CN112500456B - 一种去势ap205病毒样颗粒亚单位疫苗 - Google Patents

一种去势ap205病毒样颗粒亚单位疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，公开了一种GNRH‑I‑AP205病毒样颗粒亚单位疫苗，本发明提供了一种重组大肠杆菌表达的GNRH‑I‑AP205蛋白，该蛋白系将GNRH‑I10肽及AP205噬菌体衣壳基因克隆入原核表达载体得到重组表达载体，将该重组表达载体转染大肠杆菌BL21(DE3)，经该重组大肠杆菌BL21(DE3)表达获得。试验证明，本发明构建的重组菌株对外源蛋白表达稳定。使用本发明表达的重组蛋白制备亚单位疫苗，抗原纯度高，安全性好，且对小鼠等动物没有致病性，容易通过安全性评价。

Description

一种去势AP205病毒样颗粒亚单位疫苗
技术领域
本发明涉及分子生物学、病毒学、免疫学和医学领域。本发明提供了一种重组大肠杆菌表达的GNRH-I-AP205蛋白、重组质粒GNRH-I-AP205-pET28a、重组大肠杆菌GNRH-I-AP205-pET28a-BL21、重组大肠杆菌表达的GNRH-I-AP205病毒样颗粒的制备方法及GNRH-I-AP205病毒样颗粒亚单位疫苗。
背景技术
1971年,Baba等耶Amoss等分别在猪和绵羊的下丘脑中发现GnRH-I并确定其分子结构,由于其具有促进垂体释放促黄体素(luteinizing hormone,LH)的功能,因此被命名为促黄体激素释放激素(luteinizing hormone releasing Hormone,LHRH)。后来研究发现这种激素也能促进垂体释放促卵泡素(foUicle stimulate hormone,FSH),所以又称为促卵泡激素释放激素(follicle stimuating hormone-releasing hormone,FSHRH)。人们总称为促性腺激素择放激素(gonadotropin releasing hormone I,GnRH-I)。
自20世纪70年代发现GnRH-I并确定其分子结构来,至今己发现GnRH-I家族至少有24个家族,而且GnRH-I的氨基酸序列在所有哺乳动物间高度保守。其氨基酸序列为焦谷氨酸(PGlu)—组氨酸(His)—色氨酸(Trp)—丝氨酸(Ser)—酪氨酸(Tyr)—甘氨酸(Gly)—亮氨酸(Leu)—精氨酸(Arg)—脯氨酸(Pro)—甘酰胺(Gly-NH2),分子量为1.181KDW。
生理剂量的GnRH-I可促使促性腺激素浓度升高(如FSH轻度升高和LH明显升高),促进性腺激素(如雌二醇、孕酮及睾酮等)的合成分泌,促使卵泡发育成熟而排卵或睾丸发育和精子成熟,发生并维持第二性征。另外,GnRH-I还可以直接影响性腺,调节性腺类固醇激素的合成分泌,促进配子形成，已经报道了针对源自GnRH的抗原的免疫。
自身抗原蛋白通常难以诱导针对自身抗原的抗体应答。提高疫苗接种效率的一种方法是提高所应用抗原的重复性。与分离的蛋白质不同，病毒在没有任何佐剂的情况下及在有和没有T细胞帮助的情况下都能诱导迅速有效的免疫反应(Bachmann和Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol：15：235-270(1991))。与少数几种蛋白质相比，它们能够触发比其分离成分强得多的免疫反应。对于B细胞反应，众所周知，病毒免疫原性的一个关键因素是表面表位的重复性和顺序。许多病毒表现出准晶体表面，该表面具有规则排列的表位，可以有效地交联B细胞上的表位特异性免疫球蛋白(Bachxnann和Zinkernagel，Immunol。Today 17：553-558(1996))。B细胞表面免疫球蛋白的这种交联是一个强激活信号，直接诱导细胞周期进程和IgM的产生抗体。此外，这种触发的B细胞能够激活T辅助细胞，进而诱导B细胞中IgM抗体向IgG抗体的转换以及任何疫苗接种的长寿B细胞记忆目标的产生(Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol.15：235-270(1997))。病毒结构甚至与自身免疫性疾病中抗体的产生有关，并且是对病原体的自然应答的一部分(参见Fehr，T.，等人，J.Exp.Med.185：1785-1792(1997))。因此，由高度组织化的病毒表面呈递的抗原能够诱导针对抗原的强抗体应答。
AP205是一种RNA噬菌体的主要衣壳蛋白，180个AP205单体可以自行组装成一类新的具有高度免疫原性的病毒样颗粒(VLP),这些VLP不含有噬菌体RNA基因组而不能复制。但是多种多肽能够与AP205外壳蛋白的N-或C-末端融合，而得到的融合蛋白在大肠杆菌中表达时形成病毒样颗粒。此外，还发现如果多肽包含至少一种抗原，该抗原或该抗原的至少一个抗原性位点展示在装配的VLP的外表面上，组装形成的VLP后可有效提高目的抗原的免疫原性，可以在VLP表面展示短线性肽、肽环和全长蛋白，甚至多糖和半抗原等非蛋白形式的抗原。瑞士Cytos生物制药公司将尼古丁共价偶联与噬菌体AP205(VLP)表面，制备戒烟疫苗，Ⅰ/Ⅱ期临床评估结果表明，尼古丁-AP205病毒样颗粒可以诱导高滴度尼古丁特异性抗体。并且单独的病毒样颗粒可以在大肠杆菌中稳定表达，提高了产量的同时降低了成本。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提供一种去势AP205病毒样颗粒亚单位疫苗，易于通过菌体培养获得，表达产量高，便于工业化生产,免疫原性强、免疫反应快。
本发明提供一种重组大肠杆菌表达的GNRH-I-AP205蛋白，该GNRH-I-AP205蛋白通过将GNRH-I10肽及AP205噬菌体衣壳基因克隆入原核表达载体得到重组表达载体，将所述重组表达载体转染大肠杆菌BL21(DE3)，经所述转染大肠杆菌BL21(DE3)表达获得；所述的GNRH-I-AP205的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
本发明提供一种重组质粒GNRH-I-AP205-pET28a，该重组质粒GNRH-I-AP205-pET28a通过将SEQ ID NO.2所示的核苷酸通过同源重组方法克隆入原核表达载体pET28a的NdeI位点和BamhI位点所得。
本发明提供一种重组大肠杆菌GNRH-I-AP205-pET28a-BL21，含有上述的重组质粒。
本发明还提供一种重组大肠杆菌表达GNRH-I-AP205病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)将GNRH-I的10肽基因通过G4S linker与AP205基因串联直接合成片段克隆入pET28a原核表达载体中获得阳性重组质粒GNRH-I-AP205-pET28a；
(2)将步骤(1)经序列测定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组表达菌株GNRH-I-AP205-pET28a-BL21；
(3)培养步骤(2)的重组表达菌株GNRH-I-AP205-pET28a-BL21，加入IPTG进行诱导表达，获得GNRH-I-AP205重组蛋白。
作为重组大肠杆菌表达GNRH-I-AP205病毒样颗粒的制备方法的优选方案，所述的原核表达载体为pET28a。
作为重组大肠杆菌表达GNRH-I-AP205病毒样颗粒的制备方法的优选方案，所述的重组表达菌株GNRH-I-AP205-pET28a-BL21培养至OD600达0.6-0.8时加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达。
本发明又提供一种GNRH-I-AP205病毒样颗粒亚单位疫苗，包含上述的重组大肠杆菌表达的GNRH-I-AP205病毒样颗粒及氢氧化铝佐剂。
作为GNRH-I-AP205病毒样颗粒亚单位疫苗的优选方案，用于生产疫苗。
本发明的有益效果如下：
第一、AP205来源于一种侵染不动杆菌的噬菌体，为噬菌体衣壳蛋白具有自组装成纳米颗粒的功能，不具有感染性，具有强烈抗原免疫性，且是申请人的VLP筛选平台独有的技术；
第二、通过与AP205病毒样颗粒偶联的抗原，显示出高强度的抗原性，可以在小鼠、大鼠、猫、狗和马中诱导高水平的特异性抗体，体液免疫反应快；
第三、本发明GNRH-I-AP205病毒样颗粒可由大肠杆菌大量表达，生产工艺简单，GNRH-I-AP205病毒样颗粒纯度高；
第四、适用于产业化，本发明选择的大肠杆菌重组表达菌株具有生长快、易于培养、遗传操作简单、繁殖速度快，对培养条件要求低，培养基廉价，能进行高密度培养，且能耐受较高的液体静压，便于工业化生产等特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明实施例中提供的GNRH-I-AP205基因与pET28a质粒连接后重组质粒示意图；
图2为本发明实施例中提供的GNRH-I-AP205病毒样颗粒蛋白SDS-PAGE跑胶示意图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明实施例中所采用的酶切、同源重组连接等分子生物学实验方法可参考《分子克隆》第二版。制备本发明GNRH-I-AP205病毒样颗粒的基础材料包括：AP205蛋白核苷酸序列、GNRH-I核苷酸序列、pET28a质粒、BL21(DE3)大肠杆菌菌株、天根质粒小提中量试剂盒、LB培养基、IPTG、卡那霉素、镍柱和咪唑等。将核苷酸序列发到华大基因公司合成GNRH-I-AP205-pET28a重组质粒。
实施例1
参见图1和图2，提供一种GNRH-I-AP205病毒样颗粒制备方法
上述噬菌体GNRH-I-AP205病毒样颗粒制备方法，包括以下步骤：
(1)重组质粒的构建：将GNRH-I-AP205基因直接让华大基因公司合成到pET28a载体NdeI酶切位点及XhoI酶切位点得到重组质粒GNRH-I-AP205-pET28a；
(2)重组质粒转入表达菌株：将所述重组质粒GNRH-I-AP205-pET28a转入大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株，得到GNRH-I-AP205-pET28a-BL21重组表达菌株；
(3)菌体培养及GNRH-I-AP205病毒样颗粒纯化：培养所述GNRH-I-AP205-pET28a-BL21重组表达菌株，IPTG诱导表达获得GNRH-I-AP205病毒样颗粒。
具体的，GNRH-I-AP205病毒样颗粒表达纯化步骤如下：
(a1)GNRH-I-AP205-pET28a重组质粒制备
将含有质粒的甘油菌用移液枪吸取5ul接种到5mL的2YT培养基(含50ug/ml卡那霉素)，37℃震荡培养14-16小时，培养后取1mL菌液送测序。剩余菌液用质粒小提取试剂盒提取质粒，蛋白核酸检测仪检测核酸浓度。
(a2)GNRH-I-AP205病毒样颗粒表达
转化BL21(DE3)表达菌株，摇菌后离心浓缩，涂布卡那霉素抗性平板，37℃过夜培养，刮取菌落，接种10mL含氨苄青霉素的2×YT培养基，37℃180r摇菌至菌液OD值0.8左右。将其转接到500mL含氨苄青霉素的2×YT培养基中，37℃180r摇菌至菌液OD值0.8左右。加入终浓度为0.8mMIPTG诱导剂，30℃过夜表达。第三天4500rpm，15min离心收集菌体。超声破碎菌体45min，3s开，4s关，功率125w。超声结束后，9500rpm，20min，4℃收集上清液。
(a3)GNRH-I-AP205病毒样颗粒纯化
离心上清液，过镍柱纯化，镍柱PBS平衡5柱体积。上样，PBS洗杂5柱体积，25Mm咪唑洗2柱体积，后再用25Mm咪唑洗5柱体积。之后连续用50、100、150、200、250Mm咪唑洗脱5柱体积。收集从上样到500mM咪唑的流出液。
从各收集液中吸取10uL加入10uL 2×蛋白电泳loading buffer后100℃加热4min。之后蛋白电泳，染色观察目的条带所在收集液浓度。将目的蛋白使用3kDa超滤管进行超滤，置换成PBS溶剂。
实施例2
GNRH-I-AP205病毒样颗粒亚单位疫苗免疫方法
如实施例1所述，将GNRH-I-AP205病毒样颗粒与氢氧化铝佐剂混合用于免疫。在第0天，第14天，第28天，用50ug GNRH-I-AP205病毒样颗粒疫苗免疫八周大的雄性C57BV/6小鼠(每组五只小鼠)，同时设置GNRH-I-AP205不加佐剂组、佐剂pbs阴性组、单纯AP205实验组及单纯GNRH-I实验组。测量这些小鼠的抗GNRH-I重组蛋白抗体滴度和睾丸激素水平。在免疫后第70天，处死小鼠并测定睾丸重量。
实施例3
小鼠抗GNRH-I抗体滴度测定
在实验过程中的不同时间点，从免疫小鼠和对照小鼠中收集血清。抗GNRH-I IgG抗体滴定度通过ELISA测定如下。用2ug/ml的GnRH-I-BSA 4摄氏度包被96孔板过夜，每孔100ul，次日用1/1000PBST洗板5次，加入300ul 2％BSA封闭板，37℃封闭2h，之后用1/1000PBST洗板5次，将小鼠血清按照1：500为初始两倍为梯度进行稀释，1：1000，1：2000，1：4000，1：8000，1：16000，1：32000，1：64000，1：128000，1：256000进行稀释，稀释液用2％BSA。从高稀释度到低稀释度，每孔100ul，室温振荡孵育45min。用1/1000PBST洗板5次。使用HRP标记的羊抗鼠多抗作为二抗，稀释度1：5000，稀释液用1％脱脂奶粉，每孔100ul，室温振荡孵育45min。TMB显色5-10min，2M硫酸终止，450nm波长直接读数。光密度(OD)在450nm ELISA读数器(BioRad Benchmark)测定。使用这些数据计算得出最大OD450血清稀释度。
表1显示，在用GNRH-I-AP205病毒样颗粒未加佐剂组免疫雄性小鼠中，在第28天平均滴度达到8000，并且在第3针加强后平均滴度仍维持16000之后维持在16000。GNRH-I-AP205病毒样颗粒佐剂组的平均滴度在第28天已经达到64000滴度，之后在第3针后滴度维持在128000水平。而单纯GNRH-I免疫组效价28天仅有1000水平，这些结果清楚地表明GNRH-I-AP205病毒样颗粒能够诱导高抗GNRH的抗体滴度，且加了佐剂免疫效果更好。
表1
Figure BDA0002811970310000081
小鼠血清中的睾丸激素水平
在上述实验期间的各个时间点，从免疫小鼠和对照小鼠收集血清。使用睾丸激素-Elisa(IBL，德国汉堡)测定小鼠血清中的睾丸激素水平。
表2显示在用GNRH-I-AP205病毒样颗粒不加氢氧化铝佐剂免疫的小鼠中，在免疫后第47天平均睾丸激素水平被大大抑制(<2ng/ml)，在第70天水平仍低于2ng/ml。在GNRH-I-AP205补充氢氧化铝免疫的小鼠中，平均睾丸激素水平在第28天下降到<2ng/ml。与对照组GNRH-I+氢氧化铝免疫小鼠组中枢神经系统的激素平均水平低约38倍。这清楚地证明了诱导的抗体反应的中和活性。
表2
Figure BDA0002811970310000091
睾丸重量
在第70天处死小鼠，除去睾丸并称重，然后固定在4％甲醛中。
表3显示了在第70天经GnRH-I免疫的小鼠的睾丸重量未降低，与对照组相比，接受GNRH-I-AP205病毒样颗粒和氢氧化铝佐剂的小鼠的睾丸重量减少了77％，这清楚地表明了诱导的抗体反应的中和活性。
表3
Figure BDA0002811970310000092
序列：
SEQ ID NO.1：
MEHWSYGLRPGGGGGSMANKPMQPITSTANKIVWSDPTRLSTTFSASLLRQRVKVGIAELNNVSGQYVSVYKRPAPKPEGCADACVIMPNENQSIRTVISGSAENLATLKAEWETHKRNVDTLFASGNAGLGFLDPTAAIVSSDTTALEHHHHHH*
SEQ ID NO.2：
ATGGAACACTGGAGCTACGGTTTGAGACCCGGGgggggcgggGGATCCatggcaaataagccaatgcaaccgatcacatctacagcaaataaaattgtgtggagtgatccaactcgtttatcaactacattttcagcaagtctgttacgccaacgtgttaaagttggtatagccgaactgaataatgtttcaggtcaatatgtatctgtttataagcgtcctgcacctaaaccggaaggttgtgcagatgcctgtgtcattatgccgaatgaaaaccaatccattcgcacagtgatttcagggtcagccgaaaacttggctaccttaaaagcagaatgggaaactcacaaacgtaacgttgacacactcttcgcgagcggcaacgccggtttgggtttccttgaccctactgcggctatcgtatcgtctgatactactgctCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA

Claims (4)

1.一种GNRH-I-AP205病毒样颗粒亚单位疫苗，其特征在于，包含重组大肠杆菌表达的GNRH-I-AP205病毒样颗粒及氢氧化铝佐剂；
其中，重组大肠杆菌表达GNRH-I-AP205病毒样颗粒通过以下方法制备得到：
(1)将GNRH-I的10肽基因通过G4S linker与AP205基因串联直接合成片段克隆入pET28a原核表达载体NdeI酶切位点及XhoI酶切位点中获得阳性重组质粒GNRH-I-AP205-pET28a；
(2)将步骤(1)经序列测定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组表达菌株GNRH-I-AP205-pET28a-BL21；
(3)培养步骤(2)的重组表达菌株GNRH-I-AP205-pET28a-BL21，加入IPTG进行诱导表达，获得GNRH-I-AP205病毒样颗粒；
所述的GNRH-I-AP205的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
2.根据权利要求1所述的GNRH-I-AP205病毒样颗粒亚单位疫苗，其特征在于，所述的原核表达载体为pET28a。
3.根据权利要求1所述的GNRH-I-AP205病毒样颗粒亚单位疫苗，其特征在于，所述的重组表达菌株GNRH-I-AP205-pET28a-BL21培养至OD600达0.6-0.8时加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达。
4.根据权利要求1所述的一种GNRH-I-AP205病毒样颗粒亚单位疫苗，其特征在于，用于生产疫苗。
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