MX2008009685A - Generacion de anticuerpos solo de cadena pesada en animales transgenicos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para generar anticuerpos solo de cadena pesada VH en un mamífero no humano transgénico;en particular, la presente invención se refiere a un método de producción de un anticuerpo solo de cadena pesada VH en un mamífero no humano transgénico, que comprende el paso de expresar más de un locus heterólogo de cadena pesada VH en ese mamífero.

Description

GENERACION DE ANTICUERPOS SOLO DE CADENA PESADA EN ANIMALES TRANSGENICOS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a métodos mejorados para la preparación de un repertorio diverso de anticuerpos funcionales de afinidad madura, solo de cadena pesada, en mamíferos no humanos transgénicos, en respuesta a la provocación antigénica, y usos de los mismos. La invención también se refiere a la preparación de un repertorio diverso de anticuerpos específicos de clase, solo de cadena pesada, de múltiples locus. En particular, la presente invención se refiere a un método para generar anticuerpos humanos específicos de antígeno, solo de cadena pesada, de alta afinidad, de cualquier clase o mezclas de clases, y al aislamiento y expresión de dominios VH de unión de antígeno completamente funcionales. También se describen anticuerpos solo de cadena pesada generados usando los métodos de la presente invención. En la siguiente descripción, todos los números de posición de los residuos de aminoácido se dan de acuerdo con el sistema de numeración diseñado por Kabat y otros [1].

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Anticuerpos La estructura de los anticuerpos es muy conocida. La mayoría de los anticuerpos naturales son tetraméricos, comprendiendo dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Las cadenas pesadas están unidas una a la otra por medio de enlaces de disulfuro entre dominios de gozne localizados aproximadamente a la mitad de cada cadena pesada. Una cadena ligera está asociada con cada cadena pesada en el lado N-terminal del dominio de gozne. Cada cadena ligera normalmente está unida a su cadena pesada respectiva por medio de un enlace de disulfuro cercano al dominio de gozne. Cuando una molécula de anticuerpo se pliega correctamente, cada cadena se dobla en varios dominios globulares distintos unidos por secuencias de polipéptido más lineales. Por ejemplo, la cadena ligera se pliega en un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL). Las cadenas pesadas tienen un solo dominio variable, VH, un primer dominio constante (CH1 ), un dominio de gozne, y dos o tres dominios constantes adicionales. Los dominios constantes de cadena pesada y el dominio de gozne forman juntos lo que se conoce generalmente como la región constante de una cadena pesada de anticuerpo. La interacción de los dominios de cadena pesada (VH) y ligera (VL) da como resultado la formación de una región de unión de antígeno (Fv). La interacción de las cadenas pesadas y ligeras es facilitada por el dominio de CH1 de la cadena pesada, y el dominio C o CA de la cadena ligera. Generalmente se requiere tanto VH como VL para la unión del antígeno, aunque se ha visto que dimeros de cadena pesada y fragmentos amino-terminales retienen actividad en ausencia de cadena ligera [2]. Dentro de los dominios variables tanto de las cadenas pesadas (VH) como ligeras (VL), algunos segmentos cortos de polipéptido muestran variabilidad excepcional. Estos segmentos se denominan regiones hipervariables o regiones determinantes de complementariedad (CDR's). Los segmentos intermedios se denominan regiones de estructura (FR's). En cada uno de los dominios VH y VL, hay tres CDR's (CDR1 -CDR3). En los mamíferos hay cinco clases de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, con cuatro subtipos IgG y dos subtipos IgA presentes en los humanos.

Las clases de anticuerpos difieren en su función. Por ejemplo, la IgG desempeña una función dominante en una respuesta inmune madura. La IgM está implicada en la fijación del complemento y en la aglutinación. La IgA es la clase mayor de anticuerpo en las secreciones -lágrimas, saliva, calostro, moco- y por lo tanto tiene una función en la inmunidad local. Las funciones efectoras de los anticuerpos naturales son provistas por la región constante de cadena pesada. La IgA se puede encontrar en áreas que contienen moco (por ejemplo en el intestino, el tracto respiratorio o el tracto urogenital), e impide la colonización de áreas mucosales por patógenos. La IgD funciona principalmente como un receptor de antígeno sobre las células B. La IgE se una a los alérgenos y activa la liberación de histamina de los mastocitos (el mecanismo fundamental de la alergia), y también protege contra los helmintos (gusanos). La IgG (en sus cuatro isotipos) provee la mayor parte de la inmunidad basada en anticuerpo contra los patógenos invasores. La IgM es expresada sobre la superficie de las células B y también en forma secretada con una afinidad muy alta para eliminar patógenos en las etapas tempranas de la inmunidad mediada por células B (es decir, antes de que haya suficiente IgG para eliminar los patógenos). Las células B humanas normales contienen un solo locus de cadena pesada en el cromosoma 4, a partir del cual es producido el gen que codifica una cadena pesada por rearreglo. En el ratón, el locus de cadena pesada está localizado en el cromosoma 12. Un locus de cadena pesada normal comprende una pluralidad de segmentos de gen V, varios segmentos de gen D, y varios segmentos de gen J. La mayor parte de un dominio VH es codificada por un segmento de gen V, pero el extremo C terminal de cada dominio VH es codificado por un segmento de gen D y un segmento de gen J. El rearreglo de VDJ en las células B, seguido por maduración de afinidad, provee a cada dominio VH su especificidad de unión de antígeno. El análisis de secuencia de tetrámeros H2L2 normales muestra que resulta diversidad principalmente de una combinación de rearreglo de VDJ e hipermutación somática [3]. Existen más de 50 segmentos del gen V humano en el genoma humano, de los cuales únicamente 39 son funcionales. En la actualidad se pueden derivar anticuerpos completamente humanos (H2L2) de ratones transgénicos en respuesta a la provocación antigénica. Tales ratones transgénicos comprenden un solo locus de cadena pesada humana y un locus de cadena ligera separado. Los locus comparables de cadena pesada y ligera del ratón son suprimidos, de modo que únicamente se producen anticuerpos humanos en ausencia de los anticuerpos de ratón [4-10]. Con el surgimiento de nuevas técnicas de biología molecular, se identificó la presencia de anticuerpo solo de cadena pesada (carente de cadena ligera) en trastornos proliferativos de las células B en el hombre (enfermedad de cadena pesada) y en sistemas de modelo murino. El análisis molecular de la enfermedad de cadena pesada mostró que mutaciones y supresiones en el genoma podrían originar la inexpresión inadecuada del dominio CH1 de cadena pesada, produciendo la expresión de anticuerpo solo de cadena pesada que carece de la capacidad para unirse a la cadena ligera [1 1 , 12]. Se ha mostrado que los camélidos, como resultado de mutaciones genéticas naturales, producen dimeros solo de cadena pesada de lgG2 e lgG3 funcionales que son incapaces de unirse a la cadena ligera debido a la ausencia del dominio de CH1 , que media la unión con la cadena ligera [13]. Un rasgo que caracteriza al anticuerpo solo de cadena pesada del camélido es un subgrupo particular de dominios VH de camélido que mejora la solubilidad con respecto a los dominios VH humanos y de camélido normales. Los dominios VH de camélido de este subgrupo particular son referidos usualmente como los dominios VHH- También se ha mostrado que especies tales como el tiburón producen una familia de proteínas de unión del tipo de solo cadena pesada, probablemente relacionada con la cadena ligera de anticuerpo o receptor de células T de mamífero [14]. Para la producción de anticuerpo solo de cadena pesada de camélido, el locus de cadena pesada de la línea germinal de camélido comprende segmentos que codifican algunas o todas las posibles regiones constantes de cadena pesada. Durante la maduración, un dominio de unión VHHDJ rearreglado se empalma en el extremo 5' del segmento de gen que codifica el dominio de gozne, para proveer un gen rearreglado que codifica una cadena pesada que carece de un dominio CH1 y por lo tanto es incapaz de asociarse con una cadena ligera. Los dominios VHH de camélido contienen varios aminoácidos característicos en la posiciones 37, 44, 45 y 47 [49]. Se piensa que estos aminoácidos conservados son importantes para conferir solubilidad a los anticuerpos solo de cadena pesada. Solo ciertos dominios de VH de camélido son dominios VHH con características de solubilidad mejorada. Están limitados a una subfamilia de VH y por lo tanto responden productivamente solo a una gama limitada de antígenos. Anticuerpos monoclonales solo de cadena pesada pueden ser recuperados de las células B del bazo de camélidos mediante tecnología de clonación estándar o de ARNm de células B por tecnología de fago u otra tecnología de despliegue [18]. Los anticuerpos solo de cadena pesada derivados de los camélidos son de alta afinidad. El análisis de secuencia del ARNm que codifica anticuerpo solo de cadena pesada demuestra que resulta diversidad principalmente de una combinación de rearreglo VHHDJ e hipermutación somática [49], como también se observa en la producción de anticuerpo tetraméricos normales. Una característica importante y común de los dominios VH naturales de camélido y humano es que cada dominio se une como un monómero a un dominio VL para optimizar la solubilidad y afinidad de unión, sin depender de la dimerización. Recientemente se han desarrollado métodos para la producción de anticuerpos solo de cadena pesada en mamíferos no humanos transgenicos (véase WO 02/085945 y WO 02/085944). Se pueden producir anticuerpos funcionales solo de cadena pesada potencialmente de cualquier clase (IgM, IgG, IgD, IgA, o IgE), y derivarse de cualquier mamífero, partiendo de mamíferos no humanos transgénicos (preferiblemente ratones) como resultado de provocación antigénica. Estos estudios iniciales se basan en el uso de dos segmentos del gen V de llama y su desventaja es un repertorio limitado de respuesta de anticuerpo. Janssens y otros [15] han desarrollado métodos para la derivación de anticuerpos solo de cadena pesada en ratones transgénicos. Estos anticuerpos solo de cadena pesada tienen alta afinidad de unión como resultado de la maduración de anticuerpo en las células B; pueden derivarse por provocación antigénica y seleccionarse usando la tecnología de hibridoma establecida; y se pueden producir como cualquier clase de anticuerpo en ausencia de cadena ligera (por ejemplo IgG, IgA, IgM) o como los dominios de unión de VH solos. Estos anticuerpos solo de cadena pesada se derivaron de un locus de cadena pesada de anticuerpo en una configuración de línea germinal (es decir, no rearreglada) que contenía dos segmentos del gen VHH de llama (clase 3) acoplados con todos los segmentos de gen D y J humanos y segmentos de gen que codifican todas las regiones constantes humanas. Los segmentos de gen que codifican cada una de las regiones constantes tuvieron una supresión del dominio CH1 para impedir la unión de cadenas ligeras. Además, el locus contenía la LCR de anticuerpo en el extremo 3' para asegurar un alto grado de expresión en las células del linaje B. Este locus se introdujo en los ratones por microinyección de huevos fertilizados.

Producción de productos basados en anticuerpo La producción de productos basados en anticuerpo por ingeniería genética, en particular la producción de productos basados en anticuerpo humano o humanizado, ha resultado en la generación de nuevas clases de medicina, agentes de diagnóstico y reactivos, y en paralelo, la oportunidad de crear nuevas industrias, empleos y salud (véase www.drugresearcher.com, www.leaddiscovery.co.uk). Los productos basados en anticuerpo usualmente derivan de anticuerpos tetraméricos naturales. Existen muchas patentes y solicitudes que se refieren a la producción de productos basados en anticuerpo. Estas patentes y solicitudes se refieren a las rutas de derivación (por ejemplo partiendo de ratones transgénicos), rutas de fabricación y sustancias específicas de producto. Tales productos basados en anticuerpo varían de anticuerpos tetraméricos completos a fragmentos de anticuerpo y a moléculas Fv de una sola cadena (scFv). Los productos basados en anticuerpo representarán una alta proporción de las nuevas medicinas lanzadas en el siglo XXI. La terapia de anticuerpo monoclonal ya se acepta como una ruta preferida para el tratamiento de la artritis reumatoide y la enfermedad de Crohn, y existe un impresionante progreso en el tratamiento del cáncer. También están en desarrollo productos basados en anticuerpo para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares e infecciosas. La mayoría de los productos basados en anticuerpo comercializados reconocen y se unen a un solo epítope bien definido sobre el ligando objetivo (por ejemplo, TNFa). Recientemente, los dominios VH de alta afinidad han sido: seleccionados de dominios VH humanos aleatorizados en colecciones de despliegue, o derivados de anticuerpo solo de cadena pesada producido naturalmente por provocación antigénica en camélidos, o derivados de colecciones de dominio VH preparadas de camélidos. Estos dominios VH de alta afinidad han sido incorporados en productos basados en anticuerpo. Estos dominios VH, llamados también dominios VHH, exhiben varias diferencias de los dominios VH clásicos, en particular varias mutaciones que aseguran una mejor solubilidad y estabilidad de las cadenas pesadas en ausencia de cadenas ligeras. Entre estos cambios el más notable es la presencia de un aminoácido cargado en la posición 45 [16]. Varios grupos han trabajado en la generación de anticuerpos solo de cadena pesada derivados de anticuerpos tetraméricos naturales. Jaton y otros [2 y otras referencias ahí citadas] describen la separación de componentes de cadena pesada reducidos de un anticuerpo de conejo bien caracterizado de afinidad purificada, seguida por la renaturalización de las cadenas pesadas individuales. La caracterización inmunológica de las cadenas pesadas renaturalizadas demostró que un homodimero de cadena pesada solo, libre de cadena ligera, es capaz de unirse al antígeno. Later Ward y otros [18] demostraron sin ambigüedad que las regiones VH murinas clonadas, cuando se expresan como monómeros de proteína soluble en un sistema de expresión de E. coli, retienen la capacidad para unirse al antígeno con alta afinidad. Ward y otros [18] describen el aislamiento y caracterización de dominios VH y establecen las ventajas comerciales potenciales de este enfoque en comparación con la producción clásica de anticuerpo monoclonal (véase el último párrafo). También reconocen que los dominios VH aislados de cadenas pesadas que se asocian normalmente con una cadena ligera, carecen de la solubilidad de los anticuerpos tetraméricos naturales. Por lo tanto, Ward y otros [18] usaron el término "pegajosa" para describir estas moléculas, y propusieron que esta "pegajosidad" puede ser manejada mediante el diseño de dominios VH con propiedades mejoradas de solubilidad. El mejoramiento de la solubilidad de VH ha sido manejada subsiguientemente usando combinaciones de enfoques aleatorizados y dirigidos a sitio usando despliegue de fago. Por ejemplo, Davies y Riechmann [ 7] y otros (véase WO92/01047) incorporaron algunas de las características de los dominios VH de anticuerpos solo de cadena pesada de camélido, en combinación con despliegue de fago, para mejorar la solubilidad y mantener al mismo tiempo la especificidad de unión. Estudios separados sobre dominios VH humanos aislados derivados de colecciones de fago demostraron la unión específica de antígeno de los dominios VH, pero se observó que estos dominios VH eran de baja solubilidad. Además, se sugirió que la selección de dominios VH humanos con características de unión específicas desplegadas sobre arreglos de fago podrían formar los bloques de construcción de anticuerpos por ingeniería [18]. Se pueden construir por ingeniería dominios VH humanos para mejorar las características de solubilidad [19, 20], o la solubilidad puede ser adquirida por selección natural in vivo [21 ]. Sin embargo, cuando los dominios de unión de VH son derivados de colecciones de fago, las afinidades intrínsecas para el antígeno permanecen en la escala mícromolar baja a nanomolar alta, a pesar de la aplicación de estrategias de mejoramiento de afinidad que incluyen, por ejemplo, aleatorización de punto caliente de afinidad [22]. Los dominios VH de humano o VH de camélido producidos por tecnología de despliegue de fago o de despliegue alternativo carecen de la ventaja de características mejoradas como resultado de mutaciones somáticas y la diversidad adicional provista por la recombinacíón de segmentos de genes D y J en la región CDR3 del sitio normal de unión de anticuerpo. Algunos dominios VH(VHH) de camélido, aunque muestran beneficios de solubilidad con respecto al VH humano, pueden ser antigénicos en el hombre y además tienen la desventaja de que el VH de camélido debe ser generado por inmunización de camélidos o por tecnología de despliegue de fago. El uso de regiones VH humanas derivadas de fago es laborioso puesto que se requieren muchas rondas de selección y mutagénesis subsiguiente para obtener características de unión de alta afinidad. Los dominios VHH de camélido requieren el mismo procedimiento laborioso cuando se aislan de colecciones de despliegue de fago o similares, o requieren la inmunización de animales grandes (llamas o camellos que también hacen anticuerpos clásicos), no susceptibles de tecnología clásica de hibridoma. Además los dominios de unión de camélido pueden ser antigénicos y requieren humanización. La producción de anticuerpos solo de cadena pesada en mamíferos no humanos transgénicos como resultado de provocación antigénica (véase WO 02/085945 y WO 02/085944), supera muchos de estos problemas. Sin embargo, persiste la necesidad de maximizar la diversidad de anticuerpo solo de cadena pesada y la respuesta de células B in vivo, y en particular de generar un repertorio funcional de anticuerpos solo de cadena pesada humanos específicos de clase, y dominios de unión solo de cadena pesada VH funcionales que retengan un potencial máximo de unión de antígeno, para usarse en diversas aplicaciones clínicas, industriales y de investigación.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Sorprendentemente, los presentes inventores han superado las imitaciones de la técnica anterior, y muestran que el repertorio de la respuesta de anticuerpo se puede incrementar considerablemente aumentando el número de locus solo de cadena pesada presentes en un mamífero no humano transgénico, usado para producir anticuerpos solo de cadena pesada específicos de clase. La invención se basa en el descubrimiento de que cuando un mamífero no humano transgénico posee múltiples locus solo de cadena pesada, estos locus son sometidos a exclusión alélica. Por lo tanto, solo un locus es elegido y recombinado exitosamente, dando como resultado la producción de un anticuerpo solo de cadena pesada. Por lo tanto, se pueden usar múltiples locus de cadena pesada VH en el mismo mamífero no humano transgénico para maximizar el repertorio de anticuerpo y la diversidad obtenible del mamífero. Cuando se le provoca antigénicamente, el mamífero no humano transgénico "selecciona" el locus que comprende el segmento del gen V que es más adecuado para responder a la provocación antigénica específica, para la exclusión de los locus restantes. Los anticuerpos solo de cadena pesada que pueden ser generados por los métodos de la invención muestran alta afinidad de unión como resultado de que el mamífero no humano transgénico es capaz de "elegir" de una gama de locus, de los cuales pueden ocurrir rearreglos de segmento del gen V, D y J y mutaciones somáticas, generalmente en ausencia de un lazo CDR3 agrandado. Se observa maduración de células B esencialmente normal con altas cantidades de anticuerpo solo de cadena pesada presentes en el plasma aislado (siempre que se haya eliminado el dominio CH1 de todas las clases de anticuerpo presentes en el locus recombinante). La maduración de células B y la secreción de los dímeros (por ejemplo IgG) o multímeros (por ejemplo IgM) ensamblados, no depende de la presencia o expresión de genes de cadena ligera. Por consiguiente, en el primer aspecto de la presente invención, se provee un método de producción de un anticuerpo solo de cadena pesada VH en un mamífero no humano transgénico, que comprende el paso de proveer más de un locus heterólogo de cadena pesada VH en ese mamífero, en donde cada locus de cadena pesada VH comprende uno o más segmentos del gen V, uno o más segmentos del gen D, uno o más segmentos del gen J, y un segmento de gen que codifica una región constante de cadena pesada que, cuando se expresa, no incluye un dominio CH1 y expresa un anticuerpo solo de cadena pesada VH de por lo menos uno de dichos locus. Preferiblemente, cada locus de cadena pesada VH comprende uno o más segmentos del gen V, por ejemplo 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50 o 60 segmentos del gen V, que pueden derivarse de cualquier especie de vertebrado. En una modalidad, cada locus comprende solo un segmento de gen V. En una alternativa de esta modalidad, cada segmento del gen V es diferente de todos los otros segmentos del gen V. En una segunda alternativa, cada segmento del gen V es idéntico a todos los otros segmentos del gen V. En esta segunda alternativa, los restantes segmentos de gen de cada locus pueden ser ¡guales o pueden ser diferentes de todos los otros locus.

Así, se contempla que el mamífero no humano puede contener múltiples copias de un solo locus de cadena pesada VH. Esto tiene la ventaja de optimizar la probabilidad de que ocurra un rearreglo productivo en una célula B, permitiendo asi la producción de un anticuerpo solo de cadena pesada útil. Si el mamífero no humano contiene varios locus de cadena pesada VH diferentes, esto optimizará más la probabilidad de obtener un anticuerpo solo de cadena pesada con una especificidad deseada. En otra modalidad, cada locus comprende múltiples segmentos del gen V. En esta modalidad, todos los segmentos del gen V en cualquier locus pueden ser derivados de un organismo de la misma especie, por ejemplo todos los segmentos del gen V pueden ser de origen humano. Alternativamente, los segmentos del gen V de cualquier locus pueden derivarse de organismos de especies diferentes, por ejemplo algunos segmentos del gen V de humano y otros de camélidos o de tiburones. Preferiblemente, los segmentos del gen V son de origen humano. El término "segmento del gen V" abarca cualquier segmento del gen V natural derivado de un vertebrado, incluyendo camélidos y humano. El segmento del gen V debe ser capaz de recombinarse con un segmento del gen D, un segmento del gen J, y un segmento de gen que codifica una región constante de cadena pesada (efectora) (que puede comprender varios exones pero excluye un exón CH1 ), para generar un anticuerpo solo de cadena pesada VH cuando se expresa el ácido nucleico. Un segmento del gen V también incluye dentro de su alcance cualquier secuencia de gen que codifica un homólogo, derivado, o fragmento de proteína que es capaz de recombinarse con un segmento del gen D, un segmento del gen J y un segmento de gen que codifica una región constante de cadena pesada (que comprende uno o más exones pero no un exón CH1 ), para generar un anticuerpo solo de cadena pesada como aquí se define. Un segmento del gen V puede ser derivado, por ejemplo, de un locus del receptor de células T, o un locus de cadena ligera de inmunoglobulina. Preferiblemente, los locus múltiples de cadena pesada de la invención comprenden cualquier número o combinación de los 39 segmentos del gen V humanos funcionales, y variantes construidas por ingeniería de los mismos con propiedades mejoradas de solubilidad, distribuidos a través de los múltiples locus. Estos pueden estar en cualquier número de locus, por ejemplo 4 locus que comprenden 8 segmentos del gen V más un locus que comprende 7 segmentos del gen V; 7 locus que comprenden 4 segmentos del gen V más 1 locus que comprende 3 segmentos del gen V; o 39 locus que comprenden, cada uno, un segmento del gen V. Los genes V humanos se clasifican en 7 familias, VH1 a VH7, y los genes individuales de cada familia se numeran. La frecuencia a la cual se usa cada gen depende de diversos requerimientos de la respuesta inmune particular. Por ejemplo, los genes de la familia VH3 pueden ser usados preferentemente en comparación con los de la familia VH5 cuando responden a antigenos bacterianos. Por lo tanto, en una modalidad preferida adicional de la invención, se ha mostrado que los segmentos del gen V son útiles para generar una respuesta de anticuerpo contra antígenos específicos agrupados en líneas separadas de mamíferos no humanos transgénicos. Los segmentos del gen V se pueden agrupar de acuerdo con la familia o se pueden agrupar de acuerdo con la función individual. Por ejemplo, si se muestra que los genes V de la familia VH3 son útiles para generar una respuesta inmune contra antígenos bacterianos, entonces éstos se pueden usar para generar un mamífero no humano transgénico que es particularmente útil para generar anticuerpos solo de cadena pesada contra los antígenos bacterianos. Alternativamente, si se muestra que varios genes individuales de las familias VH3 y VH5 son útiles para generar una respuesta inmune contra antígenos bacterianos, entonces éstos se pueden agrupar y usarse para generar un mamífero no humano transgénico que es particularmente útil para generar anticuerpo solo de cadena pesada contra los antígenos bacterianos. En el contexto de la presente invención el término "heterólogo" significa una secuencia de nucleótidos o un locus como se describe aquí, que no es endógeno para el mamífero en el cual está localizado. Un "locus de cadena pesada VH", en el contexto de la presente invención, se refiere a un microlocus mínimo que codifica un dominio VH que comprende uno o más segmentos del gen V, uno o más segmentos del gen D, y uno o más segmentos del gen J, enlazados operativamente a uno o más segmentos de gen que codifican regiones efectoras de cadena pesada (que carecen de un dominio CH1 ). Preferiblemente, la fuente primaria de variabilidad del repertorio de anticuerpo es la región CDR3 formada por la selección de los segmentos del gen V, D y J, y por las uniones V-D y D-J. La ventaja de la presente invención es que el repertorio y la diversidad de anticuerpo obtenidos en las secuencias del gen VH rearregladas, pueden ser maximizadas usando múltiples locus de cadena pesada VH en el mismo mamífero no humano transgénico. Janssens y otros, 2006 [15], han mostrado que un locus transgénico como se describe arriba se comporta como un locus de inmunoglobulina normal en cuanto a rearreglo y exclusión alélica. Esto abre la posibilidad de tener múltiples locus en el mismo animal (sobre cromosomas diferentes) para maximizar el número de posibles recombinaciones de VH, aprovechando la exclusión alélica. Cada uno de los locus transgénicos contendría desde uno hasta más de cuarenta regiones VH. El proceso de exclusión alélica que elige aleatoriamente uno de los locus para empezar la recombinación, seguido por el siguiente locus si la primera recombinación no fue productiva, etcétera, hasta que se haya producido una recombinación productiva de uno de los locus, aseguraría que realmente todas las regiones VH presentes en los locus combinados serían parte del proceso de recombinación global. Janssens y otros [15] también han encontrado sorprendentemente que cuando múltiples locus de cadena pesada del mismo mamífero no humano transgénico están en tándem en el mismo cromosoma, entonces puede ocurrir un rearreglo productivo y expresión de anticuerpo de los múltiples locus de cadena pesada. En tales casos, las clonas de hibridoma subsiguientes son policlonales. El experto en la materia apreciará que éste es otro mecanismo para aumentar la diversidad de anticuerpo. Por consiguiente, en otro aspecto de la invención, se provee un método como el que aquí se describe en donde están presentes en tándem en el mismo cromosoma por lo menos dos o más locus de cadena pesada VH del mamífero no humano transgéníco, y entonces puede ocurrir rearreglo productivo y expresión de anticuerpo de dos o más locus simultáneamente. Preferiblemente, primero varios locus de cadena pesada serán introducidos separadamente en un mamífero no humano transgénico, generando mamíferos no humanos transgénicos con un solo locus de cadena pesada. Después, estos animales se cruzarán para generar progenie con múltiples locus de cadena pesada para maximizar el número de regiones VH, dando como resultado una diversidad máxima. Los locus también se pueden añadir mediante una nueva ronda de transgénesis. Los nuevos locus se inyectarían en huevos derivados de los mamíferos no humanos que ya comprenden uno o más locus heterólogos de cadena pesada VH. La integración estable de locus heterólogos de cadena pesada VH nuevos resultaría en un aumento de las regiones VH disponibles y por lo tanto en diversidad. La transfección estable de células ES derivadas de los mamíferos transgénicos no humanos que comprenden un locus heterologo de cadena pesada VH con locus adicionales heterólogos de cadena pesada VH, provee una ruta alternativa para aumentar la diversidad en mamíferos no humanos (por ejemplo ratones), en donde se puede usar tecnología de célula ES para la transgénesis por fusión de embrión e inyección de blastocito. Preferiblemente, cada locus de cadena pesada diferente estará presente como una sola copia en el genoma del mamífero no humano transgénico. Además, el uso de múltiples segmentos de genes V, D y J provee un mayor aumento en el repertorio y diversidad de anticuerpo obtenible. Se obtiene mutación somática subsiguiente mientras se usa un locus mínimo (microlocus) sin la necesidad de los locus de anticuerpo de VL y Le (cadena ligera). En el contexto de la presente invención, los términos "un segmento del gen D" y "un segmento del gen J" incluyen secuencias naturales de segmentos de genes D y J. Preferiblemente, los segmentos del gen D y J derivan del mismo vertebrado del cual deriva el segmento del gen V. Por ejemplo, si un segmento del gen V deriva de un humano, entonces como se requiere solubilizado o modificado por ingeniería, los segmentos de genes D y J preferiblemente también derivan de un humano. Alternativamente, los segmentos del gen V se pueden derivar, por ejemplo, de un camélido, y los segmentos de los genes D y J se pueden derivar de humano, o viceversa. Los términos segmento del gen D y segmento del gen J también incluyen dentro de su alcance derivados, homólogos y fragmentos de los mismos, siempre que el segmento resultante se pueda recombinar con los componentes restantes de un locus de anticuerpo de cadena pesada como aquí se describe, para generar un anticuerpo solo de cadena pesada como aquí se describe. Los segmentos de los genes D y J se pueden derivar de secuencias naturales o se pueden sintetizar usando los métodos que son familiares para los expertos en la materia y que aquí se describen. Los segmentos de gen V, D y J son capaces de recombinarse y preferiblemente sufren mutación somática. Los segmentos de gen D y J derivan preferiblemente de una sola especie de vertebrado. Esta puede ser cualquier especie de vertebrado, pero preferiblemente es de un humano. Preferiblemente, cada locus de cadena pesada VH comprende de uno a cuarenta segmentos del gen D (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, o 40), o más. Los segmentos del gen D pueden derivar de cualquier especie de vertebrado, pero muy preferiblemente los segmentos del gen D son segmentos del gen D humano (normalmente 25 segmentos del gen D funcionales). . Preferiblemente, cada locus de cadena pesada VH comprende de uno a veinte segmentos del gen J (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, o 20), o más. Los segmentos del gen J se pueden derivar de cualquier especie de vertebrado, pero muy preferiblemente los segmentos del gen J son segmentos del gen J humano (normalmente 6 segmentos del gen J). Cada locus de cadena pesada VH puede contener los mismos segmentos de genes D y J. Alternativamente, cada locus de cadena pesada VH puede contener diferentes combinaciones de los segmentos de genes D y J. Por ejemplo, cuando cada locus de cadena pesada VH contiene solo un segmento del gen V y este segmento es idéntico en cada locus, entonces es ventajoso usar diferentes combinaciones de los segmentos de genes D y J en cada locus, para optimizar más la probabilidad de obtener un rearreglo productivo. Sin embargo, cuando cada locus de cadena pesada VH contiene uno o más segmentos del gen V diferentes, puede ser ventajoso usar la misma combinación de segmentos de genes D y J en cada locus. Preferiblemente, el locus de cadena pesada VH comprende uno o más segmentos del gen V, veinticinco segmentos funcionales del gen D humano, y seis segmentos del gen J humano. Cada segmento de gen que codifica una región constante de cadena pesada puede comprender uno o más exones de región constante de cadena pesada de la clase C5, Cy-i-4, ?µ, Ce o Cai-2, con la condición de que los segmentos de gen de la región constante de cadena pesada no expresen un dominio CH . LOS segmentos de gen de la región constante de cadena pesada se seleccionan dependiendo de la clase o mezcla de clases preferida de anticuerpo. Opcionalmente, el locus heterólogo de cadena pesada es deficiente en ?µ y C5. De esta manera, cada locus de cadena pesada VH puede comprender un segmento de gen que codifica por lo menos una región constante de cadena pesada que provee funciones efectoras in vivo (por ejemplo, IgG, IgM, IgA, IgE o IgD, o un isotipo de las mismas), en donde cada región constante no incluye un dominio CH1 . Cada locus puede contener solo un segmento de gen que codifica una región constante particular. Esto será ventajoso si se requieren ciertas funciones efectoras. Alternativamente, cada locus puede comprender más de un segmento de gen, cada uno codificando una región constante diferente. Esto será ventajoso si no se requieren funciones efectoras particulares, ya que permitirá producir una variedad de clases de anticuerpo solo de cadena pesada. Cada locus puede contener los mismos segmentos de gen codificadores de región constante, o cada locus puede tener segmentos diferentes, o una combinación diferente de segmentos de gen codificadores de la región constante. Operacionalmente, una región constante de cadena pesada es codificada por un segmento de gen natural o construido por ingeniería que es capaz de recombinarse en una célula B con un segmento del gen V, un segmento del gen D, y un segmento del gen J. En cada anticuerpo solo de cadena pesada, la región constante es expresada sin un dominio CH1 , de tal manera que puede ocurrir la generación de anticuerpo solo de cadena pesada. Los exones CH se pueden suprimir de modo que la región constante del anticuerpo solo de cadena pesada VH que se describe arriba no contenga un dominio CH1 funcional. La inclusión de regiones constantes de cadena pesada específicas de clase cuando se construyen por ingeniería complejos de unión multivalentes, provee los beneficios terapéuticos de función efectora in vivo dependientes de la funcionalidad requerida. La ingeniería de regiones efectoras individuales también puede agregar o suprimir funcionalidad [23]. De esta manera, la inclusión de la funcionalidad de la región constante de IgA proveería una función mucosal mejorada contra los patógenos [24], mientras que la presencia de la funcionalidad de la región constante de lgG1 provee un incremento de estabilidad en el suero in vivo. La presencia de dominios constantes de cadena pesada CH2 y CH3 provee la base de la dimerización estable como se observa en los anticuerpos naturales, y provee sitios de reconocimiento para glicosilación posterior a la traducción. La presencia de CH2 y CH3 también permite el reconocimiento de anticuerpo secundario cuando se usan complejos biespecíficos y multivalentes como reactivos y diagnósticos. Por ejemplo, se sabe que los anticuerpos IgM desempeñan una función importante en la activación de macrófagos y de la ruta del complemento. Debido a la estrecha cercanía de sus sitios de unión, IgM tiene una alta avidez por patógenos que incluyen virus. Sin embargo, también se sabe que la IgM puede ser difícil de usar en técnicas de inmunoensayo rápidas, mientras que los anticuerpos IgG se pueden usar fácilmente en estas técnicas. Para tales usos, sería de utilidad seleccionar la clase de anticuerpo preferida, es decir, IgG o IgM. La expresión de una parte o todo un locus heterólogo de cadena pesada Cy que carece de CH1 producirá opcionalmente algunos o todos los isotipos de IgG, dependiendo de los isotipos lgG1 , lgG2, lgG3 e lgG4 presentes en el locus heterólogo de IgG. Alternativamente, las cadenas pesadas pueden comprender genes Ce. La molécula de IgE resultante también se podría usar en terapia. Alternativamente, se pueden obtener mezclas seleccionadas de anticuerpos. Por ejemplo, se puede obtener IgA e IgM cuando la región constante de cadena pesada comprende un gen Cor, y un ?µ. Preferiblemente, la región constante de cadena pesada es de origen humano, en particular cuando el anticuerpo solo de cadena pesada se va usar para aplicaciones terapéuticas en humanos. Cuando se usan los anticuerpos solo de cadena pesada para fines veterinarios, la región constante de cadena pesada se deriva preferiblemente del organismo, vertebrado o mamífero objetivo en el cual se va a realizar la terapia veterinaria. Cuando se expresa, cada región constante de cadena pesada carece de un dominio CH1 . Preferiblemente se suprime el exón CH . Opcionalmente las regiones constantes C/v y Có" se pueden mutar, suprimir o sustituir. Por ejemplo, la presencia de IgM con un dominio funcional de CH 1 inhibe la maduración de células B y consecuentemente limita la expresión productiva de IgG solo de cadena pesada (carente de CH1 ) dentro del mismo locus. Un "exón de región constante de cadena pesada" ("exón CH"), como se define aquí, incluye las secuencias de exones CH naturales de vertebrado, pero especialmente de mamífero. Esto varía de manera específica de clase. Por ejemplo, la IgG y la IgA carecen naturalmente de un dominio CH . El término "exón CH" también incluye en su alcance derivados, homólogos y fragmentos del mismo, siempre que el exón CH sea capaz de formar un anticuerpo solo de cadena pesada funcional como se define en la presente, cuando es un componente de una región constante de cadena pesada. Opcionalmente, cuando está presente, el dominio CH4 u otros dominios funcionales se pueden modificar por ingeniería o suprimir dentro del transgen, siempre que dicho proceso no inhiba el proceso de secreción intracelular, maduración de célula B, o la actividad de unión del anticuerpo resultante. Se pueden construir por ingeniería moléculas efectoras de cadena pesada para que estén libres de dominios funcionales, por ejemplo los dominios CH4 carboxi terminales, siempre que la ingeniería no afecte los mecanismos secretorios impidiendo el ensamble en la superficie celular y consecuentemente la maduración de células B. Se pueden construir por ingeniería características adicionales en el locus, por ejemplo para mejorar la glicosilación o añadir una función. Por consiguiente, el locus de cadena pesada heterólogo se diseña para producir clases o mezclas preferidas de anticuerpos solo de cadena pesada que dependen de las clases de anticuerpo requeridas, esencialmente con maduración normal de células B. La utilización de segmentos de gen V, D y J de camélido y regiones efectoras de camélido producirá anticuerpos de camélido con características peculiares para los anticuerpos de camélido, tales como lazos CDR3 agrandados. El uso de segmentos V, D y J humanos producirá anticuerpos solo de cadena pesada humanos que carecen del lazo CDR3 agrandado. Un "dominio VH", en el contexto de la presente invención, se refiere a un producto de expresión de un segmento del gen V cuando se recombina con un segmento del gen D y un segmento del gen J como se define arriba. Preferiblemente, el dominio VH tiene una capacidad mejorada para unirse al antígeno como resultado de la recombinación VDJ y mutación somática. No hay dependencia de la presencia o ausencia del lazo CDR3 agrandado, peculiar para la especie de camélido. El dominio VH es capaz de unirse al antigeno como un monómero. Cualquier probabilidad de combinarse con un dominio VL cuando se expresa como parte de un complejo de anticuerpo solo de cadena pesada, ha sido eliminada por la remoción del exón CH1 (véase [25]). El dominio VH solo se puede construir por ingeniería con diversos dominios de proteína para producir proteínas de fusión para fines terapéuticos y diagnósticos dirigidos, por ejemplo con toxinas, enzimas y agentes de imagen. Las secuencias codificadoras del dominio VH se pueden derivar de una fuente natural o se pueden sintetizar usando métodos familiares para los expertos en la materia. Las propiedades del dominio VH se pueden alterar o mejorar seleccionando o construyendo por ingeniería segmentos del gen V, D o J que codifican secuencias con las características requeridas. Como se indicó arriba, algunas de las 39 regiones VH humanas funcionales pueden no ser adecuadas para la producción de anticuerpos solo de cadena pesada. Se han realizado varios estudios que intentan mejorar diversas características del anticuerpo [26, 29]. Con respecto a las características específicas de la región VH, Dolk y otros [30] usaron técnicas de despliegue de fago para generar anticuerpos solo de cadena pesada que muestran estabilidad mejorada en condiciones severas asociadas con un champú anticaspa. El mamífero no humano transgénico es preferiblemente un roedor, tal como un conejo, conejillo de indias, rata o ratón. Se prefieren especialmente los ratones. También se pueden usar mamíferos alternativos tales como cabras, ovejas, gatos, perros u otros animales. Preferiblemente, el mamífero es un ratón. Preferiblemente, los animales no humanos transgénicos se generan usando solo la tecnología de inyección de oocito establecida. Cuando se establezca, también se puede usar tecnología de célula ES o clonación. Ventajosamente, los locus de cadena pesada y opcionalmente de cadena ligera de anticuerpo, endógenos para el mamífero, son suprimidos o silenciados cuando se expresa un anticuerpo solo de cadena pesada de acuerdo con los métodos de la invención. Los métodos para generar anticuerpos solo de cadena pesada como se describe en los aspectos anteriores de la invención, pueden ser de uso particular en la generación de anticuerpos para uso terapéutico humano, ya que frecuentemente la administración de anticuerpos a una especie de vertebrados que es de origen diferente de la fuente de los anticuerpos, da como resultado la aparición de una respuesta inmune contra los anticuerpos administrados. Los anticuerpos producidos de acuerdo con la invención tienen la ventaja sobre los de la técnica anterior de que son sustancialmente de una sola clase o de una clase conocida, y preferiblemente de origen humano. Los anticuerpos son de alta afinidad originada de una combinación de la recombinación VDJ y la maduración de afinidad in vivo. Por consiguiente, un aspecto adicional de la invención provee un mamífero no humano transgénico que comprende más de un locus de cadena pesada VH heterólogo como se define arriba. Preferiblemente, el mamífero no humano transgénico se puede construir por ingeniería para que tenga capacidad reducida para producir anticuerpos que incluyen cadenas ligeras. Se pueden derivar células productoras de anticuerpo de los mamíferos no humanos transgénícos como se define en la presente, y se usan por ejemplo en la preparación de hibridomas para la producción de anticuerpos solo de cadena pesada como se definen en la presente. Adicionalmente o alternativamente, se pueden aislar secuencias de ácido nucleico de estos mamíferos no humanos transgénícos y usarse para producir anticuerpos solo de cadena pesada de dominio VH, o complejos biespecíficos/bifuncionales de los mismos, usando técnicas de ADN recombinante que son familiares para los expertos en la materia. Alternativamente o adicionalmente, se pueden generar anticuerpos solo de cadena pesada específicos de antígeno por inmunización de un mamífero no humano transgénico como se define en la presente. Por consiguiente, la invención también provee un método para la producción de anticuerpos solo de cadena pesada inmunizando un mamífero no humano transgénico como se define arriba con un antígeno. Los anticuerpos y sus fragmentos se pueden aislar, caracterizar y fabricar usando métodos bien establecidos conocidos para los expertos en la materia. Estos anticuerpos son de uso particular en los métodos descritos en PCT/GB2005/00292. La invención se describe ahora únicamente a manera de ejemplo en la siguiente descripción detallada, que se refiere a las siguientes figuras.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una representación esquemática de los fragmentos de ADN usados para generar los ratones transgénicos. Dos de los exones VHH de llama están enlazados a los segmentos del gen de diversidad (D) y unión (J) de cadena pesada humana, seguidos por los genes de región constante humana Cp, C5, Cy2 y Cy3, y LCR 3' de Ig de cadena pesada humana. Las modificaciones de los genes Cy2 y Cy3 humanos fueron una supresión completa del exón CH1 de los genes Cy2 y Cy3 en las construcciones ?T? y GA, o también de Cp en la construcción ??T?. La presencia de dos sitios Lox P (en rojo) en la misma dirección permite la remoción de los genes ?µ y Có tras la recombinación mediada por Cre. La presencia del sitio Frt (en verde) permite la generación de un ratón transgénico de una sola copia a partir de un arreglo transgénico de múltiples copias por recombinación mediada por Flp. La figura 2A muestra el análisis de citometría de flujo de las poblaciones de células B de ratones wt, µ??, MGA/pMT, ??T?/µ?? y T?/µ?? en la BM. Las células linfoides se seleccionaron basándose en la dispersión delantera y lateral, y se gráfico la expresión en superficie de B220 e IgM o IgG humana. Los datos se presentan como gráficas de puntos. Para los ratones ?T? µ??, se seleccionó la fracción B220+ y se analizó para determinar la expresión de las cadenas H µ y ? de Ig humana intracelular (ic), presentada como sobreposiciones de histograma (líneas rojas), con tinción de fondo de células B220+ de ratones µ?? (líneas negras) como controles. Se indican los porcentajes de células positivas. La figura 2B muestra que la expresión del transgen ??T? o GA rescata la función pre-BCR y BCR. Perfiles de expresión de los marcadores indicados en fracciones totales de CD 19+ de ratones µ?? (células pro-B), en fracciones de IgM- de superficie de CD 19+ (células pro-B/pre-B), en fracciones de lgM+ de superficie de CD 19+ (células B) de ratones de tipo silvestre, en fracciones de lgM+ humanas de superficie de CD 19+ de ratones ??-ß? µ?? (células B), fracciones de lgG+ humanas de superficie de CD 19+ de ratones GA µ?? (células B); ic-lg = cadena L de Ig ? intracelular. Los datos de citometría de flujo se muestran como histogramas. Los datos mostrados son representativos de 3-8 animales examinados en cada grupo. La figura 2C muestra la alineación de secuencia de los productos -de PCR obtenidos de ADNc de BM usando iniciadores específicos de VHHI y VHH2 en combinación con un iniciador de Cy2 humano, mostrando la recombinación VDJ. Las secuencias son de GA. El verde muestra la identidad de secuencia. La figura 3A-figura 3F muestran la FISH de ADN de un locus GA humano de cinco copias. La figura 3A muestra fibra de cromatina estirada de células de pulmón de un ratón transgénico GA de lineal que lleva cinco copias intactas (1-5) del locus GA, flanqueado por la mitad de un locus que contiene la LCR (rojo) y la mitad de un locus que lleva la región VHH a J (verde). La figura 3B muestra la FISH de fibra de cromatina estirada de un hibridoma (G20) derivado de células B de GA de lineal , en donde se ha rearreglado una copia (flecha blanca). La figura 3C muestra la FISH de ADN no estirado del hibridoma T1 con la sonda de LCR (rojo). La figura 3D muestra lo mismo que la figura 3C con una sonda entre VHH y D (verde). La figura 3E muestra la sobreposición de las figuras 3C y 3E. Es de notar que T1 tiene cuatro rearreglos visibles como la pérdida de 4 señales verdes en comparación con ninguna pérdida de señales rojas. La figura 3F muestra que la exclusión alélica en ratones transgénicos GA está conservada. Análisis de citometría de flujo de la cadena H µ murina de superficie o intracelular (ic) e IgG humana transgénica sobre las fracciones de células CD19+ de BM de los ratones indicados. Los datos se muestran como gráficas de puntos y se dan los porcentajes de células dentro de los cuadrantes indicados. Los datos mostrados son representativos de cuatro ratones examinados de cada grupo. Las figura 4A-4D muestran el análisis de las poblaciones de células B en el bazo de ratones wt, µ??, GA, MAGA y MGA. Los datos mostrados son representativos de 4-8 ratones examinados en cada grupo. La figura 4A muestra: arriba, datos de FACS de células de bazo, teñidlas para IgM de ratón, IgG humana, IgM humana contra B220; abajo, análisis de citometría de flujo de poblaciones de células B en el bazo. Las células linfoides se seleccionaron basándose en la dispersión delantera y lateral, y la expresión en superficie de B220 y la Ig indicada (parte superior) o el perfil de CD21/CD23 se muestra como gráficas de puntos y se dan los porcentajes de células dentro de las puertas indicadas. CD21 |OWCD23i0w: células B inmaduras; CD21 +CD23+: células B foliculares; CD21 h¡ghCD23ioW: células B de zona marginal. La figura 4B muestra la histología del bazo de ratones wt, µ??, GA/µ??, MAGA/ µ?? y MGA/ µ??. Análisis inmunohistoquímico; secciones congeladas de 5µ?t? se tiñeron con anti-B220 (azul) para células B y antí-CD1 1 c/N4 8 (pardo) para células dendríticas. Las flechas indican la localización de pequeños racimos de células B en los bazos de MGA.

La figura 4C muestra la alineación de secuencia de los productos de PCR obtenidos de ADNc de la placa de Peyer usando iniciadores específicos de VHHI y VHH2 en combinación con iniciador de Cy2 humano, mostrando que el locus transgénico sufre hipermutación en las regiones CDR1 y 2. Las secuencias son del locus transgénico T? con una supresión CH1 . La figura 4D muestra, arriba: datos de FACS de células de bazo, teñidas con anti-CD 19 y anti-B220; abajo, izquierda: representación esquemática de la recombinación de Flp in vivo por reproducción a la línea transgénica FlpeR, y datos de FACS de células de bazo del recombinante de una sola copia derivado de GA lineal de cinco copias; abajo, derecha: representación esquemática de la recombinación de Cre in vivo por reproducción de líneas ?T? a una línea transgénica CAGCe, apoyando los datos de exploración de FACS sobre las células de bazo del recombinante, mostrando el rescate de células B observado en las líneas GA originales generadas directamente. La figura 5A- figura 5B representan Southern blots que muestran la ausencia del rearrgelo de la cadena ligera ? en líneas transgénicas GA/pMT (figura 5A) y ????/µ?? (figura 5B). ADN del hígado (L) y células B (B) de un ratón wt y dos ratones transgénicos GA o cuatro MAGA se digirieron con Hind III y se sondearon con la sonda JK radiomarcada con 32P y la sonda anhidrasa carbónica II (CAN). La sonda CAII, que híbrida con una banda de 4 kb, se usó como un control de carga. Se corrió ADN del hígado para mostrar la configuración de línea germinal (banda de 2.8 Kb). Solo las células B de wt muestran un rearreglo del locus medido como una disminución de la intensidad del fragmento de 2.8 kb (30% de señal dejada en comparación con el hígado). La figura 6A-figura 6G representan muestras de suero purificadas por Prot G o concavalina de 6 líneas de GA diferentes (A, B), 4 líneas de MAGA diferentes (C), y 2 líneas de MGA diferentes (E-G), en el µ?? de fondo corrido bajo condiciones no reductoras (A) y reductoras (B-G). El tamaño de la IgG humana transgénica (figuras 6B, 6F) e IgM (figuras 6C, 6D) es consistente con la supresión de CH1 y la ausencia de cadenas ligeras. Las cadenas ligeras ? de ratón fueron de tamaño normal (G). Se usó suero humano como control positivo. La figura 6D muestra el fraccionamiento de tamaño con Superóse 6 del suero de MAGA después de mezclar en un control de IgM humana bajo condiciones no reductoras. Cada fracción se analizó por electroforesis en gel bajo condiciones reductoras. Las fracciones recogidas de la columna de Superóse 6 son de izquierda (PM alto) a derecha (PM bajo). Los controles son suero humano solo (primer carril de la izquierda) y suero de ratón antes de mezclar en el suero de control de IgM humana (carril de suero de MAGA). Se indican marcadores de tamaño. La figura 7A muestra secuencias de ADNc's de anticuerpo monoclonal específico para el toxoide del tétanos; HSP70, rtTA y TNFa humano. La secuencia superior es la secuencia VHH2 de línea germinal. Las regiones CDR 1 , 2 y 3, y de gozne se indican arriba de la secuencia. En la derecha se indican los diferentes isótopos y clases con diferentes colores.

Las regiones J que se usan están indicadas en la derecha. La figura 7B muestra ejemplos de Western blots que usan los diferentes anticuerpos solo de cadena pesada (hibridomas, suero y sdAb); cuadro izquierdo, suero anti-rtTA y medio de hibridoma, diluido 1/100 y 1/250, respectivamente; cuadro de en medio, suero anti-DKTP de ratones wt y GA diluido 1/200 y 1 /100, respectivamente; cuadro derecho, sdAb anti-ß. pertusis contra la vacuna que contiene el antígeno de B. pertusis (DKTP) o que carece del mismo (DTP, puesto que los presentes autores no pudieron comprar antígeno purificado de B. pertusis). Las figuras 7C y 7D muestran la inmunotinción de una de las líneas de células Tet- transfectadas adicionalmente con un plásmido marcador que responde a la presencia de rtTA expresando una proteína marcadora en el citoplasma51. La figura 7C muestra núcleos que expresan rtTA (verde). La figura 7D muestra la expresión inducida por doxiciclina de la proteína marcadora en el citoplasma (rojo) en respuesta a rtTA, y la tinción nuclear de las células con DAPI (azul). La figura 7E muestra un ejemplo del análisis de BiaCore del anticuerpo anti-rtTA; se indica la afinidad. La figura 8A es una representación esquemática del locus de Ig con mutaciones de empalme de tipo camélido. Las dos regiones constantes de IgG humana (Cv2 y C 3) primero se mutaron alterando el empalme G+i a A+i , que se piensa resulta en la evasión del exón CH1 en HCAbs's IgG de camélido representados como Gy2-S y Gy3-S. El locus contenía dos regiones VHH de llama, todas las regiones D y JH humanas y Cp, Có y Cy2 y Cy3 humanas y la LCR (véase también el texto). Estos locus se introdujeron en ratones transgénicos µ?? y se analizaron para determinar la expresión de los locus humanos. La figura 8B muestra la secuenciación de ADNc de IgG humana de médula ósea (BM) de los ratones GS, que indica que ambas VHH's se recombinaron con diferentes segmentos D y J humanos y se transcribieron con la región constante Cy2. Sin embargo, el exón CH1 estaba presente todavía, excepto las últimas 16 p.b., que se desempalmaron. Aunque en avance, el mismo sitio de empalme críptico en el exón CH1 se informó en un paciente de leucemia debido a una transición de A a G en la posición 4 del intrón 1 [31 ]. Ninguna de las líneas MGS ni GS rescató el desarrollo de células B (no mostrado) en los ratones µ??. Aunque la maquinaria de transcripción/traducción de células B de ratón puede procesar VHH- 2a rearreglado de dromedario [34, 60], los datos de los presentes autores muestran que además de la mutación de G a A, otras características son importantes para la evasión del exón CH1 . La figura 9 es una representación esquemática de la clonación de regiones VH humanas sobre los diversos locus como se describe en los ejemplos 3 y 4. Las figuras 10 y 1 1 muestran ejemplos de locus de cadena pesada que contienen múltiples segmentos de gen VH, toda la región D, toda la región JH, las regiones CY2, Cy3 y Cx y la 3'-LCR.

La figura 12 muestra un cariograma con un locus integrado en el cromosoma 1 y un locus en el cromosoma 8.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Un locus de anticuerpo solo de cadena pesada es completamente funcional en ratones y sensible a la exclusión alélica Como se expuso arriba, Janssens y otros [15] han desarrollado métodos para la derivación de anticuerpos solo de cadena pesada en ratones transgénicos. Para mayores detalles de los métodos y experimentos aquí descritos, el experto en la materia puede consultar a Janssens y otros [15], que se incorpora aquí como referencia1.

Métodos Construcciones: Se hizo una colección de cósmidos genómicos de células de sangre periférica de Lama Glama usando los métodos estándares. Se escogieron dos VHH's diferentes de línea germinal basándose en su secuencia, un marco de lectura abierto sin codón de detención y la presencia de codones de aminoácido hidrofílico en las posiciones 42, 50 y 52, de acuerdo con la numeración de Lefranc [32], y uno con, y uno sin, un aminoácido hidrofílico en la posición 49. Uno es idéntico a IGHV1 S1 (No. reg. AF305944) y el otro tiene 94% de identidad con IGHV1 S3 (No. registro AF305946). Se seleccionaron dos clonas de la colección genómica humana Pac RPCI-1 1 (BACPAC Resource Center, EE. UU.): clona 1065 N8 que contiene las regiones D y J de cadena pesada humana, CM y C6, y la clona 1 1 15 N15 que contiene el gen Cy3. Se usó la clona de Bac 1 1771 de una colección genómica humana diferente (Incyte Genomics, California, EE. UU.) como una fuente del gen CY2 y la LCR de cadena pesada de Ig [33]. Usando técnicas estándares, los genes Cy3 y CY2 se subclonaron separadamente en pFastBac (Invitrogen). La mutación de un solo punto (G a A) [34] o una supresión completa del exón CH1 se logró mediante recombinación homologa [35]. Similarmente, se introdujeron sitios frt y lox P enfrente de la región de conmutación de Cp, y un segundo sitio lox P se colocó enfrente de la región de conmutación de C 2, dando como resultado MGS o MGA. Para obtener las construcciones GS o GA, el vector MGS o MGA (figura 1 ), que contiene dos genes VHH de llama, seguidos por las regiones de cadena pesada D y J humanas, Cp, C5, y los genes humanos modificados Cy2 y Cy3 y 3'-LCR, se transformó en la cepa de E. coli 16294 Cre44, produciendo el locus GS o GA mediante la recombinación mediada por Cre (figura 1 ). Se obtuvo MAGA a partir de MGA mediante supresión de la región CpCM por medio de recombinación homologa.

Generación de ratones transgénicos, reproducción y determinación de genotipo: Los fragmentos MGS o MGA o MAGA de 220Kb, los fragmentos GS o GA de 150Kb (figura 1 ) se purificaron de secuencias de vector y se inyectaron en pronúcleos de huevos FVB ??16/µ??-/- fertilizados, a una concentración de 2ng/pl. Los locus transgénicos se examinaron para determinar la integridad y número de copias por medio Southern blot de ADN de cola usando sondas de extremo 5' y 3'. Fundadores µ??+-/- transgénicos se reprodujeron como líneas en el fondo de µ??-/-. La determinación del genotipo se hizo por medio de PCR (30 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 45 s, apareamiento a 60°C durante 30 s, y extensión a 72°C durante 1 minuto y 40 s), usando los siguientes iniciadores: Asp5lgM delantero: 5'-GCGGGTACCGAATGGTGGCAGGGATGGCTC-3' (SEQ ID NO:1 ), en combinación con Asp3'lgG2 inverso: 5'-CGCGGTACCCTGCGGTGTGGGACAGAGCTG- 3' (SEQ ID NO:2) para HLL-MD, o con Asp3'lgM inverso: 5'- CGCGGTACCACGGCCACGGCCACGCTGCTCGATTC-3' (SEQ ID NO:3) para MGS y MIGMEMBINTRON1 : delantero: 5'-CCAGTCAATACTACTCGCTAAGATTC-3' (SEQ ID NO:4), en combinación con MIGMEMBEXON1 inv: 5'-CAGTGGTCCACAGTTTCTCAAAGC-3' (SEQ ID NO:5) para el genotipo µ??.

RT-PCR: Se aisló ARN total usando el sistema de aislamiento Ultraspec RNA (Biotecx Laboratories, Houston). Se sintetizó ADNc usando transcriptasa inversa (Superscript II, Life Technology) y un iniciador oligo-(dT). La PCR se realizó usando los siguientes iniciadores: LVHH delantero: 5'-AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGG-3' (SEQ ID NO:6) en combinación con HINGEIgG2 inv: 5 ACTCGACACAACATTTGCGCTC-3' (SEQ ID NO:7), o hlgMCH2 ¡nv: CACTTTGGGAGGCAGCTCAGC-3' (SEQ ID NO:8). La amplificación fue por 30 ciclos con desnaturalización a 94 °C durante 30 s, apareamiento a 60 °C durante 30 s, y extensión a 72 °C durante 1 minuto. Los productos de PCR se clonaron en el vector pGEM T easy (Promega) y se secuenciaron usando iniciadores T7 o SP6.

Análisis de citometría de flujo: Se prepararon suspensiones celulares individuales de órganos linfoides en PBS, como se describe anteriormente45. Se incubaron aproximadamente 1X106 células con anticuerpo en PBS /albúmina de suero bovino (BSA) al 0.5% en placas de 96 pocilios durante 30 minutos a 4 °C. Las células se lavaron dos veces en PBS /0.5% BSA. Para cada muestra se calificaron, 3x104 eventos usando un analizador FACScan (Becton Dickinson, Sunnyvale, California). Los datos de FACS se analizaron usando el software de computadora CelIQuest, versión 1.0. Se hicieron cuatro análisis de color en un Becton Dickinson FACS Calibur. La mayoría de los anticuerpos usados ya se han descrito [36]; se compró anti-lgG humana conjugada con FITC y anti-lgM humana a Sigma (Zwijndrecht, NL).

Análisis de rearreglo del gen de Ig: Se hicieron suspensiones de células individuales de bazos e hígados de ratones wt y ratones transgénicos MAGA y GA. Las células B se seleccionaron positivamente usando MACS CD45 (B220) MicroBeads (Miltenyi Biotec, Alemania) en un separador Automacs, de acuerdo con las instrucciones del fabricante para ~ 90% pureza [37]. ADN genómico se digirió con Hind III y se sometió a un blot sobre filtros de nylon Hybond. El filtro se hibridó con una sonda Jk radiomarcada con 32P (obtenida por amplificación de PCR de ADN genómico sobre las regiones Jk1 y Jk5), y la sonda anhidrasa carbónica II (CAN) radiomarcada con 32P. El ADN del hígado se corrió para mostrar las señales de la configuración de la línea germinal K (banda de 2.8 Kb). La sonda CAN, que híbrida con una banda de 4 kb, se usó como un control de carga. Los filtros se escanearon en un Tyfoon 9200 (Amersham Biosciences). La intensidad de la banda Jk de línea germinal se cuantificó usando el software Image Quant 5.2, normalizado con el control de carga, expresada como un porcentaje de ADN de hígado de control (que es 100%). Los iniciadores de PCR usados en el ADN genómico de híbridomas para la amplificación de diferentes eventos de rearreglo fueron de la siguiente manera: IGHJ1 R: 5'-CCAGTGCTGGAAGTATTCAGC-3' (SEQ ID NO:9), IGHJ2R: 5'-CAGAGATCGAAGTACCAGTAG-3" (SEQ ID NO:10), IGHJ3R: 5'-GGCCCCAGAYATCAAAAGCAT-3' (SEQ ID NO:11 ), IGHJ4R: 5'-GGCCCCAGTAGTCAAAGTAGT-3' (SEQ ID NO:12), IGHJ5R: 5'-CCCAGGRGTCGAACCAGTTGT-3' (SEQ ID NO:13), IGHJ6R: 5'-CCAGAACGTCCATRYMGTAGTA-3' (SEQ ID Análisis FISH de ADN: Preparación de DNA objetivo: Células de hibridoma monoclonales se cultivaron en DMEM/FCS al 10% y se incrustaron en agarosa como lo describe Heiskanen [38]. Se recolectaron pulmones de un ratón de la lineal transgénica de GA y se hizo una suspensión de una célula. Las células incrustadas se trataron con proteinasa K y Rnasa H. Se preparó ADN extendido mecánicamente en portaobjetos de poli-L-lisina (Sigma) usando un horno de microondas y el bordo de otro portaobjetos. Sondas: para detectar copias rearregladas y no rearregladas del transgen GA, se purificaron fragmentos de ADN. Un fragmento Spel de 2.3 kB y un Spel-BssHIl de 3.6 kB para hibridar la región entre VHH y D, y un fragmento BamHI-Spel de 5.9 kB o el plásmido de bajo número de copias Bluescript que contiene la 3'-LCR de IgH (16 kB) para detección de LCR. Las sondas se marcaron por traducción de nick con biotin-11-dUTP (Roche) o digoxigenin-11-dUTP (Roche). Antes de tomar las sondas con pipeta de los portaobjetos, estas se desnaturalizan durante 5 minutos a 90 °C, 5 minutos en hielo, y 45 minutos a 37 °C. Hibridación in situ: La mezcla de hibridación contenía 50% de formamida, SSC 2x, ADN de esperma de salmón (200 ng/µ?), solución de Denhardt 5x, 1 mM de EDTA, y 50 mM de fosfato de sodio, pH 7.0. La hibridación de las sondas se hizo tomando con pipeta 25µ? de la mezcla sobre los portaobjetos y cubriéndolos con un cubreobjetos de 24 x 32 mm. Para desnaturalizar las sondas y las secuencias objetivo, los portaobjetos se pusieron en una placa de calentamiento a 80 °C durante 2 minutos. Las sondas se hibridan durante la noche a 37 °C en una cámara húmeda (el humidificador es 50% de formamida, SSC 2 x). Se realizaron lavados posteriores a la hibridación como se describe [39]. Detección inmunológica de las sondas marcadas con hapteno: La sonda de digoxigenina se detectó con anti-digoxigenina de oveja (1 :500, Sigma), anti-oveja de conejo conjugada con fluoresceína (1 :500, Sigma), y anti-conejo de cabra conjugado con fluoresceína (1 :500, Sigma). La sonda de biotina se detectó con avidina conjugada con rojo de Texas (1 :500, Sigma) y anti-avidina de cabra conjugada con biotina (1 :500, Boehringer). Este paso se repitió dos veces. Todas las incubaciones y lavados se realizaron como se describe48. Después de teñir, los portaobjetos se deshidrataron en una serie graduada de etanol (70%, 90%, y 100%), 5 minutos cada paso, a temperatura ambiente. Las células o ADN se incrustaron en 25 pl de medio de incrustación antí-desvanecimiento Vectashield (Vector Laboratories). Se visualizó con un microscopio fluorescente Leica DMRBE usando un objetivo de 100x.

Inmunización y producción de hibridoma Ratones de 8 semanas de edad se inmunizaron con 5-20 de antígeno con coadyuvante Specol (IDDLO, Lelystadt, NL), o con vacuna DKTP previamente formulada, vía s.c, los días 0, 14, 28, 42, y vía i.p. el día 50. Se extrajo sangre los días 0, 14 y 45. Las células de bazo se fusionaron con la línea de células de mieloma Sp2-O-Ag1 l4 (donación de R. Haperen) el día 56, usando un equipo ClonalCelITMHY kit (StemCell Technologies, Canadá), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La vacuna DKTP se obtuvo del Netherlands Vaccine Institute (Bilthoven, NL).

Construcción de la colección sdAB y selección Se aisló ARN total de los bazos de ratones GA de una sola copia inmunizados con DTKP y ratones MAGA inmunizados con TNFa utilizando un sistema de aislamiento de ARN Ultraspec RNA (Biotecx Laboratories Inc, Houston, Texas, EE. UU.). Se hizo ADNc utilizando iniciador de oligo(dT). Los fragmentos de ADN que codifican los fragmentos VHHDJ se amplificaron mediante PCR utilizando los iniciadores específicos: iniciador vh1 back sfi [40-42] en combinación con el iniciador hlgG2hing inv (5'-AATCTGGGCAGCGGCCGCCTCGACACAACATTTGCGCTC-3' (SEQ ID NO: 1 5)), o iniciador CH2hulgM inv (5'- TGGGACGAAGACGGCCGCTTTGGGAGGCAGCTCGGCAAT-3' (SEQ ID NO: 16)). Los VHHDJ's amplificados (-400 p.b.) se sometieron a digestión con Sfil /Not I, se purificaron en gel y se clonaron en un vector derivado de pHEN de fagémido digerido con Sfil /Notl. La transformación en células electrocompetentes de TG1 (Stratagene, La Jolla, EE. UU.) produjo una colección de anticuerpos humanos de un solo dominio. Se realizaron dos rondas de selección utilizando antígenos de vacuna DKTP seleccionados adsorbidos sobre plástico (inmunotubos recubiertos con vacuna no diluida), o TNFa humano purificado (Biosource International, EE. UU.).

Inmunocitoquímica y Western blots Se desarrollaron en un portaobjetos células de la línea de células tet-on transfectadas con un plásmido marcador que responde a la presencia de rtTA. Después de una inducción de 24 horas con doxiciclina, las células se fijaron en paraformaldehído al 4% /PBS y se hicieron permeables en Triton-X-100 0.5% /PBS. El HCAb contra rtTA se usó en una dilución 1 :50, seguido por tinción de FITC anti-lgG humana de cabra (Sigma, dilución 1 :500). La proteína marcadora se detectó como se describió previamente51. Los Western blots fueron estándares utilizando anti-lgG humana de cabra-HRP (Sigma, dilución 1/2500), IgG humana-HRP (Sigma, dilución 1/2500).

Filtración en gel Superóse 6 Se efectuó fraccionamiento de tamaño del suero de ratón MAGA y suero de control humano utilizando un aparato AKTA FPLC (Amersham Biosciences, Piscataway, Nueva Jersey) con una columna Superóse 6 10/30, equilibrada en 200mM de KCI / 20mM de HEPES-KOH pH 7.9 / 1 mM de MgCI2 / 0.5mM de EGTA / 20% de glicerol. Usando un flujo de 100 µ?/min, se recogieron fracciones de 500µ?, se precipitaron con ácido tricloroacético a! 100% y se analizaron mediante SDS-PAGE (bajo condiciones reductoras), seguida por Western inmunobloting.

Mediciones de BIAcore Se efectuaron experimentos en un biosensor de resonancia de plasmón de superficie BIAcore 3000 (Biacore AB, Uppsala, Suecia). Las proteínas purificadas se inmovilizaron en un chip sensor CM5 a 3000 unidades de resonancia (RU, unidades de respuesta de unión arbitraria) con el equipo estándar NHS-EDC provisto por el fabricante. Los anticuerpos se pasaron sobre los antígenos inmovilizados a una velocidad de flujo constante de 40 microgramos por mi en 10mM de Hepes, pH 7.4, 150mM de NaCI, 2mM de EDTA, 0.005% de Tween 20. Se registró la respuesta al equilibrio y se usó ajuste de curva para obtener las constantes de disociación en equilibrio, utilizando el software de evaluación BIA del fabricante.

Resultados La mutación de empalme CH1 de camélido es insuficiente para la evasión de exón en el locus de cadena pesada humana: No se sabe si la generación de HCAb (lgG2 e lgG3) en camélidos incluye un paso intermedio de lgM+. Por lo tanto, los presentes autores primero generaron dos locus humanos híbridos, un locus (MGS) con regiones constantes humanas Cp, C5, Cy2 y Cy3, y uno solo con Cy2 y Cy3 humanas (figura 1 ), en un fondo de µ?? [43]. Primero, las regiones Cy se mutaron para contener las mutaciones de empalme de CH1 de camélido. Se generó MGS porque había mostrado que los animales µ??, que carecen casi completamente de células B debido a una supresión del dominio de transmembrana del gen de cadena µ [43], tienen una población de células B pequeña que produce IgG, IgA e IgE funcionales en ausencia de )gM de membrana [44-46], sugiriendo que (algunas) células B se desarrollan sin la expresión en superficie de IgM. En lugar de mutar los dominios VH humanos para mejorar la solubilidad de VH [47, 48], se introdujeron dos VHH's de origen de llama. Las regiones VHH de camélido contienen varios aminoácidos característicos en las posiciones 42, 49, 50 y 52 [49]. La primera, VHH1 , contenía todos estos aminoácidos distintivos de VHH, pero para probar la importancia de la solubilidad en esta prueba de experimento de principio, la otra VHH2, careció de uno de estos aminoácidos críticos de "solubilidad", una Gln (Q) en lugar de una Glu (E) en la posición 49. Los presentes autores eligieron la posición 49 en lugar de 50 (Arg, R), ya que se piensa que es adicionalmente importante para el apareamiento de la cadena ligera variable (VL)21. El locus también contenía las 5 regiones D y J humanas de cadena pesada y la región de control de locus (LCR) en el extremo 3' del locus (figura 8A-figura 8B). Sorprendentemente, la mutación de empalme no conduce a la evasión correcta del exón CH1 en ratones transgénicos y carece de expresión de lg humana (figura 8A y figura 8B).

Análisis de ratones transgénicos que contienen locus humanos que carecen de la región CH1 Para superar el problema de empalme de CH1 , los presentes autores generaron 3 construcciones nuevas (figura 1 ), todas conteniendo Cy2 y C/3, de las cuales se suprimió CH1 , una con Cp y Có (MGA), una sin Cp y C5 (GA), y una con un segmento Cp del cual se suprimió CH1 (MAGA). Se obtuvieron tres líneas de ratón transgénico MGA, seis GA y cuatro MAGA con diferentes números de copias (1 -5 copias) en un fondo de µ??. Se analizó el desarrollo de las células B en la médula ósea (MB) y el bazo. Los ratones con diferentes números de copias dieron los mismos resultados.

La expresión de GA y MAGA rescata el desarrollo de células B en ratones µ?? Los ratones MGA fueron incapaces de rescatar el desarrollo de células B en un fondo de µ??, mientras que las construcciones GA y MAGA redujeron eficientemente el desarrollo de células B. El rescate de células B220/CD19 positivas fue entre 30% y 100% en los diferentes compartimientos linfoides, independientemente del número de copias (cuadro A). Esto se confirmó por citometría de flujo de la BM usando tinción de B220 contra IgM humana o IgG humana (figura 2A). Los ratones MAGA contienen células productoras de IgM humana en MB, ausente en ratones de tipo silvestre o µ??. Apropiadamente, estas células no sufren un cambio de clase ya que no contienen IgG humana. Los ratones GA contienen solo células B que expresan IgG humana. Los ratones MGA contienen, si acaso, muy pocas células B que expresan IgG humana en la superficie celular, pero interesantemente una proporción de las células B220 expresan IgM intracelular pero no IgG (figura 2A). A diferencia de los ratones MAGA y GA (véase más abajo), los ratones MGA expresan cadenas ligeras de Ig de ratón (figura 6G). Estos resultados muestran que los genes Cp y Cy son expresados en las diferentes construcciones, y sugieren fuertemente que la ausencia de CH1 es crucial para la expresión en superficie celular de anticuerpos basados en VHH.

CUADRO A % de células B220+ /CD19+ en la población total de células nucleadas El cuadro A es un cuadro del análisis de citometría de flujo de los linfocitos B expresados como el porcentaje de células B220/CD19 positivas del total de células en los diferentes órganos.

WT GA (-5 copias) GA (una sola MAGA copia) BM 10.80+2.09 5.94+1.44 4.93+1.79 6.06+1.53 Bazo 41.80+6.05 32.14+9.46 28.70+8.70 33.95+3.24 Sangre 43.72+7.50 16.00+5.68 16.01 +3.76 9.25+3.24 Peritoneo 21.92+9.90 22.85+6.71 22.30+7.29 21.21 +14.42 Los ratones eran de 14-20 semanas de edad. Los números de ratones analizados son 5-1 1 por línea de ratón, excepto dos mediciones en células peritoneales, en donde los cálculos se basan en dos muestras (marcadas con asterisco).

HCAb IgG e IqM humanas reemplazan funcionalmente el (pre)-BCR murino durante el desarrollo de células B en la BM Durante el desarrollo de ciclos grandes a células pre-B pequeñas en reposo, la expresión de marcadores de superficie celular específicos es regulada negativamente de manera dependiente del pre-BCR [36]. Para investigar la capacidad del HCAb humano para reemplazar funcionalmente el pre-BCR, se analizó la expresión de varios marcadores por FACS. Las células pro-B expresan grandes cantidades de SLC, IL-7R y CD43 citoplásmicas, que son reguladas negativamente por la expresión de pre-BCR y están ausentes en las células B maduras (figura 2B, comparar las células pro-B de ratones µ?? y la fracción de IgM- en superficie de células pro-B/pre-B, y la fracción de lgM+ en superficie de células B de ratones wt). Las células B lg+ humanas de ratones ??T?/µ??, o T?/µ?? tienen bajas cantidades de SLC y IL-7R, indicando que los receptores de IgG e IgM humanas de una sola cadena reemplazan funcionalmente el pre-BCR murino en la regulación negativa de SLC y IL-7R. Para CD43, este parece ser el caso solo en ratones GA, pero la persistencia de la expresión de CD43 en ratones MAGA podría estar relacionada con el hallazgo de mayor diferenciación de células B B-1 en estos ratones. Similarmente, es inducida la expresión de CD2 y MHC de clase II, como en la señalización normal de pre-BCR. Las concentraciones de IL-2R/CD25, inducidas transitoriamente en la etapa de células pre-B, son muy bajas en las células ??T? o T?/µ?? maduras y comparables con las de las células B wt maduras (figura 2B). Además, la expresión de IgK ic no fue detectable en células ??T? ni T?/µ?? maduras (figura 2B), y tampoco fue inducida en cultivos de BM in vitro después del retiro de IL-7 después de 5 días de cultivo de IL-7+ (no mostrado). Finalmente, las poblaciones de células B que expresan HCAb humana en ratones transgénicos ??T? o consistió parcialmente en células que fueron generadas en la BM (HSAh¡gh y AA4.1/CD93high), y parcialmente en células que han madurado en la periferia y están en recirculación (HSA|0W y CD93iow), comparable a los hallazgos en ratones normales. Colectivamente, estos resultados muestran que la funcionalidad de HCAb IgG e IgM reemplaza funcionalmente el (pre-)BCR murino durante el desarrollo de células B, con respecto a la expresión de marcadores regulados durante el desarrollo. La cadena L de Ig no es inducida (véase más abajo). El análisis de ADNc del ARN de BM muestra el uso de los dos segmentos VHH para la recombinación de VDJ, la ausencia de CH1 , e importantemente una gran diversidad en la región CDR3 (figura 2C).

Rearreglos múltiples y exclusión alélica Se hicieron varios hibridomas de las líneas ??T? o GA después de inmunización, en particular de la línea 1 de T? de cinco copias (véase más abajo). El análisis de secuencia mostró que podría ocurrir más de un rearreglo en los locus de GA de múltiples copias. De los 5 diferentes hibridomas de 5 copias analizados, uno (G20) rearregló una copia que estaba en el marco; dos hibridomas (T7 y T 2) tuvieron 2 rearreglos con uno fuera de marco en los dos; un hibridoma (T3) tuvo dos rearreglos en marco (J2 y J4); mientras que un hibridoma (T1 ) tuvo 4 rearreglos con 2 en marco (J2 y J4). T1 y T3 expresan dos ARNm's productivos que fueron confirmados por espectroscopia de masa de los anticuerpos secretados, que coinciden exactamente con el ADNc (no mostrado). También, los autores efectuaron FISH de fibra estirada de ADN y FISH de ADN normal en dos hibridomas diferentes: G20 (un rearreglo) y T1 (4 rearreglos), usando una sonda LCR que detecta cada copia, y una sonda localizada entre VHH y el segmento D que detecta solo las copias no rearregladas (figuras 3A-3E). Las células de pulmón de control mostraron 5 copias completas más la mitad de un transgen en cualquier extremo (figura 3A), en concordancia con el mapeo de Southern blot (no mostrado), mientras que los hibridomas en realidad muestran una y cuatro copias rearregladas en G20 y T1 , respectivamente (figuras 3B, 3C-3E). De esta manera, múltiples copias se pueden rearreglar exitosamente en el mismo alelo. Después, los presentes autores se preguntaron si los locus de HCAb tienen cualquier ventaja o desventaja sobre los locus murinos normales, y si hay exclusión alélica de locus. Se analizaron células B220/CD19 positivas de BM de ratones transgénicos GA de lineal en un fondo de wt para determinar la expresión de IgG humana e IgM de ratón. Claramente, las células B de GA expresan Ig de ratón o Ig humana (figura 3F), mostrando la exclusión alélica.

Células B esplénicas en ratones transgénicos GA, MAGA y MGA Para determinar el efecto de los transgenes sobre la diferenciación de células B en ratones µ??, los presentes autores examinaron los tamaños de subpoblación de las células B de bazo por citometría de flujo, usando los perfiles de CD21/CD23 (figura 4A). En los ratones GA, las proporciones de células B inmaduras CD21 |OW/CD23iow estuvieron en las escalas normales, y las células que expresan IgG de una sola cadena humana fueron capaces de diferenciarse en células B foliculares (FO; CD21 +CD23+) y en zona marginal (MZ; CD21 h¡ghCD23i0w)- En los ratones MAGA aumentaron las fracciones de células B inmaduras, indicando que la diferenciación de células que expresan HCAb IgM en células B FO y MZ8 está un poco deteriorada. En estos bazos, la expresión reducida de CD23 fue acompañada por un incremento del grado de expresión en superficie de CD43 y CD5, indicativo de diferenciación en el linaje de células B B-1. Las pocas células B que expresan IgM humana (que también expresan cadenas ligeras de ratón, véase la figura 6A-figura 6G), presentes en ratones transgénicos MGA, manifestaron una distribución FO/MZ que fue similar a la de ratones transgénicos MAGA. Los ratones MAGA y GA, pero no los MGA, tienen una arquitectura de bazo normal que muestra la segregación del agrupamiento de células T en la lámina de linfocito periarteriolar (PALS) rodeada por áreas que contienen folículos y zonas marginales ricas en células B, en los límites externos de la pulpa blanca (figura 4B). También forman centros germinales en folículos de células B de tejidos linfoides secundarios (no mostrado) comparables con wt durante las respuestas de anticuerpo dependientes de células T. Estos son los sitios de formación de memoria y selección basada en afinidad debido a la hipermutación somática. En los ratones GA se detectan células IgG positivas humanas en estos centros germinales. Los presentes autores confirmaron la hipermutación de los genes IgG humanos mediante análisis de ADNc de las células B presentes en las placas de Peyer (figura 4C). Se usa VHH1 y VHH2. Tomados juntos, estos hallazgos demuestran que en ratones transgénicos GA y MAGA, las células B inmaduras que emigran de la BM tienen la capacidad para diferenciarse en el bazo en células B FO y MZ, y sufrir hipermutación somática después de provocación antigénica.

Locus de una sola copia rescatan eficientemente y la ausencia de CH1 es esencial Los ratones de lineal de GA (cuadro A) contenían 5 copias del locus GA y por lo tanto tuvieron la posibilidad de que el rescate eficiente estuviera relacionado con el número de copias del locus. Sin embargo, una línea transgénica de una sola copia obtenida de la lineal de GA de 5 copias por recombinación de Flp mediante reproducción con una línea FlpeR23, rescató el desarrollo de células B en un grado similar (figura 4D, cuadro A). Se confirmó que una sola copia del locus es suficiente para el rescate, y que la presencia de la región constante Cp con una región CH1 es inhibitoria, suprimiendo las regiones Cp y C5 de la línea de una sola copia no rescatadora MGA (línea 3) por recombinación de Cre (que se reproduce a una línea que expresa ere), dando como resultado una línea GA de una sola copia (figura 4D). El locus previamente no rescatador ahora da el mismo desarrollo 9 de células B que las otras líneas GA. De esta manera, el número de copias no afecta el rescate, y la presencia de CH1 en la región Cp inhibe el rescate de células B (véase también más abajo).

Los locus de Iq de cadena ligera de ratón no se rearreglan en ratones transgénicos MAGA y GA No se detectaron proteínas de Ig de cadena ligera murina en los ratones MAGA y GA por análisis Western blot del suero (no mostrado, pero véanse las figuras 2B y 6A) ni por FACS, sugiriendo que la cadena ligera de murino no se rearregla. Esto se confirmó comparando las densidades de las señales de línea germinal del locus ? de Ig en el ADN de fracciones celulares esplénicas clasificadas B220+ y células del hígado por análisis de Southern blot (figuras 5A y 5B), lo que muestra que las cadenas ligeras de ratón no se rearreglan y permanecen en una configuración de línea germinal. En contraste, las cadenas ligeras son detectadas en pocas células que expresan Ig humana en los ratones MGA/µ?? (véase la figura 6G). De esta manera, la expresión de HCAb humano en el desarrollo temprano de las células B en la BM no provee la señal que conduce al rearreglo de la cadena ligera. En este contexto, el HCAb imita un BCR en lugar de un pre-BCR, lo que está relacionado probablemente con su incapacidad para unirse a cadenas seudoligeras en ausencia de CH1 [16].

Análisis del suero de ratones GA/µ?? y MAGA/µ?? La IgM humana estaba presente en el suero de ratones MAGA y la IgG humana en el suero de ratones MAGA y GA. En animales adultos no inmunizados, la IgM humana (<50pg/ml) e IgG (200-1000pg/ml) están presentes a concentraciones comparables a las observadas en ratones normales o ratones transgénicos que llevan un locus de IgH humana normal [65]. La electroforesis en gel del suero de los seis ratones GA reveló HCAb IgG's con un PM de ~70kD bajo condiciones no reductoras, y ~35kD bajo condiciones reductoras, consistentemente con dímeros de cadena pesada que carecen de una cadena ligera, y cada cadena pesada que carece del exón CH1 (figuras 6A, 6B). El suero de ratones MAGA contenía IgM humana multimérica solo de cadena pesada. Bajo condiciones reductoras (figura 6C) las cuatro líneas contenían cadenas IgM con el PM como una IgM de control humana después de sustracción del PM de CH1. El suero también se fraccionó (figura 6D, fracciones horizontales) bajo condiciones no reductoras, después de lo cual cada fracción 10 se analizó por electroforesis en gel bajo condiciones reductoras (figura 6D, carriles verticales). Cuando se compara con la IgM de control de 900kD pentamérica del suero humano, la IgM transgénica se fracciona a 600kD, consistentemente con que son cadenas multiméricas y carentes de cadenas ligeras y CH1. De esta manera, los ratones MAGA producen HCAb IgM multimérica e IgG dimérica, mientras que los ratones GA producen IgG dimérica en el suero.

Análisis del suero de ratones MGA En la periferia y bazo de las líneas MGA/µ??, casi no se observan células B220 positivas (<1 % del tipo silvestre) y solo se observan pequeños racimos de células B ocasionales en el bazo (figura 4B). Se detectaron pequeñas cantidades de IgM e IgGs humanas en el suero, solo después de purificación (figuras 6E, 6F). La IgM humana en estos ratones fue de tamaño normal bajo condiciones reductoras, mientras que las IgG's humanas circulantes son más pequeñas (PM aparente de 35kD, consistentemente con una supresión de CH1 ). Interesantemente, también se detectaron cadenas ligeras k de ratón, presumiblemente asociadas con la IgM humana (figura 6G). Las IgM e IgGs humanas estuvieron debajo del valor de detección de una prueba de ELISA cuantitativa, pero no obstante los presentes autores hicieron pruebas para ver si los ratones MGA/µ?? pueden responder a la inmunización. Los ratones se inmunizaron con factor de necrosis de tumor a (TNF-a) humano y los ratones wt desarrollaron una fuerte respuesta de anticuerpo específica de TNF-a, mientras que en los dos ratones de línea 3 MGA utilizados, no pudieron ser detectadas IgGs humanas específicas de antígeno por análisis de ELISA o Western blot (no mostrado).

La inmunización de ratones MAGA y GA da como resultado la producción de Ab especifico de antígeno Los ratones GA/µ?? se inmunizaron con hsp70 de E. coli, DKTP (toxoide de difteria, lisado celular completo de Bordetella pertussis, toxoide de Tetanus y poliovirus inactívados de tipo 1 , 2 y 3), y rtTA [50], mientras que los ratones MAGA se inmunizaron con TNFa humano. De los ratones con suero positivo según ELISA, se aislaron anticuerpos completos individuales usando hibridomas o Ab de un solo dominio (sdAb) mediante colecciones de despliegue de fago. Los anticuerpos monoclonales específicos de ahsp70, toxoide tetánico y rtTA se secuenciaron después de RTPCR de los ARN's de anticuerpo (figura 7A). Esto mostró que se produjeron anticuerpos tanto lgG2 (7 de 8) como lgG3 (1 de 8) (el sdAb se aisló de una colección de lgG2). Se usaron diferentes regiones de D y J. Aunque no a una frecuencia alta, la VHH de los 1 1 HCAbs estaba hipermutada. Los tres anticuerpos específicos de hTNFa (un hibridoma IgM positivo, a-hTNFa #1 de las figuras 6A-6G, y dos sdAb a-hTNFa #2 y 3) tenían diferentes hipermutaciones en la región CDR2.

Al comparar las secuencias de los 14 anticuerpos, fue evidente que aunque se usaron todas las regiones J, como en los humanos, JH4 se usa más frecuentemente. De forma sorprendente, todos los anticuerpos que contenían VHH2 de llama (con una glutamina (Q) en lugar del ácido glutámico arquetípico en la posición 49 [51]). Finalmente, de forma evidente, la región CDR3 provee la mayor parte de la diversidad27. Varía entre 10 y 20 aminoácidos de longitud (promedio de 13.6 aa), muy similar a lo que se observa normalmente en llamas y humanos [52, 53]. Después, los presentes autores probaron si estos HCAb eran funcionales en pruebas regulares como sobrenadantes de hibridoma y fracciones periplásmicas bacterianas de sdAbs (figuras 7A-7E). Todos los anticuerpos fueron positivos en la prueba de ELISA y todos fueron positivos en detección de antígeno en Western blots (por ejemplo, suero de a-DKTP y a-rtTA y medio de hibridoma y sdAb de a-ß. pertussis, figura 7B). También probaron la IgG de a-rtTA en inmunocitoquímica usando una línea celular transfectada con un plásmido de expresión de rtTA (figuras 7C, 7D). La HC-lgG de rtTA dio una tinción nuclear muy clara y específica. La afinidad de varios anticuerpos fue alta, aunque la de algunos (particularmente sdAb) fue mucho más baja. Por ejemplo, el anticuerpo a-rtTA usado en la inmunocitoquímica (figuras 7C, 7D) fue aproximadamente 3nM, determinada en un BiaCore (figura 7E).

Conclusiones Aquí se informa sobre la expresión de locus de HCAb modificados que rescatan el desarrollo de células B en ratones µ??, dando como resultado la producción de HCAb funcional. Estos ratones se pueden inmunizar para producir HCAb específico de antígeno. Como en los camélidos, la remoción de CH1 es crucial para la secreción de HCAb, pero la mutación de empalme única de camélido (ver 30) en la frontera 3'-CH1/intrón no es suficiente para la eliminación de CH1 ; de esta manera, se requiere más que la sola mutación de punto, por lo menos en el locus humano. La IgM con CH1 en combinación con un VHH bloquea el desarrollo de células B, causado probablemente por un ensamble ineficaz de una molécula de superficie de IgM en el contexto del pre-BCR. En contraste, ratones que expresan la proteína µ humana de tipo HCD, desarrollan células pre-B CD43- normales en un fondo SCID independiente de A5 [54]. Las proteínas Cp truncadas se expresan sobre la superficie de las células B sin cadenas L asociadas, y se piensa que imitan la señalización de pre-BCR mediante autoagregación [55]. Normalmente BiP acompaña el pliegue y ensamble de las moléculas de anticuerpo uniéndose a superficies hidrofóbicas de las cadenas de Ig que subsiguientemente participan en contactos intercadena31. La presencia de aminoácidos hidrofílicos en FR2 de las VHHs, muy probablemente impide la unión de BiP a VHH, cuya cadena ligera (sustituto) no necesita hacerse soluble. Al mismo tiempo, CH1 provee la interacción con BiP propuesta para retener cadenas pesadas en el ER hasta que se completa el ensamble (reemplazo de BiP por una cadena ligera). En el receptor de células pre-B, los presentes resultados sugieren que el apareamiento de cadena pesada µ transgénica con la pre-proteína V, como parte de una cadena ligera sustituía (SLC) en la asociación no covalente con la proteína ?5, no podría ocurrir cuando la cadena pesada µ que contiene un dominio CH1 está enlazado a una VHH. Así, la IgM humana en los ratones transgénicos MGS y ?T? se asemejaría en este aspecto a un complejo de tipo pre-BCR incompleto, conocido por ser insuficiente para la expansión de la señal proliferativa y el avance del desarrollo [56, 57]. Esto puede explicar porqué únicamente 30% de las células B220 positivas en la BM tienen IgM intracelular (figura 2A). La presencia de las pocas células B maduras en el bazo de estos ratones puede ser explicada por el complejo receptor novedoso recién descrito que contiene una cadena pesada µ pero que carece de cualquier SLC o cadenas ligeras convencionales [58]. Cuando CH1 está ausente de Cy2 y 3 y se remueve IgM del locus, hay un rescate del desarrollo de células B, mostrando que la IgG puede reemplazar funcionalmente a la IgM. Un receptor de lgG1 , expresado progresivamente desde la etapa de células pro-B, se puede sustituir con IgM para apoyar el desarrollo de células B maduras CD21+ en ratones Rag2-/-[59]. Recientemente también se mostró que una lgG2a previamente rearreglada de camélído podría rescatar parcialmente el desarrollo de células B en uno de dos ratones transgénicos en un fondo de µ??^ CA-/-)13. En el caso de los presentes autores, IgM o IgG que carece de CH1 rescata el desarrollo de células B en 10 de 10 de líneas de ratón transgénico independientes. Además, los presentes autores no observan rearreglo de cadena ligera y concluyen que la expresión de cadena ligera no se requiere para la diferenciación ulterior de las células B. La diferencia en los resultados obtenidos aquí y los de Zou y otros [60] se pueden explicar por el grado de expresión del locus de cadena pesada (y por lo tanto señalización) debido a la inclusión de LCR en las presentes construcciones. Estos resultados confirman que la proteína de cadena pesada µ truncada que carece de CH1 [61] o VH y CH1 [62], no se puede asociar con SLCs y no puede activar el rearreglo del gen k. La lineal de T? de 5 copias (y otras líneas de multicopias) rescata el desarrollo de células B al mismo grado que la línea de solo una copia, integrada en la misma posición en el genoma. Interesantemente, uno o más de los rearreglos ocurren en locus transgénicos de múltiples copias (figuras 3A-3F). Dos de los hibridomas, que se originan de dos esplenocitos únicos dieron dos transcritos y proteínas HCAb. Este resultado confirma que la expresión de dos anticuerpos en la misma célula B no es tóxica [63]. Sin embargo, la predicción de que células B productoras de anticuerpo doble perderían competitividad con las células productoras de un solo anticuerpo bajo provocación antigénica37, no es apoyada por el presente resultado de hallar 2 células que expresan anticuerpo doble de 5 hibridomas obtenidos después de provocación antigénica. El locus (de copias múltiples) es sometido a exclusión alélica en ratones de tipo silvestre porque las células de BM expresan Ig de ratón o humana en la superficie celular. No hay población significativa de células que expresen ambos sobre la superficie celular (figura 3F, cuadros superiores). Quizás es más interesante el número de células que expresan Ig de-ratón en comparación con humana. En un ratón wt ?3? 5 copias hay tres alelos posibles disponibles para rearreglo, dos alelos de ratón con un locus de Ig y un alelo con 5 locus de CHAb humano. Si se escoge estocásticamente, un alelo humano sería elegido solo una de tres veces. Si se cuenta el número de locus, el locus humano se rearreglaría primero en 5 de 7 células. Sin embargo, HCAb humano transgénico y de ratón endógeno se expresa casi igualmente (44/38, figura 3F cuadros inferiores). Aunque estos números ignoran posibles desviaciones del uso aleatorio de las regiones V, y un posible efecto de posición sobre el locus transgénico, sugieren fuertemente que la primera elección es una elección estocástica de alelo, seguida por el posible rearreglo de múltiples genes por alelo. Esto concuerda con el hecho de que los presentes autores observan frecuentemente múltiples rearreglos del locus GA. Normalmente un rearreglo productivo regula negativamente la recombinación para impedir el rearreglo del otro alelo. Sin embargo, las múltiples copias en el alelo transgénico están presentes en el mismo locus abierto, y aparentemente se pueden recombinar antes de la regulación negativa de RAG. Esto podría ser porque ocurren múltiples rearreglos al mismo tiempo, o implica un componente espacial ("compartimiento"), que tomaría suficiente tiempo para rearreglar otro gen en el locus, ya que estaría cerca antes de que los RAG's sean regulados negativamente. Solamente cuando un rearreglo no es productivo en ratones wt (sin señalización y la permanencia de RAGs) habría suficiente tiempo para que se activara un segundo locus, reemplazara el primer locus y se rearreglara. A favor de este argumento estaría la observación de que otras especies con múltiples locus en el mismo cromosoma tienen más células que expresan dos Abs [64]. De manera importante, estos experimentos muestran que los locus de HCAb se pueden expresar exitosamente en el ratón. La provocación antigénica resulta en la producción de HCAb humano específico de antígeno de alta afinidad, de clase diferente dependiente de la composición de los locus. Estos anticuerpos son expresados en cantidades comparables a las de los ratones normales u otros ratones transgénicos de IgH humana "normal" [65]. Se usaron solo dos regiones variables en estos experimentos, pero no obstante se aislaron exitosamente anticuerpos de alta afinidad con diversa especificidad para casi todas las proteínas totalmente no relacionadas, demostrando la eficiencia y eficacia de la diversidad generada por CDR3 [66]. De esta manera, al tener la recombinación de V(D)J y la selección in vivo se provee una ventaja crítica sobre la generación de fragmentos de anticuerpo humanos de una sola cadena de colecciones de fagémido, usando despliegue de fago39. Los hibridomas se pueden generar fácilmente, lo que permite importantemente la clonación y expresión directa del HCAb humano completo o fragmento sdAb, sin la necesidad de despliegue de fago y selección adicional. De esta manera, estos ratones abren posibilidades completamente nuevas para la producción de HCAbs humanos para fines clínicos y otros propósitos, particularmente a la luz de la evidencia de que los HCAbs pueden reconocer epítopes que son escasamente antigénicos para los anticuerpos convencionales, tales como los sitios activos de enzimas4. El número restringido de regiones variables puede explicar el porqué no todos los antígenos fueron reconocidos; las proteínas de polio y Diphteria no dieron respuesta en los ratones T?, mientras que sí lo hicieron los ratones de control wt. Sorprendentemente, todos los anticuerpos tuvieron la región VHH2 de llama. Esto no incluye un aminoácido conservado [67] en la posición 49, en contraste con VHH1 que tiene uno y sería más soluble. No obstante, los presentes autores esperan que la adición de más regiones variables al locus llevaría a un repertorio aún más amplio. Mientras que es preferible evitar múltiples copias de locus en un solo alelo, sería ventajoso generar ratones que contienen múltiples alelos, cada uno comprendiendo una sola copia de diferentes regiones VH para aumentar la diversidad. En tales locus nuevos se pueden usar las regiones VH que ocurren normalmente o regiones VH (humanas) construidas por ingeniería para mejorar la solubilidad18 y el apareamiento de cadena ligera. En conclusión, los presentes autores han demostrado que se puede producir en ratones HCAb de alta afinidad específico de antígeno, potencialmente de cualquier clase. Esta tecnología permitirá la producción de HCAb's completamente humanos de cualquier clase, o fragmentos de los mismos, en respuesta a provocación antigénica, para usarse como agentes terapéuticos o diagnósticos en el hombre. Utilizando diferentes locus de vertebrado, la presente tecnología también permite la producción de anticuerpos maduros de alta afinidad de cualquier vertebrado para usarse como reactivos, diagnósticos, o para el tratamiento de animales.

EJEMPLO 2 Janssens y otros (2006) han demostrado que un locus VH transgénico se recombina adecuadamente para producir anticuerpos solo de cadena pesada codificados transgénicamente, y que dicho locus es sensible a la exclusión alélica en presencia del locus de inmunoglobulina de cadena pesada endógena (de ratón). Para mostrar que el número de locus transgénicos VH que se usan para la producción de anticuerpo solo de cadena pesada, puede ser incrementado usando el proceso de exclusión alélica, se cruzaron dos ratones transgénicos que contenían diferentes locus solo de cadena pesada, dando como resultado descendencia que contenía los dos locus. Un ratón contenía el locus MGA (locus de IgM e IgG, Janssens y otros 2006), mientras que el otro contenía el locus GA (solo el locus de IgG, Janssens y otros 2006), los dos ratones tenían el fondo µ??. Se derivaron hibridomas de las células B de la descendencia transgénica doble y se desarrollaron en cultivo por métodos estándares. Varias líneas celulares monoclonales individuales resultantes se analizaron por PC y Southern blots, y mostraron que las líneas que contenían un locus de MGA rearreglado productivamente contenían un locus T? no rearreglado y un locus GA rearreglado no productivamente. Por el contrario, las líneas celulares que contenían un locus GA rearreglado productivamente, contenían un locus de MGA no rearreglado o uno rearreglado no productivamente. De esta manera, la suma de las regiones VH disponibles se usa en el proceso de recombinación.

EJEMPLOS 3 Y 4 En una modalidad preferida del primer aspecto de la invención, todas las regiones VH humanas funcionales se incrementaron clonando las regiones VH humanas (o variantes de las mismas) en un locus humano modificado múltiple que contenía la región DH completa, la región JH completa y una combinación de las regiones Cp, Cy2, Cy3 y Ca, y la 3'-LCR, usando los métodos descritos en el ejemplo anterior y conocidos en la técnica (Janssens y otros 2006). Este procedimiento se puede efectuar usando múltiples regiones VH idénticas en locus separados, o regiones VH diferentes en locus separados. Los locus diferentes pueden contener regiones de cadena pesada idénticas o regiones de cadena pesada diferentes. El ejemplo 3 es para un locus con regiones VH idénticas en locus que tienen una combinación diferente de regiones de cadena pesada; el ejemplo 4 es para dos locus con regiones constantes de cadena pesada idénticas pero regiones VH diferentes. Obviamente, en los dos ejemplos se pueden añadir locus adicionales.

EJEMPLO 3 Regiones VH humanas se aislan por amplificación de PCR del ADN genómico humano usando iniciadores que son específicos para cada VH seleccionada de las 39 posibles regiones VH humanas funcionales (alternativamente se pueden usar o añadir regiones VL humanas o regiones V de TCR, o variantes de todas estas derivadas por mutagénesis). Las regiones VH humanas se clonan en grupos sobre el locus que se describe en el ejemplo anterior (figura 9), es decir, que comprenden DH más JH humanas (u otras regiones D y J), y Cp, Cy2, Cy3, cada una careciendo de un CH1 , más 3'LCR. La región Ca que carece de CH1 más regiones de conmutación, serán clonadas separadamente en el locus T? (figura 10). Este locus GA es una variante del locus original ya que no contiene sitios lox y las regiones VHH de llama se removieron mediante recombinación homologa estándar dejando un sitio único Pl-Pspl (figura 10). Las regiones VH funcionales se pueden clonar juntas con cualquier múltiplo en cada locus. Inicialmente, se clonarán juntas 17 regiones VH humanas funcionales en un grupo que empieza con dos genes clonados por grupo. A cada una de estas construcciones iniciales se le añadirá un segundo grupo mediante la metodología convencional (por ejemplo usando digestión/ligación de restricción Xhol y Salí, la ligación de sitios compatibles con Xhol y Salí destruye ambos). Los grupos que contienen 4, 4, 4, 3 y 2 estarán enlazados en un grupo de 17 genes en un vector BAC. Obviamente, este procedimiento se podría efectuar combinando series que contienen otros números de genes. El proceso anterior puede ser terminado en cualquier punto para lograr el número deseado de regiones VH, o extenderse para lograr un número más alto de regiones VH. El grupo completo (por ejemplo 17 genes) se clona en el locus GA modificado en el sitio Pl-Pspl único. La región Ca se clonará en el sitio I-Ceul de este locus, dando como resultado un locus ??T? capaz de producir Iga e IgG (figura 10). Alternativamente se pueden clonar otras regiones de cadena pesada. Estos locus finales se introducen entonces en ratones transgénicos separados (preferiblemente con un locus defectuoso de IgH de ratón, tal como µ??) como se describe en el ejemplo anterior. Estos locus separados se usan para generar líneas de ratón separadas, una que haría solo IgG y otra que haría IgA e IgG. Subsiguientemente estos ratones se cruzan para producir el total de reglones VH disponibles para 34 en dos locus diferentes. El cruce de estos ratones para homocigocidad para los dos locus haría 68 regiones VH disponibles para la recombinación. El tener múltiples copias de un locus integrado aumentaría este número aún más. El análisis de hibrídomas hechos de células B de estos ratones se usaría para mostrar que cuando está presente un locus rearreglado productivamente, los otros locus que se reprodujeron no están rearreglados o no están rearreglados productivamente debido a la exclusión alélica mediante procedimientos estándares.

EJEMPLO 4 Diferentes grupos de una o más regiones VH, aisladas de forma similar a las regiones anteriormente descritas (o variantes de las mismas derivadas por mutagénesis), se clonan en dos locus separados por medio de la misma metodología anteriormente descrita. Esto resultaría en dos variantes de locus GA diferentes (o variantes de los mismos, por ejemplo añadiendo Ca). Estos locus se introducirían en ratones separados resultando en líneas transgénicas separadas (por ejemplo, dos locus que tienen cada uno 10 dominios VH, figura 11 ). Estos ratones subsiguientemente se cruzarían para obtener ratones doblemente transgénicos que tendrían todas las regiones VH usadas disponibles para el proceso de recombinación. El cruce de estos ratones para homocigocidad para ambos locus duplicaría el número de regiones VH disponibles para la recombinación (figura 12, cariograma con un locus integrado en el cromosoma 1 y un locus en el cromosoma 8). El tener múltiples copias de un locus integrado aumentaría este número aún más. El análisis de hibridomas hecho de las células B de estos ratones se utilizaría para mostrar que cuando está presente un locus rearreglado productivamente, los otros locus que se reprodujeron no están rearreglados o están rearreglados no productivamente debido a la exclusión alélica. El proceso anterior se puede terminar en cualquier punto para lograr el número deseado de regiones VH. Las regiones D, JH y constante serán añadidas a estas regiones VH. Después, estos locus finales se pueden introducir en ratones transgénicos separados (preferiblemente con un locus defectuoso de IgH de ratón), como se describe en el ejemplo anterior. Alternativamente, la posición de los sitios lox permite la eliminación de regiones constantes individuales para generar locus separados que contienen C\i (IgM) solo, o C 2 y Cy3 (lgG2 y lgG3) solos, o Ca solo (IgA), o combinaciones de los mismos. Estos locus separados se usan para generar líneas de ratón separadas que harían IgM humana sola, o IgG sola, o IgA sola, o combinaciones de las mismas.

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"Molecular requirements for the mu-induced light chain gene rearrangement in pre-B cells". Embo J 10, 2147-55 (1991 ). [62] Shaffer, A.L y Schlissel, M.S. "A truncated heavy chain protein relieves the requirement for surrogate light chains in early B cell development". J Immunol 159, 1265-75 (1997). [63] Sonoda, E. y otros, "B cell development under the condition of allelic inclusión". Immunity 6, 225-33 (1997). [64] Eason DD, Lítman RT, Luer CA, Kerr W, Litman GW. "Expression of individual antibody genes occurs in an unusual system consisting of múltiple independent loci". Eur J Immunol. 34:2551-8 (2004). [65] Wagner SD, Gross G, Cook GP, Davies SL, Neuberger MS. "Antibody expression from the core región of the human IgH locus reconstructed in transgenic mice using bacteriophage Pl clones". Genomlcs. , 405-14 (1996). [66] Xu JL, Davis MM. "Diversity in the CDR3 región of V(H) is sufficient for most antibody specificities". Immunity 13, 37-45 (2000) [67] De Genst E, Saerens D, Muyldermans S, Conrath K. "Antibody repertoire development in camelids". Dev Comp Immunol. 30, 187-98 (2006).

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un método para la producción de un anticuerpo solo de cadena pesada VH en un mamífero no humano transgénico, que comprende los pasos de proveer más de un locus de cadena pesada VH heterólogo en ese mamífero, en donde cada locus de cadena pesada VH comprende uno o más segmentos del gen V, uno o más segmentos del gen D, uno o más segmentos del gen J, y un segmento de gen que codifica una región constante de cadena pesada que, cuando se expresa, no incluye un dominio CH1 y expresa un anticuerpo solo de cadena pesada VH de por lo menos uno de dichos locus. 2. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque cada locus de cadena pesada VH comprende uno o múltiples segmentos del gen V. 3. - El método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado además porque cada locus comprende solo un segmento del gen V. 4.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque cada segmento del gen V es diferente de todos los otros segmentos del gen V. 5.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque cada segmento del gen V es idéntico a todos los otros segmentos del gen V. 6. - El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque los segmentos de gen restantes de cada locus son iguales a los de todos los otros locus. 7. - El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque los segmentos de gen restantes de cada locus son diferentes a los de todos los otros locus. 8. - El método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado además porque cada locus comprende múltiples segmentos del gen V. 9. - El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque todos los segmentos del gen V de cualquier locus derivan de un organismo de la misma especie. 10.- El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque los segmentos del gen V de cualquier locus derivan de organismos de especies diferentes. 11. - El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque los segmentos del gen V son de origen humano. 12. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 8 a 11 , caracterizado además porque los múltiples locus de cadena pesada comprenden cualquier número o combinación de los 39 segmentos del gen V humano funcionales, y variantes construidas por ingeniería de los mismos con propiedades de solubilidad mejorada, distribuidos a través de los múltiples locus. 1 3. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 2, caracterizado además porque cada locus diferente de cadena pesada está presente como una sola copia en el genoma del mamífero no humano transgénico. 14. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado además porque cada locus de cadena pesada VH comprende de uno a cuarenta segmentos del gen D. 1 5. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado además porque los segmentos del gen D son segmentos del gen D humano. 16. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado además porque cada locus de cadena pesada VH comprende de uno a veinte segmentos del gen J. 1 7. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque los segmentos del gen J son segmentos del gen J humano. 18.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado además porque cada locus de cadena pesada VH contiene los mismos segmentos de los genes D y J. 1 9.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado además porque cada locus de cadena pesada VH contiene combinaciones diferentes de segmentos de los genes D y J. 20. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado además porque cada locus de cadena pesada VH comprende uno o más segmentos del gen V, veinticinco segmentos funcionales del gen D humano, y seis segmentos del gen J humano. 21 . - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado además porque cada locus de cadena pesada VH comprende un segmento de gen que codifica por lo menos una región constante de cadena pesada que provee funciones efectoras ¡n vivo, en donde la región constante, cuando se expresa, no incluye un dominio CH1 en el anticuerpo. 22.- El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque cada locus contiene solo un segmento de gen que codifica una región constante particular. 23. - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque cada locus comprende más de un segmento de gen, cada uno codificando una región constante diferente. 24. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizado además porque cada locus contiene los mismos segmentos de gen que codifican la región constante. 25.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizado además porque cada locus tiene diferentes segmentos de gen que codifican la región constante, o una combinación diferente de dichos segmentos. 26.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, caracterizado además porque cada segmento de gen que codifica una región constante de cadena pesada comprende uno o más exones de región constante de cadena pesada de la clase C5, Cyi-4, C/v, Ce o Cc .2, con la condición de que los segmentos de gen de la región constante de cadena pesada no expresan un dominio CH1 . 27. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26, caracterizado además porque la región constante de cadena pesada es de origen humano. 28. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque dos o más locus heterólogos de cadena pesada VH en ese mamífero están presentes en tándem en el mismo cromosoma. 29. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, caracterizado además porque uno o más locus heterólogos de cadena pesada VH en ese mamífero están presentes en cromosomas diferentes. 30. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, caracterizado además porque el mamífero no humano transgénico es un roedor. 31 . - El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque el roedor es un ratón. 32. - Un mamífero no humano transgénico que comprende más de un locus heterologo de cadena pesada VH como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31. 33. - Un método de producción de anticuerpos solo de cadena pesada por inmunización de un mamífero no humano transgénico como el que se reclama en la reivindicación 32 con un antígeno. 34.- Un método de producción de anticuerpos solo de cadena pesada VH específicos de antígeno, de alta afinidad, que comprende: inmunizar un mamífero no humano transgénico como el que se reclama en la reivindicación 32 con un antígeno; generar hibridomas de células B; seleccionar las células que expresan el anticuerpo solo de cadena pesada específico de antígeno; y aislar el anticuerpo solo de cadena pesada VH de afinidad madura recombinado, específico de antígeno.