KR101300528B1 - 액티노바실러스 플루로뉴모니애 감염 방지 및 처치용 조성물 - Google Patents

액티노바실러스 플루로뉴모니애 감염 방지 및 처치용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR101300528B1
KR101300528B1 KR1020110101079A KR20110101079A KR101300528B1 KR 101300528 B1 KR101300528 B1 KR 101300528B1 KR 1020110101079 A KR1020110101079 A KR 1020110101079A KR 20110101079 A KR20110101079 A KR 20110101079A KR 101300528 B1 KR101300528 B1 KR 101300528B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
composition
actinobacillus
livestock
preventing
bacteriophage
Prior art date
Application number
KR1020110101079A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20130036874A (ko
Inventor
김지훈
김태규
윤성준
전수연
강상현
김정민
김석호
Original Assignee
캔 테크놀로지스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 캔 테크놀로지스 인코포레이티드 filed Critical 캔 테크놀로지스 인코포레이티드
Priority to KR1020110101079A priority Critical patent/KR101300528B1/ko
Priority to PCT/KR2012/002046 priority patent/WO2013051773A1/ko
Publication of KR20130036874A publication Critical patent/KR20130036874A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101300528B1 publication Critical patent/KR101300528B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0087—Galenical forms not covered by A61K9/02 - A61K9/7023
    • A61K9/0095—Drinks; Beverages; Syrups; Compositions for reconstitution thereof, e.g. powders or tablets to be dispersed in a glass of water; Veterinary drenches
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/00021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/00032—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10311—Siphoviridae
    • C12N2795/10321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10311—Siphoviridae
    • C12N2795/10332—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 액티노바실러스 플루로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae)에 감염하여 액티노바실러스 플루로뉴모니애를 사멸시킬 수 있는 박테리오파지인 박테리오파지 PA1Φ를 유효성분으로 포함한 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균의 감염을 방지 및 처치하는 데에 활용될 수 있는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 박테리오파지 PA1Φ는 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균에 대한 사멸능을 갖고, 서열번호 1로 표시되는 34,553 bp 크기인 유전체를 갖는 것을 특징으로 한다.

Description

액티노바실러스 플루로뉴모니애 감염 방지 및 처치용 조성물{Composition for prevention and treatment of Actinobacillus pleuropneumoniae infection}
본 발명은 액티노바실러스 플루로뉴모니애 감염을 방지하거나 처치하는 데에 활용될 수 있는 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 액티노바실러스 플루로뉴모니애에 감염하여 액티노바실러스 플루로뉴모니애를 사멸시킬 수 있는 박테리오파지를 유효성분으로 포함한 조성물에 관한 것이다.
돼지 흉막폐렴은 전 세계적으로 발생하는 질병으로 한국의 경우 2009년도 양돈 세균성 질환에서 5번째에 해당할 정도로 발병률이 높은 질병이다. 돼지 흉막폐렴은 모든 연령의 돼지에서 발생하며 주로 환절기에 다발하는 경향을 갖고 있다. 주로 공기 감염으로 질병의 전파가 이루어지며 직접 접촉에 의해서도 전파된다. 돼지 흉막폐렴에 의한 폐사율 증가와 만성형에 의한 사료 효율 감소, 성장 지연 등에 의한 경제적 손실은 막대한 실정이다. 특히, 최근 돼지 오제스키병, 돼지 생식기 호흡기 증후군(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS) 등의 면역저하 바이러스성 질환이 만연하고 집단 사육화가 늘어남에 따라 돼지 흉막폐렴의 발생은 지속적으로 증가하고 있는 추세에 있다. 돼지 흉막폐렴은 전염성이 높아 짧은 기간 안에 폭발적으로 발병하여 돼지의 집단 폐사를 일으킨다. 따라서 돼지 흉막폐렴을 예방하고 효과적으로 처치하는 데에 활용될 수 있는 제재의 개발이 절실하다 할 수 있다.
돼지 흉막폐렴의 주요 원인균으로는 액티노바실러스 플루로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae)가 알려져 있다. 액티노바실러스 플루로뉴모니애의 병원 인자는 협막 다당류, 지다당류, 용혈소, 세포 독소, IgA 프로티아제(protease), 균체 외막 단백질 등으로 알려져 있으며, 액티노바실러스 플루로뉴모니애의 혈청형으로 1형부터 12형까지가 확인되었고 16형까지도 거론되고 있다. 한국에서는 혈청형 2형과 5형이 흔히 분리된다.
돼지 흉막폐렴에 대한 적절한 대체 치료제의 개발이 절실하다고 할 수 있다.
최근 세균성 질환의 대처 방안으로 박테리오파지(bacteriophage)의 활용이 크게 부각되고 있다. 특히 자연친화적 방식의 선호로 인하여 박테리오파지에 대한 관심은 어느 때보다 높다고 할 수 있다. 박테리오파지는 세균을 감염시키는 아주 작은 미생물로서 보통 파지(phage)라고 줄여서 부르기도 한다. 박테리오파지는 박테리아에 감염(infection)한 후 박테리아 세포 내부에서 증식을 하고, 증식 후 자손 박테리오파지들이 박테리아 밖으로 나올 때 숙주인 박테리아를 파괴하는 방식으로 박테리아를 사멸시키는 능력을 갖고 있다. 박테리오파지의 박테리아 감염 방식은 매우 특이성이 높아서 특정 박테리아를 감염할 수 있는 박테리오파지의 종류는 일부로 한정된다. 즉, 특정 박테리오파지는 특정 범주의 박테리아에만 감염할 수 있고 이로 인하여 특정 박테리아만을 사멸시키며 다른 박테리아에는 영향을 주지 않는다.
박테리오파지는 1915년 영국의 세균학자 Twort가 포도상구균(Micrococcus) 집락이 어떤 것에 의해 투명하게 녹는 현상에 대한 연구에서 발견되었다. 또한, 1917년에는 프랑스의 세균학자 d'Herelle이 이질환자 변의 여과액 중에 적리균(Shigella disentriae)을 녹이는 작용을 가진 것이 있다는 것을 발견하고 이에 대한 연구를 통해 독립적으로 박테리오파지를 발견하였으며, 세균을 잡아먹는다는 뜻에서 박테리오파지라고 명명하였다. 이후 이질균, 장티푸스균, 콜레라균 등 여러 병원균에 대한 박테리오파지가 계속적으로 발견되었다.
박테리아를 사멸시킬 수 있는 특별한 능력으로 인하여 박테리오파지는 발견 이후 박테리아 감염에 대항하는 방안으로 기대를 모았으며 관련한 많은 연구가 있었다. 그러나 1941년 Flemming에 의해 페니실린이 발견된 이후, 항생제의 보급이 일반화되면서 박테리오파지에 대한 연구는 일부 동유럽 국가들 및 구소련에 한정되어서만 명맥이 유지되었다. 그런데 2000년 이후에 항생제 내성균의 증가로 기존 항생제의 한계성이 나타나고 기존 항생제의 대체 물질로의 개발 가능성이 부각되면서 다시 박테리오파지가 항-박테리아제로 주목을 받고 있다.
이에, 본 발명자들은 액티노바실러스 플루로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae) 균에 감염하여 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균의 감염을 방지 또는 처치하는 데에 활용될 수 있는 조성물을 개발하고, 이 조성물이 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균의 감염 방지 및 처치에 효과적임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균에 감염하여 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균의 감염을 방지하는 데에 활용 가능한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균에 감염하여 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균의 감염을 처치하는 데에 활용 가능한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균에 감염하여 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물의 유효성분으로 포함되는 박테리오파지는 특징적으로, 서열번호 1로 표시되는 34,553 bp 크기인 이중 가닥 DNA 형태인 유전체를 가진 박테리오파지 PA1Φ이다. 본 발명자들에 의해 밝혀진 박테리오파지 PA1Φ의 전체 유전체 서열정보는 GenBank Accession Number HM624080으로 등록되어 있다. 박테리오파지 PA1Φ는 본 발명자들에 의해 분리된 후 2010년 10월 26일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁되었다 (기탁번호 KCTC 11796BP).
본 발명의 조성물에 포함되는 박테리오파지 PA1Φ는 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균을 효과적 사멸시키므로 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균에 의해 유발되는 다양한 질환의 예방(감염 방지)이나 치료(감염 처치)에 효과를 나타낸다.
따라서 본 발명의 조성물은 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균에 의해 유발되는 질환에 대한 예방 및 처치 목적으로 활용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "처치" 또는 "치료"라는 용어는 (ⅰ) 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균에 의해 유발된 질환의 억제; 및 (ⅱ) 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균에 의해 유발된 질환의 경감을 의미한다. 농장 동물(farm animal)에서의 세균성 감염의 치료에 있어 박테리오파지의 활용은 학문적으로 증명되어 있다 (Appl. Environ. Microbiol. 76(1):48-53, 2010; Avian Dis. 47(4):1399-405, 2003; Foodborne Pathog. Dis. 8(2):261-6, 2010).
본 명세서에서 사용된 “분리된(isolated)"이라는 용어는 물질(material)이 발생한 자연 환경(natural environment)으로부터 물질이 분리되어 있는 것을 의미한다. 분리된 물질(isolated material)은 그것의 자연 상태(natural state)로부터 인간에 의한 변환(manmade transformation)을 통하여 달성된다. 분리된 물질은 분리된 박테리오파지 PA1Φ 또는 그것이 존재하던 환경으로부터 분리되고(isolated) 배양된(cultured) 박테리오파지 PA1Φ를 포함하고 있는 박테리아 분리주(bacterial isolate)도 포함한다. 이들 분리된 박테리오파지나 박테리아 분리주는 다른 박테리오파지나 박테리아를 거의 포함하지 않은 정제된 상태인 것이 바람직하다.
본 발명은 박테리오파지 PA1Φ의 변종들(variants)도 대상으로 한다. 여기서 변종들이란 유전자형(genotypic) 및 표현형(phenotypic)의 일반적 특징이 박테리오파지 PA1Φ와 같으나 유전체 서열(genomic sequence)이나 그것에 의해 암호화되어 있는(encoded) 폴리펩타이드(polypeptide)에서 약간의 차이(minor variation)를 가진 것들을 의미한다. 박테리오파지 PA1Φ의 변종에는 다염기 변이(polymorphic variant)도 포함한다. 박테리오파지 PA1Φ의 변종은 박테리오파지 PA1Φ와 같거나(same) 동등한(equivalent) 생물학적 작용들(biological functions)을 할 수 있는 것이 바람직하다. 박테리오파지 PA1Φ 변종들의 DNA들은 서열번호 1로 표시되는 서열을 가진 DNA와 매우 엄격한 조건(stringent conditions; 두 DNA를 0.1×SSC (15 mM NaCl, 1.5 mM Na3-citrate-2H2O, pH 7.0)에 녹인 후 65℃로 정치(incubation)시키는 조건)에서도 교잡(hybridization)할 수 있는 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에는 박테리오파지 PA1Φ가 포함된다. 이때 포함되는 박테리오파지 PA1Φ는 1× 101 pfu/㎖ 내지 1× 1030 pfu/㎖ 또는 1× 101 pfu/g 내지 1 × 1030 pfu/g로 포함되며, 바람직하게는 1× 104 pfu/㎖ 내지 1× 1015 pfu/㎖ 또는 1× 104 pfu/g 내지 1× 1015 pfu/g로 포함된다.
본 발명의 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수도 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다.
본 발명의 조성물은 활용 방식에 따라, 이에 국한되지 않지만 축산용 소독제(barn sanitizers), 축산용 음수(drinking water for livestock), 및 축산용 사료(livestock feed)로 구현될 수 있다.
본 발명의 조성물은 박테리아 감염을 방지하거나 처치하는 방식으로 동물 건강을 개선시키거나 유지시키는 목적으로 사용될 수 있다. 따라서 본 발명의 조성물의 사용을 통한 동물의 사료섭취, 성장, 사료 효율, 생존율, 사양상태, 생산능 등에서의 개선이나 유지를 기대할 수 있다.
본 발명의 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균의 감염 방지 및 처치 목적의 조성물은 기존 화학물질에 기반을 둔 조성물에 비하여 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균에 대한 특이성이 매우 높다는 장점을 제공할 수 있다. 이는 다른 유용한 상재균에는 영향을 주지 않으면서도 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균의 감염의 방지 또는 처치 목적으로 사용할 수 있음을 의미한다. 이에 따라 사용에 따른 부작용이 매우 작다. 통상적으로 항생제 등의 화학물질을 사용하면 여러 종류의 일반 상재균들도 피해를 함께 입게 되어 면역력 저하 등 다양한 부작용이 나타난다. 한편, 본 발명은 자연계에 이미 존재하는 박테리오파지를 유효성분으로 한 조성물을 이용하기 때문에 매우 자연 친화적이라는 장점도 제공한다. 본 발명은 축산분야에서 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균의 감염을 방지 또는 처치를 목적으로 하는 축산용 소독제, 축산용 음수 첨가제, 및 축산용 사료 첨가제의 제조에 활용될 수 있다.
도 1은 박테리오파지 PA1Φ를 선별하는 과정의 결과로 평판 배지에 투명환이 생성된 것을 보여 주는 결과이다.
도 2는 박테리오파지 PA1Φ의 여러 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균주들에 대한 사멸능 조사 실험의 결과이다.
도 3은 박테리오파지 PA1Φ에 의한 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균의 성장 억제능을 조사한 결과이다. 좌측 시험관에서부터 차례대로 박테리오파지 PA1Φ 액 (2 ×108 pfu/ml)을 0, 0.125, 0.25, 0.5 및 1 ml씩을 각각 첨가했을 때의 결과이다.
이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 액티노바실러스 플루로뉴모니애를 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 탐색
액티노바실러스 플루로뉴모니애 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지를 선별하기 위하여 본 발명자들은 자체적으로 분리하여 확보하고 있던 300여종의 박테리오파지들을 대상으로 하여 액티노바실러스 플루로뉴모니애에 대한 사멸능을 조사하였다. 이들 대상이 된 박테리오파지들은 축사 주변 환경이나 동물 조직에서부터 분리된 것들이다.
사멸능 조사는 통상의 점적 실험(spot assay)으로 실시하였다. 구체적으로, 2 μg/ml의 NAD(Nicotinamide Adenine Dinucleotide)를 포함한 TSB(Tryptic Soy Broth) 배지(카제인 다이제스트, 17 g/L; 소이빈 다이제스트, 3 g/L; 덱스트로스, 2.5 g/L; NaCl, 5 g/L; 디포타슘 포스페이트, 2.5 g/L)에 액티노바실러스 플루로뉴모니애 (ATCC27089) 균을 1/1000비율로 접종한 후 37℃에서 한밤동안 진탕배양한 다음 배양액 3 ml (OD600이 2.0)을 2 μg/ml의 NAD를 포함한 TSA(Tryptic Soy Agar) 평판배지(카제인 다이제스트, 15 g/L; 소이빈 다이제스트, 5 g/L; NaCl, 5 g/L; 아가, 15 g/L)에 도말(spreading)하였다. 도말 후 평판 배지를 클린벤치(clean bench)에서 약 30분 정도 방치하여 도말액을 건조시킨 다음 미리 준비되어 있던 박테리오파지 액 10 μl씩을 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균이 도말된 평판 배지 위에 점적하여 다시 30분 정도 방치하여 말렸다.
본 실시예의 점적 실험에 사용한 박테리오파지 액은 통상적인 방법에 따라 준비하였다 (대한민국등록특허공보 10-0781669). 이를 간략히 제시하면, 적합 숙주 박테리아를 이용하여 증식된 박테리오파지 배양액을 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 이렇게 얻어진 상등액을 0.45 ㎛의 필터를 이용하여 여과한 다음, 여과액 100 ml에 10% 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene Glycol; PEG) 8000/0.5 M NaCl이 되게 PEG와 NaCl을 첨가하였다. 이를 상온에서 2-3시간 동안 정치한 후 8,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 박테리오파지 침전물을 얻었다. 이렇게 얻어진 박테리오파지 침전물을 완충액(buffer; 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO4, 0.1% Gelatin, pH 7.5) 5 ml로 부유시켰다. 이를 박테리오파지 액으로 사용하였다.
박테리오파지 액을 점적한 평판 배지를 37℃에서 하루 정도 정치 배양한 후 박테리오파지 액이 떨어진 위치에 투명환(clear zone)이 생성되는가를 조사하였다. 투명환이 생성되는 박테리오파지의 경우가 액티노바실러스 플루로뉴모니애에 대한 사멸능이 시험 대상이 된 박테리오파지에게 있다고 판단할 수 있다.
이러한 조사를 300여종의 박테리오파지들에 대하여 실시한 결과, 투명환을 생성시키는, 즉 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균에 대한 사멸능을 가진 박테리오파지를 선별할 수 있었다. 액티노바실러스 플루로뉴모니애에 대한 사멸능을 가진 박테리오파지로 박테리오파지 PA1Φ가 선별되었다. 박테리오파지 PA1Φ의 선별 과정에서 얻어진 투명환 생성을 보여주는 결과가 도 1에 제시되어 있다. 박테리오파지 PA1Φ는 본 발명자들에 의해 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁된 바 있는 박테리오파지이다 (기탁번호 KCTC 11796BP). 박테리오파지 PA1Φ의 전체 유전체 서열정보는 본 발명자들에 의해 GenBank Accession Number HM624080으로 등록되어 있다.
박테리오파지 PA1Φ는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)을 적합 숙주로 하는 박테리오파지임이 본 발명자들의 선행연구에서 확인된 바가 있는데, 본 실시예의 결과에 의해서 박테리오파지 PA1Φ는 액티노바실러스 플루로뉴모니애에도 감염하여 사멸시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 박테리오파지 PA1 Φ의 액티노바실러스 플루로뉴모니애에 대한 사멸능 조사
선별된 박테리오파지 PA1Φ의 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균에 대한 사멸능을 한번 더 검증하기 위하여 액티노바실러스 플루로뉴모니애 표준 균주들 및 분리주들에 대하여 실시예 1에서와 같은 방법으로 점적 실험을 실시하여 세균용혈정도를 조사하였다. 본 실험에 사용되어진 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균주는 ATCC 27089, ATCC 27090, ATCC 33377, BA01849 및 BA01850이었다. ATCC 27089, ATCC 27090 및 ATCC 33377는 표준 균주이고 BA01849 및 BA01850은 국립수의과학검역원으로부터 분양받은 균주이며 분리주이다. 관련 실험 결과가 도 2에 제시되어 있다. 도 2의 결과에서 알 수 있듯이 박테리오파지 PA1Φ는 다양한 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균종에 대하여 사멸능을 갖고 있었다.
이상의 결과로 박테리오파지 PA1Φ는 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균의 감염의 방지 및 처치 목적의 조성물의 유효성분으로 활용 가능함을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 박테리오파지 PA1 Φ의 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균에 대한 성장 억제능 조사
박테리오파지 PA1Φ가 있을 경우에 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균의 성장이 억제되나를 조사해 보았다. 구체적으로, 2 μg/ml의 NAD를 포함한 TSB 배지에 1/1000비율로 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균을 접종한 후 이를 한밤 진탕배양하였다. 이렇게 준비한 배양액을 2 μg/ml의 NAD를 포함한 TSB 배지로 희석하여 OD600을 1.0으로 조정한 후 여기에 박테리오파지 PA1Φ 액 (2 ×108 pfu/ml)을 0, 0.125, 0.25, 0.5 및 1 ml씩 각각 첨가하였다. 그렇게 한 다음 최종적으로 전체 부피가 2 ml이 되게 2 μg/ml의 NAD를 포함한 TSB 배지를 첨가하였다. 이렇게 준비된 액을 37℃에서 한밤동안 진탕배양하였다. 진탕배양한 후의 결과가 도 3에 제시되어 있다. 도 3의 결과에서 알 수 있듯이 박테리오파지 PA1Φ가 많이 첨가될수록 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균의 성장은 현저하게 줄어들었다.
이상의 결과로부터 박테리오파지 PA1Φ가 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균의 성장을 억제할 수 있어 박테리오파지 PA1Φ는 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균의 감염을 방지하는 목적의 조성물의 유효성분으로 활용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC11976BP 20101026
서열목록 전자파일 첨부

Claims (14)

  1. 액티노바실러스 플루로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae) 균에 대한 사멸 능력을 가지고 기탁번호가 KCTC 11796BP인 분리된 박테리오파지 PA1Φ 또는 표현형(phenotypic) 특징이 박테리오파지 PA1Φ와 같고 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균에 대한 사멸 능력을 가진 박테리오파지 PA1Φ의 변종(variant)을 유효성분으로 포함하는 동물 건강 증진 또는 유지 목적으로 사용되는 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균의 감염 방지 및 처치용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 분리된 박테리오파지 PA1Φ는 서열번호 1로 표시되는 유전체를 가지는 것을 특징으로 하는 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균의 감염 방지 및 처치용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 분리된 박테리오파지 PA1Φ는 34,553 bp 크기의 유전체를 가지는 것을 특징으로 하는 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균의 감염 방지 및 처치용 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조성물은 축산용 사료 첨가제, 축산용 음수 첨가제, 또는 축산용 소독제 제조 용도로 사용되는 것을 특징으로 하는 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균의 감염 방지 및 처치용 조성물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 및 부형제 또는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균의 감염 방지 및 처치용 조성물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조성물은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균의 감염 방지 및 처치용 조성물.
  7. 제4항에 있어서, 상기 조성물은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균의 감염 방지 및 처치용 조성물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균의 감염 방지 및 처치용 조성물.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항의 조성물을 가축에게 투여하거나, 또는 축산용 소독제로 사용하는 단계를 포함하는 가축 건강 증진 또는 유지 방법.
  10. 제4항의 조성물을 축산용 소독제로 사용하는 단계를 포함하는 가축 건강 증진 또는 유지 방법.
  11. 제6항의 조성물을 축산용 소독제로 사용하는 단계를 포함하는 가축 건강 증진 또는 유지 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 조성물을 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균의 감염 방지 및 처치를 목적으로 가축에게 투여하는 것을 특징으로 하는 가축 건강 증진 또는 유지 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 조성물을 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균의 감염 방지 및 처치를 목적으로 가축에게 투여하는 것을 특징으로 하는 가축 건강 증진 또는 유지 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 조성물을 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균의 감염 방지 및 처치를 목적으로 가축에게 투여하는 것을 특징으로 하는 가축 건강 증진 또는 유지 방법.
KR1020110101079A 2011-10-05 2011-10-05 액티노바실러스 플루로뉴모니애 감염 방지 및 처치용 조성물 KR101300528B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110101079A KR101300528B1 (ko) 2011-10-05 2011-10-05 액티노바실러스 플루로뉴모니애 감염 방지 및 처치용 조성물
PCT/KR2012/002046 WO2013051773A1 (ko) 2011-10-05 2012-03-22 액티노바실러스 플루로뉴모니애 감염 방지 및 처치용 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110101079A KR101300528B1 (ko) 2011-10-05 2011-10-05 액티노바실러스 플루로뉴모니애 감염 방지 및 처치용 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130036874A KR20130036874A (ko) 2013-04-15
KR101300528B1 true KR101300528B1 (ko) 2013-09-02

Family

ID=48043923

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020110101079A KR101300528B1 (ko) 2011-10-05 2011-10-05 액티노바실러스 플루로뉴모니애 감염 방지 및 처치용 조성물

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101300528B1 (ko)
WO (1) WO2013051773A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102438863B1 (ko) * 2020-05-25 2022-09-01 주식회사 인트론바이오테크놀로지 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균에 대하여 용균활성을 갖는 항균물질 및 이의 제조방법
KR102423986B1 (ko) * 2020-05-25 2022-07-22 주식회사 인트론바이오테크놀로지 액티노바실러스 플루로뉴모니애 균에 대하여 용균활성을 갖는 항균물질 및 이의 제조방법

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR19990087432A (ko) * 1996-03-01 1999-12-27 베틀 칼 더블유 돼지 생식 및 호흡 증후군 백신
KR20080004325A (ko) * 2006-07-05 2008-01-09 헬쓰뱅크스 바이오테크 코포레이션, 엘티디 Ｐｒｒｓ 백신으로서의 돼지 생식기 호흡기 증후군바이러스 융합 단백질

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060292135A1 (en) * 1997-10-31 2006-12-28 Lawrence Loomis Use of bacterial phage-associated lysing proteins for preventing and treating bacterial infections in humans, animals and fowl

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR19990087432A (ko) * 1996-03-01 1999-12-27 베틀 칼 더블유 돼지 생식 및 호흡 증후군 백신
KR20080004325A (ko) * 2006-07-05 2008-01-09 헬쓰뱅크스 바이오테크 코포레이션, 엘티디 Ｐｒｒｓ 백신으로서의 돼지 생식기 호흡기 증후군바이러스 융합 단백질

Also Published As

Publication number Publication date
WO2013051773A1 (ko) 2013-04-11
KR20130036874A (ko) 2013-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2662986C1 (ru) Новый бактериофаг clostridium perfringens clo-pep-1 и его применение для ингибирования пролиферации clostridium perfringens
US10265353B2 (en) Enterohemorrhagic E. coli bacteriophage Esc-CHP-1 and use thereof for inhibiting proliferation of enterohemorrhagic E. coli
US10265354B2 (en) Enteropathogenic E. coli bacteriophage Esc-CHP-2 and use thereof for inhibiting proliferation of enteropathogenic E. coli
RU2662985C1 (ru) Новый бактериофаг шига-токсин продуцирующей e. coli типа f18 esc-cop-1 и его применение для ингибирования пролиферации шига-токсин продуцирующей e. coli типа f18
RU2704864C1 (ru) Новый бактериофаг pas-mup-1 pasteurella multocida и его применение для ингибирования размножения pasteurella multocida
RU2662984C1 (ru) Новый бактериофаг энтероинвазивной e. coli esc-cop-4 и его применение для ингибирования пролиферации энтероинвазивной e. coli
US11529406B2 (en) Clostridium perfringens bacteriophage Clo-PEP-2 and use for inhibiting Clostridium perfringens proliferation of same
US11412760B2 (en) Escherichia coli bacteriophage Esc-COP-7, and use thereof for suppressing proliferation of pathogenic Escherichia coli
US10898531B2 (en) Vibrio parahaemolyticus bacteriophage Vib-PAP-5 and use thereof for suppressing proliferation of Vibrio parahaemolyticus bacteria
US10751377B2 (en) Vibrio parahaemolyticus bacteriophage Vib-PAP-1 and use thereof for inhibiting proliferation of vibrio parahaemolyticus
US11020442B2 (en) Vibrio parahaemolyticus bacteriophage Vib-PAP-2 and use thereof for inhibiting proliferation of Vibrio parahaemolyticus
US11497216B2 (en) Pseudomonas aeruginosa bacteriophage pse-AEP-4 and use thereof for inhibiting proliferation of Pseudomonas aeruginosa
US11457635B2 (en) Pseudomonas aeruginosa bacteriophage Pse-AEP-3 and use thereof for inhibiting proliferation of Pseudomonas aeruginosa
US11679138B2 (en) Vibrio parahaemolyticus bacteriophage Vib-PAP-7 and use of same for inhibiting vibrio parahaemolyticus bacteria proliferation
KR101300528B1 (ko) 액티노바실러스 플루로뉴모니애 감염 방지 및 처치용 조성물
US11679137B2 (en) Vibrio parahaemolyticus bacteriophage Vib-PAP-4 and use thereof in inhibiting proliferation of Vibrio parahaemoliticus bacteria
US11213050B2 (en) Escherichia coli bacteriophage Esc-COP-9 and use for inhibiting proliferation of pathogenic Escherichia coli thereof
KR101279780B1 (ko) 액티노바실러스 플루로뉴모니애에 대한 사멸능을 갖는 박테리오파지
JP2024508289A (ja) ウェルシュ菌に対する特異的死滅能を有する新規なバクテリオファージ、およびこれを含む抗菌組成物
KR20180103788A (ko) 신규한 녹농균 박테리오파지 Pse-AEP-3 및 이의 녹농균 증식 억제 용도
KR20150018171A (ko) 클로스트리디움 퍼프린젠스 감염을 방지 및 처치하는 방법
US10894068B2 (en) Bordetella bronchiseptica bacteriophage Bor-BRP-1, and use thereof for inhibition of proliferation of Bordetella bronchiseptica bacteria
US11439677B2 (en) Vibrio anguillarum bacteriophage VIB-ANP-1 and use thereof for inhibiting proliferation of Vibrio anguillarum bacteria
US11351210B2 (en) Lactococcus garvieae bacteriophage Lac-GAP-3 and use thereof in inhibiting proliferation of Lactococcus garvieae bacteria
US20210054345A1 (en) Novel salmonella typhimurium bacteriophage stp-2 and use thereof for inhibiting proliferation of salmonella typhimurium

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161116

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170719

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180821

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190918

Year of fee payment: 7