘주게이션된 염소-항-아비딘(1:500, Boehringer)을 이용하여 검출되었다. 이 단계는 2번 반복되었다. 모든 배양 및 세척은 [48]에서 설명된 바와 같이 수행되었다. 염색 후, 슬라이드들을 실온에서 각 단계별로 5분씩 등급화된 일련의 에탄올(70, 90 및 100%)로 탈수시켰다. 세포들 및 DNA는 25㎕ 항-퇴색제 함유 배지 Vectashield(Vector Laboratories)에 매입하였다. 100배율 관찰을 사용한 Leica DMRBE 형광현미경으로 관찰하였다.
면역화 및 하이브리도마 생산
8주된 마우스를, 스페콜 보조제(IDDLO, Lelystadt, NL) 또는 미리 제제화된 DKTP 백신과 함께 5~20㎍의 항원을 0, 14, 28, 42일째에 피하주사하고, 50일째에 복강내 주사하여 면역화시켰다. 혈액을 0, 14 및 45일째에 취했다. 56일째에, 제조자의 지시서에 따라, ClonalCellTMHY 키트(StemCell Technologies, Canada)를 사용하여, Sp2-O-Ag14 골수종세포 계열(R. Haperen으로부터 기증)과 비장세포들을 융합시켰다. DKTP 백신은 네덜란드 백신 연구소(Bilthoven, NL)로부터 얻은 것이었다.
sdAB 라이브러리 구성 및 스크리닝
전체 RNA는, Ultraspec RNA 분리 시스템(Biotecx Lab. Inc., Houston., Texas, USA)을 사용하여, DKTP 면역화된 단일 복제 GΔ 마우스 및 TNFα 면역화된 MΔGΔ 마우스의 비장으로부터 분리했다. cDNA는 올리고(dT) 프라이머를 사용하여 만들었다. VHHDJ 단편들을 암호화하는 DNA 단편들은 특정 프라이머들을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다: hIgG2hingrev 프라이머(5'- AATCTGGGCAGCGGCCGCCTCGACACAACATTTGCGCTC-3'(서열번호:15))와 조합된 vh1 back Sfi I 프라이머[40~42], 또는 CH2huIgMrev 프라이머(5'-TGGGACGAAGACGGCCGCTTTGGGAGGCAGCTCGGCAAT-3'(서열번호:16)). 증폭된 VHHDJ(~400bp)는 Sfi I/Not I 소화되었고, 겔 정제되었으며, Sfi I/Not I 소화된 파아지미드 pHEN 유래 벡터내로 클로닝되었다. TG1 일렉트로-컴피턴트(electro-competent) 세포들(Stratagene La Jolla, USA)내로의 형질전환으로 인간 단일 영역 항체 라이브러리를 수득하였다. 플라스틱(희석되지 않은 백신으로 코팅된 면역튜브) 또는 정제된 인간 TNFα(Biosource International, USA) 상에 흡착된 DKTP 백신 항원상에서의 패닝(panning)에 의해 2회의 선별이 수행되었다.
면역세포화학 및 웨스턴 블롯 분석
rtTA의 존재에 반응하는 마커 플라스미드로 형질감염된 tet-on 세포계열의 세포들을 슬라이드상에서 성장시켰다. 24시간 독시시클린 유도 후, 세포들을 4% 파라포름알데히드/PBS로 고정시켰고, 0.5% Triton-X-100/PBS내에서 침투시켰다. rtTA에 대한 HCAb는 1:50의 비율로 희석하여 사용되었고, 이어서 염소 항 인간-IgG FITC 염색이 이루어졌다(Sigma, 1:500 희석). 마커 단백질은 [51]에서 설명된 바와 같이 검출되었다. 웨스턴 블롯은 염소 항 인간 IgG-HRP(Sigma, 1/2500 희석), 인간 IgM-HRP(Sigma, 1/2500 희석)를 이용한 표준의 것이었다.
수퍼로즈 6 겔 여과
200mM KCl/20mM HEPES-KOH pH 7.9/1mM MgCl2/0.5mM EGTA/20% 글리세롤에서 평형화된 수퍼로즈6 10/30 칼럼을 갖춘 AKTA FPLC 장치(Amersham Bioscience, Piscataway NJ)를 사용하여, MΔGΔ 마우스 혈청 및 인간 대조군 혈청의 크기 분획화를 수행하였다. 100㎕/min의 유속으로, 500㎕의 분획들을 모아서, 100% 트리클로로아세트산으로 침전시키고, SDS-PAGE(환원조건하에서)로 분석한 후, 웨스턴 면역블롯분석을 행하였다.
BIAcore 측정
BIAcore 3000 표면 플라스몬 공명 바이오센서(Biacore AB, Uppsala, Sweden)상에서 실험을 수행하였다. 제조자에 의하여 공급된 표준 NHS-EDC 키트를 이용하여, 정제된 단백질을 CM5 센서 칩상에서 3000공명단위(RU, 임의의 결합 반응 단위)의 수준까지 고정시켰다. 항체들을, pH7.4의 10mM Heps, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 0.005% Tween 20내에서, 40㎍/㎖의 일정 유속으로, 상기 고정된 항원에 통과시켰다. 평형상태에서의 반응을 기록하였고, 제조자의 BIA 평가 소프트웨어를 사용하여, 평형해리상수를 얻기 위해 곡선접합법(curve fitting)을 사용하였다.
결과
카멜리드 유사 CH1 접합( splice ) 변이는 인간 중쇄 유전자좌내에서의 엑손 건너뛰기( exon skipping )에 불충분하다.
카멜리드내에서 HCAb(IgG2 및 IgG3)의 생성이 IgM+ 중간단계를 포함하는지의 여부는 알려져있지 않다. 그러므로, 우리는 우선 2개의 혼성 인간 유전자좌를 생성시켰는데, 하나의 유전자좌(MGS)는 인간 Cμ, Cδ, Cγ2 및 Cγ3 불변 지역을 가지고, 또 하나의 유전자좌는 다른 μMT 배경에서 인간 Cγ2 및 Cγ3(도 1)만을 가진 다[43]. Cγ지역들은, 우선 카멜리드 CH1 접합 변이[5]를 포함하도록 돌연변이되었다[5]. μ쇄 유전자[43]의 막전위 영역 결실로 인하여 거의 완전하게 B 세포를 결여하는 μMT 동물들이, 막 IgM의 부재하에서 기능성 IgG, IgA 및 IgE를 생산하는[44~46], 적은 수의 B 세포 숫자를 가지고 있다는 사실이 밝혀졌고, 이는 (몇몇의) B 세포들이 IgM 표면발현 없이 성장되었다는 것을 시사하기 때문에, MGS를 생성시켰다. VH 용해성을 향상시키기 위하여 인간 VH 영역을 변이시키는 것[47, 48] 대신, 2개의 라마 유래의 VHH들을 도입시켰다. 카멜리드 VHH 지역들은 위치 42, 49, 50 및 52에 많은 특징적 아미노산들을 포함한다. 첫번째 VHH인 VHH1은 이들 VHH 특징적 아미노산들 모두를 포함하지만, 이 원리입증실험에서 용해성의 중요성을 시험하기 위하여, 다른 하나인 VHH2는 위치 49에서, 이러한 중요한 "용해성" 아미노산들 중 하나가 결여(Glu(E) 대신 Gln(Q))되어 있다. 위치 49가 가변 경쇄(VL) 접합[21]에 추가적으로 중요한 것으로 여겨지므로, 우리는 위치 50(Arg,R)보다는 위치 49를 선택하였다. 또한, 상기 유전자좌는 5개의 인간 중쇄 D 및 J 지역들 모두를 포함하였고, 유전자좌의 3'말단에서 유전자좌 조절 지역(LCR)을 포함하였다(도 8). 놀랍게도, 접합변이로는 형질전환 마우스내에서의 올바른 CH1 엑손 건너뛰기를 유도하지 못했고, 인간 Ig 발현이 결핍되지 않았다(도 8).
CH1 지역이 결핍된 인간 유전자좌를 포함하는 형질전환 마우스의 분석
CH1 접합 문제를 극복하기 위하여, 3개의 신규의 구조체를 생성시켰는데(도 1), 3개 모두는 CH1이 결실된 Cγ2 및 Cγ3을 포함하고, 하나(MGΔ)는 Cμ 및 Cδ를 가지며, 다른 하나(GΔ)는 Cμ 및 Cδ를 갖지 않으며, 나머지 하나(MΔGΔ)는 CH1이 결실된 Cμ 세그먼트를 가진다. 다른 복제수(1~5개의 복사체)를 갖는, 3마리의 MGΔ, 6마리의 GΔ 및 4마리의 MΔGΔ 형질전환 마우스 계통들이 μMT 배경에서 얻어졌다. B 세포 발달은 골수(BM) 및 비장에서 분석되었다. 다른 복제수를 갖는 마우스도 같은 결과를 나타내었다.
GΔ 및 MΔGΔ의 발현은 μ MT 마우스에서의 B 세포 성장을 돕는다.
GΔ 및 MΔGΔ 구조체가 효율적으로 B 세포 성장을 돕는데 반하여, MGΔ 마우스는 μMT 배경에서 B 세포 성장을 돕지 못하였다. B220/CD19 양성 세포들의 회복은, 복제수와 무관하게, 다른 림프구 구획들에서 30~100%였다(도 2A). 이는 인간 IgM 또는 인간 IgG 염색에 대하여 B220을 사용하는 골수의 유세포에 의하여 확인되었다(도 2B). MΔGΔ 마우스는, 야생이나 또는 μMT 마우스에는 없는, 골수에서 인간 IgM을 생산하는 세포를 포함한다. 적절하게는, 이 세포들은 인간 IgG를 포함하지 않기 때문에 클래스 교환이 일어나지 않는다. GΔ 마우스는 B 세포를 발현하는 인간 IgG만을 포함한다. MGΔ 마우스는, 세포 표면에서 인간 Ig를 발현하지만, 흥미롭게도 B220 세포들의 일부는 IgG가 아닌 세포내 IgM을 발현하는 B 세포를 포함하더라도 아주 적은 수로 포함한다(도 2B). MΔGΔ 및 GΔ 마우스와 대비하여(아래 참조), MGΔ 마우스는 마우스 Ig 경쇄를 발현한다(도 6G). 이러한 결과는 다른 구조체들내의 Cμ 및 Cγ 유전자들이 발현된다는 사실을 보여주고, 이는 VHH 기반 항체의 세포 표면 발현을 위하여 CH1의 부재가 매우 중요하다는 사실을 강력하게 제시하여 준다.
골수 내에서의 B 세포 성장기간동안에는 , 인간 HCAb IgG 및 IgM 이 기능적으 로 뮤린 ( pre -) BCR 을 대체한다.
휴지상태인 작은 pre-B 세포내로 큰 순환의 성장이 진행하는 동안, 특정 세포 표면 마커의 발현이 pre-BCR-의존 방식으로 하향조절된다[36]. 기능적으로 pre-BCR을 대체하는 인간 HCAb의 능력을 연구하기 위하여, FACS에 의하여 다양한 마커들의 발현을 분석하였다. Pro-B 세포들은 높은 수준의 세포질 SLC, IL-7R 및 CD43을 발현하는데, 이들은 pre-BCR 발현에 따라 하향조절되어, 성숙 B 세포들에서는 부재한다(도 2C, μMT 마우스 유래의 pro-B 세포들과 표면 IgM-pro-B/pre-B세포 분획 및 wt 마우스의 표면 IgM+ B 세포 분획의 비교).
MΔGΔ/μMT 또는 GΔ/μMT 마우스로부터의 인간 Ig+ B 세포들은 낮은 수준의 SLC 및 IL-7R을 가지는데, 이는 SLC 및 IL-7R의 하향조절시 인간 단일 쇄 IgG 및 IgM 수용체들이 기능적으로 뮤린 pre-BCR을 대체함을 의미한다. CD43에 대하여, 이는 GΔ 마우스에서만 일어나는 사례이지만, MΔGΔ 마우스에서 CD43 발현의 지속은 이러한 마우스들내에서의 증가된 B-1 B 세포 분별화의 발견과 관련이 있을 수 있다. 또한, 정상 pre-BCR 신호에서와 같이, CD2 및 MHC 클래스 Ⅱ 발현이 유도된다. pre-B 세포단계에서 일시적으로 유도되는 IL-2R/CD25의 수준은 성숙 MΔGΔ 또는 GΔ/μMT B 세포상에서 매우 낮고, 성숙 wt B 세포(도 2C)의 수준과 비슷하다. 게다가, ic Igκ 발현은 성숙 MΔGΔ 또는 GΔ/μMT B 세포들에서 검출되지 않으며(도 2C), 또한 5일간의 IL-7 + 배양 후에 IL-7 투여 중지에 따라 시험관내 BM 배양에서 유도되지 않았다(도시하지 않음). 최종적으로는 MΔGΔ 또는 GΔ 형질전환 마우스에서 B 세포들을 발현하는 인간 HCAb는, 부분적으로 BM(HSAhigh 및 AA4.1/CD93high)에서 생성된 세포들로 이루어지고, 부분적으로 정상 마우스에서 발견되는 것과 유사한, 말단에서 성숙되며 재순환(HSAlow 및 CD93low)되는 세포들로 이루어져 있었다.
종합적으로, 이러한 결과들은, 성장에 따라 조절된 마커들의 발현과 관련하여 B 세포의 성장 동안 인간 HCAb IgG 및 IgM이 기능적으로 뮤린 (pre-)BCR을 대체한다는 사실을 보여준다. Ig 경쇄는 유도되지 않는다(아래 참조). BM RNA의 cDNA분석은 VDJ 재조합을 위한 VHH 세그먼트들의 사용, CH1의 부재 및 CDR3 지역(도 2D)에서의 현저히 넓은 다양성을 보여준다(도 2D).
복수의 재배열 및 대립유전자 형질 배제
많은 수의 하이브리도마가, 면역 후의 MΔGΔ 및 GΔ계열, 특히 5개의 복제 GΔ계열1로부터 만들어졌다(아래 참조). 서열분석은 하나 이상의 재배열이 다복제 GΔ 유전자좌에서 일어날 수 있음을 보여주었다. 분석된 5개의 다른 5 복제 하이브리도마들 중에서, 하나(G20)는 프레임내에 위치하는 하나의 복사체를 재배열시켰고; 2개의 하이브리도마(T7 및 T12)는 각각 2개의 재배열을 갖는데, 둘 중 하나는 프레임 바깥에서 재배열되었고; 하나의 하이브리도마(T3)는 2개의 프레임내 재배열(J2 및 J4)을 가지나; 하나의 하이브리도마(T1)는 4개의 재배열을 가지는데, 이 중 2개(J2 및 J4)는 프레임내 재배열이었다.
T1 및 T3은 2개의 생산적인 mRNA를 발현하는데, 이들은 cDNA와 정확하게 매 칭되는 분비된 항체들의 질량분석에 의하여 확인되었다(도시되지 않음). 또한, DNA 신장된 섬유 FISH 및 2개의 다른 하이브리도마에 대해 정상 DNA FISH를 수행하였다: 각각의 복사체를 검출하는 LCR 프로브 및 비-재배열 복사체들만을 검출하는 VHH 및 D 세그먼트 사이에 위치하는 프로브를 사용하여 G20(1 재배열) 및 T1(4 재배열)을 검출(도 3A-E). 실제로 하이브리도마들은 각각 G20 및 T1에서 1 및 4개의 재배열된 복사체들를 보여주었으나(도 3B, C-E), 대조군 폐세포들은 서던 블롯 맵핑(도시되지 않음)과 일치되게 5개의 완전한 복사체들 및 각각의 말단에서 절반의 도입유전자를 보여주었다(도 3A). 따라서 복수의 복사체들은 같은 대립유전자상에서 성공적으로 재배열될 수 있다. 다음으로, HCAb 유전자좌가 정상 뮤린 유전자좌에 비하여 어떠한 (장)단점을 가지고 있는지 여부 및 유전자좌에 대립유전자 형질배제가 있는지 여부를 확인하였다. 인간 IgG 및 마우스 IgM의 발현을 확인하기 위하여, wt 배경에서 GΔ 계열1 형질전환 마우스의 B220/CD19 양성 BM 세포들을 분석했다. 명확하게, GΔ B 세포들은, 마우스 Ig 또는 인간 Ig를 발현하였고(도 3F), 이는 대립유전자 형질배제를 나타낸다.
GΔ, MΔGΔ 및 MG Δ 형질전환 마우스의 비장 B 세포
μMT 마우스의 B 세포 분화에 대한 도입유전자의 영향을 결정하기 위하여, CD21/CD23 프로파일(도 4A)을 이용하여, 유세포 분석에 의하여 비장 B 세포 소집단 크기를 검사하였다. GΔ 마우스에서, CD21lowCD23low 미성숙 B 세포의 비율은 정상범위내였고, 인간 단일 쇄 IgG를 발현하는 세포들은 낭포성(FO; CD21+CD23+) B세포 및 가장자리 지역(MZ; CD21highCD23low) B세포로 분화가 가능하였다. MΔGΔ 마우스에서 미성숙 B 세포 분획들은 증가하였고, 이는 HCAb IgM 발현 세포들의 FO 및 MZ 8 B 세포들로의 분화가 어느 정도 손상되었다는 사실을 나타낸다. 이러한 비장세포에서, CD23의 발현감소는 증가된 CD43 및 CD5의 표면발현 수준을 수반하며, 이는 B-1 B 세포 계통으로의 분화를 나타낸다. MGΔ 형질전환 마우스에 존재하는 인간 IgM 발현 B세포들(마우스 경쇄들을 또한 발현함, 도 6 참조)은, MΔGΔ 형질전환 마우스에서와 비슷한 FO/MZ 분포를 나타내었다. MGΔ 마우스는 제외하고, MΔGΔ 및 GΔ 마우스는, 백색속질의 바깥 가장자리부분에 존재하는 낭포들 및 주변지역들을 포함하는 B 세포-풍부 지역에 둘러싸여 있는 림프절 방피질부(PALS)에서 T세포 무리의 분리를 나타내는 정상적인 비장 구조를 가지고 있다(도 4B).
또한, 그들은 T 세포 의존성 항체 반응동안, wt와 유사하게, 2차 림프조직의 B 세포 낭포들내에 배아중심들을 형성한다. 이러한 배아중심들은 기억형성 부위이며, 체세포성 초변이에 기인한 친화도-기초 선별 부위이다. GΔ 마우스에서, 인간 IgG 양성 세포들은 이들 배아 중심들에서 검출된다. Payer's 패치에 존재하는 B 세포들로부터 cDNA 분석을 통하여 인간 IgG 유전자들의 초변이를 확인하였다(도 4C). VHH1 및 VHH2 모두를 이용하였다. 종합하여, 이러한 발견들은 BM으로부터 전이한 GΔ 및 MΔGΔ 형질전환 마우스 미성숙 B 세포들이 비장내에서 FO 및 MZ B 세포 양쪽 모두로 분화할 수 있는 능력을 갖는다는 사실, 그리고 항원투여 이후 체세포성 초변이를 수행할 수 있는 능력을 갖는다는 사실을 나타낸다.
단일 복제 유전자좌는 효율적으로 회복하고, CH1 부재는 필수적이다.
GΔ 계열 1 마우스(도 2A)는 GΔ 유전자좌의 5개의 복사체를 포함하였고, 따라서 효율적인 회복은 유전자좌의 복제수와 관련이 있을 가능성이 있었다.
그러나, FlpeR 계열[23]과 함께 육종시키는 것을 통하여 Flp 재조합에 의해 5 복제 GΔ 계열 1로부터 얻어진 단일 복제 형질전환 계열은 유사한 정도로 B 세포 성장을 회복시켰다(도 4D, 도 2A). 유전자좌의 단일 복제는 회복을 위해 충분하고, 비-회복 단일 복제 계열 MGΔ(계열 3)으로부터 Cre 재조합(cre 발현 계열로 번식)에 의해 Cμ 및 Cδ 지역을 결실시켜 단일 복제 GΔ 계열을 얻음으로써(도 4D), CH1 지역을 갖는 Cμ 불변 지역의 존재는 억제된다는 사실이 확인되었다. 이전의 비-회복 유전자좌는 다른 GΔ 계열들과 동일한 B 세포 성장[9]을 얻게 한다. 따라서, 복제수는 보호에 영향을 미치지 않고, Cμ 지역에서 CH1의 존재는 B 세포 보호를 억제한다(이하 참조).
마우스 Ig 경쇄 유전자좌는 MΔGΔ 및 GΔ 형질전환 마우스내에서 재배열하지 않는다.
뮤린 Ig 경쇄 단백질은 MΔGΔ 및 GΔ 형질전환 마우스에서, 혈청의 웨스턴 블롯법(도시되지 않았으나, 도 2C 및 6A 참조) 또는 FACS에 의하여 검출되지 않았으며, 이는 뮤린 경쇄 유전자가 재배열되지 않는다는 사실을 시사한다. 이는 분류된 비장의 B220+ 세포 분획들의 DNA에서의 Igκ 유전자좌 생식계열 신호들의 밀도와 간세포를 서던 블롯 분석법(도 5A 및 B)에 의하여 비교함으로써 확인되었는데, 이는 마우스의 경쇄는 재배열하지 않고, 생식계열 배열에 남아있다는 사실을 보여 준다. 이와 반대로, 경쇄는 MGΔ/μMT 마우스에서, 소수의 인간 Ig 발현 세포들에서 검출된다(도 6G 참조).
따라서 BM내에서의 B 세포 성장 초기의 인간 HCAb의 발현은 경쇄 재배열을 야기하는 신호를 제공하지 못한다. 여기에서, HCAb는 pre-BCR보다는 BCR을 의태하는데, 이는 CH1의 부재시 슈도-경쇄를 결합하는데 실패하는 것과 관련이 있는 것으로 여겨진다[61].
GΔ/μ MT 및 MΔGΔ/μ MT 마우스의 혈청 분석
인간 IgM은 MΔGΔ 혈청에 존재하였고, 인간 IgG는 MΔGΔ 및 GΔ 마우스 양쪽 모두의 혈청에 존재하였다. 비-면역 성체 동물에서, 인간 IgM(<50㎍/㎖) 및 IgG(200~1000㎍/㎖)는 정상 마우스 또는 정상 인간 IgH 유전자좌를 운반하는 형질전환 마우스에서 보여지는 수준과 비슷한 수준으로 존재한다[65]. GΔ 마우스 6마리 모두의 혈청에 대한 겔 전기영동으로, 비환원 조건하에서 ~70kD의 MW 및 환원조건하에서 ~35kD의 MW를 갖는 HCAb IgG's를 보여주었으며, 이는 경쇄가 결여된 중쇄 이합체 및 CH1 엑손이 결여된 각 중쇄와 일치한다(도 6A, B).
MΔGΔ 마우스의 혈청은 다합체성의 중쇄만의 인간 IgM을 포함하였다. 환원 조건하에서(도 6C), 모든 4개 계열들은 CH1의 MW를 뺀 후의 인간 대조군 IgM으로서의 MW를 갖는 IgM 쇄들을 포함하였다. 또한, 혈청은, 각각의 10개의 분획이 환원 조건하에서 겔 전기영동에 의하여 분석된 이후(도 6D, 수직선), 비-환원 조건하에서 분획화(도 6D 수평선)되었다. 인간 혈청 5합체 900kD IgM 대조군과 비교할 때, 형질전환 IgM은, 다합체화 및 경쇄와 CH1의 결여와 일치되게, 600kD에서 분획화한 다. 따라서, GΔ가 혈청에서 이합체 IgG를 생산하는 반면, MΔGΔ 마우스는 HCAb 다합체 IgM 및 이합체 IgG를 생산한다.
MG Δ 마우스의 혈청분석
MGΔ/μMT 계열들의 말초 및 비장에서, B220 양성 세포는 거의 없고(야생형의 <1%), 가끔 적은 B 세포 덩어리만이 비장에서 발견된다(도 4B). 소량의 인간 IgM 및 IgGs들은 오직 정제 후에만 혈청에서 검출되었다(도 6E, F). 이러한 마우스들내의 인간 IgM은 환원 조건하에서 정상 크기였으나, 반면에 순환 인간 IgG들은 더 짧았다(35kD의 겉보기 MW, CH1 결실과 일치됨). 흥미롭게도, 인간 IgM과 회합되어 있을수 있는, 마우스 κ경쇄들 또한 검출되었다(도 6G).
인간 IgM 및 IgG들은 정량 ELISA 분석에서 검출 수준 이하였으나, 그럼에도 불구하고 MGΔ/μMT 마우스가 면역화에 반응할 수 있는지를 시험하였다. 종양괴사인자-α(TNF-α)로 마우스를 면역반응시켰고, wt 마우스는 강한 TNF-α 특이적 항체반응을 일으켰으나, 사용된 2마리의 MGΔ 계열 3 마우스에서는, 항원 특이적 인간 IgG들은 ELISA 또는 웨스턴 블롯 분석법에 의하여 검출할 수 없었다(도시되지 않음).
MΔGΔ 및 GΔ 마우스의 면역화는 항원특이적 Ab 생산을 야기한다.
MΔGΔ 마우스를 인간 TNFα로 면역반응시킨 반면, GΔ/μMT 마우스는 E.coli hsp70, DKTP(Diphteria 톡소이드, Bordetella Pertussis의 모든 세포 용해물, 파상풍(Tetanus ) 톡소이드 및 불활성화된 폴리오바이러스 타입 1, 2 및 3) 및 rtTA로 면역반응시켰다[50]. ELISA에 의하여 양성 혈청을 갖는 마우스로부터, 개개 의 완전한 항체들이 파아지 디스플레이 라이브러리에 의하여 하이브리도마 또는 단일 영역 Ab(sdAb)를 사용하여 분리되었다.
αhsp70-, 파상풍 톡소이드- 및 rtTA- 특이적 단일 클론들이 항체 RNAs의 RTPCR 후에 서열분석되었다(도 7A). 이는 IgG2(8개 중에서 7개) 및 IgG3(8개 중에서 1개) 항체 모두가 생산되었음을 보여주었다(IgG2 라이브러리로부터 sdAb가 분리됨). 다른 D 및 J 지역들이 사용되었다. 높은 빈도는 아니었더라도, 11 HCAbs로부터의 VHH가 초변이 되었다. 3개의 hTNFα-특이적 항체(하나의 양성 IgM 하이브리도마인 도 6의 α-hTNFα#1 및 두개의 sd(Ab α-hTNFα #2 및 #3) 모두는 CDR2 지역에서 상이한 초변이를 가졌다. 14개의 항체들 모두의 서열을 비교하여 볼 때, 모든 J 지역이 사용되었음에도 불구하고 인간에서와 같이 JH4가 가장 자주 사용된다는 것이 명백하였다. 놀랍게도, 모든 항체는 라마 VHH2를 포함하였다(이는 위치 49에서 전형적인 글루탐산 대신 글루타민을 갖는다). 결국 명확하게, CDR3 지역은 다양성의 대부분을 제공한다[27]. 이는 길이에 있어서 10개~20개의 아미노산들로 다양하며(평균 13.6개 아미노산), 라마 및 인간에서 정상적으로 보여지는 것과 매우 유사하다[52, 53]. 다음으로, 이러한 HCAb들이, 하이브리도마 상청액 및 sdAbs의 박테리아성 세포질 막주변 분획들과 같이 정규 분석에서 기능적인지의 여부를 시험하였다(도 7). 모든 항체들은 ELISA에서 양성이었으며, 웨스턴 블롯기법에 의한 항원 검출에 양성이었다(예를 들면, α-DKTP 및 α-rtTA 혈청 및 하이브리도마 배지 및 α-B. Pertusis sdAb, 도 7B). 또한, rtTA 발현 플라스미드로 형질감염시킨 세포 계열을 사용한 면역세포화학법에서 α-rtTA IgG를 시험하였다(도 7C, D). rtTA HC- IgG는 매우 분명하고 특이적인 핵염색을 나타냈다. 몇몇의 항체들(특히, sdAb)은 매우 낮은 친화도를 나타내었으나, 상당수의 항체들은 친화도가 높았다. 예를 들면, 면역세포화학법에 사용된 α-rtTA 항체(도 7C, D)는 BiaCore에서 결정된 바와 같이 약 3nM였다.
결론
본 발명에서, 기능성 HCAb 생산을 야기하는, μMT 마우스에서의 B 세포 성장을 회복시키는 변형된 HCAb 유전자좌의 발현을 보고하였다. 이들 마우스는 항원특이적 HCAb를 생산하도록 면역반응시킬 수 있다. 카멜리드에서와 같이, CH1의 제거는 HCAb 분비에 매우 중요하나, 3'CH1/인트론 접경에서의 단일 카멜리드([30] 참조) 접합 변이는 CH1 제거에 충분하지 않고, 따라서 최소한 인간 유전자좌에서, 이러한 단일 점변이 이상이 요구된다. B 세포 성장을 막는 VHH와 조합된 CH1을 갖는 IgM은 아마도 pre-BCR의 환경에서 IgM 표면 분자의 비효율적인 집합에 의하여 발생되었을 것이다. 대조적으로, HCD-유사 인간 μ단백질을 발현하는 마우스는 λ5와 무관하게 SCID 배경에서 정상 CD43-pre-B 세포를 성장시킨다[54]. 말단이 잘린 Cμ 단백질은 회합된 경쇄가 없는 B 세포 표면상에서 발현되고, 자가-집합을 통하여 pre-BCR 신호를 의태하는 것으로 생각된다[55].
정상적으로 BiP는, 연속적으로 사슬간 접촉에 관여하는 Ig쇄들의 소수성 표면에 결합함으로써, 항체분자의 접힘 및 집합을 보호한다. VHH들의 FR2내에 친수성 아미노산들이 존재하면, 아마도 VHH에 BiP가 결합하는 것을 방해하므로써, 가용성으로 되는 (대리)경쇄가 필요없게 된다. 동시에, CH1은 집합(경쇄에 의한 BiP의 대 체)이 완결될 때까지 ER내에서 중쇄를 유지하도록 BiP와의 상호작용을 제공한다. 우리의 결과에 의하면, pre-B 세포 수용체의 수준에서, λ5 단백질과 비공유결합된 대리 경쇄(SLC)의 일부로서의 Vpre 단백질과 형질전환 μ중쇄의 짝이루기(pairing)는, CH1 영역을 포함하는 μ중쇄가 VHH에 연결될 경우, 일어날 수 없음을 알 수 있다. 따라서 MGS 및 MGΔ 형질전환 마우스내의 인간 IgM은, 이러한 점에 있어서, 다량증식 및 성장진행을 신호하는데 불충분한 것으로 알려진 불완전 pre-BCR-유사 복합체와 유사하다[56, 57]. 이는 BM내의 B220 양성세포의 오직 30%만이 세포내 IgM을 갖는 이유를 설명할 수 있을 것이다(도 2B). 이러한 마우스들의 비장내에 소수의 성숙 B 세포의 존재는, μ중쇄는 포함하지만 어떠한 SLC 또는 통상적인 경쇄는 결여된, 최근에 개시된 신규의 수용체 복합체에 의하여 설명될 수 있다[58].
Cγ2 및 Cγ3에 CH1이 부재하는 경우 및 유전자좌로부터 IgM이 제거된 경우, B 세포 성장이 회복되는데, 이는 IgG가 기능적으로 IgM을 대체할 수 있음을 보여준다. pro B 세포 단계가 진행됨에 따라 그로부터 발현된 IgG1 수용체는, Rag2-/-마우스 내에서의 성숙 CD21+B세포들의 성장을 돕는데 있어서 IgM을 대신할 수 있다[59]. 또한, 최근에는, 미리-재배열된 카멜리드 IgG2a가 μMT(및 CΔ-/-)배경에서 2마리의 형질전환 마우스 중 하나에서 B 세포 성장을 부분적으로 회복시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다[13]. 우리의 경우는, CH1이 결여된 IgM 또는 IgG가 10마리의 독립적인 형질전환 마우스 계열들 중 10마리에서 B 세포 성장을 회복시킨다. 더욱이, 우리는 경쇄 재배열을 관찰하지 않았고, 추가의 B 세포 분화를 위하여 경쇄 발현은 요구되지 않는다고 결론내렸다. Zou 등[60]의 결론과 여기에서 얻은 결론과의 차이는, 우리의 구조체는 LCR을 포함하는 것에 의한 중쇄 유전자좌의 발현(및 신호)의 수준에 의하여 설명될 수 있다. 우리의 결과로서, CH1[61] 또는 VH 및 CH1[62]이 결여된, 말단부분이 잘린 μ중쇄 단백질은 SLC와 결합될 수 없고, κ 유전자 재배열을 활성화시키지 못한다는 사실을 확인할 수 있다.
5개의 복제 GΔ 계열 1(및 다른 다복제 계열)은 게놈내 같은 위치에 통합된 단일 복제 계열과 같은 정도로 B 세포의 성장을 회복시킨다.
흥미롭게도, 다복제 형질전환 유전자좌에서 하나 이상의 재배열이 일어난다(도 3).
2개의 단일 비장세포로부터 유래한 2개의 하이브리도마들은 생산적 HCAb 전사체 및 단백질을 제공하였다. 이러한 결과는, 같은 B 세포내에서의 2종류의 항체의 발현이 유독하지 않다는 사실을 확인시켜준다[63]. 그러나, 항원투여시 이중(double) 항체 생산 B 세포들은 단일 항체 생산세포들과의 경쟁에서 질것이라는 예측[37]은, 항원투여후 얻어진 5개의 하이브리도마에서 2개의 이중항체 발현 세포들을 발견한 우리의 결과에 의해서는 인정되지 않는다.
BM 세포가 세포 표면에서 마우스 또는 인간 Ig를 발현하기 때문에, (다복제) 유전자좌는 야생형 마우스에서 대립유전자 형질이 배제된다. 세포 표면에서 양쪽 모두를 발현하는 세포들의 수는 많지 않았다(도 3F, 상부패널). 가장 흥미로운 것은, 아마도 인간 Ig 발현 세포들에 대한 마우스 Ig 발현 세포들의 수일 것이다. wt/5 복제 GΔ 마우스에는, 재배열에 유용한 3개의 가능한 대립유전자, 하나의 Ig 유전자좌를 갖는 2개의 마우스 대립유전자 및 5개의 인간 HCAb 유전자좌를 갖는 하 나의 대립유전자가 존재한다. 확률적으로 선택할 경우, 인간 대립유전자는 3번에 1번 정도만 선택될 것이다.
만약 유전자좌의 수를 센다면, 우선 7개의 세포 중 5개의 세포에서 인간 유전자좌가 재배열될 것이다. 그러나, 내생적 마우스 및 형질전환 인간 HCAb는 거의 동일하게 발현된다(44/38, 도 3F 하부패널). 비록 이러한 수는 V 지역들의 무작위적 사용 및 형질전환 유전자좌상의 가능한 위치 효과로부터의 가능한 편차를 무시하지만, 이들 수는 처음의 선택이 대립유전자의 확률적 선택이고, 그에 이어서 대립유전자 하나 당 복수의 유전자의 가능한 재배열이 뒤따른다는 것을 강하게 시사한다.
이러한 사실은 GΔ 유전자좌의 복수의 재배열이 빈번하게 관찰된다는 사실과 일치한다. 정상적으로, 생산적인 재배열은 다른 대립유전자의 재배열을 막기위하여 재조합을 하향조절한다. 그러나, 형질전환 대립유전자상의 다복사체들은 동일한 열린 유전자좌상에 존재하고, RAG 하향조절 이전에 명확하게 재결합된다. 이는 복수의 재배열이 동시에 일어나기 때문일 수 있고, 또는 만일 그것이 공간 성분("구획")을 포함한다면, RAG가 하향조절되기 전에 유전자좌가 닫히므로 유전자좌에서 다른 유전자를 재배열할 충분한 시간이 있을 수 있기 때문일 수 있다.
wt 마우스내에서 재배열이 생산적이지 않은 경우에만(신호부재 및 RAG 정체), 두번째 유전자좌가 활성화되어, 첫번째 유전자좌를 대체하여 재배열될 충분한 시간이 있을 것이다. 이러한 관점은, 동일한 염색체 상에 복수의 유전자좌를 갖는 다른 종들은 2개의 Ab를 발현하는 더 많은 세포를 가진다는 관찰결과에 의해 지지 될 수 있을 것이다[64].
이러한 시험들은 HCAb 유전자좌가 마우스에서 성공적으로 발현될 수 있다는 사실을 명확하게 보여준다. 항원투여는 유전자좌의 구성에 의존적인 다른 클래스의 고친화도 항원특이적 인간 HCAb의 생산을 야기한다. 이러한 항체들은 정상 마우스에서의 수준 또는 다른 "정상" 인간 IgH 형질전환 마우스에서의 수준과 유사한 수준으로 발현된다[65]. 2개의 가변 지역만이 우리의 시험에서 사용되었으나, 그럼에도 불구하고 다양한 특이성을 갖는 고친화도 항체가, 전적으로 무관한 시험된 단백질들의 거의 모두에서 성공적으로 분리되었고, 이는 CDR3에 의하여 생성된 다양성의 능력 및 효율을 입증한다[66]. 따라서 V(D)J 재조합의 보유 및 생체 내 선택은 파아지 디스플레이[39]를 사용하는 파아지미드 라이브러리로부터의 인간 단일 쇄 항체 단편들의 생성에 대해 중요한 이점을 제공한다. 하이브리도마는 용이하게 생성될 수 있으며, 이는 중요하게도 파아지 디스플레이 및 추가의 스크리닝의 요구 없이 완전한 인간 HCAb 또는 sdAb 단편의 직접 클로닝 및 발현을 가능하게 한다.
따라서, 이러한 마우스들은, 특히 HCAb가 효소들의 활성부위와 같은 통상의 항체들에 대하여 거의 항원성이 없는 에피토프들을 인식할 수 있다는 사실[4]의 견지에서, 임상 목적 또는 다른 목적들을 위한 인간 HCAb의 생산에 대한 완전히 신규한 가능성을 열어준다. 가변 지역들의 제한된 수는 항원들 전부가 인식되지는 않는 이유를 설명할 수 있다; wt 대조군 마우스와 달리, GΔ 마우스에서는 폴리오 및 Diphteria 단백질들은 반응을 일으키지 않았다. 놀랍게도, 모든 항체들이 라마 VHH2 지역을 가지고 있었다. 이는, 위치 49에 보존된 아미노산[67]을 가지고 있고, 더 가용성이어야 하는 VHH1과는 달리, 위치 49에 보존된 아미노산을 포함하지 않는다.
그렇지만, 유전자좌내에 더 많은 가변 지역들을 추가하면, 훨씬 더 넓은 레퍼토리를 얻을 수 있을 것으로 기대된다. 단일 대립유전자상에 유전자좌의 다복사체를 피하는 것이 바람직한 반면, 다양성을 증가시키기 위하여 다른 VH 지역의 단일 복사체를 각각 포함하는 복수의 대립유전자를 포함하는 마우스를 생성시키는 것이 이로울 수 있다. 그러한 신규의 유전자좌에서는, 정상적으로 일어나는 (인간) VH 지역들, 또는 용해성이 증가하도록 조작되고[18], 경쇄와 짝을 이루도록 조작된 VH 지역들 중 어느 것을 사용할 수 있다.
결론적으로, 우리는 잠재적으로 어떤 클래스의 항원 특이적 고친화도 HCAb가 마우스내에서 생산될 수 있음을 입증하였다. 이러한 기술은 인간 내에서 치료제 또는 진단제로서 사용하기 위하여, 항원투여에 반응하는 어떤 클래스의 완전 인간 HCAb 또는 그들의 단편을 생산할 수 있게 한다. 또한, 이 기술은 다른 척추동물 유전자좌들을 사용함으로써, 시약, 진단제 또는 동물 치료용으로 사용되기 위한, 어떤 척추동물로부터의 고친화도 성숙 항체의 생산을 가능하게 한다.
실시예 2
Janssens 등(2006)은 형질전환적으로 암호화된 중쇄만의 항체를 생산하기 위하여 형질전환 VH 유전자좌가 적절하게 재조합된다는 사실을 보여주었고, 그러한 유전자좌는, 내생적 (마우스) 중쇄 면역글로불린 유전자좌의 존재하에서, 대립유전자 형질 배제에 대하여 민감하다는 사실을 보여주었다. 중쇄만의 항체의 생산에 사용되는 VH 형질전환 유전자좌의 수는 대립유전자 형질배제 과정을 사용하여 증가시킬 수 있음을 보여주기 위하여, 다른 중쇄만의 유전자좌들을 갖는 2마리의 형질전환 마우스를 교미시켜 양쪽 모두의 유전자좌를 갖는 자손을 얻었다. 마우스 한마리는 MGΔ 유전자좌(IgM 및 IgG 유전자좌, Janssens 등, 2006)를 가졌으나, 반면에 다른 마우스는 GΔ 유전자좌(오직 IgG 유전자좌만 가짐, Janssens 등, 2006)를 가졌고, 마우스 두마리 모두 μMT 배경을 가진다. 하이브리도마들은 이중 형질전환 자손의 B세포로부터 유래되었고, 표준 방법에 의하여 배지에서 길러졌다. 결과로 얻어진 다수의 각각의 단일 클론 세포 계열들은 PCR 및 서던 블롯법에 의하여 분석되었고, 이는 생산적으로 재배열된 MGΔ 유전자좌를 포함하는 계열들이 비-재배열된 GΔ 또는 비-생산적으로 재배열된 GΔ 유전자좌를 포함한다는 사실을 보여주었다. 반대로, 생산적으로 재배열된 GΔ 유전자좌를 포함하는 세포 계열들은 비-재배열된 MGΔ 유전자좌 또는 비-생산적으로 재배열된 MGΔ 유전자좌를 포함하였다. 따라서, 모든 이용가능한 VH 지역들이 재조합 과정에 사용된다.
실시예 3 및 4
본 발명의 첫번째 측면의 바람직한 구체예에서, 모든 기능성 인간 VH 지역들은 상기 실시예에서 설명된 방법들 및 당 분야에 공지된 방법들(Janssens 등, 2006)을 사용하여, 전체 DH 지역, 전체 JH 지역, 및 Cμ, Cγ2, Cγ3 및 Cα 지역들 및 3'LCR을 포함하는, 복수의 변형된 인간 유전자좌 상으로 인간 VH 지역들(또는 이 들의 변이체들)을 클로닝함에 의하여 증가된다. 이러한 과정은 개별 유전자좌 상의 복수의 동일한 VH 지역들 또는 개별 유전자좌 상의 상이한 VH 지역을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 상이한 유전자좌는 동일한 중쇄 지역들 또는 상이한 중쇄 지역들을 포함할 수 있다. 실시예 3은 중쇄 지역들의 상이한 조합을 갖는 유전자좌 상의 동일한 VH 지역들을 갖는 유전자좌에 관한 것이고, 실시예 4는 동일한 중쇄 불변 지역들을 가지지만 상이한 VH 지역들을 갖는 2개의 유전자좌에 관한 것이다. 분명하게, 양 실시예에서 추가의 유전자좌들이 추가될 수 있다.
실시예 3
인간 VH 지역들은, 가능한 39개의 기능성 인간 VH 지역들로부터 각각 선택된 VH에 대하여 특이적인 프라이머들을 사용한 인간 게놈 DNA의 PCR 증폭에 의하여 분리될 수 있다(택일적으로, 인간 VL 지역 또는 TCR V 지역 또는 돌연변이 생성에 의해 유도된 이들의 변이체들이 사용되거나 추가될 수 있다). 인간 VH 지역들은, 인간 DH 플러스 JH(또는 다른 D 및 J 지역들) 및 각각 CH1 플러스 3'LCR이 결여된 Cμ, Cγ2, Cγ3을 포함하는, 상기 실시예(도 9)에서 설명된 유전자좌 상에 세트로 클로닝된다. CH1 및 스위치 지역들이 결여된 Cα지역은 GΔ 유전자좌에서 분리되어 클로닝될 것이다(도 10). 이 GΔ 유전자좌는 그것이 lox 부위들을 포함하지 않고, 라마 VHH 지역들이 표준 동형 재조합에 의하여 제거되어 유일한 PI-PspI 부위를 남긴 다는 점에서 원래의 유전자좌의 변이체이다(도 10).
기능성 VH 지역들은 각각의 유전자좌 상에 어떤 복수로 함께 클로닝될 수 있다. 초기에, 17개의 기능성 인간 VH 지역들이, 세트당 2개의 클로닝된 유전자들로 시작하여 1개의 세트로 함께 클로닝될 것이다. 각각의 이들 초기 구조체들에 대하여, 통상적인 방법론(예를 들면, XhoI-SalI 제한 소화/결찰, 양쪽 모두를 파괴하는 XhoI 및 SalI 양립부위들의 결찰)에 의하여 2번째 세트가 추가될 것이다. 4, 4, 4, 3 및 2를 포함하는 세트들은 BAC 벡터 내에서 17개의 유전자로 이루어진 1세트로 연결될 것이다. 이러한 과정은 다른 수의 유전자들을 포함하는 세트들을 조합함으로써 분명하게 수행될 수 있다. 상기 과정은 원하는 수의 VH 지역들을 얻게 되는 어떤 시점에서 종료될 수 있고, 더 많은 수의 VH 지역들을 얻게 될 때까지 연장될 수 있다.
전체 세트(예를 들면, 17개의 유전자)는 단일의 PI-PspI 부위내의 변형된 GΔ 유전자좌 내로 클로닝된다. Cα 지역은, 이 유전자좌의 I-CeuI 부위 내로 클로닝되어, Igα 및 IgG를 생산할 수 있는 AΔGΔ 유전자좌를 생성할 것이다(도 10). 택일적으로, 다른 중쇄 지역이 클로닝될 수도 있다.
다음으로, 이들 최종의 유전자좌들은, 상기 실시예에서 설명된 바와 같은, 개별의 형질전환 마우스(바람직하게는, μMT와 같은 불완전 마우스 IgH 유전자좌를 갖는 형질전환 마우스)내로 도입된다. 이들 각각의 유전자좌들은 개별의 마우스 계열들을 생성시키는데 이용되는데, 하나는 오직 IgG만을 만들 것이고, 다른 하나는 IgA 및/또는 IgG를 만들 것이다. 이어서, 이들 마우스들을 교배시켜, 2개의 다른 유전자좌들상에서 이용가능한 총 VH 지역들을 134개가 되도록 한다. 2개의 유전자좌가 동형접합성을 갖게 하기 위하여 이들 마우스들을 교배시킴으로써, 재조합을 위해 이용가능한 68개의 VH 지역들이 만들어질 것이다. 합쳐진 유전자좌의 복수의 복사체들을 갖게 함으로써, 이 수는 더욱 증가할 것이다. 이들 마우스의 B 세포들로부터 만들어진 하이브리도마들의 분석은, 생산적으로 재배열된 유전자좌가 존재할 때, 배양된 다른 유전자좌들은 표준 과정에 의한 대립유전자 형질배제에 기인하여 비-재배열되거나 또는 비-생산적으로 재배열된다는 사실을 보여주기 위하여 이용될 것이다.
실시예 4
상기에서 설명된 지역들(또는 돌연변이생성에 의하여 유래된 그들의 변이체들)과 유사하게 분리된 1개 이상의 VH 지역들의 상이한 세트들은 상기에서 설명된 바와 같은 동일한 방법에 의하여 2개의 별개의 유전자좌들 상에 클로닝된다. 이로써, 2개의 다른 GΔ 유전자좌(또는 Cα 첨가와 같은 그들의 변이체들)가 생성된다. 이들 유전자좌들은 개별의 마우스내로 도입되어, 각각 별개의 형질전환 계열들을 생성한다(예를 들면, 각각 10VH 영역을 갖는 2개의 유전자좌, 도 11), 다음으로, 이들 마우스를 교배시켜, 재조합 과정에 유용하게 이용되는 모든 VH 지역들을 갖는 이중 형질전환 마우스를 얻는다. 양 유전자좌가 동형접합성을 갖게 하기 위하여 이 들 마우스를 교배시키는 것은 재조합에 이용가능한 VH 지역들의 수를 2배로 증가시킬 것이다(도 12, 염색체 1상에 통합된 하나의 유전자좌 및 염색체 8상에 하나의 유전자좌를 갖는 염색체도). 합쳐진 유전자좌의 복수의 복사체를 갖게 함으로써, 이 수는 더욱 증가할 것이다. 이들 마우스의 B 세포로부터 만들어진 하이브리도마들의 분석은, 생산적으로 재배열된 유전자좌가 존재할 때, 배양된 다른 유전자좌들은 대립유전자 형질배제에 기인하여 비-재배열되거나 또는 비-생산적으로 재배열된다는 사실을 보여주기 위하여 이용될 것이다.
상기 과정은 바람직한 VH 지역들의 수에 도달하는 어떠한 시점에서 종결될 것이다. D, JH 및 불변 지역들이 이들 VH 지역들에 추가될 수 있다. 다음으로, 이들 최종의 유전자좌들은 상기 실시예에서 설명된 바와 같은 개별의 형질전환 마우스들(바람직하게는, 불완전 마우스 IgH 유전자좌를 갖는) 내로 도입될 수 있다. 택일적으로, lox 부위들의 위치는, Cμ(IgM) 단독, 또는 Cγ2 및 Cγ3(IgG2 및 IgG3)단독, 또는 Cα단독(IgA) 또는 그들의 조합을 포함하는 개별의 유전자좌를 생성시키기 위하여, 각각의 불변 지역들의 제거를 가능하게 한다. 이들 개별의 유전자좌들은, 인간 IgM 단독, 또는 IgG 단독 또는 IgA 단독 또는 그들의 조합을 만드는 개별의 마우스 계열들을 생성시키기 위해 이용된다.
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Claims (34)

  1. 다음의 단계들을 포함하는, 형질전환 비-인간 포유동물 내에서 VH 중쇄만의 항체를 생산하는 방법:
    상기 형질전환 비-인간 포유동물 내에 하나 이상의 이종성 VH 중쇄 유전자좌를 제공하는 단계, 여기에서 각각의 VH 중쇄 유전자좌는 하나 이상의 V 유전자 세그먼트, 하나 이상의 D 유전자 세그먼트, 하나 이상의 J 유전자 세그먼트, 및 발현시 CH1 영역을 포함하지 않는 중쇄 불변 지역을 암호화하는 유전자 세그먼트를 포함한다;
    상기 유전자좌의 적어도 하나로부터 VH 중쇄만의 항체를 발현시키는 단계.
  2. 제 1항에 있어서, 각각의 VH 중쇄 유전자좌는 1개 또는 복수의 V 유전자 세그먼트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 각각의 유전자좌는 오직 하나의 V 유전자 세그먼트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 각각의 V 유전자 세그먼트는 다른 모든 V 유전자 세그먼트 들과 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3항에 있어서, 각각의 V 유전자 세그먼트는 다른 모든 V 유전자 세그먼트들과 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 각각의 유전자좌에서 나머지 유전자 세그먼트들은 다른 모든 유전자좌내의 나머지 유전자 세그먼트들과 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5항에 있어서, 각각의 유전자좌에서 나머지 유전자 세그먼트들은 다른 모든 유전자좌내의 나머지 유전자 세그먼트들과 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 각각의 유전자좌는 복수의 V 유전자 세그먼트들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 어떤 하나의 유전자좌 내의 상기 V 유전자 세그먼트들은 모두 같은 종의 생물로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8항에 있어서, 어떤 하나의 유전자좌 내의 상기 V 유전자 세그먼트들은 상이한 종의 생물들로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 V 유전자 세그먼트들은 인간 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항 내지 제 4항 및 제 8항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 중쇄 유전자좌는, 39개의 기능성 인간 V 유전자 세그먼트들 및 복수의 유전자좌에 걸쳐 분포된 개선된 용해 특성을 갖도록 조작된 그들의 변이체들의 어떤 수 또는 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 상이한 중쇄 유전자좌는 형질전환 비-인간 포유동물의 게놈 내에서 단일 복사체로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 VH 중쇄 유전자좌는 1~40개의 D 유전자 세그먼트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 D 유전자 세그먼트들은 인간 D 유전자 세그먼트들인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 VH 중쇄 유전자좌는 1~20개의 J 유전자 세그먼트들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 J 유전자 세그먼트들은 인간 J 유전자 세그먼트들인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 VH 중쇄 유전자좌는 동일한 D 및 J 유전자 세그먼트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 VH 중쇄 유전자좌는 D 및 J 유전자 세그먼트의 상이한 조합들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 VH 중쇄 유전자좌는, 하나 이상의 V 유전자 세그먼트, 25개의 기능성 인간 D 유전자 세그먼트 및 6개의 인간 J 유전자 세그먼트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 VH 중쇄 유전자좌는, 생체내에서 이펙터 기능을 제공하는 적어도 하나의 중쇄 불변 지역을 암호화하는 유전자 세그먼트를 포함하고, 상기 불변 지역은 발현시 항체 내에 CH1 영역을 포함 하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 각각의 유전자좌는 하나의 특별한 불변 지역을 암호화하는 오직 하나의 유전자 세그먼트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 21항에 있어서, 각각의 유전자좌는, 각각 상이한 불변 지역을 암호화하는 하나 이상의 유전자 세그먼트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 21항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 유전자좌는 동일한 불변 지역-암호화 유전자 세그먼트(들)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 21항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 유전자좌는 상이한 불변 지역-암호화 유전자 세그먼트 또는 불변 지역-암호화 유전자 세그먼트들의 상이한 조합을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 21항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 불변 지역을 암호화하는 각각의 유전자 세그먼트는, 상기 중쇄 불변 지역 유전자 세그먼트들이 CH1 영역을 발현하지 않는다는 조건하에서, Cδ, Cγ1-4, Cμ, Cε 또는 Cα1-2 클래스의 하나 이상의 중쇄 불변 지역 엑손들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 21항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 불변 지역은 인간 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 1항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질전환 비-인간 포유동물내에서 2 이상의 이종성 VH 중쇄 유전자좌는 동일한 염색체 상에 일렬로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 1항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질전환 비-인간 포유동물내에서 하나 이상의 이종성 VH 중쇄 유전자좌는 상이한 염색체 상에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질전환 비-인간 포유동물은 설치류인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 30항에 있어서, 상기 설치류는 마우스인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 하나 이상의 이종성 VH 중쇄 유전자좌를 포함하는 형질전환 비-인간 포유동물.
  33. 제 32항의 형질전환 비-인간 포유동물을 항원으로 면역반응시키는 것에 의하여 중쇄만의 항체를 생산하는 방법.
  34. 다음의 단계들을 포함하는, 고친화도의 항원-특이적 VH 중쇄만의 항체의 생산방법:
    제 32항에 따른 형질전환 비-인간 포유동물을 항원으로 면역반응시키는 단계;
    B-세포 하이브리도마를 발현시키는 단계;
    항원-특이적 중쇄만의 항체를 발현하는 세포들을 선별하는 단계; 및
    재조합된 항원-특이적 친화도 성숙 VH 중쇄만의 항체를 분리하는 단계.
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