WO2021167084A1 - ＩｇＧ結合ペプチドを用いたＩｇＧ抗体の部位特異的修飾体を用いた免疫測定方法 - Google Patents

ＩｇＧ結合ペプチドを用いたＩｇＧ抗体の部位特異的修飾体を用いた免疫測定方法 Download PDF

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WO2021167084A1
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antibody
igg
solid phase
complex
peptide
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PCT/JP2021/006433
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怜香 森
祐二 伊東
Original Assignee
デンカ株式会社
国立大学法人鹿児島大学
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • the present invention relates to an immunoassay method using a site-specific modifier of an IgG antibody using an IgG-binding peptide.
  • antibodies are usually immobilized on the surface of a material by covalent bonds obtained by physical adsorption or amine coupling. In this case, it is required that the antibody immobilized on the surface of the material does not undergo denaturation or functional loss. However, in the conventional method, the antibody immobilized on the surface of the material undergoes denaturation or functional loss, resulting in antigen binding. It was sometimes diminished or lost.
  • Non-Patent Document 1 the CCAP method (chemical connection by affinity peptide) has been developed as a method for modifying human IgG with little decrease in antigen-binding ability.
  • the present invention is a site-specific modification of an IgG antibody using an IgG-binding peptide, which is capable of binding to rodent-derived IgG and has little denaturation or functional loss even when immobilized on the surface of a material. It is an object of the present invention to provide an immunoassay method using a body.
  • the present invention relates to an immunoassay method using a complex of IgG and an IgG-binding peptide to which a functional ligand is bound.
  • the present invention also relates to an in vitro diagnostic agent comprising a complex of IgG and an IgG-binding peptide to which a functional ligand is bound.
  • the present invention also relates to a solid phase in which a complex of IgG and an IgG-binding peptide to which a functional ligand is bound is immobilized.
  • the present invention also comprises a labeled antibody holding portion holding a labeled antibody and a detection region in which a capture antibody is fixed, which is used in the immunoassay method, and the labeled antibody and / or the capture antibody are IgG and a functional ligand.
  • the present invention relates to an immunochromatographic test piece, which is a complex with an IgG-binding peptide bound to.
  • the present invention further comprises a step of covalently binding or physically adsorbing the anchor protein to the solid phase, and a step of covalently binding or physically adsorbing the complex of IgG and an IgG-binding peptide to the anchor protein bound to the solid phase.
  • a step of covalently binding or physically adsorbing the anchor protein to the solid phase and a step of covalently binding or physically adsorbing the complex of IgG and an IgG-binding peptide to the anchor protein bound to the solid phase.
  • site-specificity of an IgG antibody using an IgG-binding peptide which is capable of binding to rodent-derived IgG and has little denaturation or functional loss even when immobilized on the surface of a material. It is possible to provide an immunoassay method using a specific modified product.
  • FIG. 1 is a diagram showing a model of site-specific covalent bond formation via an anchor protein on the surface of a complex detection base material.
  • FIG. 2 is a diagram showing a model of site-specific covalent bond formation directly on the surface of the detection base material of the complex and not via the anchor protein.
  • FIG. 3 is a diagram showing a cross-linking model of IgG-Fc and Z34C.
  • FIG. 4 shows the results of SDS-PAGE examining the reactivity of Z34C variants ( ⁇ Z34C, ⁇ Z34C and ⁇ -1Z34C) to mouse IgG1 or mouse IgG2a.
  • FIG. 1 is a diagram showing a model of site-specific covalent bond formation via an anchor protein on the surface of a complex detection base material.
  • FIG. 2 is a diagram showing a model of site-specific covalent bond formation directly on the surface of the detection base material of the complex and not via the anchor protein.
  • FIG. 3 is a diagram showing a cross-linking
  • FIG. 5 shows the results of SDS-PAGE examining the reactivity of Z34C variants ( ⁇ Z34C, ⁇ Z34C and ⁇ -1Z34C) with human IgG1.
  • FIG. 6 shows the results of SDS-PAGE examining the reactivity of ⁇ Z34C to IgG from human, mouse, rabbit or rat.
  • FIG. 7 shows the results of SDS-PAGE examining the reactivity of Z34C variant Z33-38 biotin to human IgG1 or mouse IgG2a.
  • FIG. 8 shows the results of SDS-PAGE used in Test Examples 4 and 5 for examining the reactivity of Z33-38 biotin with mouse IgG1 or mouse IgG2a.
  • FIG. 9 shows the antigen-reactivity of the biotin-bound IgG obtained by using the CCAP method and the biotin-bound IgG obtained by using the random amine coupling method when each antibody was applied to the ELISA system. This is the result of the investigation.
  • FIG. 10 examines the antigen reactivity of the biotin-bound IgG obtained by using the CCAP method and the biotin-bound IgG obtained by using the random amine coupling method when the antibody was applied to the RPLA method. This is the result.
  • FIG. 11 shows an actual latex agglutination image when the RPLA reaction is carried out.
  • FIG. 12 shows the results of examining the antibody titers of the biotin-bound IgG obtained by using the CCAP method and the biotin-bound IgG obtained by using the random amine coupling method by ELISA.
  • FIG. 13 shows the results of examining the influenza antigen-specific agglutination reaction using particles in which an anti-influenza antibody was immobilized by site-specific covalent bond formation by the CCAP method.
  • antibody binds directly to the surface of the detection base material means an embodiment in which a covalent bond is formed between the surface of the detection base material and the IgG-binding peptide.
  • physisorption means an embodiment in which an antibody is adsorbed on the surface of a detection base material by electrostatic interaction or hydrophobic binding.
  • the immunoassay method uses a complex of IgG and an IgG-binding peptide to which a functional ligand is bound.
  • a complex of IgG and an IgG-binding peptide to which a functional ligand is bound.
  • IgG can be mammalian IgG.
  • IgG includes, for example, human IgG (IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4), rabbit IgG, rat IgG (IgG1, IgG2a, IgG2b or IgG2c), mouse IgG (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c or IgG3). can do.
  • Functional ligands include drugs, proteins, peptides, nucleic acids, enzymes, radioactive labeling substances, fluorescent substances, and chemical cross-linking agents (Cross-linker) having a functional group that can be covalently bonded to the surface of the detection base material.
  • the functional ligand may be biotin or an azide compound (azide).
  • the functional ligand may be directly bound to an IgG-binding peptide or may be bound via a molecule such as PEG (polyethylene glycol).
  • the binding of the IgG-binding peptide to the functional ligand is carried out by a known method, for example, a reaction between an azide group (-azide) and a DBCO (Dibenzocyclooctyne) group, a reaction between a maleimide group and a sulfhydryl group (-SH), or the like. be able to.
  • a reaction between an azide group (-azide) and a DBCO (Dibenzocyclooctyne) group a reaction between a maleimide group and a sulfhydryl group (-SH), or the like.
  • the IgG-binding peptide is a peptide derived from protein A, and includes, for example, a partial peptide of the B domain or Z domain of protein A or a variant thereof.
  • IgG-binding peptides include Z34C and variants thereof.
  • Z34C is derived from the B-domain of protein A and is optimized by the phage library method.
  • Z34C exhibits an affinity (binding ability) for IgG-Fc in humans and rodents in particular.
  • the IgG-binding peptide may contain a peptide selected from the peptides represented by SEQ ID NOs: 1 to 9, and is a peptide in which one or more amino acids are substituted, deleted or added in these peptides.
  • the IgG-binding peptide is a peptide selected from the peptides represented by SEQ ID NOs: 1 to 9, or a peptide in which one or more amino acids are substituted, deleted or added in these peptides, and is an IgG Fc.
  • a peptide having the ability to bind to a region may contain a functional ligand or a peptide to which a functional group for adding a functional ligand is added.
  • SEQ ID NO: 1 is an amino acid sequence in which all Lys contained in Z34C is replaced with Arg, and is referred to as ⁇ Z34C.
  • SEQ ID NO: 2 is an amino acid sequence in which Ph at the N-terminal of ⁇ Z34C is replaced with Lys, and is referred to as ⁇ Z34C.
  • SEQ ID NO: 3 is an amino acid sequence in which Gly is added to the N-terminal of ⁇ Z34C, and is referred to as ⁇ -1Z34C.
  • SEQ ID NO: 4 is an amino acid sequence in which the 7th Arg of ⁇ Z34C is replaced with Lys.
  • SEQ ID NO: 5 is an amino acid sequence in which the 7th Arg of ⁇ Z34C is replaced with Lys.
  • SEQ ID NO: 6 is an amino acid sequence in which the 8th Arg of ⁇ -1Z34C is replaced with Lys.
  • SEQ ID NO: 7 is an amino acid sequence in which the fifth Cys of ⁇ Z34C is replaced with Gln and the C-terminal Cys is removed.
  • SEQ ID NO: 8 is an amino acid sequence in which the 5th Cys of ⁇ Z34C is replaced with Gln, the C-terminal Cys is removed, and Pro-Ser-Arg-Arg-Lys-Arg is added to the C-terminal, and Z33-38.
  • SEQ ID NO: 9 replaces the 5th Cys of ⁇ Z34C with Gln, replaces the 7th and 28th Args with Lys, removes the C-terminal Cys, and pro-Ser-Arg-Arg-Lys at the C-terminal. It is an amino acid sequence to which -Arg-Arg-Lys-Arg-Arg-Lys is added, and is referred to as Z33-5.
  • the number of one or more amino acid residues substituted, added or deleted is, for example, 1 to 10, 1 to 5, 1 to 3, 1 to 1. It can be two.
  • the variant of Z34C can be synthesized by a known method.
  • the synthesis method include a solid-phase synthesis method such as the Fmoc synthesis method and the Boc synthesis method, and a liquid-phase synthesis method such as the fragment condensation method. From the viewpoint of ease of operation, solid-phase synthesis is used. The method is preferred.
  • an IgG-binding peptide such as a variant of Z34C is modified with a cross-linking agent described later, such an IgG-binding peptide can also be produced by modifying the synthesized IgG-binding peptide with a cross-linking agent. It can also be produced by performing peptide synthesis using amino acid residues modified with a cross-linking agent.
  • the IgG-binding peptide is considered to be bound to the side chain of Lys248 in the Fc region of IgG, and both are bound via a cross-linking agent, for example, DSG (Disuccinidiyl Glutate).
  • a cross-linking agent for example, DSG (Disuccinidiyl Glutate).
  • Other examples of the above-mentioned cross-linking agent include a cross-linking agent containing preferably 2 or more succinimidyl groups such as DSS (Disuccinimidyl subate), DMA (Dimethyl Adipimide Dihydrochloride), DMP (Dimethyl PimeridemideRodidium), and the like.
  • a cross-linking agent containing preferably 2 or more ester moieties a cross-linking agent such as DTBP (Dimethyl 3,3'-dithio-bis (polychloride) Dihydrochloride), DSP (Dithiobis (succinimimidyl-propionate)) and the like have SS bonds.
  • DTBP Dimethyl 3,3'-dithio-bis (polychloride) Dihydrochloride
  • DSP Dithiobis (succinimimidyl-propionate)
  • immunoassay methods include ELISA method, immunochromatography method, immunolatex aggregation (LA) method, immunoturbidimetric immunoassay (TIA), chemiluminescence immunoassay (Chemiluminescence immunoassay: CLIA) method. , Time-resolved fluororescense resonance transfer (TR-FRET) method, Crystal transducer microbalance (QCM) method, Biolayer interference (BioLayer Immuno) surface The plasmon resonance method and the like can be mentioned.
  • TR-FRET Time-resolved fluororescense resonance transfer
  • QCM Crystal transducer microbalance
  • BioLayer Immuno BioLayer Immuno
  • the in vitro diagnostic agent contains a complex of IgG and an IgG-binding peptide to which a functional ligand is bound.
  • the IgG-binding peptide may be modified with an enzyme, a radiolabeling substance, a fluorescent substance, or the like.
  • a complex of IgG and an IgG-binding peptide to which a functional ligand is bound is immobilized.
  • the complex may be immobilized directly on the surface of the detection substrate material by physical adsorption, without an anchor protein or via an anchor protein.
  • the detection base include latex particles (Ltx), organic substances such as polypropylene and polystyrene, and immunoassay plates (plates) containing glass as a main component.
  • the complex may be immobilized on the surface of a detection base material having a functional group that reacts with an amino group via an anchor protein (Fig. 1).
  • the anchor protein (Protein in FIG. 1) is not particularly limited, but may be streptavidin or the like, and BSA or HSA used as a blocking agent is preferable from the viewpoint of non-specific reaction.
  • the functional group that reacts with the amino group and the amino group in the anchor protein are reacted, or the functional group that reacts with the carboxy group and the carboxy group in the anchor protein are reacted.
  • -DBCO can be introduced into the anchor protein bound to the surface of the detection base material by reacting the amino group in the anchor protein with DBCO-NHS or the -SH group in the anchor protein with DBCO-maleimide. can.
  • a click reaction is generated between the-DBCO introduced into this anchor protein and the -azide introduced into the IgG-binding peptide in the complex to indirectly immobilize the complex on the surface of the detection base material. Can be done.
  • the functional group to be introduced is not limited to -DBCO, and may be any functional group that can be used for the click reaction.
  • the functional group to be introduced may be, for example, a compound having an alkyne or the like, and more specifically, cyclooctyne, BCN (biciclo [6.1.0] nonyne) or the like.
  • a reaction using -SH and -maleimide or bromoacetyl or the like can also be used.
  • Examples of the functional group that reacts with the amino group include a carboxy group, a tosyl group, an epoxy group, an isocyanate group, an isothiocyanate group, an N-hydroxysuccinimide group (-NHS), a maleimide group and the like.
  • An immobilizer (amino) (Thermo Fisher Scientific Co., Ltd. (formerly Nargenunk International Co., Ltd.)) can be used as a detection base having a functional group that reacts with an amino group.
  • the complex may be immobilized on the surface of a detection base material with a functional group that reacts with the amino group without an anchor protein (Fig. 2).
  • a functional group that reacts with the amino group without an anchor protein Fig. 2.
  • -SH or -azide is introduced into the IgG-binding peptide prior to immobilization, and a -SH protecting group is also introduced if necessary.
  • a covalent bond can be formed and the composite can be immobilized on the surface of the detection base material.
  • protecting group examples include SATA (N-Succinimidyl S-aceticlthioacetylate), SATP (N-Succinimidyl S-Aceticlthiopropionate) and the like.
  • the above complex can be produced by a step of mixing IgG and an IgG-binding peptide to which a functional ligand is bound.
  • the mixing conditions are not particularly limited as long as the cross-linking reaction occurs between the IgG-binding peptide to which the functional ligand is bound and IgG.
  • the IgG-binding peptide to which the functional ligand is bound and IgG are mixed.
  • the reaction can be carried out by mixing at room temperature in a suitable buffer.
  • an appropriate amount of a catalyst that promotes the cross-linking reaction may be added and mixed, if necessary.
  • the reaction conditions may be adjusted in order to enhance the binding property between the IgG-binding peptide to which the functional ligand is bound and IgG.
  • protein A which is the origin of the Z34C peptide, is known to have increased binding to human IgG3 under the condition of pH 8 or higher, and binding to mouse IgG1 by increasing the salt concentration of NaCl or the like. Is known to increase.
  • the conditions for the cross-linking reaction of the present invention can be set.
  • the step of mixing the IgG-binding peptide to which the functional ligand is bound and IgG can be carried out under the conditions of pH 4.5 to 8.5, and more preferably under the conditions of pH 5.0 to 8.0. It is more preferable to carry out under the conditions of pH 6.0 to 7.7.
  • the mixing time (reaction time) of the IgG-binding peptide to which the functional ligand is bound and IgG can be, for example, overnight, and is 30 minutes to 20 hours, 1 minute to 5 hours, 10 minutes to 2 hours, or 15 minutes. It can be from 1 minute to 1 hour.
  • an impurity for example, an IgG-binding peptide to which an unreacted functional ligand is bound, an IgG, a reagent, or the like is separated from the obtained mixture, and a step of purifying the complex is further carried out. It may be carried out.
  • the purification step can be performed by a known method, for example, gel filtration chromatography, ion exchange column chromatography, affinity chromatography, reverse phase column chromatography, chromatography such as HPLC, or the like.
  • the immunochromatographic test piece is used in the above immunoassay method and includes a labeled antibody holding portion for holding a labeled antibody and a detection region in which a capture antibody is fixed, and the labeled antibody or capture antibody functions with IgG. It is a complex with an IgG-binding peptide to which a sex ligand is bound.
  • the method for producing a solid phase is a step of covalently binding or physically adsorbing an anchor protein to the solid phase, and covalently binding or physically adsorbing a complex of IgG and an IgG-binding peptide to the anchor protein bonded to the solid phase.
  • it includes a step of forming a specific bond.
  • Trastuzumab was purchased from iRxMedine for research.
  • Mouse IgG1 control antibodies are available from Crown Bioscience, Inc.
  • Mouse IgG1, ⁇ isotype control purchased from, or mouse IgG1 isotype control purchased from the Medical & Biological Laboratories was used.
  • As the mouse IgG2 control antibody InVivoMAb anti-human / rat HER2 purchased from BioCell Technology, LLC was used.
  • Anti-CA19-9H7D1 antibody and anti-CA19-9G6C8 antibody were purchased from BBI Solutions.
  • the anti-IgE antibody [5D4] was purchased from abcam. Human CA19-9 was purchased from BBI Solutions.
  • Streptavidin Human IgE was purchased from abcam. Streptavidin is described in Prospec-Tany Technology, Ltd. I bought from. Streptavidin-HRP (Horse Radish Peroxidase Streptavidin) is available from Vector lab, Inc. I bought from. All peptides were prepared by the standard Fmoc solid phase synthesis method by Eurofins.
  • Synthetic peptides ( ⁇ Z34C, ⁇ Z34C, ⁇ -1Z34C, Z33-38azide and Z33-5azide) were synthesized by the Fmoc solid phase method. The C-terminus of all peptides is amidated. After removing the protecting group, the peptide was purified using reverse phase HPLC.
  • ⁇ DSG combination The following steps were performed on three types of Z34C variants ( ⁇ Z34C, ⁇ Z34C and ⁇ -1Z34C).
  • the mixture was then incubated at 50 ° C. for 3 hours. Fractions separated using an Inert-Suttain C18 reverse phase column (5 ⁇ m, 7.6 ⁇ 250 mm) were collected and the desired fractions were lyophilized for 20 hours.
  • ⁇ Peptide structure modeling> A model structure of the complex of Fc and binding peptide was constructed by software MOE (Molecular Operating Envi-ronment, CCG) based on the crystal structure of human IgG-Fc and peptide (1OQO.pdb).
  • ⁇ Binding of IgG to three types of Z34C variants ⁇ Z34C, ⁇ Z34C and ⁇ -1Z34C
  • Z33-38 biotin or Z33-5azide > 1 ⁇ M IgG diluted with phosphate buffered saline (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM phosphate buffer, pH 7.4) or acetate buffer (100 mM, pH 5.5) and DMSO to 10 mM
  • PBS phosphate buffered saline
  • acetate buffer 100 mM, pH 5.5
  • DMSO DMSO
  • FIG. 3 shows the structural simulation results of the binding between three types of Z34C variants ( ⁇ Z34C, ⁇ Z34C and ⁇ -1Z34C) and IgG.
  • ⁇ SDS-PAGE> A 4 ⁇ reduction sample buffer was prepared by mixing 450 ⁇ L of 4 ⁇ Laemmli Sample Buffer (Bio-Rad La-boratories, Inc.) with 50 ⁇ L of DTT solution (1M DTT, 1 mM EDTA). The sample solution was mixed with 4 ⁇ reduced sample buffer and incubated at 95 ° C. for 10 minutes. The obtained sample was applied to SDS-PAGE gel (Mini Protein TGX precast Gels Any kD; Bio-Rad Laboratories, Inc.) at 1-2 ⁇ g / well and subjected to electrophoresis. The gel after electrophoresis was stained with Bio-safe Machine G-250Stain (Bio-Rad Laboratories, Inc.).
  • ELISA plate (Nunc-Immuno Module plate Maxisorp; Thermo Fisher Scientific, Inc.) was coated with streptavidin at 300 ng / well and incubated overnight at 4 ° C. After washing the plates, the plates were added with plate blocking solution (100 mM Tris-HCl, pH 7.6 containing 100 mM NaCl, 0.05% Tween 20 and 0.5% BSA) and incubated overnight at 4 ° C. Biotinylated antibody was added at 150 ng / well and incubated at 37 ° C. for 1 hour. After washing the plates, human CA19-9 or human IgE was added at each concentration and incubated at 37 ° C. for 1 hour.
  • plate blocking solution 100 mM Tris-HCl, pH 7.6 containing 100 mM NaCl, 0.05% Tween 20 and 0.5% BSA
  • HRP-labeled antibody was added at an amount of 30 ng / well and incubated at 37 ° C. for 1 hour. After washing the plates, TMB substrate was added and incubated at 25 ° C. for 30 minutes. After adding 0.3MH 2 SO 4 in the same amount as the TMB substrate, the absorbance at 450 nm and 630 nm was measured.
  • the biotinylated antibody (-NHS) was prepared using Biotin Labeling kit-NH2 (Dojin Chemical Laboratory).
  • HRP-labeled antibodies were prepared using the Peroxidase Labeling Kit-NH2 (Dojin Chemical Laboratory).
  • ⁇ RPLA reaction> Antigen (human CA19-9 or IgE) diluted with blocking solution (PBS containing 0.5% BSA, pH 7.4) and dilution buffer (PBS containing 0.1% BSA, pH 7.4) 1: 1 And added to a V-bottom 96-well microplate (25 ⁇ L / well). 25 ⁇ L of antibody-bound bead slurry was added to each well. After mixing in a shaker for 1 minute, the mixture was incubated overnight at 25 ° C. and the aggregated state was observed.
  • blocking solution PBS containing 0.5% BSA, pH 7.4
  • dilution buffer PBS containing 0.1% BSA, pH 7.4
  • Test Example 1 Three types of Z34C variants ( ⁇ Z34C, ⁇ Z34C and ⁇ -1Z34C) were prepared and confirmed to react with mouse IgG1 and mouse IgG2a. Furthermore, the pH, reaction time, reaction molar ratio, and reaction temperature of the reaction solution were tested under several conditions, and the condition with the highest modification rate was found. The modification rate was evaluated by SDS-PAGE (Fig. 4).
  • FIG. 4 it can be seen that the pH of the reaction solution greatly affects the modification efficiency. Furthermore, ⁇ Z34C had a certain level of reactivity in both mouse IgG1 (FIG. 4 (a)) and mouse IgG2a (FIGS. 4 (b) and (c)), which are often used in immunoassay methods. Furthermore, modifications of these three types of Z34C variants to human IgG1 were also confirmed (Fig. 5).
  • ⁇ Z34C was prepared and confirmed to react with human IgG1, mouse IgG1, mouse IgG2a, mouse IgG2b, mouse IgG3, rabbit IgG, rat IgG1, rat IgG2a, rat IgG2b and rat IgG2c.
  • the modification rate was evaluated by SDS-PAGE (Fig. 6).
  • Sandwich ELISA was performed using a modified antibody in which Z33-38 biotin was covalently bound to mouse IgG using the CCAP method. Human CA19-9 and human IgE were used as antigens.
  • Biotinylated antibody was added to a plate coated with streptavidin, and sandwich ELISA was measured.
  • Biotinylated antibodies were prepared by the random amine coupling method (-NHS) or CCAP method (-CCAP).
  • -NHS random amine coupling method
  • -CCAP CCAP method
  • Test Example 5 Antigen detection ability in RPLA was compared using an antibody modified with biotin using the random amine coupling method or an antibody modified with biotin using the CCAP method.
  • the biotin-labeled antibody was adsorbed on streptavidin-coated beads, antigens at each concentration were prepared, and the antibody-binding beads were allowed to act.
  • FIG. 10 shows an actual agglutination image when the RPLA reaction is carried out.
  • Test Example 8 An IgG-binding peptide (Z33-5azide) was bound to an anti-influenza virus antibody using the CCAP method to obtain a complex.
  • the carboxy group of the latex particle having the carboxy group added to the surface was converted to -DBCO by amine coupling.
  • the complex and the latex particles into which -DBCO was introduced were mixed and a covalent bond was formed by a click reaction. After blocking with casein, ultrasonic dispersion was performed to obtain a latex particle suspension.
  • the obtained latex particle suspension (FluA: 0.010% or FluB: 0.016%) and the influenza antigen solution (A type: 800 pfu / mL or B type: 3300 pfu / mL) are mixed in equal amounts.
  • the scattered light signal which increases with the progress of the agglutination reaction, was measured by a neferometer. As is clear from the results shown in FIG. 13, an antigen-dependent agglutination signal was obtained. This indicates that the latex agglutination method works in systems using the CCAP method.
  • the difference in the sensitivity of the immunoassay system due to the difference in the modification method is considered to be mainly due to the following two points.
  • the first is the effect on the affinity for the antigen
  • the second is the effect on the binding orientation on the material surface.
  • the immunoassay method of the present invention it is possible to maintain the affinity of the antibody for rodent IgG and improve the binding orientation, and as a result, the highly sensitive measurement in the immunoassay method can be performed. It can be realized.
  • the immunoassay method of the present invention it is considered that highly sensitive measurement can be realized for antibodies of other hosts such as human IgG and rabbit IgG as well as rodent IgG.

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Abstract

本発明は、ＩｇＧと機能性リガンドが結合したＩｇＧ結合ペプチドとの複合体を用いた免疫測定方法に関する。

Description

ＩｇＧ結合ペプチドを用いたＩｇＧ抗体の部位特異的修飾体を用いた免疫測定方法
　本発明は、ＩｇＧ結合ペプチドを用いたＩｇＧ抗体の部位特異的修飾体を用いた免疫測定方法に関する。
　免疫測定方法において、抗体は、通常、物理吸着やアミンカップリングにより得られる共有結合によって材料の表面に固定化されることが多い。この場合、材料表面に固定化された抗体の変性や機能的損失が生じないことが求められるが、従来の方法では、材料表面に固定化された抗体の変性や機能的損失が生じ、抗原結合能が低下したり、失われたりすることがあった。
　そこで、抗原結合能の低下が少なく、ヒトＩｇＧを修飾する方法として、ＣＣＡＰ法（ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　ｂｙ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｐｅｐｔｉｄｅ）が開発されている（非特許文献１）。
　しかし、従来のＣＣＡＰ法は、インビトロ診断によく用いられる、マウスやラットといったげっ歯類由来のＩｇＧに対しては適応しなかった。
　本発明は、げっ歯類由来のＩｇＧに対して結合することが可能であり、材料表面に固定化されても変性や機能的損失が少ない、ＩｇＧ結合ペプチドを用いたＩｇＧ抗体の部位特異的修飾体を用いた免疫測定方法を提供することを目的とする。
　本発明は、ＩｇＧと機能性リガンドが結合したＩｇＧ結合ペプチドとの複合体を用いた免疫測定方法に関する。
　本発明はまた、ＩｇＧと機能性リガンドが結合したＩｇＧ結合ペプチドとの複合体を含む体外診断薬に関する。
　本発明はまた、ＩｇＧと機能性リガンドが結合したＩｇＧ結合ペプチドとの複合体が固定化された固相に関する。
　本発明はまた、上記免疫測定方法に使用する、標識抗体を保持する標識抗体保持部と捕捉抗体が固定されている検出領域を備え、前記標識抗体若しくは捕捉抗体又はその両方がＩｇＧと機能性リガンドが結合したＩｇＧ結合ペプチドとの複合体である、イムノクロマト試験片に関する。
　本発明はさらに、固相にアンカータンパク質を共有結合又は物理吸着させる工程と、ＩｇＧとＩｇＧ結合ペプチドとの複合体を固相に結合したアンカータンパク質に共有結合又は物理吸着させる工程とを備える上記固相を製造する方法に関する。
　本発明によれば、げっ歯類由来のＩｇＧに対して結合することが可能であり、材料表面に固定化されても変性や機能的損失が少ない、ＩｇＧ結合ペプチドを用いたＩｇＧ抗体の部位特異的修飾体を用いた免疫測定方法を提供することができる。
図１は、複合体の検出基盤材料表面へのアンカータンパク質を介した部位特異的共有結合形成のモデルを示す図である。 図２は、複合体の検出基盤材料表面への直接的なかつアンカータンパク質を介さない部位特異的共有結合形成のモデルを示す図である。 図３はＩｇＧ－ＦｃとＺ３４Ｃとの架橋モデルを示す図である。 図４は、マウスＩｇＧ１又はマウスＩｇＧ２ａに対するＺ３４Ｃ改変体（αＺ３４Ｃ、εＺ３４Ｃ及びα－１Ｚ３４Ｃ）の反応性を調べたＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果である。 図５は、ヒトＩｇＧ１に対するＺ３４Ｃ改変体（αＺ３４Ｃ、εＺ３４Ｃ及びα－１Ｚ３４Ｃ）の反応性を調べたＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果である。 図６は、ヒト、マウス、ウサギ又はラット由来のＩｇＧに対するαＺ３４Ｃの反応性を調べたＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果である。 図７は、ヒトＩｇＧ１又はマウスＩｇＧ２ａに対するＺ３４Ｃ改変体Ｚ３３－３８ｂｉｏｔｉｎの反応性を調べたＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果である。 図８は、試験例４，５で用いた、マウスＩｇＧ１又はマウスＩｇＧ２ａに対するＺ３３－３８ｂｉｏｔｉｎの反応性を調べたＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果である。 図９は、ＣＣＡＰ法を用いて得られたビオチン結合ＩｇＧと、ランダムアミンカップリング法を用いて得られたビオチン結合ＩｇＧとについて、それぞれの抗体をＥＬＩＳＡ系に適用させた際の抗原反応性を調べた結果である。 図１０は、ＣＣＡＰ法を用いて得られたビオチン結合ＩｇＧと、ランダムアミンカップリング法を用いて得られたビオチン結合ＩｇＧとについて、それぞれ抗体をＲＰＬＡ法に適用させた際の抗原反応性を調べた結果である。 図１１は、ＲＰＬＡ反応が行われたときの実際のラテックス凝集像を示す。 図１２は、ＣＣＡＰ法を用いて得られたビオチン結合ＩｇＧと、ランダムアミンカップリング法を用いて得られたビオチン結合ＩｇＧとについて、抗体価をＥＬＩＳＡによって調べた結果である。 図１３は、ＣＣＡＰ法によって抗インフルエンザ抗体を部位特異的な共有結合形成により固定化した粒子を用いて、インフルエンザ抗原特異的な凝集反応を調べた結果である。
　以下、本発明について詳細に説明する。本明細書において、「抗体が検出基盤材料表面へ直接的に結合する」とは、検出基盤材料表面とＩｇＧ結合ペプチドとの間に共有結合が形成される態様を意味する。一方で、「物理吸着」とは、静電的相互作用や疎水的結合によって、抗体が検出基盤材料表面に吸着している態様を意味する。
　一実施形態に係る免疫測定方法は、ＩｇＧと機能性リガンドが結合したＩｇＧ結合ペプチドとの複合体を用いるものである。本実施形態に係る免疫測定方法を用いれば、抗体工学的な抗体分子の遺伝子改変を必要とせず、室温で迅速に反応し、抗体に負担をかけない条件下でペプチド／ＩｇＧを結合させることができる。
　ＩｇＧは、哺乳動物のＩｇＧとすることができる。ＩｇＧは、例えば、ヒトのＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）、ウサギのＩｇＧ、ラットのＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ２ｃ）、マウスのＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ又はＩｇＧ３）とすることができる。
　機能性リガンドとしては、薬物、タンパク質、ペプチド、核酸、酵素、放射性標識物質、蛍光物質、及び、検出基盤材料表面へ共有結合させる事が可能な官能基を有する化学架橋剤（Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｒ）等が挙げられる。より具体的には、機能性リガンドは、ビオチンであってよく、アジ化合物（アジド）であってよい。機能性リガンドは、直接ＩｇＧ結合ペプチドに結合してもよいし、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）等の分子を介して結合してもよい。
　ＩｇＧ結合ペプチドと機能性リガンドとの結合は、公知の方法、例えば、アジド基（－ａｚｉｄｅ）とＤＢＣＯ（Ｄｉｂｅｎｚｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ）基との反応や、マレイミド基とスルフヒドリル基（－ＳＨ）との反応等により行うことができる。
　一実施形態において、ＩｇＧ結合ペプチドは、プロテインＡに由来するペプチドであり、例えば、プロテインＡのＢドメイン又はＺドメインの部分ペプチド又はその改変体が含まれる。ＩｇＧ結合ペプチドとしては、例えば、Ｚ３４Ｃ及びその改変体が挙げられる。Ｚ３４ＣはプロテインＡのＢ－ドメインに由来し、ファージライブラリー法により最適化されたものである。Ｚ３４Ｃは特にヒト及びげっ歯類のＩｇＧ－Ｆｃに対する親和性（結合能）を示す。また、ＩｇＧ結合ペプチドは、配列番号１～９で表されるペプチドから選択されるペプチドを含んでいてよく、これらのペプチドにおいて１又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたペプチドであって、ＩｇＧのＦｃ領域への結合能を有するペプチドを含んでいてよい。また、ＩｇＧ結合ペプチドは、配列番号１～９で表されるペプチドから選択されるペプチドや、これらのペプチドにおいて１又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたペプチドであって、ＩｇＧのＦｃ領域への結合能を有するペプチドに、機能性リガンドや機能性リガンドを付加するための官能基を加えたものを含んでいてもよい。なお、配列番号１は、Ｚ３４Ｃに含まれるすべてのＬｙｓがＡｒｇに置換されたアミノ酸配列であり、αＺ３４Ｃと表記する。配列番号２は、αＺ３４ＣのＮ末端のＰｈｅがＬｙｓに置換されたアミノ酸配列であり、εＺ３４Ｃと表記する。配列番号３は、αＺ３４ＣのＮ末端にＧｌｙが付加されたアミノ酸配列であり、α－１Ｚ３４Ｃと表記する。配列番号４は、αＺ３４Ｃの７番目のＡｒｇがＬｙｓに置換されたアミノ酸配列である。配列番号５は、εＺ３４Ｃの７番目のＡｒｇがＬｙｓに置換されたアミノ酸配列である。配列番号６は、α－１Ｚ３４Ｃの８番目のＡｒｇがＬｙｓに置換されたアミノ酸配列である。配列番号７は、αＺ３４Ｃの５番目のＣｙｓがＧｌｎに置換され、Ｃ末端のＣｙｓを除去したアミノ酸配列である。配列番号８は、αＺ３４Ｃの５番目のＣｙｓをＧｌｎに置換し、Ｃ末端のＣｙｓを除去し、Ｃ末端にＰｒｏ―Ｓｅｒ―Ａｒｇ―Ａｒｇ―Ｌｙｓ―Ａｒｇを付加したアミノ酸配列であり、Ｚ３３－３８と表記する。配列番号９は、αＺ３４Ｃの５番目のＣｙｓをＧｌｎに置換し、７番目及び２８番目のＡｒｇをＬｙｓに置換し、Ｃ末端のＣｙｓを除去し、Ｃ末端にＰｒｏ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｌｙｓを付加したアミノ酸配列であり、Ｚ３３－５と表記する。
　配列番号１～９で表されるペプチドにおいて、置換、付加又は欠失される１又は複数のアミノ酸残基の数は、例えば、１～１０個、１～５個、１～３個、１～２個とすることができる。
　Ｚ３４Ｃの改変体は、公知の方法で合成することができる。合成方法としては、例えば、Ｆｍｏｃ合成法やＢｏｃ合成法のような固相合成法、フラグメント縮合法のような液相合成法などが挙げられるが、操作の簡便性の観点からは、固相合成法が好ましい。Ｚ３４Ｃの改変体等のＩｇＧ結合ペプチドが、後述する架橋剤によって修飾されている場合、そのようなＩｇＧ結合ペプチドは、合成されたＩｇＧ結合ペプチドに架橋剤を修飾させて製造することもでき、また、架橋剤により修飾されたアミノ酸残基を用いてペプチド合成を行うことで製造することもできる。
　一実施形態において、ＩｇＧ結合ペプチドは、ＩｇＧのＦｃ領域のＬｙｓ２４８の側鎖に結合していると考えられ、両者は架橋剤、例えば、ＤＳＧ（Ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　Ｇｌｕｔａｒａｔｅ）を介して結合している。上記架橋剤としては、他に、ＤＳＳ（Ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｓｕｂｅｒａｔｅ）等のスクシンイミジル基を好ましくは２以上含む架橋剤、ＤＭＡ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ　Ａｄｉｐｉｍｉｄａｔｅ　Ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＤＭＰ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ　Ｐｉｍｅｌｉｍｉｄａｔｅ　Ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＤＭＳ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ　Ｓｕｂｅｒｉｍｉｄａｔｅ　Ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）等のイミドエステル部分を好ましくは２以上含む架橋剤、ＤＴＢＰ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ　３，３’－ｄｉｔｈｉｏ－ｂｉｓ（ｐｒｏｐｉｏｎｉｍｉｄａｔｅ）　Ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＤＳＰ（Ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ　（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ））等のＳＳ結合を有する架橋剤等が挙げられる。
　免疫測定方法としては、ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマトグラフィー法、免疫ラテックス凝集（ｌａｔｅｘ　ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ：ＬＡ）法、免疫比濁法（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＴＩＡ）、化学発光免疫測定法（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＣＬＩＡ）、パルスイムノアッセイ法、時間分解蛍光－蛍光共鳴エネルギー転移（ｔｉｍｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＴＲ－ＦＲＥＴ）法、水晶振動子マイクロバランス（Ｑｕａｒｔｚ　Ｃｒｙｓｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ：ＱＣＭ）法、バイオレイヤー干渉（ＢｉｏＬａｙｅｒ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ：ＢＬＩ）法及び表面プラズモン共鳴法等が挙げられる。
　一実施形態に係る体外診断薬は、ＩｇＧと機能性リガンドが結合したＩｇＧ結合ペプチドとの複合体を含む。ＩｇＧ結合ペプチドは、体外診断薬に含まれる場合、酵素、放射性標識物質、蛍光物質等により修飾されていてもよい。上記の免疫測定方法を用いることにより、抗体の抗原親和性の低下を抑制し、材料表面の固定化配向を高めることができるため、例えば、免疫測定方法を用いた体外診断薬に適用すれば、高感度な測定が可能となると考えられる。
　一実施形態に係る固相は、ＩｇＧと機能性リガンドが結合したＩｇＧ結合ペプチドとの複合体が固定化されている。
　上記複合体は、検出基盤材料表面に直接的に、物理吸着によって、アンカータンパク質なしで、又は、アンカータンパク質を介して固定化されてよい。検出基盤としては、ラテックス粒子（Ｌｔｘ）や、ポリプロピレン、ポリスチレン等の有機物又はガラスを主成分とする免疫測定用プレート（ｐｌａｔｅ）等が挙げられる。
　上記複合体は、アミノ基と反応する官能基付きの検出基盤材料表面にアンカータンパク質を介して固定化されてもよい（図１）。アンカータンパク質（図１中のＰｒｏｔｅｉｎ）は特に限定されないが、ストレプトアビジン等であることができ、非特異反応との兼ね合いからは、ブロッキング剤に用いているＢＳＡやＨＳＡが好適である。
　図１に示すようにアミノ基と反応する官能基とアンカータンパク質中のアミノ基とを反応させたり、あるいは、カルボキシ基と反応する官能基とアンカータンパク質中のカルボキシ基とを反応させたり等して、さらに、アンカータンパク質中のアミノ基とＤＢＣＯ－ＮＨＳ、又は、アンカータンパク質中の－ＳＨ基とＤＢＣＯ－ｍａｌｅｉｍｉｄｅとを反応させて、検出基盤材料表面に結合したアンカータンパク質に－ＤＢＣＯを導入することができる。さらに、このアンカータンパク質に導入された－ＤＢＣＯと複合体中のＩｇＧ結合ペプチドに導入された－ａｚｉｄｅとの間でクリック反応を生じさせ、検出基盤材料表面に複合体を間接的に固定化することができる。なお、導入される官能基は－ＤＢＣＯに限定されず、クリック反応に利用可能な官能基であればよい。導入される官能基は、例えば、アルキンを有する化合物等であってよく、より具体的には、シクロオクチン、ＢＣＮ（ｂｉｃｙｃｌｏ［６．１．０］ｎｏｎｙｎｅ）等であってよい。このクリック反応以外に、－ＳＨと－ｍａｌｅｉｍｉｄｅ又はブロモアセチルを用いた反応等も利用可能である。
　アミノ基と反応する官能基としては、カルボキシ基、トシル基、エポキシ基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド基（－ＮＨＳ）、マレイミド基等が挙げられる。なお、アミノ基と反応する官能基付きの検出基盤としては、イモビライザー（アミノ）（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社（旧　ナルジェヌンクインターナショナル株式会社））を使用することができる。
　上記複合体は、上記アミノ基と反応する官能基付きの検出基盤材料表面にアンカータンパク質なしで固定化されてもよい（図２）。この場合、固定化する前に、ＩｇＧ結合ペプチドに－ＳＨ又は－ａｚｉｄｅを導入し、必要な場合は－ＳＨの保護基も導入する。必要に応じて脱保護し、－ＳＨ又は－ａｚｉｄｅを検出基盤材料表面のアミノ基と反応する官能基と反応させることによって導入したアルキンを有する官能基（シクロオクチン、ＤＢＣＯ、ＢＣＮ等）と反応させることで共有結合を形成させ、上記複合体を検出基盤材料表面に固定化することができる。
　保護基としては、ＳＡＴＡ（Ｎ－Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　Ｓ－ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ）、ＳＡＴＰ（Ｎ－Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　Ｓ－Ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）等が挙げられる。
　上記複合体がアミノ基と反応する官能基付きの検出基盤材料表面にアンカータンパク質なしで固定化される具体例として、図２（ｂ）、（ｃ）が挙げられる。
　上記複合体は、ＩｇＧと機能性リガンドが結合したＩｇＧ結合ペプチドとを混合させる工程によって製造することができる。混合の条件は、機能性リガンドが結合したＩｇＧ結合ペプチドとＩｇＧの間で架橋反応が生じる条件で行うものであれば特に限定されないが、例えば、機能性リガンドが結合したＩｇＧ結合ペプチドとＩｇＧを、適当なバッファー中において、室温で混合することにより反応を行うことができる。機能性リガンドが結合したＩｇＧ結合ペプチドに架橋剤が結合している場合、必要に応じて架橋反応を促進する触媒を適量加えて混合を行ってもよい。
　機能性リガンドが結合したＩｇＧ結合ペプチドとＩｇＧの結合性を高めるため、反応条件を調整してもよい。例えば、Ｚ３４Ｃペプチドの由来となるプロテインＡは、ｐＨが８以上の条件でヒトＩｇＧ３との結合性が増すことが知られており、またＮａＣｌ等の塩濃度を高めることによってマウスＩｇＧ１との結合性が増すことが知られている。このような知見を参照して、本発明の架橋反応の条件を設定することができる。
　機能性リガンドが結合したＩｇＧ結合ペプチドとＩｇＧとの混合工程は、ｐＨ４．５～８．５の条件下で行うことができ、ｐＨ５．０～８．０の条件下で行うことがより好ましく、ｐＨ６．０～７．７の条件下で行うことが更に好ましい。
　機能性リガンドが結合したＩｇＧ結合ペプチドとＩｇＧとの混合比率（モル比）は、ＩｇＧ：ペプチド＝１：１～２０とすることができる。
　機能性リガンドが結合したＩｇＧ結合ペプチドとＩｇＧとの混合時間（反応時間）は、例えば、一晩とすることができ、３０分～２０時間、１分～５時間、１０分～２時間又は１５分～１時間とすることもできる。
　上記混合工程の後に、必要に応じて、得られた混合物から不純物、例えば、未反応の機能性リガンドが結合したＩｇＧ結合ペプチド、ＩｇＧ、及び試薬等を分離し、複合体を精製する工程をさらに実施してよい。精製工程は、公知の方法、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等のクロマトグラフィー等により行うことができる。
　一実施形態に係るイムノクロマト試験片は、上記免疫測定方法に使用され、標識抗体を保持する標識抗体保持部と捕捉抗体が固定されている検出領域を備え、上記標識抗体又は捕捉抗体がＩｇＧと機能性リガンドが結合したＩｇＧ結合ペプチドとの複合体である。
　一実施形態に係る固相の製造方法は、固相にアンカータンパク質を共有結合又は物理吸着させる工程と、ＩｇＧとＩｇＧ結合ペプチドとの複合体を固相に結合したアンカータンパク質に共有結合、物理吸着又は特異的な結合をさせる工程とを備える。
　以下、本発明について、実施例を挙げて更に詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜モノクローナル抗体、抗原及びペプチドの調整＞
　トラスツズマブはｉＲｘＭｅｄｉｃｉｎｅから研究用に購入した。マウスＩｇＧ１コントロール抗体は、Ｃｒｏｗｎ　Ｂｉｏｓｃｉ－ｅｎｃｅ、Ｉｎｃ．から購入したマウスＩｇＧ１、κアイソタイプコントロール、又は医学生物学研究所から購入したマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロールを用いた。マウスＩｇＧ２コントロール抗体は、ＢｉｏＣｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＬＬＣから購入したＩｎＶｉｖｏＭＡｂ抗ヒト／ラットＨＥＲ２を用いた。抗ＣＡ１９－９Ｈ７Ｄ１抗体及び抗ＣＡ１９－９Ｇ６Ｃ８抗体は、ＢＢＩ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓから購入した。抗ＩｇＥ抗体［５Ｄ４］は、ａｂｃａｍから購入した。ヒトＣＡ１９－９は、ＢＢＩ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓから購入した。ヒトＩｇＥは、ａｂｃａｍから購入した。ストレプトアビジンは、Ｐｒｏｓｐｅｃ－Ｔａｎｙ　Ｔｅｃｈｎｏｇｅｎｅ、Ｌｔｄ．から購入した。ストレプトアビジン－ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼストレプトアビジン）は、Ｖｅｃｔｏｒ　ｌａｂ、Ｉｎｃ．から購入した。全てのペプチドは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓによる標準Ｆｍｏｃ固相合成法により調製した。
＜ペプチド合成＞
　合成ペプチド（αＺ３４Ｃ、εＺ３４Ｃ、α－１Ｚ３４Ｃ、Ｚ３３－３８ａｚｉｄｅ及びＺ３３－５ａｚｉｄｅ）をＦｍｏｃ固相法により合成した。すべてのペプチドのＣ末端はアミド化されている。保護基を除去した後、逆相ＨＰＬＣを用いてペプチドを精製した。
＜分子内ジスルフィド結合の形成＞
　以下の工程を、３種類のＺ３４Ｃ改変体（αＺ３４Ｃ、εＺ３４Ｃ及びα－１Ｚ３４Ｃ）に対して行った。ＤＭＳＯに溶解した１０ｍＭペプチド溶液及び０．２ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）を等量混合し、室温で２時間インキュベートした。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加することによって反応混合物（１．６ｍＬ）を酸性化させ、０．１％ＴＦＡ溶液で平衡化したＳｅｐ－Ｐａｋ　ｔＣ１８逆相カラム（Ｗａｔｅｒｓ）に通した。０．１％ＴＦＡ溶液で洗浄した後、０．１％ＴＦＡを含有する６０％アセトニトリル溶液でペプチドを溶出させた。アセトニトリルを蒸発させて除去し、２０時間凍結乾燥した。凍結乾燥物を１０ｍＭの濃度となるようにＤＭＳＯに溶解させた。
＜ＤＳＧ結合＞
　以下の工程を、３種類のＺ３４Ｃ改変体（αＺ３４Ｃ、εＺ３４Ｃ及びα－１Ｚ３４Ｃ）に対して行った。ＤＭＳＯに溶解した１０ｍＭ酸化ペプチド溶液と、アセトニトリルに溶解した５００ｍＭジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）溶液とを、モル比がペプチド：ＤＳＧ＝１：３０となるように混合し、ピリジンを最終濃度０．５％となるように添加した。その後、混合物を５０℃で３時間インキュベートした。Ｉｎｅｒｔ－Ｓｕｓｔａｉｎ　Ｃ１８逆相カラム（５μｍ、７．６×２５０ｍｍ）を用いて分離した画分を回収し、目的の画分を２０時間凍結乾燥した。
＜Ｚ３３－３８ａｚｉｄｅへのビオチンとＤＳＧの結合＞
　以下の工程を、Ｚ３３－３８ａｚｉｄｅに対して行い、Ｚ３３－３８ａｚｉｄｅにビオチンを導入したＺ３３－３８ｂｉｏｔｉｎを得た。ＤＭＳＯに溶解した４０ｍＭ　Ｚ３３－３８ａｚｉｄｅと、ＤＭＳＯに溶解した１００ｍＭ　ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）と、アセトニトリルに溶解した５００ｍＭ　ＤＳＧとを、モル比がペプチド：ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－Ｂｉｏｔｉｎ：ＤＳＧ＝１：１：２０となるように混合し、ピリジンを最終濃度５％となるように添加した。その後、混合物を５０℃で２時間インキュベートした。
＜ペプチド構造モデリング＞
　Ｆｃと結合ペプチドとの複合体のモデル構造を、ヒトＩｇＧ－Ｆｃとペプチド（１ＯＱＯ．ｐｄｂ）との結晶構造に基づいて、ソフトウェアＭＯＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ　Ｅｎｖｉ－ｒｏｎｍｅｎｔ、ＣＣＧ）で構築した。
＜３種類のＺ３４Ｃ改変体（αＺ３４Ｃ、εＺ３４Ｃ及びα－１Ｚ３４Ｃ）、Ｚ３３－３８ｂｉｏｔｉｎ又はＺ３３－５ａｚｉｄｅとＩｇＧとの結合＞
　リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１３７ｍＭ　ＮａＣｌ、２．７ｍＭ　ＫＣｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）又は酢酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ５．５）で希釈した１μＭのＩｇＧと、ＤＭＳＯで１０ｍＭに希釈したペプチド試薬とを、モル比がＩｇＧ：ペプチド＝１：５となるように混合した。混合物を各反応温度（２５℃、３７℃、５０℃）で１時間又は一晩（約１６時間）インキュベートした。３種類のＺ３４Ｃ改変体（αＺ３４Ｃ、εＺ３４Ｃ及びα－１Ｚ３４Ｃ）とＩｇＧとの結合の構造シミュレーション結果を図３に示す。
＜ＳＤＳ－ＰＡＧＥ＞
　４５０μＬの４×Ｌａｅｍｍｌｉ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ　Ｌａ－ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）と、５０μＬのＤＴＴ溶液（１Ｍ　ＤＴＴ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）とを混合して、４×還元サンプルバッファーを調製した。試料溶液と、４×還元サンプルバッファーとを混合し、９５℃で１０分間インキュベートした。得られた試料を１－２μｇ／ウェルでＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｍｉｎｉ　Ｐｒｏｔｅａｎ　ＴＧＸ　ｐｒｅｃａｓｔ　Ｇｅｌｓ　Ａｎｙ　ｋＤ；Ｂｉｏ－Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）にアプライし、電気泳動を行った。電気泳動後のゲルをＢｉｏ－ｓａｆｅ　Ｃｏｍａｓｓｉｅ　Ｇ－２５０Ｓｔａｉｎ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）で染色した。
＜サンドイッチ－ＥＬＩＳＡ＞
　ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ　Ｍｏｄｕｌｅ　ｐｌａｔｅ　Ｍａｘｉｓｏｒｐ；Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．）にｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを３００　ｎｇ／ｗｅｌｌとなるようにコートし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄した後、プレートをプレートブロッキング溶液（１００ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．５％ＢＳＡを含む１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．６）を加え、４℃で一晩インキュベートした。ビオチン化抗体を１５０ｎｇ／ウェルで添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄後、ヒトＣＡ１９－９又はヒトＩｇＥを各濃度で添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、３０ｎｇ／ウェルの量でＨＲＰ標識抗体を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、ＴＭＢ基質を添加し、２５℃で３０分間インキュベートした。０．３Ｍ　Ｈ２ＳＯ４をＴＭＢ基質と同量添加した後、４５０ｎｍ及び６３０ｎｍにおける吸光度を測定した。
　ビオチン化抗体（－ＮＨＳ）は、Ｂｉｏｔｉｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｋｉｔ－ＮＨ２（同仁化学研究所）を用いて調製した。ＨＲＰ標識抗体は、ペルオキシダーゼ標識キット－ＮＨ２（同仁化学研究所）を用いて調製した。
＜ＲＰＬＡ（逆受身ラテックス凝集反応）用抗体結合ビーズの調製＞
　１ｍＬのＰＢＳを、６０μＬのストレプトアビジンコートビーズ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　Ｃｏａｔｅｄ　Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ　１．０μｍ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）スラリーと混合し、遠心分離した。上清を除去し、ＰＢＳで希釈した６００μＬのビオチン化抗体（２０μｇ／ｍＬ）を加えてほぐし、２５℃で２時間ローテートした。遠心分離後、上清を除去し、６００μＬのブロッキング溶液（０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）を添加し、混合物を２５℃で１時間ローテートした。遠心分離後、上清を除去し、１ｍＬのブロッキング溶液を添加して懸濁し、次いで遠心分離して上清を除去し、洗浄を行った（計３回行った）。２．１ｍＬの保存溶液（０．５％ＢＳＡ及び０．０８％ＮａＮ３を含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）を添加し、懸濁してから、超音波処理した。
＜ＲＰＬＡ反応＞
　ブロッキング溶液（０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）と希釈緩衝液（０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）で希釈した抗原（ヒトＣＡ１９－９又はＩｇＥ）を１：１で混合し、Ｖ底９６ウェルマイクロプレートに添加した（２５μＬ／ウェル）。２５μＬの抗体結合ビーズスラリーを各ウェルに添加した。シェーカーで１分間混合した後、２５℃で一晩インキュベートし、凝集状態を観察した。
（試験例１）
　３種類のＺ３４Ｃ改変体（αＺ３４Ｃ、εＺ３４Ｃ及びα－１Ｚ３４Ｃ）を調製し、マウスＩｇＧ１及びマウスＩｇＧ２ａと反応することを確認した。さらに、反応溶液のｐＨ、反応時間、反応モル比、反応温度をいくつかの条件で試験し、修飾率が最も高い条件を見いだした。修飾率はＳＤＳ－ＰＡＧＥで評価した（図４）。
　図４によれば、反応溶液のｐＨが修飾効率に大きく影響することが分かる。さらに、αＺ３４Ｃは、免疫測定方法でしばしば使用されるマウスＩｇＧ１（図４（ａ））及びマウスＩｇＧ２ａ（図４（ｂ）（ｃ））の両方において、一定以上の反応性を有した。さらに、これら３種類のＺ３４Ｃ改変体のヒトＩｇＧ１に対する修飾も確認された（図５）。
　この反応によれば、理論的には一価又は二価の修飾が生じる（図４（ｄ））。実際のＨ鎖に対する修飾率は５０％前後であることが多かった（図４、図５）。
（試験例２）
　αＺ３４Ｃを調製し、ヒトＩｇＧ１、マウスＩｇＧ１、マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、マウスＩｇＧ３、ウサギＩｇＧ、ラットＩｇＧ１、ラットＩｇＧ２ａ、ラットＩｇＧ２ｂ及びラットＩｇＧ２ｃと反応することを確認した。修飾率はＳＤＳ－ＰＡＧＥで評価した（図６）。
（試験例３）
　Ｚ３３－３８ａｚｉｄｅにクリック反応によってビオチンを導入して得られたＺ３３－３８ｂｉｏｔｉｎと、ヒトＩｇＧ１及びマウスＩｇＧ２ａとの結合をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより確認した。ヒトＩｇＧ１に対する結果を図７（ｂ）に、マウスＩｇＧ２ａに対する結果を図７（ｃ）に示す。Ｚ３３－３８は、３種類のＺ３４Ｃ改変体（αＺ３４Ｃ、εＺ３４Ｃ及びα－１Ｚ３４Ｃ）に比べて合成ペプチドの収率が高い傾向にあり、より合成が容易かつ安価である。
（試験例４）
　ＣＣＡＰ法を用いてマウスＩｇＧにＺ３３－３８ｂｉｏｔｉｎを共有結合させた修飾抗体を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡを行った。抗原としてヒトＣＡ１９－９とヒトＩｇＥを用いた。
　ビオチン化抗体を、ストレプトアビジンでコーティングしたプレートに加え、サンドイッチＥＬＩＳＡの測定を行った。ビオチン化抗体を、ランダムアミンカップリング法（－ＮＨＳ）又はＣＣＡＰ法（－ＣＣＡＰ）によって調製した。ＩｇＥ抗原の濃度を変えて測定した結果、ランダムアミンカップリング法とＣＣＡＰ法との間に有意差が認められ、ランダムアミンカップリング法と比べてＣＣＡＰ法は高感度であった（図９）。これは、第一に、ＣＣＡＰ法により修飾を行った抗体はランダムアミンカップリング法により修飾を行った抗体よりも抗原に対する抗体の反応性の低下が少ないためであることが考えられる。第２に、ＣＣＡＰ法はプレートに対する捕捉抗体の配向が良好であり、抗原に結合することができる抗原結合部位の数が多いためであることが考えられる。
（試験例５）
　ランダムアミンカップリング法を用いてビオチンで修飾した抗体又はＣＣＡＰ法を用いてビオチンで修飾した抗体を用いて、ＲＰＬＡにおける抗原検出能を比較した。ビオチン標識抗体をストレプトアビジン被覆ビーズに吸着させ、各濃度の抗原を調製して抗体結合ビーズを作用させた。ＣＡ１９－９又はＩｇＥを抗原とする系では、ｎ＝３で試験が実施された。
　ＣＡ１９－９を抗原として用いた各系において、抗原濃度に依存したスコアの増加が観察された（図１０（ａ））。ＣＣＡＰ法を用いたシステムは、より低い抗原濃度でもより高いスコアを示し、感度はランダムアミンカップリング法を用いた系より高かった。また、コントロール抗体を結合させたビーズを用いた場合には、本来凝集反応が起こらずスコアは（－）であるはずであるが、ランダムアミンカップリング法を用いた系では非特異的な凝集反応が生じた。これは、ランダムアミンカップリング法を用いた系では、抗体表面のリジン残基でランダムに起こるカップリング反応により、抗体の構造が維持されず、疎水性部分が露出したためと考えられる。一方、ＣＣＡＰ法を用いた系では、このような非特異的な反応は観察されなかった（図１０（ａ））。
　ＩｇＥを抗原とする系では、ＣＣＡＰ法を用いた系でのみ抗原濃度に依存したスコアの増加が確認された。ランダムアミンカップリング法を用いた場合、いずれの濃度でもビーズの凝集反応は観察されなかった（図１０（ｂ））。図１１は、ＲＰＬＡ反応が行われたときの実際の凝集像を示す。
（試験例６）
　表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｘ１００装置（ＧＥヘルスケア）を用いて２５℃で行い、ヒトＩｇＥをＣＭ５センサーチップ（ＧＥヘルスケア）にメーカーの説明書に従ってアミンカップリング法により固定した。結合動態は、分析緩衝液（１２０ｍＭ　ＮａＣｌ、７．１ｍＭ　Ｎａ２ＰＯ４、２．３６ｍＭ　ＫＣｌ、１．２９ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、１１８ｍＭ　Ｔｒｉｓ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）で希釈した５つの濃度のＩｇＧを用いて、シングルサイクルカイネティクスモードにより分析した。結合過程の測定は、各濃度のＩｇＧを２分間添加することにより行った（流速３０μＬ／ｍｉｎ）。解離過程の測定は、分析緩衝液を３０分間流した（流速３０μＬ／ｍｉｎ）。ＩｇＧの希釈濃度を表１に、結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
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（試験例７）
　サンドイッチＥＬＩＳＡ系及びＲＰＬＡ法に用いたビオチン化抗体の力価は、抗原を固定化したプレートを用いたＥＬＩＳＡ法により確認した。抗ＣＡ１９－９　Ｇ６Ｃ８抗体及び抗ＣＡ１９－９　Ｈ７Ｄ１抗体のいずれも、ランダムアミンカップリング法（－ＮＨＳ）はＣＣＡＰ法とあまり差がなかった。抗ＩｇＥ抗体価については、ＣＣＡＰ法がランダムアミンカップリング法より有意に高かった（図１２）。
（試験例８）
　ＣＣＡＰ法を用いてＩｇＧ結合ペプチド（Ｚ３３－５ａｚｉｄｅ）を抗インフルエンザウイルス抗体に結合させ、複合体を得た。表面にカルボキシ基を付与されたラテックス粒子のカルボキシ基を、アミンカップリングによって－ＤＢＣＯに変換した。上記複合体及び－ＤＢＣＯが導入されたラテックス粒子を混合し、クリック反応によって共有結合を形成させた。カゼインにてブロッキングを行った後、超音波分散を行ってラテックス粒子懸濁液を得た。得られたラテックス粒子懸濁液（ＦｌｕＡ：０．０１０％又はＦｌｕＢ：０．０１６％）とインフルエンザ抗原溶液（Ａ型：８００ｐｆｕ／ｍＬ又はＢ型：３３００ｐｆｕ／ｍＬ）をそれぞれ等量で混合し、ネフェロメーターによって凝集反応の進行と共に増加する散乱光シグナルを測定した。図１３に示した結果から明らかなように、抗原依存的な凝集シグナルが得られた。これは、ＣＣＡＰ法を用いた系においてラテックス凝集法が機能することを示す。
　このような修飾法の違いによる免疫測定系の感度の違いは、主に以下の２点に起因すると考えられる。第一は、抗原への親和性に対する効果であり、第２は、材料表面への結合配向に対する効果である。以上の結果から、抗ＩｇＥ　５Ｄ４抗体においてみられるように、ＩｇＧの修飾法の違いによって抗原に対する親和性に差が生じることがわかる。しかしながら、いくつかの場合において、抗ＣＡ１９－９　Ｇ６Ｃ８抗体、抗ＣＡ１９－９　Ｈ７Ｄ１抗体のような抗原に対する親和性に有意差はなかった（図１２）。また、ランダムアミンカップリング法では、修飾する部位を選択できない。そのため、ランダムアミンカップリング法にて修飾したビオチンを介してストレプトアビジン被覆プレートやストレプトアビジン被覆ビーズなどの材料表面に結合する場合、抗体の配向を均一にすることが困難である。抗原に対する結合能を維持する抗体分子の数は、配向の低下により制限されると考えられる。一方、ＣＣＡＰ法によるビオチン修飾抗体の場合、ビオチンは部位特異的に修飾されるため、材料表面の結合配向を均一にすることができる。したがって、より多くの分子が抗原に対する結合能を維持できると考えられる。特に、ＲＰＬＡ法では、立体障害の観点から抗原に結合することで凝集反応に至るビーズの数が制限されると考えられる（図１０（ｃ））。
　以上のように、本発明の免疫測定方法を用いることにより、げっ歯類ＩｇＧに抗体の親和性を維持し、結合配向性を向上させることができ、その結果、免疫測定方法における高感度測定を実現することができる。本発明の免疫測定方法を用いれば、ヒトＩｇＧ、ウサギＩｇＧ等の他の宿主の抗体についても、げっ歯類ＩｇＧと同様に高感度測定を実現することができると考えられる。

Claims (45)

  1. 　ＩｇＧと機能性リガンドが結合したＩｇＧ結合ペプチドとの複合体を用いた免疫測定方法。
  2. 　前記機能性リガンドが、薬物、タンパク質、ペプチド、核酸、酵素、放射性標識物質、蛍光物質、検出基盤材料表面へ共有結合させる事が可能な官能基、前記官能基を有する化学架橋剤及びビオチンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 　第一の抗体のみを使用するワンサイトイムノアッセイである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　第一の抗体及び第二の抗体の２種の抗体を使用するツーサイトイムノアッセイである、請求項１又は２に記載の方法。
  5. 　第一の抗体及び第二の抗体並びに第三の抗体又はそれ以上の抗体を使用するマルチサイトイムノアッセイである、請求項１又は２に記載の方法。
  6. 　前記免疫測定方法がＥＬＩＳＡ法、イムノクロマトグラフィー法、免疫ラテックス凝集（ｌａｔｅｘ　ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ：ＬＡ）法、水晶振動子マイクロバランス（Ｑｕａｒｔｚ　Ｃｒｙｓｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ：ＱＣＭ）法、バイオレイヤー干渉（ＢｉｏＬａｙｅｒ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ：　ＢＬＩ）法及び表面プラズモン共鳴法からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　前記免疫測定方法がＥＬＩＳＡ法、イムノクロマトグラフィー法、免疫ラテックス凝集（ｌａｔｅｘ　ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ：ＬＡ）法、免疫比濁（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ　ｉｍｍｕｎｏ　ａｓｓａｙ　：ＴＩＡ）法、化学発光免疫測定（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＣＬＩＡ）法、パルスイムノアッセイ法、時間分解蛍光－蛍光共鳴エネルギー転移（ｔｉｍｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＴＲ－ＦＲＥＴ）法、水晶振動子マイクロバランス（Ｑｕａｒｔｚ　Ｃｒｙｓｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ：ＱＣＭ）法、バイオレイヤー干渉（ＢｉｏＬａｙｅｒ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ：　ＢＬＩ）法及び表面プラズモン共鳴法からなる群から選択される、請求項１、２及び４のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　前記免疫測定方法がＥＬＩＳＡ法、イムノクロマトグラフィー法、免疫ラテックス凝集（ｌａｔｅｘ　ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ：ＬＡ）法、免疫比濁（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ　ｉｍｍｕｎｏ　ａｓｓａｙ　：ＴＩＡ）法、化学発光免疫測定（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＣＬＩＡ）法、パルスイムノアッセイ法、時間分解蛍光－蛍光共鳴エネルギー転移（ｔｉｍｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＴＲ－ＦＲＥＴ）法、水晶振動子マイクロバランス（Ｑｕａｒｔｚ　Ｃｒｙｓｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ：ＱＣＭ）法、バイオレイヤー干渉（ＢｉｏＬａｙｅｒ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ：　ＢＬＩ）法及び表面プラズモン共鳴法からなる群から選択される、請求項１、２及び５のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　前記第一の抗体が、検出基盤材料表面へ直接的に、物理吸着によって、アンカータンパク質なしで、又はアンカータンパク質を介して結合した状態で捕捉抗体として使用される、請求項３～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　前記第一の抗体が、検出基盤材料表面へ直接的に結合しない状態でトレーサー抗体として使用される、請求項３～８のいずれか一項に記載の方法。
  11. 　前記第一の抗体と前記第二の抗体の両方が、検出基盤材料表面へ直接的に、物理吸着によって、アンカータンパク質なしで、又はアンカータンパク質を介して結合した状態で捕捉抗体として使用される、請求項４、５、７及び８のいずれか一項に記載の方法。
  12. 　前記第一の抗体と前記第二の抗体の両方が、検出基盤材料表面へ直接的に結合しない状態でトレーサー抗体として使用される、請求項４、５、７及び８のいずれか一項に記載の方法。
  13. 　前記第一の抗体が、検出基盤材料表面へ直接的に、物理吸着によって、アンカータンパク質なしで、又はアンカータンパク質を介して結合した状態の捕捉抗体として使用され、前記第二の抗体が検出基盤材料表面へ直接的に結合しない状態のトレーサー抗体として使用される、請求項４、５、７及び８のいずれか一項に記載の方法。
  14. 　前記第一の抗体と前記第二の抗体と前記第三の抗体又はそれ以上の抗体の全てが、検出基盤材料表面へ直接的に、物理吸着によって、アンカータンパク質なしで、又はアンカータンパク質を介して結合した状態で捕捉抗体として使用される、請求項５又は８に記載の方法。
  15. 　前記第一の抗体と前記第二の抗体と前記第三の抗体又はそれ以上の抗体の全てが、検出基盤材料表面へ直接的に結合しない状態でトレーサー抗体として使用される、請求項５又は８に記載の方法。
  16. 　前記第一の抗体、前記第二の抗体、前記第三の抗体又はそれ以上の抗体の何れか一種が検出基盤材料表面へ直接的に、物理吸着によって、アンカータンパク質なしで、又はアンカータンパク質を介してに結合した状態で捕捉抗体として使用され、且つそれ以外の抗体が検出基盤材料表面へ直接的に結合しない状態でトレーサー抗体として使用される、請求項５又は８に記載の方法。
  17. 　前記第一の抗体、前記第二の抗体、前記第三の抗体又はそれ以上の抗体の何れか一種が検出基盤材料表面へ直接的に結合しない状態でトレーサー抗体として使用され、且つそれ以外の抗体が検出基盤材料表面へ直接的に、物理吸着によって、アンカータンパク質なしで、又はアンカータンパク質を介して結合した状態で捕捉抗体として使用される、請求項５又は８に記載の方法。
  18. 　前記免疫測定方法がサンドイッチＥＬＩＳＡ法であり、前記複合体の機能性リガンドはビオチンであり、アビジン又はストレプトアビジンで被覆された固相に前記ビオチンを介して前記複合体が結合している、請求項１、２、４、５、７～１３，１６及び１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 　前記免疫測定方法がイムノクロマトグラフィー法である、請求項１～１４，１６及び１７のいずれか一項に記載の方法。
  20. 　前記免疫測定方法がラテックス凝集法である、請求項１～１４、１６及び１７のいずれか一項に記載の方法。
  21. 　前記免疫測定方法がラテックス凝集法であり、前記複合体の機能性リガンドはビオチンであり、アビジン又はストレプトアビジンが被覆されたラテックス表面に前記ビオチンを介して前記複合体が結合している、請求項１～１４、１６及び１７のいずれか一項に記載の方法。
  22. 　前記免疫測定方法が表面プラズモン共鳴法であり、前記複合体がセンサーチップに固定化されている、請求項１～３、６、９及び１０のいずれか一項に記載の方法。
  23. 　前記ＩｇＧ結合ペプチドが、配列番号１～９のいずれかのアミノ酸配列、又は、配列番号１～９のいずれかのアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたペプチドであってＩｇＧのＦｃ領域への結合能を有するペプチドを含むペプチドである、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 　ＩｇＧと機能性リガンドが結合したＩｇＧ結合ペプチドとの複合体を含む体外診断薬。
  25. 　前記ＩｇＧ結合ペプチドが、配列番号１～９のいずれかのアミノ酸配列、又は、配列番号１～９のいずれかのアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたペプチドであってＩｇＧのＦｃ領域への結合能を有するペプチドを含むペプチドである、請求項２４に記載の体外診断薬。
  26. 　請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法に使用する、標識抗体を保持する標識抗体保持部と捕捉抗体が固定されている検出領域を備え、前記標識抗体若しくは捕捉抗体又はその両方がＩｇＧと機能性リガンドが結合したＩｇＧ結合ペプチドとの複合体である、イムノクロマト試験片。
  27. 　前記ＩｇＧ結合ペプチドが、配列番号１～９のいずれかのアミノ酸配列、又は、配列番号１～９のいずれかのアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたペプチドであってＩｇＧのＦｃ領域への結合能を有するペプチドを含むペプチドである、請求項２６に記載のイムノクロマト試験片。
  28. 　ＩｇＧと機能性リガンドが結合したＩｇＧ結合ペプチドとの複合体が固定化された固相。
  29. 　前記複合体の前記機能性リガンドはビオチンであり、アビジン又はストレプトアビジンで被覆された固相に前記ビオチンを介して前記複合体が結合している、請求項２８に記載の固相。
  30. 　前記複合体の前記機能性リガンドは検出基盤材料表面へ共有結合させる事が可能な官能基、前記官能基を有する化学架橋剤であり、検出基盤材料表面に前記複合体がアンカータンパク質を介さずに共有結合している、請求項２８に記載の固相。
  31. 　ＩｇＧと機能性リガンドが結合したＩｇＧ結合ペプチドとの複合体が固定化されたラテックス粒子及び高分子材料からなる粒子を含む固相。
  32. 　前記複合体の前記機能性リガンドはビオチンであり、アビジン又はストレプトアビジンで被覆されたラテックスに前記ビオチンを介して前記複合体が結合している、請求項３１に記載の固相。
  33. 　前記複合体の機能性リガンドはラテックス材料表面へ共有結合させる事が可能な官能基、前記官能基を有する化学架橋剤であり、ラテックス表面に前記複合体がアンカータンパク質を介さずに共有結合している、請求項３１に記載の固相。
  34. 　ＩｇＧとＩｇＧ結合ペプチドとの複合体が結合した固相であって、前記ＩｇＧ結合ペプチドはアンカータンパク質と共有結合し、前記アンカータンパク質は固相表面に共有結合している、固相。
  35. 　前記固相がアミノ基と反応する官能基を介したＩｇＧ結合ペプチド複合体の固定化である、請求項２８～３４のいずれか一項に記載の固相。
  36. 　前記固相がスクシンイミド基と反応する官能基を介したＩｇＧ結合ペプチド複合体の固定化である、請求項２８～３４のいずれか一項に記載の固相。
  37. 　前記固相がチオール基と反応する官能基を介したＩｇＧ結合ペプチド複合体の固定化である、請求項２８～３４のいずれか一項に記載の固相。
  38. 　前記固相がマレイミド基と反応する官能基を介したＩｇＧ結合ペプチド複合体の固定化である、請求項２８～３４のいずれか一項に記載の固相。
  39. 　前記固相がカルボキシ基と反応する官能基を介したＩｇＧ結合ペプチド複合体の固定化である、請求項２８～３４のいずれか一項に記載の固相。
  40. 　前記固相がクリック反応により結合形成される官能基を介したＩｇＧ結合ペプチド複合体の固定化である、請求項２８～３４のいずれか一項に記載の固相。
  41. 　ＩｇＧとＩｇＧ結合ペプチドとの複合体が結合した固相であって、前記ＩｇＧ結合ペプチドはアンカータンパク質と物理吸着し、前記アンカータンパク質は固相表面に物理吸着している、固相。
  42. 　前記ＩｇＧ結合ペプチドが、配列番号１～９のいずれかのアミノ酸配列、又は、配列番号１～９のいずれかのアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたペプチドであってＩｇＧのＦｃ領域への結合能を有するペプチドを含むペプチドである、請求項２８～４１のいずれか一項に記載の固相。
  43. 　固相にアンカータンパク質を共有結合させる工程と、ＩｇＧとＩｇＧ結合ペプチドとの複合体を固相に結合したアンカータンパク質に共有結合させる工程とを備える請求項３４～４０のいずれか一項に記載の固相を製造する方法。
  44. 　固相にアンカータンパク質を物理吸着させる工程と、ＩｇＧとＩｇＧ結合ペプチドとの複合体を固相に結合したアンカータンパク質に物理吸着させる工程とを備える請求項４１に記載の固相を製造する方法。
  45. 　前記ＩｇＧ結合ペプチドが、配列番号１～９のいずれかのアミノ酸配列、又は、配列番号１～９のいずれかのアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたペプチドであってＩｇＧのＦｃ領域への結合能を有するペプチドを含むペプチドである、請求項４３又は４４に記載の方法。

     
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