CZ35138U1 - ransportní médium pro transport a skladování virů - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládané technické řešení se týká transportního média pro transport a skladování virů, a zejména například viru SARS CoV-2.

Dosavadní stav techniky

V současné době se k vyšetření přítomnosti SARS-CoV-2 viru (SARS, Wuhan 2019 CoV pneumonia vim) a dalších virů napadajících respirační trakt používají nasofaryngeální nebo orofaryngeální výtěry. Stěr se provádí syntetickým tamponem, který se následně vloží do zkumavky s transportním médiem. Obdobně se transportní médium používá i pro transport vzorků odebraných z jiných tkání určených pro diagnostiku virů. Transportní médium se používá i pro transport vzorků určených pro diagnostiku jiných patogenů, nebo i vzorků určených pro detekci DNA, RNA či proteinů pacienta. Takto transportované a skladované vzorky se používají k izolaci nukleových kyselin a následné detekci (např. detekci virů či jiných patogenů) pomocí amplifikace nukleových kyselin (například PCR či LAMP metodami).

Používaným transportním médiem je tzv. transportní virologické médium (VTM, viral transport medium), které obsahuje fetální bovinní sérum a popřípadě i sérový albumin, a dále antibiotika a antimykotika. Typické složení VTM je například: 2% fetální bovinní sérum (FBS), 100 pg/ml gentamycin nebo jiné antibiotikum; 0,5 pg/ml amphotericin B nebo jiné antibiotikum, Hank’s balanced salt solution (HBSS). Složení transportního virologického média není chemicky definovatelné a reprodukovatelné. Fetální bovinní sérum je směs obsahující tisíce proteinů, která se získává z nenarozených telat. Jedná se tedy o produkt s proměnlivým složením, který navíc může obsahovat inhibitory polymerace anebo reverzní transkripce, což dále snižuje reprodukovatelnost jakýchkoliv amplifikačních testů prováděných s nukleovými kyselinami ve vzorcích skladovaných či transportovaných ve VTM. Použití FBS navíc značně komplikuje či přímo znemožňuje stanovení proteinů v transportovaných či skladovaných vzorcích, neboť je obtížné je odlišit od proměnlivých zastoupení proteinů vyskytujících se v FBS. Dále již samotný způsob získávání fetálního bovinního séra je považovaný za problematický z etického hlediska a vyžaduje použití zvířat, je tedy žádoucí jej nahrazovat jinými produkty, kdekoliv je to možné.

Biologické vzorky odebrané do VTM jsou podle údajů výrobců i podle zkušeností původců předkládaného technického řešení stabilní při teplotě 4 °C po dobu až 5 dní, v některých případech až 7 dní, jejich zpracování se však doporučuje nanejvýš do 3 dnů od odběru. Transport vzorků ve VTM také může probíhat v zamraženém stavu, ve kterém jsou patogeny stabilní až 6 měsíců.

Předkládané technické řešení si klade za cíl vyvinout dobře chemicky definované a dobře reprodukovatelné transportní médium pro transport a skladování vzorků virů. Dále má toto médium být zejména vhodné pro transport a skladování vzorků získaných samoodběrem kloktáním.

Podstata technického řešení

Předmětem předkládaného technického řešení je transportní médium, které obsahuje pufrovací roztok, alespoň jedno antibiotikum, alespoň jedno antimykotikum, a polymer, kterým je dextran nebo polyvinylpyrrolidon nebo jejich směs.

V rámci vývoje nového transportního média bylo zjištěno, že proteiny fetálního bovinního séra lze nahradit některými polymery. Polymery musí zajistit vhodný onkotický tlak, a musí být rovněž zajištěna správná rovnováha onkotického a osmotického tlaku pro stabilizaci virů a dalších

-1 CZ 35138 UI patogenů, ale i somatických buněk v médiu. Kombinace těchto parametrů vytvoří prostředí obdobné prostředí organismu, v němž je vzorek stabilní.

Nahrazením proteinů vhodnými neproteinovými polymery se odstraní problémy s přítomností proteinů, zejména s přítomností špatně definovaných směsí proteinů. V médiu tak nejsou přítomny degradační enzymy, které by mohly virus či jiný vzorek rozložit, zničit, nebo které by mohly inhibovat polymeraci, amplifikaci nebo například reverzní transkripci v dalších krocích diagnostického či identifikačního postupu. Rovněž lze u vzorku transportovaného nebo skladovaného v takovémto médiu bez problémů detekovat či stanovovat proteiny. Médium má jednoznačně chemicky definované složení, je opakovaně připravitelné se stabilním a opakovatelným přesným složením, a to vede k lepší reprodukovatelnosti a menší chybovosti veškerých navazujících metod.

Oproti standardnímu VTM není v transportním médiu podle předkládaného technického řešení zapotřebí používat fetální bovinní sérum (FBS) nebo sérový albumin, jejich funkce je plně nahrazena syntetickými nebo rekombinantními polymery. To odstraňuje i etické problémy spojené s používáním FBS, a zároveň odstraňuje potřebu využívání živých zvířat, což jev souladu s principy tzv. 3Rs - nahrazování (replacement) živých zvířat, snížení (redukce) množství využívaných zvířat, zlepšení (refinement) metod tak, aby způsobovala zvířatům co nejnižší míru bolesti či stresu. Zde se tedy jedná o úplné nahrazení produktu, jehož výroba zahrnuje využití zvířat.

Dextran a polyvinylpyrrolidon jsou polymery schválené pro farmaceutické použití jako pomocné látky. Případný kontakt média s organismem pacienta tak není rizikový a polymery jsou organismy dobře snášeny.

Navíc bylo v rámci předkládaného technického řešení zjištěno, že dextran a polyvinylpyrrolidon stabilizují odebraný virový materiál i za teploty místnosti, a zároveň neinhibují amplifikaci nukleových kyselin metodou PCR, ani metodou LAMP. Stabilizace za teploty místnosti je podstatnou výhodou proti standardnímu VTM.

Množství polymeru v transportním médiu může být s výhodou v rozmezí 0,05 až 5 % hmoto., výhodněji 0,1 až 2 % hmota., ještě výhodněji 0,1 až 1 % hmota.

Relativní molekulová hmotnost polymerů by měla být alespoň 10 000, například v rozmezí 10 000 až 100 000, výhodněji 10 000 až 70 000. Při relativní molekulové hmotnosti polymerů pod 10 000 už nemusí docházet k vytvoření potřebného onkotického tlaku. Horní hranice relativní molekulové hmotnosti polymerů nemá technické omezení.

Pufrovacím roztokem v transportním médiu podle technického řešení může být v některých provedeních pufrovaný fýziologický roztok (PBS, phosphate buffered saline) nebo Hanksův vyvážený solný roztok (HBSS, Hanks' balanced salt solution). Obecněji je pufrovacím roztokem pufrovaný fyziologický roztok.

V transportním médiu podle technického řešení lze používat antibiotika a antimykotika, která se používají ve standardním VTM. Nejčastěji používanými antibiotiky ve VTM jsou gentamycin, penicilín či streptomycin, ale lze použít i jiná antibiotika. Nejčastěji používaným antimykotikem ve VTM je amphotericin B, ale lze použít i jiná antimykotika. Antibiotikum může být s výhodou přítomno v množství 50 až 200 pg/ml. Antimykotikum může být s výhodou přítomno v množství 0,1 až 2 pg/ml.

V některých provedeních transportní médium podle technického řešení dále obsahuje sérový albumin. S výhodou může médium obsahovat 0,05 až 2 % hmota, sérového albuminu, výhodněji 0,1 až 0,5 % hmota, sérového albuminu. Sérové albuminy lze připravit rekombinantními nebo

- 2 CZ 35138 UI purifikačními procesy. V některých provedeních se použije bovinní sérový albumin (BSA) nebo lidský sérový albumin.

Sérový albumin je čistý, jednoznačně definovaný protein. Lze jej vyrábět rekombinantně, např. v kvasinkových kulturách, není potřeba jej získávat ze zvířat nebo lidí. Albumin v médiu podle technického řešení zvyšuje onkotický tlak, lze jej tedy použít pro optimalizaci parametrů média, je-li to potřeba. Sérový albumin v uvedených koncentracích neinhibuje amplifikaci či jiné kroky následných identifikačních či diagnostických metod.

Médium podle předkládaného technického řešení může být v kapalné formě nebo v lyofilizované pevné formě. Lyofilizovaná pevná forma se získá lyofilizací (mrazovým sušením) kapalné formy média.

Médium podle překládaného technického řešení je dobře chemicky definované, neobsahuje směs bílkovin. Toto médium má stabilizační funkci i při skladování vzorků za teploty místnosti. Zároveň dovoluje bezproblémovou následnou detekci nukleových kyselin pomocí technik založených na amplifikaci nukleových kyselin, kvalitativních i kvantitativních, včetně jejich modifikací v reálném čase. Dovoluje i bezproblémovou detekci proteinů.

Výše popsané médium lze zejména použít pro transport a skladování vzorků obsahujících viry. S výhodou se jedná o vzorky odebrané pacientovi kloktáním vody, tzv. vzorky kloktacích samoodběrů.

Médium je, obdobně jako standardní VTM, vhodné pro transport a skladování virů, a to jak DNA virů, tak RNA virů. Zejména může být virem virus SARS-CoV-2, HPV a další viry způsobující onemocnění u člověka nebo zvířat, jako jsou viry hepatitidy, chřipky, koronaviry, viry klíšťové encefalitidy, neštovic, mononukleózy, HIV, apod. Médium je dále vhodné pro transport a skladování jiných patogenů vyšetřitelných technikou PCR, například mycoplasmy, chlamydie, apod.

Příklady uskutečnění technického řešení

Příklad 1: Výběr polymerů

S ohledem na možnost kontaktu pacienta se složkami média byly testovány zejména polymery, které j sou využívány ve farmaceutických formulacích, a j sou tedy spolehlivě zdravotně nezávadné. Jednotlivé polymery byly testovány na inhibici amplifikace metodou LAMP a PCR. Pro testování byly použity komerční kity AUMED test RT-LAMP Assay SARS-CoV-2 od společnosti AUMED, a.s., Praha, Česká republika, Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real Time Multiplex RT-OCR Kit (Detection 3 genes) od společnosti Liferiver, Shanghai Z J Bio-Tech Co.), dále bylo postupováno podle instrukcí výrobce. Amplifikovaným vzorkem byla nukleová kyselina viru SARS-CoV-2.

Výsledky tohoto testování uvádí Tabulka 1, z níž je zřejmé, že pouze polymery dextran a polyvinylpyrrolidon neinhibovaly amplifikaci metodou LAMP.

Tabulka 1. Test inhibice LAMP kandidátními polymery*

Polymer	SARS ředění 105/ 10-2 / 0	Koncentrace
SoluPlus (kopolymer polyvinylkaprolaktamupolyvinyl acetátu-polyethylenglykolu)	+ /0/0	1,00 % hmotn.
Lutrol F 68 (blokový kopolymer polyoxyethylenu a polyoxypropylenu)	++ / 0 / 0	1,00 % hmotn.
Kollidon 17 PF (polyvinylpyrrolidon)	++ /++ / 0	1,00 % hmotn.

-3CZ 35138 UI

Kolliphor RH40 (polyoxylovaný ricinový olej)	++ / 0 / 0	1,00 % hmota.
Dextran (MW 40000)	++ / + / 0	1,00 % hmota.
Polyvinylpyrrolidon (MW 40000)	++ / + / 0	1,00 % hmota.
Polyethylenglykol (MW 6000)	+ /0/0	1 μΜ
PCR voda	+ /0/0
Fosfátový pufir (PBS)	+ /0/0

++- vysoce pozitivní, +- slabě pozitivní, 0- negativní;

*- PCR reakce testovanými polymery inhibovaná nebyla.

Příklad 2: Příprava médií pro testování

Kpufrovánému fýziologickému roztoku (PBS) byl přidán zásobní roztok gentamycinu na finální koncentraci 100 pg/ml gentamycinu, zásobní roztok amphotericinu B na finální koncentraci 0,5 pg/ml amphotericinu B, a dále polymer (dextran nebo polyvinylpyrrolidon, relativní molekulová hmotnost 40 000) v množství uvedeném v jednotlivých testech (typicky na finální koncentraci 0,1 % hmota., 0,5 % hmota., nebo 1 % hmota.). Média byla přímo použita nebo skladována za teploty místnosti.

Příklad 3: Testování stability SARS-CoV-2 v médiích

V tomto experimentu byla testována stabilita SARS-CoV-2 v médiích podle technického řešení, ve srovnání se standardním transportním virologickým médiem. Média podle technického řešení obsahovala 0,1 % hmota. 0,5 % hmota, nebo 1 % hmota, polymeru, kterým byl PVP40 nebo dextran.

Stabilita byla testována při teplotě místnosti (24 až 27 °C) a při 4 °C po dobu 15 dní. V den 0 bylo do každého testovaného média inokulováno 6223 PFU/ml a 62,23 PFU/ml viru SARS-CoV-2. (PFU = plaque forming units, plaky tvořící jednotky). Z každé alternativy média byl za daných podmínek testován pouze jeden replikát.

Izolace nukleových kyselin byla provedena pomocí kitu RNA-VIRAL-PREP-96 (Palacky University Olomouc, IMTM) nebo VIRAL-RNA-Prep (ITA-Intertact). K detekci koronavirů jsme použili Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real Time Multiplex RT-PCR Kit (Liferiver, Shanghai ZJ Bio-Tech Co.). Test detekuje 3 geny, a to ORF1, gen N, gen E. Dále byla detekována interní kontrola (IC). Při izolaci i detekci bylo postupováno podle instrukcí výrobce. Testy byly provedeny i s negativní a pozitivní kontrolou, byly použity kontroly z uvedeného komerčního kitu.

Výsledky jsou uvedeny níže v Tabulce 2, uvedené hodnoty jsou v jednotkách Ct. Je zřejmé, že transportní médium podle technického řešení stabilizovalo virus po dobu 2 týdnů, a to i při teplotě místnosti nebo teplotě 37 °C.

Příklad 4: Testování stability SARS-CoV-2 v médiích

V tomto experimentu byla testována stabilita SARS-CoV-2 v médiích podle technického řešení, ve srovnání se standardním transportním virologickým médiem. Pro toto testování byla vybrána média s 0,5% dextranem a 0,5% dextranem s 0,25% BSA (bovinní sérový albumin). Stabilita byla testována při 4 °C, teplotě místnosti (24 až 27 °C) a 37 °C po dobu 15 dní. V den 0 bylo do každého testovaného média inokulováno 62,23 PFU/ml SARS-CoV-2. Z každé alternativy média byly za daných podmínek testovány tři replikáty.

Izolace nukleových kyselin byla provedena pomocí kitu RNA-VIRAL-PREP-96 (Palacky University Olomouc, IMTM) nebo VIRAL-RNA-Prep (ITA-Intertact). K detekci koronavirů jsme

-4CZ 35138 UI použili Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real Time Multiplex RT-PCR Kit (Liferiver, Shanghai ZJ Bio-Tech Co.). Test detekuje 3 geny, a to ORF1, gen N, gen E. Dále byla detekována interní kontrola (IC). Při izolaci i detekci bylo postupováno podle instrukcí výrobce.

Výsledky jsou uvedeny níže v Tabulce 3, uvedené hodnoty jsou v jednotkách Ct. Je zřejmé, že transportní médium podle technického řešení stabilizovalo virus po dobu 2 týdnů, a to i při teplotě místnosti.

Příklad 5: Testování stability vzorků z kloktacích testů s SARS-CoV-2 v médiích

Pro konečné ověření stability vzorku odebraného do média obsahujícího 0,5% dextran byl testován simulovaný vzorek. Po kloktání 10 až 20 ml pitné vody po dobu 10 až 30 s byl obsah vyplivnut do odběrové nádobky s lyofilizo váným médiem a po uzavření důkladně protřepán. Po přidání 10 až 20 ml kloktání by měl vzorek v odběrové nádobce obsahovat přibližně stejné množství složek média jako při předchozích stabilitních testech. Simulovaný vzorek vznikl smícháním vzorku kloktání od tří jedinců. Stabilita byla testována při 4 °C, teplotě místnosti (24 až 27 °C) a 37 °C po dobu 15 dní. V den 0 bylo do každého testovaného média inokulováno 62,23 PFU/ml SARS-CoV2. Z každé alternativy média byly za daných podmínek testovány tři replikáty.

Izolace nukleových kyselin byla provedena pomocí RNA-VIRAL-PREP-96 (Palacky University Olomouc, IMTM) nebo VIRAL-RNA-Prep (ITA-Intertact). K detekci koronavirů jsme použili Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real Time Multiplex RT-PCR Kit (Liferiver, Shanghai ZJ BioTech Co.). Test detekuje 3 geny, a to ORF1, gen N, gen E. Dále byla detekována interní kontrola (IC). Při izolaci i detekci bylo postupováno podle instrukcí výrobce.

Byla prokázána stabilita SARS-CoV-2 pro jeho následnou detekci pomocí real-time PCR v čistém médiu obsahujícím 0,5% dextran i v simulovaném reálném vzorku. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 4, uvedené hodnoty jsou v jednotkách Ct.

-5CZ 35138 UI

O

Φ

Os o?

<x;

ci :X>

«>

CJ <χϊ

-6CZ 35138 UI

-7 CZ 35138 UI

O.

e-

Ol

<A

»c>

04

iO>

Ό

NO

0·

00

v%

NO

io,

so

t··-

’0\

NO

f X

r-

so

4-.

Is-

Is

00

vCj

>X>

00

S’V

w

ύθ

<5

<*>

so

'-O

co-

CO

<^

’X>

r*

oi

oí

ci

04

ό$

ON

O|

Cl

CN

Cl

CN

O:l

04

V'·'

w;

NO

NO

04

O'

CO

Ό

U-

CO

’□

NO’'

$3

04

s<>

o

so

i*

O·

CO

0

O

’>0

w

&

1'

t-‘

N>

1·^

SO

1'

r-·

so

^0*

NÍ

ICx

'N.·

NO

WO

£«·

01

01

Cl

o-l

oi

04

Cl

Cl

04

ci

0.!

C’4

0!

CN

04

wO

0s

jo

Ό*

ιΓΛ*·»'

O·

04

®

»<-·

OS

so

IOk

ts

·«-<

£3

1'

có

t-

o$

Xv

C5;;

·Ο

co

CCj.

V;

<’ >

ri

Wk

CXx

<*

ι'ΧΧ,

cx·

χθ

O'

'OÍ

<-V.

o-

t-

Γ-

i-

Γ-

1'

’xC

**

oi

Ol

οι

O-i

oi

«>

O|

oi

T4

C4

0.!

Cl

04

¢-4

O|

<O

W

A as

’CO

>o

NO

[z

NO

c-'l

r

Is·

Is-

01

vi<

Ml

Cx

V;

o

cr

v'j

ΛΌ

Os

w’

¢0

>x>

<O

SO

OS

0

oi

VX

0¾

oí

«V ·.

ft

Ol

?V 5

o<

ci

CNt

cl

c-4

Cl

MS

X*‘

í*t

V

•w

voi

£ A

04

CO

^N(

ν>

Vs

Is-

Vs

Is-

8'

O

*0

ÍX>

•Οχ

O;

Is

<0'

¢/

Όχ

OS

O

sO

NO

f

NO

NO

’NO

NO

MO

N;

VN

vi

mS

Ml

C\

•Ί

Ol

oi

Λ-4

^4

«‘Ν

4

oi

Λ 4

0'1

<N

oi

¢-4

Cl

¢-4

'či

8

NO

SO

;O

>*4

NO

Ν“«

N<

4'

f·

V;

<0·

Cl

$3 ca

&

v·

O·,

co>

NO

Άί

V'>

4-K

VC

Nt

Γν

O

w<

<·

x^;

NO

'4

\ď

NO

N*’

XOi

V;

Vs'

N;

Wv

MO

<Ο·

&

Cl

Ol

Cl

Ol

Cl

Cl

ft

Cl

A

•”4

ci

<-4

cl

cM

04

Jx>

SSÍ

v*·

w

kV>

•Μψ.

ΛΜ

XM.

6,-x.

Ό

CO

,Xs

cs

&«·

Cl

ON

X'·*

’.w

A

Cx,'

X·1;

Cx»·

?-4

NO

NO

Vs?

. _

ts?

r’

r’

0·'

r'

N>

tv

t-x

10».

NO

\ď

O

Λ

04

Ol

0|

<-4

<Ν

04

04

r--4

oi

04

Cl

<Nl

fl

<N

**!

<0

A A

O·

<0>

»c<

W>i

CI

0 I

r « >

so

Nt

f-Λ

so

i-;

Nt

o-

NO

Vs.'

50

ΌΛ

< >

x-s

NO

'Ό

ss

Ox

co

<0.

NO

<Ό

VrtV

so

CO

V-

A

co

I-

vs

oj

0

o i

cl

c i

ΟΊ

Ost

ΟΊ

o t

c i

0-4

c 1

01

0'4

OJ

CN

OI

A

To

»C3

O

<s

04

cv.

<c\

• χχ

|v.

.'O,

>0.

•Ό

ST

eV.

CO

NO

s

O‘>

\Cz

fOx

NT

NO

*4*

NO

V;

cK

<r>

*O

\£>

NO

NO

NO

NO

Ν;

NO

N>

NO1

NO1

NC

N>

NO

Ή

NO

A

¢-4

Ol

o|

<4

aN

o4

o4

f-N:

0'1

K-Xj

01

•'N

01

‘N

v>

.νγ

<n

AM

Ol··

04

04

Nf

Ox

v>

sc?

£

N>

NO

0-

Γ'

y*4

Ok

CO

•v'

'Ό

>0

νγ

Ο-

-Λ·

’CT

s

W

NO

NO

UC·

NO

NO

NO

NO

NO

NO

</x

NC

'.C.'

ΝΟ

'd

£ú

04

04

0|

<4

w

fNf

04

04

¢-4

A

04

01

<-4

Cl

'*-4

Oj

V'.

e.$

*A

NO

IO>

.“•V.

NO·

0-

x<4

<0.

’^0

OS

ss

Ok

NO

1X0

íOx

íOx

Ν’'«

ri

WJ

t-

CO

A

NO

w<

Z

tv’

t-·

t '

í-

f-

f s

t s*

CO

Is

t ·

f'

V-

t-ř

1*

r'

**

Ol

Cl

Cl

04

04

s^4

04

04

04

Cl

o.|

C1

0-4

CN

04

| <0

o A

g A 0

fl

s o' Cl

Ol

NO o- 01

NO 01

ιοί

01

O' fl

r0'1

fN 0f I

1-- 01

Is Is- •--4

NO oi

NO NO Γ- ‘M

ΙΟΙ

v

04

, is

fS

OX

‘p

&

Λ>·

«-.·

.«Vj

íV·.

<‘C<

.·»?·.

/V·'.

.Ύΐ

••'Ci

•XFX

<Ό·

Λ*Ύ

'Ά

j-V,

CO

M#

<4

oj

oi

C 4

H

Λ'4

A

A

Oi

C'i

O|

s 4

Cl

04

55

,.£j

A

04

Ol

o|

ÍXJ

f-4

fN

04

řŇ

Ο-Γ

O Í

A

oi

<N

>·*>

no

NO

Φ

NO

'O

NO

NO

N^

X-·

NO

Ό

NO

NO

NO

NO

*>

•w.

O

4-í

r

f-

f-

t-

1'

r-

,••4

<N

c-4

cxj

¢-4

NZ

*s-

4

r

ts

ts

*b

-Λ-

n?

s—'

Ό

NT

Ný

0.4

oi

04

fCj,

o->

<Ό

-t

’ey

oi

04

oi

s? O'-

Ν» »

O <$·

-.0 os

$> o-:

MO

J/i

MO

MS

W)

?ά 5

04

04

04

ON

Ol

04

/|*X

O

S’

ψ

»·

T

·»·

T

i-

>^x*

X»

xO

Φ'·

O'·

«0

«·

Mf>

wo

MO

MS

\S

•0

X«>

N®

«Λ

N*1

-0

v>

CN

04

04

Ai

04

<N

*0

-yg

&

«Τ MS

&

45 MO

a · I*; M

$5 $

méd

A

S> X

S

K

X

X:

X

<

X

'<

8

De

A

w

&

U4

&

w

ΐώ

SO

&

1/5

ftš

&

z?

A

00

u<

<Š

A

A

A

A

A

A

ft

X M'

>•«1

A

ft

ft

A

A

A

ft

A

A

r·WO oi t^s Cs

WN f l »EX ύ.25βΛ*ύ.25%

B$A

BEX (>.25^0^.25%

BSA

-8CZ 35138 UI

-9CZ 35138 UI

				/7044/44/44444/444444
				1®S4/		líoi	i®				i®
		T®®		O|®4	ifiiiii	i Hz®®:
	Sl®ssssš		e·			1®			®ii?
						lOO:
							gj	®1Ο®:
			lil®:					®4/®ls	?o|
	I^OÝýýý·		O®;®:	lil®	|i®|/	•••••JNA?···	O?)				ww
							β	. άν,-2ν. .X®®.·.·.·
		$ž		1|®?Í
		ý: WŠ&ŠN	Wl®			11®		|®/O|//4
		41®®	Ol®		ŽIIÓ®	í? i.
			O®®;		ísílísssís	iie	β	®ií®šs	ϋ^ύίϊί		/QI
				i®®			i®		ίϊ>%ί?γ·		/io
			Oiiii			44414					«ϊί
				ž®®		i /w®?

Příklad 6: Klinická validační studie

Validační studie byla prováděna s kloktacím testem, který obsahuje transportní médium podle předkládaného technického řešení. Transportní médium v kloktacím testu bylo připraveno namícháním kapalného média obsahujícího 0,5 % hmota, dextranu a lyofilizací tohoto média.

Testované osoby provedly samoodběr vzorku vykloktáním 10 až 20 ml pitné vody po dobu 10 až 30 s, následně byl obsah vyplivnut do odběrové nádobky s lyofilizovaným médiem a po uzavření důkladně protřepán.

Izolace RNA proběhla po transportu a popřípadě několika dnech skladování odběrové nádobky, pomocí izolačního kitu s paramagnetickými kuličkami VIRAL-RNA-Prep (ITA Intertact), a RT-PCR detekce byla provedena s pomocí kitu Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real Time Multiplex RT-OCR Kit (Detection 3 genes) od společnosti Liferiver, Shanghai ZJ Bio-Tech Co.). Při izolaci i detekci se postupovalo podle instrukcí výrobce.

Souhrnné výsledky PCR detekce jsou uvedeny v následující tabulce:

PCR	Vzorek	Celkem
Pozitivní	Negativní
Kloktání	Pozitivní	206	0	206
Negativní	24	229	253
Celkem	230	229	459

Na základě testování byly vypočteny následující statistické parametry kloktacího testu využívajícího transportní médium podle technického řešení (Cl = interval spolehlivosti):

senzitivita: SE = 89,6 %, 95 %CI = (84,9 %, 93,2 %) specificita: SP = 100,0 %, 95 %CI = (98,4 %, 100,0 %) negativní prediktivní hodnota: NPV = 90,5 %, 95 %CI = (86,2 %, 93,8 %) pozitivní prediktivní hodnota: PPV = 100,0 %, 95 %CI = (98,2 %, 100,0 %) přesnost (accuracy) = 94,8 %, 95 %CI = (92,3 %, 96,6 %).

Claims (6)

1. NÁROKY NA OCHRANU

   1. Transportní médium pro transport a skladování vzorků obsahujících viry, obsahující pufrovací roztok, alespoň jedno antibiotikum, alespoň jedno antimykotikum, vyznačující se tím, že dále obsahuje polymer, kterým je dextran nebo polyvinylpyrrolidon nebo jejich směs.
2. 2. Transportní médium podle nároku 1, vyznačující se tím, že množství polymeru v transportním médiu je v rozmezí 0,05 až 5 % hmota.
3. 3. Transportní médium podle kteréhokoliv z nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že relativní molekulová hmotnost polymeru je alespoň 10 000.
4. 4. Transportní médium podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že dále obsahuje sérový albumin.
5. 5. Transportní médium podle nároku 1, 3 nebo 4, vyznačující se tím, že je v lyofilizované pevné formě.
6. 6. Transportní médium podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že je v kapalné formě.